Methoden Des Mykologischen Laboratoriums

5/11/2018 Methoden Des Mykologischen Laboratoriums

1/91

Methoden des m ykologischenLaborator iumsVon Hanns Kreisel und Frieder Schauer

Mit 26 Abbildungen


2/91

Anschrift der Autoren:Prof. Dr. rer. nat . habil . Hanns KreiselWissenschaftsbereich Allgemeine Mikrobiologie und VirologieSektion Biologie der Emst-Moritz-Amdt-Universitit GreifswaldDr. rer. nat . Frieder SchauerWissenschaftsbereich Technische MikrobiologieSektion Biologie der Emst-Moritz-Amdt-Universitit Greifswald

CIP-Kurztitelaufnahme der Deutschen BibliothekKreisel, Hanns:Methoden des mykologischen Laboratoriumsjvon Hanns Kreisel u. Frieder Schauer. -Stuttgart; New York: Fischer, 1987.ISBN 3-437-20382-7NE: Schauer, Frieder:

Lizenzausgabe fiir Gustav Fischer Verlag Stuttgart New YorkAIle Rechte vorbehalten. VEB Gustav Fischer Verlag Jena, 1987Printed in the German Democratic RepublicGesamtherstellungVEB Druckerei "Thomas Miintzer", 5820 Bad LangensalzaI S BN 3 - 43 7 -2 0 38 2 -7

Vonvor t

Mit der hi er vorge legten Sammlung einfacher Arbe it svorschr if ten fU r mykologischeLaborator ien so lI Studenten, jungen Wissenschaf tl em und techn ischen Krii .f ten die Ein-arbei tung in grundlegende Techniken, wie sie in mykologischen Laboratorien mikrobio-logischer, botanischer und phytopathologischer Insti tute gebriuchl ich sind oder nii tzlichsein konnen, ermoglichen, Auch sol I den auf Grenzgebieten t ii ti gen Bio logen, welche nurgelegent li ch mit Pil zen zu tun haben, der Umgang mit di esen Organi smen erl eichte rt wer-den.Obwohl die Vielfal t der experimenteIl -mykologischen Arbei tsrichtuagen gebiihrend

beriicksichtigt werden sol lte - die hiufig prakt izierte Spaltung ineine "mikrobiologische~'und eine "botanische" Mykologie sowie mehrere angewandte Fiicher ist unseres Erachtensein wesentliches Hemmnis fU r die Entwicklung der Disziplin -, war es nieht unsere Ab-s icht, e in u rnfas sendes und kost sp ie liges Handbuch zu schreiben. Die Auswahl der vo r-gest ell ten Methoden i st daher auf Grunds it zli ches und wenige weit er fli hrende Beispi elebegrenzt und wahrscheinlich auch etwas subjektiv, bedingt durch die personlichen Er-fahrungen der Verfasser; das Inhal tsverzeichnis weist die Schwerpunkte aus. Methodender Genetik , dec Biochemie , der med iz ini schen und phytopatholog ischen Mykolog ieb le iben bier weitgehend ausgeklammcr t und mii ssen s ti cker spezi ali si er ten Handb ii -chern entnommen werden, d ie schon ein ige Grundkenntni sse voraussetzen . Einige der -a rti ge Werke sind im Lit eratu rverzeicbni s mit au fgefi ih rt. Einzelne Methoden und Re-zep tu ren sind auch in mikrobiolog ischen Arbe itsbi ichem entha lten; d iese sind jedochvorwiegend auf bakter io logi sche Techniken or ient ie rt und beri icks ich tigen spez if lschmykologische Arbei tsmethoden nur in geringem Umfange.Herbartechnik und morphologische Bestimmungsmethoden haben wir nicht auf genom-

men . Hier sei auf das Handbuch fU r Pil zf reunde , Band II (3. Auf l. 1985) und I II (4. Aufl.1986), aus dem YEB Gustav Fischer Verlag lena und auf andere Bestimmungsbiicherverwiesen.Die Methoden werden in der Reihenfolge dec Arbei tsginge so beschrieben, da B sie von

Aoiangem leicht nachvo ll zogen werden kannen. Vari ant en und andere erg inzende Hin-weise sind jeweils un te r "Aomerkungen" aufgefi ih rt. D ie Arbe itsvo rschr if ten werdenun ter Ber ii cks ichtigung sparsamen Mater ia l- und Energieverb rauchs sowie der Arbei ts-schutzbestimmungen ausgearbeitet.D ie Mehrzahl dec Methoden wurde von den Verfas sem oder deren Schi il ern und Mit-

a rbe item selbst e rp rob t. Wei te re Arbe it svorschr if ten wurden aus dec zitierten Literaturiibemommen, urn ein einigermaBen abgerundetes Bild zu geben. ~.Fiir eine Anzahl von Hinweisen und Rezepturen , di e uns von Kol legen und ehemaligen

Sch ii le rn f reundl icherweise zur Kenn tn is gegeben oder demons tr ie rt wurden, bedankenwir uns bei Dr. Dietrich AMELUNG, Restock, Dr. sc. Giinter R. W. ARNOlD, Weimar,Prof . Dr. 'SC. Hannelore BERNHARDT,Greifswald, Lektor Erik BILLEHANSEN,Kopenha-gen, Dipl.-Biol. Wolfgang GIERER, Born (DarB), Dr. l ii rgen GOTz, GroB Li isewi tz , Dr .

5


3/91

Harald GRANZOW, I nse l R iem s, P ro f. Dr. sc. W olfgang H IR lE , K leinm achnow , D r.Ve ron ik a KAR1HEUSI !R-WIEHLE,u ed li nbu rg, Dr. Eberhard KLUGE, Eberswalde-Finow/Kleinmachnow, Dr. s c. An na KOC lwvA-KRATOCHVtLo vA ,B ra ti sl av a, P r of . Dr. s c. Man-f re d KOOLER ,G r ei fswal d, P r of . Dr. Denise LAMouRE, L yo n, u nd D ip l.-A gr ar in g. S eb ua r ;PETzoLDT, Artem.E s is t u ns er W un sch , daB d ies es B uc h h elf en m og e, d er M yk olo gie den dringend be -no ti g te n Nachwuchs zuzufiihren un d diesem d en Z ug an g z u e xp er im en te lle n A r be it en z uerleichtern.Greifswald, imN ov em be r 1 98 6 Hann s K r ei se lF r ie de r S ch au er

6

InhaltsUbersicht

Vorwort . 59465369839211 912 514 114 6

A Herstellung von Nihnnedien .B S te ri li si er un g und Des in fe kti on .C lsolierung. . . . . . . . . .D I mp fte cb nik und StammhaltungE Fruktif ikation und Sporulation .F P hy sio lo gis ch -b io ch em is ch e T es tu ng ,G G ew innung und Rekombination von Einsporkulturen .H L ichtm ikroskopie, F iirbem ethoden .I Rasterelektronenmikroskopie . . . .K P hy sio lo gi sc h- ok ol og is ch e M et ho de nA D h m I IRezepturen fU r Re ag en zi en , F a rb - und FixierlOsungen.Gesundheits- und Arbeitsschutz im mikr ob io lo gi sc he n L abo r.Verzeichnis de r im Text genann ten giftigen SubstanzenAog loamer i kan ische MaBe inhei te n und A bldir zu ng en .

15 216 316 516 716 817 4

UteraUverzeidmis .s.dIregiIter . . . .

7


4/91

'11

, ' , ' 1, I

A

At

He rs teUung v on N ih rmed ie n

Fast j ede myko logi sche Laborarbe it beginnt mit der Hers te llung eines Ni ih r-mediums sowie seiner Abfii llung in Vorrats- oder KulturgefiiJ3e (Kolben, Rohr-chen, Petrisehalen) vor oder nach der Steri lisation. Die Niihrmedien konnen alsfli issiges Niihrmedium oder, unter Verwendung von Agar-Agar, als fester Niihr-boden berei tgestell t werden; prakt isch kann jedes Rezept fUr AgarniibrbOdendurch Weglassen des Agar-Agars auch als ein Rezept fU r fliissiges Niihrmediumdienen.Hunderte von Rezepturen fU r NiibrbOden fUr die unterschiedlichsten Zwecke

der Mykologie sind publiziert worden (eine bedeutende Auswahl ist be i Boora1971 kompiliert) . Wir bringen bier Rezepte fU r 61 in de r Praxis ~ undmeis t b iiuf ig verwendete Niihrmedien, d ie folgendenna.Ben geordnet sin'd:A Ibis A 18 NiihrbOden fU r die Stammhaltung und fU r universelle ZweckeA 19 bis A 32 'Medien zur Erzielung von Sporulation, Fruktifikation und

anderen morphologischen StrukturenA 33 b is A 43 Selektivmed ien zur Isol ati on und KeimzahlbestimmungA 44 bis A 55 Medien fU r physiologische UntersuchungenA 56 bis A 68 Weitere f li ss ige Nibnnedien, Spurenlemen te-, Vi taminlo-

sungen u. dgl. (vgl. auch A 22)Die Vorschr if ten A 69 bis A 72 betretTen die Aufbewahrung sterilisierter Niihr-medien sowie da s Abfii llen von NiihrbOden in Kulturrobrchen und Petrischa-len.Aile Rezepte sind auf I IWasser bezogen. Die angegebene Menge Agar-

Agar (meist 20 g) ist e in Richtwer t, welcher j e nach Qualit ii t des Agar-Agarsvon 15 bis 30 g variiert werden muB; von Markenerzeugnissen wie Difco-AgargenUgen mei st 15g /l. Die Eins te llung des gewi inschten pH-Wer tes er fo lg t mitI N KOH oder I N NaOH hzw. 0,1 N Ha (Rezepte im Anhang). F ii r dieBehandlung stark saurer NiihrbOden - pH 4 und darunter - beachte man dieEinf 'uhrung zum Kapit el B, S . 46 .Die hinter der Bezeichnung des Niihrbodens in Klammern angegebenenBuchst aben (MEA usw.) sind d ie in der anglo-amer ikani schen Li te ra tur ge -briiuchlichen Kiirzel fiir StandardniihrbOden.

MaIz-Agar 2 , 5% (MEA)zur Stammhaltung ftlamentOser Pi1ze und heterobasidialer Hefen (AulxoPOlJl.O& B E N E K E 1952)

25 g Ma1zextrakt (getrocknet und pulverisiert) ode r 30g Biomalz20 g Agar-Agar1000ml Aqua dest.9


5/91

1. Ag ar -A g ar a bw ie ge n und 5 m in in f lie.6 en de m W as ser w as ch en ; d an ac hWasser weggi e .6 en.2. 10 00 m l A qua d est. zu geben un d im Becherglas im Wa ss er ba d e rh it ze n, b issich das Aga r-Aga r a u flO st .3 . Ma lz ex tr a kt (bzw. B iom al z) a bw ie ge n u nd d er LO su ng z uf ii ge n.4. p H-W er t p riif en u nd g eg eb en en fa lls e in ig e T ro pf en H CI z ug eb en , b is s ic hein pH etw a 5,5 einstellt. Der pH-Wert kaon mi t I nd ik a to r pa pi er g eme ss enwerden.s. LO su ng d ur ch w ei ch en P ap ie rf il te r f il tr ie re n u nd das F iltra t in ein em E r-lenmeyerkolben im Ki ib l ach rank au fbewab ren .6 . In R O br ch en f iille n n ach V or sc hr if t A 7 0.7. IS min be i 1 21 DC im Au to kl av en s te ri li si er en n ac h V o rs ch ri ft B 3 oder B 4.8. V or dem Festw erden des A gars sind die R ohn:hen nach V orschrif t A 71s ch r ag z u l eg en .AImerk.. .. .. :FU r schwachwiichsige Pilze sind SO g Biomalz auf II Wasser zu empfeblen.Die Verwendung von Biomalz ist weniger giinstig, da ihm z. T. Caco3 oderandere Substanzen beigemischt sind, we1chedas Wachstum mancher Pilze ungiinstigbeeintlussen.Zur 8estiJDmung und Stammhaltung von eenicillium wird der Nihrboden mit 20 gpu1verisiertem Ma1zextrakt, 20g Glucose und I g Pepton angesetzt (PITr 1979).

A2 Maiz-Agar (MEA)z ur K u lt iv ie ru ng , S tammh al tu ng u nd m or ph ol og is ch en C h ar ak te ri si er un g v ona s komyz et al en He fe n (LoOOI!ll & KIu!omt-vAN Ru 1952)1000 ml Ma1zextrakt (verdiinnt)20g Agar-Agar

1 . M alze xtr ak t (H er ste llu ng n ac h V or sc hr if t A 59) au f c ine sp cz i fi s che Dicht ev on 1 ,0 4 g/cml ( en ts pr ec he nd 1 0 B a l li ng -G r ad ) m it L ei tu ng sw a ss er v er di in -Den.

2. Zu 1 00 0 m l v er diin nte m M alz ex tr ak t 20 g A ga r-A ga r zuf iigen u nd imD am pf to pf cr hitz en , b is A ga r-A ga r s ic h lO st.3 . I n R ob rc hc n oder i n N ib rb od en fl as ch en a bf iU l en .4. IS min be i 1 10 D C im Au tok l av en s t er i li s ie r en .S. V or dem E rstarren des A gars R ohn:ben schrag r e g e n oder in ste r il i s ie r te

Petrischalen ausgicBen.A .' qru:Das Medium kann aucb mit 100g Malzext rakt (ge trockne tes und pulveri si er tesHandelspriiparat) pro Liter Medium bergestellt werden.A D J te Ue .de r unter Punkt 4 angegebenen Steri lisierung ist es auch moglicb, an3 aufeinander folgenden Tagen je e ine Stunde im Dampf top f (100 DC ) zu sterili-

sieren.Oft wird zur Stammhaltung von Hefen genereD MaIzagar verwendet, der aus MaIz-extrakt , verdi innt auf 7 Balling-Grad (bzw. mit 70 g getrocknetem Ma1zextrakt proLiter), hergesteDt wurde. (Balling-Grad: s. FuBnote S. 40).10

A 3 . Supplementierter Maiz-Agarz ur S tammh al tu ng v on H e fe n ( SE E LIG I! Il1 97 8)

IS g Malzextrakt12,75g Maltose0,78 g Pep ton2,75g Dextrin2,35 g Glycerol (""Glycerin)1 g NH4Cl1,70g K1HP0420 g Agar-Agarad 1000 ml Aqua dest.1. B es ta nd teile a bw ieg en u nd in A qu a dest. im Dampftopf b ei 10 0 OC losen.2. Agar f i lt r ie r en .3 . p H-W er t a uf 6, 5 b i s 7 , 0 e in s te ll e n.4. A bfiillen zu 7 bis 10 m l in R ohn:h en .S. IS mi n be i 1 21 D C im Au tok l av en s t er i li s ie r en .6 . V or d en t E rs ta rr en d es A gllJ 'S R O br ch en s cb rig le ge n.

A 4 Bienriirze-GIucose-Agarzur S tammh al tu ng v on H e fe n ( Ko cr c. OVA -KRATOCHVf LOvA970. rniindl. I1000 ml Bierwiirze2g D-Glucose20g Agar-Agar

1 . B i erw ii rz e ( be ll e Vo rd erw ii rz e, a u s B r au er e ie n b ez ie hb a r) m i t L e it un g swa ss erauf 7 Balling-Grad (bzw. Masse-% an 100000henExtrak tstofTen) verd i innenunci Glucose B O W i e Apr-Agar zufiigen.2 . 1 h be i 1 00 C i n D amp ft op f steUen, anschlieBend f iItr iercn.3. A bf iillen in R ohr ch en na ch V or sch rif t A 70 .4. An3 aufeinandcrfoJsenden TageD je 1 h im D am pf top f (1 00 OC)steri l isicren.

AS Maismelll-Apr '(CMA)f ii r D a ue rk ul tu re o u nd S po ru la tio n vieler imperfekter PiIze

30 g Maismchl20 g Agar-Agar1000 ml WIlSICI"1. 1000 m l W a sser m it 30 IMaismchl im Bccherglas bi s zum Sied en c r h it zen .Varber StandlWbe de s BechcrgIases mit Fettsti:ft markicren.2 . E in e S tu nd e k och en lassen, dabe i bin un d wieder 1 l 1 D 1 " i i h m 1 .3 . Wih r enddesscm Apr-Apr abwiegen und 5 m in in f lieB en de nt W as serwaschen; danach Wasse r abg ie . 6en .4 . D en M ais meb lb re i d ur ch e in T uc h f iltr ie re n.

S. Da s A g ar -A ga r d en t b ei 8e n F il tr at z uf ii ge n.I 6. Im Wasserbad erwirmen (evtl. im D am pf to pf ), b is s ic h das Agar-Agar

lOst.11


6/91

7 . D as v er da mp fte W as se r b is z ur M ar kier un g ( s. o be n) a uf fiille n.8. p H-Wer t p ro fe n u nd n otig en fa lls e in ig e T ro pf en H CI z uf iig en , b is s ich e inp H z wi sc he n 5 ,0 u nd 6 ,0 e in st el lt . Der p H -W e rt b on m it I nd ik at or pa pi erg emessen we rd en .9. D ie h ei Be LO su ng d ur ch P ap ie rf il te r f il tr ie re n; d as F il tr at i n E rl enme ye r-k ol be n im K i ih ls ch r an k au fb ewahr en .1 0. N ac h V or sc hr if t A 7 0 in R oh rc he n f iille n.11. N ach V orschrift B 4 20 m in im Au tok l av en s t er i li si e re n .1 2. V or d em A bk iih len R oh re he n n ach V or sch rif t A 7 1 s ch rig le ge n b zw . n ac hV o rs ch ri ft A 72 i n P e tr is ch al en g ie B en .

A6 Hafermehl-Agar (OA)zu r S ta mm ha ltu ng v on Phytophthora, Pythium u. v. a. PiIzen30 g Hafermehl20 g Agar-Agar

1000ml Aqua dest.I. H af er meh l2 0 m in in d es t. W as se r k oc hen .2 . M e hl br ei d ur ch e in T uc h f il tr ie re n.3. A qua dest. bis 10 00 ml auffillien.4 . G ew as ch en es A ga r- Ag ar h in zu fiig en , im W a ss er ba d o der D am pf to pf er -h it ze n u nd z ur LO su ng b ri ng en .5. Nahrboden 1 5m i n b ei 1 21 C im Au to kl av en s te ri li si er en .

A7 Hafer-Erbsen-Agar (OPA)z ur S tamm h al tu ng p hy to pa ra si ti sc he r u nd a nd er er Pilze10g Erbsenmehl10g Hafermehl20 g Agar-Agar

1000ml Leitungswasser1 . G elb e S pe is eer bs en m it e in em M ix er zu M eh l z er kle in er n.2 . H af er flo ck en m it ein em M ix er zu M eh l z er kle in er n.3. A gar-A gar abw iegen und in ein Becherglas f ilIIen , m it 1 00 0 ml WasseriibergieBen.4 . E rb se nm eh l u nd H af er meh l zu fiig en u nd a lle s g ut u mr U hr en .5 . D as B ec he rg la s m it I nh alt im Damp ft op f o de r W a ss er ba d c th it ze n; mehr-maIs um ri ih re n, b is da s Aga r- Ag ar g el Os t is t.

6 . L Os un g d ur ch ein T uc h o de r V er ba nd mu ll f iltr ie re n.7 . p H -W e rt e tw a 6 ,0 e in st el le n.8. N ihr boden n ach V or sch rift A 70 in R ohr chen f Ullen.9 . S te ri li si er cn 2 0 m in bei 1 21 C im Au to kl av en .AS KartotIeI-Agar (PA)

fU r Dau er k ul tu r en v ie le r P iI ze240ml KartotTelextrakt20g Agar-Agar760ml Wasser

12

A9

AIO

HersteDung des KlII1Offelextrakts:1 . 1 00 g g es ch ii lt e K a rt of Te ln r ei be n u nd den B r ei m it 3 00 m l W a ss er a nr ii hr en .2 . D ie se L Os un g 24 him Ka lt en s te he n l as se n.3 . L osung dur ch ein T uch f iltr ier en und da na ch 1 h im W asser ba d kochen la s-

sen.He rs teUung des N ib r IJocI eIw :4 . A ga r- Ag ar a bw ie ge n und 5 m in in f liel3 en de m W as se r w as ch en ; d an achWasser abg ij :l 3 en .5 . 7 60 m l W as se r z ug eb en u nd in e in em B ech er gla s im Was se rb a d e rw i i. rm e n,b is s ic h d as A ga r- Ag ar lO st.6. 240 mlKar tofTe le x tr ak t h inzu f ii g en .

7 . D ie LO su ng d ur ch P ap ie rf il te r f il tr ie re n; d as F il tr at i n E rl enme ye rk ol be nim Ki ihl sch r ank au fbewah ren .8. N ac h V or sch rif t A 7 0 in R O hr ch cn fiillen.9. N ac h V or sc hr if t B 4 2 0 m in im A uto kla ve n s ter ilis ie ren .1 0. V or d em A bk iih le n R oh rc he n n ach V or sc hr if t A 7 1 s ch rij,g le ge n.Kartoffel-MOhren-Agar (PeA)zu r S t ammhal tung und Sp or u la ti on v o n f il am e ntO se n PiIzen

20 g KartotTeln, geschilt20 g Mohren, geputzt20 g Agar-Agar1000ml Leitungswasser

I. G es ch iilte K ar to fT eln in S tU ck e s cb ne id en u nd m it 2 50 m l W as se r 4 5 b is 6 0minkochcn.2 . K ar to fT eln d ur ch e in T uch o de r S ieb p res se n.3 . E xtra kt m it W asser a uf 50 0 ml auffiillcn. 4. G ep ut zt e M o hr en inS tU ck e s ch ne id en u nd m it 2 50 m l W as se r 4 5 b is 6 0 m i nkochen.5. M ohr cn d urch ein T uc h o de r S ie b p re ss en .. 6 . E xtr ak t m it W as se r a uf 5 00 m l a uf fiillen .7. Kartoffel- u n d Mohr e ne xt ra k t z us amme ng ieB en .8. A ga r- Ag ar a bw ie gen , 5 m in unter f li cB e nd em Was se r wa sc he n, dann demEx tr ak t z u Iugen .9. N ach V or sc hr if t B 4 2 0 m in im A uto kla ve n s ter iIis ie re n.

Allmerk ..... :Dieser niihrstoffarme Nihrboden ist hervorragend zur Stammbaltung der meistenPi1ze geeignet. Das Wachstum ist zwar ziemlich spirl ich, aber gesund; die Luft-myzelbildung ist gehemmt.Eineandere ller.epturemprreblt ISOgKartotTeln und ISOgMohrenaufll Wasser.Kartoffel-Glucose-Apr (PDA)(CCM Bmo 1 98 2)

200 g KartotTeln, gesohilt und geschnitteri15g D-GkJcose( =Dextrose)20 g Agar-Apr1000ml Aqua dest.

13


7/91

I. Ka rt otT el n s eh il en , i n S ti ic ke s eh ne id en unci mit 330 ml W asser 60 minkochen.2. Kar to tTe lbr e i du r ch ein T uc h o de r f ei ne s S ie b pressen. Ri ic k st and ve rwe r f en .3. Den E xtr ak t m it d es t. W as se r a uf 1 00 0 m l a uf fiille n ..4. Agar -Ag ar a bw i eg en , 5 m in i n f li eB en dem Wa ss er w a sc he n, dann dem Ex -trakt hinzufiigen.5 . G l uc os e hlnzuffigen, dabei umrilhren.6. LOsung im O am pf topf oder W asserb ad er hitzen, b is das A ga r-A ga r s ichgelOsthat.7. Sterilisieren im Autoklaven 20 min bei 121 "C .A kwc:Es wird auell folgendes Rezept empfohlen (VAN DER WALT 1970):

100g KartotTeln, geachilt und fein ,escbnitten20 g D-Glucosc20 g Agar-Apr

1000 ml WasllCfl.KartotTeln sebilen, fein sehneideri, in 30 0 ml Wasser i iber Nacht in einen Kiihl-schrank stellen.2. Dun:h ein Tuell filtrieren.3. Das Fihrat im Autoklaven I h bei 121C steri lisiercn.

4. 230ml von diesem Extrakt mit 770 ml Wasser, 20 g Glucose und 20 g Apr-Agarmisc:hen, bis zur LOsung des Apr-Agars erbitzen.S. SteriHsieren im Autoklaven IS min bei 121C.Dieses Medium wird von mehrercn Firmen als Fertigpriparat anaeboten.

All Kindlea-Agar (CbA)nach BoarH (1971), VON AllX ( 1976) , STALPI !I tS ( 1978)

109 Apr-Apr20 0 ml Dekokt von Sauerkinchen80 0 ml Leitunpwasser

I. 1 kg e nt st ei nt c S au er ki nc be n i n 1 I Waas ec z um Koc he n b ri ng en , 2 h l ei ch tkochen 1uIIen, d an n d ur ch ein Tuch fd tr i er e n .2. Dekokt int:rockensterili Kolben mt Ien , 30 m in b ei 110C im Autokla-ye n steriIisicren.3. 20 g Aga r -Aga r in80 0 mI Leitungswasser 10aen, 30 m in bei 110 "C im Auto-

k laven ste r il i s ie ren .4. 200 mI d es De ko kt es h in zu fi ig en .5 . N ibrboden auf pH 3,8 bis 4,6 einaacllen unci illJtolux:hCln fiillen.6 . N i hr bOd en ind en R ohn:ben 30 m in im Dampftopf o de r Wa s se rb ad (odcr5 min be i 1 02 C im Au tok l av en) s t ai li s ie r en .

Nihrboden zur Isoli erung , Kul tur und Cb8nal t ta ia ieru von Pilzen, z. B. zurBestimmung der Myzclien holzbewohneDder ~e8. .Das ~hdekokt kann in t rockenster i li s ier teo KoIben oder Fluchen vorritiggehalten werden.

14

Sterilisieren des Nihrbodens bei Temperaturen oberhalb 102C ist zu vermeiden,da das saure Medium dann Diehl mehr fest wird.In analoger Weise kann aus sauren Pflaumen bzw. Zwetscbgen ein Pilaumen-Agarhergestellt werden.

A 12 Sabouraud-Agar (SA)fU r k er at in op hi le u nd h um an pa tb og en e P il ze

10 g Pepton40 g D-Glucose20 g Agar-Agar1000 ml Aqua dest.

I. Aga r-Aga r a bw i eg en unci 5 m in u nt er f li eB en dem Wa ss er w a sc he n, d an ac hdas Wasser weggi eBen .2. 1000 mI Aqu a d es t. z uf ii ge n unci im Damp ft op fb zw . W a ss er ba d e rh it ze n,bis das Aga r -Aga r s ic h lOs t.3. 'Pepton unci G lu co se a bw ie ge n u nd der LOsung zugeben .4. LOsung d ur ch P api ec fI lt er f d tr ie re n; das 1Filtrat in Erlenmeyerkolben imKiihIschrank aufbewahren.5 . N ach V or sc hr if t A 7 0 in R oh rc hen f iille n.6. N ach V orscbrif t B 4 15 m in be i 1 10 " C im Au tok l av en s t er i li s ie r en .

7. V or d em A bld ih len , R oh rc hen n ac h V or sch rif t A 71 schrag Iegen.Vcqef .... ~AprI. 45,2 g de s Pulwrs abwiegen unci in2SO mI kaltcm Aqua dest. suspendieren.2. 750 mI Aq ua d es t. im Wa ss er ba d b is zum Sieden erhitzen.3. Die Suspension unter s ti nd ig em Um r ii hr en indas s ie de nd e Was se r g ic 8e n.4. 5 m in ko chen la ssen, his sich das im Pu lv e r en th a lt ene Apr-Apr lOst5. InRohrchen oder Er le nmeye rko lb en f i il le n .6. ImA uto kla ve n 1 5min be i 121C s t cr i li s ie r en .An C :Sabouraud-Apr ist als Trockenpriparat im Handel.Nach SI!I!uoIla (1978) kann del" Agar fU r die KuhiviCl"UDlalllpruchsvoller Pilzemit 10mg Thiamin und S O mg Inositol pro Liter supplementiert werden.Zur Isolierung von Pilzal BOlltede r pH-Wert des Agars nach der Stcri lisiCl"UDlund Abkiihlung auf S O bis 60 C auf S, O billS,S eiDgestelk werden, z. B. mitsteriler 10Y.,igerWeinsiure.Zur Unterdriickung der Begleitflora is t ein Zusalz von Anb"biotika vorteilhaft,z. B. 40ppm Streptomycin unc i 40 ppm Penicillin. D ei Isolierung pathogener m a -m e n tO s er P il ze a u s s ta rk v e n m n r i n i a t e m Material bat sich e m Z1I Iatz von S O ppm,Chloramphenicol unci 40 0 ppm Cycloheximid bewihrt. Die Zupbe der Antibiotikaerfolgt in c I e r Regel als steril filtrierte StammlOsung naeh Sterilisierung des Agars(vgl. auell Vorschrift A 43).Nach anderen Vorschriften wird ansteUe von 4% Glucose auch 2% Glucose,4% Maltose, 2 % Maltose oder I % Glucose + I % Maltose verwendet. Auch diesevari ierten Sabouraud-Medicn sind teilweise als Trockenpriparate im Handd.Fiir AnreicIIerungsze kOnncn Sabouraud-Medien auch oboe Aprzusatz als Fliis-

Is i gme d i en e in g e se tz t werden.15


8/91

A 13 Hefe-Pepton-Glucose-Agar (yPD =YEP-G)Nihnnedium fUr schwachwii cbs ige Hefen (E. BILLE HANSENbriefl., WEBER1982)

10 g Hefeextrakt20 g Pepton20 g D-Glucose20g Agar-Agar1000ml Wasser1. Substanzen inWasser 1000n, im Dampftopf bzw. Wasserbad erhitzen, bisdas Agar-Agar gelost ist .2. pH-Wert 5,5 b is 6 ,0 e ins te llen.3. LOsung inRohrchen fUllen.4 . S te ril is ie ren 15 min im Autok laven bei 121C.Aome r kDDge l l :Bei Bedarf kann Glucose dureh andere C-Quell en ersetzt werden. Dureh Weg-lassen des Agar-Agars kann das Medium auch fliissigverwendet werden.VANDEIt WALT(1970) gibt folgende Rezeptur fU r das fliissige Medium an:5 g Hefeextrakt10 g Pepton20 g D-Glucose

1000ml WasserEinstellung des pH-Wertes ist in diesem Faile nieht erforderlieh.

A 14 Glucose-Pepton-Hefeautolysat-Agar (GPy)zur Stammhaltung von Hefekul turen (VONAltx & SCHIPPER, 1978)40g D-Glucose5 g Pepton20g Agar-AgarSOOml HefeautolysatSOOml Aqua dest.

I. Glucose und Pepton in 500 ml Aqua dest. losen.2. 50 0 ml Hefeautolysat (Vorschr if t A 61) und 20 g Agar-Agar zufiigen.3. Im Dampftopf bei 100 C erhi tzen , b is Agar-Agar s ich lost .4. Abfiillen zu 7 ml inRohrchen.5. 15 min bei 121C im Autoklaven sterilisicren.6. Vor de m Erstarren des Agars Rohrchen schr ig legen.A.aerIamg:'Auf d iesem Agar sol l wihrend der Stammbaltung von Hefen fiber einen l iingerenZeit raum das Risiko e iner Selekt ion von mutativ ver ii nder ten Stammen in derHefepopulation geringer sein als bei anderen Hefemedien.

A 15 Glucose-Pepton-Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (YM)zur Stammhaltung von Hefen (WICKERHAM1951)1000ml Glucose-Pepton-Hefeextrakt-Malzextrakt-Medium (Vorschrift A 62)20 g Agar-Agar

16

1. Zu 1IGlucose-Pepton-Hefeextrakt-Malzextrakt-Medium vor dessen Steri -l isat ion 20 g Agar-Agar zufUgen.

2. Medium im Dampftopf bei 100 C erhitzen, bis das Agar-Agar sich lost;til trieren.3. Abfiillen zu 10 ml inRohrchen.

4. 15 m in be i 121C im Autoklaven sterilisieren.5. Bei Herstellung von Schragagarrohrehen: Rohrchen vor dem Erstarrendes Agars schr ig legen.

AnmerkDDge l l :Zur Isolierung von Hefen wird YM-Agar mit 30% (w/v) Glucose verwendet. Fallsosmotolerante bzw. osmophile Hefen isoliert werden sollen, kann der Glueosegehaltbis auf 50% (w/v) erhoht werden.Das Medium ist als Trockenpriiparat erhii lt lieh (Oifeo Lab., Detroit , USA).

A 16 CaIciumcarbonat-Agarzur Stammhaltung und morphologisehen Charakterisierung von Hefen derGattungen Brettanomyces und Dekkera (VANDI!Il WALT 1970)

~-"--"

10 0 g Malzextrakt (getrocknet und pulverisiert)20g CaC0320 g Agar-AgarI ml VitaminlOsung (Vorschrift A 66)

ad 1000ml Aqua dest.1 . Malzagar nach Vorschr if t A 2 herst ell en und inRohrchen zu 9 ml abfUll en.2. Nach der Sterilisation zu dem verfliissigten, auf ca . 55C temperiertenAgar (pro 9 ml) unter sterilen .Bcdingungen zupipettieren:- 1 ml einer Calciumcarbonat-Suspension (20 g Caro3 pro 100 ml Aquadest.), die varber 15 min b ei 121C im Autoklaven st er il is ie rt wurde .

Beim Pipettieren - mit einerPipette mit etwas weiterer OtTnungan.der Spit ze - ist auf moglicbst homogene Verteilung de s unlOslichenCalciumcarbonats zu achten.

- 0,1 ml einer steri l ftl tr ierten Vitamin-StammiOsung3. Vor dem Ersta rren des Agars das Calciumcarbonat nochmal s aufsch ii tte lnund Rohrchen sch rag 1egen.

Aumerklllllea:Auf anderen f ibl iehen Med ien zur Stammhaltung s te rben Hefen der GattungenBrettanomyces und Dekkera aufgrund der fU r diese Hefen typischen starken Essig-saure-Produktion schnell ab, falls nieht eine (mindestens) monatliehe Oberimpfungerfolgt.Fal ls Calciumcarbonat-Agar - in Petrischalen gegossen - ffi rden Nachweis einerstarken Siiureausscheidung dureh Pilze (Aufhel lung um jeweilige Kolonien) ver-wendet werden soi l, empfiehlt es sieh, nur 0,5 % Calciumcarbonat dem Agar zuzu-fiigen. Indiesem Fall ist als C-Quelle 5% D-Glucose in Mineralsalz- oder Hefewasser-Agar zu empfehlen.

2 Kreisel, Metboden 17


9/91

A 17 Hagem-Agarzur lsolierun g u nd K ultu r von ek to myk orr hizab ildenden P iJzen ; a uch fdrs ap r op h yt is ch e Ba si di omy ze te n g ee ig n et (LAlHo 1970).

0,5g KH2P040,5g NH.O0,5 g MgS04 7Hp0,5 mI FeCl2 (I %ige LOsung)5 g D-Glucose5 g MalzextraktIS g Agar-Agar1000mI Aqua dest.

H er steU u ng d es N ih rb od en s a na lo g V or sc hr if t A I.S te rilis ie re n 2 5 m in b ei 1 15 C imAutoklaven (LAMoURE miindl.).

Al8, Hefe-Stlrke-Agar (YpSS)zur K ultu r von Al lomyce s , Bo s to c lad ie ll a ( E M E R S O N 1958)

4 g Hefeextrakt , pulverisiertISg 100000heti rkeI g ~HP040,5 g MgS04' 7 H2020g Agar-Agar340ml Teichwasser, filtriert

660ml Aqua dest.1. A ga r-A ga r a bw ieg en u nd 5.min u nte r f lie &n dem W a ss er w as ch en ; d an ac hWuser weggie8en.2. Teich- und destilliertes Wa ss er m ia ch en , A g ar -A ga r h in zu fi ig en und imWaaserbad oder Dampftopf erhitzen, bis das Agar-Agar s ic h l os t.3 . D ie i ib ri ge n S U bs ta nz en hi nz uf il ge n u nd gut 11IDl'iihren.4. Di e LOsun g d u rc h P api er f dt er f il tr ie re n.5. Nacb Vo rs cb r if t B 3/4 3 0 min bei 110 O C im Au tok l av en s t er i li s ie r en .

Al9 Hefe-Starke-Agar (SSY)zur lsolierung von limnisch-aquatischen Pitzen (BANOONI & a I. 1 97 5)

2 g Hefeex trak t10g 1000icheStirke20g Agar-Agar1000ml Aqua dest.HersteUung analog V or sc hr if t A 1 8.

18

A 20 Czapek-Dox-Agar (CzA) .C he mis ch d ef mier ter ( "s yn th etis ch er ") N ih rb od en f iir d ie B es tim m un g v onK ultu ren v on ASpe1Jillus, Penicillium u. a.

3g NaN03I g ~HP040,5g KO0,5 g MgS04' 7 Hp0,01 g FeS04 1Hp30g Saccharose (oder 30g D-GlucoS!' ), f re ivon S0220 g Agar-Agar1000mI Aqua dest.1. A ga r- Ag ar a bw ie ge n u nd 5 m in u nte r f lie 6e nd em W as se r w as cb en , d an ac h

das Wasse r wegg ie6 en .2 . 1000 m l Aqua dest. zugeben und im W asserb ad erh itzen, bis da s A gar -A g ar s ic h l Os t.3 . D ie iib rig en S ub sta nz en ( s. o ben ) h in zu fiig en u nd g ut umriihren .. 4 . D ie LO su ng d ur ch P ap ie rf dt er f il tr ie re n.5. N ach V or sch rif t A 7 0 i n R oh rchen filllen.6. N ach V or scbr if t B 3/415 min imAu tok l av en s t er i li s ie r en .7. N ac h V or sch rif t A 72 i n v or b er ei te te s te ri le P e tr is ch a le n g ie B en .

A21

2

A om er k ... : IZur Bestimmung osmophiler Aspergillus-Arten wird ein Czapek-Dox-Agar mi4()()_gSaccharose auf 1000mlAqua dest. verwendet (A.,ergillus-g/auCIIS-Gruppe).Zur Bestinunung und Stammhaltung von Penicillium wird dem Nihrboden 5 gHefeautolysat ode r Hefeex:trakt zupsetzt (Czapek-Hefeautolysat-Agar, CYA, Prrr1979).

Maltose-Agarz ur F ru ch tk or pe rb il du ng v on Basidiomycetes, z. B . Coprinus(E. B I l J. .I ! H A N s E N , miindlich)

0,5g KN030,25g ~HP040,5 I MgS04' 7 ~O0, I mg Thiaminhydrochlorid1,0ml SpureneJementelOsung (Fe, Zn , Cu. .. ) ,vg l. A 63109 MaltoseIS g Agar-Agar

1000mI WasserVe re in f ach t e Rezep tur :

10g MaltoseIg Hefeex: t raktIS g Agar-Agar1000ml WasserZubereitung w ie Cza pe k: -D o x- Ag ar ( Vo nc br if t A 2 0) .

19


10/91

A 22 Syntbetisches Nihrmedium fU r Phytophtborazur Oosporenbildung und -keimung (RIBEIRo, ERWIN & ZENTMYER1975)

4,5g D-Glucose0,1 g L-Asparagin0,15 g KN03I,Og KH2P040,5 g MgS04' 7 H200,1 g CaC~30 mg p-Sitosterol, gelOstin 30 ml Dichloromethan1,0ml Spurenelementelosung (5. unten)1,0 ml Fel+ -Stammlosung (5 . unten)1000ml {\qua dest .Spurenelementelosung (nach C o c H R A N E 1958)41,1 mg N~Mo04' 2 Hp87,8mg ZnS04' 7 Hp7,85mg CuS04 . 5 H p15,4mg MnS04' Hp0,5 mg Na2B407100 ml Aqua dest.

Fel+ -StammlOsung44,44 mg FeCI3 6 Hp2,6 g N~-Ethylendiamintetracetat (EDTA)2,5g KOHlOOml Aquadest.

I . LOsung (oboe Thiamin) nach de n oben angegebenen Rezepten zusammen-ste1len.

2. pH-Wert mittels 6 NKOH auf 6,2 einstel len.3. 20 g Agar-Agar (bzw. 14 g Difco Noble Agar) zusetzen.4. 1m Autoklaven sterilisieren.5. I ml e iner du rch Bakter ienf ilt er f ilt rie rt en StammIOsung von Th iamin-HOzusetzen, so da B eine Endkonzentration von I ppm Thiamin erreicht wird.

6. Niihrmedium in Petrischalen ausgieBen.A 23 Gemiisesaft-Agar

zur Sporula tion von Hefen (MIwc & al. 1942)I. Gemiisesaftherstellung: Zu einer abgewogenen Menge cines Gemischesvon fein geschnittenem bzw. gehacktem Gemiise, das zu gleichen Teilenaus gewaschenen, ungeschii lt en Mohren , Riiben, Gurken und Kar to fTelnbesteht , wird die gleiche Menge Leitungswasser zugefiigt und die Mischung10 min be i no C autok lavie rt. Anschl ieBend wird das Gemisch durch e inTuch filtriert, Das Filtrat solI dann einen pH-Wert von etwa 5,7 bis 60Mben. '

2. In I I Gemi isesaft 20 g PreBhefe suspendieren, anschli eBend Agar-Agar zu-rugen.

3 . 1m Dampf top f bei 100 C erh it zen, b is Agar -Agar si ch lOs t. , anschl ieBendin Rohrchen zu 10 ml abfiilIen (Vorscbrift A 70).

4. 15 min bei 121C imAutoklaven steri lisieren (Vorscbrift B 4).5. Vor de m Erstarren des Aga rs Rohrchen schri ig legen.

20

A24

A2S

Anme rk u ng eo :Hiiufig wird als Gemusesaft ..V8 - vegetable' juice" (Campbell Soup Comp. ,Camden, USA) verwendet , der aus einem Gemisch von Tomaten, Mobren, Sel lerie,Ruben, Kopfsalat, Petersilie und Brunnenkresse bereitet wird. Zur Herstellung von..VB-Agar" werden nach WICKERHAM& al, (1946) 350 ml des V8-Gemusesaftes mit5 g in 10ml Aqua dest . suspendiert er PreBhefe gemischt und nach Erhi tzen fi ir10min im Dampftopf (pH-Wert: 6 ,8) mit 34 0 ml geschmolzenem, heiBem 4%igem.Wasser-Agar (in Aqua dest.) gemischt.Fiir manche Hefen (z. B. Metsclrnikowio-Arten) ist zu r Anregung einer Sporulationdie Verwendung von verdiinntem Gemiisesaft (I: I bis I: 100mit Aqua dest. verdiinnt,pH 5,5) ohne Zusatz von PreBhefe besser geeignet (Prrr & MIlLER 1968). Beieventuell notigem erneutem Aufschmelzen von Gemiisesaft-Agar sollte unnotigesErhitzen vermieden werden.

Gorodkowa-Agarzur Sporulation von askogenen Hefen (GoRODKOWA1908)

10 g Pepton10g D-Glucose5g NaCI20 g Agar-Agar1000ml Leitungswasser1. Bestandteile in Wasser losen.2. 1m Dampftop fbe i 100 C erh it zen, b is Agar-Agar si ch lost .3. Agar filtrieren und in Rohrchen zu 7 ml abfiillen.4. 15min b ei 121C imAutoklaven sterilisieren.5. Vor dem Erstarren des Agars Rohrchen schrag legen.Anmerkung:Nach einer modiflZierten Rezeptur wird nur I g D-Glucose pro l iter Medium einge-setzt (LoDDER &KRooER-VANRu 1952). )Acetat-Agarzur Sporulation von askogenen Hefen (KLEYN 1954)

5 g Natriumacetat . 3 Hp2,5 g Bacto-Tryptose0,62 g D-GlucoseO,62g NaCI20 g Agar-Agar

1000ml Aqua dest.1. Bestandteile in Aqua dest. bei 100 C im Dampftopf losen.2. InRohrchen abfiillen zu 7 ml (Vorschrift A 70).3. 15 min bei 121C imAutoklaven steri lisieren (Vorscbrift B 4).4. Vor de m Erst ar ren des Agars Rohrchen schrag legen.~ . . .:Der Ausgangs-pH-Wert soli nach der Sterilisation 6,9 bis 7,1 betragen.

21


11/91

A 26 Acetat-Agarzur Sporula tion von askogenen Hefen (FOWELL 1969)

5 g Natriumacetat (wasserfrei)109 KCl20g Agar-Agar

1000ml Aqua dest.I. Bestand te ile in Aqua des t. bei 100C im Dampftopf losen,2. In Rohrehen abfiillen zu 10 ml (Vorschrift A 70).3. 15 min. bei 121C im Autoklaven sterilisieren.4. Vor dem Erstarren des Agars ROhrchen schrag legen.Aome rk u ng en :Vielfach wird aueh der Fowell-Acetat-Agar ohne KCI-Zusatz verwendet (FOWELL1952).Der Acetat-Agar naeh FOWELL(1969) soi l besonders bei s ieh anschlieBendenHybridierungsversuchen von Hefen geeignet sein und zielt nieht nur auf die hochsterreiehbare Sporenzahl pro Zellpopulation, sondem aueh auf die fU r Hybridisierungenof t g iinst ige hohe Sporenzahl pro Askus (z. B. be i Sac ch a romyce s c er e vi s ia e mog-liehst viele Aszi mit 4 Sporen).

.A 27 Acetat-Mediumzur Sporulation von askogenen Hefen (McCLARY & aI. 1959)

8,2g Natriumacetat (wasserfrei)2,5 g Hefeextrakt (getrocknet)1,0g D-Glucose1,8g KCI0,7g MgS04 7 HzO1000ml Aqua dest.I . Bestandteile in Aqua dest. losen.2. InRohrchen zu 10ml abfii llen.3. 15 min bei 121C im Autoklaven steri lisieren.Amnerkungen:Zur Beimpfung wi rd zu 10ml des Med iums eine gewaschene Hefesuspens ionzupipet tiert. Dabei wird ein Titer von 3x 1 ( 1 ' Zellen/ml eingestellt.Vielfaeh wi rd das Medium mit 3% Agar-Agar verfestigt und als Scbriigagar ver-wendet.Nach e iner var iie rt en Vorsch rif t werden ans te ll e von 8,2g Natr iumacetat und1,8g KCI auch 9,8 g Kaliumacetat und 1,2g NaCI verwendet .

A 28 Verdiinnter Malz-Agarzur Sporu la tion von askogenen Hefen

40 g Malzextrakt (getrocknet und pulverisiert)30g Agar-Agar1000ml Aqua dest.

22

1. Agar-Agar abwiegen und 5 min mit Aqua dest. waschen, danach Wasserweggie8en.

2. 1000 ml Aqua dest. zufiigen und im Dampftopf bei 100 C erbitzen, bisAgar-Agar sich lOst.

3. Zu der noch hei8en AgarlOsung Malzextrak t zugeben und un ter RUhren auf-1000n.4. Abf iil len zu 7 ml in Rohrchen.5. 15 min bei 110C im Autoklaven steri lisieren.6. Vor dem Erstarren des Agars Rohn:hen schriig legen.. 7 . Aufbewahrung der Sehragagarrohrchen im Kii,hlschrank. FaIls erneutes

Aufschmelzen des Agars notig sein sollte, ist auf minimales Erhitzen zuachten.

Aome rk u ng en :Anstelle des getrockneten Malzextraktes kann auch selbst hergestelher Malzextrakt(Vorschrift A 59)oder ungehopfte Bierwiirze verwendet werden, wobei vor Zugabe desAgars mit Leitungswasser auf 4 Balling-Grad zu verdiinnen ist.Statt der unter Punkt 5 angegebenen Steri lisierung ist es auch mOgli ch, an d re iaufeinaaderfolgenden Tagen je I h im Oampftopf (100 "C) zu sterilisieren.

A 29 Reis-Agarzur Bildung von Chlamydosporen und Pseudomyzel beiHefen nach TASCHD1lAN(LoDDER 1971)

20 g Reis20g Agar-Agar1000ml Leitungswasser r

1. Reis (geschi il t) in Lei tungswasser geben.. 2. Mischung aufkochen und bei bedeck tem Gef iil l45 min aufkle iner Flamme

weiterkochen.3. Filtration durch Mull bzw. Gaze; Reis verwerfen.4. F il trat mit Agar -Agar versetzen und auf I I auf fi ill en.5. Erbitzen im Dampftopf, bis Agar-Agar gelOst ist.6. Abfiillen in RohrOOen zu 10 ml oder in Flaschen.7. 15 min bei 121C im Autoklaven sterilisieren.8. Bei Bedarf Agar inPetrischalen mit diinnem Glasboden aUSgieBen;Aomerkungen: 'Nach einem variierten Rezept wird da s Reiswasser nur durch eine ca. 18sti indigeAufsehwemmung von Reis (20 gIl) bei Zimmertemperatur und anschlie8ende Filtra-tion gewonnen. Nach Losen des Agar-Agar bei einem pH-Wert des Reiswassers von7,2 (ggf 10/oige NaOH zufiigen) wird nachFil trat ion der pH-Wert mit 10%igerMilchsiure auf 6,0 eingestellt unc i an 3 aufeinanderfolgenden Tagen je 20 min imDampftopf sterilisiert (BBRNHA.Iu>T 1983,miindl.). Von SBl!LIOEll1978)werden 10mlFiltrat einer 5O%igen(w/v) Reismehlaufschwemmung pro Liter Medium eingesetzt.Zur Herstellung von Reis- Tween-Agar wird der Reis-Agar mit 1% (v/v)Tween 80 komplettiert.Koa:ovi-IUATOCHViLOvA (miindl. Mitt.) bereitet Reis-Tween-Agar durch Extrak-.tion von 100g Reis pro Liter Wasser bei 100 C(10min), anschlie8ende Filtration undZusatz von 0,2% (v/v) Tween 80, Sterilisation: drcimal Dampftopf. .

23


12/91

A 30 Tauroeholat-Agarzum N achw eis der C hlam ydosporenbildung bei H efen (H . B ER NH ARD T)

2,5 g Na-Taurocholat4,5g Agar-Agar250m l Aqua dest.

1. N ii hr bo de n 2 1/ 2 h k oc he n, n ic ht a ut ok la vi er en .2 . D an ac h s of or t in S eh alen g ie8 en .A um er k . ... :Der N8hrboden ist nur 8 bis 10Tage haltbar, daher nur Ideine Mengen ansetzen!

A 31 Zwiebel-Agarzum N ach weis ein er P se ud om yz elb ild un g b ei H ef en (KOCKovA-KRATOCH-vlwvA, mi in d i. 1 9 70 )

50 0 g Zwiebeln2 g D-Glucose20 g Agar-Agar1000ml Leitungswasser

1. Zw ie be ln s ch ii le n u n d z er s ch ne id en ; 50 0 g in I I L ei tu ng sw a ss er g eb en u ndauf k oc he n l as se n.2 . W i iB ri ge n E xt ra kt a bd ek an ti er en u nd f il tr ie re n.3. 0, 2 % D -G lu co se s ow ie A ga r- Ag ar z uf iig en .4 . In E rlea mey er ko lb eh en z u j e 3 0 m l a bf iille iJ ..5 . A n 3 a uf ein an der fo lg en de n T ag en je I h in D am pf to pf (IO O "C) sterilisieren6. Vor G eb ra uc h i n P et ri sc ha le n g ie 8e n.

A 32 Hefe-Morphologie-Agarz ur C ha ra kt er is ie ru ng d er M o rp ho lo gi e v eg et at iv er Z el le n VOnHe fe n (WICKER-HAM 1951, modif lZie r t nach VAN DBR WALT 1 97 0 )

10 g D-Glucose1,5 g L-Asparagin3,5 g (NHJ2S040,85 g K.H 2P040,15 g K2HP040,5 g MgS04 7 Hp0,1 g NaO0,1 g eao2 6 H2010mI SpurenelementelOsung (Vorschrift A 63)10ml .VitaminlOsung (Vorschrift A 66)10ml ' AminosiurelOsung (Vorscbrift A 67)20 g. Agar-Agar

ad 1000ml Aqua dest.1 . B e st an dt ei le ( auDer V i tam in lO s un g und Am in os ii ur el os un g) i n 9 80 m l A qu adest. imD am pf to pf 1 00 0n b ei 1 00 C.2 . Ab f ii ll e n de s M edium s in R Ohrchen zu 9,8 ml oder i n Ni ihr boden fl aschen

24

3. 15 m in bei 121C imAu tok l av en s t er i li s ie r en .4. V or dem E rsta rr en des A gar s u nter ster ilen B ed in gungen p ro R ohrchen(9,8 ml) zupipettieren:

- 0, I m l V i tam in lO s un g , s te ri l f il tr ie rt- 0, I m l Am i no si iu r elO su n g, s te ri l f il tr ie rtA n sc hli eB en d R oh rc he n s ch ri ig l eg en o de r i n P et ri sc ha le n a us gi e8 en .

Anmerkungen:Dieses Medium wird auch als Fertigpri iparat (in getrockneter Form) angeboten(Difco Laboratories Detroit, USA).Zur Herstellung des Agars werden 35g des getrockneten Hefe-Morphologie-Agarsin 1Ialtem destilliertem Wasser suspendiert und die Bestandteile durch Erhitzen imDampf topf gelost, Nach Abf ii ll ung in Rohrchen oder Flaschen erfolg t - unge-achtet des Gebalts an Vitaminen und Aminosiuren - die Sterilisation durch15miniitiges Autoklavieren bei 121C (VAN DER WALT& YARROW 1984).

A33 Heo-Agarzu r I sol ie r ung un d Ku lt ur p hy to pa th og en er P il ze , r emer fU r Gymnoascaceae;Chytridiomycetes un d Acrasiales.

50g trockenes Heu20 g Agar-Agar1000ml Wasser

I . 5 0 g H eu (B la tte r v on v er sc hie den en P fla nze n, g em is ch t u nd g etr oc kn et)abwiegen.2. 1000 ml Wasser z u fi ig en und 30 mi n imAu tok l av en s t er i li s ie r en nach Vor-schriftB 4.

3. Du rc h e in T uc h f dt ri er en .4. D as v erd am pf te W asser auf 10 00 ml auffiillen.5. A gar -A gar abw ieg en un d 5 m in in f lie8endem W asser w asch en; da na chWas se r we ~e 8e n.6 . D as A ga r- Ag ar de r he il le n F l ii s si gke it zuiugeD; im Wa ss er ba d k oc he nl as se n, h is s ic h das Ag ar -A g ar l Os t.7 . D ur ch P ap ie rf dt er f il tr ie re n.8. N ach V orschrif t A 70 in R ohr chen f iillen.9 . N ach V orschr ift B 3/4 20 min im Au tok l av en s t er i li s ie r en .1 0. V or d em A bk iih len R oh rc he n n ac h V or sch rif t A 7 1 s ch riig leg en .

A 34 Bodenextrakt-Agar (SEA)z ur I so li er un g v on B od en pi lz en ( S. P ET zo lDT briefl.)1000g gut humoser Boden (z. B. Gartenerde)10mg Chloramphenicol10mg Streptomycinsulfat15 g Agar-Agar1000ml Wasser

25


13/91

l.Bo de n a bw ie ge n u nd m it g le ic he n V o lu mt ei le n W a ss er m is ch en .- 2 . B o de ns us pe ns io n s ed im en ti er en l as se n, d an ac h F lii ss ig ke it d ek an ti er en u ndaufbewahren.3. A gar-A gar abw iegen und 5 min u nt er f li e8 en de m Wa ss er w a sc he n.4. D ie d ek an ti er te F li is si gk ei t m it d em Ag ar -A g ar v er se tz en .5 . LOsun g im Au to kl av en s te ri li si er en .6. An ti bi ot ik a a bwi eg en u n d h in zu f ii ge n.7 . B o de ne xtr ak t- Ag ar i n v or he r s te ri li si er te R oh rc he n a bf U ll en .8. Rohrchen s ch ra g l eg en o de r ( 20 m l) i n P et ri sc ha le n a us gi e8 en .

A 35 CarboxymetbyJ-CeUulose-Agar (CMC)z ur l so li er un g v on Bo de np i1 ze n (GAMS 1960)10 g Tapetenleim, handels iibl ich3g NaN03I g KHlP040,5 g MgS04 7Hp0,5g KO0,01g FeS04 7Hp0,5 g Hefeextrakt10mg CuS045 mg MnS04Img ZnS0450mg csci,15 g Agar-Agar

1000ml Aqua dest.1 . T ap ete nle im in 5 00 m l W as se r 2 4 h q ue llen la ss en , dann i n g el os tem Zu st an da uf p H 7 ,0 e in st el le n.2. A gar-A gar 5 min u nt er f li e8 en de m Wa ss er w a sc he n u nd d er L os un g z uI ug en ,i ib r ig e Sub st anz en zu fi ig en.3 . W a ss er a uf 1 00 0 m l a uf fi il le n.4 . L Osu ng filtrieren un d n ach V or schrif t A 70 in R ohr ch en fU llen.5 . 1m Au to kl av en s te ri li si er en .6 . R oh rc he n s ch riig le ge n o der ( 20 m l) in P etr is ch alen a us gie Be n.

A 36 Wasser-Agar20 g Agar-Agar

1000ml Wasser (oder Aqua dest.)l.A ga r-A ga r a bw ie ge n u nd in 1 00 0 m l W as se r e in we ic hen .2. 1m W asser ba d erw iirm en, bis da s A ga r-A ga r sich lost,3 . LOsun g d ur ch P api er f il te r f il tr ie re n.4. N ach V or sch rift A 70 in R oh rchen f Ullen.5 . N ach V or sc hr if t B 3 /4 2 0 m in im A uto kIa ven s ter ilis ie re n.6 . N ac h V or sch rif t A 7 2 in P etr is ch alen g ie 8en .

26

HaferfloekeugarZur lsolierung und Kultur mancher Schleimpilze (Myxomycetes) i st nach demGieSen in Petrischalen, bevor der Wasseragar fest wird, in jede Schale eine IdeineMenge Haferflockenzu streuen.

A 37 Armer Maiz-Agarz ur I so li er un g v on n ie de re n P i1 ze n m it Z oo sp or en (Oomycetes, Chytridiomyce-tes)

2 g Ma1zextrakt oder Biomalz20g Agar-Agar1000ml Wasser

1 . A ga r- Ag ar a bw ieg en u nd 5 m i n in f lieB en de m W a ss er w as ch en ; d an ac h W as -se r weggi eBen .2. 10 00 m l W asser zug eb en; im D am pf topf oder W asserba d erbitzen, bis sichd as A g ar -A g ar a uf lO s t.3 . M a1 zex tr ak t (b zw . B io ma lz ) a bw ie ge n u nd d er L os un g zu fiig en .4. p H -W e rt p ri if en u nd g eg eb en en fa ll s e in ig e T ro pf en H el z ug eb en , b is s ic h e inp H v on e tw a 5 ,5 ein ste llt. D er p H-W er t kann mi t I nd ik a to rp a pi er g eme ss enwerden.5. Di e LOsun g d ur ch Papierfilter f i lt r ie r en und das F il tr a t i n e in em E r le nme ye r-k o lb en im K i ih ls ch r an k au fb ewah re n.6. In Rohrehen f U lle n n a ch V or sc hr if t A 7 0.7 . 2 0 m in im A uto kla ven s te rilis ier en n ac h V or sch rif t B 3 /4 .8. V or dem Festw erden des A gars sind die Rohrchen nach V orschr ift A 71 .s eh r ag z u l eg en .

A 38 MaIz-Hefe-Pepton-Agar (MYP)z ur I so li er un g v on li mn is ch -a qu at is ch en P i1 ze n ( BANDON I& a l. 1 97 5)

7g Ma1zex traktI Sojabohnen-Pepton (z. B. Difco soytone)0,5 g Hefeextrakt15 g Agar-Agar1000ml Aqua dest,

Na ch d em Au to kl av ie re n w ir d d em M e di um T et ra cy cl in -H y dr oc hl or id ( 10 0 m gin 1 m l E thanol 95 %) zugesetzt.A39 Y-Agar

z ur I so li er u ng v o n He fe pi 1z en au s S u sp en s io ne n u nd Was se rp r ob en (BUCK. 1975)20 g D-Glucose2 g Malzcx traktIg Hefeextrakt20 g Agar-Agar (bzw. 23 g Difco-Nutrient-Agar)

1000ml Aqua dest.27


14/91

1. Med ium auf pH 6,0 e ins te ll en.2. Nach dem Autoklavie ren werden 200 bi s 500 ppm Chlo ramphen icol zuge-setzt.

A 40 Candida-Selektivagarzur Kultivierung potentiell pathogener Candida-Arten (NICKERSON, modifiziertnach SEEUGER1978)

10g D-Glucose10 g Glycin8 g Wismutsulfi t1 g Hefeextrakt

20 g Agar-Agarad 1000 ml Aqua dest.1 . Bestandteile in 'Aqua dest. geben.2. Mischung aufkochen und 5 min im Dampftopf b ei 100 C stehen lassen.3. Agar auf 50C abkuhlen und Platten gieBen. .A am er ku ng ea :Potentiell pathogene Candida-Arten bilden auf diesem Agar mittelgroBe, runde, braunbis schwarz geiarbte Kolonien.Der Agar ist auch als Trockenpriiparat im Handel (z, B. Merck).

A 41 Dopa-Agarzur Melaninbi ldung bei Crypto co c cu s neoformans (CuAsKES & TYNDALL1975,modiftziert nach VAN DERWALT& YARROW 1984)I. 0,04 g Dihydroxyphenylalanin (DOPA)

1 g Asparagin1 g L-Glutamin1g Glycinad 200 ml Aqua dest.II. 0,5 g D-Glucose4g KH2P042,5 g MgS04 7Hp10mg Thiamin-HCl20 1'8 Biotin25 g Agar-Agar

ad 800 ml Aqua dest.1. Zur Herstellung der als Substrat fUr die Pigmentbildung notigen DOPA-Aminosaurelosung (I) die oben genannten 4 Bestandteile in200 mlAqua dest.Iosen,2. pH-Wert der Losung mit 1M ~HP04-L6sung (ca. 7 ml) auf 5,5 einstellen.3. LOsung steril fJltrieren.4. Zur Hers te llung des Grund-Agar -Mediums (II ) Best andteil e (ohne Agar)in800 mlAqua dest. geben.5. pH-Wert des Grund-Agar-Mediums mit I M ~HP04-LOsung (ca. 7 ml)auf 5,5 einstellen.

6. Aga r zufiigen und 15 min b ei 121C autoldavicren.28

7. 800 ml des sterilisierten Grund-Agar-Mediums (II) bei 55C mit 200 mlder steril filtrierten DOPA-Aminosaurelosung (I) mischen und sofort inPetrischalen ausgieBen oder in Rohrchen abfii llen.

A am er ku ng en :Der Agar wird zur SchneIlditTerenzierung von Cryptococcus neoformans eingesetzt.D ie Ko lonien wben si ch durch die Wirkung der Pheno loxidase dunkelbraun bi sschwarz (28 C, 1 bis 3 Tage).Die DOPA-Aminosiiurelosung darf nicht mehr als unbedingt notig einer erhohtenTemperatur (55C) ausgesetzt werden.Das fertige Medium ist im Kiih1schrank aufzubewahren und nur ca. eine Wocheverwendungsiahig.Anstelle de r DOPA-AminosiiurelOsung konnen auch verschiedene andere Verbin-dungen als FarbstotT-Pri ikursoren verwendet werden, z. B. Samen von Guizotiaabyssinica, Catechol, Protokateehusaure, Norepinephrin, Dopamin u. a.

A 42 Glycerol-Pepton-Agarzur Keimzahlbest immung von Bakter ien und Hefen (HIRTE 1965)

20 g Glycerol (Glycerin)2,5 g Pepton1g ~HP043g NaO0,25g MgS04 7 H200,01g FeS04 7H20O,04g Cac0320 g Agar-Agar1000ml Leitungswasser

pH-Wert einstel len auf 6,9.ADmerkung:Geziihlt wird in den Verdiinnungsstufen 10-4, 10-', 10-6, vgl. Vorschrift K 1.

A 43 Zusatzvon Antibiotika m Nihrbiiden(u. a . nach SBIDEL&. AMELUNG1981)a) antibakterieDe AadlJiofika O D d Wirkstotre~phenieoI250 bis 300 ppm ....zuerst 10 etwas Ethanoll&en, da schlecht wasserlOslich; kann mit autoklaviert werden.BeapI_ 0,5 bis 60ppm nach dem Autoklavieren zugebenCItIDrtetraeydi 4 bis 100ppm nach dem Autoklavieren zugebenN.......... roclaolat 500 ppm nach dem Autoklavieren zugebenOdwmplle 500-1000 ppm nach dem Autoklavieren zugebenOxytetncydiD 100ppm nach dem Autoklavieren zugeben. PeU:ilIin 50ppm nach dem Autoklavieren zugebenStreptcaydll 10bis 300 ppm nach dem Autoklavieren zugebcn

29


15/91

b) andfungale Antibiotika unci Antimykotika8eaomyilOO ppmNystatfa 10bis SO ppmzuerst in Glyc::eroll&en, da nieht wasserloslich;vorwiegend gegen Hefepilze wirksam.PImaric:ia 10bis 100ppm

. Amaerk ... :Die angegebenen Mengen variieren je nach der Empfmdlichkei t der kul tiviertenPilzart . Wenig Biozide vertragen z. B. Phytophthora, Pylhium, Rhizoctonia, Cera-tocystis.I ppm = I mgfl.

A43a Antibiotika-Selektivmedium (MPVM)zur Isolierung und quant itat iven Bestimmung von Phythium-Arten aus Boden -suspensionen nach MIRCETICH (1971) .

20 g Saccharose100mg Pentachlornitrobenzen (PCNB), techno10mg 8engalrosa10mg MgS04 7 H20I mg Zn020,02 mg CuS04 . 5 H200,02mg M~0,02mg MnCI20,02 mg FeS04 .7 H20100I'g Thiamin-Hydrochlorid17g Maismeh l-Agar , vo rgefer tigt23 g Agar-Agar1000ml Aqua dest.1. Antimykotika (PCNB, Bengalrosa, Vancomycin und Pimar ic in , s . auch un-ten) unmittelbar vor Gebrauch in sterilem Wasser IOsen bzw. suspendieren.

2. Oben angegcbene Substanzen und gewascbenes Aga r -Aga r in dest. Wasser10sen.3. LOsung 30 min bei 121 "C imAutoklaven s te ril isi eren , dann auf e twa 50 "Cabldihlen lassen. Nunmehr zugeben:300mg Vancomycin-Hydrochlorid5 mg Pimaricin10mg CaClz, a ter i l is ier t

4. Agarplatten gie8en, im Dunkeln aufbewahren und am gleicben Tag ver-wenden (vgl. Vorschrift C 27).

30

A 44 Glucose-Alanin-AgarfU r physiologische Untersuchungen (TRINH TAMKmr 1974)

20 g D-Glucose2g AlaninI g KH2P040,5g K2HP040,5g CaCI2I g MnS04 . 7 H200,5 mg Aneurin-Hydrochlorid2 ml ~ Spurenelementelosung (z. B. A 63, A 64)2 ml Eisen-EDTA (5 . unten)30 g Agar-Agar

1000 ml Aqua dest.pH-Wert nach dem Steril isi eren: 4 ,9.Eisen-EDTA:

0,695 g FeS04 .7 H200,93 g Na2-Ethylendiamintetraacetat (EDTA, Handelsname "Chelaplex III")100ml Aqua dest.

A 45 MaIz-Hefeextrakt-Agarzur Bestimmung tier Wacbstumsrate von Pilzen (BRACANTO& GolDEN 1953undOoUNDERO 1980)

20 g Ma1zextrakt2,5 g Hefeextrakt0,2g NaN030,05g KO0,05g Na-Glyc::erophosphat0,03g KzS040,01g FeS04 . 7 H20IS g Agar-Agar

1000ml Aqua dest.A InIIerk .. :Die K.uhuren \WJ"den 5 Tage be i 10, 15,20,45 und S O C bebriitet.Ein einfacheres Rezept fU r Malz-Hefeextrakt-Agar (CCM Hmo 1982)sieht vor:

S O g Malzextrakt2 g Hefeextrakt20 g Agar-Agar1000 ml Aqua dest.pH-Wert 5,6 einste11cn.Steri1isieren im Dampftopf, je 30min an 3 aufeinanderfolsenden Tagen.

31


16/91

A 46 NihrbOden fU r CeUulasenachweismittels Clearing-Test nach RAUTELA & COWLING(1966)a) Nibrbodeo 1

5 g Cel lu lo sepulver (Schleicher & Schilll 123a)2g NH4HzP04Ig KHzP04I g Hefeextrakt0,5 g MgS04' 7 HzO55mg CaClz5 mg Fe-Citrat4,4 mg Znso4 7 HzO5mg MnS04 '4HzO1mg ceo, '6HzO20 g Agar-Agar

1000 ml LeitungswasserpH-Wert : 5 ,6 .b) Nibrbodeo 2

2g NH4HzP040,6g KHzP040,4g KzHP040,9g MgS04 7 HzO0,5 g Hefeextrakt4mg Adenin8 mg Adenosin

100 ug Aneurin-Hydrochlorid20g Agar-Agar1000 ml Aqua dest.e) HersteDung der siureaufgesc:hlosseneo Cellulose(W. HIRTEbriefl.)1. 10 g Cellulosepulver (s. oben) mit 500 ml eisgekiihlter Phosphorsaure(SOcy.,ig)versetzen.2. 2 h be i 4 C riihren.

3. Die viskose Losung mit einer eisgekiihlten 5 cy.,igen N~C03-Losung inAqua dest. suspendieren und teilweise neutralisieren.

4. Ober eine Porzellannutsche abfiltrierem5. Siu re-Cellulose mit e isgekiihl te r N~C03-Losung so lange waschen, b is dasFil trat neutral ist .

d) Herstelluog des Nibrbodeos 2 fiir den CIearing-Testl.Agar-Agar abwiegen, 5 min unter flieBendem Wasser waschen, danachWasser weggieBen.

2. Die iibrigen Substanzen (auBer Aneurin-Hydrochlorid) zusammen mit demAgar-Agar in 1000 ml Aqua dest. losen.

3. Kurz autoklavieren.4. Durch Papierfil ter fil tr ieren,5. Ca. 2 g s iiu reaufgeschlossene Cellulose (s. oben) zugeben. Bereehnung derZugabemenge: Gewichtszunahme de r durch Phosphorsiiure aufgeschlos-senen 109 Cellulose wird gravimetrisch ermit telt ; entsprechend der Zunahme

32

A47

A48

wird 115 der aufgeschlossenen Cellulose den 1000 ml Nihrboden 2 zuge-setzt.

6. Dem autoklavierten und filtrierten Medium vor dem AusgieBen Aneurin-Hydrochlorid zugeben .

. 7. pH-Wertauf5,Oeinstellen.S . Niihrboden in Rohrchen gieBen, di ese senkrecht s te llen.Anmerklllll:Durchfuhrung und Auswertung des Tests s . Vorschrift F 24.

Tanninsiure-Agarzum Nachweis von Polyphenoloxidasen (NOBLES 1965)

15g Malzextrakt20 g Agar-Agar5 g Tanninsaure (oder Gallussaure)1000 ml Aqua dest.

Herstellung wie Malz-Agar (MEA, s. Vorschrift AI). Der pH-Wert mulljedoch zwischen 5,6 und 6,5 l iegen.Anmerklllll:HOLUBOvA-JBCHovA1971) gibt nur 0,8 g Tanninsaure auf II an.

NihrbOden zur Best iJDmung der pektolytischen Aktivitit5 g Pektin (Citrus oder Apfel)1 g Hefeextrekt15g Agar-Agar500ml Mineralsalzlosung (s. unten)500 ml Aqua dest.

MJoeraIsaIzIiis:2g (NHJZS044g KHzP046g NazHP040,2 g FeS04 7 lIzO1mg cso,10 Il& H3B~10 llg MnS0470 Il& znS0450l lg CuS04IOllg Mo031000ml Aqua dest.

.>:Einstellung des pH-Wertes:fU r Pektatlyase-Bestimmung pH 7,0 direkt einstellbar; fUr Polygalakturonase-Bestimmung pH 5,0: Medium ohne Agar-Agar doppelt konzentriert herstel len,Agar-Agar und Basahnedium getrennt auf ca. 48 C abkiihlen, mischen undsofort Platten gieBen.

3 Kreisel, Methoden 33


17/91

A 49 Arbutin-Agarzum Nachweis von /l-Glucosidase bei PiIzen

5 g Arbutin20g Agar-Agarad 1000mI HefCwasser (Vorschrift A 60)

I. Bestandteile unter Erhitzen imDampftopf bei 100C in Hefewasser losen,filtrieren.2. Zu 5 b is 7 mI in Rohrehen abfiillen.3. 15min bei 121C imAutoklaven sterilisieren.4. Sofort nach der Sterilisation in verfliissigten Agar 2 bis 3 Tropfen I %igewaBrige, steril filtrierte Eisen-Ammonium-Citrat-Losung pro Rohrchenzufiigen und gut durchmischen.5. Rohrchen vor dern Erstarren des Agars schrag legen.

Am ne rk un ge n :Anstelle von Hefewasser kann auch I: 10 verdnnntes Hefe-Autolysat verwendetwerden.Es kann auch Eisen(III)chlorid zugefUgt werden (KOCKovA-KRATOCHvll.ovA,mOndl.).

A 50 Hamstoff-Agarzum Nachweis einer Ammoniakbildung aus Harnstoff (CHRISTENSEN946)

20 g HamstotrI g D-GlucoseIg Pepton5g NaO2g KH2P0412mg Phcnolrot20g Agar-Agarad 1000ml Aqua des t.

I. Bestandteile abwiegen und (auBerHarnstoffund PhenoIrot) in 900 mI Aquadest. imDampftopf losen, anschlieBend filtrieren.2. pH-Wert auf 6,7 bis6,9 einstellen.3. 12mg Phenolrot oder I mI einer 1,2%igen Phenolrotstammlosung zufiigen.4. In Rohrchen zu 4,5 mI abfi il len und im Autoklaven bei 121C steri li -sieren.5. Harnstoff m 100ml Aqua dest. losen und Losung steril fIltrieren.6. Zu dern auf 50 C abgekUhlten fliissigen Agar pro Rohn:hen 0,5mIsterile Harnstofflosung zufiigen und Rohrehen mit kurzer Schragfliicheerstarren lassen.Amnerklmg:Das fU r Bakterlen entwick:elte Medium hat sich nach SBI!LIOER1978) sowie nacheigencn Erfahrungen auch fU r Hefen u. a. PiIze bewihrt . Eine starke HamstotT-stotTspaltung (positive Urease-Reaktion) AuBert sich in einem Farbumschlag desIndikators nlch Rosarot . Eine schwache Nutzung von HamstotT als N-Quelle, dieden meisten Hefen eigcn ist , wird dabei nicht erfaSt (VAN DER WALTcl YAlUlOW1984).

34

A 51 Syntbetisd les M ediumfU r C-Quellen-Assimilationstests (N-base) bei Hefen (VAN DER WALT1970)

5g (NHJ2S040,85g KH2P040,15 g KzHP040,5 g MgS04 7 HzO0,1 g NaO0,1 g CaClz 6 H2010mI SpurenelemcntelOsung (Vorschrift A 63)10mI VitaminlOsung (Vorschrift A 66)10mI Aminosiurelosung (Vorscbrift A 67)ad 1000mI Aqua dest.

pH-Wert: 5,6.I. MineralsaIze in 890 mI Aqua dest. lOsen, Spurenelernentelosung zufiigen.2. AbfiiIlen in Rohrchen zu 9 mi.3. 15min bei 121C imAutoklaven sterilisieren.4. Unter sterilen Bedingungen pro Rohrchen (9ml) zupipettieren:- 0,1 ml Vitaminlcsung, steril filtriert- 0,1 mI Aminosiurelasung, steril filtriert

Anmerkungen: - . . 5 IDas Medium kann auch, um eine bessere BelUftung zu gewahrle~ten, I ? -m -Mengen (Gesamtvolumen) indie Rohrchen abgefiillt werden. In Vorschrift F 615tdannentsprechcnd anders zu dosieren. ..Das Medium wird a1s Fertigpriparat (getrocknet) angeboten (Difco Lab. Detroit,USA). ' .Vor der Beimpfung ist noch die zu testende C-Quelle (s. Vorsehrift F 6) zuzu-fOgen. nschli 0 dBei Zusatz von 2% (wfv) Agar-Agar (im Arbei tsschrit t Iund a ie.. en ~LOsen im Dampftopf) kann da s Medium als Festmed imn verw~det w~den . Dieun ter Punk t 4 genanntcn st eri len Losungen werden dann beim Ausgte8en derRohrchen in die Petrischalen zugefOgt (vgl. Vorscbrift F 7).

A 52 Syntbetiscbes M edi1BD .fiir N-Quellen-Assimilationstests (C-base) bei Hefen (VAN DER WALT1970)

109 D-Glucose0,85 g KHzP040,15 g K,HP040,5 g MgS04 7 HzO0,1 g NaCl0,1 g CaClz 6HzO .10mI Spurenelemcntelosung (Vorscbrift A 63)10mI VitaminIOsung (Vorschrift A 66)I mI AminosiUceIOsung (Vo rs ch rif t A 67)

ad 1000mI Aqua dest.pH-Wert 5,6.

35

-,_/


18/91

I . Mineralsalze in 890 ml Aqua dest.Iosen, Spurenelemente-LOsung zufiigen,2. Abfiillen in Rohrchen zu 9 ml.3. 15m in bei 121C imAutoklaven sterilisieren.4. Unter sterilen Bedingungen pro Rohrchen (9 ml) zupipettieren:0,1 ml Vitaminlosung, steril filtriert0,01 ml Aminosaurelosung, steril filtriert0 ,4 ml Glucoselosung (25%ig in Aqua dest.), s teri l fil tr iertAmn er ku a ge n :Das Medium kann aueh, um eine bessere Deliiftung zu gewahrleisten, in 5-ml-Mengen(Gesamtvolumen) in Rohrchen abgefiillt werden.Das Medium wird als Fertigpri iparat (getrocknet) im Handel angeboten (DifeoLab. Detroit, USA).Vor der Beimpfung ist noch die zu testende N-QueHe zuzufiigen (Vorschrift F 8).'Dei Zusatz von 2% (w/v) Agar-Agar (im Arbei tsschrit t Iund anschliel3endemLosen im Dampftopt) kann das Medium als Festmedium verwendet werden (Vor-schrift F 9). Dei guter Agarquali ti it ist eine Neutral is ierung des Mediums niehterforderlieh. Die unter Punkt 4 genannten, sterilen LOsungen werden dann beim Aus-giel3ender Rohrchen in die Petrischalen zugefiigt.

A 53 SyntbetischesMedimnzur Best immung des Vit aminbedarfs (v it amin -f ree base) be i Hefen (VANDE RWALT1970)

10 g D-Glucose5 g (NH4)2S040,85 g KH2P040,15 g K2HP04O,5g MgS040,1 g NaO0,1 g CaCI2 6 H2010ml Spurenelementelosung (Vorschrift A 63)10ml Aminosaurelosung (Vorschrift A 67)ad 1000ml Aqua dest.

I. Synthetisches Medium fU r C-Quellen-Assimilationstests bei Hefen nach Vor-schrift A 51 bis einschl ieBlich Arbei tsschrit t 3 ansetzen.2. Unter sterilen Bedingungen pro Rohrchen (9 m1 ) zupipettieren:0,1 mI Aminosaurelosung, steril filtriert0,4 mI Glucoselosung (25 %ig in Aqua dest.), s teri I fil tr iert

Amne rk u ag en :Das Medium wird als Fertigpraparat (getrocknet) im Handel angeboten (Difeo Lab.Detroit, USA).Vor der Deimpfung sind noch alle Vitamioe auBer demjenigen, dessen Bedarf b e-stimmt werden soll, zuzufugen (Vorsehrift F 13).

36

A 54 Saccharose-Pepton-Agarzur Pulcherrimin-Bildung bei Me t schn ik owia pu lc herr ima (BEIJERINCK,modi-fiziert nach VANDE R WALT 1952)

40 g Saccharose20 g Pepton2g KH2P04O,5g MgS04 7Hp .0,5 g Ferriammoniumeitrat10ml Hefeautolysat (Vorschrift A 61)20g Agar-Agar

ad 1000 ml Wasser1 . Bes tandtei le abwiegen, auBer E isenammoniumcit ra t in Leitungswassergeben und bei 100 C im Dampftopf losen.

2. Fil trat ion durch weiches Fal tenfil ter.3. Abfiillen zu 7 bis 10 ml in Rohrchen.4. 15m in bei 121C imAutoklaven sterilisieren.5 . Pro Rohrchen 0,1 ml e iner 5%igen (w/v) waBr igen st er il fil tr ie rten Losungvon Eisenammoniumcitrat zufiigen.

6. Vor dem Erstarren des Agars Rohrchen sehrag legen oder Agar in sterilePetrischalen ausgieBen.

Anme rk l ll ll eD :Es gibt auch Stiimme von M. pulche"imIl, die zu keiner FarbstotTproduktionbefiihigt s ind (z. T. aueh Sektorenbildung in Kolonien), so da B dieses Medium nurals zusatzlieher Test zu anderen Identifizierungsmethoden verwendet werden soHte.1m Gegensatz zur Bildung von Puleherrimin bedarf der Nachweis der Syntbesecarotinoider FarbstotTe bei Hefen (z, B. bei Rhodotorula-, Rhodosporidtum- undSporobolomyces-Arten) keiner spezi eHen Medien. Die Bildung von Carot inoid-Pigmenten kann auf aIlen Hefemedien, die rur eine Beurteilung anderer Waehstums-eigenschaften Verwendung finden, erfaDtwerden.Eine Bildung von FarbstotTen aus extern zugefiigten kiinstliehen Priikursoren wirdz .B. bei Cryptococcus-Arten zur DitTerenzierung ausgenutzt (vgl. Vorschrift A 41).

A 55 Weichagarals Trager de r Testkeime (Bakterien, vgl . F 16) zum Nachweis von Antibiotika

14g. NiihrbouiIlon IIFa. Immunpriiparate Berlin)14g Niihragar IIFa. Immunpriiparate Berlin)I()()()l Aqua dest .l.Substanzen in dest. Wasser 10000, im Dampftopf oder Wasserbad er-hitzen.

2. Nach Bedarf in Rohrchen (ie 3 ml) abfiillen.3. Rohrchen imAutoklaven steriIisieren.

37


19/91

A 56 Mineralsalzmedimn~.' ,. (HORNEI, K~HLER.& WEIDE 1972)$:_. 5 g NH.H2PO.2,5g KH2PO.1g MgSO. 7Hp

20mg Ca(N03)2 .4 H202 mg FeCI3 6 H2010ml Spurenelementelosung (Vorschrift A 64)ad 1000 ml Aqua dest.pH-Wert fii r Fli issigmedium: 5,4;pH-Wert f ii r Fes tmedium: 6,5.Alllllerkllllpll :Da s Medium is t - : mit 2% A~ sowie mit einer st er il f ilt ri ec ten Vi taminlOsung(A 65 ) SUpp1ementlert - fU r die Testung der Ass imil ati on verschiedenst er C-Quellen durch Pi1ze einsetzbar.Besonders bewihrt hat sich das Medium zur Kultivierung von Hefen auf Kohlen-wasserstoffen.

AS7 FliissigesNihrmedium fU r phytoparasitische Pilzenach WEDDING& KENDRICK (1959)

7,8 g D-Glucose1,92g Asparagin2,37 g NH.N031,5 g KH2PO.1 g MgSO. 7 Hp0,1 g cso,0,5 ml SpurenelementelOsuog (s.uoten)0,01 g Fe(NHJ(SO.h0,2~ Thiamin1000ml Aqua dest.

HoagIaads Spu reoe lemeat el ii suag (ver e in f a cb t )I g H DO /1/1),"'.3 3 (0,2 g ZnSO . 7H20 0,.20,2g Co(N03)2 . 6 Hp c ? ) - :;1 g N~-Ethylendiamintetraacetat (EDTA)11,5g MnCI2 4Hp ./1, r;0,2g CuSO. 5Hp /";):0,2g N~MoO. C , ;;1000ml Aqua dest.

Ni ibnnedium nach obigen Angaben zusammenstelIen. F il tr ie ren i st n iehterforderlich.pH 6 ,8.

38

~~T~A 58 Fliissiges Nihrmedimn fiir MykorrhizapHze

fii r physiologische Untersuchungen (MncOLA 1948, LAmo 1970)20 g D-Glucose5 g NH.-Tartrat1 g KH2PO.0,5 g MgSO. 7 Hp0 ,5 ml FeCI2 (1%ige LOsung)0,5 g ZnSO. 7 Hp0,5 g MnSO. 4 a,o5 ml Cac~ (0,1 M LOsung)50 I1g Thiamin

1000ml Aqua dest.1. Subs tanzen in Aqua dest. l asen.2. Losung 20 min bei 121C imAutoklaven sterilisieren.3 . Je 25 ml Nib rlOsung in sterile Erlenmeyerkolben abfiillen.Attmerk.... :Kulturen von C~coccum, Paxil lus u. a . werden 26b is 28 Tage bebr iit et.

AS9 MaJzextraktzur Kultivierung und morphologischen Charakteris ierung von Hefen (LoDDER&KREGER-VANRu 1952)1000 g Malz2600 ml Wasser

1. Malz (geschrotetes Darrmalz/Malzschrot, aus Brauereien beziehbar) in2,61 Wasser geben.

2. Mischung imWasserbad unter s tindigem Riih ren b is 45C 3 h erwiirmen,danach nochmal s f ii r Ih bei 63C.

3. Mischung durch ein Haarsieb oder Tuch fil tr ieren.4. Filtrat 15 min b ei 121C autoklavieren.5. Durch grobes Papierfilter filtrieren.6. Filtrat mit Wasser verdiinnen auf eine s p c z D I S C h e Diehte von 1,06 g/cmJ(en tspr icht 15BaUing-Grad, s. FuBnote S. 40) .

7 . pH-Wert priDen und gegebenenfalls auf ca. 5,5 nachstelIen. (Fur lsolierungs-und Anreicherungszwecke pH-Wert auf 3,7 e inst eI len, jcdoch n ieht , wennMalzextrakt zur Herstelhmg von Agarmedien wciterverwendet werden solI.)

8. Abf iil Ien in Kolbchen oder Rohrchen (Vorschr if t A 70) .~:Dieses Medium wird von verschiedenen FinneD a1s Trockenpriparat angeboten. E swerden dabe i 15 g des pulveri sie rt en Ma1zext rakt sin 1 I Aqua dest . im Dampf-topf gelOstunci anschlieBend wie oben abgefiillt und sterilisiert.

Anste11e der uo te r Punk t 8 angegebenen Steril is ie rung i st es auch mogl ich, an3 aufeinanderfolgenden Tagenje 1him Dampftopf (100 "C) zu sterilisieren ..[)as'Medium ist vergleicbbar der aus Brauereien beziehbaren Bierwiirze (helle Vor-derwtlrze), wenn deren Zuckergehal t auf den oben (Punkt 6) angegebenen Wertein~guliertwird.39


20/91

Nach andercn Rezepturen wird die Bierwiirze (z. T. nach Istiindiger Behandlung bei100 C im Dampftopfund anschlieBender Filtration) mit Leitungswasser auf 7Balling-Grad") (bzw. Masse- % an loslichen ExtraktstofTen) verdiinnt.

A 60 HefewasserGrundsubstrat fU r verscbiedene Tests zur Identifizierung von Hefen (KOCKovA-KRATOCHViLovA,miindl.)

50 0 g PreBhefe5000ml LeitungswasserI. Pre6hefe in Lei tungswasser suspendieren und I h be i 100 C imDampftopferbitzen.2. Absetzen lassen, Uberstand dekantieren und fil tr ieren.

3. In I-I-Kolben zu je 500 ml abfiillen und an 3 aufeinanderfolgenden Tagenje I h bei 100 C imDampftopf sterilisieren.

4. Aufbewahrung als 10%iges Hefewasser im Kiihlschrank.5. Vor Gebrauch mi t ste ril em Leitungswasser I : I verdiinnen (=5%iges Hefe-wasser).

Nach einer anderen Vorschrift (LoDDER& KREGER-VANRu 1952) wird folgender-maBen verfahren:

20 0 g PreBhefe1000ml LeitungswasserI. PreBhefe in Leitungswasser suspendieren.2. Etwas HiihnereiweiB zusetzen und 15min bei 121C autoklavieren.3. Noch heiBe Mischung durch dickes Filterpapier filtrieren,

A 61 HefeautolysatGrundsubstrat zur Kultivierung von Hefen500g PreBhefe500ml Leitungswasser1 m 1 Toluen (Toluol)

I. Pre6hefe (Biickerhefe) in Wasser geben; zur Beschleunigung der Autolysekann wenig Toluen zugefligt werden.

2. Fliissigkeitsstand imGefii13 mit wasserunlOsliChem Filzstift markieren.3. Mischung 3 Tage in e inem Wasserbad bei 50 bi s 55 DCunter gel egentl ichemRiihren inkubieren.

4. Verdunstetes Wasser mit Aqua dest. bis zur Markierung wieder auf-flillen.5. Kurz aufkochen, danach abkiihlen.6. Einstellen des pH-Wertes auf 6 (mit I NKOH).

.) Balling-Grad - Grad einer naeh dem osterreicbischen Chemiker K. J.N. BALUNG(1805-1868) benannten Ariiometerskala (Saccharimeter), die den Zuckergehalt derwiiBrigenLosungen angibt. I Balling-Grad (auch: B)= I Masseprozent Zucker.

40

,7. Durch weiches Papierfilter (Faltenfilter) bzw. ein Tuch filtrieren oderdie nieht Iysierten Hefebestandteile durch Zentrifugat ion abtrennen.

8. Der Oberstand kann - falls er noch triib ist - auch noch mit Eiweillgeklart werden (Zugabe des abgetrennten Eiwei6es eines Hiihnereies zudem auf ca. 60 C erwarmten Fil trat , aachfolgend dekantieren).

A 62 Glucose-Pepton-Hefeextrakt-Malze~akt-Medium(yMbroth)(WICKERHAM 1951)

lO g D-Glucose5 g Pepton3 g Hefeextrakt (getrocknet)3 g Malzextrakt (getrocknet)ad 1000ml Aqua dest.

I . Bestand te il e abwiegen und in Aqua dest. losen,2. Falls notig, nachstellen des pH-Wertes auf 5 bis 6.3. Abf ii ll en zu 5 oder 10 ml in Rohrehea.4. 15 min bei 121C imAutoklaven sterilisieren.Anmerkung: .Zur Isolierung von Hefen wird der pH-Wert des Mediums auf 3,5 eingestel lt . Wenngarende Hefen isoliert werden sollen, kann das Medium mit einigen Millilitern sterilenParaffins iiberschichtet werden, um einer Entwicklung filamentOser Pilze entgegen-zuwirken.

A 63 SpurenelementelOsungU r synthetischeMedien(WICDlRHAM & BURTON 1948)

50mg H380340mg MnS04 4 H2040 mg ZnS04 7 Hp20 mg FeCl3 6 Hp20m g N~Mo04 . 2 Hp10mg KJ4mg CuS04' 5 Hp1000ml Aqua dest.

Dem jeweiligen zu supplementierenden Medium werden vor der Steri lisationund moglichst vor dem Auffi il len des Mediums auf das Gesamt-Fl iiss igkeits-volumen to ml dieser SpurenelementelOsung pro Liter zugef1igt.

41


21/91

/A64 Spurenelementeliisung fdr synthetische Medien

(F'RrrscHE 1968)50mg H3B0340 mg MnS04 4 H2040mg Znso4 7 Hp20mg NIlzMo0410mg CuS04' 5 Hp10mg COC1210mg KJ1000ml Aqua dest.

Dem jeweiJigenzu supplementierenden Medium werden vor der Sterilisationund mogliehst vor de m Auffiillen des Mediums auf das Gesamt-FIiissigkeits-volumen 10ml dieser SpurenelementelOsung pro Liter zugefiigt.

x

A6S Vitaminliisung fdr syntbetische Medien(VAN DERWALT& vAN.KEltKEN 1961)

20mg p-Aminobenzoesiure0,2 mg Biotin0,2 mg Folsiiure200 mg myo-Inosi tol40mg Nicot insi iure40mg Pantothensiure, Ca-SaIz40 mg Pyridoxin (-Hydrochlorid)20 mg Riboflavin

100mg Thiamin (-Hydrochlorid)1000ml Aqua dest.Oem jeweiligen zu supplementierenden, abgekiihlten Medium werden nachder Sterilisation desselben 10ml dieser vorher steril filtrierten LOsung proLiter zugefligt.Die sterile VitaminlOsung kann, abgefiillt in 5- bis lO-ml-Mengen, be i -10bis -15C aufbewahrt werden. Diinnwandige Glasrohrchen soll ten beimEinfriervorgang vorsiehtshalber schriig gelegt werden.

A-m-c:Die Vitaminlosung nach VAN DEll WALT&: VAN Kmuu !N stellt eine Modifikation derVitaminlosung nach WIClU!RHAM1951) dar, in der nur 40mg Thiamin pro LiterStammlOsung enthalten sind.

A66 Vitaminlfisung fiir syntbetische Medien(VAN DERWALT1970)

20 mg p-Aminobenzoesiure2mg Biotin0,2 mg Folsiure1000mg myo-Inositol20mg Nicot insiure

200mg40mg20mg40mgl000ml

PantothensiurePyridoxin (-Hydrochlorid)RiboflavinThiamin (-Hydrochlorid)Aqua dest.

Weitere Handhabung s.A 65.42

A67

A68

A69

\

\ : " 'Aminosiureliisung fiir syntbetische Medien(WICKERHAM &BURTON 1946)100mg L-Histidin (-Monohydrochlorid)20 0 mg DL-Methionin200mg DL-Tryptophan100mI Aqua dest.Dem jeweiligen zu supplementierenden Medium werden nach der Sterili-sation desselben i. d. R. 10ml dieser, vorher steriI fiItrierten LOsung proLiter zugefUgt; bei N-Assimilationstests jedoch nur 1mI pro Liter.Es empfiehlt sieh, dieLOsung,abgefiillt in 5-bis 100m1-Mengen,klihl und nur

kurzzeitig aufzubewahren.

Raulinsche LOsungzur Reinigung von Hefekulturen von Bakter ien (vgl. C 26) (RAUUN 1870,Boom 1971)S tammII Ie Img I : 70 g Kandiszucker

40 0 mI Aqua dest.s'....... n. 4g Weinsiure4g NH4N030,6g (NHJ2HP04O,6g ~C03O,4g MJC030,25 g (NH4)2S040,07 g ZnS04 . 7 H200,07g ~Si030,07g FeS04 .7 Hz01100mI Aqua dest.Beide LOsungengetrennt autoklavieren, erst vor Gebrauch vereinigen.Hefen in dieser LOsung5 bis 10 Tage bei 37C anziehen.

Aufbewahnmg von NihrbOden inErlenmeyerkolben1. Hei8en Nihrboden durch einen Trichter in saubere Erlenmeyerkolben ein-fiillen. Dabei darf der Hals des Kolbens innen nicht benetzt werden.2. Kolben mit Watte oder ZellstofTverschlieJ3en.3. linAutoklaven 30min bei 121C sterilisiercn (Vorschrift B 3/4).4. Nihrboden abkiihlen und fest werden lassen. Stopfen mit Folie ver-schIieJ3en.Aufbewahrung der Kolben im Kfihlschrank oder Kiihlraum.5. Vor neuem Gebraueh ist der Nihrboden im Wasserbad oder Dampftopfbis zur Verfllissigung zu erbitzen. AgarnihrbOden diirfen niemals liberofTenerFIamme erbitzt werden! 6. Falls nur ei n Teil des Nihrbodens ausgegoSlCllwurde, ist der Hals d e sKolbens innen mit Nihrboden benetzt; daher muS der Rest des Nihr-bodens wie unter 1.in einen anderen Kolben umgefiillt werden.

43


22/91

/ A 70 Einflillen von NihrbOden in Kulturriihrchen1. Die gut gereinigt en Rohrchen (l60x 16nun) in Geste llen senkrech t auf -stellen.2. Den im Wasserbad erwiinnten Niihrboden dureh einen Glastrichter (odermit einer Pipette) einfiillen. Dabei darf der Agar die Wand der oberenHiilfte des Rohrchens n irgends bene tzen. Daher mull der Tr iehte r bzw. diePipet te immer mit i iuBerster Vorsieht eingef1ihrt werden, damit der am un- .t eren Ende hi ingende Agart rop fen n ieht di e Rohrchenwand beriihrt.

3. Zur Herst ell ung von Schr iigagar werden d ie Rohrcben bi s zu 1/4 oder 1/5 ihrerHohe (ca. 7ml)gefiillt.4. Zur Vorbereitung von Petrisehalen konnen groBere Rohrchen verwendetwerden. In j edes wi rd e ine der GroBe der Petr ischa le ent sprechende MengeNiihrboden eingefullt, z. B. je naeh vorgesehener Kulturdauer 10mloder 20 ml flir lO-cm-Schalen.

5. Die Rohrchen werden sofort mit Watte- oder ZellstofTstopfen verschlos-sen. Steri lisieren nach Vorschrift B 3/4.6. I bis 2 Tage spater, wenn da s Kondenswasser verdunst et i st , werden d ieStopfen mit Folie iiberzogen.

Aomerkung:Zur Herstellung von Schragagarrohreben fUrStammkulturen unter Paraffinol werdengeringere Mengen von Niihrboden eingefiillt: vgl. Vorschrift D 6.

A 71 Herstellung von SchrigagarrObrchenI. Niihrboden nach Vorschrift A 70 einfiillen und nach Vorsehrift B 4 sterili-sieren.

2. Sofort nach dem Sterilisieren werden die Rohrehen mit de m noch fliissigenNiihrboden so geneigt , da B die gut verschlos sene OfTnung auf e iner e twa5 nun hohen Holz le is te li eg t. Der Niihrboden so li 3/5 oder 2/3 ( fUr Stamm-haltung un ter Paraf finol nu r 1/4 bis 1/5) der Lange des Rohrehens erreiehen("Agarzunge") ; gl eichzeit ig so li di e Oberf l8che des Niihrbodens den hin-te rs ten Winkel des Rohrchens erreiehen (Abb . 1 ).

Abb. i3. Es is t unbed ingt zu venneiden, da B der Nihrboden di e Wand des oberenDri ttels des Rohrchens benetzt .

4. Der Niihrboden wird binnen 15 b is 20 min fest. Danach sind die Rohrchenfertig zur Beimpfung.

A 72 Gie8en von Agar in Petrischalen1 . Die in Petr iseha lenbuchsen befind li ehen oder in Pap iergewickelt en Pet ri-sehalen werden im Hei81ufts teri lisator (Vorschrift B 5) oder im Autoklaven(Vorschrift B 3/4) sterilisiert.2. Die fUr jede Petr ischa le erforderl iehe Menge Ni ih rboden wird in Kultur -rohrchen naeh Vorschrift B 3/4 sterilisiert.3. 1m Impfraum wi rd der Deckel der Petr ischa le e inse iti g angehoben und de rverfliissigte, auf ca. 55C temperierte Inhal t eines Rohrchens hineingegos-sen, naehdem die Miindung des Rohrchens abgeflammt wurde.

4. Binnen 15b is 20 min kiihlt sieh der Agar ab und wird fest. Danach sind diePetrischalen fertig zur Beimpfung.

Anmerkungea :FUrcinePetrischale von 10em 0werden in der Regel 10ml, bei vorgesehener liingererKultivierungsdauer (>7 Tage) 20 ml Niihrboden benotigt.1mRoutinebetrieb vieler Laboratorien wird der Agar direkt von Niihrbodenflaschenin Petrischalen abgefiillt, wobei die Agarmenge je Petrischale zwar nicht genau dosiertwerden kann, jedoch viel Zeit gespart wird. Bewiihrt haben sich auch automatischeAbfiilleinrichtungen.Agarmedien lassen sich besser beimpfen, wenn man den Agar nach dem Abkiihlen

erst einige Stunden stehen liiJ3t.

A 73 Glycerol-Nitrat-Agar (G25N)zur Bestimmung de r Wachstumsrate (Koloniedurchmesser) von P en ic il li um - .Arten (Prrr 1979)250 g Glycerol p.a.7 ,5 ml Czapek-Konzentrat (s. unten)3,7 g Hefe-Autolysat (A 61) ode r Hefeextrakt0,75 g K2HP0412 g Agar-Agar

750 ml Aqua dest. oder LeitungswasserAomerklmgell:Czapek-Konzen trat enthi il t 30 g NaN03 5 g KCI, 5 g MgS04 . 7 H20 und 0,1 gFeS04 7 H20 auf 100ml Wasser. Es ist ohne Sterilisation unbegrenzt haltbar. EinNiederschlag von Fe(OHb kann durch Schiitteln vor Gebrauch wieder suspendiertwerden. Das Konzentrat wird Medien zu 1% des Wasseranteils zugesetzt.Petrischalen mit G2SN miissen beimpft werden, wenn der Agar frisch gegossen ist;der Niihrboden ist vor Austrocknung zu schiitzen.

45


23/91

B S te r il is ie rung und Desi nf ek ti on

Sterilisierung ist das Abtoten oder Entfemen aller lebensf"ahigen Vegetat iv-und Dauerfonnen von pathogenen und apathogenen Mikroorganismen inStoff en, Zuberei tungen und an Gegenst inden.Unter Desinfektion versteht man dagegen einen Vorgang, bei dem totes'

oder lebendes Material in einen Zustand versetzt wird, in welchem es nichtmehr mf iz ie re n k an n . 1m Gegensatz zu r Steri lisation werden bei der Desinfek-tion (z. B. des Arbeitsplatzes, Vorschrift B I) nieht aile Keime vernichtet.Das Z ie l der Desinfek tion besteht darin, Infektionsquellen auszuschalten undInfekt ionen durch Verschleppung pathogener Keime zu vermeiden. Gle ich-zeit ig werden Kon tamina tionen der Kulturen durch unerwiinschte Keime er-heblich vennindert.Die Steri lisation von GlasgefiiJ3en und -geri iten sowie anderer t rockener Ma-

t er ia lien erfolgt in der Regel im HeiBlu fts te ril is ato r (Vorschr if t B 5), die vonNl ih rmedien in Kolben oder Rohrchen im Autoklaven (Vorschr if ten B 3, 4) .Saure Agarnlihrboden (PH 2 bis um 4,0) verfestigen sich oftmals nichtnach de m Autoklavieren. In diesem Faile kann man sich mit folgenden

MaBnahmen helfen:I. Der saure Bestandteil wird gesondert autoklaviert und erst beim Ab-

kOOlen dem Agarnahrboden beigemischt.2 .Der Nahrboden wird nicht autoklaviert, sondem dreimal30min imDampf-

topfsteri lisiert (diese Methode eignet s ich nieht fU r sehr saure NahrbMen mitpH < 4,0).Quecksilberhaltige Medien konnen den Autoklaven durch AblOsen de r

Kupferbeschichtung stark beschlidigen. Mit Hg-Verbindungen iiberschichteteMed ien in Rohrchen oder Platt en d ii rfen daher n icht autok lavie rt werden.

B1 Desinfektion.des Arbeitsplatzes1 . Arbe its raum von allen iiberf lii ss igen Staubf"angem (z. B. Bla ttpf lanzen,Blumen, gebrauchte Glasgerate) frei hal ten. BUcher, Flaschen, Glasgerateusw. in geschlossenen Schranken aufbewahren.

2 . S te ril es Arbe it en erfolg t am best en un ter e iner Laminarbox. Wo eine so lcheDieht zu r Verfi igung steht , Raum 30 min vor Beginn der Arbe it mit e inemVers tiuber mit Wasser e innebe ln , um Kontamina tionen aus der Luft starkzu vermindem.

3 . Tischf lachen mit e inem geeigneten Desinfek tionsmit te l ( s. Vorschr if t B 2)reinigen.4. Arbe it sger ii te mit E thanol (70%) waschen und dann abf lammen.

46

Aume r lcun gea :Eine weitere Keimverminderung in geschlossenen Riumen kann durch Bestrahlungmit UV-Licht (z.B, Quecksilber-Niederdrucldampe mit einer Wellenliinge desUV-Lichtes von 2 5 4 nm) oder in har tni ckigen Fil len durch Verdampfung bzw.Vemebelung von Chemiblien (z. B. Formaldehyd: 5 g pro m3 Raum, .6 bi s 8 h ) er-reicht werden. Personen konnen dabei nicht im Raum verbleiben.Pilzsporen erweisen sich allerdings als besonders UV-resistent, so da B UV-Licht immykologischen Labor nur beschriinkt wirksam ist.

\

B2 Gebriuchliche DesinfektionsmittelEinige fU r .das mykologische Laboratorium geeignete, aIlgemein gebrl iuch-li che bzw. in der DDR handelsii bl iche Desinfekt ionsmit te l und deren Anwen-dungsbedingungen sind der Tabel le 1zu entnehmen.Tabelle I. Gebriuchliche DesinfektionsmittelWirkstoffiyp Name Verwendung Wir1cungsbedingungen

Konzen- Einwir1c-tration zeitAlkohol Ethanol Hiindedesinfe1ction 70bis 80% Ibis 5 minn-Propanol Hiindedesinfe1ction 40 bis 60% Ibis 5 minFormaldehyd Formaldehyd- Wiischedesinfe1ction 2 bis 4% 5 bis 10 hLOsung (30 %ig)Formaldehyd- Raumdesinfe1ction 5 g/m3.) 6 bis 8 h

GasFesia-form t Wiischedesinfektion 2 bis 4% 5 b is 10 hFlichendesinfe1ction 2 bis 5% 4hQuarternire C4 Hindedesinfe1ction 2% 2 minNH4 -Verbindg. Fesia-mon Hindedesinfe1ction 2 bis 3% 2 minPhenolderivat , Fesia-sept. Wiischedesinfe1ction 2 bis 3% 5hhalog. Benzyl- Konz, Hiindedesinfektion 1% 2 minph~?1 Fliichendesinfe1ction 4% 4hHalog. Kresol, Wofasept Wiischedesinfe1ction 4% 5 bis 10 hhalog. Benzyl- HiindedesiDfe1ction 2% 2 minphenol Flichendesinfektion 4% 4hWofasept WiisOOedesinfe1ction 4% 5-IOh

spezial HiDdcdesinfe1ction 2% 2 minFlichendesinfe1ction 4% 4hWofasept- Hiindcdesinfe1ction 3 bis 4 - cm - 2 min~it"engelee StrangXylenole K.resomerJat Wischedesinfe1ction 2%, 5 bis 10 hFlichendesinfe1ction 4 bis 5% 4hVersch. Wir1c- Fesia-cito Hiindedesinfe1ction 5 bis 10 ml 4 minstotTtypenPeressigsiiure Wofasteril Hiindedesinfe1ction 0,3bisO,S% Ibis 5 min.) Substanzmenge verdampfen oder vemebeln

47


24/91

Amnerkllllg:~ii r d i~ Desinfekt ion von bewachsenen Kulturmedien oder von mit Mikroorganismen10 Ber ti hrung gekommenen Ku lturgei aBen , P ipe tt en, Ger ii tseba ft en u sw . konnen d ieoben genannt en Bed ingungen f ii r e ine Wische- oder F li ehendes in fe kt ion angewendetw~r~en, falls nieht eine AbtOtung der Keime im Autoklaven (in speziellen Alu-miniumkesse ln) durehgefi ihrt wird.

B3 Sterilisierung in einfachen Autoklaven1. Autoklaven offnen, Wasserstand kontrol lieren, evt l. nachfii llen.2. Gestell mit den zu sterilisierenden Sachen einsetzen.3. Deckel schlieBen (dabeijeweils gegeniiberstehende Schraubennacbeinanderfestdrehen).4. Ventil schlieBen.

5. ~uto~laven heizen, bis der Druck in ihm 1a tm erreicht; bald daraufmuBs ic h eme Temperatur von 121C einstellen.6 . Venti l vorsichtig of fenen, so daB sich wi ih rend der vorgeschr iebenen Zei t( 15 , 2 0 oder 30 min) ein konstanter Druck von 1 atm halt.7. Heizung abstellen und Ventil so weit offnen, daB der Druck sehr langsamauf 0 zuriickgeht.8. Ventil ganz offnen und Deckel offnen (dabei Vorsicht: heiBer Dampfentweicht!).9. Gestell herausnehmen.Amnerk ... :Vorstehende Anleitung bezieht sich auf kleine Autoklave: ilterer Bauart wie siebe sonder s i n Entwick lungs li ndern noeh ange trof i' en we rden. An de rar ti gen Ge rat en(~d in ameri~en Pu~likationen) kann der Druck aueh in psi oder in Ibs(bb~) angegeben sem , wobei folgende Umreehnungsverhi il tni sse ge lt en :7 pSI = 7 Ibs = 0,47 at entsprieht 110 CII psi = II lbs = 0,73 at ents prieht 116 C15 psi = 151bs = 1,00 a t en tspr ieh t 121C20 ps i = 20lbs = 1 ,33 a t en tspr ieh t 126CUmrechnung in kPa s. S. 167.

B4 Sterilisierung in elektrischen Autoklaven1. Deckel. offnen, Wasserstand priifen und notigenfalls Aqua dest. nach-fii llen b~ der crforderl iche Stand erreicht ist (Anzeige imGlasrohrchen),

2. Oberpriifen, da B der StrOmungshahn geoff net ist .3 . Die zu steri lisierenden Sachen einstel len.4. Sicherung losen, Deckel schlieBen und festdrehen.5. Strom einschalten; warten, bis das Thermometer etwa 100 DC anzeigt undaus dem StrOmungshahn Dampf ausstromt,

6. Stromungshahn schlieBen. Der Druck s te ig t danach au f 1a tm, die Tempe-ratu r auf 121C und b le ibt automat isch so stehen.

7. Sobald diese Werte erreicht sind, Laborwecker einstellen. Je nach Vor-schrift 15,20 oder 30 min autoklavieren.8. Nach Ablauf der Zeit e lek tr ische Heizung ausscha lten.

48

B5

9. Stromungshahn sehr l angsam (!) of fnen, Hahn rur Wasserki ih lung offnen ,Druck allmahlich (in etwa 10 bis 15 min) auf 0 atm absinken lassen.1 0 . De ck el losdrehen, mit Pedal offnen; Sicherung einschieben.

11. Sachen herausnehmen.12 . Hahn fUr Wasserkiihlung schlieBen.Amnerkungea :Leere Petrischalen wer den gut gerenigt, in Papier (Zeitungs papier) gewiekelt und30min au tokl avi er t. B is zum Gebrauch l iiBt man die ste ri lisier ten Petrischa len einge-wiekelt. Meistens werden Petrischalen jedoch trockensterilisiert.Inde r Regel au tokl av ier t man bei 121 DC15b is 20min. Zur Ster ifisierung g rcBe-rer Volumina (mehr als 11 Medium) sind liingere Sterilis ationszeiten, bis zu 60 min,notwendig,Zur Kontrol le de s S ter il isat ion se ff ek tes sol lt e ge legen tl ie h eine ger inge Menge (3g )getrockneter Gartenerde, in Filter papier doppelt eingewiekelt, mit autoklaviertwerden. Die darin entha ltenen relat iv hitze resistenten Sporen, z . B. von Bacil lus-Arten,diirfen nach dem Sterilisationsvorgang, mit der Erdprobe in Nahrlos ung gebr aeht,n ieht mehr lebensfahig sein.

Trockensterilisierung im HeiBluftsterilisatorIm HeiBluf ts te ri li sa to r werden Gegens tande aus Glas, Porze ll an und Meta llsterilisiert."1 . Die gut gewaschenen Petrischalen, Pipetten, Biiretten, Kaniilen, Instrumenteetc. werden in geeignete Behii lter eingebracht . Fii r Petrischalen verwendet

man z. B. zyl indrische Petrischalenbiichsen mit enthaltenem Leichtmetal l-stander (zur vere infachten Herausnahme der Pet rischa len) , f iir P ipettenentsprechende Pipettenbiichsen aus Glas mit Leichtmetallkappe oder ausMetall.Fa lls derarti ge Behi il te r ni cht zur Verfiigung stehen, wickelt man dieGegenstande in Aluminiumfolie oder in Papier (z. B. Zeitungen) ein -wenn moglich, mehrere in kleinen Piickchen abgepackt, Bei Pipetten aufde m Papierpackchen Sei te des Mundsti icks markieren.

2. Behal ter oder eingewickel te Gegenst iinde in den HeiBlufts teri lisator s tellenund Temperatur ansteigen lassen.

3. Bei 1 80 D C 1 h steri lisieren, fal ls Glas- oder Metal lbehiiher verwendet wer-den. In Papier eingewickel te Gerii tschaften miissen 2 h. bei 15 0 bis 160 D Csteri lisiert werden, um ein Verkohlen de s Papiers zu verhindern.

4. Nach Ablauf der Sterilisationszeit Abschalten der Heizung und nach Ab-ki ih len Ster ili sa tionsgut herausnehmen; bi s zum def in it iven Gebrauch inBehal tern bzw. in Papier eingewicke1t lassen.

Amnerk lmgen :Roh rchen mi t Metal lve rschluB (Kapsenberg-Kappen ) und andere gut ve rsch lo sseneGe fi J3 e brauchen n ieh t i n Behi il ter g es tel lt ode r eingewieke lt zu we rden.Anste lle e ines HeiBluftste ri lisa tors kann aueh e in Trockenschrank bzw. Trockenofen

zur Ste ri lisierung verwendet werden.

4 Kreisel,Methaden 49


25/91

B6 Entkeimung durch FiltrationDureh Fil trat ion lassen sieh F1iissigkei ten mit hitzelabi len Bestandteilen ent-keimen oder Gase keimarm machen, Die "Sterilfiltration" f iihrt zur Ent-femung von Bakterien und PiIzen. Nieht zuriiekgehalten werden L-Formen vonBakterien, Viren sowie StotTwechselprodukte von Mikroorganismen. Als Fil -termateriaI konnen gesintertes Glas (Jenaer Bakterienfilter nach SCHorr),unglasiertes PorzelIan (Chamberland-Fi lter), gepreBte Kieselgur (Berkefeld-Filter), Asbest (Seitz-Filter), dicht gepackte Watte (Wattefilter) oder ver-sch iedene synthe ti sche Materia lien (Membranf il te r) eingeset zt werden . Zurmechanischen Abtrennung von Mikroorganismen durch Jenaer Bakterienfi lterwerden sogenannte R5-Fi lt er verwendet (porenwei te 1,0b is 1,6 J . I D l ) . Die Ent-keimung durch Fil trat ion mit tels Jenaer Ganzglas-Bakterienfil ter (Fi lt rations-glocke mit aufgescbmolzener Fil temutsche) wird in folgenden Schri tten durch-gefiihrt:I. In Fil trat ionsglocke geeignetes GefiiB fO r das Sterilfiltrat einfiihren (beiBakterienfi lter 117 R: l00-ml-Stei lbrustflasche), das Ganze auf den Metal l-boden mit Gummiring stellen und dureh Einhl ingen des Federverschlussesabdiehten.

2. Se itli ehen Absaugstu tzen mit e inem Watt ebausch verschl ieBen; of t wirdzusatzlich d ie Glas filt emutsche mit Aluminium- oder hi tzebesti ind igerPlastfolie abgedeckt , die mit einem kleinen Gummiring befestigt wird.

3. Steri lisierung der so vorbereiteten Fil trat ionsglocke 15min be i 121C imAutokIaven.

4. Steri lisierte Fil trat ionsglocke fiber Absaugstutzen an Wasserstrahlpumpeoder andere geeignete Pumpe - moglichst fiber AusgleichsgefiiB mit Drei-wegehahn - anschlieBen.

5. Zu sterilisierende Losung in Glasfil temutsche gieBen und Pumpe in Betriebsetzen.

6. SobaId Losung f il tr ie rt i st, Pumpe abs te ll en (be i 61pumpen Dreiwegehahnam AusgleiehsgefiiB vorsiehtig offnen und Vakuum langsam ablassen) ,Schlauch von Absaugstutzen entfemen (dabei nochmals Kontrolle desWatteverschlusses).7 . FederverschluB vorsiehtig ofTnen, AufTangefiiB (Steilbrustf1asche) mit ent-haItenem Steri lftl trat herausgleiten lassen, 6tTnung sofort abflammen undmit sterilem Wattestopfen verschlieBen.

8. Reinigung des Ganzglasbakterienfilters sofort nach Benutzung, um einTrockenwerden des verunreinigten Filters zu vermeiden. Zuniichst Ab-spritzen der Filteroberf1iiehe mit scharfem Wasserstrahl, anschlieBend mehr-fach mit dest ill ie rtem Wasser und nachfolgend mogli ehst noch mit he iBemAqua dest. durchspil len. LiiBt die DurchfluJ3geschwindigkeit s ti irker nach,ist eine Behandlung mit Schwefelsiiure anzuraten. Dazu wird auf 100 bis200 C erh itz te konzent ri ert e Schwefe ls iiu re, der ca. 1% Kal

Documents

Methoden Des Mykologischen Laboratoriums