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Konventionelles Lichtmikroskop
Antonie van Leuuwenhoeck, 1660
275 fach, 1,3 um
Konventionelles Lichtmikroskop
Verbessertes Design,
John Yarwell, 1680
Optische Abbildung
Werkzeug
Unterschiedliche Brechungsindices
-> Unterschiedliche Lichtgeschwindigkeiten
Anwendung
Gekrümmte Flächen
Optische Abbildung, reelles Bild (Projektor)
Objekt zwischen f und 2f :Reelles Bild das auf dem Kopf steht
Optische Abbildung, virtuelles Bild (Lupe)
Objekt zwischen 0 und f :Virtuelles Bild seitenrichtig
Optische Abbildung, Vergrößerung
Definition der Vergrößerung
Optische Abbildung, Linsenfehler
Lichtmikroskop: Strahlengang
Lichtmikroskop: Vergößerung <-> Auflösung
Abbe 1900:
Die Auflösung eines Mikroskops ist durch die Licht-Wellenlänge auf λ/2 beschränkt.
Definition Apertur
Lichtmikroskop: Apertur, Ölimmersion
Typische Objektive
Billig: Apertur 0.1 Auflösung 2,75µm
Hochwertig: Apertur 0,65 Auflösung 0,42µm
Öl: Apertur 1,4 Auflösung 0,20µm
Lichtmikroskop Kontraststeigerung: Hellfeld / Dunkelfeld
Hellfeld:Kreisförmige Blende
Transmission
Dunkelfeld:Ringförmige Blende
Sichtbar sind Umrisse
und Beugung
Vergleich Hellfeld / Dunkelfeld
Hellfeld Dunkelfeld
Erythrozyten ca 7µm
Phase, Welleneigenschaften
Wellenfronten alsÜberlagerung von Punktwellen Hauptmaximum & 1. Nebenmaximum
Phase, Welleneigenschaften
2 Spalte dicht beieinander
Nebenmaxima weit weg vom
Hauptmaximum ->
starke Störung des Hauptmaximums
da gut sichtbar
2 Spalte in Abstand
Nebenmaxima nah am
Hauptmaximum ->
wenig Störung des Hauptmaximums
da schlecht sichtbar
Phasenkontrast-Mikroskop
Prinzip
1) Abschattung durch Ringblendevor Eintritt in Objekt
2) Phasendrehung durch λ/2 Plättchennur des Objektlichtes
3) Mischung Objektlicht und Direktlicht
Phasenkontrast-Mikroskop
Zusätzliche Phasendrehung
durch λ/2 Plättchen
1.Phasendrehungim Objekt bis zu λ/2
Interferenz in der Zwischenbildebene
Vergleich Phasenkontrast
Normal Phasenkontrast
Differencial Interference Contrast = DIC
Prinzip
1) Strahlaufspaltung hinsichtlich Polarisationvor Eintritt in Objekt
2) Seitlich versetzter Durchgang der polarisierten Strahlen durch Objekt
3) Mischung der unterschiedlichen Polarisationen nach Durchgang
Vergleich DIC
Normales DICmisst n • ∆s
PlasDICmisst ∆s
Befruchtete Eizelle einer Mausvor der Kernverschmelzung
Konfokales Mikroskop
Transmission
Reflektion
Prinzip
1) Punktförmige Beleuchtung des Objekts durch 1.Blende. Fokussierung auch in 3.Dimension
2) Detektion der Objektstrahlen die in unterschiedlichen Ebenen fokussieren hinter 2. Blende.Falsche Ebenen liefern reduzierten und diffusen Beitrag
3) Bildgebung durch 3D-Scannen
Konfokales Mikroskop
Vergleich Konfokal
Zelle mit Teilungsapparat
4Pi-Mikroskop
Prinzip
1) Beleuchtung des Objekts von 2 Seitenbei vollem Raumwinkel
2) Bildgebung durch 3D-Scannen
Auflösungs unter 100 µm auch in 3D
4Pi-Mikroskop
Historie
1600 Drebbel 1. Mikroskop
1890 Abbe Theorie
1913 Lehmann, Prowazek Fluoreszenz
1941 Zernike Phasenkontrast Nobelpreis
1955 Nomarski DIC
1957 Minski Konfokal
1982 Binning, Rohrer STM Nobelpreis
1986 Binning, Gate, Gerber AFM
1990 Hell 4Pi
Atomic Force Microscope = AFM
Spitze
Prinzip
1) Andrücken einer sehr dünnenfedernden Spitze gegen das Objekt
2) Messung der Gegenkraft durch Federverbiegung, meist mittels abgelenktem Laserstrahl
3) Bildgebung durch 2D-Scannen
Auflösungs unter 10 nm
AFM Betriebsmodus
Betriebsmodi
1) Kontakt-Modus: Ungünstig da zerstörend bei hohen Strukturen
2) Abstands-Modus: Instabil da Kraft/Abstandskurve Hysterese aufweist
3) Oszillations-Modus: Nichtzerstörend, stabil, aber aufwendig
AFM: Resonant Mode
Resonant Mode: Schwingende Spitze
Abstandsmessung durch Verschiebungder Resonazfrequenz aufgrund der Dämpfung
AFM
DNA
CD Membranverdau
Chromosomen
Nearfield Scanning Optical Microscopy = NSOM
Abbe 1900:
Die Auflösung eines Mikroskops ist durch die Licht-Wellenlänge auf λ/2 beschränkt.
Nur richtig für Wellenausbreitung des Lichts = Fernfeld
Im Nahfeld - unterhalb einer Lichtwellenlänge - ist die Ausbreitung von Licht exponentiell gedämpft. Aber nicht null !
Durch geeignete Strukturen kann man Licht auch hier "führen".
1. Vorschläge: 1928 Synge, 1956 O'Keefe
Nachweis mit Mikrowellen
bei λ/60 Auflösung 1972 Ash, Nichols
1. Gerät 1984 Lewis, Isaacson, Harootunian Murray
NSOM Prinzip
NSOM Prinzip
Prinzip
1) AFM-Spitze im non contact mode mit Lichtaustrittsöffnung
2) Globale Detektion des in Nahfeld beeinflußten Lichts
3) Bildgebung durch AFM-kontrolliertes 2D-Scannen
Auflösungs bis 20 nm
NSOM Modi
Spitzentypen
NSOM Auflösung
MuskelzelleAluminiummuster unter Wasser
NSOM Auflösung
Tabakmosaik-Virus
AFM NSOM
Optische Auflösung 18nm = λ/25
Nearfield Scanning Micowave Microscopy = NSMM
NSMM Prinzip
Prinzip
1) AFM-Spitze im non contact mode mit Mikrowellenaustrittsöffnung
2) Globale Detektion der in Nahfeld beeinflußten MW-Strahlung
3) Bildgebung durch AFM-kontrolliertes 2D-Scannen
Auflösungs aktuell um 200 nm
liefert Informationen aus dem Materialinneren !
NSMM Spitze
NSMM Prinzip
NSMM Prinzip
NSMM Prinzip
Prinzip der Fluoreszenz
Niveauschema der Fluoreszenz-Anregung
Farbstoffe
Konventionelle Fluoreszenz-Farbstoffe
Green Fluorescent Protein - GFP
Prinzip GFP
1) DNA die ein bestimmtes Protein herstellt steht zur Verfügung
2) In einer Zelle, z.B. einem Bakterium, wird die DNA verwendet um das Protein herzustellen (zu exprimieren)
3) Zuvor kann in der DNA eine Sequenz eingefügt werden die zusätzlich das GPF (ein relativ kleines Molekül) an dem gewünschten Protein "anbringt"
Damit ist ein markiertes Protein hergestellt, das
zumeist noch die gleiche Funktionalität aufweist.
GFP
Fluoreszenz Mikroskop
Prinzip
1) Das Objekt (meist Zelle mit GFP-markiertem Protein) wird mit Licht der Anregungsfrequenz bestrahlt.
2) Über einen Strahlteiler und nach selektion der Emissionswellenlänge wird das emittierte Licht aufgefangen.
3) Auflösung je nach Mikroskoptyp:LichtmikroskopPhasenkontrastKonfokal4PiNSOM
Fluoreszenz Bilder
Zelle markiert mit 2 Farbstoffen
Fluoreszenz Bilder
NSOM-Fluoreszenz Einzelne Fluoreszenzmoleküle !Normale Fluoreszenz
Mikroskop-Typen
Normales Lichtmikroskop Auflösung bis 200 nm
Phasenkontrast-Mikroskop Erhöhter Kontrast
DIC-Mikroskop Erhöhter Kontrast, Höhenmessung
Konfokales Mikroskop 3D-Bilder, Auflösung bis 150 nm
4Pi-Mikroskop Auflösung bis 70 nm
NSOM Auflösung bis 20 nm
AFM Auflösung bis 10 nmKraft-Messung
Fluoreszenz-Technik Auflösung wie Träger-Mikroskopextremer Kontrast, einzelne Atome leuchten
NSMM Auflösung bis 200 nmMessung der Dielektrizitätskonstante
