Mikrurgische Untersuchung über die geringe Fusionsneigung plasmolysierter, nackter Pflanzenprotoplasten

Mikrurgische Untersuchung fiber die geringe Fusions- neigung plasmolysierter, nackter Pflanzenprotoplasten

Yon

Lothar Hofmeister , Wien

Mit 5 Tex t abb i l dungen

(Eiugelaugt am 4. lu l i 1955)

Inhalt Seite

I. E in le i tung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278

II. Die exper imente l le Fus ion nackter Pf lanzenpro toplas ten . . . . . . . . 281

III . Methodik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283

IV. Versuche tiber die Oberfl~ichenbesehaffenheit und die Fusionsberei tschaf t yon Pro top las ten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286 1. Versuche in Zuckerl~sungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286

a) Glukose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286 b) Saccharose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289

2. Versuche in Salzl~sungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291 a) Ka l iumni i r a t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291 b) Yersuche mi t f iquil ibrierter Lasung . . . . . . . . . . . . . . . . 293 c) Versuche mi t Seewasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 296

3. Versuche unter dem Einflufl oberi l / ichenaktiver Subs tanzen . . . . . . 297 a) A lky l l au ry l a lkoho l su l fona t neben R o h r z u & e r . . . . . . . . . . . 299 b) A lky l l au ry l a lkoho l su l fona t neben Ka l iumni t r a t . . . . . . . . . . 301 c) A lky l l au ry l a lkoho l su l fona t nu t zmn Sptilen der P ipe t ten ve rwende t 302 d) Versuche mi t dem Netzmi t te l Teepol . . . . . . . . . . . . . . . 305

V. Das Verhal ten der Plasmaoberfl~iche verschiedener Objek te in vers&ie- denen Plasmolyt ic i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 308

~r Das u der P lasma- und Tonoplasten0beri lhehe yon Al l ium gegert Paraff inbl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 311

VII. Besp redmng der Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 316

VIII. Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 322

I. E in le i tung

D i e ~u[~ere P l a s m a g r e n z s c h i c h t , se i t P l o w e (1931) a ls P l a s m a l e m m a

b e z e i c h n e t , i s t n i ch t a l l z u o f t G e g e n s t a n d e ines d i r e k t e n S t u d i u m s g e w e s e n

u n d b i e t e t u n s d e s h a l b noch h e u t e m e h r R h t s e l a ls d i e b e s s e r s t u d i e r t e

i n n e r e G r e n z s c h i c h t , d i e T o n o p l a s t e n h a u t . D a s P l a s m a l e m m a is t in d e r

L. Hofmeister: Mikrurg. Unters. plasmolysierter, naekter Pflanzenprotoplasten 279

intakten Zelle nieht naehzuweisen, am plasmolysier/en Protoplasten nicht ohne Eingriffe zu sehen, nnd sehliel~lich besteht noeh Unsieherheit dariiber, ob Lipoide oder Eiweil]verbindungen oder beide seine Zusammensetzung bestimmen.

Wet s (1926) hat, ausgehend yon den Untersuehungen yon P f e f f e r (1877) und yon H a n s t e e n - C r a n n e r (1922), die Natur der iiul~eren Plasmagrenzsehieht dureh Dunkelfeldbeobaehtungen, u mit Elektro- lyten, Kataphoreseversuche nnd aueh dureh Verclauungsversuehe mit Fer- menten studiert; er befa~te sich besonders mit den Heehtschen Fiiden in der Annahme, dal] diese vorwiegend aus dem Material der Hautsehieht bestehen mfissen. W e t s kam zu dem Schlul], daft die Grenzs&ieht yon lipoider Naiur ist, dai3 abet eine Eiweil?komponenie, welehe allerdings gerade in den Plasmaf~iden nieht naehzuweisen war, ctarin nieht fehlen clfirfte.

P l o w e (1931) hat das Plasmalemma mit mikrurgiseher Methodik be- arbeitet und hat es vor allem an plasmolysierten Protoplasien siehtbar maehen kbnnen, indem sic das Plasma darunter zur Degeneration braehte. Sic hat uns aueh gelehrt, das Material des sonst nieht siehtbaren Plasma- lemmas in dell dfinnen Verbindungsstr~ngen zu sehen, welehe die perl- sehnurartig angeordneten Trbpfehen verbinden, in die ein aus der Plasma- obertl~iehe ausgezogener Faden bisweilen zerf~illt. P t owe besehrieb das Plasmalemma als eine hoehelastisehe Fliissigkeit und spraeh sieh bereits damals im Ansehlu~ an S e i f r i z (1924, 1929) ffir die u ether aus Kettenmolekfilen mit elastisehen Eigensehaften bestehenden Plasmastruktur aus. F r e y- W y s s I i n g (1938--1953) s&reibt der iiul~eren Plas.magrenzsehieht eine Struktur aus Polypeptidketten zu, wobei er eine diehtere Lagerung der Fadenmolekiile in der Grenzsehieht annimmt als im Binnenplasma. P l o w e is/ nieht fiir die Annahme, daft die ~ul~ere Plasmahautsehieht bet Plasmo- lyseeintritt neu entsteht. W e b e r (1932, 193~) konnte zeigen, daft eine der- artige Entstehung oder Wiederherstellung unterbleibt, wenn dutch u behandlung mit verdiinnter Kalimnoxalatlbsung alle Kalziumspuren aus der Oberfliiche entfernt werden. Bet naehfolgender ginwirkung stark hyper- toniseher Ltisungen yon Harnstoff, abet aueh yon anderen Plasmolyticis, kommt es zu Tonoplastenplasmolyse, weil in Abwesenheit yon Ca-Ionen d as schiitzende Plasmalemma nieht entstehen oder nieht restituiert werden ]~ann.

In indirekter Weise beschiiftigen sieh nlit dem Plasmalemma alle Unter- suehungen fiber die Permeabilitiit des Plasmas, da sic aueh die Dureh- lgssigkeiiseigensehafien der iiul]eren Plasmagrenzsehiehte mitbestimmen. Dennoeh ist davon nut eine begrenzte Fbrclerung der Vorstellungen fiber die Plasmaoberfliiehe zu erwarten, weil die Permeation nieht nur dutch das Plasmalemma, sondern zu unbekannten Teilen aueh yore Binnenplasma und der Tonoplastenhaut bestimmt wird ( H b f l e r t931, 1951, 1952).

Direkt befassen sieh mit cler Plasmaoberfliiehe die u fiber die experimentelle Fusion naekter Protoplasten, wie sie K f i s t e r (1909, 1910a, 1937a, 1939a) und seine Sehiiler ( M i s s b a c h 1928, L o r e y 1929, M i c h e l 1937) ausgefiihrt habeu. Die Auswertung dieser Versuehe erfolgte allerclings

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mehr im Hinbliek auf die Erseheinung selbst und ihre Folgen als auf ihre Ursaehen. Im folgenden wird yon diesen Fusionsstudien ausftihrlieher zu spreehen sein, da sie den Ausgangspunkt ftir meine vorliegende Unter- suehung darsiellen. -- Direkt mit dem Plasmalemma befassen sieh au& die Untersuehungen yon P f ei f f e r (1934, 1935) iiber die Adhasion naekier Protoplasten an versehiedenen FremdkiSrpern und iiber das Fadenziehen des Protoplasmas.

Zuleizt riickte das Studium des Plasmalemmas dureh die Untersu&ungen yon HiSf ler (1951, 1952) wieder in den Vordergrund. Dureh Anwendung plasmolysierender NairimnkarbonatliSsung vermag H i5 f 1 e r die Ausbilduug des Plasmalemlnas bei versehiedenen Objekten vergleiehend zu beuvteilen: die Resistenz gegen die fiir lebendes Plasma sehr sehiidli&e Sodal~Ssung gibt ein Mail fiir die Sehutzfunktion des Plasmalemmas und damit fiir die St~irke seiner Ausbildung. Wir erfahren, daft das Plasmalemma versehiedener Zellsorten sehr versehieden ausgebildet ist und da[] viele Desmidiaeeae vor anderen Pflanzen dadureh ausgezeiehnet sind, daf~ ihr Plasmalemma eine besonders naehhaltige Sehutzfunktion gegen das Eindringen dee Soda- Itisung ausiibt und daiS. es im Gegensatz zu anderen Objekten zu seinev Restitution oder Neubildung der Ca-Ionen nieht zu bediirfen seheint. C h o l n o k y (1952) konnte dureh Anwendung verdiinnter Natronlauge ebenfalls weitgehende gers&iedenheiten im Bau des Plasmalemmas yon Zellen der Corollepidemnis yon Caleeolaria, Senecio crueutus mid Pelar- gouium zonale zeigen, und er fiihrt sie auf den weehselnden Anteil vevseif- barer Lipoide an seinel: Zusammensetzung zurtiek.

In meiner vorliegenden Untersuehung stellte ieh mir die Aufgabe, die Teehnik der experimentellen Plasmafusionen neben der Untersuehungs- methode der Mikrodissektion zu einem intensiven Studium der Plasma- oberfiiiehe zu verwenden. Die relativ hohe Zahl der yon K f is ter und seinen Sehiilern angefiihrten Fusionsergebnisse gehtirt zu den seh~Snsten Erfolgen der Giel]ener Experimenfierkunst. hn Sehatten dieser Erfolge neigt der Leser leieht dazu, die einsehr~inkenden Bemerkungen fiber ablehnendes u halten yon Protoplasten in ihrer Bedeutung zu unterseh~itzen oder doeh eine grundsiitzliehe Bedeutung dieses ablehnenden u nieht zu vermu- ten. Als ieh damit begann, die Fusionsversuehe yon K i i s t e r (1910a) und M i c h e l (19_37) mit vm'wiegend mikrurgiseher Methodik zu wiederholen, kam ieh bald zu der ldberzeugung, daf~. die Fusion plasmolysierter, na&ter Protoplasten keineswegs die Regel, sondern eine an sehr enge und kaum resilos zu definierende Bedingungen gekniipfte Ausnahme ist. Die Mit- {eilung yon Protokollausziigen soll eine Vorstellung davon vermitteln, wie selten ]?usionen selbst unter bewul]t giinstig angesetzten Versuehsbedingun- gen zustande kommen. Trotzdem also mit der Herstellung einer nennens- werten Zahl von Protoplastenfusionen nieht zu reehnen war, behielt ieh die gegenseitige Beriihrung naekter Protoplasten als vorteilhafte Meihode zur Beurteilung des Zus*andes der Plasmaoberfliiehe bei.

Die Versuehsbedingungen wurden Jm aIlgemeinen so eingeriehtet, dal~. sie als fusionsfiSrdernd gelten konnten, daneben abet im vitalen Bereieh

Milgrurgische Untersuehung plasmolysierter, naekter Pflanzenprotoplasten 281

kriiftige ?[nderungen der Oberfl~icl~enbesehaffenheit der Protoplasten her- beizufiihren verspra&en. In der Hauptsaehe handel te es sieh um die Wir- kung yon Plasmol,y-se in Zuckerlbsungen, um die yon Vorplasmolyse in Kal iumni t ra t bei nachfolgender Zuckerplasmolyse (yon M i c h e l 1957 er- folgreieh zur Herstel lung yon Fusionen angewendet), um die Anwendung ~iquilibrierter Lbsungen (Seewasser sowie eine Lgsung naeh C h a m b e r s , 1945) und um den Einflul~ oberfliiehenaktiver Substanzen (Netzmittel). Dutch weehsetnde Dauer der E inwirkung dieser Einfliisse, dureh zusgtzliehe Anwendung des Deplasmolysevorganges, dutch Kleisterzusatz und dureh Kombinat ion der versehiedenen Faktoren mit der Netzmit te lwirkung ergaben sieh die untersehiedliehen Versuehsbedingungen. Aul~erdem kam in versehiedenen F~illen das Verhalten der Plasmaoberfltiehen gegen Paraffin51 zur Untersuehung. Diese Experimente, die ieh entspreehend ihren Vor- bildern ( C h a m b e r s u. H b f l e r 1931; C h a m b e r s u. K o p a e 1957) mittels Mikropipet ten durehfiihrte, sind leiehter zu positiven Ergebnissen zu fiih- ten als die Fusion zwisehen Protoplasten und sind deshalb fiir das ver- gleiehende Studimn der Plasmaoberfl~ichen aufsehlul~reieh.

II. Die experimentel le Fusion nackter Pflanzenprotoplasten

l~bcr den Gegenstand der experimentellen Fusion gibt es zwei zusammen- fassende Darstellungen. Mi ch el (1957) behandelt den Gegenstand ausfiihrlich lind bringt auch die vorhergetlende Literatur. Eine vollstgndige i2rbersicht iiber alle Fusionserscheinungen gibt Kii s t e r (1959 a) in seinem Buche ,,tiber Plasma- pfropfungen", das die ira normalen und pathologischen Zellgeschehen vorkommen- den Fusionen ebenso umfafif wie die experimente]le Herstellung solcher. Ich darf reich daher weiterhin darauf beschrhnken, die Literatur nur sowcit zu erwhhnen, als meine Versuche damit in Zusamlnenhang stehen, und im iibrigen auf die er- w~ihnten Darstellungen zu verweisen.

K ~i st e r (1909)brachte Protoplasten Yon Allium und Elodea, die sial1 infolge kr~iftiger Plasmolyse in Kalziumnitrat in den Zellen geteili hatten, durch rasche Deplasmolyse unter Wasserzusatz wieder zur Vereinigung. Die Teilstticke vereinigten sich nieht immer leieht, das Ausbleiben der Verschmelzung in vielen Y~illen wurde mit Yer~inderung der Plasmaoberfl~iehe durdl die Plasmolyse erkl/irt. In Rohrzuekerli3sung war die Vereinigung ni&t zu erzielen. Bald darauf beschreibt K ii s t e r (1910 a) erstmalig die Vereinigung Yon aus ihren Zellgeh~usen befreiten Protoplasten zu abnorm grol~en, auch mehrkernigen Gebilden. Die Freilegung der Protoplasten erfolgt dur& kriiftige Plasmolyse in Kalziumnitrat und naehfolgende Zerteilung der S&nitte dutch einen Rasiermessersdmitt senkred~t zur L/ingsachse der plasmolysierten Zellen (Vorgang nach K 1 e r c k e r, 1892). Dutch Wasserzusatz wird der Zellinhalt zur Deplasmolyse und zum Austritt aus den gebffneten Zellen gebraeht, audl mechanisch kann das Heraustreten bewirkt werden. Wenn die Schnitt- h~ilften eng aneinandergelegt werden, beriihren sich zahlreiehe der ausschltipfenden Protoplasten. Schon naeh kurzer Bertihrung zwisdlen ihnen kann Verklebung zustande kolmnen, erst nach lgngerer Bertihrung kommt es zu Versehmelzung, d. h. zu einer innigeren und haltbaren Vereinigung der Plasmen. Aud~ in dieser Mitteilung wird erw~hnt, dal3 das Plasma vieler Pflanzenzellen sich selbst bei kr~iftiger gegenseitiger Beriihrung ni&t versdlmelzen l~iflt. Wenn Fusionsbereitsdmft vor|iegt, bleibt sie nur eine gewisse Zeit bestehen, in versdfiedenen Li~sungen verschieden lang. So lassen sich na& K ii s t e r (i9i0b) Allium-Protoplasten in der gesehlos-

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senen Zelle in. u-Kalziumnitrat bis zu 24 Stunden, in 1,0mol Rohrzucker bis zu 15--18 Stunden vereinigen. M is s b a e h (1928) befaflt sieh mit der Dauer der Fusionsbereitschaft von in Elodea-Zellen erzeugten Teilprotoplasten. Nach Plas- molyse in n-Kaliumnitrat ist eine Fusion bet Deplasmolyse durcb. Wasserzusatz no& bis zu 6 Stunden zu erreiehen, in n-Kalzinmnitrat bis zu 3 Stunden, bet Zu- satz yon 0,2--0,5% A1-Salz nur dural1 60--170 Minuten. L o r e y (1929) vermeidet bet seinen Fusionsversuchen an AIlium-Zellen und anderen Objekten die De- plasmolyse dur& Wasserzusatz. Die durch krtiftige Plasmolyse erhaltenen Teil- protoplasten werden dutch Druek, der mittels Glasnadeln oder zwisehen Deckglas und Sehnitt gelegten Glasftiden auf die Auflenfl/i&e der Zellen ausgeiibt wird, zur Bertihrung gebraeht. Der Zeitraum, wtihrend dessen die Teilprotoplasten fusions- f/~hig bleiben, ist in n-Rohrzucker 6 Stunden, in n-Kal iumnit ra t 1�89 Stunden, in n-Kalziumnitrat (das tibrigens eine sehr hohe Konzentration darstellt) gab es keine vollst~indige Vereinigung. Bet Anwendung yon Deplasmolyse blieb die Fusions- ftihigkeit l~inger erhalten, ein Zusatz yon Chloralhydrat (0,5%) zur plasmolysierenden LSsung verl/ingerte die Dauer der Fusionsftihigkeit his gegen 20 Stunden.

In mandler Hinsidlt neue Methoden wendet M i e h e l (1937) an. Er arbeilet mit naekten Protoplasten zahlrei&er Objekte aus ~'erschiedeneu Pflanzenfamilien. Die Schnitte pllegt er vor der Plasmolyse his zu 14 Stunden in fliefiendem Wasser zu halten, daun werden sie fiir 10 Minuten mit 0,5 n-Kaliumnitrat behandelt and schliefilich in einem z~hen Medium (St~irkekleister-Rohrzucker-Gemiseh oder mit Soda neutralisiertes Opekta-Rohrzucker-Gemisch) dur& den Rasierklingenschnitt getiffnet. Vielfach werdeu die Protoplasten audl durch Zerreillen mSglichst grof~er und dicker Schnitte mittels Nadeln freigelegt. In dem ztihen Medium lassen sich Protoplasten in gentigender Zahl erhalten und dureh Bewegen der Fliissigkeit writ Prtipariernadeln vorsichtig miteinander in Bertihrung bringen. M i c h e I beschreibt Fusionen nicht nur yon Teilprotoplasten derselben Zelle (autoplastisdle Fusionen), sondern auch yon verschiedenen Geweben derselben Art (homtioplastische F.) und sogar die yon Protoplasten, die yon ~,erschiedenen Arten stammen (heteroplasti- stile F.). Nieht alle Ftille betreffen vollstandige Vereinigung der Fusionspartner. Wenn nur Verklebung eingetreten ist, sind die Partner leieht wieder zu trennen, gewi3hnlidl spannt sich noch ein Plasmafaden zwischen ihnen, der dana zerreil~t. Fusion (die nur nach kurz daueruder Plasmolyse vorkommt) bedeutet noch nicht Vereinigung der Vakuolen, die in den meisten F~illen getrennt bleiben. Verklebung und Fusion lassen sich durch den Winkel unterscheiden, nnter dem die Partner wieder getrennt werden ktinnen. Dieser Wiukel ist bet Vorliegen yon Verschmel- zung anntihernd 180 ~ bet Yerklebung kleiner. Nut selten kommt es ~'or, da~ das Plasma des einen Partners in Form yon zungenftirmigen Vorstiilpungen in den anderen hinein vordringt. Eine weitergehende Vermisdmng der Plasmen wird nicllt beschriebenL gereinigung, also Vermischung der Vakuolen wird ebenfalls als selten bezeichnet, ~-ier konkrete Beispiele sind angeftihrt 2. M i c h e I bildet eine Auzahl yon Fusionsprodukten ab, die durch das Zusammenwirken der Oberfltichen- spannung beider Partner eine gemeinsame Minimalform angenommen haben oder einem solchen Gleichgewieht entgegenstreben. In giinstigen Ftillen wird die Kugel-

* Vi~llige Vermischung der Plasmen eines experilnentell erzeugten Fnsions- produktes hat Ki i s t e r (1939 b) bet Bryopsis beobaditet.

2 Eine homi30plastische u (rote Riibe), drei heteroplastisehe Ver- schmelzungen (farbloser Protoplast aus dem Grundgewebe vom Radies&en mit rotem Epidermisprotoplasten derselben Pflanze, Wurzelepidermisprotoplasten yon Radiesehen and Rettich, Wurzelproioplast yon Beta vuIgaris mit einem aus dem Grundgewebe yon Allium cepa).

Mikrurgische Untersuehung plasmolysierter, naekter Pflanzenprotoplasten 283

form schon nadl 20 Minuten erreicht (rotes Wurzelgrundgewebe yon Beta otdgaris), bei vielen Objekten dauert es 1/inger. Fusionsprodukte yon Allium nehmen keine Kugelform an. Die Lebensdauer der Fusionsprodukte s&eint vielfach geringer zu sein als die der Ausgangsprotoplasten, ftir Allium werden 9 Stunden angegeben, ftir Raphanus 5�89 Stmaden, fiir Chara 1 Stunde.

Nach den Angaben der L i t e r a tu r di irfen wi t uns iiber die exper imen- tellen Fusionen folgendes Bild machen: die Verschmelzungen gehen nu t selten und bei wenigen Ob jek t en bis zur Vermischung der Plasmen oder der Vakuolen, Verk lebung ist der wei taus hiiufigere Fall. Unter dem Anschein nach gleichen Bedingungen kann e inmal Verschmelzung vorkommen, ein anderes Mal nicht ~. Ftir die Verschmelzung freigelegter Pro toplas ten Sind folgende Bedingungen als besonders fiSrderlich beschrieben: Mehrsti indige Vorwii.sserung in fliel~endem Wasser, kurze D a u e r der Plasmolyse, Vor- behand lung in Ka l iumni t r a t mit nachfolgender Uber t r agung in Rohrzucker- liSsung ( M i c h e l 1937), rasche Dep lasmolyse durch Verdi innung der Ltisung, Ka lz iumni t r a t als P l a smoly f ikum ( K i i s t e r 1910 a). Die Verwendung ziiher Medien (St~irkekleister, Opek ta ) bei M i c h e l di irf te nicht so sehr die Ver- schmelzung als solche fiSrdern als zur Schonung der Pro toplas ten bei allen Manipulaf ionen beitragen.

Wenn wi t versuchen, die verschiedenen Grade einer Vereinigung, welche zwischen Pro top las ten e int re ten ktinnen, zu bewerten, di irfen wi t als niedrigste Stufe das Fadenz iehen zwischen ihnen, als hiihere alle Ar ten yon Verklebung und als htichstc die viillige Vereinigung yon P la sma und Vaku01e bezeichnen. Diese letzfe und hbchste Stufe wurde in meiner ganzen Versuchsreihe n u t e inmal beobachtet (S. 297).

I I I . M e t h o d i k

Die Autoren von Fusionsversuehen haben durchgehend bewul~t darauf ver- zichtet, mit einem Mikromanipulator zu arbeiten. Sie wollten die einigermaSen zeitraubende und umst~indliehe Versuchsvorbereitung und die 1/ingere Dauer der Manipulation nicht fiir eine Verrichtung in Kauf nehntenl die mit Pr/ipariernadeln usw. raseher ausgeftihrt werden kann. Ich entschlol~ reich trotz dieser Nachteile, den Mikromanipulator fiir die iiberwiegende Zahl meiner Versur'he anzuwenden. Bei dem verwendeten GerM, dem Gleitmikromanipulator yon Zeifi (R e i n e r t 1939), ist der Zeitaufwand fiir die technisehen Verrichtungen, der einfachen Bauart wegen, geringer als bei verschiedenen anderen Konstruktionen. Die Vorteile der Anwendung eines Manipulators liegen in der M6gliehkeit, mit st~irkereu VergriS~e- rungen zu arbeiten, individuelle Protoplasten unter st~indiger Beobadltung mit willkiirlieh bemessener Gesdlwindigkeit und unter weitgehender Schonung zu ~-er- ]agern und sie mit ebenso willkiirlieh bemessenem Druck aneinanderzulegen. Be- sonders wertvoll abet war es mir, dal~ ieh jederzeit mit mikrurgisehen Mitteln die Plasmabesehaffenheit meiner Versudlsobjekte und den Grad der Yereinigung ~on Fusions- oder Verklebnngsprodukten beurteilen konnte. Anfangs ~erlagerte idl die Protoplasten mittels Mikronadeln (Versuehe Nr. 2--23), spgter nahm ich sie

3 K i i s t e r (19_59 a, S. 25) erw/ihnt Versehmelzung der freien Protoplasten aus dem Fruchtfleisch reifer Friiehte von Solarium etc. und verweist auf frtihere Ver- suche unter vermutlieh glei&en Bedingungen, die erfolglos blieben (1928, S. 230).

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mit Mikropipetten yon halbem bis tiber dreiviertel Zelldurchmesser '~ auf, um sie mit anderen in der [,~isung oder in ge(3ffneten Zellen zusammenzubringen. Diese Behandlung der Protoplasten mit Mikropipetten lfiflt sid~ nut mit ether Injektions- einriehtung durdlfiihren, weldle medmniseb gesteuert ist und die sichere Versehie- bung sehr kleiner Fltissigkeitsvolumina ermbglieht, so daft ungewollte und beziiglieh ihrer Gesehwindigkeit unkontrollierte Verlagerungen der Protoplasten nieht vorkommen ktinnen. Die ~on mir verwendete lnjektionseinrichtung (H o f- ro e i s t e r 1930) entspra& diesen F0rderungen im Ptahmen des M6glichen. t3ei der Aufnahme in die Mikropipette ebenso wie bet der darauf folgenden Abgabe mils- sen alle Protoplasten, die gri3fler sind als Kugeln yore Durct~messer der Pipette, Formver/inderungen durdmlaehen. Diese Formver~inderungen werden sehr gut ertragen, wenn sie langsam vor sieh gehen. Beispielsweise kann ein in ZuekerlOsung plasmolysierter Protoplast, dessen L~inge drei Zelldurchmesser betrggt, in etwa 40 his 60 Sekunden aus der Zelle heraus in eine Pipette yon einem halben Zell- durchmesser Weite ohne jedes Zeichen einer Sdl~idigung eingesaugt werden; wird die Aufnahme etwa in 15 his 20 Sekunden erzwungen, dann stirbt unter Umstfin- den das Plasma infolge der zu raschen Forrnverfinderung, der sich seine Struktur unter dem gleiehzeitigen Einfiufl der Reibung ni&t so raseh anpassen kann. t~ine weitere Fehlerquelle (die au& im angegeber~en Beispiel vorlag) ist Koagulation des Plasmas an den Glaswiinden der Pipette, ~-or allem an ihrer Mtindung. Von jedem Protoplasten bleibt auch bet gri3flter Vorsicht ein wenig Koagulum h~ingen. Weitere Protoplasten werden dureh die Bertihrung mit den Resten der vorhergehenden (mtiglicherwei'se rein lne&anisch) gesdliidigt, so daft die Pipetten oft ausgewechselt werden miissen. Diese Sti3rung l~il3t sidl vermeiden, wenn die Mikro- pipette vor der Aufnahme der Protoplasten mit Netzmittelltisung gespiilt und ansehliel~end mit dem Plasmolytikum mehrmals ausgewasehen wird (siehe S. 502).

Eine Mtiglichkeit zn besonders sehonender Aufnahlne oder Abgabe yon Proto- plasten ergab sich, wenn der Pipettendurdlmesser nur wenig kleiner war als der der Zelle. In solchen Ffillen konnte die Pipette derart in die Zellmiindung ein- gefiihrt werden, daft sie diese versdflofi und Aufnahme sowie Verschiebungen you Fliissigkeit oder Protoplasten in dem abgeschlossenen Raum nut sehr langsam und gewissermal~en gebremst vor sieh gehen konnten, da dazu die L~isnng durch die Zellw/inde diffundieren muI~te. Lediglich beim darauffolgenden Zurtiekziehen der Pipettenmtindung mufite sehr behutsam vorgegangen und jeder i/ber- oder Unterdruck in der Pipette vermieden werden, da sonst die Protoplasten durd~ rasehe Fliissigkeitsstri3mungen gettitet wurden.

Es sd~ien mir besonders vorteilhaft, die Protoplasten in gebffneten Zellen miteinander in Beriihrung zu bringen. Zun~chst ist die Beriihrung mit einer Zellwand far sie weniger nachteilig als die mit anderen Ktirpern, sodann werden sie durch die Zellw~inde in ihrer gegenseitigen Lage festgehalten, so dal~ ~'on den u weldm die ersten Untersuchungen ~on K t i s t e r (1909), M i s s b a e h (1928) und L o r e y (1929) durch das Arbeiten in gesdflossenen Zellen erwu&sen, so viel tibernommen wird, als die geiinderte Problemstellung erlaubt.

Meine Versuchsobjekte waren zum iiberwiegenden Tell ruhende Zwiebeln x~on Allium cepa, und zwar Zellen der ~iufieren, unteren Epidermis aus der :~quator- gegend der, yon aul~en gezhhlt, dritten oder vierten lebenden Zwiebe|sdluppe. In

Die Mikropipetten mit derart grol~en Durehmessern wurden aus gewiSlmlidlem Glas oder Jenaer Glas nach ungef~hrer Formung in der Gasflamme tiber einer sehwach gltihenden Platinspirale yon Hand aus gezogen. Die R~inder mu[{ten glair und gleichmh~ig abgeschmolzen sein.

Mikrurgisdle Untersuchung plasmolysierter, nackter Pflanzenprotoplasten 285

den Versuehsprotokollen steht ftir diese Zellsorte der Ktirze wegen ,,Alli!un, rot" bzw. ,Allium, gelb". Abweichungen, wie Verwendung treibender Zwiebeln start ruhender oder der oberen statt der unteren Schuppenepidermis sind ausdrticklieh vermerkt. Die roten Zwiebeln waren bis Versud~snummer 17 die in Wien vielfaeh ftir plasmolytische Untersuehungen gebrauchten der Sorte ,,Hiesige ZwSlfer", in Nr. 22 waren es aus Italien importierte Zwiebeln, Yon Nr. 23 bis 43 nicht ngher bezeichnete rote oder gelbe Zwiebeln, yon da an ,,Zittauer Riesen gelb" und ,,Wiener Rote", die aus der Gartenbausehule in Wien-Kagran stammten. Soweit andere Pflanzen verwendet wurden, sind die Einzelheiten im Text ersichtlich.

Vor der Plasmolyse wurden die Schnitte gew~issert, yon Nr. 25 an entspreehend den Angaben yon M i e h e 1 meist mehrere Stunden in fliel~endem Leitungswasser 5 Diese Behandlung hatte - - wie zu erwarten war - - die Folge, dal~ die Plasmolyse und auch da~ nachfolgende Zerteilen des Schnittes besser ertragen wurde als yon ungew~isserten Zellen. Die Protoplasten zeigten nach lang dauernder W~isserung in flie~endem Wasser besonders starke Neigung zur Bildung yon zahlreichen Plasmastr~ngen, Plasmaraumgittern, Plasmaamtiben (K ti s t e r 1937, T o t h, G r a f u. R i c h t e r 194,3) und zu lebhafter Plasmastr~Smung. Abweichlmgen in der Durdl- fiihrung der W/isserung sind fallweise angegeben. Die verwendeten Abkiirzmlgen sind wetter unten (S. 286) angeftihrt.

Nach Plasmolyse yon einiger Dauer wurden die Schnitte naeh der Teehnik yon K l e r c k e r (1892), K t i s t e r (1910a), S e i f r i z (1927), P l o w e (1951), C h a m - b e r s u. H ti f I e r (1931), H o f m e i s t e r (1940) mit der Rasierklinge zerteilt und so die Zellen ge~ffnet. Da keine sehr hohen Konzentrationen der plasmolysierenden L~sungen angewandt wurden, diirften viele der sold~erart freigelegten Proto- plasten mit den Zellen zerteilt worden seth, was ihren Lebenszustand nicht wetter beeintr/~chtigt, wenn sonst keine sch/idlichen Einfliisse v6rliegen. Versn&sbedin- gungen, unter denen in den geOffneten Zellen mehr Protoplasten tot als am Leben waren, wurden ausgeschaltet, da sie nicht als normal betrachtet wurden. Wenn an derartigem Material trotzdem ein Versuch durchgeftihrt wurde, ist dieser Umstand vermerkt. Gelegentlich wurden die Protoplasten auch ha& dem yon M i c h e l angegebenen Vorgang dur& Zerreil~en dicker, plasmolysierter Schnitte mittels Pr~i- pariernadeln freigelegt, was insbesondere ftir unregelm~i/~ig geformte Zellen in Frage kam und fallweise angegeben ist.

Die zerteilten Schnitte wurden bis zu Versudl 17 mit Vaseline ant der Unter- seite des grol~en Deekglases der zum Mikromanipulator gehi3rigen fenchten Kam- mer festgeklebt und yon unten mit einem ebenso befestigten Deekglassttiek bedeckt, den Absehlu[~ bildete Paraffiniil. Fiir die Mikroinstrumente besser zug~inglich und aueh gegen ungewolltes Abfliei3en des abs&liel~enden ParaffiniJls und damit gegen Eintroeknen besser gesd~titzt.ist das Pr~iparat, wenn es yon unten mit einem all- seits etwas tiber den S&nitt hinausragenden Bl~ittehen Cellophan ~ bedeekt wird; aueh in diesem Fall wird mit ParaffiniJl abgeschlossen, um die Verdunstung des Plasmolytikums zu verhindern. Bisweilen wurde, um ganz schwache Wasserzufuhr zmn Pr/~parat zu bewirken (die audl in Stunden nieht zu Deplasmolyse ftihrte), ein Tropfen Wasser ant die Unterseite des Cellophans gebraeht, der aueh mit dem

Zur Zeit dieser Versuehe enthieR das verwendete Wiener Leitungswasser laut Auskunft der Hygienisch-bakteriologisehen Untersuehungsanstalt der Stadt Wien 0,02 bis 0,05 mg freies Chlor pro Liter.

6 Das Cellophanbl/ittchen mul~ vorher eine Zeitlang in dem Plasmolytikum liegen, well es sieh sonst infolge der einseitigen Benetzung ~r einrollt und im Pr~iparat Unordnung anrichtet.

286 L. Hofmeister

Paraffintiltropfen bede&t wurde, tn den Protokollen ist der u yore Zer- teilen des Schnittes bis zur Fertigstellung der Montage mit der Abktirzung ,,Pr~ip." (Pr/iparation) bezeichnet. Abweiehende Vorg~inge sind fallweise genau angegeben.

In den Protokollangaben werden fiir stets wiederkehrende Ausdriicke oder Verfahrensangaben die naehstehenden Abkiirzungen gebraueht:

u 1 . . . usw. Allium, rot bzw. Allium, gelb

LW ft. 7 St. 50 Min.

dW 5 St.

P1 bzw. pl Pr~ip.

(LW) oder (dW), naeh Konzentrationsangaben

Pipette gespiilt

Chamb.

ALAS

Versuchsserie V, Versuehsnummer 1 . . . die auf S. 284 f. n~iher bezeidlneten Zwie- belzellen. Wiisserung in tliefiendem Leitungswasser dureh 7 Stunden 30 Minuten.

Wiisserung in (stehendem) destilliertem Wasser dureh 3 Stunden. Plasnmlyse bzw~ plasnmlysiert. Zerteilen und Montage des Sehnittes in der im ~'orhergehenden Absatz angegebenen Art. Ltisungsmittel des Plasmolytikums.

siehe S. 284, die Mikropipetfe mit Plasmo- [ytikum @Netzmittel gespiilt, dann mit reinem Plasmolytikum mehrmals aus- gewaschen.

~iquilibrierte Salzlbsnng nach C h a m - b e r s 1943, siehe S. 294. Alkyllaurylalkoholsulfonat, siehe S. 299.

IV. Versuche fiber die Oberfl~chenbeschaffenheit und die Fusions- bereitschaft von Protoplasten

1. V e r s u c h e in Z u c k e r l S s u n g e n a) Glukose.

Fiir die ersten Versuche, die schon 1958 unternommen wurden, w~hlte ich Traubenzu&er als Plasmolyfikum, well Plasma und Plasmaobertl~iche darin weniger nachteilig ver~indert werden als in den meisten anderen Plasmolyticis. Vor allen, erh~irtet die Plasmaoberfl~iche der plasmolysierten Protoplasten in GlukoseliSsung langsamer als in dem ansonsten ebenfalls unsch~idlichen Rohrzucker. So ist ( H o f m e i s t e r 1940) das Plasma der Allium-Protoplasten nach Traubenzuckerplasmolyse yon 24 St. unter der Mikronadel zwar teigig test, die Protoplastenkontur aber trotz der in diesem Zeitpunkt infolge Permeation eingetretenen Riickdehnung yon etwa 2% der Protoplastenl~inge unversehrt. In Rohrzucker findet man nach so langer Zeit gewi3hnlich die yon K i i s t e r (1910b) beschriebenen Bruchsack- bildungen, welche die griS~ere Spriidigkeit der Plasmaoberflhche verraten. Krhfiige Deplasmolyse, etwa durch Wasserzusafz, wiirde allerdings auch

Mi~rurgische Untersuehung plaslnolysierter, naekter Pflanzenprotoplasten 287

bei den gesehilderten Traubenzuckerprotoplasten Bruehsaekbildung hervorgerufen haben.

g 2 (IS. 8.58). AUium, rot; dW kurz, P1 in 1,0 tool Glukose (dW) 55 Min., Priip. - - Priifung auf Fusionsbereitsehaft: Bis zu 2 Stunden naeh dem Plasmolyseeintritt wurden mit Mikronadeln versehiedene austrefende nackte Protoplasten jeweils fiir I his 2 Min. aneinandergeprel3t, aueh so gegeneinander versehoben, dal3 sie dadureh gezerrt und gedriiekt wurden. Es war keine weitere Vereinigung zwisehen ihnen zu erreiehen, als die Bildung einzelner Plasmafiiden.

Sehon in diesem Versuch sah ieh bei der Plasmolyse langgestreekter Zellen die immer wieder zu beobaehtende Tatsaehe be st~itigt, daft Teile eines plaslnolysierten Protoplasten sieh wieder vereinigen kiinnen, solange no& ein P l a s m a f a d e n zwisehen ihnen besteht. Ieh konnte einen Teil- protoplasten unter Erhalfung des verbindenden Fadens z. B. 15 Zellbreiten weir wegziehen: wenn er so langsam zuriiekgeftihrf wurde, daft der Faden sich verkiirzen und wieder aufgenommen werden konnte (z. B. wiihrend einer Minute), vereinigten sieh die Teilstiieke wieder. In der Mehrzahl der Fiille ist die Vakuole sofort naeh der u einheitlieh, manehmal bleibt eille Plasmalamelle eine Zeitlang (in diesem Yersueh F~; his 2 Min.) als Grenze bestehen. Bekanntlieh (Ki i s t e r 1927) kann gerade bei Allium- Protoplasfen innerhalb des Plasmafadens die Vakuolenhiille einen deut- lieh siehtbaren Strang bilden. Wit diirfen annehmen, daft im Falle sofortiger spurloser Vereinigung die Kontinuit~it der Yakuolenhiille dureh einen Tonoplastenfaden hergestellf war, wiihrend das Verbleiben einer trennenden Plasmalamelle zwisehen den Teilvakuolen dafiir sprieht, daft diese nieht mehr in u waren. Bemerkenswert an diesem u ist die ungeheure D e h n b a r k e i t von Plasmalemma und Binnenplasma (P 1 owe 1931), denn bei der Wiedervereinigung erweiterf sieh die sehmale Pforte yon oft nut 1 his 2~t Durehmesser, welehe der Plasmafaden darstellt, in weniger als einer Sekunde auf reiehlieh das ttundertfaehe. -- Selbstversfiindlieh kann die gesehilderte Erseheinung nieht als Fusion yon Protoplasten betraehtet werden, da die Kontinuitiit des Plasmas niehf unter- broehen war und nur gegebenenfalls Teilvakuolen vereinigt wurden. Es ergibt sieh daraus die Notwendigkeif, in allen F~illen, in denen T e i l e des- s e l b e n P r o t o p l a s t e n vereinigt werden sollen, besonders d a r a u f zu a e h t e n , dal~ z w i s e h e n d e n T e i l s t i i e k e n k e i n v e r b i n d e n d e r F a d e n m e h r b e s t e h f .

u 22 (27.7.51). Alliurn, gelb; dW kurz, P1 in 1,0tool Glukose (dW) 50 Min., Pr~ip. in 0,5mol Glukose-~-Sfiirkekleister. - - Die reiehlich austretenden Protoplasfen, die lebhafte Plasmastrbmung zeigen, bilden bei gegenseitiger Beriihrung Plasmaf~iden. Wenn einer dieser Fiiden abgerissen wird, erleiden seine beiden Teile ein versehiedenes Sehieksal. Ein Tell wird yon dem Prot0plasten, von dem er stammf, langsam wieder eingezogen (Dauer: Sekunden his Minuten); der andere Teil wird y o n dent zwei- t e n P r o t o p l a s t . e n , an d e m er blol~ k l e b t , n i e m a l s a u f g e n o m - m e n, aueh nieht naeh liingerer Zeit, und bleibt als Plasmafropfen an seiner

288 L. Hofmeister

Oberfliiehe sitzen. Eine weitere Vereinigung der beideu durdl einen so[then ,,sekundiiren '~ Faden verbundenen Protoplasten sah ieh niemals. Der grund- legende Untersehied gegeniiber der im vorhergehenden Absatz erwiihn{en Fadenbildung ist trotz der :~iul~eren Ahnliehkeit der Erseheinungen unverkennbar. - - Im gleiehen Versueh verkleben weitere aneinandergedriickte Protoplasten so fest, dan sie sieh dureh Beriihren des einen yon ihnen mit der Mikronadel in dem ziihen Medium herumschieben oder umeinander drehen lassen, ohne den Zusainmenhang aufzugeben. Isolierte Tonopiasten lieI~.en sieh nieht vereinigen. 2*/.., St. naeh Plasmolysebeginn wurde der Versu& abgebroehen.

Naeh Plasmolyse yon 3 St. in 1,0 lnol Glukose ist (tie Plasmaoberfl:dche soweit erhiirtet, dai~ bei iJbertragen in 0,5 moI Glukose @Kleister in[olge der Deplasmolyse Bruehsiicke auftreten.

An einem Protoplasten liel~ sieh (bald naeh gersuehsbeginu) feststellen. da[~ eine P l a s m a l a m e l l e , wie sie bei der Wiedervereinigung yon n'od~ dur& einen Faden verbundenen Teilprotoplasten bisweilen zwisehen den Vakuolen bestehen bleibt, diese tats~ehlieh trenIm Es wurde in die Quer- wand zwisehen einer gebffne{en, leeren und der dahinter liegenden unx'er - sehrten Zelle mit einer Mikronadel eine kieine Offnung gestochen. Daml wurde mit einer stumpfen Nadel yon unteu auf den Sehnitt gedrii&t und so der plasmolysierte Proioplast der rtiekwiirtigen Zelle in mehr als zehn kleinen Portionen durch die Stieh5ffnung herausgedriickt :. jeder dieser kleinen Teilprotoplasten war mit dem vorhergehenden nnd dem folgenden dutch einen Plasmafaden verbunden, und sic vereinigten sieh in der ~iu~eren Zelle sofort wieder zu einem Protoplasten yon einheitli&em Um- ri[~.. An einer Stelle blieb eine feine Plasmalamelle zwisehen den Teil- vakuolen bestehen. Der ~iul~ere Meniskus des Protoplasten wurde ansehliel~.end verletzt, so daf~ er siela yon dieser Seite her aufzulbsen begann. An der erwiihnten Plasmalamelle blieb die Sehiidigung stehen, der restliehe Protoplast b lieb am Leben.

Der na&folgende gersueh belegt die V e r f e s t i g u n g d e r P l a s m a - o b e r f l i i e h e und des Plasmas nach Plasmolyse yon 24 Stunden Dauer.

V 17 (15.10.58). Allium, rot; dW, kurz, P1 in 1,0tool Glukose (dW) 24 St., Pr~ip. Die Plasmaoberfliiehe ist gegen eine stumpfe Mikronadel (die zuniiehst keine gerletzungen bewirkt) vbllig abweisend. Erst nadl mehrmaliger Beriihrung gelingt es, einen kleinen u aus dem Me- uiskus herauszuziehen, in einem weiteren Fall einen kurzen, di&en und trtiben Plasmafaden zu erhalten, der langsam wieder aufgenommen wird. Von der bereits dutch die Manipulation beeinflu~ten Oberfl~iehe lii{~t sidl sehlieitlich aueh wieder ein donner Faden 1 �89 Protoplastenl~ingen weir ausziehen, reifit aber dann bereits ab. Die Elastizitiit des Plasmalemmas ist

7 Das Durchtreten eines Protoplasten dural1 eine kleine Offnung besd~reibt P 1 o w e (1931) und schliel~t daraus, da~ das Plasmalemma elastisch ist und da~ es bei dieser Gelegenheit ebenso die Offnung passiert wie das gesamte Plasma und nicht etwa zuriiekgehalten und yon der durehgetretenert Plasmamenge neu gebildet wird.

Mikrurgische Untersuchung plasmolysierter, nadder Pflanzenprotoplasten 289

stark herabgesetzt; der dieke Plasinafaden besteht in seiner Hauptmasse aus dein ebenfalls verfestigten Binnenplasina. Wenn sieh sparer naeh me- ehanischer Beeinflussung ein d[inner Faden ausziehen lfil]t, der offenbar welter aul~en seinen Ursprung hat, kann au~ neuerliche Veriliissigung des P[asinaleminas auf Grund yon Thixotropie oder auf Verletzung einer festen An[~ensehieht und Fadenziehen eines darunter erhalten geblieBenen oder neu gebildeten Plasinaleminas gesehlossen werden (Ki i s t e r 1939).

b) Sacdmrose.

u 58 (20.9. 52). Allium, gelb; LW ft. 20 St., P1 in 0,8 tool Saecharose (dW) t St. 17 Min., Priip. -- Mit einer Pipette yon etwas weniger als Zelldureh- Inesser wird ein Protoplast an einen anderen, der in einer offenen Zelle liegt, angedriickt, his alle zwisehen den Partnern liegende LSsung verdr~ingt ist und sie sieh ohne Zwisehenraum beriihren. Ansehliel~end wird die Pi- pette vorsiehtig weggenominen. Die beiden Protoplasten, die sich nieht sofort trennen k~innen, wenu sie die Zellbreite ganz ausfiillen, runden sieh in der iiberwiegenden Mehrzahl der Yersuche (auch in anderen L6sungen) langsam wieder ab, so dal] die Beriihrungsfl~ehe kleiner wird. Die Fliissig- keit, welche dabei in den Raum zwischen den Menisken gelangt, Inu~ durdl die Zellwand zugetreten sein. IIn vorliegenden Falle verkleinerte sich die Beriihrungsflh.ehe in 1 his 2 Minuten auf etwa ein Drittel Zelldurehmesser, naeh 58 Min. war sie noeh etwas kleiner, nach i St..58 Min. unver~indert. 2 Tage sparer war der ~iul]ere, kleinere Protoplast abgestorben, das tote Plasma haftete an dem lebenden Partner. Dieser war in gutein Zustand, zeigte Plasinastr~inge und StrSinung und dein toten Plasma zugewendet einen etwas dickeren, hyalinen Plasinabelag. Diese Erscheinung, da~ a ia S t e l l e n , wo s i c h P r o t o p l a s t e n b e r i i h r e n , e t w a s P l a s m a an- g e s a i n m e l t w i rd , habe ich h~iufig beobaehtet. -- Zwei weitere Proto+ p]astenpaare, die naeh Plasmolyse yon 1 St. 22 Min. zusaininengedriiekt wurden, trennten sieh whhrend 10 his 15 Min. his auf einen Bertihrungs- punkt.

-V .50 (17. 7. 52). Allium, rot; LW fl. 8 St., P1 in 0,8 Inol Saccharose (dW) _57 Min., Pr~p. -- Naeh Plasinolyse yon insgesamt 57 Min. wurde ein Proto- plasfenpaar in einer Zelle aneinandergedrtiekt, naeh I St. 22 Min. ein wei- teres; in beiden Fiillen waren zwei Minuten sp~iter die Menisken wieder halbkugelig und beriihrten sidl kauin noch.

V 47 (26. 9. 52). Allium, rot; LW tl. 7 St., P1 in 0,8 Inol Saccharose 20 his .50 Min., Pr~ip. (inehrere Sehnitte). - - Sehonende Deplasinolyse dutch lang- samen Wasserzutritt vom Rande des Pr~iparates. Mehrere Protoplasten- paare wurden in der sehon gesehilderten Weise zusaininengebraeht. Keine Bereitsdmft zu Fusion, u oder aueh nur Fadenziehen. ~u Paare kleinerer Protoplasten wurden Init einer Pipette yon weniger als einem halben Zelldurehineser in einer Zelle so nebeneinandergelegt, dal] ihre B e r i i h r u n g s f l ~ c h e in d e r L ~ n g s r i c h t u n g d e r Z e l l e liegt (vgl. Abb. 3, S..50.5). Das Rnndungsbestreben der beiden Partner mull in diesem Fall, da sie auch an den Zellw~inden anliegen, eine krhftige gegen-

Protoplasma, Bd, XLIII/3. 22

290 L. Hofmeister

seitige Beriihrung bewirkell. Trotzdem war keine Verklebung oder son- stige Vereinigung die Folge.

Ein Versuchspaar diente dem V e r g l e i c h des P l a s m a s r u h e n d e r u n d w a c h s e n d e r Z w i e b e l n . Auch die wachsende Zwiebel zeigte dasselbe ablehnende Verhalten wie die ruhende. Nachstehend die Versuchs- bediugungen: V I1 (25.8.38). Allium, rot, r u h e n d ; dW kurz, P1 in J,0mol Saccharose (bidest. Wasser) I b i s 1�89 St., Pr~ip. - - V 12 (27.8.38). Allium, gelb, w a c h s e n d , frisch aus dem Garten; dW kurz, PI wie in V 1l, jedo& 30 his 50 Min., Prhp. -- In beiden Versuchen zeigten sich keine Fusions- erscheinungen, auch nicht Fadenbildungen oder Verklebung.

Ein weiterer Versuch brachte Protoplasten yon roten Radieschen mi'~: Allium-Protoplasten zusammen (Mic h e 1 hatte mit Radieschenprotoplasten sowohl allein wie auch bei Kombination mit Allium gute Erfolge). V 32 (17.7.52). Allium, rot; Radieschen, rot, Epidermis der ttypokotylknollen~ LW ft. 23 St., P1 in 0,8 mol Saccharose 20 Min., Pr~ip. - - Ein Radieschen- protoplast wurde an einen Allium-Protoplasten in ether geSffneten Zelle angeprel~t und blieb daran kleben. Etwa 35 Min. nach Plasmolysebeginn wurden vier Radieschenprotoplasten (sie sind kleiner als die yon dlli,m und haben als Kugeln etwa ein Drittel des Durchmessers ether Allium- Zelle) mit einem etwa doppelt so grol~en Allium-Protoplasten in eine Allium-Zelle zusammengebracht und durch leichten Druck lnit der Pipette zwei Stunden lang in gegenseitiger Beriihrung gehalten. Sie blieben getrennt. Nach Entfernung der Pipette blieben sie weitere 3 Tage miteinander in Beriihrung, vereinigten sich abet auch dann nieht. Weitere fiinf Radieschenprotoplasten blieben mit einem AlIium-Protoplasten durd~ 3 Tage in einer Zelle in lockerer Bertihrung; sie vereinigten sich ebenfalls nicht. Zwischen zwei Radieschenprotoplasten s liet~ sich 20 his 35 Min. nach Plasmolysebeginn ein Plasmafaden herstellen, der sich in den an- schlief~enden 5 Minuten so weir verkiirzte, dal~ sieh die Protoplasten be- rtihrten; eine weitere Vereinigung ergab sich daraus nicht, auch nicht beim nachfolgenden Reiben und Driicken.

Zusammenfassend l~i[~t sich tiber die Versuche in ZuckerliSsung sagen. dal~ R ohrzucker und Traubenzucker, welche die Oberflhche der plasmolysierten Protoplasten weniger ver~indern als eine grol~e Zahl der sonst in Frage kommenden Plasmolytika, die Fusion yon Allium-Protoplasten nicht begiinstigen. GlukoseliSsung lgfit immerhin Fadenziehen zwischen den Protoplasten zustande kommen, wenn auch erst nach lgngerem An- einanderpressen (V 2). Bet zusgtzlichem Einfluf~ yon Sfiirkekleister und Deplasmolyse kommt es zu h:~tufigerem Fadenziehen und zu Verklebung. Dal~ auch Glukose bet lang danernder Plasmolyse (24 St.) die Plasnlaober- flhehe verfestigt und sie unelastisch und abweisend macht, zeigt V 17.

s Die Radiescllenprotoplasten -- dutch Zerreifien der Schnitte g'ewonnen -- waren allgemein recht plasmareich, gesund und robust; einer der beiden erw~ihntcn zeigte einen Zellkern mit umgebendem Plasma nach Art ether Plasmasystrophe, der andere ein etwa der Zentrierung (Vorstadium der Systrophe, Germ 1931) ent- sprechendes Bild.

Mikrurgisdle Untersuchung plasmolysierter, nackter Pflanzenprotoplasten 291

In Rohrzuckerltisung trennten sieh dagegen die Protoplastenpaare stets wieder, his ant einen Fall ether besehr~nkten Verklebung (V 58), ohwohl die Protoplasten in den geiSffneten Zellen auf eine Art zusammengebraeht wurde~, welehe das Auseinandertreten nieht begiinstigt. Die Radiesehen- protoplasten zeigen aneh in Saeeharose untereinander und gegeniiber Allium ihre yon M i c h e l gesehilderte Fusionsneigung; fiber Fadenziehen nnd Verklebnng ging es in meinen Versuehen allerdings nieht hinaus.

2- V e r s u c h e in S a l z l 6 s u n g e n

a) Kaliumnitrat.

Bet Plasmolyse in Kaliumnitrat zeigen sich bald nach dem Einlegen in die LSsung die ersten Anzeichen der Plasmaquellung. Nach Einwirkung yon zwei bis mehreren Sfunden kommt Kappenplasmolyse zustande (H~i t- Ie r i928). Das Plasma madlt dabei eine Volumszunahme his auf das Zehn- und Mehrfaehe des Ausgangsvolmnens dutch. H t i f l e r (1959, S. 574) hal diese starke Volumszunahme als Argument gegen die Vorstellung eines dureh allzu viele Bindungen starren Molekiilgeriistes aus sieh iiberkreu- zenden Ketten gebrauehf, wie es nach der Haftpunktfheorie F r e y - W y s s - l i n g s in der Fassung yon 1958 angenommen werden konnte. H S f l e r machte geltend, da~ ein derarfiges Plasmageriist bet einer so enormen ger- grSl~erung zerstbrt werden mtil]te, w~ihrend in Wirkliehkeit das Kappen- plasma am Leben b]eibt und die Quellung bet Einwirkung yon Kalzium bis zu einem hohen Grade reversibel ist. F r e y - W y s s l i n g (1955, S. 184 f.; vgl. 19~8, S. l16f.) wendet dagegen ein, dal~ molekulare Netzstrukturen enorme Quellungsgrade erreiehen ki3nnen, ohne zerstiSrt zu werden. Er legt iibrigens in den sphteren Ausgaben seines Werkes mehr Gewieht ant dureh Kohiisionskriifte bewirkte Parallellagerung der Kettenmolektile (1948, S. 118) bzw. auf die Orientierung yon Makromolekiilen dureh long-range forces (1955, S. 158 ft., 186) als auf die u eines sfarren Netzes mit festen Bindungen an den Kreuzungsstellen.

Die Vakuolenhiiufe treten bet der Kappenplasmolyse starker hervor a|s im Normalzusfand (oder etwa bet Plasmolyse in Zu&erl6sung) und nehmen an Sehiehtdicke zn (Ht i f le r , 1. e., S. 552). Man nimmf gewtihnlieh an, dal] es Lipoide sind, die bet der Aafquellung aus dem Binnenplasma, in dem sie locker gebunden waren, in die Tonoplastenhaut iibertreten; es fragt sieh, ob dabei nieht aueh an Proteine gedaeht werden soll. Es isf sehwer vorstellbar, daft die ~iu~ere Ptasmagrenzsehieht "con diesen Vor- giingen g~nzlieh unbeeinflul]t bleiben sollte; tatsgehlieh erweist sich die iiul]ere Plasmahaut naeh liingerer Plasmolyse in Kaliumnitrat bet Behand- lung mit Mikroinstrumenfen als besonders test nnd widerstandsfiihig ( H o f m e i s t e r 1940). - - H i i f l e r unterseheidet zwisehen starker Quellung bei Kappenplasmolyse, bet der die Plasmastrbmung anfhSrt, und der leiehten QuetIung, wie sie naeh kurzer Einwirkung des Kaliunmitrates zustande kommt, bet der die StrSmung erhalten bleibt, in den vorliegenclen Yer- suehen isf mit Einwirkung yon 12 Min. bis 2 Stunden durehwegs leiehte Quelhmg gegeben. Das Plasma ist sehon naeh kurzer Einwirkung reeht

22 *

292 L. Hofmeistcr

fliissig, wie sieh bet der Behandlung mit der Mikropipette zeigt, auch dk" Plasmaoberfliiehe seheint bereits veriindert zu sein. Jedenfalls verliefen F u s i o n s v e r s u e h e in r e i n e r K a l i u m n i t r a t l b s u n g an den drei untersuehten Sehnitten n e g a t i v . Die Versuehsbedingungen waren: V 13 (27. 8.38). Allium, rot; dW 3 Min., P1 in 0,6 n-KNO:, (bidest. Wasser) 47 Min. his I St. 17 Min., Priip. -- Die Protoplasten verhielten sieh gegeneinander vbllig abweisend.

Anders wirkt k u r z d a u e r n d e P l a s m o l y s e in K a l i u m n i t r a t - l t i sung , n a e h de r d ie S e h n i t t e in R o h r z u e k e r g e b r a e h t we t - den. I)iese gersuehe entspreehen weitgehend den yon M i c h e l fiir Plasma- fusionen besonders giinstig gefundenen Bedingungen.

g 37 (20. 9. 52). Allium, gelb:, LW ft. 16a/'* St., P1 zuniiehst in 0,5 u-KNOa (dW) 12 Min., dann Sehnitt in 0,8 mol Rohrzucker gut abgespiilt und darin priip. Naeh 14 Min. werden in einer Zelle zwei Protoplasten mit breiter Fliiehe yon ca. neun Zehntel Zelldurehmesser aneinandergedrti&t. Naeh Aufhbren des Druekes raseher Riickgang der Beriihrungsfl:~iehe au[ dreiviertel Zelldurehmesser, naeh ether Stunde weitere Verkleinerung auf halben Zelldurehmesser, yon da an (46 Stunden) unver~indert. Die Pro{o- plasten sind sehliefllieh (trotz Paraffintilversehluf~) dureh leiehten Wasser- verlust der Lbsung etwas verkleinert, keine Fusion. -- Mit einem anderen Protoplastenpaar wurde naeh 44 Min. Yerweilen in der Zuekerlbsung Fu- sion erzielt. Die Plasmalamelle an der Fusionsstelle versehwand w~hrend I0 Min. und ist dann nur noeh dureh eine Ansammlung feiner Kbm/chen im Plasma kenntlieh. - - Im Laufe yon Stunden g e h t in de r R o h r z u c k e r - l t i sung d ie d u r e h das K a l i u m n i t r a t v e r u r s a e h t e Q u e l l u n g w i e d e r z u r ii e k, ein Vorgang, der zmnindest fiir stiirkere Quellungsgrade sonst nur bet Darbietung yon Ca eintritt. Das Plasma sieht dann wieder aus wie das der Kontrollsehnitte in Zuekerlbsung, bleibt abet etwas fliissiger; z. B. zeigt sieh in V 35 (19. 9. 52) naeh 20 Min. KNOa-P1. und 1 St. 25 Min. Rohrzueker-Pl. noeh immer auffallend tltissiges Plasma, w~ihrend bet reiner Rohrzuekerbehandlung eine Verfestigung hereits kenntlieh w~ire. Naeh 46 Siunden lebten die Protoplasten noeh und zeigten keine Spur dee urspriingliehen Quellung mehr. Man kann annehmen, dal~ das Salz ent- weder wieder exosmiert ist oder da~ es aus dem Plasma in die Vakuole eingedrungen und zu unwirksamer Konzentration verdtinnt ist.

Im folgenden Versueh tritt zu den bisherigen Einfltissen noeh der yon Sfiirkekleisterzusatz und Deplasmolyse:

V 24 (5.7. 52). Allium, rot; LW fl. 4 Tage, P1 zuniiehst in 0,5 n-KNO~, 2 St., dann in 0,8mol tlohrzueker-Stiirkekleister 30 Min., Priip. - - Das Plasma ist mehr verquollen als in den vorhergehenden u zeigt abet trotz der liingeren Einwirkung des Salzes noeh keine Kappenplasmo- lyse. Kin Protoplastenpaar wurde ill der Pipette dureh 30 Miu. in Be- riihrung gehalten. Keine Fusion, aber Neigung zum Zusammenkleben und ]~Tntstehung -v-on Plasmafiiden bet Trennung der Verklebungen. Let&re, sehonende Deplasmol3rse dureh Was,serzusatz iindert diesen Zustand sofort:

Mikrurgis&e Untersuchung plasmolysierter, naekter Pflanzenprotoplasten 293

Die Bereitsehaft zur u versehwindet und die Protoplastenober- fliiehen verhalten sieh - - iiberrasehenderweise - - vSllig abweisend.

Die Besehaffenheit der mit Kalinmnitrat vorbehandelten und in Rohr- zueker iibertragenen Protoplasten ist der Beaehtung weft. Zuniiehst is~ das Plasma naeh der Salzbehandlung aueh in der Zuekerlbsnng auf lange Zeit auffallend fliissig, und die Aufnahme yon Protoplasten mit Pipetten, die gewShnlieh einen etwas kleineren Durehmesser haben als der Proto- plast bzw. die Zelle, geht besonders glatt und leicht vor sieh, da der De- formation kein Widerstand entgegengesetzt wird; sie hat aueh keine naeh- teiligen Folgen fiir den Zustand der Protoplasten. Naeh 20 bis 50 Min. Aufenthalt in Rohrzueker (u 35) geht die Wiedervereinigung geteilter Protoplasten, zwisehen denen ein Plasmafaden erhalten blieb, sehr raseh vor sieh, die Formver:~inderung geschieht geradezu ruekartig, was auf die fliissige Eigensehaft des Plasmas und besonders der ~iul~eren Plasmagrenz- schieht hinweist. Unter diesen Bedingungen ist gewShnlieh Bereitsehaft zu Verklebung und Fadenziehen gegeben. Doeh sehon naeh 50 his 40 Minmen Verweilen in Rohrzucker sehliel]en in der Regel die Tonoplasten nieht mehr aneinander, es bleibt eine Plasmalamelle dazwisehen. (Doeh ist die Fusion des u u 37 naeh 44 Min. Zu&eraufenthalt entstanden.) Allgemein ist zu sagen, da~ eine gewisse Bereitsehaft der Plasmaobertliiehe wenigstens zu Fadenziehen und Verklebung in den Ablauf der Entquellung hin- einf~illt, welehen das Plasma naeh der KaliumnitratpIasmolyse in Rohr- zucker durehliiuft. Naeh 1 St. 4t Min. Rohrzu&eraufenthalt (V 57) ist das Plasma nieht mehr so fliissig wie kurz naeh der ~rbertragung in die Zueker- 15sung. Ansgezogene F~iden sind auffallend elastiseh. (Es wiire interessant, naeh dem Beispiel yon P l o w e zu entseheiden, ob fiir diese Eigensehaft das Plasmalemma oder das Binnenplasma verantwortlieh isI.) Na& 3�90 St. I/ohrzu&ereinwirkung blieb bet dem Versueh, die Protoplasten mit der gewohn~en Gesehwindigkeit in eine engere Pipette einzusaugen, ein Tell des Plasmas in Form einer Plasmafahne zuriiek; es war ein offenbar feste,- rer Teil der Plasmahtille yore Tonoplasten nieht mitgenommen worden, die iiefer gelegenen Sehiehten des Plasmas verbleiben als nunmehr diinnere Hiille tiber der Vakuole und lassen keine Seh~idigung erkennen. Es fragt sieh, ob in diesem Falle eine neue Oberfliiehensehieht gebildet wurde oder ob die verbleibende sieh tiber die ganze Fliiehe gedehnt hat (wie dies naeh Plowe anzunehmen wiire). An vergleieb_barem Material, das nut in 0,8tool Rohrzucker (also nicht mit KNO:~) behandelt wurde, war naeh Plasmolyse yon 2�89 Stunden Ahnliehes zu beobachten. Es diirfte sieh demnaeh im ersten Falle nieht um den Einflu{~ des Ka]iumnitrates, sondern um den der langdauernden Zu&erplasmolyse naeh seinem Sehwinden handeln.

b) Versuche mit gquilibrierter Ldsung. Die Beeinflussung der Plasmaoberfl~iehe dureh kurz dauernde Behand-

lung mit KaliumnitratlSsungen ist unverkennbar, wenn aueh in lneinen Yersuchen nieht mehr als ein Fall yon Fusion zustande kam und sonst nut die Tendenz zu Fadenziehen und Verklebung auftrat, w~ihrend M i c h e l

294 L. Hofmeister

bet etwa gleiehen Yersuehsbedingungen zahlrei&e Fusionen gelangen, hn Grunde trat die fusionsf5rdernde Wirkung des KNOa, wie sehon erw~ihnt, nieht in dieser Lbsung, sondern bet dem naehherigen Aufenthalt der Sehnitte in Rohrzuekerltisung auf; reine KNOa-Ltisung ist fusionsfeindlieh. Um einerseits die anerkanut sehiidliehe Wirkung des reinen Alkalisalzes zu xTermeiden und anderseits die Versuehe in der Salzlibsung selbst zu Ende fiihren zu ktinnen, wandte ieh eine iiquilibrierie Ltisung an. Idl wiihlte dazu -- vbllig willktirlieh -- eine Lbsung, die yon C h a m b e r s (1943) bet Mikroinjektion in das Plasma des Sehleimpilzes Physarum und aueh yon Siifiwasserambben als vtillig unsehiidlieh befunden wurde. Die Znsammensetzung dieser Libsung war: KC1 0,120 tool, NaC1 0,015 mol, CaCI~ 0,003mol; das gerh8ltnis K : N a = 9 : I und ( K - } - N a ) : C a = 4 1 : I . Idl stellte unter Beibehaltung dieses Verhiiltnisses eine konzentrierte Stamm- ltisung mit der vierfaehen Konzentration her tim folgenden stets als ,Chamb. 4faeh ~176 bezeiehnet) und davon Verdtinnungen bis zu ,,Chamb. 1,bfaeh ~ Die Lbsung wurde yon den Allium-Protoplasten sehr gut vertragen, zumal sie nur auf ihre Oberfl'aehe einwirkte; aueh Plasma, da.~ seiner Vakuole beraubt wurde, h~ilt sieh darin l:angere Zeit ]ebend (V 72). Fiir das Objekt Allium enthiilt die Ltisnng vielleieht etwas zt~ wenig Kal- zimn, denn in den Randzellen der Sehnitie war vereinzelt Plasmaquellung zu beobaehten. C h a m b e r s (1. c.) finder, dal~ als vertr/igliehe Anl}enltisung {iir die Plasmamembran (zuniiehst zoologiseher Objekte) eine 1)alaneierte Ltisung yon Natrium und Kalimn in Frage kommt, Kalzimn ist dafiir i~l der Aul~enltisung nieht notwendig. Bet Allium-Protoplasten wttrde Quel- lung des Plasmas eintreten, wenn die Libsung ohne Kalzium gebo[en wird. l)af~ aueh bet gewissen Pflanzenzellen Kalzium fitr die ~ul~ere Plasma- grenzsehieht entbehrlieh sein kann, zeigt die Feststellung yon } t r i f l e r (1951), wonaeh Desmidiaeeae Behandlung mit Kalimnoxalat und sogal: Plasmolyse darin ertragen ktinnen, also Kalzimn zur Restitutim~ oder Neu- bildung des P]asmalemmas bet Plasmolyse ni&t benibtigen.

V 61 (15. 10. 52). Allium, rot; LW fl. 4'/-, St., P1 in ,,Chamb. 4faeh" 32 Min.. Priip.: Plasmolyse, auffallend viel Heehtsehe F~iden, die bet der Mani- pulation sofort versehwinden; glatte Plasmakontur zeigt dann, dat~. das Plasma iltissig ist.

u Wie in V61, jedoeh: P1 1 St. 27 Min. -- Plasmolysegrad nm 0,47. Deplasmolyse dureh sehonenden Wasserzusatz his zu Einstellung eines Plasmolysegrades yon etwa 0,8. Yerklebung und Fadenziehen zwisehen den Protoplasten vielfaeh und leieht ztt erreiehen. -- Weiterer Wasserzusatz his zur vtilligen Deplasmolyse: Die Bereitsehaft zu Verklebung und Faden- ziehen dureh 2 Stunden hindureh an zahlreiehen Protoplasten festgestellt. Ein Beispiel: Ein farbloser Protoplast aus Grundgewebszellen mit zwei roten Epidermisprotoplasten ,-erklebt. Die Beriihrungsfliiehen haben einen I)urehmesser yon 20 #. Dureh Bertihren des in der Lbsung sehwebenden Ver- klebungsproduktes mit dem Mikroinstrument ist die Yerbindung ni&t zu !iJsen. Dutch eine unbeabsi&tigte, st~irkere Erschtitierung der feudtten Kam- mer wird jedoeh der eine der roten Protoplasten losgerissen, der andere

Mikrurgische Untersudmng plasmolysierter, naekter Pflanzenprotoplasten 295

legt sieh zugleieh nnd sehlagartig mit breiterer Fl~iehe an den weil?en an. Der Winkel zwisehen den be]den Fliiehen ]st grtil~er als ein reehter. Es liegt Fusion vor, jedoeh ohne u der Vakuolen.

3?63. Wie V6t und 62, jedoeh: P1 2 St. 27 Min., Priip. - - Deplasmolyse. Plasma ]miner noeh fliissig, Oberfliiehe nieht verfestigt. Leiehte Plasmaquel- tung in Randzellen.

V T0 his 75 (16. 10. 52). All]urn, rot; LW ft. ca. 50 St., PI in ,,Chamb. 4faeh" lg Min., Priip. - - Herstellung der Beriihrung zwisehen den zahlreieh austretenden. Protoplasten dureh Versehieben der Sehnitte. Verklebung vielfaeh beobaehtet.

V 64 (15. I0. 52). All]urn, rot; LW ft. 7 St. 17 Min., P1 in ,,Chamb. 4faeh" 20 Min., Priip., sehonende Deplasmolyse dureh Wasserzusatz. Es ]st !eieht und vielfaeh gerklebung herzustellen. Die so entstandenen Doppel- protoplasten ]assen sieh dureh Mikroinstrmnente in der Ltisung sehwebend nieht mehr trennen. -- Naeh 17 Stunden Einwirkung -,'on ,,Chamb. 4faeh": Kappenplasmolysen mit sehmalen Kappen am Sehnittrand, zwei Zellreihen fief. In den iibrigen Zellen viele Heehtsehe Fiiden, Plasmastr:,inge, Systrophe, Plasmalamellen. Die Kerne (in Salzltisungen das eniseheidende Merkmal fiir guten Zustand) nieht aufgebliiht.

u 69 (15. 10. 52). All]urn, rot; LW ft. 6 St. 20 Min., P1 in ,,Chamb. 4faeh ~ i0 Min., Pr~ip. in ,,Chamb. 2faeh" @ Kleister. In dieser Konzentration nut ganz sehwaehe Plasmolysen. Naeh weiteren 20 Min. aneinandergelegte Protoplasten rfieken noeh mehr zusammen bzw. bleiben in ihrer Lage, in einem Fall noeh naeh 15 Stunden unver~ndert; in einem anderen Fall war einer der be]den Protoplasten abgestorben, ohne an der Oberfliiehe des Partners Koagulum zu hinterlassen, was flit nut leiehte gerklebung sprieht. - - Naeh 15 Stunden war die Oberfl~iehe kleiner Protoplastenkugeln, wie sie yore Zerteilen des Sehnittes her stammen, verfestigt. Die grtil~eren Protoplasten sind nieht verfestigt, aber doeh ein wenig empfindlieher als etwa frisehe Zuekerprotoplasten. Wie in vielen Fiillen, wurde aueh an die- sere Material versueht, die Fusion dutch Verletzen der Beriihrungsfl~iehe zweier Protoplasten zu bewirken, wie stets ohne Erfolg.

Da starke Plasmolyse eine Fnsionsbereitsehaft nieht begiinstigt, wurden Versuche aueh mit der nut schwaeh hypertonis&en Konzentrafion ,,Chamb. 2faeh" angestellt.

V66 (14. 10. 52). All]urn, rot; LW tl. I St. 18 Min., P1 in ,,Chamb. 2[aeh ~ 52 Min., Priip. - - Die Plasmolyse ]st in dieser Liisung sehr sehwaeh, so daft der Rasierklingensehnitt in jeder ge6ffneten Zetle den Protoplasten trifft und zerteilt. Das Plasma ]st fliissiger als in ,Chamb. 4faeh '~ es gibt viele, feine Heehtsehe Fiiden, Verklebung eines kleinen Teilprotoplasten yon weniger als einem halben Zelldurehmesser mit einer in einer Zelle liegendeu Protoplastenkugel yon etwa Zelldurehmesser (Abb. 1). Der kleinere Proto- plast erhiilt beim Andrtieken unregelmM~ige Gestalt und beh~ilt diese be], eine P]asmalamelle sehriig dureh die u (ira Bild links oben) halt die Deformation aufreeht. Abb. I a ]st 40 Min. naeh Herstellung der Verklebung und 1 St. 22 Min. naeh Plasmolysebeginn aufgenommen. Naehbeobaehtung

296 L. Hofmeister

5 St. 10 Min. (Abb. I b) und 5 St. 47 Min. nach dem Einlegen: die Bertih- rungs}liiche hat sieh ein wenig vergrti[~.ert, die Protoplasten haben an u lumen etwas zugenommen.

V67 (14. 10. 52). Allium, rot; LW fl. 5 St. 10 Min., P1 in ,,Chamb. 2faeh" 40 Min., Pr~ip. in ,,Chamb. 2faeh" @ Kleister. gerklebung yon zun~iehst vtillig getrennten Teilen desse]ben Protoplasten in einer Zelle; sie waren nieht mehr zu trennen.

V 67 a (14. 10. 52). Allium, rot; LW ft. 5 St., P1 in ,,Chamb. 2faeh" 30 Min.. Priip. in ,,Chamb. 2faeh" @ Kleister. Nach weiteren 15 bis 20 Minuten wurden zwei Protoplasten frei im Kleister znsammen- gelegt, wobei der eine klein und kugel- fiSrmig, der andere langgestreckt aus der Pipette kam und diese Gestalt aueh bei- behielt. Sie waren zuniiehst dutch leiehtes Anstol~en mit Mikroinstrumenten nieht zu trennen. Naeh 25 Min. dureh heftiges Anstol~en getrennt, verhalten sie sieh gegeneinander weiterhin viillig abweisend. Naeh wiederholtem Einsaugen und Ausstofien mit der Pipette bat ten sie wieder aneinander, jedenfalls auf Grund thixotropiseher gerfliissigung ihrer Ober- tl~iehe, vielleieht anch nach Enffernung oder ZerstiSrung eines hemmenden Ober- flhchenfilmes. Dutch die energische Be- handlung wurde yon einem der Proto- plasten ein kleiner Plasmatropfen mit

Abb. 1. totem Zellsaft abgetrennt, der einem der beiden zun~ichst aufien anhaftete, nach

Stundc aber als Ganzes, d. h. unter Beibehaltung seines Zellsaftes yon ~hm aufgeuommen wurde, so daft er innerhalb der Plasmakontur zu liegen kam.

c) Kersuche mit Seewasser. Seewasser, das Medium, in dem viele Orgauismen leben, dart als idealc

tiquilibrierte LiSsung betrachtet werden. Seine Yertrhglichkeit auch for nicht marine Objekte mag durch einen Resistenzversuch aus meinen alten Proto- kollen illustriert werden. Zygnema sp. aus dem Wienflufi bei Hiitteldorf wurde in plasmolysierenden Konzentrationen yon Kaliumchlorid und Kaliumnitrat gehalten. Nach 24 Stunden waren nahezu alle Zellen tot. In Seewasser dagegen, das mit bidest. Wasser auf 60% verdiinnt worden war. lebten am 16. 1.33 eingelegte F~iden noch am 9. 2. zu 90 bis 95% in schwad~ plasmolysiertem und sonst gutem Zustand; am 29. 3. desgleichen, doch waren sie nut ganz schwach plasmolysiert. In ann~ihernd isotonischem 38%igem Seewasser lebten zu den gleiehen Zeitpunkten noeh 100%. Es lag ~

Mikrurgisehe Untersuchung plasmolysierter, naekter Pflanzenprotoplasten 297

nahe, Seewasser als besonders unsehgdliehes Medium audl ftir Fusions- versuehe anzuwendem

V16 (27. S. 58). A!lium, rot; dW 5 St. 20 Min., P1 in unverdiinntem Helgoliinder Seewasser 9 1 St., Priip., ansehliefiend Zusatz yon bidest. Wasser un te r Absaugen auf der anderen Seite des Prgparates bis zur viJlligen Deplasmolyse, wobei viele Protoplasten aussehliipften. Etwa im Zeitpunkt der erreichten Deplasmotyse wurden an einen aus einer ZelIe herausstehen- den Profoplasten zwei Teilsttieke anderer mit der StriSmung herangefrieben. Sie b e r i i h r t e n n a e h e i n a n d e r d e n v o r s t e h e n d e n P r o t o p l a s t e n u n d w u r d e n j e w e i l s s e h l a g a r t i g a u f g e n o m m e n . Unmitfelbar da- naeh war keine Spur mehr davon zu sehen, dal] es sieh um ein Fusions- produkt handelte, aueh die V a k u o l e n hatten sieh sofort zu einer einheit- lichen vereiuigf. Das Fusionsprodukt enfspraeh in seiner Grgl3e etwa der Hiilfte bis einem Dritfel einer Allium-Zelle; es konme nur dureh einige Minuten weiterbeobaehfef werdeu und "blieb so lange unver:dndert. Dieser Fall yon Fusion war der e i n z i g e , in d e m d i e V a k u o l e n s o f o r f zu r V e r e i n i g u n g k a m e n .

Ein Riickblick auf die u in SalzlSsungeu zeigt zungchst, daI~ bei , Plasmolyse in reiner KaliumnitratliSsung die Oberfliiche der Protoplasten

verst~irkt und gegen ihresgleicheu vi~llig ablehnend wird. Nach m~ifliger Einwirkung der SalzlSsung kommt es nach ~bertragung in Rohrzucker wiihrend des allm~ihlichen Schwindens der Salzwirkung zu Verklebungen. besonders wenn der ZuckerlSsung Stiirkekleister beigemengt isi. In diesem Fall macht Deplasmolyse die Oberfl~iche vSllig abweisend. In ~iquilibrierten Liisungen ist Fadenziehen und Verklebung hiiufig, auch Verschmelzung wurde erzielt. In Seewasser plasmolysierte und dutch Wasserzusatz vi~llig" deplasmolysierte Protoplasten zeigten die einzige zugleich schlagartige und restlose Vereinigung yon Plasma und Vakuole, welche in der ganzen Ver- suchsreihe beobachtet wurde. Deplasmolyse wirkf in den ~iquilibrierten L6sungen fiSrdernd auf die Verklebungs- bzw. Fusionsbereitschaft.

5. V e r s u c h e u n t e r d e m Ein f lu [~ o b e r f l ~ i c h e n a k t i v e r S u b s t a n z e u

Protoplasfen, welche mit mikrurgischen Methoden so aneinandergedriick~ werden, dal~ sie sich an der Berhhrungstl~iche abflachen, trennen sich in der Regel bald wieder unter dem Einflu~ ihres Rundungsbestrebens. Wenn die Grenzfliichenspannung Protoplast/Li~sung durch enisprechende Zusiitze zum Plasmolyiikum herabgesetzt wird, ist das Rundungsbestreben geringer und die Rundung tritt langsamer ein; die Oberfl~ichen bleiben dadurch l~l~ger in Beriihrung und kSunen einander wiihrend eines liingeren Zeitraumes be- einflussen. Daneben ist damit zu rechuen, dal~ die oberflgcheuaktiven Mittet die Struktur der Protoplastenoberfl~ichen ~indern. Eine solche _;~nderung kSnnte dutch einfache Adsorpfion der oberflhchenakti~en Substanz an der

9 Das Seewasser stand seit einigen Wodlen in einem Ballon in dcr Dunkel- kammer des Wiener Pflanzenphysiologisdmn Institutes.

298 L. Hofmeister

P ro top l a s t enobe r f l i i ehe bzw. b e s t i m m / e n K o n s t i t u e n t e n d e r s e l b e n z u s i a l l d e k o m m e n ode r d u t c h E i n d r i n g e n d e r b e f r e f f e n d e n S u b s t a n z e n z w i s d l e n d i e B e s t a n d t e i l e de r P l a s m a m e m b r a n , also i h r e n E i n b a u in diese, u n d sehliel~- lieil d t l reh D e n a t u r i e r m l g ode r sons t ige V e r i i n d e r u n g yon Eiweil~stoffen, w e l & e a m A u f b a u d e r P lasmaober{ l~ehe b e t e i l i g t s in& Al l e d iese Yer- :~inderungen s ind sowohl {[ir d ie F u s i o n s v e r s u c h e als auch z u m S f u d i m n d e r P l a smaobe r f l i i ehe yon In te resse .

Idt bediente nlidl zur Herabsetzung der Grenz[l/ichenspannung Protoplasffl~ii- sung bzw. Protoplas t /Protoplas t handelsi ibl i&er Netzmittel. Die N e t z m i t t e I, wekhe in vielen Industr iezweigen seit l~ngerem grol~e Bedeutung erlangt haben, spielen (in Osterreidl lnit der dutch den Krieg bedingten Versp:~itung) heute audl im biirgerliehen All tag als Bestandleile yon Desinfektions-, Was&- und Reinigungs- mitteln, Zahnpasten, Ptlanzensdlutzpr~iparaten und in -eielen anderen \Terwendun- gen ihre Rolle. Es sind Substanzen yon polar -apolarem Verhalten, das heifit, eine Seite ihres Molekiiis ist polar-hydrophi[ (Hydroxyl- , Karboxyl- , Sutfons'~iure- Gruppe), die andere apolar-organophi l -hydrophob (Alkylgrnppen). Diese Mittel setzen, in geringer Konzentration geboten, die Grenz[l~idmnspannnng zwis&en ver- sdliedenen Medien betr~idltlieh herab. So gibt die F inna Shell in einer Druekschrift tiber ihr Netzmittel Teepol (ein Na-alkyl-sulfat) ,0 Herabsetzung der Grenzfl/iehen- spannung Xylol/Wasser Yon 56 auf 6,5 dyn/em bet einer Beimisdmng yon 0,2% des Mittels an.

Zun~i&st galt es festzustellen, wie solehe Netzmittel auf lebendes Protoplasma wirken. H ~5 b e r (1947) besprieht die Bedeutung, weldle die als Netzmittel, Di- spergiermittel und Emulgatoren verwendeten oberfl/iehenaktiven Substanzen fiir experimentelle Studien an biologis&en Grenzfl~iehen haben. Er behandelt die Wirkung derart iger Stofie ** auf die Ruhepotentiale und die Erregbarkei t yon Muskel und Nerv nnd gibt Hypothesen fiber ihre Wirkungsweise an den plas- mat is&en Oberflhchen. Er betont den denatur ierenden Einflu~ der polar-apolaren [onen auf Eiweil~e, der allen diesen Substanzen zukommt, und spridl t yon Loeke- rungsvorghngen in den Ober|l~idtenmend)ranen des Plasmas, die bis zur Dc, s- organisation fiihren (1. e., S. 571). M o n n 6 (1947) untersudlte an Eiern yon Strougylocentrotus snwie an Keim- nnd Gewebezellen yon Helix pomatia die Wir- kung hiehergehSriger Substanzen, die er linch ihrer sauren oder alkal isdlen Natur in zwei Gruppen einteilt ~h In den ziemlieh hohen Konzentrat ionen yon 0,1 his 1% fand er sie alle kr'aftig eytolysierend. Sie lbsen die Lipoide des Plasmas. Beziig- Itch der Wirkung auf die Plasmaproteine ergab sidl vers&iedene Wirkungsweise der sauren und alkal isdlen Verbindungen; die saurel~, wirken dispergierend, die basisdmn fhllend. In geringeren Konzenirat ionen yon 0,00t his 0,002% ist kein

i0 R ' , R ) CI{. O . SOaNa. I& beniitze im weiteren Text die Bezeidmungen Sul-

fat bzw. Sulfonat entspre&end den Angaben des betreffenden Autors oder der Firma, atteh wenn die gleidle Verbindung gemeint ist.

** Alkylsulfonate, Dialkylsueeinylsulfonate , Alkylbenzolsulfonate.

~-~ Basisehe Substanzen: Cetylpyridiniumchlorid, Zephirol (Al!;yldimethylbenzyl- ammoniumddorid) , QR-Dupont (Brompyridiniumeetylsulfonat) . Saure Sabstanzen: Natr iummyris ty lsul fa t , Natr imnlaurylsul fa t , Laneth-Salz (Misdmng Yersddedener Natr iumalkylsulfate) , Aerosol OT (Nafriumsulfobernsteins/iureditithylester) und Texapon LZ A689. Fi ir diese Auswahl reeht verschiedener Substanzen wird die Sammelbezeiehnung ,,detergents" gel)rm~dlt.

Mikrurgisdm Untersudmng plasmolysierter, naekter Pflanzenprotoplasten 299

Einflm~ auf die Helix-Zellen wahrzunehmen, solange die Plasmaoberflti&e (cortex) intakt ist.

M i r i m a n o f f (1953) unterseheidet drei Klassen yon Netzmitteln, anionisehe, kafionisdm und nicht ionisierte. Die anionisdmn sind in wgl!.riger L~isung je nadl Stoff und Zellsorte ~'ersdlieden giftig ftir die Pflanzenzellen. So ist ~.pirogyra in sehr ~Terdfinnter LiSsung (1 : 100.000) yon Natriumlaurylsulfat naeh 24 Stunden tot, wiihrend Zellen hSherer Pllanzen (Wurzelhaare, Wurzelmeristem) in 1:5000 noeh nadl 15 Tagen am Leben bleiben und die Pflanzen in denselben Li~sungen aneh kultiviert werden kSnnen. Elodea canadensis zeigt in 1 : 1000 naeh 24 Stunden nodl PlasmastrSmung und ist audl noch plasmolysierbar. Die kationisehen Mittel wirken stark keimti3tend und schiidigen Pflanzenzellen audt in Verdiinnten LSsungen. Die nidlt ionisierten Netzmittel dagegen sind besonders unsd~gdlid~. So wird das gut wasserlSs|iehe ,,Tween 20" nnd ,,Tween 80" in der Konzentration wm 1% yon L'lodea ohne Anzeichen einer Schgdigung ertragen.

Ieh verwm:tdete vorwiegend Alkyl lauryla lkoholsul fonat , das in geringen Konzentra t ionen wei tgehend nnsdlgdlieh war, in einer t /eihe yon u suehen aueh das schon erwiihnte Pr i ipara t Teepol der F i rma Shell.

a) Alkyllaurylallcoholsulfonat neben Rohrzudcer.

Znngdlst wurde die Grenze der gertr i igl iehkeit des Alkyl lauryla lkohol- su]fonates (ira folgenden stets mit ALAS bezeiehnet) festgeste]lt. In der dazu ausnahmsweise verwendeten AIlium-Innenepidermis, welehe ernp- i'indlieheres Plasma hat als die Aul~enepidermis, waren in 0,8 tool Rohr- zucker @ I : 1000 ALAS naeh 20 Min. die Randzel len noeh konkav plasmolysiert, die Zellen der Sehnittmitte mif runden Formen. Das Plasma war leieht gequollen. Naeh 50 Min. in einigen Ze]len im Schnit t inneren nu t Tonoplasten, in einigen anderen Tonoplastenplasnmlysen mit glasigen Ker- nen, der i iberwiegende Teil des Pr~iparates lebend mit normalen Plasmoly- sen. Naeh 16�89 St.: alles tot. - - Die Aufienepidermis war bedeutend resisten- l er, wie die folgenden Yersuehe zeigen.

V34 (18. 7. 52). Allium, rot; Radiesehen, rot (Epidermis und Grund- gewebe der Hypokotylknol leu) . LW tq. 35 St., Pl in 0,8 tool Rohrzueker @ I :1000 ALAS dutch 27 Min., Priip. Ansehliel~end Fusionsversuehe mit durehans negat ivem Ansgang zwisehen roten nnd farblosen }{adiesehen- protoplasten, die teils fret in der LSsung, tells in ether leeren Allium-Zelle aneinandergelegt wurden. Ferner zwisehen einem roten Radiesehenproto- plasten und einmn aus dem Zwiebelparenehym, die als einzigen Erfolg des Versuehes einen P lasmafaden zwisehen sieh bildeten. - - Naeh 55 Min. Plas- molysedatmr waren v i d e Zellen im Pr i ipara t gesehiidigt, die freigelegten Protoplas ten ver t rugen die Manipulat ion mit der P ipe t te nicht mehr und verliel3en sie meist als Tonoplasten, die won ~erquollenem Plasma mngeben waren. Dennoeh lebie bet der Naehbeobaehtung naeh drei Tagen eines der zusammengelegten Protoplas tenpaare , ohne indes Fusion zu zeigen.

g 5 3 (wie u Pr i ipara t ion nach Plasmolyse Yon 25 Min. Ein Proto- p las tenpaar mit Verklebung, die naeh vier Tagen noeh bestehf, doch zu keiner vi31ligen Fusion fiihrt. Der Winkel zwisehen den beiden Protoplas ten war auf einer Seite 150 ~ an t der andereu etwas kleiner als 90 ~'.

300 L. Hofmeister

Sehonender als Plasmolyseeintritt in Gegenwart des Netzmittels wa: dessen Oarbietung erst naeh der Pr~iparation. Die Versuche 29 und 41 zeigen die Wirkung der Netzmittelbehandlung naeh versehieden langer Dauer der Rohrzuckerplasmolyse.

V29 (17. 7. 52). Allium, rot; LW t3. 2 St. 20 Min., PI in 0,8mol Rohr- zucker 15 Min., Priip., dann in 0,Smol Rohrzucker @ 1:1000 ALAS. W~.hrend der ansehliefienden 20 bis 25 Min. wurden drei Protoplastenpaare jeweils in den Zellen mit der Pipette dutch 5 Minuten aneinandergepref~t. dann die Pipette entfernt. In allen drei Fiillen Verklebung, jedoeh keine Vereinheitliehung der Form des Doppelpr0toplasten. Naeh 2 St. alle drei. naeh 6�89 St. noeh zwei Paare lebend, nach 28 St. noeh ein Paar. Die Ver- klebung ist nieht wetter fortgesehritten.

V 41 (22.9. 52). Allium, gelb; LW fl. 5 St., P1 in 0,8 mol Rohrzueker 2 St., Pr~p., dann in 0,8 tool Rohrzueker -4- 1 : 1000 ALAS. Das Plasma ist merk~ lieh fester als in den ~-orhergehenden u wird j edoch im Gegensatz zu dem Verhalten in reiner Zuckerltisung dureh die Pipettenbehandlung' wieder fliissig (siehe S. 289). u der Protoplasten ist leieht herzustellen, ebenso Fadenbildung, weitergehende u nieht.

Aueh zwis&en unbehandelten und mit Netzmittel vorbehandelten Proto- plasten besteht keine Fusionsneigung. Als Fehlerquelle ist dabei allerdings denkbar, daf~ trotz gr[indliehem Abspiilen des Netzmittelsehnittes in reiner Rohrzuckerlbsung noeh genug Substanz iibrigbleibt, nut die unbehandelten Plasmaoberfliiehen zu ver~indern.

V l0 (22. 9. 52). Allium, gelb; LW ft. 5 St., P1 in 0,Stool Rohrzu&er 20 Min. - - Parallel dazu ein weiterer Sehnitt: PI in Rohrzu&er 10 Min.. dann 10 Min. in Rohrzucker q- ALAS. Dieser letztere Sehnitt naeh griind- liehem Abwasehen in Rohrzucker m it denl ersten zusammen prhparierL Fusionsversuche zwischen den beiderlei Protoplasten ohne Erfolg.

In einigen Fiillen wurde zusiitzlieh zu der Netznfittelbehandlung Stiirke- kleister angewandt, der im allgemeinen Fadenziehen und Verklebung fiJr- dert. Neben dem Netzmittel hat er die gegenteilige Wirkung.

V 18 (26. 9. 52). Allium, rot; LW ft. 2�88 St., P1 in 0,8moI Rohrzucker 11 Min., dann in 0,8 tool Rohrzuel';er @ 1:1000 ALAS 10 Min., Priip. iu 0,8mol Rohrzueker -q- Stiirkekleister. Die Protoplastenoberfl~ichen zeigen keinerlei Fusionsbereitsehaft.

V 50 (6. lO. 52). Allium, gelb und rot; LW fl. l �89 St., P1 in 0,Smol Rohr- zucker 1�89 St., Priip. in Rohrzucker q- Kleister, dann erst Zusatz ether kleinen Menge Netzmittel-Zucker-L~sung zum Pr~iparat. Abb. 2a zeigr einen kleinen roten Protoplasten, der eben (1 St. 2 Min. naeh dem Einlegen in das Plaslnolytikmn) aus der Pipette heraus und gegen den Meniskus eines gelben Protoplasten angedriiekt wurde. Naeh etwa einer halben Minute wird die Pipette unter leiehtem Naehstrom des darinnen enthaltenen Plasmolytikums vorsiehtig weggenommen. Der rote Protoplast ltist sieh wieder ab. Abb. 2 b zeigt zwei Stadien der Abltisung, die naeheinander, dureh zweimalige Beliehtung, auf demselben Fihn aufgenommen wurden: 3 Min. und 11 Min. naeh der ersten Aufnahme. Der rote Proioplast liegt

Mikrurgische Untersuchung plasmolysierter, naekter Pflanzenprotoplasten 30I

zuniiehst noeh mit breiterer Fliiehe an, dann nur noch mit sehr kleiner Fliiche, naeh weiteren 42 Min. (ABb. 2 c) wird er an der ZelI6ffmmg frei- ~iegend gefunden. Seine dem gelben Protoplas~en zagekehrte Seite zeig~ eine Plasmaansammlung, welehe in Abb. 2b noeh nicht festzustellen ist und der naeh Behandlung init der Pi- pette wie aueh mit Netzmittel erh5h- ten Neigung zu Plasmadifferenzierun- gen entsprieht, (Dieselbel~ Protoplasten wurden 25 Min. naeh der letzten Auf- nahme noehmals zusammengebraeht, trennten sieh abet wieder ziemlieh raseh.)

b) AlkylIaurylalkoholsulfonat nvben Kaliumn#rat.

Es wurde auch versueht, die Wir- kung yon Netzmitteln und Kalium- nitrat ztl vereinen. Die Grenze der gertr~igliehkeit gemeinsamer Einwir- kung, jenseits weleher der Protoplast die mikrurgisehe Behandlung nieht mehr erlaubte, war bald erreieht.

u (25. 9. 52). Allium, gelb; 12 Mi- nuten Plasmolyse in Kaliumnitrat und ansehliel~ende Priiparation in 0,8 tool Rohrzueker + 1 : 1000 ALAS lie13 die Protoplasten in gutem Zustand, Auf- nahme und Abgabe mit der Pipette war dureh etwa 55 Min. mSglieh. Naeh weiteren 20 bis 25 Min. 15sten sieh die Protoplasten sehon wiihrend des Ein- saugens in die Pipette auf; allgemein war zu diesem Zeitpunkt das Plasma leieht gequollen und liel~ lange, dicke l~'~iden zuriiek.

Wurde aber (V43) der Sehnitt ha& 12 Min. Plasmolyse in KNO~ in Zueker- lbsung pr~ipariert, erst naehher mit Zuekerlbsung @ Netzmittel ALAS kurz gespiilt und wieder mit reiner Zuk- Abb. 2. kerlbsung abgewasehen, so trat keine Sehiidigung ein, Das Plasma war sehr fliissig, die Hechtsehen Ftiden ~er- sehwanden binnen 10 Min, yon selhst. Neigung zu Verklebung war zu beobaehten. Wenn an einem Ende der Protoplasten das Plasma mit einer Pi- pette abgesaugt wurde, setzten sieh im gleiehen Augenblick [iber die ganze Protoplastenliinge zusammenhiingende Plasmastrhnge in Bewegung, die an

302 L. Hofmeister

sieh unsiehtbar, nur dureh mitbewegte KSrnchen und Mikrosomen kenntlidl waren. Diese Wirkung des Netzmittels betrifft zuniiehst sichtlieh nur die iiufieren Sehi&ten der Plasmahiille. Es liege sieh daran denken, daI~ lang- gesireckte Aggregate yon parallel liegenden Kettemnolektilen dureh die gemeillsame Wirkung yon KNO:~ und Netzmittel gegen andere, nieht his zmn Protoplastenende reidmnde Elemenie sehr leiehf ~r werden.

In einem Fall (V 44, 25. 9. 52) wurde der Netzmitteleinflul~ naeh KNO~- Behandhmg auf das Spiilen der Pipette mit der Netzmittel-ZuekerlSsung besehrankt. Die Protoplasfen zeigten weder gerklebung noeh Fadenziehen. obwohl die ersten, welehe die Pipette passierten, eine reeht fliissige Plasma- oberflg&e erkennen lie~en.

c) Alk'yllauryIalkoholsulfonat nut zum Spiilen der Pipetten oerroe~dei.

In den weiteren Versuehen wurde die Netznfitielwirkung auf das Ans- sp~ilen der Mikropipetten mit der LSsung 0,Stool Rohrzueker @ 1 : 1000 ALAS besehr~inkt, meist wurde ans&liel~end noeh mit rei~ler llohr- zuckerlSsung naehgewasehen, hn Protokollauszug steht ffir diesen Vorgang ,,Pipette gespiilt ~ Die Wirkung auf die Protoplasten besteht, wenn nieht geniigend ausgespiilt wnrde, in leichter Verfliissigung des Plasmas, welehe nur die ersten zwei his drei bearBeiteten Protoplasten betrifft. Weiterhin ist als einzige Auswirkung festzustellen, daft da s P l a s m a d i e W i i n d e d e r P i p e t t e z w a r b e n e t z t , a b e r n i e h t d a r a n k o a g u l i e r t u n d s i e h r e s t l o s w i e d e r d a v o n a b l b s t . Es verhhlt sieh gegen die Pipetten- wand etwa so wie gegen eine Zellwand, yon der es sehon einmal durctt Plasmolyse abgelSst wurde. Dadurch wird die Behandluug der Protoplasten mit der Pipette besonders gut veriragen und die Pipettes1 kSnnen mit mehreren Profoplasten naeheinander in Beriihrung gebraclat werden, ohne durch Koagulum unbrauehbar zu werden. Aneh das Paraffin51 verunreinigt die mit Netzmittel ausgespiilten Pipetten nicht, so daft ansehlieltend wieder mit w~il~riger LSsung gearbeitet werden kann. Die Erseheinungen erkl~iren sieI~ vielleieht dadureh, da~ die Netzmittehnolekiile die Pipettenoberfl~i&e, mit den hydrophilen Enden yore Glas abstehend, besetzen und so den Proto- plasten eine Sehieht bieten, weleb_e sieh :~ihnlieh verhiilt wie die hs, drophile Zellwand.

Fiir alle Arten yon Mikroinjektionsversuehen ergeben sieh dutch die Vorbehandlung der Mikropipetten mit Netzmitteln neue Mbglichkeiten.

hi bezug auf die Frage der Fusion gaben Versuehe mit den netzmittel- gespiilten Pipetten etwa dieselben tlesultate wie die vorhergehend mitgeteilten vergleiehbaren u ohne Netzmitteleinflufi; der Untersehied seheint lediglieh in der sehonenden Wirktmg der Manipulation zu liegen.

V 39 (20. 9. 52). Allium, gelb und rot; LW ft. 22�89 St., P1 in 0,8 mol Rohr- zueker t St., Priip., Pipette gespiilt.

V 45 (26. 9. 52). Allium, rot; LW fl. 21 St., PI in O,Smol Rohrzucker 50 Min., Pr~ip., Pipette gespiilt. - - In Liingsriehtung der Zelle neben- einandergelegte Protop]astenpaare (vgl. S. 289 f.) vereinigen sieh aneh nach stundenlanger Beriihrung nieht. Abb. 5 a, die 5_5 Min. naeh Plasmol?'sebeginn

Mikrurgisdle Untersuchung plasmolysierter: nackter Pflanzenpl:otoplasten 303

und 10 Min. nach dem Aneinanderlegen der Protoplasten aufgenommen wurde, zeigt den kleineren Protoplasten noch unrege]m~il~ig geformt nebeu dem griSI~eren. (Der Innendurchmesser der im Bild sichtbaren Pipette ist 24 pt.) In Abb. _5 b, die 55 Min. sparer aufgenommen ist, hat sich der kleinere Protoplast bereits gerundet und hat den gr6~eren, der vorher fret lag, his an die Ze]lwand geschoben. Der gri~l~ere Protoplast stirbt 8 Min. sphter. - - Eine weitere Yerklebung zwisehen Protoplasten desselben Schnittes zeigt Abb. 4. Der kleinere Protoplast wurde 32 Min. nach Plasmolysebeginn a u den grti~eren angedriickt. Die Beriihrungsfl~iche wurde znn~ichst wieder kleiner und blieb dann auf etwas m ehr als einem Drittel Zelldurch- messer stehen. Abb. 4a ist 27 Min. nach dem Andriicken, Abb. 4 b It Min. spSter mit sthrkerer Vet-

Abb. 5. Abb. 4.

grtii~erung aufgenommen. Man sieht in 4 b eine Ansammlung yon Plasma an der Bertihrungsflhche, wie man sie 6fter beobachten kann; sie scheint auf eine gegenseitige Beeinflussung der beiden Plasmen hinzudeuten. Der kleinere Protoplast zeigt noch weitere Plasmadifferenzierungen, die nach dem Passieren der Pipette hiiufig entstehen und his zu systrophe~ihnlichen Bildungen fiihren ktinnen (vgl. S. 504 f.).

V 46 (26. 9. 52). Allium, gelb und rot. LW fl., .~ St. 40 Min.; P1 in 0,8 tool Rohrzucker 50 Min., Priip., Pipette gespiilt. Auf dem bedeckenden Cellophan ein Wassertropfen. - - Eine Stunde nach dem Einlegen Herstel- lung einer Verklebung zwischen einem roten uud einem gelben Proto- plasten. Der gelbe Protoplast lag tiber die ganze Zellbreite liickenlos an. 25 Min. sphter war er infolge der Rundung bereiis teilweise abgehoben,

304 L. Hofmeister

l/ach weiteren 17 Min. 15ste er sich durch eine Erschtitterung des Mikroskops ab. Abb. 5 zeigt die Situation unmittelbar nachher. Man sieht einen di&en Plasnmfaden und eirfige Tropfen verquellenden Plasmas zwisehen de~ Protoplasten. Zwei Zellreihen wetter sind zwei Teile eines roten Proto- plasten, die vorher viSl]ig getrennt worden waren, aneinanderge]egt. Die im Bild siehtbare Pipette von 30}t Durehmesser enthglt einen kteinen Rest des Protoplasten nnd an zwei Stellen Verunreinigungen durch koaguliertes Plasma. Bet der Nadlbeoba&tung naeh 21 Stunden waren die beiden roten Protoplasten no& in derselben Lage und nieht wetter vergndert: die Ver- k lebung war also nieht mehr gelbst worden. Die Plasmatropfen zwischen

den beiden anderen Protoplasten waren versehwunden. Im ganzen Sehnitt Plasmalamellen und Va- kuolenzerteihmg.

V 49 (6. 10. 52). Allium, gelb und rot. LW K 2 �88 St., P1. in 0,8 mol Rohrzueker 14 Min., Priip. in Rohr- zueker -}- St~irkekleister. Naeh ca. t0 Min. kurz ein roter und ein gel- her Protoplast in einer Zelle zusam- mengeprel~t. Beim Wegziehen der Pipette ein derber Plasmafaden zwisehen Glas und gelbem Proto- plasten. D er Protoplast 15st sieh unter dem Zug dieses Fadens yon dem Partner ab und h~ingt an der Pi- pette. No&reals dureh drei Minuten angedrtiekt, Pipette wieder wegge-

Abb. 5. zogen: wieder hiingt ein Plasma- laden an der Pipette, dessen Zug

aber die Partner nicht mehr voneinander ]5st. Dennoeh treten sie wahrend der folgenden drei Minuten wieder yon selbst auseinander. Wie sieh aus vielen u ergeben hat, bewirkt liingere Dauer der Beriihrung zwisehen zwei Protoplasten eine weitergehende gerbindung als ktirzere, wenn es tiberhaupt zu Verbindung kommt. In unserem Falle ist der Zug eines Plasmafadens zun:dchst imstande, die Verbindung zu liSsen, spiiter, naeh weitergehender Verklebung nidlt mehr.

Die Wirkung x~on Alkyllaurylalkoholsulfonat (zumeist in der Konzen- tration I : 1000 oder weniger angewendet) auf die Oberfl~i&e pla.smolysierter Protoplasten war allgemein die ether gerfliissigung, die insbesondere die iiul3ersten Oberfliiehenpartien betraf. Plasmolyseeintritt in Rohrzucker erfolgte in Gegenwart dieses Stoffes start konkav mit gerundeten Formen, Heehtsehe F~iden traten nicht auf oder versehwanden bet naehtri~gliehem Zutritt der Netzmiftell~isung bald. Protoplasten (besonders kleinere), die in die Pipette aufgenommen und aus ihr wieder abgegeben wurden, neigten naehher zur Bildung derber innerer Plasmastriinge, die die Vakuole dureh-

Mikrurgisehe Untersuehung plasmolysierter, nackter Pfianzenprotoplaslen 305

zogen, oder zu einseitigen Plasmaansammlungeu, die in gewisser Weise an Sys~rophe erinnern und mSglieherweise den hyalinen Plasmadifferenzierun- gen zuzuordnen sind, welehe K i e ~ r e i b e r (1948) beschreibf. Diese Ersehei- nungen, welehe sehr raseh zustande kommen, zeigen den guten, reaktions- f~ihigen Zustand des Plasmas. Dureh Zuekerplasmolyse l~ingerer Dauer verh~rtetes Plasma wird unter dem Einflul] der NetzmiitellSsung wieder weleher und neigt dann unier Umst~inden aueh zu Verklebungen; das ver- hiirtefe Plasma kann bei Gegenwarf yon Netzmitteln dutch meehanisehe Behandlung mit der Mikropipetfe (oder anderen Mitteln) wieder welch bzw. fliissig werden, was lediglich mif Rohrzueker behandeltes Plasma nieht zeigt.

Aueh kurzfristige und minimale Einwirkung des Netzmiffels, wenn d i e - ses z. B. nur an den W~inden der Mikropipefte adsorbiert gebofen wird, hat eine besehr~nkte verfliissigende Wirkung auf die Plasmaoberfl~iehe. Bei sehonender Einwirkung besehr~inkt sieh die Wirkung des Stoffes zun~ehst sieh~lieh auf die Verfliissigung der hul]eren Sehiehten des plasmolysierten Pro~oplasfen, dureh die der Lebenszustand nieh~ beeintrhehtigf wird. Man sieht dabei bisweilen, daft sieh eine diinne ~iufiere Sehiehfe zusammen- h~ingend fiber den darunter liegenden Plasmaanteilen versehieben l~ifit. -- Zufuhr einer konzentrierfen Nefzmi~te!lSsung (ALAS 1:1000) ~3 zu einem bereits 1�90 Sfl in 0,Stool Rohrzueker plasmolysierten Pr~ipara~ liefi sehon 5 Minufen sp~ter die Profoplasfen bei Einsaugen in die Pipette zu Tono- plasten werden. Das Plasma verquoll und wurde sehr welch und fliissig, dabei aber nieht klar wie bei Kappenplasmolyse, sondern trfibe und k5rnig, im Laufe weiterer 2 Minufen sehleierarfig, sehliel~]ieh lSste es sieh spur- los auf.

Bemerkenswert war die Wirkung auf Plasma, das durch vorhergehende Plasmolyse mit Kaliumnitraf schon aufge]ockert war und anschliefiend in RohrzuckerlSsung dem Einflufi des Netzmittels in schonender Weise ausgesetzt wurde (Yersuch d~2, 45, S. 501). Beide Agenzien, Kaliumnitrat und Netzmittel, greifen an der Oberfl~iche an, das Kaliumnitrat auch im Bin- nenplasma. Das Ergebnis ist die geschilderte auffallende u und Auflockerung.

Versuche mit dem Netzmittel Teepol~4.

Das Pr~iparat (siehe auch S. 298) lag mir als fabrikm~il]ig hergesfellte LSsung ,,Teepol 610 hochkonzentrierf" vor, deren genaue Zusammensefzung und Konzentration nich~ bekann~ ist. Ich verwendete in den folgenden Versuchen unter der Bezeichnung ,,ca. 1%" eine LSsung yon 0,5 g bzw. unter ,,ca. 0,5%" eine yon 0,15g der S~ammlSsung auf 10cm 3 Wasser; ich hoffe damif die GrSl]enordnung der Verdiinnung ungef~ihr gefroffen zu

1.~ LSsung dieser Konzentration war nur durch Erw/irmen herzustellen, blicb aber nach dem Abkiihlen durch Stunden erhalten.

~ Fiir die Uberlassung des Pr~iparates bin ich der Shell Austria A.G., Wien, sehr zu Dank verpflichtet.

l'rotoplasma, Bd. XLIII/3. 23

306 L. Hofmeister

haben. Die StammlSsung ist gepuffert und enthiilt au[~erdem eine kleine Menge Natriumsulfat. Der pH-Wert der verdiinnten Lbsung war far l : 10 ca. 7,5 und fitr 1:100 zwisehen 5,5 und 6. Es handelt sieh um ein saures Netzmittel.

In den angegebenen Konzentrationen wirkte das Mittel auf die /e- benden Protoplasten ziemlieh intensiv. Zuniiehst kant es darauf an, festzustellen, welche Konzentrationen und welehe Art der Darbietung ohne Beeintriiehtigung des Lebenszustandes ertragen werden und welehe Ver- ~inderungen der Plasmaobertliiehe sie bewirken. In der hochkonzentrierten Lbsung verf~irbten sieh in der roten AlIium-Epidermis die Vakuolen der Randzellen sofort, die iibrigen binnen 4 Minuten. Dann fiillt zuerst die Ver~nderung der Kerne auf, die grol~ aufsehwellen und platzen; die Kern- membran bleibt, yon einem farblosen Hof mngeben, liegen. In LSsung t :10 verf~irbten sieh die Zells~ifte binnen etwa 15 Minuten. Die erste Plasmaveriinderung ist das Unsiehtbarwerden der die Vakuole dureh- querenden Plasmastriinge, die an dem in der Mitre aufgeh~ingten Kern zusammenlaufen. Die u geht also auffallenderweise yore Zen- trum der Vakuole naeh aufien. Naeh 1 Stunde ist das Plasma fliissig de- generiert; die Kerne sind in ihrer Form erhalten, jedoeh gleiehm~[~ig kbr- nig, die Nueleoli stark liehtbreehend. In LSsung I : 100 nach 5 Min. Zellen intakt, Plasmastr5mung, Kerne normal; naeh 15 Min. Stillstand der PlasmastrSmung, naeh 50 Min. Anthokyan aus den Vakuolen bereits ent- wiehen.

Bet Darbietung des Netzmittels zugleieh mit 0,8mol Rohrzucker in ,,ca. 1% '~ keine Plasmolyse, in ,,ca. 0,3%" Plasmosehise, d. h. die Tono- plasten kontrahieren sieh mit einem inneren Teil des Plasmabelages, der iiuI~ere bleibt an der Zellwand. Das Plasma zergeht langsam, die Tono- plasten w51ben sieh buehtig einw~irts und die Tonoplastenhaut sehmilzt raseh yon diesen Stellen aus ein ~5. Aneh naeh Eintritt der Plasmolyse dargebotene ,,0,3%"-LSsung fiihrte in 1 his 1�89 St. zum Tode.

Da sieh die Lbsung in den angegebenen Konzentrationen als letal erwies, ging ieh zu kurzfristiger Behandlung mit sdlwaeher Konzentration fiber. In Lbsung 1:100 wurden Sehnitte dureh 60, 40 und 10 Sekunden eingetaueht und dann in Rohrzuekerlbsung yon 0,8mol iibertragen. Naeh 16 Stunden waren in den 60-Sekunden-Sehnitten die Randzellen durehwegs abgestorben, in den 40-Sekunden-Sehnitten zum kleinen Teil; in den 10-Sekunden-Sehnitten war alles am Leben und plasmolysiert. Interessant ist, dal] naeh langer Plasmol~Tsedauer die Plasmolysegrade gegentiber den Kontrollen sehwiicher sind, was auf Permeation des Rohrzuekers zuriick- gehen diirfte. Fiir manehe Untersuehungen ist der Umstand erfreulieh, daI3 der Tod der Zelle sehon vor dem Austreten des Anthokyans dureh das Erseheinen vieler kleiner Kristalle (vermutlieh yon Kalziumoxalat) am

15 Wenn Tonoplasten in reiner ZuekerlSsung nadt Verletzung ,,einsehmelzen", entsteht ein zarter Sehleier, vermutlich -con Eiwei~, und der Vorgang geht aus- gesprochen langsam vor sich (It o f m e i s t e r 1950, S. 330).

Mikrurgische Untersuchung plasmolysierter, nackter Pflanzenprotoplasten 307

Boden der Vakuole angezeigt wird. Ich nehme an, dat} es sidn um den Augenblick handelt, in dem der Tonoplast seine Semipermeabilit~it ver- liert.

Die Einwirkung des Teepol wurde ffir die weiteren Versuche auf kurze Dauer (z. B. 30 Sekunden) oder auf das vorhergehende Ausspfilen der Pipette mit der Lti.sung beschri~nkt.

V 58 (11.10. 52). Allium, rot; LW stehend 21 �89 St., P1 in 0,8 tool Rohr- zucker 38 Min., dann 30 Sek. in 0,8mol Rohrzucker +, ,ca. 0,3%" Teepol, dann in reiner RohrzuckerliSsung abgewaschen und pr~ip. - - Unter zehn Protoplastenpaaren einmal Verklebung nach wiederholtem gegenseitigem Reiben und' Beriihren.

V 57 (10. 10. 52). Allium, rot. Keine Vorwhsserung. P1 in 0,8 tool Rohr- zucker 40 Min., Pr~ip. Die Einwirkung des Netzmittels wird auf Spfilen der Mikropipette mit ,,ca. 1%" Teepol-}-Zuckerltisung beschr~inkt, die Pipette anschliel]end in ZuckerliSsung kurz gewaschen. In der verwendeten h ohen I(onzentration bleibt in der leeren Pipette immer noch etwas Netz- mittel zuriick. Die ersten Protoplasten, die mit der Pipette aufgenommen wurden, zeigten sofort verquollenes Plasma, die weiteren lieflen keine nachteilig'e Wirkung mehr erkennen. Die Benetzung der Pipette durch die Protoplasten erfolgt in der gleichen vorteilhaften Art, wie S. 302 fiir A1- kyllaurylalkoholsulfonat beschrieben. Es ergibt sich in mehreren F~illen Fadenbildung zwischen den aneinandergedrfickten Protoplasten, eine ab- gesaugte und vtillig getrennte Plasmaportion liel~ sich wieder an denselben Protoplasten ankleben und trennte sich nicht mehr ab. - - Weiter- gehende Vereinigung war nicht zu erzielen, eine Steigerung der Netz- mitfelwirkung kam nicht in Frage, da Sch~idigung eingetreten w~ire.

Die Wirkung des Teepol scheint yon der des Alkyllaurylalkoholsulfo- nates verschieden zu seth, was nut zum Tell mit seiner grSl]eren LiSslich- keit und der deshalb angewandten hiSheren Konzentration zusammen- h~ingen diirfte. D:as Plasma wird nicht fliissig wie bet ALAS, es verquillt lediglich im Falle der Sch~idigung. In unplasmolysierten Protoplasten wird die Wirkung st~irkerer Konzentrationen zuerst an den Plasmastr~ingen im Innern der Vakuole und an den eventuell dort aufgehiingten Zellkernen sichtbar. Bet Darbietung yon ,0,3%" zugleich mit einem Plasmolytikum bleibt beim Plasmolyseeintritt der ~iul~ere Plasmabelag an der Zellwand, das fibrige Plasma liSst sich ant, ebenso die Tonoplasten. Ungeschiidigtes Plasma liiJ~t sich yon den Protoplasten absaugen und in Portionen teilen; fiber die ganze Protoplastenliinge zusammenh~ngende Plasmastriinge, wie in ALAS-}-KNO~ beobachtet, treten nichf auf.

Ebenso wie die Formel des Alkyls im ALAS ist die wirksame Ver- bindung des Teepol Fabrikgeheimnis. Doch (siehe S. 298) wird angegeben, dal] zwei hydrophobe bzw. lipophile Reste im Molekiil enthalten sind. Wenn man nicht annehmen will, daft die in den stiirkeren Verdiinnungen sicherlich unsch~dlichen Beimengungen yon Puffersubstanz oder Natrium- sulfat die beschriebene, gegenfiber ALAS auffallende Tiefenwirkung ver- ursachen, mul~ man ihren Grund in einer andersarfigen Natur des Alkyls

23*

308 L. Hoflne~ster

suchen, welche das rasehe Eindringen des Stoffes erkl~iren kSnnte. Die daranf folgenden ~r beruhen wohl auf der Denaturierung der Eiweifikomponente des Cytop]asmas ~G.

V. Das Verhalten der Plasmaoberfl~iche von Zellen verschiedener Pflanzen in verschiedenen Plasmolyticis

Ich kam schon w~ihrend der Yersuchsserie des Jahres 1958 zur C:ber- zeugung, da[~ in ZuckerliSsungen Fusionen yon Allium-Protoplasten ohne Zusatz weiterer Substanzen nicht zustande kommen, auch nicht bet Anwen- dung der gewi~ fusionsfSrdernden Deplasmolyse. Ich unterwarf deshalb in orientierenden Versuchen die AlIium-Proioplasten neben der Zucker- plasmolyse zus~itzlich der Wirkung yon C h l o r a l h y d r a t , won P u f f e r - 1 5 s u n g e n und won verdiinnter N a t r o n l a u g e . Ferner versuchte idl auch Glycerin und Harnstoff~ Plasmolytika, bot auch Ca-Ionen in geringer Menge dutch Verwendung yon Leitungswasser als LSsungsmittei bzw. vermied Ca-Spuren dutch Verwendung yon aus Quarzdesfillator stammendem bidestilliertem Wasser. Neben Allium kamen in diesem Zu- sammenhang auch andere Objekte zur Untersuchung. Die Versuehe waren hauptshehlieh zur Feststellung etwa auftretender Fusionsneigung angestetlt worden und batten in dieser Beziehung durehwegs negativen Ansgang. Sic zeigen, wie die ganze vorliegende Untersuehung, in welch einem b r e i - t e n B e r e i c h won g e r s u c h s b e d i n g u n g e n d i e N i c h t - F u s i o n i e r - b a r k e i t d e r P r o t o p l a s t e n d i e R e g e ] ist . Abgesehen davon, da~ die Festlegung der Bedingungen der Versuehe mit negativem Ausfall won einem gewissen Interesse ist, ist die jeweilige Reaktion der Plasmaoberfl~iehe auf die versehiedenen Einfliisse der Mitteilung wert.

G l y c e r i n . g 5 (22.8. 58). Allium, rot; dW kurz. P1 in 1,0 tool Glycerin (LW), Prhp. - - Fusionsversuche sofort naeh dem Einlegen in das Plasmo- lyfikum noeh whhrend des Plasmolyseeintrittes wie aueh 30 Min. his 1 St. naeh dem Einlegen erfolglos. Die Protoplasten kleben ein wenig aneinander, Fadenziehen naeh gegenseitiger Beriihrung kommt vor.

u 6 (23.8.58). Allium, rot, ferner Nymphaea alba, Blattstielparenehym. Pl in 1,0 tool Glycerin (LW). 10 his 20 Min. naeh dem Einlegen Fusions- versuehe durehans negafiv, Plasma jedoch ktebrig.

H a r n s t o f f . V 15 (27.8.38). Allium, rot; dW 3 St., P1 in 1,0mol Harn- stoff (bidest. Wasser). Fusionsversuche negafiv. u Sehnitte derselben Zwiebel gaben in Seewasser unter dem ]~influfi won Deplasmolyse die auf S. 297 gesehilderte vollkommene Yersehmelznng.

R o h r z u c k e r q - C h l o r a l h y d r a t . V 14 (27.8.38). Allium, rot; dW I St. 26 Min., P1 in 1,0mol Rohrzuekerq-0,5% Chloralhydrat 50 Min.,

1, Teepol wurde yon H o f f m a n n - O s t e n h o f und F r i s e h - N i g g e m e y e r (1952) bet der Herstellung yon Desoxyribonukleins~iure aus Kalbsthymus zur Ent- eiweifiung der Pr~iparation verwendet; es wirkt hier dadureh, daft es die anhaften- den Proteine denaturiert und damit aus der LiJsung entfernt. (ggl. Marko u. But- ler, 1951.)


Prhp. - - Ansehliel~end durch eine Stunde wiederholte Fusionsversuehe negativ, dasselbe 1 �89 his 1�90 Stunden naeh Plasmolysebeginn unter Wasser- zusatz his zur viilligen Deplasmolyse. Dieses Ergebnis ist deshalb interessant, weil L o r e y (1929) an Allium land, dal~ Chloralhydraf die Fusion fbrdert und die Bereitsehaft dazu bis zu 20 Stunden erhiilt. Es zeigt wie- derum, wie sdlwer Fusionsversuehe zu reproduzieren sind.

t / o h r z u e k e r @ P u f f e r l i i s u n g e n . Um die Wirkung versehiedener Wasserstoffionenkonzentrationen zu priifen, wurden 1/150 molare Phosphat- puffer (naeh S t r u g g e r 1958) in t,0mol Ilohrzueker geliisf angewendet. F r e y - W y s s l i n g (194-8) erwiihnf Untersuehungen, naeh denen die Sprei- tungsoberfliiehe yon Fihnen aus Polypeptidketten auf Wasser infolge ihres amphoteren Charakters yo re -pH abhiingig ist. Eine Beeinf[ussung des Plasmalemmas, in dem solehe Molekiile angenommen werden miissen, liegt durehaus im Bereieh der MiSgliehkeit. Dagegen hat die yon C h a m b e r s u. K o p a c (1957) besehriebene Abh~ingigkeit des Eindringens yon Olfropfen in naekte Seeigeleier yon der Wasserstoffionenkonzentration keinen Bezug auf die Fragestel!ung der Fusion -con Protoplasten, da sie allein auf einer Ver~inderung der Oberfliiehen.spanllung yon polaren Olen beruht.

p H 5,5. V 7 (23. S. 38). Allium, rot. Keine u Fusionsversuehe J 7 bis 34 Min. naeh dem Einlegen negativ. Sogar Protoplastenteile, die dureh einen Plasmafaden noeh zusammenhingen, liel~en sieh nieht wieder vereinigen. Der Zellsaff war etwas naeh rot verfiirbt.

p H 6,4. u 9 (wie u 7), abet dW 1 St. 10 Min. - - Won 20 Min. his 1 St. naeh dem Einlegen keine Fusionsbereitsehaft, aueh nieht bei Deplasmolyse.

p H 8,2. u l0 (wie V 7). Keine u In vielen Zellen waren m dieser Liisung naeh dem Zerteilen des Sehnittes nut noeh Tonoplasten zu sehen, so dal~ der Versneh nieht zustande kam. 15 Min. his I St. naeh dem Ein!egen FusionsverSuehe erfolglos.

p H 1 1,1. u 8 (wie u 7). Keine u 20 Min. his 1 St. 7 Min. naeh dem Einlegen in das Plasmolytikum keine Fusion zu erreiehen.

T r a u b e n z u c k e r ( l , 0 m o l ) @n/100 N a O H . u 5 (22.8.38). Allium, rot. Na& Plasmolyse yon 50 Min. Farbmn der Vakuole unveriindert. Plasma klebrig, zwisehen Protoplasten, die in Beriihrung gebraeht wurden, ent- s~ehen dieke Fiiden. Keine Fusion. Teilprotoplasten, die noeh mit einem Plasmafaden zusammenhiingen, lassen sieh (wie oben in u 7) nieht wieder vereinigen. - - C h o 1 n o k v (1952) sieht unter der Wirkung yon Plasmolyse in KNO~ @n/100 KOH in kurzer Zeit das Plasma -yon Corollepidermis- zellen versehiedener Objekte absterben und die Yakuole sieh verfiirben. In meinen Versuehen war wghrend der mindest doppelt so langen u suehsdauer keine nennenswerte Sehhdigung festzustellen, was sieh damit erkliirt, daft die Allium-Zwiebelzellen resistenter sind, ferner daft Trauben- zu&er und nieht KNO~ als Plasmolytikum diente.

N y m p h a e a sp., Epidermis and Parenehvm des Blattstieles. V 1S (19. 7. 51). P1 in 0,8 tool Traubenzueker 30 Min., dann Priip. und leiehte D e- plasmolyse dutch Wasserzusatz. Aueh bei diesem Objekt gab es keine

310 L. IIofmeister

Fusion yon Protoplasten, auffalleHderweise auch keine yon Tonoplasten. Wiihrend und kurz nach Durchfiihrung der Deplasmolyse kann aus der Plasmaoberfliiche mit der Mikronadel ein diinner Faden ausgezogen wet- den. Zu einem spiiteren Zeitpunkt lassen sich F:dden nur mehr aus tieferen Partien des Binnenplasmas gewinnen. u Innenseite des Touoplasten lassen sich dagegen jederzeit mit einer diinnen Mikronadel feine Plasma- fiiden dutch die Vakuole ziehen. Die ans der Obertl~iche gewonnenen feinen Fiiden kehren restlos in diese zuriick, wenn die Mikronadel wieder geniihert wird, die dickeren Fiiden aus dent Binnenplasma werden nicht mehr zur Giinze wieder aufgenommen. --

P 1 o w e (1931) besehreibt das Plasmalemma als eine hochelastische Fliis- sigkeit im Gegensatz zum Mesoplasma mit geringerer, aber immerhin fest- stellbarer Elastizitht, dem sie schon damals eine Netzstruktur im Sinne yon S e i f r i z (1924, 1929) zuschreibt (a continuous, labile, elastic framework). P f e i f f e r (1935) beschreibt al~s Unterschied zwischen Plaslnafiiden, welche aus dem Plasmalemma allein und solchen, welche aus dem Mesoplasma stammen, dal~ sich die Fiiden aus dem Plasmalemma viel liinger ausspinnen ]assen als die anderen. Aus der Tonoplastenhiille stammende Fiiden werden liinger als die aus dem Mesoplasma. Den Grund dafiir sieht P f e i f f e r in der hSheren Elastizitiit ~on Plasmalemma und Tonoplastenmembran. Hi~f le r (1952) dagegen betont, dal~ die Tonoplastenhaut im Gegensatz zum Plaslualemma elastische Eigenschaften kaum nachweisen lii[~t.

Wenn im obigen gersuch durch Bertihrung der Plasmaober|liiehe mit der Mikronadel kein Faden mehr zu gewinnen ist, so mu[~ das Plasmalemma zumindest seine Elastiziti/t verloren haben. Bei intaktem und elastischem Plasmalemma kSnnte die Nadelspitze nicht mit dem Mesoplasma in Be- riihrung kommen, weil das Plasmalemma wie ein Handschuhfinger die Nadetspitze unlhiillen wiirde. Auch das Mesoplasma ist fester und weniger elastisch geworden, denn es bildet einen dicken Strang, der nieht restlos wieder aufgenommen werden kann. Das abweisende Yerhalten des Nym- phaea-Plasmas kommt unter gerade den Einfliissen znstande, welche an anderen Objekten das P]asma f[iissig und eventuell fusionsf~ihig erhalien. niilnlich in dent harmlosen Plasmolytikum Traubenzucker und bei kurz dauernder Plasmolyse (50 Min.) mit anschliel~ender leichter Deplasmolyse. Das Protoplasma "con Ngmphaea weieht aud~ in einer andcren Hinsicht yon der Mehrzahl der sonst studierten Plasmen ab: es ist gegen die mikrurgische Behandlung, also gegen leichte mechanische Insulte ziemlich empfind- lich. Vielleicht gehen beide Erscheinungen auf die gleiche Ursache zuriick, n'amlich auf eine mangelnde Stabilit~it der Plasmastruktur. Dal3 die innere Plasmagrenzschicht, die Tonoplastenhaut, yon diesen u un- beeinflul3t bleibt, spricht ftir ihre andersartige Natur.

Agapanthus sp., Epidermis und Parenchvm der Blattbasis. u i9 (19. 7. 51). P1 in 0,S tool Traubenzucker 5 Min., dann in Stiirkekleister (ohne Zugabe einer osmotisch wirksaInen Sub.stanz bereitet) gelegt und sofort Zer- {eilt. Die rasch ausschliipfenden Protoplasten kleben aneinander, wenn sie mit der Nadel zusammengebraeht werden, weitere Vereinigung geschieht

Mil/rurgische Untersuchung plasmolysierter, nackter Pflanzenprotoplasten 311

nieht, aueh nieht naeh meehaniseher Behandlung der Oberflii&e oder Dureh- steehen der Kontaktfliiehe.

B e e i n f l u s s u n g d e r O b e r f l a e h e d u r e h K - O x a l a t . W e b e r (1932) hat gezeigt, daft Zwiebelprotoplasten naeh Vorbehandlung mif u/lO KaliumoxalatliSsung in HarnsfofflSsung Tonoplastenplasmolysen zei- gem weil die OxalatliSsung den :aufieren Plasmapartien das Kalzimn en{- zieht und dadureh die Neubildung einer gufieren, semipermeablen Plasma- grenzsehieht {surface precipitation reaction) unmiSglieh maeht. Es sollte nun festgestellt werden, ob dureh Entfernung des Kalziums aus der Grenzsehieht und die damit verbundene Sehw~iehung oder Aufhebung der Restitutions- fiihigkeit des Plasmalemmas die Fusionsbereitsehaft erhiSht wird; das Er- gebnis war negativ.

g 21 (20. 7. 51). Agapanthus sp., P1 in 0,8 mol Traubenzucker q-ca. n/30 Kaliumoxalat; parallel Anwendung derselben LSsung, jedoeh mit Sthrke- kleister ,eersetzt. D'as sonst reeht unempfindliehe Agapanthus-Plasma war in beiden LSsungen gegen die Manipulation sehr empfindlieh, unvorsieh- tige Behandlung fiihrte in beiden F~illen raseh zur Verniehtung der Proto- plasten. Es ergab sieh keine Neigung zu Fusion, gerklebung oder Faden- ziehen. - - Aueh Tonoplasten liel~en sieh nicht vereinigen, sie bildeten bet Verletzung bisweilen eine neue, sehr zarte Hiille, die aber nieht mehr semi- permeabel oder doeh nieht yon Dauer war; sie wurde saint ihrem Inhalt naeh und naeh unsiehtbar. Wieder verhalien sieh die beiden Grenzsehiehten bet gleieher Behandlung versehieden. Der Versueh ergab keinen Anhalts- punkt dafiir, dal~ ein Sehwiiehen oder Beiseitesehaffen des Plasmalemmas eine Fusion der damit freigelegten tieferen plasmatisehen Sehiehten begiinstigen wiirde.

VI. Das Verhalten der Plasma- und Tonoplastenoberfl/iche von A l l i u m gegen ParaffinS1

Versuche tiber das Verhalten der Plasmagrenzsehichten gegen ParaffiniS[ wurden an Pflanzenzelleu zuerst yon C h a m b e r s u. H a f l e r (1931) durch- gefiihrt. Allium-Protoplasien, die in 1,2 tool Glukose plasmolysiert waren, lie~en sich leieht mit Paraffinal (auch mit OliveniS1 oder Chloroform) benetzen. Ausftihrlicher beschrieben ist die Vereinigung yon To noplasten mit Oltropfen. Ihre Oberfl~iche mul~ dazu von Plasmaresten vtillig fret seth. Nach kurzer Beriihrung der gewiSlbten Oberfliichen yon Protoplast und Oltropfen entsteht schlagartig eine griJl~ere Kontaktfliiche; der Oltropfen wiSlbt sich dabei in den Tonoplasten hinein v o r u n d wird flacher. An tieri- schem Cytoplasma sind die entsprechenden gorgiinge schon friiher studiert worden. Nach den ersten Studien yon C h a m b e r s (1920) fiber das Ver- halten der Oberfliiche yon Amaben gegen applizierte Oltropfen beschrieben D a w s o n u. B e l k i n (1929) unterschiedliches u der Oberfliiche yon Amoeba proteus und A. dubia gegen Tropfen yon polaren Olen pflanzlicher und tierischer Herkunft. A. dubia nimmt Oltropfen, die mit ihrer Oberfl~iche in Beriihrnng gebracht werden auf oder sie bleiben nach Art einer Kappe attf der Oberfl~che sitzen; beides konnnt bet A. proteus ni&t

312 L. Hohneister

vor. Doeh kann auch die Aufnahme der Tropfen bei A. dubia zeitweise ohne ersichtliehe Ursache unterbleiben, wofiJr vielleicht vorhergehende Nah- rungsaufnahme der Grund sein kann. C h a m b e r s (1955, 1956) besehreibt, wie unbefruchtete, durch Schiitteln mit isotoniseher KaliumchloridlSsung yon den ~irtf]eren Schiehten befreite Arbaeia-Eier einen frischen Tropfe~ yon OlivenS1 schlagartig aufnehmen. Wenn der Oltropfen nicht frisch aus der Pipette abgegeben wird, sondern zuvor einige Sekunden mit dem See- wasser des Pr~iparates in Kontakt war, kommt keine Aufnahme zustande, sondern nur noeh Adh~ision art der Protoplasmaoberfl~iche. C h a m b e r s u. K o p a c (1937), K o p a c u, C h a m b e r s (1937) studierten ausfiihrlieh die Aufnahme yon Tropfen polarer nrtd apolarer Ole in das nackte, rtnbefruch- fete Arbacia-Ei. Die Aufnahme der Oltropfen wird durdl die Differenz der freien Oberfl~chenenergie bewirkt, welche dem aus den beiden Trop- fen (O1 und El) und der damit nicht misehbaren w~ii~rigert Phase bestehert- den System vor und nach der Aufnahme des Oltropfens dutch das t~:i zukommt. Wenrt der Oltropfen nicht in das Ei eintritL sondern nach Art einer Kappe der Plasmaoberfl~iche aufsitzt, wird das dami~ erkl~irt, da[~ die Zelloberfl~iche nicht fliissig, sondern yon einem festen Film bedeckt ist ~. Es kommt abet auch vor. dal~ der Oltropfen weder aufgenommen wird noch an der Eioberfl[4che adh~iriert. ]n diesem Fall wird angenommen, daJ] diese Oberfl~iche nicht nackt, sonderrt ,con ether ~iui~eren H[ille bedeekt ist, also nicht die eigentlid~e Plasmaoberfl~iche darstellt.

Das Yerhalten der Plasmaoberfi~iehe gegert Oltropfen pr[ifte ieh nut in einem Teil meiner Versuehe. Ieh fand zun~iehst das yon C h a m b e r s u. H S f l e r (1951) besehriebene u grunds~itzlieh bestiitigt. Im weiteren zeigte es sieh, daft es yon der Natur des Plasmolytikums sowie der" zus~tzlieh wirkenden Einfltisse abhiingt, oh die Benetzung der Plasma- oberfl~iche mit dem i31 eintritt bzw. ob der Oltropfen in weiterer Folge die AuflSsung des benetzten Protoplasten oder Tonoplasten herbeiftihrt oder ob er sieh etwa wieder ablSsert liiB~t.

In Rohrzueker plasmolysierte Protoplasten (V 26, 15.7.52, LW. ft. 24 St., P1 in 0,8mol, 1--4 St.) waren mit ParaffinSltropfen ~on etwa Zelldureh- messer zuniiehst nieht, aueh nieht bet liinger dauernder Beriihrung zu benetzen. Erst naeh wiederholtem Beriihren, besser noeh Reiben einer Stelle der Plasmaoberfliiehe mit dem Oltropfen kmnmt es zu plbtzlieher Adhiision. An Protoplasten mit bereits gesehiidigtem Plasma legte sieh der Oltropfen meist bereitwillig an, an Tonoplasten, wenn sie yore Koagulmn befreit waren, immer. Wie bet K o p a e u. C h a m b e r s (1937) wurden die (}l- tropfen jedesmal unmittelbar naeh vorherigem Abstreifen eines Tropfens [riseh aus der Pipette herausgedriickt. Wenn derselbe Oltropfen mit mehreren Protoplasten naeheinander oder mit demselbert Protoplasten mehrmals

~v Die Autoren fiihren n~iher aus, da~ die Existenz fester Filme seit langem bekannt ist, daft sehon ein monomolekularer Film quantitativ dieselben Eigcn- schaften haben kann wie ein dreidimensionales Gebilde desselben Stoffes und dall die Festigkeit eines derartigen Fihns yon der Kettenl~inge seiner Molektile und yon der Natur ihrer Endgrnppen abh/ingt.

Mikrurgische Untersu&ung plasmolysierter, nackter Pflanzenprotoplasten 313

in Bertihrung gebracht und sein Volumen anschlie[~end durch Zuriicksaugen etwas verkleinert wurde, entstanden Falten auf seiner Oberfl~iche; die Faltenbildung wurde auch in anderen Plasmolyficis beobachtet.

K op a c (1950)18 beschreibt Schrmnpfung der Oberfl~iche ,r Oltropfen, die in unreife Arbacia-Eier injiziert wurden und die auftriff, wenn dutch Verletzung des Keimbl~schens Cytolyse hervorgerufen wird. Die Erschei- nung wird damit erkl~irt, dai3 Proteinmolekiile an der Tropfenoberfl~iche angesammelt werden, dort unter dem Einflu[~ der Grenzflhchenkr~ifte dena- turieren, d. h. gestreckt werden und so die Fa!mng bewirken. Auch sonst ist es eine Eigenschaff yon Proteinfilmem Falten zu bilden. Filme yon Proteinen, insbesondere Globulinen sefzen nach C h a m b e r s u. K o p a c (1937) die Grenzfl~icbenspannung yon Oltropfen herab, die einige Sekunden dem Seewasser eines Pr~iparates mit nackten Arbaeia-Eiern ausgesetzt sind. Die Aufnahme solcher ,,~ilterer" Oltropfen in Arbacia-Eier unterbleibt, well die Oberfl~ichenspannungsdifferenz, welche die treibende Kraft darstellt, herabgesetzt ist. So kiSnnte efwa auch in meinen Versuchen das Oberfl[ichenhhutchen auf dem Oltropfen aus Eiweil~molekiiien bestehen, die bet wiederholter Beriihrung aus der Protoplastenoberfl~iche in die des Oltropfens tibergegangen sin&

In 0,5 n-KNO3 plasmolysierte Protoplasten (V 25) waren gegen das ParaffinS1 viSllig abweisend J9. Die Tonoplasten desselben Pr~iparates nab- men das O1 nur an, wenn sie sorgfiiltig yon allen Plasmaresten gereinigt wurden, und dann gewShnlich erst nach wiederholter reibender Beriihrung. -- Wenn nach KNO3-Vorbehandlung l~ingere Zeit in Rohrzucker ptasmoly: siert wird, entsteht ein vSllig anderes Bild: V 35 (19.9.52). Allium, rot; L W fl. 44 St., P1 in 0,5 n-KNO~ durdl 20 Min., dann in 0,8 tool Rohrzucker 1 St. 50 Min. Die Protoplasten nehmen das ParaffinS1 sofort an, beim Ver- such, den Oltropfen wieder abzuziehen, zer~eilt sich der Promplast, woraus sowohl die fliissige Beschaffenheit des Plasmas als auch die feste Adh~ision des Oles hervorgeht. An Protoplasten mit gesch~idigtem Plasma bzw. mit gequollenen Kernen l~il3f sieh der [31tropfen nicht applizieren. Die Tono- plasten dieses Schniftes halten das O1 sofort test, zergehen aber nach wenigen Sekunden; bet dieser Gelegenheit fliel~t regelm~f~ig O1 aus der Pipette nach, was fiir den Beginn auf die gute Benetzbarkeit der Tonoplastenhaut, im weiteren aber auf eine ~nderung der Grenzfl~ichenspannung in der Um- gebung hinweist. Gleiches Verhalten der Tonoplasten wurde in zwei weiteren vergleichbaren Versuchen beobachfet (V 36, 57). - - Bet gleicharfiger Vorbehandlung, aber dazu noch kurz dauernder Netzmitteleinwirkung (V 43, 12 Min. KNO3, Pr~ip. in 0,8 tool Rohrzucker, kurz gespiilt mit Rohr-

~s Diese Untersuchung konnte ich noch nicht im Original einsehen, sie isf mir nur durch Referate in Ber. wiss. Biol. 74 (1952) bzw. Forts&r. d. Botanik (1955) bekannt.

~s In der ~iquilibrierten Li3sung (10 Min. in ,,Chamb. 4faeh", anschlieflend 16 St. in ,,Chamb. 2faeh"-t-Kleister) waren die Protoplasten ni&t mit 0l zu benetzen (V 68), doeh kann aus diesem einzigen Versuch der vielstiindigen Plasmolyse wegen kein Sdflul~ gezogen werden.

314 L. Hofmeister

zucker if- 1 : 1000 ALAS, dann zurtick in Rohrzucker) wird das Paraffintil mit Ausnahme eines Falles von Fadenbildung -- nicht angenommen. Bet wiederholter mechanischer Behandlung kann es in Ausnahmef/illen zur An- heftung kommen; auf diese folgt sofort die Aufltisung der Protoplasten. Die Tonoplasten nehmen das ParaffiniS1 etwas ziSgernd an, zergehen abet nicht. Nach fiinfstiindiger Einwirkung der Rohrzuckerltisung ist irn glei- chert Versuch das Plasma steif, der Oltropfen bleibt wohl batten, lgl~t sich aber wieder restlos abli%en, wobei die Vertiefung, die das Andriicken des Tropfens in der Protoplastenoberfl~iche verursaeht hat, bestehen bleibt. Faltenbildung des Oltropfens, wie oben beschrieben, wurde auch hier beobachtet.

Protoplasten, die in RohrzuckerliSsung nut kurz, 15 Minuten, plasmolysiert wurden und anschliefiend in 0,8 tool Rohrzucker q- 1 : 1000 ALAS tiber- tragen wurden und darin blieben (V29, 17.7.52; vgt. S. 300), waren m i t ParaffiniS1 leicht zu benetzen, in 50% der Fiille liSsten sie sich ansdfliefiend auf. Wenn die Netzmittel-Zucker-Ltisung erst nach 3 Stuladen Rohrzucker- plasmolyse geboten wurde, kam die Vereinigung O1-Protoplasf erst zustande, wenn der Oltropfen durch 10 bis 15 Sekunden angedriickt wurde; die Vereinigung beschriinkt sich dann auf das Areal, das beriihrt wurde, die Benetzung schritt nicht mehr wetter fort, auch kam es nicht mehr zur Auflbsung. In einem Fall kam es zum Eintritt eines kleinen Oltropfens in das Plasma. Es wurde yon einem Protoplasten der angelegte Oltropfen wieder abgerissen, ein kleiner Oltropfen trat dabei in den Plasmabelag des Protoplasten hinein und lag dann zwischen Tonoplast und Plasmalemma als flache Linse yon etwa ein Drittel Protoplastendurchmesser (V 27. 16. 7. 52. LW i1. 48 St.. 0,8mot Rohrzucker 3 St., Prhp., dann in 0,Stool Rohrzuckerq-l:2000 ALAS). In den Versuchen yon C h a m b e r s u. Ko- p a c (1937) tritt der Oltropfen in der Mehrzahl der F~tlle in die Arbacia- Eier ein. Die an dersgeartete Organisation de r Pflanzenzelle l~il~t das Ein- treten grol~er Oltropfen (ich verwendete gewiShnlich solche yon eindrittel his dreiviertel Zelldurchmesser) gegen die Spannung des Tonoplasten als unmiJglich erscheinen. Dal~. der Eintritt eines kleinen Oltropfens in das Pflanzenplasma prinzipiell miJglich ist, zeigt die geschilderte einmalige Beobachtung (vgl. S. 296, V 67 a, Eintritt eines sehr kleinen Protoplasten in den Plasrnabelag eines grtil~eren).

Wenn der Schnitt lhngere Zeit in Rohrzucker-Netzmittel-LiSsung lag (3 St. in Rohrzucker, 1 St. 20 his ~ St. 50 Min. in Rohrzucker q- 1 : 1000 ALAS), war es nicht mehr miSglich, das Plasma mit ParaffiniS1 zu benetzen. Trat zu der kombinierten Wirkung ~on Rohrzucker und Netzmittel noch leichte Deplasmolyse (V 28, 16.7.52. P1 in 0,Stool Rohrzucker@ i:1000 ALAS 1 St., dann in 0,8 mol Rohrzucker priip., leichte Deplasinolyse dutch Wasser- zusatz), dann nahmen die Protoplasten das O1 zuniichst wieder leicht am eine Zeit nach Aufhbren der deplasmolytisehen Rtickdehnung jedoeh nicht mehr.

Die gereinigung yon Paraffiniiltropfen und Plasmaoberfliietle erscheint in meinen u g e f b r d e r t dureh: zeitlieh begrenzte Vorbehandlung


mit Kaliumnitrat, vorsiehtig dosierte Anwendui1g des Netzmittels Alkyl- laurylalkoholsulfonat, dureh Deplasmolyse infolge Wasserzusatz. In allen drei Fhllen wurde mit RohrzuckerliSsung gearbeitet. Die Plasmaoberfl~iche ersehiei1 in allen posifiv verlaufenen Versuchen aufgelockert. Diese Locke- rung besteht im Falle des Netzmittels in einer Verfliissigung, die nach M o n n d (1947) dureh Yerhnderungen der Eiweiflkomponente der Grenz- sehiehten bedingt ist, ira Falle der Deplasmolyse entsteht sie durch Ver- grSl]erung der Plasmaobertlhehe, welehe naeh TSrn~iv~i (1939) ihren Sub- stanzgehalt bei Kontraktion und Expansion (abgesehen yon Wachstums- vorg~ngen) nicht ver~indert. Der Einflufl des Katiumnitrates auf die Grenz- sehieht ist insofern nicht ganz einfaeh zu deuten, als yon den Fusions- versuchen zwischen Protoplastei1 her bekannt ist, dal~ in Kalimnnitrat- 15sung die Plasmaoberflhehe mehr abweisend ist als in ZuckerlSsui1g. Die Anflockerung der Struktur durch Kalinmnitrat wird an der Oberfl~iche erst wirksam, wenn die Protoplasfen ansehliel~end in Zucker]iSsung iibertragen werden und das Kaliumnitrat nur mehr yon innen auf diese Ober- fl~iehe einwirkt.

Abtriiglich fiir die Yerein,igung ~r ParaffinSl und Plasmaoberfliiehe sind: lange Dauer der Plasmolyse, besonders in SalzlSsungen (KNO~, iiquilibrierte SalzlSsui1g), und lang dauernde Einwirkung des Netzmittels ALAS. Diese Einfliisse bewirken, daft Benetzung erst naeh l~ingerer Be- riihrung zwischen O1 und Plasma oder erst nach nachdriicklicher t/eibung entsteht oder dal~ die Oltropfen nut locker anhaften, schliet31ich auch daft keinerlei Yereinigung eintritt.

Nach C h a m b e r s (1955, 1956) sowie K o p a c u. C h a m b e r s (1937) wird man ani1ehmei1 diirfen, da[~ ein Oberfliichei11film aus Proteimnole- kiilen das Hindern'is darstellt, wenn der Oltropfen yon der Plasmaober- fliiche nicht angenommen wird; dieser Film kann auf dem Oltropfen, auf der Plasmaoberfliiche oder auf beidei1 liegen. Das Auftreten des Films auf dem Paraffii151tropfei1 wird durch die Faltenbildung demonstriert, die nach mehrmaliger Beriihrung mit plasmolysierten Protoplasten bei u verkleinerung des C)ltropfens auftritt. Durch u stets frischer (Jltropfei1 wird die Filmbildung ant denselben -eermiedei1. Die Proto- plastenoberlliiche wird unter Umst/inden erst I1ach l~ingerer Zeit f[ir die Oltropfen abweisei1d, was darauf hinweist, da[~ der Oberfliichenfilm erst entstanden oder mit der Zeit stiirker geworden ist. Schon K i i s t e r (1910b) hat beobachtet, dal~ die ~iuI~erste Schicht des Plasmas yon in Rohrzucker plasmolysierten Allium-Protoplasten nach 24stiindiger Plasmolyse erstarrt. Er hat diese Bildung als Haptogenmembran beschrieben und in ihr eine ,,feste oder hydrogelartige Oberil~ichenhaut '~ gesehen, derei1 u er unter anderem auch aus dem Verlust der Fusionsf~ihigkeit plasmolysierter Protoplasten abgeleitet hat (1. c., S. 715). Er sah auch bei ErhiJhung der Konzentration der plasmolysierenden ZuckerlSsung und dadurch be- dingter u die Oberflhche dieser durch 24 Stui1den plasmolysierten Protoplasten briichig-knitterig zusammensinken. Die Zu-

316 L. Hofmeister

riiekfiihrung dieser Erseheinungen auf ein Hiiutehen aus Eiwei131nolekiifeu inure, re einer spiiteren Zeit vorbehalten hleiben.

Das Zergehen der Protoplasten naeh Benetzung mit dem (31tropfen beschriinkt sieh in meinen Versuehen auf zwei Fiille, in denen die Plasma- struktur einmal durda gemeinsamen Angriff yon Kalimnnitratvorbehand- lung und Netzmittelwirkung (die Summierung zweier verfliissigender Mit- tel), im anderen Falle dureh liingere Einwirkung des Netzmiftels belastet war. Da das Netzmittel die Eiweiflphase angreift, sind die Lipoide dem Angriff des ~les mehr ausgesetzt als gewbhnlieh, so dal] es zur A uflhsung des Plasmas kommt. Das Verhahen der Tonoplasten geht einigermal]en in dieselbe t/iehtung wie das der dazugehhrigen Protoplasfen; wenn z. B. wie in Kaliumnitrat die Protoplasten nicht benetzbar sind, lassen sieh audl die Tonoplasten wenigstens nur sehwer mit dem O1 benetzen.

VII. Besprechung der Ergebnisse

Bet Plasmolyse in R o h r z u c k e r l S s u n g bleibt die Oberfl~iche yon Allium-Protoplasten auf die Dauer yon einer bis wenigen Stunden in einem Zustand, der als normal gelten kann. Man kann mit der Mikronadel F~den aus der Plasmaoberflgche ziehen oder auf andere Art ihre fliissige Beschaf- fenheit festsiellen. Trotzdem gelingt eine Wiederverschmelzung vSllig ab- getrennter Protoplastenteilstiicke nicht, auch Fadenziehen und Verklebung 20 kommt nicht vor. Daran gndert sich auch nichts, wenn Deplasmolyse durch Wasserzusatz eingeleitet wird oder die Protoplasten aneinandergepre[ft werden. Im letzteren Falle wandern sie, wenn kein Druck mehr ausgeiibt wird, nnter dem Einflufl der Rundung der abgeplatteten Berfihrungsflgche wieder auseinander. Protoplasten yon Radieschen sind, wie M i c h e l ge- schildcrt hat, weniger abweisend. Fiir Paraffin51 waren die Rohrzucker- protoplasten "con Allium nach 1 bis 4 Stunden Plasmolyse nur nach mehrmaliger Beriihrung oder nach Reiben mit dem Oltropfen benetzbar.

Plasmolysierende T r a u b e n z u c k e r l S s u n g hiilt, wie schon auf S. 286 ausgeftihrt, die Plasmaoberflgche und das Binnenplasma in einem weitgehend normalell Zustand und ist darin dem Rohrzncker noch fiberlegen. Erst nach Stunden wird die Oberfl~iche fester. Nach 24 Stunden war bei Allium aus der Plasmaoberfl~iche mit der Mikronadel kein Faden mehr auszuziehen, lediglich aus dem Binnenplasma konnten F~den gewonnen werden, die entsprechend dicker waren. Nach mechanischer Behandlung wird Fadenziehen aus der Oberflgche wieder mSglich, die Lhnge und Elastizit:~it der F~den bleibt hinter der urspriinglichen zuriick. Zwischen den Protoplasten kam Fadenziehen und Verklebung vor. Die Benetztmg der Plasmaoberflhche mit ParaffinSltropfen ist fiir Traubenzuckerplasmo- lyse yon Allium schon bet C h a m b e r s u. H S f l e r (1931) beschrieben. Agapanthus-Plasma lielt in Traubenzucker @ Kleister Verklebung be- obachien, Nymphaea-Plasma blieb in Traubenzucker, auch unter Deplasmo-

~o Als Ausnahme w~ire u 58, S. 289, zu erw/ihnen.

Mikrurgische Untersudmng plasmolysierter, naekter Pflanzenprotoplasten 317

tyse, abweisend und liel~ Fadenbildung mit der Mikronadel naeh kurzer Zeit nur mehr aus dem Binnenplasma zu.

In K a l i u m n i t r a t l b s u n g land ieh die Protoplasten gegeneinander vSllig abweisend, aueh gegen Paraffinbltropfen. Die Plasmaoberfliiehe er- seheint, wie sehon S. 291 erwiihnt, verstiirkt, ihre Elastizit~it gesteigert, Fadenziehen mit der Mikronadel ist stets gut mbglieh. Das Plasma ist sehr tltissig. Die Tonoplasfen werden dureh Paraffini31 benetzt.

Ganz anders zeigt sieh die Wirkung yon K a l i u m n i t r a / , w e n n n a e h k u r z e r P l a s m o l y s e in demselben die Protoplasfen in R o h r - z u e k e r u n t e r s u e h t werden (Vorgang naeh Miche l ) . Unter diesen Be- dingungen erhielt ieh (S. 292) einmal Fusion yon Protoplasfen, die in einer offenen Zelle aneinandergedriiekt wurden. Bet gleieher Vorbehandlung, jedoeh Beimisehung yon Stiirkekleister zur Zu&erli3sung komm~ Yerklebung und Fadenbildung noeh leiehter zustande. Neben diesen Einfliissen ange- wandte Deplasmolyse maeht enfgegen i.hrer sonstigen fusionsfSrdernden Wirkung die Plasmaoberfliiehe viSllig abweisend, vielleieht, weft eine dureh die anderen Einwirkungen bewirkte Orientierung der Molekiile in der Grenzsehieht verhndert wird.

Der Gegensafz zwisehen dem Verhalten der Protoplasten in Kalium- nitrat allein und in ansehliel~end angewandter Rohrzuckerlbsung l~il~t sieh nur so verstehen, daft das Kaliumnitrat dem Plasmalemma im zweiten Falle nur Yon der Innenseite, yore Plasma her, geboten wird. Es w~ire mbglieh, daft dadureh eine Umorientierung "con in der Oberfliiehe tlaeh liegenden Polypeptidketten eimritt und yon diesen untereinander oder mit Lipoiden eingegangene seitliehe Bindungen zur Auflbsung und zu neuen Kombinatio- nell veranla~t werden. Das allm~ihliehe Sehwinden der Kaliumnitrat-Wir- kung in der Zuekerli3sung kann nut mit Sinken der KNO,-Konzentration im Plasma erkl~irf werden. Ob das Salz wieder herausdiffundiert oder ob es in die Vakuole eindringt und dadureh zu unwirksamer Konzen/ration verdiinnt ~vird, wiire noeh zu enfseheiden.

In der yon mir willkiirlieh ausgewiihlten ~ i q u i l i b r i e r t e n Sa lz - l b s u n g naeh C h a m b e r s (1943) bleibt das Allium-Plaslna dureh lange Zeit in besonders gutem Zus/and. Es ist fliissiger als in Traubenzueker und bleibt so dureh mehrere Stunden. Fadenziehen und u zwisehen Protoplasten sind in dieser Lbsung leieht herzustellen und werden d,rreh Deplasmolyse oder Zusa/z yon Sthrkekleister noeh begiinstigt. Naeh mehr- stiindiger Plasmolyse verh~irtete Obert]~iehe wird naeh meehaniseher Behand- lung mit der Mikronadel wieder fltissig.

In S e e w a s s e r , dieser idealen ~iquilibrierten Lbsung, plasmolrysierte Protoplasten zeigen besten Plasmazustand. Bet Deplasmolyse dutch Wasser- zusatz kamen Protoplasten, die sieh beriihrten, zu s o f o r t i g e r F u s i o n . Dabei vereinigten sieh a u e h d i e Y a k u o l e n sofort.

Von o b e r f l i i e h e n a k t i v e n S u b s t a n z e n , welehe dem Plasmolyti- kum beigemengt wurden, ist zuniiehst Alkyllaurylalkoholsulfonat zu er- wiihnen, Es wnrde vorwiegend in ether Verdiinnung yon 1 : 1000 der plasmolysierenden Zuekerlbsung beigemiseht. Seine Wirkung war eine starke

318 L. Hofmeister

Viskosit~itserniedrigung der hul]eren Plasmapartien und eine Auflockerung der Plasmastruktur. Nach l~ingerer Plasmolysedauer in der kombinierten LSsung (gegen i Stunde) kam es zu schwerer Sch~idigung des Plasmas, Dar- bietung des Netzmittels dureh kiirzere Zeit oder erst nach P]asmolyse- eintritt wurde gut vertragen. Verklebung und Fadenziehen war unfer dem Einflul~ dieses Netzmittels leicht zu erreichen. Bei gleichzeitiger Darbietung yon St~irkekleister in der RohrzuckerlSsung war die Plasmaoberfl~che iiber- wiegend ablehnend. Verhgrtete Oberflhchen konnten unfer Einflufl des Netzmittels dutch mechanisehe Behandlung wieder zu Verklebung f~ihig werden. Die auflockernde Wirkung war am sthrksten bei gleiehzeitiger Verwendung yon Kaliumnitrat. Sic ~iul~erfe sich auch in einer versthrkten Neigung zur Bildung yon Plasmadifferenzierungen nach der Behandlung yon Protoplasten mit der Mikropipette. Gegen ParaffinS1 verhie]ten sieh aus KNO3 in Rohrzucker @ Netzmittel iibertragene Protoplasten ablchnend. Nut nach mechaniseher Beeinflussung der Protoplastenoberflgche kam es znr Annahme des Ones, der sofort die AuflSsung des Protoplasten folgte. Die dazugehSrigen Tonoplasten zergingen, fiir sich allein behandelt, nicht. Nach l~ingerer Zeit war die Plasmaoberfl~iche dieser Zellen fiir das ParaffinS1 vSllig unbenetzbar; wurde Deplasmolyse durch Wasserzusatz herbeigcfiihrt, war Benetzung voriibergehend wieder mSglich.

Des zweite verwendete Netzmittel ,,Teepol" zeigt nicht die starke Wir- kung auf die Plasmaoberfl~iehe wie des vorhergehende, dagegen auffallende Tiefenwirkung. Sch~digung der Protoplasten tritt zuerst an dem in der Zellmitte aufgeh~ingten Kern und den umgebenden Plasmastr~ingen ein. -Verfliissigung des ]ebenden Plasmas tritt nicht ein, doch erfolgt seine Degeneration unter AuflSsung. Hervorzuheben ist aueh die beobachtete Art der AuflSsung yon Tonopla:sten, ferner die Permeabilit~itserhShung fiir Rohrzucker (siehe S. 306). Die Auswcrtung der u mit Teepo| ist mit einer gewissen Unsicherheit behaftet, well das Pr~parat aufler der wirksamen Substanz noch Zushtze enth~lt; ans diesem Grund wurde nur ein Teil der damit angestellten Versuche mitgeteilt.

Eines der wiehtigsten Mittel zur Beurteilung der Protoplastenober- fl~iehen war ihr u bei d e r g e g e n s e i f i g e n B e r i i h r u n g . Wie ant S. 282 schon erw~ihnt, kSnnen nach M i c h e l (1937) und K i i s t e r (1939) die Plasmaoberfl~chen gegeneinander vSllig abweisend sein oder abet Fadenziehen, u oder schlie~lich Verschmelzung zeigen. Nut bei Versdlmelzung mischen sich die Plasmen beider Partner. Sie bilden dann bei gewaltsamer Trennnng einen Winkel yon ann~ihernd 180 ~ und nehmen unter dem Einfln[~ der Oberfl~iehenkrhfte friiher oder sp~iter eine gemeinsame Minimalform an. Die Verschmelzung der Protoplasten wird voll- kommen, wenn auch ihre Vakuolen zusammenfliel~en. Je welter die Ver- einigung' geht, desto seltener ist sic im Experiment zu erreichen. Deshalb enthalten meine mitgeteilten Versuchsprotokolle zahlreiche Fhlle yon Faden- ziehen und lockerer, abet nut wenige yon dauerhafterer Verklebung. Ganz selten weichen die Partner yon ihrer Ausgangsform dutch mehr als dutch eine einfache Abplattung der Beriihrungsfl~ehen ab und nur in zwei


Fallen vereinigten sieh in meinen Versuchen Plasma und u Dabei waren fast alle Versuehe unter Bedingungen angestellt, unter denen versehiedenen Autoren Fusionen gelungen waren oder unter denen sie auf Grund theoretiseher Voraussetzungen hiitten vorkommen kbnnen. In den Mitteilungen yon K i i s t e r ist wiederholt darauf hingewiesen, daft manehe Plasmen nieht fusionieren, andere aus unbekannten Griinden es einmal tun und andere Male nieht. Von Al l ium sagt Mi che l , daft es besonders geringe Neigung zu Fusionen zeigt und dai3 seine Protoplasten keine gemeinsame Minimalform annehmen, wenn es doch zu einer Fusion kommt. Meine Ein- drii&e yon Al l ium waren dieselben, dennoch beobaehtete ieh in einem Fall eine gersehmelzung mit sofortiger Abrundung des Produktes zur Kugel- form. Gelegentliehe Versuehe mit Radiesehen und Agapanthus , die Mi- c h e l fiir Fusionen giinstig land, ergaben mir aueh nur Yerklebungen, so daft aueh fiir diese Objekte die Niehtfusionierbarkeit die I/egel und Versehmelzung die Ausnahme darstellen diirfte.

Wie K o p a e u. C h a m b e r s (1957) ausfiihren, kommt die Ver sehmel~ zung zweier Fliissigkeitstropfen in einem damif nieht misehbaren Medium zustande, wenn die Oberfliiehenenergie naeh der Yersehmelzung niedriger ist als vorher. Fiir den Fall des Eintretens eines Oltropfens in das Arbacia- Ei fiihren sie die folgenden Gleiehungen an:

EA = ~r(dl 2 T,/3 @ d2 2 T3/.O

E A ist die Oberfliichenenergie des Systems A, welches aus dem Oltropfen (1) in Beriihrung mit dem Ei (2) in Seewasser (3) besteht. EB ist die Ober- tliichenenergie des Systems B (Oltropfen im Ei liegend, dieses in Seewasser). d~ und d2 sind die Durchmesser yon Oltropfen und El, T,/8 die Ober- fliichenspannnng des Oltropfens gegen Seewasser, T2/~ die des Eies gegen Seewasser und %/, die Grenzfl:~ichenspannung des Oles im Kontakt mit dem Cytoplasma des Eies. Die Differenz der Oberfliiehenenergien, welehe die gereinigung der Tropfen bewirkt, ist im Falle der gereinigung zwisehen O1 und Plasma viel grSl~er als bei der gereinigung zweier Protoplasten. Die Obertliiehenspannung des Mineralbles liegt um 40 dyn/em, die ,con 131 im Konfakt mit dem Eiplasma um 0,8 dyn/em und die Oberfliiehen- spannung des Arbaeia-Eies gegen Seewasser wird mit 0,2 dyn/em angegeben. Die Oberfliiehenspannung yon Pflanzenprotoplasfen liegt vermuilieh iihnlieh niedrig (vgl. H b b e r 1947, S. 304; F r e y - W y s s l i n g 1948, S. 31). Auf Grund der bestehenden Energiedifferenz wird das O1 x'om Ei fast dureh- gehend aufgenommen, aueh an den Pflanzenprofoplasten hatter es vielfaeh. Wenn die Plasmaobertliiehe des Eies test oder von einer nieht dazugehSrigen Membran oder Haut bede&t ist, sehlief~lieh auch ( K o p a e 1936) wenn der Oltropfen mit einem festen Film aus Globulinen bedeekt ist, kommt es im Falle des Eies nieht zum Eintritt (siehe S. 512).

Wie sehon ausgefiihrt, diirfte es mit der besonderen Organisation der Pflanzenzelle zusammenhiingen, dalt die Oltropfen in die Protoplasten nieht eindringen kSnnen, sondern ihnen nur aul~en anliegen. Unter bestimmten

320 L. Hofmeister

Bedinguugen wird in meinen Versuehen das Ol nieht angenommen, so be[ Plasmolyse -- insbesondere yon 1/ingerer Dauer -- in Kaliumnitrat, in Rohrzu&er, ferner in Rohrzueker q-Netzmiftel naeh Vorbehandlui~g mit Kalimnnitrat. Dnreh meehanisehe Behandlung kann die Ober[lhehe wieder zug~tnglieh werden, besonders bet Gegenwart yon Netzmitteln.

Als Hindernis fiir die Vereinigung sind aueh bet Pflanzenprotoplasten f e s t e F i l m e in Betraeht zu ziehen. Znmindest sieht man die Bildung solcher Filme auf den Oltropfen, welehe mit Protoplasten in Beriihrung waren und dann bet Volumsverminderung eine fait ige Haut zeigen. Wie bet K o p a e (1936) diirfte es sieh um einen Film aus Eiweiflmolekiilen handeln. D a das Material dieses Films aus dem Protoplasten stamm{, wiire es miSglieh, daft aueh auf der Plasrnaoberflhehe selbst Eiweifimolektile die Adh~ision eines (frisehen) Oltropfens verhindern.

F{ir d.ie Fusion zwischen Protoptasten steht, wie gesagt, nur die geringe Energiedifferenz als treibende Kraf t zur Verftigung, welehe sieh naeh den angefiihrten Gleiehungen aus der Differenz der Oberfl~tehenentwicklung yon Ausgangsprodukten und Endprodukt der Fusion ergibt, Dementspre- ehend werden sehwache Hindernisse geniigen, um Fusion zwisehen Proto- plasten zu verhindern. D;ie Annahme eines Eiweil{fihns (Oberfliiehen- erseheinung) oder ether Hap{ogenmembran (Fiillungsprod,~kf) vermag das Ausbleiben yon Fusionen oder Verklebungen ausreiehend zu erkl/iren. Sehwerer ist es zu verstehen, warnm Fusionen in einem kleinen Prozentsatz der Versuehe dennoch herzustellen sin& Eine Erkl~irung kann nur in der Zusammensetzung der Plasmahautsehieht gesueht werden.

Es wird seit langem angenmnmen, daft im Plasmalemma mehr Lipoide enthaIfen sind als im iibrigen Plasma, wenn aueh ein nnwiderleglieher Be- wets dafiir ~qelleieht nieht erbraeht ist. Das u e t h e r E i w e i l ] k o m p o n e n t e dagegen ist noeh nieht allgemein anerkannt, do& mehren sieh die Stimmen in letzter Zeit, die dafiir spreehen. Auf Orund der Darstellung yon F r e y - W y s s l i n g (1948) liif]t sich die Situation an der Plasmaoberfl~iehe wte folgt skizzieren: In den :auf~ersten Schiehten des Plasmas ist das Eiweifigeriist diehter als wetter innen (I. e,, S. 126); die Polypeptidketten liegen der Grenzfl~iehe etwa parallel (1. e., S. 36). In der Grenzflhehe sammeln s.ieh Lipoide auf Grund ihrer Eigensehaft als obertl~iehenaktive Verbindungen. ,,The plasmalemma does not represent a de- finitive skin, but only a boundary layer in which lipids aeeumnlate" (1. e., S. 126); das Plasmalemma w~ire also nieht als selbsfiindiges Organ des Protoplasten zu betraehfen, sondern als eine Grenzfl~iehe, die in der intakten Zelle zwisehen Membran und Binnenplasma sehon bestehen kann und die bet Plasmolyse aus dem im Plasma vorhandenen Material restituiert wird 2L Fiir das u yon Eiweif~ in der Pla.smahaut sprieht vor allem die yon F r e y - W y s s l i n g (1. e., S. 126) hervorgehobene Tatsaehe,

=* Fiir das u derselben Grenzsehiehf im plasmolysierten nnd ira unplasmolysierten Zustand spricht die mehrfach konslatierte Gleiehheit der Per- meabilit~it plasmolysierter und unplasmolysierter Zellen (Beispiele bet HiJ f l e r 1934, S. 218 f.).

Mikrurgische Untersudlung plasmolysierter, nackter Pflanzenprotoplasten 321

dal~ die Plasmahaut elasfisch ist and dal~ diese Eigenschaft den Oberflgchen- h~iutchen yon Lipoiden nicht, wohl abet denen yon Proteinen zukommt. Fiir die Annahme yon Eiweift in der Plasmagrenzschicht sprechen auch die kiirzlich entdeckten Verschiedenheiten in den Resistenzeigenschaften des Plasmalemmas gegen Natrimnkarbonat and gegen Kalilauge. H 5 f l e r (1951, 1952) beniitzt die Resistenz der Zellen gegen plasmolysierende Natrium- karbonatliSsung als Marl fiir die Ausbildnng des Plasmalemmas. Es stellt sich heraus, daft die gufiere Plasmahaut bei verschiedenen Objekten gegen die Sodal~isung - - die auf das Plasma vernichtend wirkt, wenn sie eindringen kann - - eine sehr unterschiedliche Schutzfunkfion ausiibt und daher recht versehieden ausgebildet sein muff. Insbesondere vertragen gewisse Desmidiaceae die Sodalbsung so gut, daft sie darii1 normale Plasmolyse zeigen, tagelang am Leben bleiben and bei nachheriger Verdiinnung des" LSsung normal deplasmolysieren. Ihr Plasmalemma ist also gegen die SodalSsung sehr dicht und sehr resistent; es vertr@t sogar Plasmolyse in KaliumoxalatliSsung, kann also auch in Abwesenheit yon Kalziumionen restituiert werden (siehe S. 280). C h o l n o k y (1952) stellte grofte Verschie- denheiten im Ban des Plasmalemmas yon Corollzellen verschiedener Pilan- zen fest. Bei Plasmolyse in Kaliumnitrat unter Zusatz yon ~/1~o oder 1[~ normaler Kalilauge tritt die ZerstiSrung der Protoplasien yon Objekt zu Objekt verschieden schnell ein. Der Autor erklgrt diese Differenzen damiL daft die Hautschicht ein Kolloidsystem ist, dessert Phasen, Lipoide und EiweiSbestandteile bei verschiedenei10biekten in verschiedenem Verhiilt- nis miteii1ander gemischt sin& Wo die lipoiden Phasen dominieren, ver- seifen sie unter dens Einflufi der Kalilauge rasch, wo die Eiweifiphasen eine gri3ftere Rolle spielen, geschieht die Zerstbrung durch die Lauge lai1g- samer. Die Vorstellung einer einfachen molekularen Hautschicht aus Li- poiddipolen lehnt C h o l n o k y mit der Begriindung ab, daft eine solche Schicht yon den KOH-Molekiilen beim ersten Durchtritt sofort zerstSrt werden miil~te.

In diesem Zusammenhang soll eines Yersuehes yon W e i s (1926) gedaeht werden, der ebenfMls fiir das u yon Eiwei[~ in der Grei1zsehieht spricht. Es wurden Epidermiszellen yon Rhoeo in 0,5%ige Na- triumkarbonatliJsung mit und ohne Trypsin eingelegt: in der Liisung ohne Trypsin bleibt die Farbe der Vakuolen I1och naeh 24 Stunden unveriindert, in d e r m i t Trypsin fiirbt sich naeh 20 Minutei1 der Zellsaft ii1folge Ein- dringens des Salzes blau. Diese Erhbhi1ng der Permeabilitiif dureh ein pro- teolytisehes Enzym sieht der Autor als Beweis dafiir an, daft eine Eiweift- komponente in der iiul]eren Plasmagrenzsehieht eine Rolle spielt.

Wenn man annimmt, daft fiir das Unterbleiben der Versehmelzung oder Verklebui1g die in den Plasmaoberfl~iehen liegenden Polypeptidketten verantwortlieh sii1d, bleibt die Frage often, welches die Rolle der Kettenmole- kiile im Falle einer Fusion sein soil Bei Yerklebung kommt es nieht zur gegenseitigen Durehdringung der Strukturen, vielleieht darf an eine geringe Zahl yon Bindungen zwisehen Seitenketten gedaeht werden. Bei lang dauernder Beriihrung mSgei1 mehr solehe Bindungei1 eingegangeI1 werden,

Protoplasma, Bd. XLIII /K 24

322 L. Hofmeister

denn tats~ichlich kSnnen durch lange Dauer der Bertihrung Verschrnelzun- gen zustande kommen. u Fusionen, bei denen sich Plasma und Vakuole augenblicklich vereinigen, kommen durchgehend unter Bedingun- gen zustande, welche die P l a s m a g r e n z s c h i c h t v e r f l i i s s i g e n und ih re S t r u k t u r l o e k e r n (Deplasrnolyse, Alkalisalze, iiquilibrierte Salz- 15sungen). Es ware sehr wohl denkbar, dal~ die Auflockerung der Grenz- sehi&t (vielleieht unter LSsung yon zwisehen den Kettenmolekiilen bestehenden Bindungen) eine gegenseifige Durehdringung der Plasmen er- miSglieht.

Die gernmtungen fiber die Zusammensetzung des Plasrnalemma und fiber die Wirkung der versehiedenen Agenzien auf dieses wurden bewu[}.t sehr allgemein formuliert. Die physikalisehe Chemie weist indessen heute u auf -- und sie werden sehon in Handbiiehern auf- geftihrt --, welehe Perspektiven auf viel tiefergehende ErkliirungsmSglieh- keiten erSffnen und fiber die eine Andeutung erlaubt sein rnSge. In H S- be t s ,,Physikaliseher Chernie" (1947) ist in dern Beitrag yon B a t e m a n eine Reihe x-on u versehiedener Autoren an k i i n s t l i e h e n Fil- men referiert, welehe dent Protoplasrnatiker das u fiir viele Erseheinungen bringen kgnnen, die an den Plasrnagrenzfl~ichen zu beobaehten sind. Gemisehte Filme kSnnen Mosaikstrukturen yon molekularen Dimensionen darstellen; der Vergleieh rnit den P!asrnagrenzsehiehten iiegt nahe. Eine gernisehte .monornolekulare Gliadin- und Cholesterinsehieht zeigt bei Kornpression die reversible Versehiebtmg einer Komponente in die wiifirige Phase. (Ein mit einem gemischten Lipoproteinfihn bedeckter Proto- plast kSnnte analog bei GrSlenveriinderung dureh Plasmolyse und De- plasmolyse in seiner Oberfliiche einmal beide Bestandteile, einrnal nut einen aufweisen.) i3ber monomolekulare Proteinsehiehten wird beriehtet, dal~ die Segmente der Polypeptidketten bei hydrophober Natur der Seitenketten aus der Oberfliiehe auftanehen kSnnen, ferner daft bestirnmte Anordnunge~l -yon Seitenketten entstehen kSnnen, wenn die Polypeptidketten in der Oberfliiehe dureh Rotation urn Einzelbindungen gefaltet werden. (Man ist versueht, eine Analogie in den versehiedenen Verhaltensweisen zu sehen, die das Plasmalernma zeigt, wenn Kaliumnitrat einrnal in der Ault.en- 15sung und einlnal yon innen, vom Plasma her, geboten wird.)

Die beobaehteten V e r h a l I e n s w e i s e n der :dufieren P l a s r n a g r e n z - s e h i e h t d e u t e n attf das V o r h a n d e n s e i n e i n e r Eiweil~kornpo- n e n t e n e b e n e i n e r L i p o i d k o r n p o n e n t e hin. Einzelheiten im Ver- halten der Protoplastenoberfliiehen gegeneinander und gegen Oltropfen zeigen mehr als eine zufiillige Nhnliehkeit rnit Erseheinungen, die an den yon der physikalisehen Chernie studierten gernisehten Filmen unter vergleiehbaren Einfliissen beobaehtet werden.

VIII. Zusammenfassung

Die Oberfliche plasrnolysierter, nackter Pflanzenprotoplasten wurde mit rnikrurgischer Methodik untersucht, Das Verhalten der Protoplastenober-


fl~iche be i dcr im Fusionsversuch hergeste!lten gegenseitigen Beriihrung s0wie bet der Beriihrung mit ParaffinSltropfen war zugleich Mittel zur Beurteilung der Plasmagrenzschicht und Gegenstand des Studiums.

Hauptversuchsobjekt war die Auf~enepidermis der Kiichenzwiebel, deren Plasma nach der Literatur nicht leieht fusioniert. Ob~ekte, deren Fu- sionsfghigkeit als grSl~er bekannt ist, kamcn fallwelse aueh zur An- wendmlg.

Trotz der Herstellnng als fusionsfSrdernd bekannter Bedingungen und sorg[~iltiger Schonung des Lebenszustandes der Protoplasten war der Pro- zentsatz gelungener Fusionen sehr gering; aueh die Erscheinungen der Verklebung und des Fadenziehens sind nicht unbegrenzt herzustellen. Die Fusionierbarkeit plasmolysierter Protoplasten stellt nicht nur bet Allium, sondern auch bet den anderen untersuchten hSheren Pflanzen eine seltene und an schwer reproduzierbare Bedingmlgen gebundene Ausnahme dar. Die Nieht.fusionierbarkeit ist die Regel.

Im Einklang mit der Literatur wurde die fusionsfSrdernde Wirknng yon Deplasmolyse und yon Beimischung yon Sfiirkekleister zum PlasIno- lytikum sowie yon kurz dauernder Kaliumnitratwirkung bet nachheriger Durchffihrung des Fusionsversuehes in Rohrzucker festgestellt. Weitere Plasmolytika wirkten untersehiedlich, KaliumnitratlSsung allein angewandt war fusionshindernd. Als sehr gut vertr~iglich und fusionsfSrdernd erwies sich eine ~iquilibrierte SalzlSsung. In Seewasser wurde augenblickliche nnd vollsfiindige Vereinigung yon Plasma und Vakuole der Fusionspartner beobachtet. Der Zusatz obertl~chenaktiver Substanzen (Netzmittel) zu den plasmolysierenden LSsungen begiinstigte ebenfalls die Fusionsbereitsehaft; Auflockerung der Plasmastruktur scheint dabei eine Rolle zu spielen.

Auch gegen ParaffinS1 verhielt sieh die Plasmaoberflgche unterschied- lieh, beziiglieh der Wirkung verschiedener Agenzien auf dieses Verhalten besteht eine ungef~hre Parallelitgt zu dem Verhalten der Protoplasten gegeneinander. Das aus der Literatur bekannte Auftreten yon Eiweil~- filmen ant der Oberfl~che der Ultropfen, welche sieh eine Zeitlang im Medium des Pr~iparates befinden, wird besfiitigt.

Alle Ergebnisse lassen sieh mit der Annahme in Einklang bringen, daf~ im Plasmalemma vorhandene Polypeptidketten das Hindernis darstellen, welches der Fusion yon Protoplasten ira Normalfalle entgegensteht. Im Experiment pflegt Fusion oder aueh nur Verklebung nut dann einzutreten, wenn die Plasmaoberfl~iche durch Deplasmolyse, leiehte Alkaliquellung oder Netzmittelwirkung verhndert wurde, also nach Einfltissen, denen die auf- lockei.nde Wirkung gemeinsam ist. - -

Fiir die mikrurgische Methodik ist die MSglichkeit yon Interesse, Proto- plasten in Mikropipetten aufzunehmen und sie damit zu transferieren, was bisher wegen der Koagulafion des Plasmas an der Pipette nur begrenzt mSglich war. Nach vorausgehender Spiilung der Pipette mit Netzmittel- 15snng benetzt das Plasma zwar die Pipettenwand, kann aber restlos wieder abgelSst werden. Wenn die nieht an der Glaswand adsorbierten Netz-

24*

324 L, Hofmeister

m i t t e l m e n g e n aus der P i p e t t e sorgfi i l t ig ausgesp i i l t we rden , ist e in Einflul~ der S u b s t a n z a u f die P r o t o p l a s t e n naeh de n b i she r igen E r f a h r u n g e n nieht naehzuweisen .

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Mikrurgische Untersuchung über die geringe Fusionsneigung plasmolysierter, nackter Pflanzenprotoplasten