H. BRt:u]~: ~oderne Methoden zur Bestimmung yon Steroidhormonen 253

Moderne Methoden zur Bestimmung yon Steroidhormonen

H. BREUER Aus der Chemischen Abteilung der Chirurgischen Universit~tsklinik Bonn (Direktor: Prof. Dr. A. Gi?TG]~A~)

Eingegangen am 5. April 1965

Summary. In the present paper the following newer methods for the determination of steroid hormones are discussed: 1. Chemical determination of 17-hydroxy- and 17-desoxycorticosteroids in urine after oxidation and/or reduction of the functional groups of the C17-side chain; 2. thin-layer chromatographic methods for the identi- fication of the metabolites of testosterone in human liver, and for the quantitative determination of pregnanetriol and aldosterone in urine; 3. determination of steroid hormones by gas-liquid chromatography with special reference to the difficulties involved in the quantitative evaluation of the chromatograms and 4. determination of testosterone in human blood by (a) the aromatising enzyme system which converts testosterone to oestrogens, (b) a double isotope-derivative dilution method and (c) gas chromatography with electron capture detector.

Einleitung Die Besthnmung yon Steroidhormonen in K6rperfliissigkeiten war seit jeher ein besonderes Anliegen der klinisehen Bioehemie und der experi- mentellen Endokrinologie. W~hrend bis vor etwa 20 Jahren -- yon wenigen Ausnahmen abgesehen -- biologische ~[ethoden im Vordergrund standen, ist es heute m6glieh, fast alle physiologisch bedeutsamen Steroidhormone mit Hilfe chemiseher Verfahren quantitativ zu erfassen. Die zunehmende Verbesserung und Verfeinerung der ~ethoden mug allerdings in vielen Fi~llen mit einem vergleichsweise groBen experimentel- len und technischen Aufwand erkauft werden. Diese Entwicklung steht in gewissem Gegensatz zu dem verstgnd]ichen Wunsch des Klinikers, nicht nur jeweils die neuesten ~ethoden verffigbar zu haben, sondern dariiber hinaus auch mSglichst sehnell fiber das Resultat der Bestim- mung orientiert zu werden. So gers der klinische Chemiker h~ufig in die schwierige Situation, mit einer aufwendigen ~ethode in kurzer Zeit verls Ergebnisse gewinnen zu mfissen. Es liegt auf der I~Iand, dab hier Kompromisse notwendig sind ; denn bisher ist es noch nieht gelungen, Verfahren zur Steroidbestimmung zu finden, dig so einfach0 billig, empfindlich, speziilseh, genau und richtig sind, dag sic in jeder Hinsicht befriedigen k6nnen und allseitig akzeptiert werden.

A. Statistische ~berlegungen Im vorliegenden Zusammenhang erscheint es notwendig, kurz auf einige statistische Uberlegungen bei der Beurteilung yon }Iormonbestimmungen hinzuweisen. W~hrend der letzten Jahre hat sich in zunehmendem MaBe die Erkenntnis durchgesetzt, dab nur solche Methoden zur Bestim-

254 It. BREUEIr :

mung yon Steroidhormonen benutzt werden sollten, deren Zuverlgssigkeit im statistischen Sinne erwiesen ist. Als Kriterien der Zuverl~ssigkeit sind im allgemeinen 4 Parameter gebr~uchlich: Richtigkeit, Genauigkeit, Empfindlichkeit und Spezifit~it. Es ist das Verdienst yon Bo~TI~ 1-3, diese Begriffe zur Beurteilung yon Steroidbestimmungen eingeffihrt und spgter erg/~nzt zu haben. Die Ausdrfieke ,,Spezifits und ,,Empfindlichkeit" sind leicht verst~ndlich, und im allgemeinen besteht Einigkeit fiber ihre Begriffsinhalte; dagegen herrscht bei der Anwendung der Termini ,,Riehtigkeit" und ,,GenaMgkeit" h/iufig eine gewisse Unsicherheit. Diese ist offenbar auf die Sinnverwandtschaft der Begriffe ,,t~ichtigkeit" und ,,Genauigkeit" zurfiekzuffihren. Beide Begriffe werden im allgemeinen Sprachgebraueh vielfach als Synonyma benutzt und sind in den meisten WSrterbfiehern auch als so]ehe zu finden. Demgegenfiber steht ihre Benutzung als statistisehe termini technici, wobei sie in folgender Weise eindeutig definiert sind.

Der Ausdruek ,,Richtigkeit" gibt die AnnKherung eines Analysenresulta- tes an den ,,wahren" Weft an, bezeichnet also den systematischen oder methodischen Fehler der Bestimmungen. Dieser Fehler beeinfluBt die Analysenergebnisse immer in der gleichen Richtung. Dabei liegt der wahre Weft stets auBerhalb -- im allgemeinen oberhalb -- des Sehwan- kungsbereiehes der gemessenen Werte. Als MaB ffir die Riehtigkeit einer Methode gilt die prozentuale Wiederfindung authentischer Referenz- substanzen, die den zu untersuchenden Proben in bekannten ~engen zugesetzt werden (Zusatzversuehe).

Demgegenfiber gibt der Ausdruck ,,Genauigkeit" -- gelegentlieh auch als ,,Reproduzierbarkeit" bezeiehnet -- die Streuung der Analysenresultate bei einer grSl3eren Zahl wiederholter Bestimmungen an derselben Probe an*. Die Genauigkeit kann aueh aus den Abweiehungen der Einzelwerte vom zugeordneten Mittelwert bei einer grSgeren Anzahl yon Doppel- bestimmungen verschiedener Proben bereehnet werden**. Die Genauig- keit bezeiehnet also den zuf/~lligen Fehler der Bestimmungen, der die Analysenergebnisse nach beiden l~iehtungen beeinflul~t. Dabei liegt der wahre Wert stets innerhalb des Schwankungsbereiches der gemessenen Werte, die ihrerseits um den wahren Wert normal-verteilt sind. Der dureh den Zufallsfehler bedingte Streubereieh der Mel~werte (2-4-s), innerhalb dessen ein Analysenergebnis bei wiederholter ~essung mit einer gegebenen Wahrscheinhehkeit (P) gemessen werden kann, weist eine Bestimmungsmethode als mehr oder weniger genau aus. Um eine Vorstellung davon zu vermitteln, in welchen GrSBenordnungen sieh die kliniseh bedeutsamen Steroide und Steroidgruppen beim Men-

* * 1/i(xl- s - - [ ~ _ _ ~ . s = V 2~v

Moderne XVrethoden zur Bestimmung yon Steroidhormonen 255

schen unter physiologischen Bedingungen bewegen, sind in Tab. 1 die Konzentrationsbereiche im Urin und im Blut ffir Frauen und M~nner zusammengestellt. Es sei ausdrficklich darauf hingewiesen, dab die bier angegebenen W e r t e in ers ter Linie or ien t ie renden Cha rak te r haben u n d n ich t unbed ing t als Mlgemein verb ind l ich b e t r a c h t e t werden dfirfen. Die I-I6he der N o r m a l w e r t e is t n ich t nur yon der ve rwende ten ~[ethodik , sondern in vielen F~l len auch yore Al ter , yore Gewicht sowie bei F r a u e n yon der Cyclusphase abhgngig. Die Zahlen der Tab. 1 lassen jedoch erkennen, d a g die Mengen der zu bes t immenden Steroide fiber mehrere Gr6Benordnungen hinwegreichen. Dieser Ta t sache mfissen die jeweil igen ana ly t i schen Methoden a n g e p a g t werden. W~hre nd die 17-Ketos tero ide in mg-Mengen/24 S td im Ur in ausgeschieden werden, bewegen sich die

Tabelle 1. Konzentrationsbereiche klinisch bedeutsamer Steroide und Steroidgruppen im Urin und Blut bei normalen Frauen und Mgnnern Die Werte stiitzen sich auf Angaben der Literatur sowie eigene Ergebnisse. Die Abh~ngigkeit vom Alter und yore Gewieht blieb unberiieksiehtigt

Steroide bzw. Steroidgruppen

17-Ketosteroide (gesamt) 11-oxygenierte 17-Keto- steroide

Dehydroepiandrosteron Androsteron ]~tioeholanolon

Testosteron

17-Hydroxycorticosteroide (gesamt)

Cortison Tetrahydrocortison Cortisol Tetrahydroeortisol Tetrahydro-ll-desoxy-

Konzentrationsbereich in] Urin (rag/24 Std)

Frauen

5--10

1,3 0,9 1,8 2,0

0,005--0,015

5--12

lVI~nner

7--15

2,0 1,3 2,4 2,6

i

0,015--0,070

6--14

0,040--0,100 1,5 --2,5 0,040--0,120 1,5 --3,0

Konzentrationsbereich imBlut (~g/100 ml)

Frauen I Nfinner

50--200

20-- 100 20-- 30 bis 20

bis 0,2 ! bis0,6

5--30

0,5--5

5--20

cortisol Cortieosteron A]dosteron

Pregnandiol Pregnantriol Progesteron

0estrogene (Oestradiol-17fl, Oestron und Oestriol) auBerhalb der Gravidit~t Ende der Gravidit~t

0,020 0,020

0,004--0,012

2--5 0,2--2

< 2 0,4--2

0 , 5 - - 4

bis 0,02

0,020-- 0,080 1 0,005-- 0,040 15--30 I - -

m

2,5--5

I 0,058--0,135 r -- 5 30

i

256 H. BREUER:

Konzentrationen von Testosteron im #g-Bereich; noch deutlichere Unterschiede zeigen sich zwischen den 17-Hydroxycorticosteroiden einerseits und Aldosteron andererseits. Die Ausscheidung der Oestrogene liegt bei der normalen Frau im #g-Bereich, in der Schwangerschaft steigt sie um fast das Tausendfache auf 20--40 rag/24 Std an. Die Steroid- konzentrationen im Blur sind naturgem/~$ wesentlich geringer als die- jenigen im Urin; dadurch entstehen besondere methodische Schwierig- keiten, die erst langsam mit I-Iilfe moderner Verfahren tiberwunden werden kSnnen.

B. Analysenmethoden Durch die Verbesserung der analytischen Methoden -- wobei insbesondere die Fluorimetrie und die Gaschromatographie genannt seien -- ist es nunmehr mSg]ich, fast alle Steroide in Nanogramm-Mengen (10 -9 g) quantitativ zu bestimmen. Diese Feststellung gilt jedoch nur fiir Rein- substanzen. Bei der Bestimmung yon Ster0idhormonen in KSrper- flfissigkeiten ist die Situation sehr viel schwieriger, tiler mfissen die zu untersuchenden Proben zuni~chst einer mehr oder weniger intensiven Reinigung und anschlieBend einer Auftrennung in die einzelnen Steroid- fraktionen unterworfen werden. Aus diesem Grunde umfaBt eine Steroid- bestimmung im allgemeinen 4 Phasen: a) ~ydrolyse der wasserlSslichen Konjugate (Glucuronide und Sulfate) und Extraktion der freigesetzten Steroide, b) Reinigung der Steroide durch Verteilung zwischen verschie- denen LSsungsmitteln, c) Auftrennung der einzelnen Steroidgruppen oder Steroide und d) quantitative Bestimmung.

I. Chemische Methoden

Die Kydrolyse der Steroidkonjugate wird mit MJnerals~uren oder mit geeigneten Enzymen durchgefiihrt, wobei die Festlegung optimaler Bedingungen h~ufig Schwierigkeiten bereitet; die Spaltung yon Steroid- suffaten kann auBerdem durch Solvolyse erfolgen. Die Entscheidung, welche l~ethode benutzt werden sollte, hiingt in erster Linie vonder Stabi- liter der nachzuweisenden Steroide, in manchen F/~llen aber auch yon der verffigbaren Zeit ab. Von besonderem Interesse in diesem Zusammenhang ist eine Beobachtung von BU~STEI~, JACOBSOHN u. LIEBERMAN s wonach bei Anwendung einer verdfinnten Perchlorss in organischem LSsungs- mittel, z.B. J~thylacetat, innerhalb von 3 Std bei 50~ nicht nur die Steroidsulfate, sondern auch die Glucuronide hydrolysiert werden. Inzwischen konnte nachgewiesen werden, dab dieses einfache und wenig zeitraubende Verfahren zur vollst~ndigen ttydrolyse der 17- Ketosteroidglucuronide irn Urin geeignet istL Auf die Freisetzung der Steroide aus ihren Konjugaten folgt die Extrak- tion mit organischen LSsungsmitteln. Durch anschlieBende einfache oder

Moderne Methoden zur Bestimmung yon Steroidhormonen 257

mehrfache Verteilung zwischen organischen und w/~Grigen Phasen wird eine Reinigung erzielt, die ffir Gruppenbestimmungen yon Steroiden im allgemeinen ausreicht. Die Prinzipien dieser Reinigungsschritte sind seit den ersten Arbeiten fiber die Isolierung yon Steroidhormonen arts dem Urin bekannt und wurden in den letzten Jahren nicht mehr entscheidend verbessert. Hingegen sind bei tier Auftrennnng tier Steroidgruppen und Steroide sowie bei ihrer quantitativen Bestimmung wesentliche Fort- schritte gemacht worden. Auf einige dieser neueren Verfahren soll n/~her eingegangen werden, ohne da$ damit der Anspruch auf Vollst/~ndigkeit erhoben wird; vielmehr sollen an wenigen Beispielen die vielfaltigen methodischen MSglichkeiten zur Bestimmung yon Steroidhormonen demonstriert werden. Aufgrund langj/~hriger Untersuchungen yon NOI~YMB~SKI U. Mitarb. 15 ist es heute mSglich, 17-Hydroxy- und 17-Desoxycorticosteroide auf ein- lathe Weise durch strukturelle Umwandlung der C17-Seitenkette des Steroidmolekiils zu bestimmen. Bei diesen indirekten Verfahren werden dutch Behandlung mit 0xydationsmitteln oder durch kombinierte Anwendung yon Reduktions- und Oxydationsmitteln bes~immte Kon- figurationen tier Seitenkette am Ring D des Steroidmolekiils selektiv in 17-Ketosteroide umgewandelt. Die so gebfldeten 17-Ketosteroide werden dann mit der Zimmermann-Reaktion quantitativ bestimmt. In Tab. 2 ist das Verhaltender einzelnen 17-Hydroxycorticosteroidegegeniiberder Oxy- dation und Reduktion sowie verschiedenen Kombinationen beider Ver- fahren fibersichtlich zusammengestellt. Wie aus Tab. 2 hervorgeh~, stehen fiir die Gruppenbestimmung yon 17-Xydroxycorticosteroiden 5 verschie- dene MSglichkeiten zur Verffigung. Von diesen haben die ~ethoden zur Be- stimmung der 17-ketogenen Steroide (17-KGS, ~ethode I) und der gesam- ten 17-1:fydroxycorticosteroide (17-OItCS, Methode II) eine besondere Bedeutung ffir die Klinik erlangt, w/~hrend die Bes~immungder 21-Des- oxyketole (~ethode III) nut eine begrenzte Anwendung gefunden hat. Als 17-KGS werden alle 17-I~ydroxycorticosteroide mit Ausnahme der 21-Desoxyketole erfaSt (vgl. Tab.2; B - ? C + D). Da die 21-Desoxy- ketole unter normalen Bedingungen nur in sehr geringer Menge aus- geschieden werden, ist die Bestimmung tier 17-KGS im allgemeinen repr/~- sentativ f~ir die Gesamtausscheidung der 17-Itydroxycorticosteroide. Der Gehalt an 17-KGS ergibt sich aus der Differenz zwischen den vor und nach Behandlung mit Natriumwismutat nachgewiesenen 17-Keto- steroiden. Als 17-0~CS werden alle 17-Hydroxycorticosteroide unter Ein- schlu$ der 21-Desoxyketole (vgl. Tab.2; A -~ B ~ C ~- D) erfal~t. Die Methode unterscheidet sich yon der 17-KGS-Bestimmung durch einen weiteren Arbeitsgang, der in der Vorbehandlung der zu untersuchenden Probe mit Natriumborhydrid besteht. I-Iierdurch werden die endogenen 17-Ketosteroide zu 17-~ydroxyverbindungen reduziert. Da die 17-J=[y-

Z. analyt . Chem., Bd. 212 17

258 H. BBEtT]~B :

droxysteroide durch Wismutat nicht reoxydiert werden, stammen die bei der anschliegenden Oxydation mit Natriumwismutat entstehenden 17-Ketosteroide aussehlieBlich aus den 17-I-Iydroxycorticosteroiden; eine Differenzmessung wie bei der 17-KGS-Bestimmung entfgllt also.

Tabelle 2. Verhalten yon 17-Hydroxycorticosteroiden gegeniiber Oxydation, Reduktion und verschiedenen Kombinationen von Oxydation und Reduktion (nach ~OI~u ) 17-KGS = 17-Ketogene Steroide 17-OHCS = 17-Hydroxycor~icosteroide

I. 17-Ketogene Steroide (B ~- C + D) nach Subtraktion der endogenen 17-Keto- steroide. II. Totale 17-Hydroxycorticosteroide (A -F B + C + D).

III. 17,20-Ketole oder 21-Desoxyketole (A) IV. 17,20-Glykole und 17,20,21-Trio]e (B ~- D). V. Dihydroxyacetone und 17,20,21-Triole (C + D).

2 Behadd[ung 20FO OH OH O OH qy~OH oH ..~0H 0H JL ~L.

A B C D /

NaBiO 3 J~O O O O O OH 1 t-.oH ~L. /L ~ ~

(17- KGS )

1. BH~- O O O O OH OH II 2. NaBiO3 J--,. /[L~ / ~ . /]],-.. /L. . / J~

(]7-OHCS)

1 NOB_~O 3 O OH OH OH OH OH ill 2BH4 A A A A A A

3.NaB[O 3

1,Zn /~OO O A O O O OH ]V 2NaBiO3 H , ~ /JL ~ ~J~

V 8 2 1 BH 4- 2 Sdure 3. IOff

0 0 .x. .A.

OH OH .r r

Auch die 17-Desoxycortieosteroide sind, wie bereits erwghnt, einer indi- rekten Bestimmung nach partieller Abspaltung der Seitenkette zuggnglich (Abb. 1). Bei den 17-Desoxycorticosteroiden handelt es sieh um 20,21- Ketole oder 20,21-Glykole. Die 20,21-Ketole werden mit Natrinmbor- hydrid zu 20,21-Glykolen reduziert; die durch l~eduktion entstandenen und die endogenen 20,21-Glykole werden dann mit Na~riumwismutat zu C20-Aldehyden oxydiert. Dureh Behandlung mit Benzolsulfohydroxam- sgure in schwaeh alkalischer LSsung werden die Steroidaldehyde in Steroidhydroxamsguren iiberffihrt, die mit Eisen(III)-ehlorid eine pur- purrote Komplexverbindung bilden.

1I. Diinnschichtchromatographie

Nine wesentliche Bereieherung der Steroidanalytik stellen die dfinn- sehichtchromatographischen Methoden dar. Sie sind wghrend der letzten

Moderne l~Iethoden zur Bestimmung yon Steroidhormonen 259

Jahre in zunehmendem l~Iage zur Reinigung yon Urin- und Blutextrakten sowie zur Trennung yon Steroidgemischen benutzt worden. Als besonders geeignet erweist sieh die Dfinnschichtchromatographie bei biochemischen Untersuehungen des Steroid- stoffwechsels, da hier im allgemeinen relativ reine Ex- t rakte vorliegen und grSl3ere Reinigungsschritte nieht not- wendig sind. Die Vorzfige der

Dtinnschichtchromatogra- phie bestehen in der schnellen Ent~4cklung der Chromato- gramme, dem geringen Sub- stanzbedarf sowie der An- wendbarkeit einer Vielzahl yon mikroehemisehen lgeak- tionen und Farbreaktionen,

CH2OH ~H2OH

C~O CHOH

B~0~-~

/ ~-O ~ O"-")3 Fe

Benzolsulfo - hydroxams

Abb.1, Indirekte Bestimmung yon 17-Desoxycortico- steroiden (nach NOKY~BERSK115)

die h~ufig eine vollst~ndige Identifi- zierung der Steroide in situ auf der Diinnsehiehtplatte erlauben. Von den zahlreichen Farbreaktionen eignet sich die Anisaldehyd-Schwefels~ure- reaktion besonders gut zur Charakterisierung yon einzelnen Steroiden und Steroidgruppen, wenn die Dtinnschichtplatte naeh dem Ansprfihen mit dem Iteagens in zunehmendem Ma6e, z.B. mit tIflfe eines FShns, erhitzt wird. Dadureh ergeben sieh versehiedene Stufen der Farbent- wieklung, die fiir bestimmte funktionelle Gruppen charakteristiseh sind. So dauert die Farbentwicklung bei ges/~ttigten 3-Ketonen 3--1 min, bei Steroiden mit A 4-3-Ketogruppen 4-- 6 min, bei 17-Ketonen 6-- 7 min und bei 3,17fl-Dio]en 7--10 rain (weitere Einzelheiten vgl.12). Nit ttflfe der eindimensionalen Mehrfaehehromatographie dureh wiederholte Ent- wieklung in 2 verschiedenen Systemen sow~e der Anisaldehyd-Sehwefel- s~ure-Reaktion ist es z. B. m6glieh, die Metaboliten des Testosteron-Stoff- wechsels in der Leber des Mensehen ohne Schwierigkeiten zu identifizie- ten is. Wie aus Abb.2 hervorgeht, gelang auf diese einfaehe Weise eine Trennung der 5c~- und 5fi-Isomeren yon Androstan-3,17-dion, Androstan- 17fi-ol-3-on und Androstan-3cc-o]-17-on. Bag die Dfinnsehiehtehromatographie auch bei klinischen I-Iormon- bestimmungen yon grogem Wert sein kann, sei an den Beispielen der Pregnantriol- und der Aldosteronbestimmung im Urin gezeigt. Bei der yon STX~KA u. ~ALIXOVX 16 angegebenen Methode zur Bestimmung von Pregnandiol und Pregnantriol handelt es sich um eine Ubertragung der S&ulenehromatographie an AI~O~ auf eine Fl&ehe. Dadureh wird es m6glieh, neben Pregnandiol und 3c~,17cr162 aueh das 20fi- Epimere yon Pregnantriol sowie Pregnantriolon auf einer Diinnsehieht- platte naehzuweisen. Die Methode fiberzeugt dureh ihre Einfaehheit:

17"

260 H. BI~EUEI~:

Nach enzymatischer Hydrolyse wird der Urin mit Benzol extrahiert und der Riickstand des Benzolextraktes ohne weitere Reinigung unmittelbar der Dfinnschichtchromatographie unterworfen. Die Steroide werden dutch Ansprfihen der Platten mit Phosphorsiiure sichtbar gemacht, eluiert und anschliel3end als Schwefels~ure-Chromogene bestimmt. Da auf einer Platte 5 Urinextrakte gleichzeitig im Verlaufe yon etwa 30 rain untersucht werden kSnnen, ist die ~e thode yon STXI~I~A u. MALIKOVi 16 ein besonders eindrucksvolles Beispiel ffir die Brauchbarkeit der Dfinn- schichtchromatographie in der klinischen Routinediagnostik.

Auch das yon NlSmKAZE u. STAUDINGER 14 mitgeteflte Verfahren zum dfinnschichtchromatographischen Nachweis yon Aldosteron im Urin stellt eine wesentliche Vereinfaehung der bekannten Aldosteronmethoden dar. W~hrend bei den bisherigen Verfahren eine mehrfache Papier- chromatographie sowie zahlreiche Reinigungsschritte erforderlich sind, genfigt bei der I)finnschichtchromatographie eine zweidimensionale Entwicklung des vorbehandelten Urinextraktes (Abb. 3). Zunhchst wird eine aufsteigende Chromatographie im System Cyclohexan-Isopropanol durchgeffihrt, wobei Aldosteron yon Cortisol und seinen Metaboliten sowie von Corticosteron und weniger polaren Corticosteroiden getrennt wird.Anschliel~end ~_rd die Platte um 90 ~ gedreht, in Chloroform-Eisessig entwickelt und dadurch Aldosteron yon l l-Dehydrocorticosteron und seinem Dihydroderivat abgetrennt. Da die Rt-Werte gut reproduzierbar sind, kann Aldosteron ohne vorherige Anfi~rbung im Schnittpunkt von 2 Leitlinien lokalisiert werden. Nach Elution des Aldosteronfleckens er- folgt dann die quantitative Bestimmung mit Tetrazoliumblau. Der be- sondero Vorteil der ~ethode nach NISHIKAZE U. STAUI)INGEt~ 14 liegt in der erheblichen Zeitersparnis ; das Verfahren hat sich in der Klinik bereits gut bew~hrt (STXRKA, pers. Mitteflung).

III . Gaschromatographie Die jfingste und eine nach Meinung zahlreicher Autoren vielversprechende Methode zur Trennung und quantitativen Bestimmung yon Steroiden ist die Gaschromatographie, die allerdings im Falle der Steroide einige Besonderheiten aufweist (l~bersiehten vgl. 10,n). Diese sind bedingt durch das hohe Molekulargewieht und den niedrigen Dampfdruck der Steroide sowie die geringen zur Verffigung stehenden Substanzmengen. Aus den genannten Grfinden sind die Kennzeichen einer gaschromatographischen Analyse yon Steroiden a) die hohe Kolonnentemperatur (200--260~ b) eine zusgtzliche Eingangsheizung (Flash heater; etwa 300 ~ C), c) kleine Kolonnen (etwa 100 cm lang, 1--4 mm ;~ ) und d) empfindliche Detek- toren. I)er niedrige I)ampfdruck der Steroide erfordert eine hohe, fiber 200~ liegende Arbeitstemperatur der Kolonne. Nun sind einerseits in diesem

~r ~ f e t h o d e n z u r B e s t i m m u n g y o n S t e r o i d h o r m o u e r ~ 261

Temperaturbereich nur noch die unpolaren Silicone (z.B. SE-30) hin- reichend stabfl genug, um als Adsorptionsphase Verwendung zu finden;

OH

.o~ 5 O OH / H OH

o ~ , . I'o 1'o.

o • ~ / 1o ~o~ o~ o

H H H

Abb.2. Stoffwechsel ~'on Testosteron in Leberschnitten des 51enschen. Die Identifizierung der ~etaboliten yon Testosteron erfolgte aufgrund der Diinnschichtchromatographie und der Anis- aldehyd-Schwefelsfiure-Reaktion (Einzelheiten u

C.

i

j'e Io}~ ~orhcoslero/~e Front

2. Ohloroform : E/sessig (8:2)

5' /qI # 0 ~

THF F§ E+ALLO-THB / / t QO %B //

j "

Aldosleron / . . . . . _g.,"

/ /

/ /

. / /

/ x 2"t~,ff

ALLO-DHA

. # 6 I )

Abb.3. Dfinnschichtchromatographische :Bestimmung yon Aldosteron uach ~ISHIKAZE U. STAU- DINGIER ~4. Leitsteroide zur Lokalisierung yon Aldosteron: S 11-Desoxycortisol un4 A ll-Dehydro- cor ticosteron. Bezeichnungen der fibrigen Steroide: F Cortisol; T H F Tetrahydrocortisol; E Cortison; T H E Tetrahydrocortison; B Corticosteron; Allo .THB Allotetrahydrocor~icosteron, DO C Desoxycor- ticosteron; Allo-DHA Allopregnan-21-ol-3,11,20.trion

262 H. B R E V ~ :

andererseits zersetzen sich bei der hohen Temperatur viele der zu unter- suehenden Steroide. Diese Schwierigkeiten entfallen weitgehend bei Steroidderivaten, deren Verwendung aus 2 Grfinden vorteilhaft erscheint : Erstens wird die Polariti~t der Steroide herabgesetzt, so dal3 man Silicon- 61e als flfissige Phase verwenden kann; zweitens sind die Steroidderivate thermisch stabiler and ]eiehter zu verdampfen als die freien Steroide. Die zur Zeit gebrgueh]ichen Derivate sind die Acetate, die Trifluoracetate und Trimethylsilyli~ther. Zahlreiche Untersueher, insbesondere I~oa~I~G u. VA~D~ I-IEVV]~L 11 sowie WOTIZ u. Mitarb. 17 haben sich wi~hrend der letzten Jahre mit den Bedingungen der Gaschromatographie yon Steroiden beschaftigt. Dabei zeigte sich, dab die Trennung und quantitative Bestimmung authen- fischer Substanzen normalerweise keine Schwierigkeiten bereitet. Diese treten erst bei Verwendung yon Urin- und Blutextrakten auf, da die Detektoren infolge ihrer Unspezifitgt noch die geringsten Verunreinigun- gen erfassen. In diesem Zusammenhang sei auf 2 GrS~en aufmerksam gemacht, die ffir die Zuverl~ssigkeit einer gaschromatographisehen Me- rhode yon Wichtigkeit sind: a) Die Retentionszeit und b) die quantitative Auswertung der gewonnenen Kurven. Im a]lgemeinen ~ r d angenommen, dab unter definierten Bedingungen (8i~ule, Temperatur, Gasdruek) die Retentionszeit ffir ein gegebenes Steroid eine konstante GrSl~e ist. Bei der Aufnahme yon Eichkurven fiber mehrere Zehnerpotenzen zeigte sich ]edoch eine Abhgngigkeit des I~r-Wertes yon der untersuchten Steroid- menge (Abb. 4). Bei niedrigen Steroidkonzentrationen war die Retentions- zeit yon Oestradiol-17~-diacetat deutlich verlgngert. Da bei der Gas- chromatographic die Identifizierung einer Substanz ausschlie~lich auf Grund der l~etentionszeit erfolgt, mu{~ auf die l~eproduzierbarkeit dieses Wertes sorgfgltig geachtet werden. Ein wciteres Problem, das bei der quantitativen Steroidbestimmung in KSrperfltissigkeiten deutlieh wird, betrifft die Ausmessung der Gipfel; dies gilt besonders dann, wenn die einzelnen Gipfel nicht yon der Null-Linie ausgehen oder nicht zur Null-Linie zurfickkehren und infolgedessen die Basislinie des Gipfels nicht parallel zur Nullinie des Schreibers verlguft. I)ieser Effekt macht sieh nicht nut in Gegenwart yon Verunreinigungen oder bei ungleichen Steroidmengen bemerkbar, sondern auch bei Ver- wendung yon organisehen LSsungsmitteln (z. ]3. Aceton). So kann dutch den LSsungsmittelgipfel, der zu Beginn des Chromatogramms auf- tritt , die quantitative Bestimmung kleinster Steroidmengen mit kurzen Retentionszeiten wesentlieh erschwert werden. Aus diesem Grunde ver- wenden wit in Anlehnung an einen Vorsehlag yon ~O~Y~m~SKI (pers. Mitteilung) eine Verdampfungsapparatur*, die aus einem Pyrolyseaufsatz

* Herste]ler: Fischer-Labortechnik, Chemisch-physika]ischer Gergtebau, Bad Godes- berg. Eine iihnliehe Apparatur ist yon ETT~E u. VXZAI)I s beschrieben worden.

Moderne Methoden zur Bestimmung yon Steroidhormonen 263

Retentionszeit

6,0

Min.

4,0

2,0 3~ S E - 30 220", 60cm

o I I I

0,ol o,1 1,o jug io

Oestradiot-17 [t -d iece ta t

Abb.4. Abh~ngigkeit der l~etentionszeit yon der eingesetzten ~enge Oestradiol-17fl- diacetat

Abb.5. Pyrolyseaufsatz zur trockenen Ver- dampfung yon Steroidderivaten bei der Gas- chromatographie, ltersteller: Fischer-Labor- technik, Chemiseh-physikaliseher Ger~te- bau, ]~ad Godesberg. ]~inzelheiten siehe Text

6/ase/nsa/zI~

2.~rz t~ll P/a//zspu/e

i

'1 ~A X X X N X X ~ 7 ( X X X X

He~z- X X X ) < o/'en XXX>< 5oW XXX><

2%XX7 2 S X X )

5~ew/'nde f~)k 5'E2

//2 X~,S

Probenaufnahme e (G/as)

~A

und einem Glasrohr zur Aufnahme der Proben besteht (Abb. 5). Die zu untersuchende Steroidprobe wird in einem organischen LSsungsmittel gelSst und durch Verdampfen auf ein MetallgazerSllchcn (Dixon gauze

1 1 . rings), 16-in. • ~ m. ; Griffin & George Ltd. Manchester) gebracht. Mit

ttilfe eines Magneten werden die l~611chen in den Pyrolyseaufsatz befSr- dert, wobei die aufgebrachte Snbstanz verdampft und in die gaschromato- graphisehe Kolonne eintritt. Die Teehnik der troekenenVerdampfung bietet mehrere Vorteile : Es treten keine stSrenden LSsungsmittel-Vorgipfel auf, die Reproduzierbarkeit ist besser, der Zeitaufwand ist geringer. Die quantitative Bestimmung yon Substanzen in einem Gasehromato- graphen kann naeh 3 versehiedenen Verfahren erfolgen: a) Angabe der Gipfelh6he und Vergleieh mit einer etwa gleieh grogen Kurve der authen- tisehen Substanz, b) geometrische Bereehnung aus der ~She des Gipfels x Kalbwertsbreite der Kurve sowie e) planimetrische lV[essung der

Fl~che unterhalb der Gipfelkurve. Abb. 6 zeigt, dub die Werte ftir eine gegebene Steroidmenge je nach Applikationsverfahren (fliissig oder trocken) und Anwesenheit anderer Substanzen (Steroide oder Verun- reinigungen) stark differieren. I)iese Feststellungtrifftunabh/ingig yon den

264 It. BREU]~I~ :

gew/~hlten Auswertungsverfahren zu und sollte deshalb bei der quantita- riven Auswertung yon Steroidgasehromatogrammen beaehtet werden. Die bisher vorliegenden Ergebnisse znr Bestimmung yon Steroiden in KSrperflfissigkeiten mit Hflfe der Gasehromatographie sind zum Tell ermutigend. Am besten geeignet zur gasehromatographisehen Analyse sind die im Urin in mg-Mengen ausgesehiedenen Steroide, zu denen z.B. die 17-Ketosteroide, die 17-I-Iydroxyeortieosteroide und Pregnandiol z/ihlen. Zur Bestimmung dieser Verbindungen sind bereits zahlreiehe Verfahren besehrieben worden, auf die im einzelnen nieht n~her ein- gegangen werden kann.

C. Beispiel Absehliel3end sei am Beispiel der Testosteronbestimmung im Blur gezeigt, welehe zahlreiehen methodischen M6gliehkeiten heute zur Verffigung stehen. Die Bestimmung der Testosteronkonzentration im Blur hat gerade in jiingster Zeit bei bestimmten endokrinen Erkrankungen der Frau (z. B. Virflismus) eine Bedeutung erlangt. Naehdem sieh ergeben hatte, dug eine quantitative Bestimmung der sehr geringen Testosteronkonzentra- tionen im Blur mit HJlfe der Colorimetrie nieht mSglieh war, wurden in wenigen Jahren 3 ganz versehiedene Verfahren entwiekelt, die alle zu einer LSsung des analytisehen Problems ffihrten. Die erste Methode beruht auf der Umwandlung yon Testosteron in Oestradiol-17fi und Oestron dutch das aromatisierende Enzymsystem der Placenta 9. Dieser Weg wurde gew/~hlt, weft die analytisehe Naehweisgrenze ffir Steroidoestrogene um mehrere GrSl3enordnungen niedriger liegt als diejenige fiir Testosteron. Da das aromatisierende Enzymsystem nieht nur Testosteron, sondern aueh andere A4-3-Oxosteroide und insbesondere z]5-3fi-tfydroxysteroide (z. B. Dehydroepiandrosteron) angreift, ist die papierchromatographisehe Abtrennung der Testosteronfraktion eine notwendige Voraussetzung f/it die Spezifit~tt der ~ethode. Zur Ermittlung der bei jeder Preparation versehiedenen Aromatisierungsrate sowie der methodisehen Verlusto werden Parallelversuehe mit [4-1~C]-Testosteron durehgefiihrg. Die Empfindliehkeit der Methode liegt bei 0,1 #g Testosteron/100 ml. Eine Verbesserung der Empfindliehkeit gelang dureh Einfiihrung von Doppelisotopenderivat-Verdiinnungsmethoden, die allerdings einen gro- Ben experimentellen Anfwand erfordern. Die wesentliehen Sehritte des von K~LLIE u. Nitarb. 5 angegebenen Verfahrens seien kurz angedeutet. 10ml Plasma werden mit Chloroform extrahiert; nach Zusatz yon [4-14C]-Testosteron als endogenem Standard wird der Riiekstand des Chloroformextraktes mit Tritium markiertem Aeetanhydrid in Pyridin aeetyliert. Nach Zusatz yon 20#g inaktivem Testosteronaeetat als Currier erfolgt eine zweimalige, zweidimensionaleDfinnschiehtehromato- graphie in vier verschiedenen Systemen und ansehliel3end eine dreimalige

Moderne Methoden zur Bestimmung yon Steroidhormonen 265

Papierchromatographie. Nach Elution der Testosteronacetatfraktionen wird dos Verhi~ltnis 3It zu 14C bestimmt und daraus der endogene Testosterongehalt des Plasmas berechnet. Die Empfindlichkeit liegt bei 0,05 #g Testosteron/100 ml. Eine dritte Methode zur Bestimmung yon Testosteron, deren Empfind- lichkeit bis 1 ng reicht, besteht aus der Kombination yon Diinnschicht- chromatographie und Gaschromatographie mit Elektroneneinfang- detektort Verglichen mit den Doppelisotopenderivat-Verdiinnungs-

/ 5 11

Probe 2,ug Os[ronace[ot / 2.,ug Ostrodioldiocetot 2#ug Ostradioldiacetcl~(dVaer~T::)il t,~ (verd.) mit Verunreini-

114.,ug Ostrioltriocetclt - "gung yon Ch . . . . to - ll graphiepapier

22Jg Os t rad io ld iace te t I 2 p g Ost rad io td iace ta t ( v e r d a m p f t ) ( mit lOja[ Aceton e inge-

spritzt )

H6he

H6he ~ Halbwerts= breite

plonimetc Fidch~

110 mm 113 mm 152 mm 234 mm

605 mm 2 620 mm 2 760 m m 2 820ram 2

1100 mm 2 850ram 2 1000ram 2 960mm 2

Abb. 6. Yergleich verschiedeuer Auswer tungsverfahren bei der Gaschromatographie. Jeweils 2 t~g Oestradiol-17fl-diaeetat wurden unter verschiedenen experimentellen Bedingungen der Gaschromato- graphie unterworfen. Die quan t i t a t ive Auswertung erfolgte nach 3 verschiedenen Verfahren. Einzel- heiten siehe Text. Kolonne : 100 em 1 m m i. D,, 3 ~/o S E 30 auf Chromosorb W 60/80 mesh; TrS~gergas: Stickstoff 30 psi; Temperatur : 220 ~ C ; Detektor : F.I .D. ~IdLuf t 7 psi, At tenua to r 20 x l0 S

266 H. ]~REUER: l~oderne Methoden zur Bestimmung yon Steroidhormonen

methoden erscheint die Ausffihrung einfach. Nach Zusatz yon [1,2-3H]- Testosteron wird die Plasmaprobe in iiblicher Weise extrahiert und der Extraktrfickstand der D/innschichtchromatographie unterworfen. Die Testosteronfraktion wird eluiert und mit Monochloracetanhydrid in Tetrahydrofuran und Pyridin behandelt. Das so gewonnene Testosteron- monochloracetat wird nunmehr auf einer Dfinnschichtplatte chromato- graphiert, eluiert und mit 0,4 #g Cholesterin-monochloracetat als inter- nero Standard ffir die Gaschromatographie versetzt. Die quantitative Bestimmung erfolgt nach Gaschromatographie mit Hilfe eines Elektro- neneinfangdetektors. 0,005 #g Testosteron-monochloracetat ergeben eine Fls yon 4,5 cm ~ bei einem mittleren Fehler yon 6,60/0 . Mit einem sauberen Detektor sollen noch 0,001 #g (1 ng) Testosteron-monochlor- acetat als Gipfel deutlich erkennbar sein. Uberbliekt man die modernen Methoden der Steroidanalytik, so stellt man lest, dab fast alle der heute bekannten Steroidhormone einer quan- titativen Bestimmung zug~nglieh sind. Einsehrgnkend muB jedoch be- merkt werden, dab die l'Jbertragung dieser Methoden anf die klinische Routinediagnostik in vielen F~llen noch auf Schwierigkeiten st613t. Es wird die Aufgabe weiterer Untersuchungen sein, dutch sinnvolle Kom. bination yon Reinigungsverfahren und geeigneten Bestimmungsmetho- den diese Sehwierigkeiten zu iiberwinden.

Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit werden s neuere 1V~ethoden zur Be- stimmung yon Steroidhormonen besprochen: 1. Gruppenbestimmung yon 17-Hydroxy- und 17-Desoxycorticosteroiden im Urin nach Oxy- dation und/oder Reduktion der funktionellen Gruppen der C17-Seiten- kette unter verschiedenen Bedingungen; 2. Diinnschichtchroraato- graphische Identifizierung der Metaboliten yon Testosteron in der menschlichen Leber sowie quantitative Bestimmung yon Pregnantriol und yon Aldosteron ira Urin; 3. Gaschromatographische Bestimmung yon Steroidhormonen unter besonderer Berficksichtigung der Schwierig- keiten bei der quantitativen Auswertung und 4. Bestimmung yon Testosteron im Blur mit Itilfe a) des aromatisierenden Enzymsystems, wobei Testosteron zu Oestrogenen umgewandelt wird, b) einer Doppel- isotopenderivat-Verdfinuungsmethode und c) der Gaschromatographie mit Elektroneneinfang-Detektor.

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Uber fluorometrisehe Bestimmungsmethoden fiir Steroide im menschliehen ttarn berichten H. GE~DES und W. ST~]~ ~. Die Induk t ion einer s tarken Fluorescenz von Testosteron in schwefelsaurem Medium bei Einhal ten optimaler l~eaktions- bedingungen wird beschrieben und mi t der Fluorescenzintensit~t yon Cortisol, Corticosteron und Aldosteron bei gMchfalls opt imalen Bedingungen verglichen. Die opt imalen geakt ionsbedingungen fiir die En tMcklung der Fluorescenz yon Testosteron liegen bei einer Tempera tur yon 55~ a n d einer Inkubat ionsdauer yon 10 min. Bei gleicher Inkubat ionsdauer fanden wit das Tempera turopt imum fiir die maxi- male Fluorescenz yon Corticosteron bei 30~ yon Cortisol bei 22~ und yon Aldosteron bei 75 ~ C. Die MOglichkeit der quant i ta t iven fluorometrischen Endpunktsbes t immung yon Testosteron wird diskutiert , da eine lineare Eiehkurve in einem Bereich yon 0,05 bis 2,0/~g erhal ten werden kann. Zur Isolierung yon Testosteron aus biologischen Flfissigkeiten wird eine zweimalige Diinnsctfichtchromatographie auf Kieselgel HF~a~ in den Systemen Chloroform- ~_thanol (9 : 1) a n d Chloroform-Cyclohexan-Eisessig (4: 5 : 1) nach vorausgehender Vorreinigung du tch Verteilung in geeigneten organischen LOsungsmitteln vor- gesehlagen. Die Spezifitgt der Methode und die N6glichkeit der quant i ta t iven Analyse yon Testosteron in biologischen Flfissigkeiten du tch die eharakterist ischen Anregungs- und Fluorescenzspektren wird besprochen. Angerdem sind die Aufarbeitungsgi~nge zur quant i ta t iven fluorometrischen Be- s t immung yon freiem Cortisol und Aldosteron im menschlichen H a m mitgeteil t worden. N i t diesen fiir die klinische Chemie recht einfachen ~ e t h o d e n fanden wir bei 10 gesunden Versuchspersonen eine mit t lere Ausscheidung yon 63,4 • 6,1 #g ( • Standardabweichung) Cortisol und 8,8 ~ 2,5/~g ( • Standardabweiehung) Aldosteron im 24 Std-Harn. Die Wiederfindungsrate lag fiir Cortisol bei 90,50/0 und ftir Aldosteron bei 70o/0 .

Physiologisch-Chemisches In s t i t u t der Medizinischen Akademie in Diisseldorf. -- Die Arbei t wird demngchst in der Zeitschrift , ,Steroids" erscheinen.

Einen optiseh-kinetisehen Test zur Bestimmung der aIkalisehen Phosphatase im Serum empfehlen W. RICK und T.-V. H~vs~-w]~L Ffir die l?[essung dec Aktivi t~t tier sogenannten aika]isehen Phosphatase im Serum sind eine groBe Zahl yon Ver- fahren angegeben worden, die sich durch das Subst ra t and die Substratkonzentr~tion, durch den Nachweis des Produktes, in der benStigten Serummenge, im pH, in der Inkubat ionsdauer und - temperatur sowie der Ar t des verwendeten Puffers unter-