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Mund-, Kiefer-, Gesichtschirurgische Klinik
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. Dr. Dr. F. W. Neukam
Osseointegration elektronenstrahlgesinterter Titani mplantate mit und
ohne LbL-Pamidronat-Beschichtung
- eine tierexperimentelle Studie -
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Stefan Kaßler
aus
Nürnberg
Gedruckt mit der Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. Jürgen Schüttler
Referent: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. K. A. Schlegel
Korreferent: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h. c. F.W. Neukam
Tag der mündlichen Prüfung: 05.12.2011
Der Promovend ist Zahnarzt.
Meiner Familie gewidmet
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung/Abstract ................................................................... - 1 -
1.1 Zusammenfassung ........................................................................... - 1 -
1.1.1 Hintergrund und Ziele ................................................................ - 1 -
1.1.2 Material und Methode ................................................................ - 1 -
1.1.3 Ergebnisse ................................................................................. - 1 -
1.1.4 Schlussfolgerung ....................................................................... - 2 -
1.1 Abstract ............................................................................................ - 2 -
1.2.1 Background and objectives ........................................................ - 2 -
1.2.2 Materials and methods ............................................................... - 2 -
1.2.3 Results ....................................................................................... - 3 -
1.2.4 Conclusion ................................................................................. - 3 -
2 Einleitung ................................................................................................ - 4 -
2.1 Probenherstellung und Oberflächenmodifizierung ............................ - 5 -
2.1.1 Titanimplantate .......................................................................... - 5 -
2.1.2 Layer-by-Layer – Allgemeiner Ablauf ......................................... - 9 -
2.1.3 Implantatbeschichtung mit Layer-by-Layer-Anordnung ........... - 10 -
2.1.4 Experimentelle Daten............................................................... - 11 -
2.2 Implantateinheilung ........................................................................ - 12 -
2.3 Knochenmatrixproteine................................................................... - 14 -
2.3.1 Bone Morphogenetic Protein 2/4 (BMP-2/4) ............................ - 15 -
2.3.2 Kollagen Typ I .......................................................................... - 16 -
2.3.3 Osteocalcin .............................................................................. - 16 -
3 Material und Methode ........................................................................... - 17 -
3.1 Wahl des Versuchstieres ................................................................ - 17 -
3.2 Ablauf und Dauer der Eingriffe ....................................................... - 17 -
3.3 Anzahl und Opferungszeitpunkte der vorgesehenen ...................... - 19 -
Versuchstiere ................................................................................. - 19 -
3.4 Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufes ........................ - 20 -
3.5 Sektion ........................................................................................... - 20 -
3.6 Entnahme und Aufarbeitung der Knochenresektate ....................... - 20 -
3.6.1 Präparatröntgen, Fixierung, Dehydration sowie Einbettung ..... - 20 -
3.6.2 Trenndünnschlifftechnik ........................................................... - 22 -
3.6.3 Mikroradiographie .................................................................... - 22 -
3.6.4 Histomorphometrie................................................................... - 22 -
3.7 Immunhistologie ............................................................................. - 25 -
3.7.1 Methodik und Antikörper .......................................................... - 25 -
3.7.2 Auswahl der Untersuchungsbereiche ...................................... - 27 -
3.8 Statistik ........................................................................................... - 32 -
4 Ergebnisse ............................................................................................ - 32 -
4.1 Knochen-Implantat-Kontakt ............................................................ - 32 -
4.2 Periimplantäre Knochendichte ........................................................ - 35 -
4.3 Immunohistochemische Ergebnisse ............................................... - 40 -
4.3.1 Bone Morphogenetic Protein (BMP-2/4) .................................. - 40 -
4.3.2 Osteocalcin .............................................................................. - 43 -
4.3.3 Kollagen I ................................................................................. - 47 -
5 Diskussion............................................................................................. - 50 -
6 Literaturverzeichnis ............................................................................... - 59 -
7 Danksagung .......................................................................................... - 71 -
- 1 -
1 Zusammenfassung/Abstract
1.1 Zusammenfassung
1.1.1 Hintergrund und Ziele Das Ziel dieser Studie war die Evaluierung von Knochen-Implantat-Kontakt
und periimplantärer Knochendichte von Titanimplantaten. So wurden mittels
SEBM-Verfahren und anschließender LbL-Beschichtung hergestellte Titan-
implantate mit unbeschichteten SEBM-Implantaten verglichen.
1.1.2 Material und Methode
20 Hausschweine erhielten jeweils 6 unterschiedlich strukturierte Titan-
implantate und 6 entsprechende Implantate, die mittels Layer-by-Layer-
Verfahren mit Pamidronat beschichtet wurden. Zu den Opferungszeitpunkten
3, 7, 14 und 30 Tagen wurden jeweils 5 Schweine geopfert und Proben für
die späteren histologischen und mikroradiographischen Untersuchungen
erstellt.
1.1.3 Ergebnisse
Hinsichtlich des Knochen-Implantat-Kontaktes zeigte sich kein signifikanter
Unterschied zwischen unbeschichteten und mit Pamidronat beschichteten
Implantaten. Die periimplantäre Knochendichte ist bei den mit Pamidronat
beschichteten Proben tendenziell höher. Die größten Unterschiede hin-
sichtlich höherer Werte für Knochen-Implantat-Kontakt (in %) und peri-
implantärer Knochendichte (in %) konnten innerhalb der verwendeten
verschiedenen Oberflächenstrukturen der Implantate beobachtet werden.
- 2 -
1.1.4 Schlussfolgerung
Die Ergebnisse dieser Studie zeigen keinen signifikanten Vorteil für die
Verwendung der LbL-Beschichtung hinsichtlich einer Steigerung von
Knochen-Implantat-Kontakt oder periimplantärer Knochendichte. In Hinblick
auf die periimplantäre Knochendichte waren die Ergebnisse für LbL-
Implantate geringfügig höher. Die Ergebnisse zeigen, dass der größte
Unterschied hinsichtlich höherer Werte für Knochen-Implantat-Kontakt und
periimplantärer Knochendichte auf die unterschiedlichen Oberflächen-
strukturen der Implantate zurückzuführen ist.
1.1 Abstract
1.2.1 Background and objectives
The aim of this study was to evaluate the bone-to-implant (BIC) contact and
the periimplant bone density of different titanium implants produced by
Electron Beam Melting with pamidronate layer-by-layer coating in contrast to
uncoated implants.
1.2.2 Materials and methods
20 domestic pigs received each 6 differently structured titanium implants and
six equal implants that were coated with pamidronate by the layer-by-layer
technique. Each 5 animals were sacrificed after 3, 7, 14 and 30 days and the
specimens were prepared for histological and microradiographic
examination.
- 3 -
1.2.3 Results
Considering the BIC, there was no significant difference between the
pamidronate coated and the uncoated probes. By tendency, the results for
periimplant bone density were higher in the pamidronate-coated probes. The
most prominent differences considering higher results for BIC (in %) and the
periimplant bone density (in %) could be detected between the different
surface structures of the implants.
1.2.4 Conclusion
The results of this study show no significant benefit for layer-by-layer coating
on enhanced BIC or periimplant bone density. Respectively on the
periimplant bone density, the results for pamidronate-coated probes were
slightly higher. The results show that the most prominent differences
concerning BIC and periimplant bone density arose from the different surface
structures of the implants.
- 4 -
2 Einleitung
Heutzutage ist die Verwendung von Titan als Werkstoff, im Bereich der
Orthopädie, wie auch in der Zahnmedizin und der Mund-, Kiefer-,
Gesichtschirurgie das Material der Wahl bei Implantaten [119]. Allerdings
besteht ein Ungleichgewicht zwischen der Steifigkeit des menschlichen
Knochens (E = 5-27 GPa) und der von Titan (E = 105–110 GPa). Dieses
Ungleichgewicht ist verantwortlich für den als „Stress-Shielding“ bekannten
Effekt. Dieser kann eine der Ursachen für langfristigen Knochenabbau und
eventuelle Mikrofrakturen bei Implantaten sein.
Eine Möglichkeit dieses „Stress Shielding“ zu vermeiden liegt in der
Oberflächengestaltung der Implantate, um die mechanischen Eigenschaften
denen des menschlichen Knochens anzupassen. Zusätzlich gestattet die
Verwendung einer porösen Struktur ein direktes Einwachsen von Knochen in
das Implantat, so dass eine bessere Fixierung erreicht werden kann [96]. Die
Verbesserung der Osseointegration von orthopädischen und zahnmedizi-
nischen Implantaten wurde anhand unterschiedlichster Oberflächen-
gestaltungen untersucht [14, 101]. Bei der Verwendung von sandgestrahlten,
geätzten und veränderten SLA Oberflächen konnte ein positiver Effekt
hinsichtlich der Osseointegration gezeigt werden [14, 101]. Die Verwendung
von Calciumphosphat beschichteten Implantaten zeigte eine Steigerung der
Osteokonduktivität [24, 36]. Auch die Effekte bei der lokalen Verwendung
verschiedener Bisphosphonate hinsichtlich der Knochenheilung und
Osseointegration haben das Interesse geweckt [57, 71]. So wurde in der
Studie von Kajiware et al. gezeigt, dass es bei Ratten zu einer erhöhten
Knochenbildung bei Pamidronat beschichteten Implantaten im Gegensatz zu
Calcium beschichteten oder reinen Titanimplantaten kommt [57]. Die
Verwendung von Pamidronat wirkt auf kultivierte menschliche Osteoblasten
bei einer Konzentration kleiner 10 nM mineralisationsfördernd, ab einer
Konzentration größer 10 µM jedoch hemmend [111]. In einer anderen Studie
konnte nachgewiesen werden, dass die Verwendung von Pamidronat in
Lösung eine stark hemmende Wirkung auf die Protein- und Kollagen-
synthese hat. Eine gegenteilige Wirkung wird jedoch erzielt, wenn
Pamidronat an Hydroxylapatit gebunden vorliegt. An Hydroxylapatit
- 5 -
gebunden wirkt Pamidronat steigernd hinsichtlich der DNA-, Protein- und
Kollagensynthese von Osteoblasten und könnte somit die Osseointegration
von Implantaten fördern [41]. In dieser durchgeführten tierexperimentellen
Studie wurden die Wirkungen von elektronenstrahlgesinterten Ti-6Al-4V
Implantaten, mit Pamidronat als Bestandteil der LbL-Beschichtung (äußerste
Schicht) und unterschiedlichen Oberflächengestaltungen untersucht.
Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine zusätzliche Beschichtung mit
Pamidronat möglicherweise den Knochen-Implantat-Kontakt steigert und die
periimplantäre Knochendichte (Mineralisationsrate) des periimplantären
Knochens erhöht.
2.1 Probenherstellung und Oberflächenmodifizierung
2.1.1 Titanimplantate
Zwei kompakte und vier spezifisch poröse Proben von Titanimplantaten
(8 mm Länge, 4 mm Durchmesser) wurden mittels SEBM-Verfahren
(selective electron beam melting) hergestellt. Für die Herstellung wurde die
EBM-S12 Einheit von Arcam AB (Arcam AB, Mölndal, Sweden) und als
Rohmaterial handelsübliches Ti-6Al-4V-Pulver (Partikelgröße 45-100 µm)
verwendet (Abb. 1 und Tabelle 1). Der Herstellungsprozess wird bei
Heinl et al. beschrieben (Abb. 2) [47]. Um eine glatte Oberfläche
nachzuahmen, wurden die kompakten Titanimplantate mit Silicium-Carbid-
Schleifpapier (Körnung 2400) poliert (A) und zusätzlich mit der LBL-
Beschichtung versehen (Ac) (Abb. 3 und 4). Die zweite Art kompakter
Proben wurde ohne Modifizierung mit teilweise oberflächlich anhaftenden,
geschmolzenen Pulverpartikeln verwendet (D und Dc). Zwei kompakte (A, D
und Ac, Dc) und vier poröse Proben (B, C, E, F und Bc, Cc, Ec, Fc) wurden
mittels dem sogenannten „Hatching process“ hergestellt. Bei diesem Prozess
wird jede Pulverschicht mittels Elektronenstrahl in parallelen Linien bei
gleichbleibendem Abstand abgetastet. Für die Herstellung der kompakten
Proben ist der Abstand d zwischen den Pulverlinien kleiner, als die
- 6 -
Abtastungsgröße des Elektronenstrahls D (0,1-0,4 mm), so dass die
geschmolzenen Linien überlappen. Mit zunehmenden Abstand d der
Pulverreihen (d > D) wird der Verbund benachbarter Schmelzreihen
verhindert und Strukturen mit zunehmender Porosität entstehen. Somit wird
ab einem bestimmten Abstand d zwischen den Reihen eine säulenartige
Struktur generiert, bei der alternierend nach jeder Schicht die Scanrichtung
um 90⁰ gedreht wird. Um eine dreidimensionale netzwerkartige Struktur zu
bilden, muss die Abtastungsrichtung des Elektronenstrahls für eine fest-
gelegte Anzahl an Schichten N beibehalten werden (Abb. 2) [47].
Der Abstand zwischen den Titanpulverreihen d, die Anzahl der Schichten N
bei gleichbleibender Richtung des Elektronenstrahls und die Oberflächen-
rauhigkeit sind in Tabelle 2 dargestellt. Abschließend wurden die Proben für
30 Minuten in einem Ultraschallbad mit 70%igen EtOH und destillierten
Wasser behandelt und bei 121 ⁰C, 30 Minuten sterilisiert. Die Werkstoffe Ac-
Fc erhielten zusätzlich die sogenannte LbL-Beschichtung (siehe unten).
Abb. 1: Verwendetes Rohmaterial (Ti-6Al-4V) mit Partikelgröße (45-100 µm)
Al V Fe O N C H Ti
Ti-6Al-4V Pulver 6,09 4,14 0,07 0,13 0,008 0,011 0,0030 balance
Tab. 1: Zusammensetzung des verwendeten Ti-6Al-4V-Pulvers
- 7 -
Abb. 2: Schematischer Aufbau des Herstellungsprozesses von porösen Titanstrukturen mittels des SEBM-Verfahrens
Erläuterungen zur Grafik in Abb. 2:
D = Durchmesser des Elektronenstrahls (01-0,4 mm)
D = Abstand zwischen den Pulverreihen des Titans
t = Dicke der einzelnen Titanschicht (100 µm)
N = Anzahl der Schichten
Abb. 3: Makroskopisches Bild der Titanimplantate. Die Strukturen Ac bis Fc sind zusätzlich mit der LbL-Anordnung beschichtet (hier nicht dargestellt).
- 8 -
Abb. 4: Rasterelektronenmikroskop-Aufnahmen der Implantatoberfläche für die Strukturen A bis F. Die Strukturen Ac bis Fc sind zusätzlich mit der LbL-Anordnung beschichtet (hier nicht dargestellt).
Struktur d [mm] N Ra [µm] Bauweise
A/Ac 0,3 1 0,077
Kompakt, mit
Schleifpapier(Körnung
2400) geglättet
B/Bc 0,5 1 96,7 hatched structure
C/Cc 0,5 1 56,9 hatched structure
D/Dc 0,3 1 24,9 Kompakt nicht
geglättet
E/Ec 0,5 5 73,3 hatched structure
F/Fc 1,0 8 24,8 hatched structure
Tab. 2: zeigt d = Abstand zwischen den Pulverreihen des Titans, N = Anzahl der Schichten bei gleichbleibender Scanrichtung und Ra = Oberflächenrauhigkeit.
- 9 -
2.1.2 Layer-by-Layer – Allgemeiner Ablauf
Im Jahr 1991 entwickelte Decher et al. das Konzept der Layer-by-Layer-
Beschichtung (LbL) mittels löslicher organischer Polyelektrolyte [29]. Dabei
wird eine negativ geladene Oberfläche in eine wässrige Lösung mit positiv
geladenen, kationischen Polyelektrolyten getaucht. Aufgrund mehrfacher
elektrostatischer Wechselwirkungen binden die Kationen an der Oberfläche
des Werkstoffes und bilden so eine positiv geladene Schicht. Nach einem
Waschvorgang, welcher lose adsorbierte Moleküle von der Oberfläche
entfernt, wird der Vorgang unter Verwendung einer anionischen,
polyelektrolythaltigen Lösung wiederholt. Dadurch entsteht eine Anordnung
von wechselseitig geladenen Schichten. Diese Iteration kann als ein sehr
allgemeines, elektrostatisch bedingtes Umsetzungsverfahren gesehen
werden (Abb. 5). Im Wesentlichen ist es also möglich jeden mehrfach ionisch
geladenen Werkstoff zu beschichten. Dieser Vorgang findet überwiegend in
Lösung statt. Die Konzentration der in Lösung befindlichen Elektrolyte ist im
Gegensatz zur Substratkonzentration sehr hoch. Entropie und Gleich-
gewichtsreaktionen ermöglichen somit die Anbindung von Molekülen an der
Oberfläche. Dieses Phänomen ist besser bekannt als hydrophobischer Effekt
und eine der treibenden Kräfte bei der Ausbildung von mizellaren Strukturen
und anderen Aggregaten in Wasser. Die Vorteile dieses neuen Verfahrens
sind offensichtlich: Es ist leicht anwendbar und kostengünstig. Das Verfahren
könnte eventuell ebenso in den Werkstoffwissenschaften und in der Medizin
zur Herstellung maßgeschneiderter Drug-Release-System Werkstoffe
verwendet werden (Abb. 6).
Abb. 5: Beschichtungskreislauf für die LbL-Anordnung
- 10 -
Abb. 6: schematische Darstellung des Freisetzungsmechanismus
2.1.3 Implantatbeschichtung mit Layer-by-Layer-Anor dnung
Die Verwendung von LbL-beschichteten Implantaten als mögliches Drug-
Release-System wurde bereits erwähnt. Die Auswirkung der Implantat-
beschichtung auf die Biokompatibilität wurde in vivo getestet. Als kationischer
Bestandteil wurde das natürlich vorkommende, mehrfach geladene Fe-
Cytochrom C als Molekül verwendet. Es ist nicht toxisch und hochgeladen.
Für die anionische Komponente wurde Newkome-Dendrimer der zweiten
Generation verwendet [77]. Es ist mehrfach geladen und nicht amphiphil und
somit für die Beschichtungszusammensetzung gut geeignet. Aus diesen zwei
Molekülen wurde die Basis, welche aus drei Doppelschichten besteht
gebildet. Diese wurde anschließend um eine weitere kationische Schicht mit
Pamidronat als pharmazeutischer Wirkstoff ergänzt (Abb. 7). Die ersten
Voruntersuchungen zeigten einen Zusammenhang zwischen der Position
einer Schicht und ihrer zeitlichen Freisetzung. Somit wird Pamidronat, als
- 11 -
Bestandteil der äußersten Implantatschicht, in kürzester Zeit freigesetzt und
ein unmittelbarer Einfluss auf die umliegenden Strukturen erzielt.
Abb. 7: Beschichtung der Titanproben
2.1.4 Experimentelle Daten
Die Titanimplantate wurden mittels einer Mixtur bestehend aus Wasser,
Isopropanol und Methanol (alle HPLC Grad), welche mit KOH gesättigt war,
geätzt. Sämtliche für die Beschichtung benötigten Oligoelektrolyte wurden
mit einem Puffer (pH 7,0) verdünnt. Die Konzentration der LbL-Lösung lag
bei 10−2 mol/L. Im Anschluss wurden alle Lösungen mittels eines Millipore
Millex-GP hydrophilen Filter (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs,
Switzerland) filtriert. Die Porengröße des Filters lag bei 0,22 µm. Die
Herstellung einer Schicht der LbL-Zusammensetzung benötigt 30 Minuten,
gefolgt von einem zwei minütigen Waschvorgang [128].
- 12 -
2.2 Implantateinheilung
Die Osseointegration, welche das Ausmaß der direkten Knochenanlagerung
beschreibt, ist von immenser Bedeutung für die Erfolgssicherheit enossaler
Implantate [1, 2, 9, 32, 73, 102]. Die Einheilung von Implantaten ist
morphologisch gesehen den gleichen biologischen Prozessen unterworfen,
wie sie nach Knochenfrakturen oder innerhalb der embryonalen Osteo-
genese zu beobachten sind [43, 117]. Da es sich bei den inserierten
Implantaten um körperfremdes Material handelt sind die stattfindenden
Prozesse der Implantatheilung von besonderem Interesse für einen
langfristigen Erfolg [24].
Nachfolgend soll hier auf Osteokonduktion, de novo-Knochenbildung,
Distanz- bzw. Kontaktosteogenese und Fibrinmatrix eingegangen werden.
Die periimplantäre Einheilung lässt sich in 3 Phasen einteilen: erstens
Osteokonduktion, zweitens de novo-Knochenbildung und drittens knöchernes
Remodelling, welches auf langsam ablaufenden Prozessen basiert und hier
nicht näher beschrieben wird [24].
Die erste und wichtigste Heilungsphase ist die Osteokonduktion [24]. Sie
basiert auf Rekrutierung osteogener Zellen, welche mittels Migration durch
das periimplantäre Blutgerinnsel zur Implantatoberfläche gelangen. Zu den
wichtigsten Aspekten der Osteokonduktion zählen hier vor allem „knock-on“
Effekte auf der Implantatoberfläche, die durch Initiation der Thrombozyten-
aktivierung eine Migration osteogener Zellen bedingt [10, 24].
Die zweite Heilungsphase ist die de novo-Knochenbildung [23]. Der Prozess
der de novo-Knochenbildung ist elementarer Bestandteil der Kontakt-
osteogenese. Sie führt zum Entstehen einer mineralisierten Grenz-
flächenmatrix entsprechend der im natürlichen Knochengewebe
vorkommenden Zementlinie [22, 116]. Die Zementlinien-Matrix ist eine
kollagenfreie, mineralisierte Grenzflächenmatrix, welche dem Knochen-
Implantat-Interface anliegt, bzw. alten von neuen Knochen trennt [24, 25, 27].
Die de novo-Knochenbildung kann in einen vierstufigen Prozess eingeteilt
werden und ist durch in vitro und in vivo Experimente belegt [22, 26].
Differenzierende osteogene Zellen sezernieren zunächst eine kollagenfreie,
organische Matrix, die Keimbildungsstellen für die Mineralisation von
- 13 -
Calciumphosphat bildet [50]. Der Calciumphosphat-Keimbildung schließt sich
das Wachstum der Kristallisationskeime, sowie der Aufbau kollagener Fasern
an und führt letztendlich zur Verkalkung des Kollagen-Kompartimentes [50].
Osteokonduktion und de novo-Knochenbildung sind maßgeblich für eine sich
anschließende Kontaktosteogenese und führen, eine geeignete Implantat-
oberfläche vorausgesetzt, zur Knochenbindung [24].
Im Rahmen periimplantärer Einheilung enossaler Implantate sind immer
sowohl Distanz- als auch Kontaktosteogenese beteiligt [24]. Die Signifikanz
mit der sich beide ereignen ist von großer Bedeutung hinsichtlich der
Beziehung Implantatdesign und Einheilung, sowie für die Entschlüsselung
von Struktur und Zusammensetzung des Knochen-Implantat-Interface.
Die Distanzosteogenese beschreibt einen Vorgang bei dem sich im
periimplantären Bereich neuer Knochen auf der Oberfläche des alten
Knochens bildet [23, 83]. Die sekretorisch aktiven Osteoblasten, welche mit
ihren Zellprozessen in der von ihnen gebildeten extrazellulären Matrix
verankert sind, werden somit zwischen dem von ihnen gebildeten Knochen
und dem Implantat eingemauert [24]. Es kommt somit zu einer appositionell
bedingten Annäherung des Knochens Richtung Implantat und nicht zu einer
Knochenbildung direkt auf der Implantatoberfläche. Die Distanzosteogenese
ist bei kortikaler Knochenheilung zu erwarten, da es beim Einbringen des
Implantates zur vaskulären Disruption kommt [92]. Diese bedingt den
Untergang des periimplantären kortikalen Knochens, welches langsames
Remodelling durch Osteoklasteninvasion aus tieferliegenden Markgebieten
zur Folge hat [12, 20, 64, 69].
Im Gegensatz dazu steht die Kontaktosteogenese (Produkt aus Osteo-
konduktion und de novo-Knochenbildung), welche den Vorgang der direkten
Knochenbildung auf der Implantatoberfläche beschreibt [23]. Da per
Definition nach der Implantation kein Knochen auf der Implantatoberfläche
existiert, muss diese vor der Knochenmatrix-Synthese von Osteoblasten
besiedelt werden. Das bedeutet differenzierende osteogene Zellen gelangen
mittels Migration an einer durch die Blutgerinnung gebildeten temporären,
fibrösen Matrix zur Implantatoberfläche [24]. Es kommt zur de novo-
Knochenbildung, welche bereits beschrieben wurde. Die stattfindende
Knochenbildung erfolgt von der Implantatoberfläche Richtung ortsständigen
- 14 -
Knochen. Ein entscheidender Faktor der Kontaktosteogenese ist somit die
Migration von Osteoblasten zur Implantatoberfläche. Dabei müssen sie die
temporäre, dreidimensionale biologische Matrix passieren welche ein
Produkt der Gerinnungskaskade ist (Fibrin des Blutgerinnsels) [24]. Die
Stabilisierung des Blutgerinnsels auf der Implantatoberfläche erfolgt zum
einen durch Fibrin und zum anderen durch die Struktur der
Implantatoberfläche. Aus Abläufen der dermalen Wundheilung ist bekannt,
dass die Bindegewebszellen-Migration mit einer gleichzeitigen Wund-
kontraktion (circa 5. postoperativer Tag) verbunden ist [45, 86]. Eine
Ablösung der Fibrinmatrix bedingt durch Fibrinoblasten-Migration, bei der
kontraktile Kräfte von circa 3 nN wirken, kann die Osteoblasten-Migration
erheblich behindern und somit die erwünschte Kontaktosteogenese
verhindern [40]. Die Fähigkeit der Zellen die Matrix, welche sie durchwandern
zu verändern, ist mittels in vitro Experimenten belegt [11, 35, 81].
2.3 Knochenmatrixproteine
Die Entstehung eines Knochendefektes setzt einen komplexen, kaskaden-
förmigen Reparaturprozess in Gang, bei dem die verschiedensten Proteine
beteiligt sind und ein aufeinander abgestimmtes, funktionelles Netzwerk
bilden. In der Abb. 8 ist chronologisch die Freisetzung der an dem
Reparaturprozess eines Knochendefektes beteiligten Knochenmatrixproteine
dargestellt. Die in dieser Studie untersuchten Proteine werden nachstehend
genauer beschrieben.
- 15 -
Abb. 8: Zeitlicher Expressionsverlauf der Knochenmatrixproteine (Umzeichnet nach Sodek, J. und Cheifetz, S.: Molecular Regulation of Osteogenesis, aus Bone Engineering; em squared incorporated, Toronto, Canada, (1999)) [106].
2.3.1 Bone Morphogenetic Protein 2/4 (BMP-2/4)
BMPs als Mitglieder der Superfamilie sind in der Lage orthotopisch sowie
heterotopisch eine „de novo“ Knochenbildung zu initiieren. Von den 15
bekannten BMPs gelten BMP 2-7 und 9 als osteoinduktiv. Sie sind in der von
Osteoblasten synthetisierten Knochenmatrix in hoher Konzentration
anzutreffen [3, 30, 60, 97]. Die mesenchymalen Vorläuferzellen werden von
ihnen mittels spezifischer chemotaktischer und mitogener Signale stimuliert
und somit die Knochenneubildung gefördert. Die dabei ablaufenden
Vorgänge entsprechen dem Ablauf der enchondralen Ossifikation [16, 84].
Nach dem Beginn der Angiogenese und der Ausformung des Gewebes
entsteht schließlich ein den biomechanischen Anforderungen entsprechender
funktionstüchtiger Knochen [90, 91, 112].
- 16 -
2.3.2 Kollagen Typ I
Kollagen ist ein Überbegriff für eine Gruppe von Proteinen die in ihrer
Struktur eine tripelhelikale Struktur aus Polypeptidketten zeigen. Das
Kollagen I, II, V und XI gehört zur Gruppe der fibrillären Kollagene. Im
menschlichen Organismus ist mit mehr als 90 % Kollagen I, das am
häufigsten vorkommende [52, 70, 74]. Das Kollagen I ist ein Strukturprotein
der organischen Knochenmatrix [72, 110]. Aufgrund seiner Tripelhelixstruktur
ist es maßgeblich an der hohen Belastungsfähigkeit des Knochens beteiligt
[82]. Die Bildung und Anordnung der extrazellulären Kollagen-I-Matrix ist
Ausgangspunkt für die Neubildung von Knochengewebe. Anschließend findet
die Mineralisation statt, bei der Apatitkristalle sich der Längsachse orga-
nischer Fasern anordnen [120].
2.3.3 Osteocalcin
Osteocalcin ist ein aus 49 Aminosäuren bestehendes, nicht-kollagenes
Protein. Dieses Protein wird hauptsächlich von Osteoblasten, aber auch im
geringen Maße von Odontoblasten synthetisiert. Die Osteocalcinbildung
findet in der Mineralisationsphase der Knochenmatrix statt und fungiert dabei
als Calciumbinder. Da Osteocalcin von Osteoblasten synthetisiert wird, kann
es als biochemischer Marker für den Prozess der Knochenumbauvorgänge
benutzt werden. Es stellt somit einen spezifischen Indikator für die
Mineralisation im Knochenstoffwechsel dar [5, 19, 30, 103]. Der Beginn der
Expression liegt bei 3 Wochen und das Expressionsmaximum bei 5 Wochen
[19, 28, 30].
- 17 -
3 Material und Methode
3.1 Wahl des Versuchstieres Im Rahmen dieser tierexperimentellen Studie war das adulte Hausschwein
das Tier der Wahl. Es ist besonders für die Evaluation von Knochenheilung
und Knochenumbau prädestiniert [62]. Die Knochenneubildungsrate des
Schweines ist der des Menschen ähnlich (Schwein 1,2-1,5 µm/Tag; Mensch
1,0-1,5 µm/Tag) [46, 49, 62, 89, 95]. Gewebsdurchblutung, Frakturheilung,
zirkulatorische Prozesse im Organismus sowie die Stoffwechselrate und
Heilungszeit sind mit den Vorgängen beim Menschen vergleichbar [46, 49,
62]. Die morphologischen und anatomischen Charakteristika des Haus-
schweins erlauben es die gewonnenen Ergebnisse auf den Menschen zu
übertragen.
3.2 Ablauf und Dauer der Eingriffe
Das vorliegende Tierversuchsmodell ist etabliert und wurde bereits in
früheren Studien angewendet [66, 99]. Eine Genehmigung durch den
Ausschuss der Regierung Mittelfranken, Deutschland (Genehmigungs-
nummer 54-2531.31-7/06) liegt vor. In jedes der 20 adulten Hausschweine
wurden jeweils 6 Titanimplantate (A-F) und 6 Titanimplantate, welche eine
zusätzliche LbL-Beschichtung aufweisen (Ac-Fc), im Bereich des Os frontale
implantiert. Alle Eingriffe erfolgten in Intubationsnarkose. Um einer möglichen
bakteriellen Infektion vorzubeugen wurde den Tieren, 1 h präoperativ sowie
für 2 Tage postoperativ eine Antibiose (Streptomycin, 0,5 g/d Grünenthal,
Stolberg, Germany) verabreicht. Zur Narkotisierung der Tiere wurde den
Tieren Ketamin HCL 5 mg/kgKG (Ketavet®, Ratiopharm, Ulm, Germany)
intravenös verabreicht und im Bereich des Os frontale zusätzlich zur
Schmerzausschaltung eine Lokalanästhesie mit 6 ml Articain (Ultracain DS
forte, Hoechst GmbH, Frankfurt am Main, Germany) appliziert. Um Zugang
zum Neurocranium zu erhalten wurde im Bereich der Kalotte die Haut sagittal
inzidiert und das Periost mobilisiert. Unter Verwendung eines Trepanbohrers
- 18 -
(4,0 mm Durchmesser, 15 mm Länge, Straumann GmbH, Freiburg,
Germany) wurden 15 identische Knochendefekte (4,0 mm Durchmesser,
8 mm Tiefe) gesetzt, wobei für diese Studie nur 12 der 15 mit Implantaten
versorgten Defekte relevant waren. Nach der Platzierung der Implantate in
den geschaffenen Defekten, wurden das Periost und die Haut zweischichtig
vernäht (Vicryl® 3.0; Vicryl® 1.0; Ethicon GmbH & Co. KG, Norderstedt,
Germany). Die Anordnung der in dieser vorliegenden Studie zu
untersuchenden Werkstoffe in der Schweinekalotte ist in Abb. 9 dargestellt
und in Tabelle 2 beschrieben.
Abb. 9: Intraoperative Darstellung der knöchernen Schweinekalotte nach Mobilisation des Periost und Einbringen der Titankonstrukte A bis F und Ac bis Fc (c = beschichtet mit Pamidronat, hier nicht dargestellt).
- 19 -
3.3 Anzahl und Opferungszeitpunkte der vorgesehenen
Versuchstiere
Opferungszeitpunkte Anzahl der
Versuchstiere
Anzahl der
Proben A-F
Anzahl der
Proben Ac-Fc
3-Tage 5 30 30
7-Tage 5 30 30
14-Tage 5 30 30
30-Tage 5 30 30
Gesamtanzahl 20 120 120
Tab. 3: Übersicht über Opferungszeitpunkte, Anzahl der Tiere und Einzelproben.
Von den insgesamt 20 Versuchstieren wurden jeweils 5 Schweine nach 3, 7,
14 und 30 Tagen geopfert. Jedem Tier wurden 15 unterschiedliche
Titankonstrukte in die Schädelkalotte implantiert. In dieser Studie wurden 12
der Titankonstrukte ausgewertet (6 Titankonstrukte A-F + 6 Titankonstrukte
mit zusätzlicher LBL-Beschichtung entspricht Ac-Fc). Die restlichen 3
implantierten Probenkörper hatten für diese Studie keine Relevanz und
wurden in anderen Untersuchungen verwendet.
- 20 -
3.4 Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufe s
Abb. 10: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs.
3.5 Sektion
Die Opferung der Tiere erfolgte durch i.m. – Injektion von Azaperone
(1 mg/kg) und Midazolam (1 mg/kg) in die Nackenregion und anschließender
i.v. – Injektion von 20%iger Pentobarbitallösung in die Ohrvene bis zum
Herzstillstand.
3.6 Entnahme und Aufarbeitung der Knochenresektate
3.6.1 Präparatröntgen, Fixierung, Dehydration sowie Einbettung
Nach Opferung der Tiere wurden die Schädelkalotten entnommen und
umgehend bei -80 ⁰C tiefgefroren. Vor der Anfertigung der Proben wurden
Präparatröntgenaufnahmen (40-45 kV, 0,25 mA und 5 Minuten) erstellt, um
die spätere Defektauffindung zu erleichtern. Die Röntgenaufnahmen der
Resektate erfolgten mit einem Tisch-Röntgengerät, dem Faxitron® (Faxitron
Cabinet X-Ray Systems, Illinois, USA). Das Separieren der einzelnen
- 21 -
Implantate erfolgte durch das Standard-Trennsystem der Firma Exakt (Exakt
Apparatebau GmbH, Norderstedt, Germany) [21]. Um die organische Matrix
der Probenblöcke zu insolubilisieren und die biologische Aktivität der dort
befindlichen Proteine zu erhalten, wurden die Proben über einen Zeitraum
von 4 Tagen in 1,4%igen Paraformaldehyd (PFA) bei 4 ⁰C gelagert. Das
weitere Procedere erfolgte nach der von Heraeus-Kulzer beschriebenen
Einbettungsmethode [48].
Bei Raumtemperatur erfolgte die Dehydration der Proben in aufsteigender
Alkoholreihe im Entwässerungsautomaten (Shandon Citadel 1000, Shandon
GmbH, Frankfurt, Germany). Xylol kam als Intermedium zum Einsatz. Die
Immersion erfolgte in 3 Stufen, wobei die Präinfiltration 1 im Entwässerungs-
automaten und die Präinfiltrationen 2 und 3 sowie die Infiltration selbst, bei
4 ⁰C und unter kontinuierlichem Rühren stattfand. Für die Einbettung wurde
ein Kaltpolymerisationssystem auf Methylmethacrylat-Basis verwendet,
welches unter Sauerstoffausschluss nach Vermengung der Stammlösung A
und B bei -4 ⁰C innerhalb von 2 Tagen auspolymerisiert. Dieser spezielle
Kunststoff Technovit® 9100 Neu (Heraeus Kulzer, Abteilung Kulzer,
Werheim, Germany) ermöglicht einen quantitativen Nachweis von
Knochenmatrixproteinen und ist gleichzeitig zur Durchführung der Trenn-
dünnschlifftechnik nach Donath geeignet [31]. Dieses Verfahren kombiniert
die morphologische Überlegenheit von in Kunststoff eingebettetem
Knochengewebe mit den Vorteilen der spezifischen histochemischen und
immunochemischen Enzymmarkern. Somit werden der Erhalt von
morphologischen Details, das Überleben der Antigen-Determinanten und die
Speicherung der Enzymaktivität ermöglicht [100, 127]. Anschließend wurde
ein Längsschnitt durch das in Technovit® eingebettete Knochenresektat
gelegt, welcher nach Möglichkeit zentral durch den Titanwerkstoff gehen
sollte. Die Schnitte erfolgten mit einer Präzisionssäge (Exakt Apparatebau
GmbH, Norderstedt, Germany) [21]. Die eine Hälfte der Proben wurde für die
lichtmikroskopische, die andere für die immunhistologische Untersuchung
verwendet.
- 22 -
3.6.2 Trenndünnschlifftechnik
Die weitere Verarbeitung der Proben erfolgte nach der Trenndünn-
schlifftechnik nach Donath [56]. Hierbei wurde nach dem Einbetten, an die
angeschliffenen Außenflächen der Präparateblöcke, planparallele Plexiglas-
objektträger (Exakt Apparatebau GmbH, Norderstedt, Germany) mit
Zyanoacrylat (Technovit® 7210 VI-C, Abteilung Kulzer, Werheim, Germany)
angeklebt. Anschließend wurden mit dem Exakt-Trennsystem (Exakt
Apparatebau GmbH, Norderstedt, Germany) ca. 180 µm dünne Scheiben
abgesägt. Mit Hilfe der Schleifmaschine (Exakt Apparatebau GmbH,
Norderstedt, Germany) erfolgte unter Verwendung verschiedener grob
gekörnter Nassschleifpapiere (Körnungen 320-2000) die Reduzierung der
Präparate auf die gewünschte Schichtdicke von 90-130 µm.
3.6.3 Mikroradiographie
Zur Erstellung von Mikroradiographien, nach dem Verfahren von Freitag
(1980), wurden die unentkalkten kunststoffeingebetteten Schliffe mit Hilfe der
Schleifmaschine (Exakt Apparatebau GmbH, Norderstedt, Germany) auf
150-180 µm reduziert und im Faxitron® Tischröntgengerät (Faxitron Cabinet
X-Ray Systems, Illinois, USA) mit 11 kV Röhrenspannung und 0,25 mA für 6
Minuten bestrahlt. Der Objekt-Film-Abstand beträgt dabei nahezu Null, um
eine möglichst hohe Auflösung zu erhalten [54]. Die Mikroradiographien
wurden anschließend mit einem Epson-Scanner bei 1200 dpi und 8 bit-
Graustufen eingescannt und unkomprimiert als TIFF-Datei gespeichert.
3.6.4 Histomorphometrie
Die Dünnschliffpräparate wurden anschließend mit der Schleifmaschine
(Exakt Apparatebau GmbH, Norderstedt, Germany), wie oben beschrieben
auf 30 µm reduziert und poliert. Im weiteren Verfahren wurden die Schliffe für
5 Minuten in 10%igen H202 kontinuierlich bewegt und unter fließendem
- 23 -
kaltem Leitungswasser abgespült. Nach Trocknung erfolgte die Färbung in
Toluidinblau O-Lösung für die Dauer von ca. 15 Minuten. Die überschüssige
Farbe wurde unter Leitungswasser abgespült. Bei der Toluidinblaufärbung
stellt sich das mineralisierte Hartgewebe ungefärbt bis blassblau dar,
hingegen färben sich Zellen, Zellkerne, Kollagenfasern und Weichgewebe in
unterschiedlichen Blautönen. Knorpelmatrix und frühe Wundheilungsareale
werden metachromatisch rotviolett angefärbt und verkalkte Knorpelmatrix
stellt sich dunkelblau dar [6].
Nach erfolgter Trocknung der Schliffe wurden diese lichtmikroskopisch mit
spezieller Software, Bioquant Osteo V7.10.10 (Bioquant Image Analysis
Corporation, Nashville, TN, USA) im knochenhistologischen Labor der Mund-
Kiefer-, Gesichtschirurgischen Klinik der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg ausgewertet. Pro Probe wurden vier standardisierte,
reproduzierbare Auswertungsbereiche am Übergang des Knochens zum
Implantat festgelegt. Innerhalb dieser vier ROI (Region of Interest) wurde der
jeweilige Knochen-Implantat-Kontakt (KIK) gemessen und prozentual
angegeben.
- 24 -
Abb. 11: Exemplarische Darstellung der 4 ROI (gelb markiert) für die Errechnung des KIK an einer mit Toluidinblau gefärbten Knochenprobe.
Abb. 12: Screenshot des Auswertungsverfahrens mittels Bioquant Osteo System®. Der rote Bereich entspricht der Position des Implantates, die grüne Linie dem Bereich, in dem der Knochen am Implantat anliegt (bei dieser Probe wurde ein KIK von 70,87 % errechnet).
- 25 -
3.7 Immunhistologie
3.7.1 Methodik und Antikörper
Die zweite Hälfte der in Technovit® 9100 Neu (Heraeus Kulzer, Abteilung
Kulzer, Werheim, Germany) eingebetteten Präparateblöcke diente der
immunohistochemischen Untersuchung. Ein wesentlicher Aspekt für die
Anfertigung der Schnittpräparate war die Entfernung der Titanwerkstoffe aus
dem Knochen, um ein Schneiden und Trimmen zu ermöglichen. Die
Titanwerkstoffe wurden mittels rotierender Hartmetallfräse und Wasser-
kühlung sowie unter Verwendung eines Bein’schen Hebels aus dem
Knochenblock entfernt. Besonderes Augenmerk wurde darauf gelegt das
Knochen-Implantat-Interface maximal zu schonen. Der durch die Entfernung
entstandene Hohlraum wurde erneut mit Technovit® 9100 Neu (Heraeus
Kulzer, Abteilung Kulzer, Werheim, Germany) aufgefüllt, um ein
problemloses Schneiden zu ermöglichen. Mit einem Rotationstrimmgerät
wurden die Proben getrimmt und anschließend auf Halteblöcke mit
Technovit® 3040 gelb (Heraeus Kulzer, Abteilung Kulzer, Werheim,
Germany) aufgeklebt. Das Schneiden der Proben erfolgte mit dem Mikrotom
Leica RM 2165 (Leica Microsystems GmbH, Nussloch, Germany). Die Dicke
der Probenschnitte beträgt 5 µm. Die Dünnschnitte wurden unter
Verwendung von Alkohol mit einem Pinsel auf die Objektträger (Super Frost,
Firma Menzel Gläser, Braunschweig, Germany) gezogen. Die dabei teilweise
entstandenen Faltungen des Schnittes wurden glatt gezogen und mit Ethanol
96 % befeuchtet. Anschließend wurde der Schnittträger mit einer 0,025 mm
dicken Polyethylenfolie abgedeckt, der überschüssige Alkohol entfernt und in
einer Presse unter leichten Druck für ca. eine Woche in einem Brutschrank
bei 57 ⁰C getrocknet. Nach Entfernung der Polyethylenfolie von den noch
warmen Trägern wurden die getrockneten Schnitte bis zur Färbung lichtge-
schützt bei Raumtemperatur gelagert.
Bei der Immunhistologie handelt es sich um ein Nachweisverfahren, bei dem
unter Verwendung von Antikörpern Farbstoffe an bestimmten Oberflächen-
strukturen von nachzuweisenden Proteinen, wie z. B. Kollagen oder den
- 26 -
Knochenmatrixproteinen BMP-2, und Osteocalcin, gebunden werden. Man
unterscheidet eine direkte, bei der der Farbstoff direkt an den Antikörper
gebunden ist, von einer indirekten Methode, bei der ein Sekundärantikörper
zum Einsatz kommt, bis hin zu Polymer-Methoden, bei denen der Primär-
antikörper bzw. Sekundärantikörper mit Polymer-Molekülen konjugiert ist.
Alle in dieser Studie verwendeten Färbemethoden gehören zur
StreptAB/HRP-Methode (Strept-Avidin-Biotin/Horseaddish-Peroxidase-
Methode). Hierbei handelt es sich um die indirekte Methode. Bei diesem
Verfahren bedient man sich der hohen Affinität von Streptavidin zu Biotin, um
das Chromogen an den Sekundärantikörper zu koppeln (Abb.13).
Abb. 13: Schematische Darstellung der Immunhistochemie nach StreptAB/HRP-Methode [42].
Um im eigentlichen Färbevorgang ein Angreifen des Antikörpers an Antigene
im Probenmaterial zu ermöglichen, mussten die Proben durch eine Reihe
von Arbeitsschritten modifiziert werden.
- 27 -
So wurden die Träger der Reihe nach dreimal in 2-Methoxyethylacetat (MEA)
für 20 Minuten entakryliert und anschließend in einer absteigenden
Alkoholreihe rehydriert (Alkoholreihe: 2mal 100 % Ethanol, 2mal 96 %
Ethanol, 1mal 90 % Ethanol, 2mal 70 % Ethanol; jeweils für 3 Minuten).
Abschließend erfolgte ein 5 minütiges Bad in destilliertem Wasser sowie die
Entkalkung der Proben in 10%iger EDTA-Lösung für 20 Minuten. Um die
Proben von sämtlichen Calcium-Rückständen zu befreien wurden die Träger
für 10 Minuten unter fließendem Wasser gespült. Es folgten zwei Bäder in
Aqua dest. für jeweils 2 Minuten und anschließend drei Bäder in TBS-Puffer
für ebenfalls 2 Minuten. Die Peroxidase wurde daraufhin mit einer 3%igen
H2O2/TBS-Puffer-Lösung für 15 Minuten blockiert. Im Unterschied zu den
beiden anderen Färbungen mussten an dieser Stelle für die BMP-2/4-
Färbung die Proben mit Citratpuffer pH 6,0 für 15 Minuten im Wasserbad bei
99 ⁰C angedaut werden, um ein besseres Andocken der Antikörper zu
ermöglichen. Nach dem Färbevorgang erfolgte eine Gegenfärbung mit
Haemalaun (Firma Dako, Glostrup, Sweden). Eine Negativkontrolle (hier
wurde der erste Antikörper weggelassen) wurde für jede Probe mitgeführt.
3.7.2 Auswahl der Untersuchungsbereiche
Nach dem Färbungsverfahren wurden die Proben mittels Lichtmikroskop der
Firma Zeiss (Axioskop, Zeiss, Jena, Germany) und passender Kamera
digitalisiert und unkomprimiert als „TIFF-Format“ (Tagged Image File Format)
gespeichert. Als Software diente das Programm KS 300 (Zeiss, Jena,
Germany). Für die Auswertung der BMP-2/4-Färbung wurden die Fotos bei
einer 40-fachen Vergrößerung aufgenommen, da hier eine Zellzählung
erfolgte. Bei den beiden anderen Färbungen (Osteocalcin, Kollagen I)
wurden Fotos bis maximal 20-facher Vergrößerung erstellt, da hier eine
Flächenauswertung erfolgte. Um die ausgewerteten Bereiche exakt zuordnen
zu können wurde von jeder Probe zusätzlich ein Übersichtsbild bei 1,25-
facher und 2,5-facher Vergrößerung erstellt. Die Auswertungsbereiche
- 28 -
wurden am Übergang Knochen zu Probenkörper an jeweils vier standardi-
sierten, reproduzierbaren Stellen pro Probe ausgewählt (Abb. 14).
Abb. 14: Schematische Darstellung der Untersuchungsbereiche. Der schwarz eingefärbte Bereich entspricht der ursprünglichen Position des Probenkörpers, die nummerierten Bereiche (1 - 4) den standardisierten Auswertungsbereichen.
Die Flächenauswertung der Osteocalcin- und Kollagen-I-Färbung erfolgte mit
Hilfe der speziellen Software Bioquant OSTEO (Bioquant Image Analysis
Corporation, Nashville, Tennessee, USA). Bei der Verwendung dieser
Software wurde die gefärbte Fläche ins Verhältnis zur ungefärbten Fläche
gesetzt und so ein prozentualer Wert für die jeweilige Expression von
Kollagen I bzw. Osteocalcin errechnet. Die so ermittelten Werte sind als
Flächenprozent des jeweiligen Defektausschnittes zu verstehen. Die
gewählten Auswahlbereiche sind in ihrer Größe und Position standardisiert
und reproduzierbar. Die Auswertung der BMP-2/4-Färbung erfolgte mittels
Auszählungsverfahren der Zellen. Hierbei wurden die positiven Zellen ins
Verhältnis zur Gesamtzellzahl gesetzt und als Maß für die Expression von
BMP-2/4 verwendet.
- 29 -
Abb. 15: Lichtmikroskopaufnahmen einer Osteocalcin-Probe bei unterschiedlichen Vergrößerungen: A = 2,5 fache Vergrößerung, B = 5-fache Vergrößerung, C = 10-fache Vergrößerung und D = 20-fache Vergrößerung. Die rot eingefärbten Bereiche entsprechen den zu untersuchenden Knochenmatrix-proteinen (hier: Osteocalcin).
- 30 -
Abb. 16: Screenshot des Auswertungsverfahrens mittels Bioquant OSTEO System®. In diesem Fall ist die Flächenfärbung einer Osteocalcin-Färbung in 20-facher Vergrößerung exemplarisch dargestellt. Die Osteocalcin-Expression beträgt hier, schwarz markiert, 13,12 %. Die Auswertung für das Knochenmatrixprotein Kollagen I erfolgte analog.
- 31 -
Abb. 17: Lichtmikroskopaufnahmen einer BMP-2/4-Probe bei unterschiedlichen Vergrößerungen: A = 5-fache Vergrößerung, B = 10-fache Vergrößerung, C = 20-fache Vergrößerung und D = 40-fache Vergrößerung.
Abb. 18: Exemplarische Darstellung von positiven und negativen Zellen einer BMP-2/4-Probe (Vergrößerung aus Abbildung 17, Bild D).
- 32 -
3.8 Statistik
Die Auswertung der Proben erfolgte jeweils durch drei Untersucher
unabhängig voneinander. Die ermittelten Werte pro Probe wurden an-
schließend aggregiert und mit dem Median, Minimum und Maximum
angegeben. Die grafische Darstellung der Werte erfolgte unter Verwendung
der Software AXUM (Math-Software, Cambridge/MA, USA). Die Ergebnisse
wurden mittels 2-seitigen t-Tests verifiziert. Bei einem p-Wert ≤ 0,05 wurde
von einem signifikanten Unterschied der verglichenen Daten ausgegangen.
4 Ergebnisse
4.1 Knochen-Implantat-Kontakt
Der Knochen-Implantat-Kontakt (KIK) wurde zu den jeweiligen Opferungs-
zeitpunkten sowie innerhalb der verschiedenen Strukturen und Oberflächen-
modifikationen verglichen (Abb. 2).
Bei den Opferungszeitpunkten Tag 3 bis Tag 14 zeigten sich die höchsten
KIK-Ergebnisse bei den kompakten Proben, welche mit Silicium-Carbid-
Schleifpapier poliert wurden (A und Ac) (Abb. 19-21). In diesem Zeitraum
zeigten Proben der Layer-by-Layer-Anordnung mit ihrer äußersten
Pamidronat-Schicht höhere Werte für KIK, als die unbeschichteten Proben.
Die Unterschiede zeigten jedoch keine Signifikanz. Nach 3 Tagen lag der KIK
für A bei 7,5 % ± 15,1 und für Ac bei 9,7 % ± 18,3.
Des Weiteren zeigten alle Werkstoffe, mit Ausnahme von Dc (1 % ± 2,5),
einen Knochen-Implantat-Kontakt kleiner 1 % (Abb. 19). Für den Opferungs-
zeitpunkt 7 Tage wurden die höchsten KIK-Werte für die Struktur A (3,7 % ±
9,3) und Ac (11,4 % ± 25,1) errechnet. Es zeigten sich jedoch große
Abweichungen bei beiden Oberflächen. Die anderen Strukturen B-F und Bc-
Fc zeigten nur geringfügigen Knochen-Implantat-Kontakt (Abb. 20). Bei ihnen
war eine fibröse Einheilung festzustellen (Abb. 18).
- 33 -
Am 14-ten postoperativen Tag zeigten sich, bezüglich des Knochen-
Implantat-Kontaktes, die höchsten Werte für die kompakten Proben (Abb.
21). Die kompakte Probe A zeigte einen KIK von 18 % ± 25,6, Ac einen KIK
von 22,8 % ± 22,7 und D einen KIK von 6,2 % ± 15,7. Die restlichen Gruppen
zeigten einen KIK um 1 % oder niedriger (Abb. 21).
Nach 30 Tagen lag der höchste ermittelte KIK-Wert für A bei 14,9 % ± 26,4,
gefolgt von Dc mit 4,2 % ± 13,6 und Ac mit 2,7 % ± 7,5 (Abb. 22).
Abb. 19: Knochen-Implantat-Kontakt zum Opferungszeitpunkt 3 Tage.
Abb. 20: Knochen-Implantat-Kontakt zum Opferungszeitpunkt 7 Tage.
- 34 -
Abb. 21: Knochen-Implantat-Kontakt zum Opferungszeitpunkt 14 Tage.
Abb. 22: Knochen-Implantat-Kontaktt zum Opferungszeitpunkt 30 Tage.
Abb. 23: Fibröse Einheilung (Cc) nach 30 Tagen.
- 35 -
Abb. 24: Einsprossung von Knochen in die poröse Struktur F/Fc nach 30 Tagen.
4.2 Periimplantäre Knochendichte
Die kompakten Proben (A/Ac) zeigten bezüglich der periimplantären
Knochendichte in den Ergebnissen (in %) keinerlei signifikanten Unterschied
unabhängig davon, ob sie beschichtet waren (LbL), oder nicht. Es konnte
festgestellt werden, dass die periimplantäre Knochendichte ab dem 3-ten
Tag bis zum 14-ten Tag rückläufig ist, was sich durch die postoperativen
Knochenumbauvorgänge erklären lässt. Nach 30 Tagen zeigt sich ein
signifikanter Anstieg der periimplantären Knochendichte (p = 0,03) verglichen
mit dem Zeitpunkt nach 14 Tagen. In der LbL-Gruppe ist ein Absinken bis
zum 7. Tag zu beobachten. Nach dem 7. Tag kommt es bei der LbL-Gruppe
zu einem Anstieg der Knochendichte mit einer signifikanten Erhöhung nach
30 Tagen (p = 0,00) (Abb. 25).
- 36 -
Abb. 25: Periimplantäre Knochendichte in % für A/Ac zu den Opferungszeitpunkten 3-30 Tage.
In der Gruppe B/Bc waren die Ergebnisse hinsichtlich der Knochendichte für
die Layer-by-Layer behandelten Proben nach 3 Tagen (p = 0,01) und 7
Tagen (p = 0,02) signifikant höher, als für die unbeschichteten Proben. In
dieser Gruppe waren die Werte nach 30 Tagen allgemein niedriger als in A.
Wie schon bereits bei den Ergebnissen für KIK erwähnt, zeigt diese
Oberfläche mit ihren relativ scharfen Kanten einen fibrösen Einheilungs-
prozess. Diese Tatsache führt zwangsläufig zu einer verringerten peri-
implantären Knochendichte (Abb. 26).
- 37 -
Abb. 26: Periimplantäre Knochendichte in % für B/Bc zu den Opferungszeitpunkten 3-30 Tage. Sternchen, p ≤ 0,05 mittels t-Test.
Ähnliches ist bei der Werkstoffgruppe C/Cc zu beobachten (Abb. 27). In
dieser Gruppe zeigen die LbL-Proben nach 14 Tagen signifikant niedrigere
Werte (p = 0,00).
Abb. 27: Periimplantäre Knochendichte in % für C/Cc zu den Opferungszeitpunkten 3-30 Tage. Sternchen, p ≤ 0,05 mittels t-Test.
- 38 -
Die Gruppe D/Dc zeigt im Rahmen des Knochenumbauprozesses bis zum 7.
Tag sinkende Werte hinsichtlich der periimplantären Knochendichte. Ab dem
30. Tag ist im Vergleich zum 7. Tag ein signifikanter Anstieg für die
unbeschichteten Proben D (p = 0,00), als auch für die beschichteten Proben
Dc (p = 0,00) gegeben (Abb. 28). In dieser Gruppe (D/Dc) sind die Werte der
LbL-Proben (Dc) zu jedem Zeitpunkt geringfügig höher, als bei den
unbeschichteten Proben (D). Der Unterschied ist nur schwach und nicht
signifikant.
Abb. 28: Periimplantäre Knochendichte in % für D/Dc zu den Opferungszeitpunkten 3-30 Tage.
Ähnliche Ergebnisse zeigen sich bei dem Werkstoff E bzw. Ec. Ein
Unterschied zeigt sich bei den beschichteten Proben (Ec), die sich in der
Abnahme der Knochendichte bis zum 14-ten Tag darstellt. Die Werte
unterscheiden sich kaum zwischen beschichteten und unbeschichteten
Proben (Abb. 29).
- 39 -
Abb.29: Periimplantäre Knochendichte in % für E/Ec zu den Opferungszeitpunkten 3-30 Tage.
Innerhalb der Gruppe F/Fc ist die Knochendichte für die LbL-Proben Fc zum
Zeitpunkt 30 Tage signifikant höher (p = 0,01). Zu allen anderen Opferungs-
zeitpunkten zeigen die LbL-Proben (Fc) ähnliche bis leicht höhere Werte im
Vergleich mit den unbeschichteten Proben (F) (Abb. 30).
Abb. 30: Periimplantäre Knochendichte in % für F/Fc zu den Opferungszeitpunkten 3-30 Tage.
Sternchen, p ≤ 0,05 mittels t-Test.
- 40 -
4.3 Immunohistochemische Ergebnisse
Da der Knochen ständigen physiologischen Umbauvorgängen unterliegt und
dabei die zu untersuchenden Knochenmatrixproteine einen entscheidenden
Einfluss haben, wurde zunächst die Grundexpression der Knochenmatrix-
proteine BMP-2/4, Osteocalcin und Kollagen im ortsständigen Knochen
ermittelt. Die Spezifität der immunhistochemischen Untersuchung wurde
durch die für jedes Präparat mitgeführte Negativkontrolle belegt.
4.3.1 Bone Morphogenetic Protein (BMP-2/4)
Der Vergleich der Layer-by-Layer-Proben Ac-Fc mit ihren jeweils
unbeschichteten Pendant A-F zeigt eine signifikant höhere BMP-2/4-
Expression für die mit Pamidronat beschichteten LbL-Proben. Keine
Signifikanz zeigt sich jedoch beim Vergleich der kompakten Proben A mit Ac
zum Opferungszeitpunkt 3 und 14 Tage. Die kompakten Proben D/Dc zeigen
ebenfalls keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der BMP-2/4-
Expression zu den Beobachtungszeitpunkten 3 und 14 Tagen. Die
Signifikanzen, Median, Mittelwert und Standardabweichung sind in der
Tabelle 4 und 5 dargestellt. Die grafische Darstellung ist der Abb. 31 und 32
zu entnehmen.
- 41 -
Tab. 4: Darstellung von Median, Mittelwert und Standardabweichung zu den Opferungszeitpunkten 3, 7, 14 und 30 Tagen für die BMP-2/4-Expression in %.
Tab. 5: Signifikanz der BMP-2/4-Expression, für die Werkstoffe A/Ac-F/Fc für die Opferungszeitpunkte 3, 7, 14 und 30 Tage. Von einer Signifikanz wird ausgegangen wenn p ≤ 0,05 (mittels t-Test).
- 42 -
Abb. 31: Grafische Darstellung der BMP-2/4-Expression nach 3, 7, 14 und 30 Tagen für A-C und Ac-Cc. Schwarze gestrichelte Linie: Grundexpression im ortsständigen Knochen.
- 43 -
Abb. 32: Grafische Darstellung der BMP-2/4-Expression nach 3, 7, 14 und 30 Tagen für D-F und Dc-Fc. Schwarz gestrichelte Linie: Grundexpression im ortsständigen Knochen.
4.3.2 Osteocalcin
Nach 3 Tagen zeigt sich ein signifikanter Unterschied in der Osteocalcin-
Expression bei der kompakten Probe A zu Ac (p = 0,0402). Die Expression
ist bei Ac (LbL-Anordnung) signifikant höher als bei A. Diese Signifikanz zeigt
sich auch noch am 7-ten Tag (p = 0,0281), zu den späteren Untersuchungs-
zeitpunkten 14-ter und 30-ter Tag aber nicht. Bei C/Cc zeigt das beschichtete
Konstrukt (Cc) eine signifikant höhere Osteocalcin-Expression, als das
unbeschichtete Pendant C (p = 0,0277). Bei dem porösen Probenpaar E/Ec
- 44 -
zeigt Ec am 3. Tag signifikant höhere Werte als E (p = 0,0159). Dieses
Verhältnis kehrt sich am 14. Tag um und E zeigt eine höhere Osteocalcin-
Expression (p = 0,0476). Die hochporöse Struktur F zeigt zum Zeitpunkt 7
und 30 Tage eine signifikant höhere Expression, als das beschichtete
Konstrukt Fc (p = 0,0493).
Weitere Signifikanzen konnten am 30. Tag bei den Paaren D/Dc (p =
0,0105), E/Ec (p = 0,0176) und F/Fc (p = 0,0325) festgestellt werden, die sich
durch eine höhere Expression der unbeschichteten Werkstoffe darstellt. Die
Signifikanzen, Median, Mittelwert und Standardabweichung sind in der
Tabelle 6 und 7 dargestellt. Die grafische Darstellung ist der Abb. 33 und 34
zu entnehmen.
Tab. 6: Darstellung von Median, Mittelwert und Standardabweichung zu den Opferungszeitpunkten 3, 7, 14 und 30 Tagen für die Osteocalcin-Expression in %.
- 45 -
Tab. 7: Signifikanz der Osteocalcin-Expression, für die Werkstoffe A/Ac-F/Fc für die unterschiedlichen Opferungszeitpunkte 3, 7, 14 und 30 Tage. Von einer Signifikanz wird ausgegangen wenn p ≤ 0,05 ist (mittels t-Test berechnet).
Abb. 33: Grafische Darstellung der Osteocalcin-Expression nach 3, 7, 14 und 30 Tagen für A-C und Ac-Cc. Schwarz gestrichelte Linie: Grundexpression im ortsständigen Knochen.
- 46 -
Abb. 34: Grafische Darstellung der Osteocalcin-Expression nach 3, 7, 14 und 30 Tage für D-F und Dc-Fc. Schwarz gestrichelte Linie: Grundexpression im ortsständigen Knochen.
- 47 -
4.3.3 Kollagen I
Es kann zu allen Opferungszeitpunkten (3, 7, 14 und 30 Tagen) ein
signifikanter Unterschied hinsichtlich der Kollagen-I-Expression beobachtet
werden. Die unbeschichteten Konstrukte (A-F) zeigten kontinuierlich eine
höhere Kollagen-I-Expression (18-25 %), während die Expression der LbL-
Proben (Ac-Fc) mit einem Minimum von 1 % und einem Maximum von 10 %
signifikant niedriger ausfällt.
Die Signifikanzen, Median, Mittelwert und Standardabweichung sind in der
Tabelle 7 und 8 dargestellt. Die grafische Darstellung ist der Abb. 35 und 36
zu entnehmen.
Tab. 8: Darstellung von Median, Mittelwert und Standardabweichung zu den opferungszeitpunkten 3, 7, 14 und 30 Tagen für die Kollagen-I-Expression in %.
- 48 -
Tab. 9: Die p-Werte der Kollagen-I-Expression, für die Werkstoffe A/Ac-F/Fc für die unterschiedlichen Opferungszeitpunkte 3, 7, 14 und 30 Tage. Von einer Signifikanz wird ausgegangen wenn p ≤ 0,05 ist (mittels t-Test berechnet).
Abb. 35: Grafische Darstellung der Kollagen-I-Expression nach 3, 7, 14 und 30 Tagen für A-C und Ac-Cc. Schwarze gestrichelte Linie: Grundexpression im ortsständigen Knochen.
- 49 -
Abb. 36: Grafische Darstellung der Kollagen-I-Expression nach 3, 7, 14 und 30 Tagen für D-F und Dc-Fc. Schwarze gestrichelte Linie: Grundexpression im ortsständigen Knochen.
- 50 -
5 Diskussion
Die Geschichte der zahnärztlichen Implantologie reicht weit in die
Vergangenheit zurück. So wird in der Literatur immer wieder von
sensationellen Funden altertümlicher Implantate gesprochen. Irish et al.
beschreibt z. B. den Fund eines 5500 Jahre alten ägyptischen Zahnes der
möglicherweise als einer der ersten Versuche eines Zahnimplantates
gesehen werden kann [53]. Attila et al. beschreibt den Fund eines
Zahnimplantates in Anatolien aus dem Jahr 600 v. Chr. [4]. Die Literatur ist
voll von angeblichen archäologischen Funden zahnärztlicher Implantate.
Diese Funde werden aber auch kritisch in der Literatur in Frage gestellt und
oftmals eher als Wunschvorstellung der Archäologen gesehen [8].
Unabhängig davon, ob diese Funde als echte Implantate anzusehen sind
oder nicht, zeigt das der Versuch fehlender Zähne durch Implantate zu
ersetzen, die Menschheit schon seit langer Zeit beschäftigt. Die ersten ernst
zu nehmenden ennossalen Implantationsversuche der Neuzeit waren in der
Regel Sofortimplantate. Jourdan und Magiolo beschreiben in ihrem Buch
Manual d`art dentaire, die Versenkung eines Goldrohres in die Alveole,
welches mit einer vierarmigen Kralle fixiert wurde und somit der Aufnahme
eines Stiftzahnes diente [118]. Im Jahr 1886 ist es Younger der eine
künstliche „Alveole“ zur Aufnahme eines Spätimplantates aufbereite [118].
1913 kommt es zur Verwendung neuer Legierungen im Bereich enossaler
Implantate. Greenfield verwendet ein Hohlimplantat aus einer Platin-Iridium-
Legierung [94]. Ende der 30er-Jahre finden nicht oxidierende Metalle wie
Chrom, Molybdän und Kobalt als Werkstoff in der zahnärztlichen
Implantologie Verwendung [118]. Die Implantologie ist einem ständigen
Wandel unterzogen. Die Erforschung neuer Materialien und Modifizierungen
bereits bewährter Werkstoffe ist die Triebfeder für Neuerungen in der
Implantologie. Durch technische und wissenschaftliche Fortschritte bedingte
Erfolge stellen immer wieder neue Ansprüche an die Werkstoffe unserer Zeit.
Moderne Werkstoffe in der Implantologie müssen über folgende wichtige
Eigenschaften verfügen:
- 51 -
� Biokompatibilität – d.h. die Verträglichkeit zwischen einem biologischen
und einem technischen System [125].
� Osseointegration – d.h. ein direkter funktioneller und struktureller
Verbund zwischen dem organischen, lebenden Knochen und der
Oberfläche eines belasteten Implantates, der unter dem Lichtmikroskop
betrachtet werden kann [21].
� Osteokonduktion – d.h. die Fähigkeit aufweisen das Knochenwachstum
auf der Oberfläche zu unterstützen [21].
� Unterstützung der de-novo Knochenbildung [24].
Die hohen mechanischen Anforderungen führen zum bevorzugten Einsatz
metallischer Werkstoffe. Die langjährigen klinischen Erfahrungen erweiterten
die Anforderungen an den Werkstoff um Korrosionsbeständigkeit und
mechanische Festigkeit. Die mechanische Festigkeit soll eine dauerhafte
Kraftübertragung zwischen Implantat und Körpergewebe sowie eine
knochenähnliche Implantatsteifigkeit gewährleisten. Durch die Wahl von
elektrochemisch stabilen Werkstoffen soll eine korrosive Implantat-
schädigung vermieden werden [126]. Die Suche nach den geeigneten
metallischen Ersatzmaterialien, die den Anforderungen genügen führten zum
Einsatz von cp Titan (cp = commecially pure) und Titanlegierungen (Ti-Al6-
4V) als Implantatwerkstoff [104]. Der routinemäßige Einsatz am Menschen
setzt die Durchführung von in vitro und in vivo Studien voraus, die einen
eindeutigen medizinischen Wert sowie eine Unbedenklichkeit des Einsatzes
belegen. Voraussetzung für eine spätere Übertragbarkeit in die Praxis, der
durch tierexperimentelle Studien gewonnenen Daten, ist die Wahl eines
Versuchsmodells mit größtmöglicher biologischer Humananalogie bezüglich
der menschlichen Knochenregeneration [49, 123]. Es wurde das etablierte
Modell des Hausschweins gewählt, da es aufgrund der Ähnlichkeit zur
menschlichen, ossären, reparativen Kapazität geradezu prädestiniert ist [95,
121, 122].
In der vorliegenden Studie wurde primär der Knochen-Implantat-Kontakt und
die periimplantäre Knochendichte von verschiedenen Titanimplantaten zu
den jeweiligen Opferungszeitpunkten sowie innerhalb der verschiedenen
- 52 -
Strukturen und Oberflächenmodifikationen beurteilt. Es wurde mittels SEBM-
Verfahren und anschließender Layer-by-Layer-Beschichtung hergestellte
Titanimplantate mit SEBM-Implantaten ohne LbL-Anordnung verglichen.
Die Biokompatibilität ist die wichtigste Voraussetzung eines Biomaterials für
eine langfristige Akzeptanz in physiologischer Umgebung. Sie berücksichtigt
die komplexen Wechselwirkungen zwischen dem Fremdmaterial und dem
biologischen Gewebe. Das Auftreten verschiedener Wechselwirkungen am
Material, als auch am Gewebe selbst ist möglich. Diese Reaktionen sind alle
ein Kriterium für die Beurteilung eines Materials hinsichtlich der
Biokompatibilität [125]. Es kann beim Begriff der Biokompatibilität eine
Struktur- von einer Oberflächenkompatibilität unterschieden werden. Die
Strukturkompatibilität beschreibt die Anpassung der Implantatstruktur an das
mechanische Verhalten des Empfängergewebes. Es ist sowohl die
Formgebung als auch die “Innere Struktur“ gemeint. Die Oberflächen-
kompatibilität beschreibt die Anpassung der physiochemischen Oberflächen-
eigenschaften des Implantates an das Empfängergewebe mit dem Ziel einer
klinisch erwünschten Wechselwirkung [124]. Im Rahmen einer aktuellen in
vitro Studie konnte gezeigt werden, dass Ti-6Al-4V Werkstoffe, welche durch
das SEBM-Verfahren hergestellt wurden, keine zelltoxische Wirkung
aufweisen [88]. Es wurde auch ein stimulierender Effekt auf die Proliferation
und Differenzierung von Osteoblasten gezeigt [88]. Um die Biokompatibilität
der in dieser Studie verwendeten Werkstoffe in vivo zu testen wurden diese
histologisch untersucht [88].
Der prozentuale KIK, der in dieser Studie verwendeten Werkstoffe ist
generell niedriger, als der in anderen Veröffentlichungen, die sich mit
Knochen-Implantat-Kontakt bei Implantaten beschäftigten [14, 48, 78, 101,
115]. Als mögliche Ursache für den geringeren Knochen-Implantat-Kontakt
kommt die bearbeitete Implantatoberfläche, Oberflächen mit veränderter
Struktur hinsichtlich der Oberflächenrauhigkeit in Frage, die anschließend
nicht weiter durch Sandstrahlen oder Ätzung, wie bei Implantaten zur
Förderung der Osseointegration üblich, bearbeitet wurden. Eine weitere
Erklärung für den höheren Knochen-Implantat-Kontakt bei Dentalimplantaten
ist möglicherweise auf das Gewinde zurückzuführen. Das Gewinde dient auf
der einen Seite der Oberflächenvergrößerung auf der anderen Seite
- 53 -
ermöglicht es initialen Kontakt und Primärstabilität [38, 108]. Frenkel et al.
zeigte, dass das Gewinde die Richtung des Knochenwachstums beeinflusst
und Oberflächen mit Mikrorillen die Knochenbildung steigern [38]. Veis et al.
beschreibt, dass zweifach geätzte Oberflächen signifikant höhere Werte, als
maschinierte (glatte) Oberflächen erzielen [114]. Der von Veis et al.
beschriebene Knochen-Implantat-Kontakt (KIK) bei maschinierten
Implantatoberflächen verhält sich wie der für die in dieser Studie
untersuchten kompakten Proben (A und Ac) mit glatter Oberfläche [114].
Wenig et al. beschreibt außerdem niedrigere Knochen-Implantat-
Kontaktraten (KIK) für maschinierte (glatte) Oberflächen im Vergleich zu den
jeweils entsprechenden modifizierten, geätzten Oberflächen [119].
Die Untersuchung der periimplantären Knochendichte zeigte nur tendenziell
höhere Werte innerhalb der Gruppe, der mit Layer-by-Layer-Anordnung
konfigurierten Konstrukte. Die Konstrukte Fc zeigten dabei noch die höchsten
Werte hinsichtlich periimplantärer Knochendichte. Jakobsen et al. beschreibt
erhöhte Werte hinsichtlich periimplantärer Knochendichte bei mit
Bisphosphonaten behandelten Gruppen [55]. Allerdings gibt es keinerlei
Steigerung hinsichtlich der Implantatfixierung [55]. In der Gruppe B/Bc und
C/Cc zeigte sich zwischen dem mineralisierten Gewebe und dem Implantat
offenkundig kein direkter Kontakt unabhängig davon, ob sie der
unbeschichteten Gruppe oder der mit Pamidronat beschichteten Gruppe
angehören. Diese Tatsache spiegelt sich auch in den niedrigeren
prozentualen Werten für periimplantäre Knochendichte wieder. In einer
kürzlich veröffentlichten in vitro Studie wurden Ergebnisse einer geringeren
Proliferation und Zellen-Überlebensrate für die Oberflächen dieser hier
verwendeten, unbeschichteten Oberflächen (B und C) gezeigt [88]. Es zeigt
sich ein starker Zusammenhang zwischen den in vitro und in vivo
Ergebnissen. Es ist anzunehmen, dass die scharfkantige Oberfläche dieser
Implantate ungeeignet für eine erfolgreiche Osseointegration ist. Die
scharfen Seiten verursachen Mikrotraumen im Knochen und stimulieren
daraufhin die Bildung von fibrösem Gewebe. Auch wenn die Ergebnisse für
Knochen-Implantat-Kontakt, der mit Pamidronat beschichteten Proben etwas
höher ausfallen, sind diese nicht als signifikant anzusehen.
- 54 -
Bei der immunhistologischen Untersuchung der hier vorliegenden Studie
wurde die Expression der Knochenmatrixproteine BMP-2/4, Osteocalcin und
Kollagen I bei der Osseointegration der bereits vorher beschriebenen
Werkstoffe untersucht. Die Betrachtung von bereits vorhandenen, veröffent-
lichten Untersuchungen über Knochenmatrixproteine zeigt, dass die
Proteinexpression untersuchungsbedingt großen Schwankungen unterliegt
[13, 15, 17, 34, 67, 76, 79, 85]. Die Bedeutung der Knochenmatrixproteine
bei Umstrukturierungsprozessen und Knochenneubildungsprozessen ist
unumstritten, auch wenn die dabei ablaufenden Vorgänge im Detail noch
nicht vollständig geklärt sind [37, 113]. BMP-2/4 stimuliert die Proliferation
der Osteoblasten und Chondroblasten. Somit ist BMP-2/4 in der Lage die
Knochenneubildung zu initiieren. Es führt in den Zellen zu einer gesteigerten
Zellmatrixproduktion. Desweiteren konnte nachgewiesen werden, dass BMPs
die Differenzierung mesenchymaler Stammzellen zu Osteoblasten stimuliert
und somit in ossären Bereichen in erhöhter Konzentration anzutreffen sind
[58, 79].
Bei Betrachtung der immunhistochemischen Ergebnisse im untersuchten
Bereich des Knochen-Implantat-Interfaces sind hinsichtlich der BMP-2/4-
Expression signifikante Unterschiede zu erkennen. Die unbeschichteten
Proben A-F, mit Ausnahme von A am 14. Tag, weisen eine Expression
unterhalb der des ortsständigen autologen Knochens (19,0 %) auf. Nur die
kompakte Probe A zeigt am 14. Tag einen höheren Wert (25,0 %). Die
beschichteten Konstrukte Ac-Fc weisen signifikant höhere Werte in Bezug
auf die BMP-2/4-Expression, als A-F auf. Die höheren Werte sind zu allen
Opferungszeitpunkten (3, 7, 14 und 30 Tage) gegeben. Mit Werten bis zu
40 % liegt die Expression deutlich über dem Median des ortsständigen,
autologen Knochens mit 19,0 %. Der Versuch die experimentell ermittelten
Werte mit Werten aus der Literatur zu vergleichen gestaltet sich schwierig.
Die Ergebnisse in dieser Studie für A-F zeigen starke Schwankungen und
erscheinen unspezifisch. Nahezu alle Autoren berichten von einer anfänglich
sehr hohen BMP-2/4-Expression [15, 34, 59], welche der Defektsetzung
mittels Trepanbohrer zugesprochen wird [44, 72]. In dieser Studie konnte
dieses Phänomen für die Konstrukte A-F nicht beobachtet werden. Die
Ergebnisse für Ac-Fc jedoch scheinen dieses Phänomen zu bestätigen. So
- 55 -
zeigt Ac am 3. Tag eine Expression von 26,6 %, steigt dann am 7. Tag auf
35,6 % und sinkt dann bis zum 30. Tag deutlich auf 13,1 %. Das Konstrukt
Bc zeigt am 3-ten Tag einen Median von 38,1 %, am 7-ten Tag 38,4 %, am
14-ten Tag 25,9 % und am 30-ten Tag 31,5 %. Der Median der porösen
Probe Cc sinkt von 40,0 % am 3-ten Tag auf 22,6 % zum Opferungszeitpunkt
30 Tage. Die Probe Dc zeigt einen kontinuierlichen Anstieg vom 3-ten Tag
(26,9 %) bis zum 30-Tag (34,8 %). Der Median der porösen Probe Fc steigt
von anfänglich 26,7 % am 3-ten Tag auf 30,4 % am 7-ten Tag, auf 31,3 %
am 14-ten Tag und fällt anschließend am 30-ten Tag auf 13,6 %. Ein
Expressionsmaximum am 14. postoperativen Tag wird von Onishi et al.
beschrieben, welches sich mit dem Ergebnis für das unbeschichtete Material
A (27,8 %) zum Opferungszeitpunkt 14 Tage deckt [80]. Bei den
beschichteten Proben zeigen Dc, Ec und Fc ihr Expressionsmaximum am 14.
postoperativen Tag. Die Konstrukte Ac, Bc und Cc hingegen zeigen ihr
Expressionsmaximum hingegen bereits schon zum Opferungszeitpunkt 7.
Tag.
Das Knochenmatrixprotein Osteocalcin wird als „nichtkollagenes“ Protein
während der Mineralisationsphase der Knochenmatrix von Osteoblasten und
Chondroblasten synthetisiert. Die Osteocalcin-Expression findet zu einem
späteren Zeitpunkt der Matrixreifung statt. Osteocalcin ist somit ein Marker
für die Knochenmineralisation [19]. In der vorliegenden Studie zeigte sich,
dass die Osteocalcin-Expression für die unbeschichteten Proben A-F und die
mit Pamidronat beschichteten Proben Ac-Fc zu allen Opferungszeitpunkten
unter der Expression des ortsständigen Knochens (7,0 %) lag. Der Vergleich
mit einschlägiger Literatur anderer Studien lässt dieses Ergebnis untypisch
erscheinen. In diesen Studien ist die Osteocalcin-Expression mit dem Beginn
nach 3 Wochen und einem Expressionsmaximum nach 12 Wochen
beschrieben [19, 28]. Dies konnte in der vorliegenden Studie für A-F sowie
Ac-Fc nicht bestätigt werden. Es zeigte sich beim Vergleich der unbe-
schichteten Konstrukte A, C, D, E und F im Vergleich mit den
entsprechenden beschichteten Konstrukten A, Cc, Dc, Ec und Fc eine
signifikant höhere Osteocalcin-Expression für die unbeschichteten Proben.
Die erniedrigte Osteocalcin-Expression für den gesamten Untersuchungs-
- 56 -
zeitraum lässt sich durch die vermehrte Bildung von Bindegewebe erklären.
Wie bereits vorher erwähnt wird vermutet, dass die Adsorption der
Osteoblasten durch die scharfen Kanten gehemmt und somit ein fibröses
Einheilen gefördert wird. Indem Osteocalcin erst zu einem späteren Zeitpunkt
der Matrixreifung exprimiert wird, stellt es einen Marker für die
Knochenmineralisation dar [107]. Da die Implantate verstärkt fibrös
eingewachsen sind wurde weniger Knochen gebildet. Dieser Umstand
manifestiert sich in einer den Ergebnissen dieser Studie entsprechenden
erniedrigten Mineralisationsrate.
Das Knochenmatrixprotein Kollagen I gilt als wichtiges Matrixprotein bei der
Neubildung von Knochen. Es ist ein unspezifischer Marker für die
Knochenentwicklung und Knochenheilung [19, 63, 109]. Kollagen I bildet ein
Gerüst für das Zellattachment und die Zellmigration im Gewebe. Desweiteren
besitzt es einen stimulierenden Effekt hinsichtlich der Morphogenese und der
Zelldifferenzierung durch Veränderung chemischer und mechanischer Stimuli
[9]. Betrachtet man die Werte der Kollagen-I-Expression in der vorliegenden
Arbeit, so ist ein signifikanter Unterschied zwischen den unbeschichteten
Proben A-F und den mit Pamidronat beschichteten Layer-by-Layer Proben
zu erkennen. Während die Konstrukte A-F (18-25 %) eine deutlich höhere
Expression als im ortsständigen Knochen (11,4 %) zeigen, ist bei den
Konstrukten Ac-Fc (1-6 %) eine signifikant niedrigere Kollagen-I-Expression
gegeben. Die Expression für A-F zeigt zu allen Opferungszeitpunkten (3, 7,
14 und 30 Tage) innerhalb der Gruppen geringfügige Schwankungen, die
über den Werten des ortsständigen Knochens liegen. Diese Schwankungen
ähneln der Kollagen-I-Expression, wie sie bei Zuk et al. in vitro, bei Sasano
et al. und Roser et al. beschrieben werden [93, 98, 129]. Die Schwankungen
innerhalb der Werte sind ein Spiegel der im Organismus ständig
stattfindenden Um- und Abbauprozesse der Matrix. Eine mögliche Erklärung
für die höheren Medianwerte der Kollagen-I-Expression bei A-F, als die des
ortsständigen Knochens könnte auf kaskadenförmige Reparaturprozesse
nach der Defektsetzung zurückzuführen sein [65]. Eine weitere Erklärung
hierfür kann in der durch die Distanzosteogenese bedingten bindegewebigen
Formation, um das Implantat gesehen werden. Da Bindegewebe aus
- 57 -
fibrillären Proteinen besteht und diese zum größten Teil kollagenen
Ursprungs sind ist eine erhöhte Kollagensynthese nötig. Ein erhöhter Anteil
an Kollagen ist zu Beginn der Knochenbildung physiologisch, um dann mit
Einsetzten der Mineralisation geringer zu werden. Die Kollagen-I-Expression
der beschichteten Proben Ac-Fc liegt zu allen Opferungszeitpunkten (3, 7, 14
und 30 Tagen) unterhalb der Expression des ortsständigen Knochens. Eine
Erklärung dieser Sachlage ist möglicherweise auf die Beschichtung der
Proben Ac-Fc mit Pamidronat zurückzuführen. So wird bei Simon et al. die
Beeinträchtigung der Kollagensynthese unter Einfluss von Pamidronat
untersucht was die niedrigeren Werte für Ac-Fc erklären könnte [105]. In der
Literatur wird auch eine Steigerung der Kollagenasen beschrieben was
möglicherweise die niedrige Kollagen-I-Expression erklären könnte [7].
Abschließend kann festgestellt werden, dass bei der Beschichtung von
Implantaten mit Pamidronat durch das Layer-by-Layer-Verfahren kein
nennenswerter Nutzen hinsichtlich gesteigerten Knochen-Implantat-
Kontaktes (in %) bzw. periimplantärer Knochendichte (in %), gegenüber den
unbeschichteten Implantaten zu verzeichnen ist. Das Beschichtungs-
verfahren jedoch als solches stellt ein interessantes Verfahren mit Potential
dar. Es bedarf auf diesem Gebiet weiterer Forschung um zu zeigen, dass es
ein erfolgreiches Drug-Release-System für die stimulierende Knochen-
Regeneration sein kann. Es sollten auch Überlegungen hinsichtlich der
Verwendung anderer Releasing-Faktoren unternommen werden, die positiv
auf die Knochenheilung und Osseointegration wirken. Weiterhin sollte das
LbL-Verfahren mit konventionellen Titanimplantaten kombiniert werden, um
eine Biokompatibilität zu gewährleisten. Die hier vorliegenden Ergebnisse
zeigten keine signifikant erhöhten Ergebnisse hinsichtlich KIK für die mit
Pamidronat beschichteten LbL-Gruppen. Die Betrachtung der peri-
implantären Knochendichte zeigte nur vereinzelt erhöhte Werte für die LbL-
Gruppe. Die Verwendung von Pamidronat und den damit verbundenen
Langzeitwirkungen sollte ebenso genauer beobachtet werden. Nach der
Freisetzung von Pamidronat wird dieses in dem Knochen eingelagert und
hemmt die Osteoklasten. Es wirkt aber nicht nur auf die Osteoklasten,
sondern auch auf die Osteoblasten. Die Osteoblasten werden gehemmt und
- 58 -
Knochenumbauprozesse kommen zum erliegen [7]. Der Knochen veraltet
und die damit einhergehende Hypermineralisation kann zu Implantatverlust
oder Knochennekrose führen. Choi et al. konnte in seiner Arbeit gehemmtes
Knochenwachstum verbunden mit gering vaskularisierten, fibrösen Gewebe
und nekrotischen Knochen in den Kalotten von Hasen nach der lokalen
Applikation von Pamidronat in die Defekte nachweisen [18]. Die Verwendung
von antiresorptiven Molekülen, die nicht im Knochen eingelagert werden und
über eine kurze biologische Halbwertszeit verfügen, könnte die bessere Wahl
sein. So könnte Osteoprotegerin, RANKL-Antikörper, Kathepsin K Hemmer
eventuell in Verbindung mit Faktoren wie BMP-2, VEGF und anderen
bessere Ergebnisse hinsichtlich der Osseointegration liefern [18, 33, 36, 39,
51, 61, 68, 75, 87].
In dieser Studie wurde die Osseointegration von neuen Titan-Implantaten mit
Hauptaugenmerk auf Knochen-Implantat-Kontakt und periimplantärer
Knochendichte untersucht. Zu diesem Zweck wurden Titan-Implantate mit
und ohne zusätzlicher Layer-by-Layer-Beschichtung miteinander verglichen.
Die Hypothese lag darin einen gesteigerten KIK sowie eine gesteigerte
periimplantäre Knochendichte mittels LbL-Beschichtung der Implantate mit
Pamidronat zu erzeugen. Die meisten Implantate zeigten unabhängig von
einer vorhandenen bzw. nicht vorhandenen Beschichtung eine fibröse
Einheilung. Der erhoffte positive Pamidronat assoziierte Effekt konnte nicht
festgestellt werden. Die besten Ergebnisse hinsichtlich KIK zeigten die
glatten kompakten Implantate. Eine Kombination dieser Implantatstruktur mit
herkömmlichen Implantatdesign und effizienteren Releasing-Faktoren für
Knochenheilung durch das LBL-Verfahren könnte vielversprechend sein,
bedarf aber weiterer Untersuchungen. Die porösen Strukturen F/Fc könnten
positive Verwendung im Bereich der Wirbelsäulenchirurgie oder bei anderen
großen Knochendefekten finden. Bei F/Fc konnte ein Einwachsen des
Knochens innerhalb der porösen Struktur festgestellt werden. Die porösen
Strukturen F/Fc zeigten auch hinsichtlich der periimplantären Knochendichte
verhältnismäßig hohe Werte (Abb. 29).
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7 Danksagung
Mein ganz besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. med.
Dr. med. dent. K. A. Schlegel für die Planung des Versuchsvorhabens sowie
für die durch die regelmäßig angesetzten Doktorandenbesprechungen
gewissenhafte Betreuung und Motivation. Er stand mir jederzeit mit Rat und
Tat zur Seite.
Herrn Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h. c. F. W. Neukam möchte ich für die
Möglichkeit danken, diese Arbeit an der Mund-, Kiefer-, Gesichts-
chirurgischen Klinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
durchführen zu können.
Herzlichst möchte ich mich bei Herrn Dr. med. dent. Rainer Lutz und Herrn
Dr. med. dent. Cornelius von Wilmovsky bedanken, die mich jederzeit bei der
Bewältigung von Problemen bei der Durchführung der praktischen als auch
der theoretischen Arbeit unterstützt haben.
Für die Hilfestellung bei histologischen Fragen bedanke ich mich bei Herrn
Dr. med. dent. Sawan Srour.
Mein Dank gilt auch den medizinischen technischen Assistentinnen des
Genlabors, Heidi Heider und Susanne Schönherr.
Ganz besonders danke ich meinen Eltern, die mir mein Studium und damit
auch diese Arbeit ermöglicht haben. Desweiteren danke ich allen, die an
mich geglaubt haben.
