Nachweis des Epithelialen Nachweis des Epithelialen Wachstumsfaktor Rezeptors (EGFR) und Wachstumsfaktor Rezeptors (EGFR) und

der cytoplasmatischen Tyrosinkinase der cytoplasmatischen Tyrosinkinase c-src in Urothelkarzinomzellenc-src in Urothelkarzinomzellen

A. Melchior, J. Herrmann, S. Tomasetti, M. P. Wirth, U. FiedlerKlinik und Poliklinik für Urologie, Technische Universität Dresden

Einleitung:

Die Tyrosinkinasen Epidermaler Wachstumsfactor-Rezeptor (epidermal growth factor receptor EGFR) und c-src sind entscheidende Regulatoren verschiedener Signaltransduktionswege (Abbildung 1). Eine erhöhte Expression des EGFR wurde bei einer Vielzahl von Tumoren beobachtet und korreliert mit dem Wachstum von Metastasen, der Migration und einer Chemotherapie sowie Radiotherapie insensitivität von Zellen. Der EGFR scheint an der Transformation von oberflächlich zu invasiv wachsenden Zellen beteiligt zu sein. C-src ist in die Mitogenese der Zellen involviert und wird ebenfalls in vielen Karzinomen überexprimiert. Beide Tyrosinkinasen scheinen im Prozeß der Karzinogenese wechselzuwirken bzw. zu kooperieren. Innerhalb der hier vorgestellten Studie wurde die Expression von EGFR und c-src in vier Urothelkarzinom-Zellinien (TCC, transitional cell carcinoma) sowie bei vier Patienten mit TCC der Harnblase untersucht. Die Menge an gebildeten Proteinen EGFR und c-src wurde mit Western-Blot-Analysen nachgewiesen, während die mRNA-Expression durch eine RT-PCR für die Marker GAPDH, EGFR und c-src untersucht wurde.

Ergebnisse:In allen 4 Zellinien wurde der EGF-Rezeptor immunologisch nachgewiesen. Durch Anwendung immuncytologischer Untersuchungen konnte dargestellt werden, daß der EGF-Rezeptor in der Plasmamembran lokalisiert ist (Abbildung 2). Eine quantitative Aussage zur EGFR-Expression wurde durch Western-Blot-Analysen erhalten. Dabei hatten die Zellinien HT1376 und EJ28 die stärkste Expression. Die Menge an EGFR-Protein korrelierte jedoch nicht mit der Menge mRNA (Tabelle 2). Hinsichtlich der Expression von c-src zeigte die Zellinie 5637 das stärkste Signal im Western-Blot (Abbildung 3), wobei bei dieser Zellinie auch die höchste Konzentration an c-src mRNA festgestellt wurde (Tabelle 2). Bei den vier Patienten wurde im Western-Blot in drei Proben verstärkt im Tumorgewebe c-src (Abbildung 3) und in zwei Proben EGFR ausschließlich im Tumorgewebe nachgewiesen (Tabelle 2). In der Probe von dem Patienten R.G., die einem fortgeschritten metastasierten TCC entstammt (pT4a pN3 M1 G3), wurde im Tumor im Western-Blot keine, in der RT-PCR nur eine geringe Expression für EGFR und c-src gefunden. Die auf Proteinniveau aufgezeigten Expressionsunterschiede wurden in den RT-PCR-Analysen bestätigt. Allerdings wurden hier bei allen vier Patienten erhöhte Mengen an spezifischer mRNA im Tumorgewebe festgestellt. Die c-src mRNA Expression ist in Abbildung 4 dargestellt.

Abbildung 2: Immuncytologische Darstellung des EGF-Rezeptors bei der Zellinie EJ28 (oben: Anfärbung mit Anti-EGFR-Ak und FITC-markiertem sekundären Ak, unten: nur sekundärer Ak).

Abbildung 3: Immunologischer Nachweis von c-src (60kD) in den TCC Zellen, der Zellinie A431 als Positivkontrolle und den Patientenproben.

A43

1

EJ2

8

J82

5637

HT

1376

49

84

127

MW in kD T

f

Tu

Tf

Tu

Tf

Tu

Tf

Tu

H.R

.

R.W

.

S.A

.

R.G

.

DN

A-S

tand

ard

Tu

Tf

Tu

Tf

Tu

Tf

Tu

Tf

EJ2

8J8

2H

T13

7656

37R.G

.

S.A

.

R.W

.

H.R

.

c-src

Abbildung 4: Nachweis der c-src mRNA (350 bp) in den TCC-Zellinien und den Patientengeweben.

123

246369492

bp

S.A. TCC pT2 pN0 M0 G3R.W. Plattenepithel-Ca pT2 pN0 M0 G2H.R. TCC pT3b pN0 M0 G3R.G. TCC pT4a pN3 M1 G3EJ28 TCC invasiv G25637 TCC invasiv G2J82 TCC invasiv G3HT1376 TCC invasiv G3

Tabelle 1: Charakterisierung der Zellinien und der Patienten-proben hinsichtlich Tumorstadium und Tumorgrad.

Patienten und Methode:Es wurde Tumorgewebe (Tu) und tumorfreies Gewebe (Tf) von vier Patienten (R.G., S.A., R.W. und H.R.) mit Urothelkarzinom der Harnblase sowie die TCC-Zellinien EJ28, J82, HT1376 und 5637 untersucht. Eine genaue Charakterisierung der Proben ist in Tabelle 1 aufgeführt. Alle Zellinien wurden aus invasiven Karzinomen der Harnblase etabliert. Die Proteinextrakte wurden durch Homogenisierung der Gewebe und anschließende Aufnahme in einem Lysis-Puffer bzw. ausschließlich durch eine Zelllyse gewonnen. Für die Western-Blot Analysen wurden 60-80 µg Gesamtprotein zur Detektion von EGFR und c-src eingesetzt. Von den gleichen Ausgangsmaterialien wurde RNA isoliert, und in cDNA umgeschrieben. Die cDNA diente als Template für die PCR-Analysen. Es wurden Primer entwickelt und verwendet, die spezifisch für GAPDH, EGFR und c-src sind. PCR´s zum Nachweis des house keeping Enzyms GAPDH dienten der Analyse der cDNA Qualität. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden nach Auftrennung im Agarosegel analysiert. Zum Nachweis des EGFR in den Zellinien wurden zusätzlich immuncytologische Untersuchungen durch-geführt. Dafür wurden die Zellen auf Objektträgern kultiviert und nacheinander mit einem Anti-EGFR und einem FITC markierten Antikörper (Ak) inkubiert.

Schlußfolgerung:

Die Untersuchungen mit den Geweben der vier Patienten mit Urothelkarzinom der Harnblase lassen vermuten, daß die verstärkte Expression von EGFR und c-src auch bei der Karzinogenese der Blase eine entscheidende Rolle spielt, aber nicht mehr bei Fernmetastasierung. Aus den Ergebnissen der Zellinien läßt sich schlußfolgern, daß die Expression der cytoplasmatischen Tyrosinkinase c-src auf mRNA-Niveau, die des EGF-Rezeptors dagegen scheinbar posttranskriptional reguliert wird. Die festgestellten Korrelationen und Aussagen müßen durch weitere Untersuchungen mit einem Patientenkolletiv validiert werden. Die hier vorgestellten Ergebnisse könnten bei der Entwicklung neuer Therapieansätze für das invasiv wachsende Urothelkarzinom, die auf der Hemmung der beschriebenen Marker basieren, hilfreich sein.

Abbildung 1: Signalkaskade des transmembranen Epidermalen Wachstum Faktor-Rezeptors.

Kin

ase

Kin

ase

Shc

GRB2

RasSOS

MEK

MAPK

Mitogenese

Ziel-Genc-fos

c-jun

c-src

PLCy

Raf

EGF-Rezeptor

c-myc

EGF EGF

Zellkern

Plasmamembran

Tabelle 2: Ergebnisse des Western-Blots und der RT-PCRs von den TCC-Zellinien und den Patientengewebeproben.

Western-Blot RT-PCREGFR c-src EGFR c-src

EJ28 ++ +++ + ++5637 + ++++ ++++ +++J82 + ++ +++ +HT1376 ++++ + ++ ++H.R. Tu + +++ + +

Tf 0 (+) 0 0R.W. Tu + +++ ++ +

Tf 0 (+) (+) 0S.A. Tu 0 +++ +++ +++

Tf 0 0 ++ ++R.G. Tu 0 0 + +

Tf 0 0 0 0