Nukleotidbindung an KtrA, der cytoplasmatischen Untereinheit des K-Aufnahmesystems ...... · 2018. 6. 6. · 3.7.1 Überexpression und Aufreinigung zweier KtrA–Varianten mit Aminosäureaustauschen

Nukleotidbindung an KtrA, der cytoplasmatischen

Untereinheit des K+-Aufnahmesystems KtrAB aus

Vibrio alginolyticus

Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der

Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) des Fachbereiches Biologie/Chemie an

der Universität Osnabrück

von

Nadine Kröning

Osnabrück, 2006

„Adieu“, sagte er….

„Adieu“, sagte der Fuchs. „Hier mein Geheimnis. Es ist ganz einfach: man sieht nur mit dem

Herzen gut. Das Wesentliche ist für die Augen unsichtbar.“

Antoine De Saint – Exupéry, „Der kleine Prinz“

I

Inhaltsverzeichnis

I. Abkürzungsverzeichnis 1

II. Zusammenfassung 2

1. Einleitung 5

2. Material und Methoden 19

2.1 Chemikalien, Enzyme und Materialien 19 2.2 Bakterienstämme, Plasmide und Oligonukleotide 20 2.3 Anzuchtverfahren 21 2.4 Molekularbiologische Methoden 22 2.4.1 Plasmidisolierung 22 2.4.2 Gerichtete Mutagenese 22 2.4.3 Herstellung kompetenter Zellen und Transformation 23 2.4.4 Restriktion von DNA 23 2.4.5 Elektrophoretische Auftrennung von DNA 23 2.4.6 DNA-Sequenzanalyse 24 2.5 Komplementationstest 24 2.6 Biochemische und analytische Methoden 25 2.6.1 Überexpression von 10xhis-ktrA 25 2.6.2 Zellaufschluss 26 2.6.3 Reinigung von 10xHis-KtrA mittels Ni2+- Affinitätschromatographie 26 2.6.4 Umpufferung von gereinigtem 10xHis-KtrA 26 2.6.5 Proteinbestimmung 27 2.6.6 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 27 2.6.7 Immunoblot 28 2.6.8 UV-Spektroskopie 29 2.6.9 Gelfiltration 29 2.6.10 Antikörperherstellung gegen 10xHis-KtrA und KtrA 29 2.6.11 Overlayblot 30 2.6.12 Limitierte Proteolyse von 10xHis-KtrA und KtrA 30 2.6.13 Nukleotid-Bindestudien mittels Flowdialyse 30 2.6.14 ATPase–Aktivitäts-Test 31 2.6.15 Energiekopplung von KtrAB in vivo 32 2.6.15.1 Bestimmung der K+-Aufnahmaktivitäten in intakten Zellen 32 2.6.15.2 Bestimmung des cytoplasmatischen ATP-Gehaltes 33 2.6.15.3 Bestimmung der Prolin und Glutamin Aufnahmaktivität 33

3. Ergebnisse 34

3.1 Overlay vorhandener Kristallstrukturen von verschiedenen KTN – und RCK– Domänenstrukturen 34 3.2 Überproduktion und Reinigung von 10xHis-KtrA 35

II

3.2.2 Reinigung von 10xHis–KtrA mittels Ni2+-Affinitätschromatographie 36 3.3 Stabilitätstests von 10xHis–KtrA und KtrA 38 3.4 Nukleotidbindestudien mittels Flowdialyse 40 3.4.1 Effekte von zweiwertigen Kationen 44 3.5 Limitierte Proteolyse von 10xHis–KtrA und KtrA 46 3.5.1 Limitierte Proteolyse von 10xHis-KtrA 46 3.5.2 Limitierte Proteolyse von KtrA mit Trypsin 48 3.6 Messungen der ATPase–Aktivität von 10xHis–KtrA 50 3.7 Detektion der ATP–Bindestelle mittels Aminosäureaustausche im konservierten Glycinmotiv 51 3.7.1 Überexpression und Aufreinigung zweier KtrA–Varianten mit Aminosäureaustauschen im Glycin–Motiv 52 3.7.2 Komplementations– und K+ -Transportversuche mit 10xHis– G15AKtrA 54 3.7.3 Limitierte Proteolyse mit 10xHis–G15AKtrA 55 3.7.4. Nukleotidbindestudie mit 10xHis–G15AKtrA mittels Flowdialyse 56 3.8 Bindung der cytoplasmatischen Untereinheit KtrA an die membranständige Untereinheit KtrB aus V. alginolyticus 57 3.8.1 KtrA-Antikörper 57 3.8.2 Nachweis der Intensivierung der Bindung von KtrA an KtrB

durch ATP mittels Overlayblot 58 3.8.3 Nachweis der Intensivierung der Bindung von KtrA an KtrB

durch ATP mittels Affinitätschromatographie 61 3.9 Energiekopplung von KtrAB aus V. alginolyticus 62 3.9.1 Komplementation 64 3.9.2 Hungerphase von LB692(pKT84) 65 3.9.3 K+-Transport via KtrAB aus V. alginolyticus in Gegenwart

unterschiedlicher Energiequellen 66 3.9.4 Effekt von 2,4–Dinitrophenol auf die K+-Aufnahme und ATP–Gehalt von LB692(pKT84) 68 3.9.4.1 Effekt von 2,4–Dinitrophenol auf die K+ -Aufnahme und den ATP– Gehalt von LB692(pKT84) 68 3.10 Glutamin – und Prolin – Aufnahme von LB692(pKT84) 70 3.10.1 Glutamin–Aufnahme von LB692(pKT84) 70 3.10.2 Prolin–Aufnahme von LB692(pKT84) 71

4. Diskussion 73

4.1 Strukturvergleich publizierter KTN- und RCK-Domänen 73 4.2 ATP-Bindung an die cytoplasmatischen Untereinheit KtrA des KtrAB- Transportsystems aus V. alginolyticus 75 4.2.1 Isolierung der cytoplasmatische Untereinheit KtrA aus V. alginolyticus 75 4.2.2 Bei einer limitierten Proteolyse führte nur die Zugabe von ATP

zu 10xHis-KtrA und KtrA zu einem differentiellen Spaltungsmuster 76 4.2.3 10xHis-KtrA zeigte keine ATPase-Aktivität 77 4.2.4 Mittels Flowdialyse konnte eine hohe Affinität von 10xHis-KtrA

für ATP ermittelt werden 78 4.2.5 Charakterisierung der ATP-Bindestelle in KtrA 79 4.3 ATP unterstützt die Assemblierung des KtrAB-Komplexes 81

III

4.4 Energetisierung des K+-Transportes via KtrAB in E. coli 84

5. Literaturverzeichnis 88

Anhang

1

I. Abkürzungsverzeichnis

AK Antikörper

Amp Ampicillin

ampR plasmidvermittelte Ampicillin-Resistenz

BCIP 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat

BSA Rinderserumalbumin

Carb Carbenicillin

CPM counts per minute

DDM β-D-n-Dodecylmaltosid

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

kDa Kilodalton

Ni2+-NTA Nickel-Nitrilotriessigsäure (nickel-nitrilo-

triaceticacid)

NBT 4-Nitro-blue-tetrazolium-chlorid

OD578nm optische Dichte bei 578 nm

PAP SDS-Probenauftragungspuffer

Rifampicin 3-[4-Methylpiperazinyliminomethyl]-rifamycin

SDS Natriumdodecylsulfat

SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-

Elektrophorese

2

II. Zusammenfassung

Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die cytoplasmatische Untereinheit KtrA des

K+-Transportsystems KtrAB aus V. alginolyticus, das zusammen mit einem TrkH-

ähnlichen, niedrig affinen und konstitutiv exprimierten Transportsystem die

Kaliumversorgung von V. alginolyticus gewährleistet. Dabei standen Untersuchungen

zur Ligandenbindung an die cytoplasmatische Untereinheit KtrA und dessen Funktion

im Transportprozess im Vordergrund.

Am Anfang meiner Arbeit war ATP als Ligand der cytoplasmatischen Untereinheit

KtrA noch umstritten. KtrA enthält in der Aminosäuresequenz ein konserviertes Glycin-

Motiv (GXGXXG…..D), das so genannte „Rossman fold“-Motiv (Roosild et al., 2002),

welches bereits von TrkA und NAD+-abhängigen Dehydrogenasen bekannt war und bei

RCK-Domänen fehlt. Dieses konservierte Glycin-Motiv ließ eine NAD+(H)-Bindung an

KtrA vermuten und führte zu einer Zuordnung von KtrA zur Gruppe der KTN-Proteine.

Roosild und Mitarbeiter publizierten 2002 Kristallstrukturen von einem TrkA-Fragment

aus M. jannaschii im Komplex mit NAD+ und einem KtrA-Fragment aus B. subtilis im

Komplex mit NADH. Auf Grund eines detektierten Winkelunterschiedes in der

Scharnierregion zwischen zwei miteinander wechselwirkenden Untereinheiten als Folge

der Bindung von NAD+(H) (Abb.1.7) wurde ein „Conformational switch“-

Mechanismus zur Regulation des K+-Transportes bei KTN-Proteinen vorgeschlagen. In

der Arbeit von M. Willenborg (2003) konnte allerdings gezeigt werden, dass ATP

radioaktiv markiertes und an gereinigtes KtrA gebundenes NAD+ wesentlich besser

verdrängen konnte als NAD+ oder NADH. Zudem konnte weiter gezeigt werden, dass

entsprechend der Arbeit von Roosild et al. (2002) verkürzte Fragmente von KtrA aus V.

alginolyticus keine biologische Aktivität mehr aufwiesen. Ein weiteres Argument gegen

eine allgemeine NAD+(H)-Bindung an KTN-Domänen war der Vergleich ähnlicher,

aber doch paraloger Proteine in der Arbeit von Roosild et. al (2002). Für einen

eindeutigeren Hinweis auf einen „Conformational switch“-Mechanismus als Folge einer

Nukleotid-Bindung an KTN-Domänen hätten Fragmente von ein und demselben Protein

mit und ohne Liganden verglichen werden müssen.

Eine limitierte Proteolyse mit Trypsin der gereinigten cytoplasmatischen Untereinheit

10xHis-KtrA und KtrA ohne und in Gegenwart verschiedener Nukleotide sollte einen

ersten Aufschluss über eine Änderung der Konformation von KtrA im Zuge einer

3

Nukleotidbindung geben. Im Verlauf dieser Untersuchungen konnte eine

Konformationsänderung von 10xHis-KtrA und KtrA nur nach Zugabe von ATP

festgestellt werden. Mit Hilfe der Flowdialyse ermittelte ich die Dissoziationskonstanten

für eine Vielzahl von Nukleotiden. Die mit Hilfe dieser Technik ermittelten Daten

zeigten, dass ATP mit einer enorm hohen Affinität (KD = 9 ± 0,8 µM) von 10xHis-KtrA

gebunden wurde. Ebenfalls konnte eine 1:1 Stöchometrie errechnet werden. NAD+

dagegen konnte in diesen Experimenten nicht an 10xHis-KtrA gebunden werden und

zeigte in Bezug auf ATP keinerlei Verdrängungseffekt. Ebenso konnte GTP radioaktiv

markiertes und an 10xHis-KtrA gebundenes ATP nicht verdrängen. Zweiwertige

Kationen zeigten ebenfalls keinen kompetitiven Effekt auf eine ATP-Bindung an

10xHis-KtrA. Des Weiteren konnte ich am gereinigten 10xHis-KtrA keinerlei ATPase-

Aktivität detektieren. Anschließend untersuchte ich, an welcher Aminosäureposition

ATP an 10xHis-KtrA bindet. Dieses versuchte ich mittels einfügen von

Punktmutationen innerhalb des konservierten Glycin-Motives (GXGXXG……D). Bei

einem Austausch des ersten Glycins konnte allerdings kein Zielprotein in der löslichen

Fraktion nach Aufschluss der Zellen im Anschluss einer Überproduktion detektiert

werden. Nach Mutation des zweiten Glycins wurde zwar eine starke Minderung der

Affinität gegenüber ATP entdeckt, aber es schien nach Austausch des zweiten Glycins

gegen ein Alanin ebenfalls zu einer Konformationsänderung des Zielproteins zu

kommen. Damit konnte nicht eindeutig geklärt werden, ob die Minderung der Affinität

gegenüber ATP nach Austausch des zweiten Glycins durch den Austausch selbst oder

aber durch eine Änderung der Konformation des Proteins auftrat.

In Zusammenarbeit mit der Firma Charles River Laboratories (Kisslegg) stellte ich

einen Antikörper gegen KtrA ohne His-Tag her. Dieser wurde dafür verwendet, KtrA

in Gegenwart von 6xHis-KtrB parallel nachzuweisen. Dieser Antikörper ermöglichte es

mir, einen KtrAB-Komplex nachzuweisen. Zusätzlich stellte ich im Verlauf dieser

Experimente fest, dass die Assemblierung von KtrAB durch die Zugabe von ATP

unterstützt wurde. Diese Experimente wurden sowohl unter denaturierenden, als auch

unter nativen Bedingungen reproduziert. Ein ähnlicher Effekt konnte für keines der

anderen verwendeten Nukleotide nachgewiesen werden. Alle bisher gesammelten

Ergebnisse sprachen für eine ATP-Bindung an die cytoplasmatische Untereinheit

10xHis-KtrA, unabhängig von dem Vorhandensein des His-Tags, anstatt der erwarteten

NAD+(H)-Bindung. Zusätzlich schien ATP die Assemblierung des KtrAB-Komplexes

zu fördern.

4

Da aber alle bisherigen Ergebnisse am gereinigten und isolierten Protein und in

Abwesenheit von KtrB gemacht wurden, war es notwendig, eine ATP-Abhängigkeit des

K+-Transportes via KtrAB in vivo nachzuweisen. Dazu wurde der Stamm LB692

verwendet. Dieser Stamm enthielt keine K+-Transportproteine und keine

funktionsfähige ATP-Synthase mehr, mittels derer eine Umwandlung einer „Protonen-

motorischen-Kraft“ in ATP und vise versa möglich gewesen wäre. Nach

Transformation dieses Stammes mit dem Plasmid pKT84, das für das K+-

Transportsystem KtrAB codiert, konnte nach einer so genannten „Hungerphase“, in der

die Zellen K+- und ATP-frei gemacht wurden, durch die Zugabe unterschiedlicher

Energiequellen (Ansatz 1: Glukose; Ansatz 2: Glukose und 2,4-Dinitrophenol; Ansatz

3: Succinat; Ansatz 4: ohne Energiequelle) zwischen ATP, der „Protonen-motorischen-

Kraft“ oder beiden Komponenten als Energiequelle für den K+-Transport via KtrAB aus

V. alginolyticus differenziert werden. Die Ergebnisse aus diesen Experimenten

bestätigten einen Bedarf an ATP und der „Protonen-motorischen-Kraft“ im

Transportprozess via KtrAB.

Meine Ergebnisse wurden vor kurzem zur Veröffentlichung eingereicht und werden in

nächster Zeit in J. Biol. Chem. erscheinen. Unabhängig von meiner Arbeit

veröffentlichten im September 2006 Albright und Kollegen ebenfalls Daten über eine

ATP-Bindung an einem verkürzten KtrA-Fragment aus B. subtilis.

5

1. Einleitung

Mikroorganismen leben in einer Umgebung, die sich durch einen ständigen Wechsel der

Lebensbedingungen auszeichnet. Vor allem Wasser– und Nährstoffverfügbarkeit,

Temperatur und pH–Wert unterliegen einer raumzeitlichen Dynamik. Das Spüren von

und die Reaktion auf sich ändernde Umweltbedingungen sind Grundlagen für das

Überleben von Mikroorganismen. Die Ausbildung von semipermeablen Membranen,

die eine Abgrenzung des Cytoplasmas gegen das umgebende Medium darstellen, liefert

eine Strategie zur Reaktion auf ein sich änderndes Milieu. Während diese Membranen

eine Diffusion von hydrophoben, unpolaren und kleinen, ungeladenen, polaren

Molekülen erlauben, sind sie für große, ungeladene und geladene, polare Moleküle und

Ionen undurchlässig. In die Membran integrierte Transportsysteme ermöglichen die

Aufnahme und Abgabe von Substanzen, die während der laufenden

Stoffwechselprozesse nicht über die Membran diffundieren können. Die

Wasserverfügbarkeit spielt für das Wachstum von Mikroorganismen eine besondere

Rolle. Da allen Organismen die Fähigkeit eines aktiven Wassertransportes fehlt, hängt

der Grad der Hydratisierung des Cytoplasmas von den osmotischen Bedingungen und

den dadurch induzierten Prozessen in der Zelle ab (Holtmann et al., 2003).

Mikroorganismen reagieren bei hyperosmotischen Bedingungen in drei sich

überlappenden Phasen (Wood, 1999). In der ersten Phase kommt es zur Dehydrierung

des Cytoplasmas. In der zweiten Phase erfolgt eine schnelle Aufnahme von

Kaliumionen (Dinnbier et al., 1988) mittels spezifischer Kaliumtransportsysteme

(Stumpe et al., 1996). Die dritte Phase beinhaltet die Synthese und/oder die Aufnahme

kompatibler Solute (Brown, 1976; Yancey et al., 1982) und den Export von Kalium

(Bremer und Krämer, 2000; Csonka und Epstein, 1996; Dinnbier et al.,1988), da

übermäßig viele Kaliumionen störend auf Enzymwirkung, DNA–Proteininteraktionen

und die Translation (Record et al., 1998) wirken. Die zelluläre Antwort auf

hypoosmotische Bedingungen ist noch nicht im Detail charakterisiert. Zunächst kommt

es zu einem Wassereinstrom in die Zelle und somit zu einer Erhöhung des Turgors. Um

ein Platzen der Zelle zu verhindern, erfolgt eine schnelle Abgabe von Osmolyten

(Schleyer et al., 1993) mittels mechanosensitiver Kanäle, wie zum Beispiel MscL (s.

unten), die sich beim Dehnungsprozess der Cytoplasmamembran öffnen (Booth et al.,

1996). Um den Turgor und den Grad der Hydratisierung des Cytoplasmas konstant zu

6

halten, variieren Mikroorganismen ihren intrazellulären Pool an gelösten Substanzen

(Holtmann et al. 2003).

Ebenfalls ist die Aufrechterhaltung des pH-Wertes für den Organismus wichtig. Diesem

Prozess liegt nach Booth (1985) und Olson (1993) die Idee zugrunde, dass

Mikroorganismen im Fall einer Ansäuerung des umgebenden Mediums mittels

elektrogener K+-Aufnahme, gekoppelt an einen Protonenausstrom den zellinternen pH–

Wert von 7,6–7,8 (Booth, 1985) aufrecht erhalten (Bakker und Mangerich, 1981). Die

Aufnahme von Protonen und die Abgabe von Natriumionen mittels

Kation/Protonenantiportern erfolgt im Zuge einer Alkalisierung des umgebenden

Mediums. Eine Beteiligung von Kaliumionen an diesem Prozess bleibt bisher ungeklärt.

In Bezug auf die pH-Wert-Homöostase (Bakker und Mangerich, 1981; Kroll und Booth,

1983; Booth et al., 1985; Krulwich et al., 1990) und die Osmoadaptation (Epstein et al.,

1993) nimmt Kalium (K+) eine zentrale Stellung ein. K+ ist das zweithäufigste

alkalische Kation in der Natur und findet seine Bedeutung unter anderem als

Hauptosmolyt prokaryotischer Zellen (Stumpe et al., 1996). Des Weiteren spielt Kalium

eine Rolle bei der Aktivierung von intrazellulären Enzymen (Suelter, 1970), als

sekundärer Messenger und es findet sich ein Kaliumion im aktiven Zentrum von

Ribosomen (Nissen et al., 2000). Der Grund für die Präferenz von Kalium im Vergleich

zu Natrium, bei dem es sich um das häufigste alkalische Kation in der Natur handelt,

liegt nach Wiggins (1990) in dessen physikochemischen Eigenschaften und einem

positiven Einfluss auf die native Konformation und die Aktivität von Enzymen. Der

durch den Ausschluss von Natriumionen in einer natriumreichen Umgebung,

entstehende elektrochemische Natriumgradient kann für Transportprozesse genutzt

werden und wird als weiterer Grund für die Bevorzugung von Kaliumionen diskutiert

(Bakker, 1993A). Für die Aufnahme bzw. Abgabe von Kalium stehen Mikroorganismen

verschiedene Systeme mit unterschiedlichen Verbreitungsmustern,

Transporteigenschaften und Energetisierungsstrategien zur Verfügung. Sehr gut

untersucht sind die Aufnahme– und Abgabesysteme des Enterobakteriums Escherichia

coli, das mit seinen Transportsystemen, Effluxsystemen und Kanälen einen Überblick

über die Varianz des K+-Transportes verschafft (Abb.1.1).

So vermitteln mechanosensitve Kanäle, wie MscL und MscS, zum Beispiel den Efflux

von unspezifischen Molekülen, abhängig von ihrer Größe und in geringem Maße von

ihrer Ladung. MscL besitzt nach Sukharev et al. (1997) eine hohe Durchflussrate.

7

Abb. 1.1 Schematisierte Übersicht über K+-Aufnahme und K+-Abgabesysteme in E. coli nach Tholema, 2002.

MscM und MscS dagegen weisen geringe Durchflussraten auf, wirken aber ebenso

einem Zelltod bei einem osmotischen Downschock entgegen (Martinac et al., 2001;

Sukharev et al., 2002).

1994 entdeckte Milkman einen weiteren möglichen Kaliumkanal in E. coli. Kch scheint

ein spannungsabhängiger Kaliumkanal zu sein (Ungar et al., 2001; Musey et al., 2002;

Kuo et al., 2003). Für die cytoplasmatische Domäne (RCK-/KTN–Domäne, siehe

unten) des Kch-Kanals wird eine Regulation mittels Bindung eines noch unbekannten

Liganden postuliert (Jiang et al., 2002, 2003). Die spezifische Funktion von Kch ist

bisher nicht geklärt, da Deletionsmutanten nach Ungar et al. (2001) keine

Auswirkungen auf die Kaliumaufnahme in Escherichia coli zeigten.

KefB und KefC sind K+/H+-Antiporter, deren primäre Funktion in der Entgiftung der

Zelle liegt (Ferguson et al., 1999).

Ein konstitutiv exprimiertes K+-Aufnahmesystem mit einer geringen Ionenspezifität

(Bossemeyer et al., 1989b) und das H+ im Symport transportiert ist das Kup–System

8

(Schleyer, 1994). Csonka und Epstein ermittelten für das Kup–System 1996 eine eher

geringe Affinität für Kalium und eine niedrige Umsatzrate. Die Hauptfunktion des Kup

–Systems scheint in der K+-Aufnahme im Verlauf eines hyperosmotischen Schockes in

sauren pH–Bereichen zu liegen (Trchounian und Kobayashi, 1999).

Ein in vielen Prokaryoten verbreitetes K+-Aufnahmesystem, das ebenfalls konstitutiv

exprimiert wird, ist das Multikomponentensystem Trk. Es zeigt eine hohe Umsatzrate

und eine relativ geringe Affinität zu K+. Es ist das Hauptaufnahmesystem für K+ im

Zuge eines hyperosmotischen Schocks. Das Trk–System setzt sich aus den

Genprodukten trkA, trkE und trkH zusammen (Epstein und Kim, 1971; Dosch et al.,

1991). Die entsprechenden Gene aus S. thyphimurium wurden wie folgt bezeichnet:

sapG, sapD und sapJ (Perra–Lopez et al., 1993). In E. coli K–12 wurde eine weitere

transmembrane Version von TrkH, TrkG, gefunden. TrkG scheint nachträglich in das

Genom von E. coli inseriert worden zu sein, da es in der rac-Prophagen–Region kodiert

wird (Schlösser et al., 1993). Diese Version des Transmembranproteins zeigt eine

Sequenzübereinstimmung zu TrkH von 41 % und einen geringeren GC-Gehalt

(Schlösser et al., 1991). Sowohl TrkH, als auch TrkG benötigen die membranassoziierte

Untereinheit TrkA. TrkA besitzt eine Dinukleotidbindestelle, ähnlich der von

Dehydrogenase, an der NADH und mit einer geringeren Affinität auch NAD+ bindet

(Bossemeyer et al., 1989b; Schlösser et al., 1993). TrkE, das häufiger auch als sapD

bezeichnet wird, ist eine von zwei ATP–bindenden Komponenten eines ABC–

Transporters mit der Bezeichnung Sap, dessen erste Identifizierung in S. typhimurium

1993 durch Perra–Lopez und Mitarbeiter stattfand. Das Trk–System zeigt eine hohe K+-

Präferenz. Cs+ werden kaum messbar transportiert (Bossemeyer et al., 1989b), während

Rb+ als Substrat genutzt werden kann, aber mit einer 10fach geringeren Transportrate

(Rhoads et al., 1977). Rhoads und Epstein (1977) zeigten, dass sowohl ATP als auch die

„Protonen-motorische-Kraft“ zur Energetisierung dieses Transportsystems notwendig

sind. ATP wird hierbei zur Aktivierung des Systems und die „Protonen–motorische–

Kraft“ zur Energetisierung des Transports benutzt (Rhoads und Epstein, 1976; Stewart

et al., 1985). Auch die Ergebnisse von Harms und Mitarbeitern (2001), die zeigten, dass

TrkE (sapD) ATP bindet aber nicht hydrolysiert, unterstützen eine regulatorische Rolle

des ATPs und widersprechen einer energetisierenden Funktion. Nach Epstein (2003) ist

auch für TrkA eine ATP–Bindung möglich, auch wenn hier eine entsprechende Bindung

im Bereich submicromolarer Konzentrationen bisher scheiterte und eine NAD+/NADH–

Bindung postuliert wurde (Schlösser et al., 1993).

9

Bei sehr niedrigen K+-Konzentrationen im Medium, die eine Aufrechterhaltung des

interzellulären K+-Pools mittels TrkH, TrkG und Kup nicht mehr ermöglichen, kommt

es zur Induktion des K+-Aufnahmesystems Kdp (Bossemeyer et al., 1989b; Dosch et

al., 1991; Schlösser et al., 1992). Hierbei handelt es sich um eine hochaffine bakterielle

P-Typ-ATPase (Altendorf und Epstein, 1996), die ATP zusammen mit einem

zweiwertigen Kation, aber nicht die „Protonen–motorische–Kraft“ zur Energetisierung

des Transports benötigt (Rhoads und Epstein, 1977).

Während über die K+-Transportsysteme aus E. coli bereits viel bekannt ist, befinden

sich die Untersuchungen in Bezug auf K+-Transportsysteme aus anderen Bakterien oft

noch am Anfang. 1998 entdeckten Nakamura und Mitarbeiter ein neues, Na+-

abhängiges bakterielles K+-Transportsystem in Vibrio alginolyticus. Dieses

Transportsystem bekam die Bezeichnung KtrAB. Die cytoplasmatische Untereinheit

KtrA dieses K+-Transportsystems aus V. alginolyticus war Gegenstand meiner

Untersuchungen. In V. alginolyticus scheinen Kaliumionen mit einer internen

Konzentration von 400 mM hauptverantwortlich für die pH-Werthomöostase zu sein

(Nakamura et al. 1984). V. alginolyticus ist ein Gram negativer, gekrümmter, halophiler

Mikroorganismus, der aus Küstenwasser und Sedimenten auf der ganzen Welt

angereichert werden kann. (Hörmansdorfer et al., 2000). Die optimale

Wachstumstemperatur dieses Organismus liegt zwischen 17 und 35 °C und bei

alkalischen bis neutralen pH-Werten. Salinitäten zwischen 5 – 25 ‰ werden bevorzugt.

Die wirtschaftliche Bedeutung von V. alginolyticus liegt in der Produktion von

Proteasen und Kollagenasen, die in der Lederindustrie genutzt werden, um Tierfelle

schonender abzulösen. Eben in diesen Enzymen liegt auch die Pathogenität von V.

alginolyticus für Fische, Korallen und Krebse begründet. Ob dieser Organismus auch

für das Sterben der Steinkorallen verantwortlich gemacht werden kann, ist noch

ungeklärt (Kushamaro et al., 1996; Hörmansdorfer et al., 2000). Bei infizierten Fischen

ist es nach Hörmansdorfer et al. (2000) möglich, den Organismus in der Haut, den

Kiemen, den Muskeln, im Blut und im so genannten Bauchwasser (ascites)

nachzuweisen. Für große Fischfangnationen, wie zum Beispiel Japan mit einem

Jahresvolumen von über 7 Millionen Tonnen, stellen fischpathogene Organismen ein

Problem dar. Nach Berichten der NAL (1955) und der BFA-Fischerei (1997) kommt es

durch die Infektion mit Krankheitserregern wie V. alginolyticus immer wieder zu

beträchtlichen wirtschaftlichen Verlusten. V. alginolyticus ist nicht direkt für den

Menschen pathogen. Der Verzehr von kontaminiertem Fisch kann aber zu einer

10

Gastritis führen. Menschliche Zellen können nur bei einem direkten Kontakt des

Organismus mit Wunden, bei Fischbissen und Verletzungen an Muscheln oder Korallen

mit V. alginolyticus infiziert werden (Hörmansdorfer et al., 2000). Der interzelluläre

Na+-Gehalt beträgt 70 mM, während der entsprechende K+-Gehalt bei 470 mM liegt.

Trotz größerer pH-Wert-Schwankungen zwischen pH 6 und pH 9 kann mittels Na+/H+-

und K+/H+-Antiportern ein relativ konstanter pH-Wert von 7,8 aufrechterhalten werden

(Nakamura et al., 1984, 1992). Vergleicht man die benötigten Kaliumkonzentrationen

von E. coli mit denen von V. alginolyticus, so findet man für den marinen Vertreter

einen wesentlich höheren Bedarf an K+. Die K+-Aufnahme in V. alginolyticus geschieht

mittels zweier Aufnahmesysteme und erlangt besondere Bedeutung in der pH–

Werthomöostase bei externen pH–Werten im alkalinen Bereich (Nakamura et al.,

1984). Zum einen kann K+ mittels eines konstitutiven, Trk–ähnlichen Transportsystems

akkumuliert werden, das eine geringe Affinität zeigt, und zum anderen findet eine

Kaliumaufnahme durch ein induzierbares, hoch affines Transportsystem statt, das sich

von dem bekannten Kdp–System unterscheidet (Nakamura et al., 1994). Dieses

Transportsystem bekam die Bezeichnung KtrAB. Homologe Systeme fanden sich auch

in Bacillus subtilis, Borrellia burgdorferi, Mycoplasmen und anderen Bakterien, aber

nicht in E. coli oder Archea (Nakamura et al., 1998). Enterococcus hirae zum Beispiel

enthält das induzierbare Kaliumtransportsystem KtrII, von dem man weiß, dass es

Rubidium nur mit einer geringen Affinität und Rate transportiert. Zusätzlich benötigt

KtrII das ntpJ-Genprodukt für eine funktionale Aktivität (Nakamura et al., 1998). Bei

NtpJ handelt es sich um ein membranintegrales Protein, das der KtrB-Untereinheit des

KtrAB-Transportsystems aus V. alginolyticus entspricht. Zu NtpJ homologe Proteine

sind weit verbreitet im Reich der Bakterien. In E. hirae ist KtrII für die

Kaliumaufnahme bei submillimolaren Kaliumkonzentrationen verantwortlich (Murata et

al., 1996). B. subtilis enthält u.a folgende für den Transport von K+ wichtige Gene:

yuaA (ktrA) und ykqB (ktrC) kodieren für zwei Proteine, die zu KtrA von V.

alginolyticus homolog sind und yubG (ktrB) und ykrM (ktrD) kodieren für zwei

Proteine, die zu KtrB von V. alginolyticus homolog sind (Holtmann et al., 2003). Bei

KtrAB und KtrCD von B. subtilis handelt es sich um die beiden Hauptaufnahmesysteme

für K+, wobei KtrAB wichtig bei einem plötzlichen osmotischen Upshift und KtrCD

wichtig für das Überleben bei längerfristig anhaltendem osmotischem Stress ist. Auch

die Kaliumaufnahme in dem Cyanobakterium Synechocystis 6803 erfolgt mittels eines

Natrium abhängigen KtrAB–Transportsystems (Berry et al., 2003). Uozumi und

11

Kollegen fanden 2004 ein drittes Genprodukt (ktrE), das für die Aktivität dieses KtrAB-

Systems notwendig zu sein scheint.

Das KtrAB–System in V. alginolyticus besteht zum einen aus der membranintegralen,

kaliumtranslozierenden Untereinheit KtrB mit einer Größe von 50 kDa. KtrB weist eine

Sequenzähnlichkeit von 36 % zu ntpJ aus E. hirae auf (Nakamura et al., 1996). Eine

Entwicklung könnte mittels Genverdopplungen oder –fusionen aus einem Monomer

eines homotetrameren KcsA-ähnlichen Kanal stattgefunden haben. KtrB wurde

zusammen mit anderen K+-Transportproteinen zu einer K+-Transporter-Superfamilie

(SKT-Proteine) zusammengefasst. Abbildung 1.2 gibt einen Überblick über die

Superfamilie von K+-Transportern. Zu dieser zählen neben KtrB (NtpJ) auch HKT1 aus

Weizen, HKT2 aus Reis, HKT1 aus Arabidopsis, Trk2 aus Pilzen, die Untereinheit

TrkH des prokaryotischen Trk-Systems und KdpA aus Prokaryoten (Abb.1.1; Durell et

al., 1999; Durell & Guy, 1999; Durell & Guy, 2000; Tholema et al., 2005). Alle SKT-

Proteine weisen eine 4-fache Wiederholung des M1PM2-Motifs auf, das zwei

Transmembrandomänen bezeichnet, die durch einen periplasmatischen P(Pore)-Loop

verbunden sind. Indem sich die vier P-Loops aus dem Periplasma in die Membran

zurückfalten, formen diese wahrscheinlich den Permeationsweg für die K+-Ionen. Fast

alle dieser K+-Transportproteine weisen konservierte Glycin-Reste innerhalb der P-

Loops auf, die den Selektivitätsfilter bilden. Die Glycine sind äquivalent zum ersten

Glycin der Selektivitätsfilter-Sequenz Thr-Val-Gly-Tyr-Gly des KcsA-Kanal-

Monomers (Tholema et al., 1999; 2005).

Zum anderen besteht das ktrAB-Transportsystem aus der membranassoziierte

Untereinheit KtrA. Für KtrA konnte eine Größe von 28 kDa ermittelt werden.

Rückschlüsse auf die Funktion der cytoplasmatischen Untereinheit KtrA konnten durch

Transportversuch von Tholema et al. (1999; 2005) gezogen werden. Der KtrAB–

Transportkomplex transportiert K+ in E. coli mit einer hohen Affinität (Km≈25 µM),

hoher Geschwindigkeit (200 nmol•min-1•mg-1 Trockengewicht) und zeigt eine

Abhängigkeit von Natriumionen. KtrB alleine dagegen transportiert K+ auch in

Abwesenheit von Natriumionen mit gleicher Affinität, aber mit einer deutlich

geringeren Transportrate (16 nmol•min-1•mg-1 Trockengewicht). Liegt KtrB alleine vor,

so kommt es auch zu einem Transport von Na+. KtrB alleine zeigt somit keine K+-

Selektivität. Aus diesen Ergebnissen kann der Schluss gezogen werden, dass KtrA dem

System die Kaliumselektivität, die Na+-Abhängigkeit und die Transportgeschwindigkeit

verleiht.

12

Abb1.2 Übersicht der Superfamilie von K+-Transportern nach Tholema, 2002. Dargestellt sind die Vertreter der Transporter–Superfamilie, wie sie nach Durell et al. (1999, 2000) zusammengefasst wurden. Farblich gleich gekennzeichnet sind Systeme, die funktionell ähnlich sind. Gelb steht für Na+-abhängige, Grün für H+ -abhängige Systeme und Blau für die P–Typ–ATPase. Die Pfeile geben die Richtung der Substrattranslokation über die Membran (Grau) an.

Vergleicht man die Aminosäuresequenz von KtrA mit der anderer K+-

Transportproteinen und K+-Kanälen (Abb.1.3), so findet man ein konserviertes Glycin–

Motiv (GXGXXG……D/E) im Bereich βAαBβB, das auch aus der Aminosäuresequenz

von TrkA und NAD+-abhängigen Dehydrogenasen bekannt ist (Nakamura et al., 1998)

(Abb. 1.3). NAD+-bindende Domänen besitzen ein strukturelles β-α-β-Motiv, das die

Bindung von NAD+ vermittelt (Branden und Tooze, 1991). Zwei βαβαβ-Einheiten

nehmen eine Anordnung ein, bei der sechs parallele β-Faltblätter von α-Helices

umgeben sind (Abb. 1.4). Die Topologie der beiden Abschnitte ist dabei identisch und

bildet eine symmetrische α/β-Struktur. Jede dieser beiden Hälften wird als „Rossmann–

Fold“ bezeichnet (Rossmann et al., 1975). Es handelt es sich hierbei um ein

Mononukleotid–Bindemotiv. Aufgrund dieses Bindemotives in der Aminosäuresequenz

von KtrA erfolgte eine Zuordnung dieser cytoplasmatischen Untereinheit zu der Gruppe

der KTN-Proteine.

Die weite Verbreitung von RCK/KTN-Domänen innerhalb verschiedenster K+-

Transportsysteme und die immer auftretende direkte Nähe zu den innersten

porenformenden Helices deuten auf eine wichtige Rolle in der Regulation und

Koordination des K+-Flusses über Membranen hin (Roosild et al., 2002).

13

--p-loop--- --inner---

--outer helix (M1)- --helix---- filter- helix (M2)

2TMMthK 1- -------------MVLVIEIIRKHLPRVLKVPATRILLLVLAVIIYGTAGFHFIEGE-------SWTVSLYWTFVTIATVGYGDYSPSTP--LGMYFTVTLI

6TMEcKch 141- --------------------------------IFAFISFTTLLFYSTYGALYLSEGFN--PRIESLMTAFYFSIETMSTVGYGDIVPVSE--SARLFTISVI

MjTrkA 1- ------------------------------------------------------------------------------------------------------

BsKtrA 1- ------------------------------------------------------------------------------------------------------

VaKtrA 1- ------------------------------------------------------------------------------------------------------

AaeKtrA 1- ------------------------------------------------------------------------------------------------------

inner helix (M2)-- --βA--- ----αA-- --βB--- ---αB--- ---βC-- -αC2TMMthK 81- VLGIGTFAVAVERLLEFLIN-----REQMKLMGLIDVAKSRHVVICGWSESTLECLRELRG---SEVFVLAEDENVRKKVLRSG---ANFVHGDPTRVSD

6TMEcKch 207- ISGITVFATSMTSIFGSLIRG---GFNKLVKGNNHTMHRKDHFIVCGHSILAINTILQLNQRGQNVTVISNLPEDDIKQLEQRLGDNADVIPGDSNDSSV

MjTrkA 1- ----------------------------------------MYIIIAGIGRVGYTLAKSLSEKGHDIVLIDI—-DKDICKKASAEID-ALVINGDCTKIKT

BsKtrA 1- ----------------------------------MGRIKNKQFAVIGLGRFGGSICKELHRMGHEVLAVDIN—-EEKVNAYASYA--THAVIANATEENE

VaKtrA 1- -----------------------------------MKTGDKQFAVIGLGRFGLAVCKELQDSGSQVLAVDIN--EDRVKEAAGFV--SQAIVANCTHEET

--αC-- -βD-- -----αD------- --βE-- ---αE---- -βF-- -----αF----- ----αG-----2TMMthK 170- LEKANVRGARAVIVDLESDSETIHCILGIRKIDES-----VRIIAEAERYENIEQLRMAGADQVISPFVISGRLMSRSIDDG----YEAMFVQDVLAE-E

6TMEcKch 304- LKKAGIDRCRAILALSDNDADNAFVVLSAKDMSSD-----VKTVLAVSDSKNLNKIKMVHPDIILSPQLFGSEILARVLNGEEINNDMLVSMLLNSGHGI

MjTrkA 58- LEDAGIEDADMYIAVTGKEEVNLMSSLLAKSYGIN------KTIARISEIEYKDVFERLGVDVVVSPELIAANYIEKLIERPG------ILDLAIVGR--

BsKtrA 63- LLSLGIRNFEYVIVAIGANIQASTLTTLLLKELDIP-----NIWVKAQNYYHHKVLEKIGADRIIHPEKDMGVKIAQSLS------DENVLNYIDLSD—-

VaKtrA 62- VAELKLDDYDMVMIAIGADVNASILATLIAKEAG-----VKSVWVKANDRFQARVLQKIGADHIIMPERDMGIRVARKML------DKRVLEFHPLGS--

AaeKtrA 59- LEEAGVFNADTAIVSIGQNVEASIFVVVILKEKG-----VKEIVAKAINQLHGKVLERLGVARVVYPEMETAIKLAHSLLLKG---LIEEIPFAPG----

---βG--- -αH- -αI- ---βH--- -βI- --βJ--- ---αJ----2TMMthK 260- STRRMVEVPIPEGSKLEGVSVLDADIHDVTGVIIIGVGRGD-ELIIDPPRDYSFRAGDIILGIGKPEEIERLKNYISA*-------------336

6TMEcKch 399- FSDNDEQETKADSKESAQK*------------------------------------------------------------------------417-

MjTrkA 144- GEAEILEFIIPEKAKVVNKKIKELGRPQD--YLIIAIYDGD-ELKI-PSGDTELKSGDRVLVLVKKDAADAIRKMFLEE*------------218

BsKtrA 150- -EYSIVELLATRKLDS--KSIIDLNVRAKYGCTILAIKHHG-DICLSPAPEDIIREQDCLVIMGHKKDIKRFENEGM*--------------222

AaeKtrA 147- --YSIFEIKTPENFHG--KSLKELDLRKRYDITVLAVKKPDGKIVVNPSGDYVLDKEDTLLVLGNKEKMVEFVENE*---------------218





MjTrkA 1- ------------------------------------------------------------------------------------------------------

BsKtrA 1- ------------------------------------------------------------------------------------------------------

VaKtrA 1- ------------------------------------------------------------------------------------------------------

AaeKtrA 1- ------------------------------------------------------------------------------------------------------





















MjTrkA 1- ------------------------------------------------------------------------------------------------------

BsKtrA 1- ------------------------------------------------------------------------------------------------------

VaKtrA 1- ------------------------------------------------------------------------------------------------------

AaeKtrA 1- ------------------------------------------------------------------------------------------------------

















Abb. 1.3 Vergleich von Aminosäuresequenzen verschiedener RCK-und KTN-Domänen. Das konservierte Glycin-Motiv im Bereich βA bis βB sowie die Scharnierregion zwisch βF und αF sind weiß hervorgehoben.

2001 stellten Jiang und Mitarbeiter mittels Kristallisierung des 6TM K+-Kanlas Kch aus

E. coli eine solche cytoplasmatische RCK-Domänenstruktur vor.

Auch in 2TM K+-Kanälen, K+-Effluxsystemen (Kef), eukaryotischen Ca2+-abhängigen

BK Kanälen und den cytoplasmatischen Untereinheiten des Trk- und des KtrAB-

Systems konnten Domänen der RCK–Familie gefunden werden (Jiang et al., 2001).

Zusammenfassend lassen sich drei Eigenschaften von RCK–Domänen nennen: 1. die

Rossmann–Fold Topologie, 2. Salzbrücken zwischen einem positiv geladenen Rest (Arg

oder Lys) am C–Terminus von α4 und einem negativ geladenen Rest (Asp oder Glu)

am N–Terminus von β6 und 3. eine hydrophobe Dimergenzfläche an der externen

Fläche von α4 (Jiang et al., 2001).

Bisher sind nicht für alle RCK–Domänen die Liganden identifiziert worden. Für den

K+-Kanal aus Methanococcus jannaschii (MthK) konnten Jiang und Mitarbeiter (2002)

die Bindung von Ca2+ zeigen.

Auch der eukaryotische BK Kanal bindet Ca2+, allerdings erfolgt hier die Bindung über

eine Serinprotease–ähnliche Domäne, die intrazellulär an die RCK–Domäne anschließt

(Jiang et al., 2001).

14

Abb. 1.4 NAD+-Bindemotiv Schema der Sekundärstruktur (links) und Topologie (rechts) der beiden, die NAD+-Bindung vermittelnden, βαβαβ- Einheiten nach Brandon & Tooze (1991).

Domänen, die innerhalb ihrer RCK–Domäne ein NAD+-bindendes Glycinmotiv

enthalten, bilden eine Untergruppe der RCK–Domänen. Diese Untergruppe wird als

KTN–Domäne bezeichnet (K+ transport nucleotide binding; Bateman et al., 2000;

Roosild et al., 2002). Ein solches Glycinmotiv findet sich bei den cytoplasmatischen

Proteinen TrkA und KtrA. Allerdings konnte eine Bindung von NAD+ bisher nur für das

TrkA–Protein gezeigt werden (Schlösser et al., 1993).

Einen weiteren Schritt in Richtung funktionaler Aufklärung von RCK/KTN–Domänen

brachten die Ergebnisse von Jiang und Mitarbeitern (2002), die an der intrazellulären

Oberfläche der membrandurchspannenden Pore von MthK einen „Gating Ring“

Abb.1.5 RCK-Domänen des K+-Kanals MthK aus M. thermoautotrophicum. Die Zylinder stellen die porenbildenden Helices dar, während die acht RCK-Domänen als blaue und rote Ovale dargestellt sind (Jiang et al., 2002).

15

bestehend aus acht RCK–Domänen fanden, der in der Ca2+-gebundenen Konformation

eine Porenöffnung begünstigt (Abb.1.5). Durch die Bindung von Ca2+ kommt es zu

einem Konformationswechsel und somit zu einer Vergrößerung des Durchmessers des

Gating–Ringes, was zu einer Öffnung des Kanals führt.

Auch Arbeiten von Niu et al. (2004) an dem Spannungs–und Ca2+-abhängigen BK–

Kanal (Large conductance Ca2+-activated K+ channel) bestätigten eine

Konformationsänderung im K+-translozierenden Teil nach der Bindung von Ca2+

(Abb.1.6). Hier kommt es durch eine Konformationsänderung in der RCK–Domäne

nach Ca2+-Bindung zu einer Zugbewegung an den S6–RCK1–Linkern, die das Gate mit

dem Gating–Ring verbinden, und dadurch das Öffnen des Gates ermöglichen (Magleby,

2003; Niu et al., 2004). Ebenfalls in Abbildung 1.5 zu sehen ist eine tetramere bzw.

oktamere Struktur der cytoplasmatischen Domäne. Die tetramere bzw. oktamere

Struktur von RCK/KTN–Domänen organisiert sich so, dass jeweils zwei Schwanz–

Schwanz wechselwirkende Untereinheiten über αF der ersten Untereinheit mit αE und

βF der zweiten Untereinheit verbunden sind.

Der Winkel zwischen den Untereinheiten wird durch ein Scharnier zwischen βF und αF

bestimmt.

Abb. 1.6 Ca2+-abhängiges Gating. Bindet Ca2+ an den intrazellulären Gating–Ring, folgt eine Erweiterung des Gating–Ringes. Das führt zu einer Zugbewegung an den S6–RCK1–Linkern und somit zu einem Öffnen des Kanals (nach Niu et al., 2004).

2002 veröffentlichten Roosild und Mitarbeiter zwei Kristallstrukturen von verkürzten

KTN–Fragmenten. Hierbei handelte es sich um ein 144-Aminosäuren–Fragment von

KtrA aus B. subtilis im Komplex mit NADH und ein TrkA–Fragment aus M. jannaschii

im Komplex mit NAD+ (Abb. 1.7). Ist NAD+ gebunden, ragt der Nicotinamidring in die

Gelenkregion hinein (Abb.1.7, A). Dabei vergrößert sich der Winkel zwischen βF und

16

αF. Die NAD+-gebundene Form wird als die inaktive Konformation angenommen. Liegt

dagegen NADH gebunden vor, befindet sich der Nicotinamidring in einer hydrophilen

Tasche zwischen den C–terminalen Enden des 4. und 5. β –Faltblattes (Abb.1.7, B).

A

B

CA

B

C

Abb.1.7 Vergleich der Konformation von verschiedenen KTN– und RCK-Domänen. (A) Schleifendiagramm der KTN–Domäne von TrkA (136 Aminosäuren) aus M. jannaschii im Komplex mit NAD+. (B) Schleifendiagramm der KTN–Domäne (144 Aminosäuren) von KtrA aus B. subtilis im Komplex mit NADH (Roosild et al., 2002). (C) Schleifendiagramm der RCK-Domäne von MthK im Komplex mit Ca2+ (Albright et al., 2006).

Die Gelenkregion bleibt in diesem Fall frei. Dabei verkleinert sich der Winkel zwischen

βF und αF. Die NADH–gebundene Konformation wird als die aktive Konformation

angenommen (Roosild et al., 2002). Die Winkeländerung in Folge der Bindung von

NAD+/NADH wurde als „conformational switch“–Mechanismus bezeichnet. Allerdings

ist die genaue Funktion von RCK/KTN–Domänen bisher nicht geklärt. Von Roosild und

Mitarbeitern (2002) wird die zentrale Aufgabe in der Regulation und Koordination des

Kaliumflusses gesehen, bezüglich deren weiter Verbreitung innerhalb verschiedener K+-

Transportsysteme und deren unmittelbarer Nähe zu den innersten, porenbildenden

Helices. In Bezug auf KTN–Domänen wird angenommen, dass das NAD+/NADH–

Verhältnis mittels „conformentional switch“ einen Einfluss auf die Regulation des

jeweiligen Transportsystems ausübt (Schlösser et al., 1993). Die Ergebnisse von

17

Roosild sind jedoch nicht unproblematisch, da ein Vergleich von sehr ähnlichen, aber

doch paralogen Proteinen (KtrA bzw. TrkA) aus dem Reich der Bakterien bzw. Archaea

angestellt wurde. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass entsprechende

Verkürzungen, wie sie zur Kristallisation von Roosild et al. (2002) verwendet wurden,

von KtrA aus V. alginolyticus keine biologische Aktivität mehr aufweisen (M.

Willenborg, 2003). Betrachtet man die in Abbildung 1.7, C dargestellte Kristallstruktur

von MthK wird erkennbar, um welchen Bereich die Fragmente von Roosild et al.

(2002) verkürzt wurden. Anhand dieser Abbildung wird ebenfalls deutlich, dass es

insgesamt an zwei Stellen zu einer Wechselwirkung zwischen zwei einen Homodimer

bildenen Monomeren kommt.

Erste Untersuchungen in Bezug auf die Ligandenbindung an KtrA konnten zeigen, dass

radioaktiv markiertes NAD+, das mittels Photoquervernetzung an gereinigtem KtrA

gebunden wurde, trotz der postulierten NAD+/NADH–Bindestelle wesentlich effektiver

durch ATP verdrängt werden konnte als durch NAD+ oder NADH (Willenborg, 2003).

Eine Testreihe mit verschiedenen Nukleotiden ergab folgende Affinitäts–Folge: ATP,

ADP > AMP > NADH > NAD+ > NADPH, NADP+. Die bisherigen Ergebnisse in

Bezug auf KtrA von V. alginolyticus lassen trotz der Zuordnung dieses Proteins zu der

Gruppe der KTN–Proteine eine andere Art der ligandenabhängigen Regulation

vermuten als bisher angenommen wurde.

18

Zielsetzung

In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob ATP oder ein anderes Nukleotid

an die cytoplasmatische Untereinheit KtrA des K+-Transportsystems KtrAB bindet und

welche Funktion diese Bindung in Bezug auf die Regulation der K+-Aufnahme mittels

KtrAB ausübt.

Die Analysen an dem KtrA–Protein wurden basierend auf den Ergebnissen von M.

Willenborg (2003) fortgesetzt. Die Ergebnisse von Rossild et al. (2002), infolge dessen

postuliert wurde, dass eine NAD+(H)–Bindung Einfluss auf die Konformation von

KTN–Domänen und somit auf die Aktivität des K+-Transportes haben soll, sollten

genauer untersucht werden, da aus den Ergebnissen von M. Willenborg (2003) bereits

ersichtlich war, das ATP radioaktiv markiertes NAD+ von gereinigtem 10xHis-KtrA

besser verdrängte als NAD+ oder NADH. Durch limitierte Proteolyse nach Zugabe

verschiedener Nukleotide sollte eine Änderung der KtrA–Konformation detektiert

werden. Mittels der Flowdialyse könnten dann Bindungskonstanten für einzelne

Nukleotide bestimmt werden und die Herstellung eines Antikörpers gegen KtrA ohne

His–Tag sollte zur Detektion eines KtrAB–Komplexes dienen. Nach erfolgreicher

Komplexdetektion sollte untersucht werden, ob die Zugabe von Nukleotiden einen

Einfluss auf die Assemblierung des KtrAB–Komplexes hat.

Um die Energiekopplung des K+-Transportes mittels KtrAB auch in vivo zu untersuchen

sollte der Stamm LB692, der weder ein K+-Transportsystem noch eine funktionsfähige

ATP-Synthase enthält, benutzt werden. Nach Transformation des Stammes mit dem

Plasmid pKT84, welches sowohl KtrA als auch KtrB enthält, sollte nach Zugabe

unterschiedlicher Energiequellen eine Abhängigkeit des K+-Transportes entweder von

ATP, der „Protonen-motorischen-Kraft“ oder beiden Komponenten untersucht werden.

19

2. Material und Methoden

2.1 Chemikalien, Enzyme und Materialien

Für diese Arbeit wurden Chemikalien, Enzyme und Materialien von folgenden Firmen

bezogen:

Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg) Superdex 200 HR10/30

Gel Filtration Calibration Kit

[32P]-NAD+

[32P]-γATP

NAP5-Säulen

Biomol (Hamburg) Dialyseschlauch

Boehringer Ingelheim (Heidelberg) Serva Silikonöl, Dichte 1,04

Duchefa ( Haarlem, NL) Rifampicin

ICN Biomedicals GmbH (Eschwege) EDTA

Invitrogen Life Technologies (Karlsruhe) Subcloning Efficiency™ DH5α™

Competent cells

Macherey-Nagel Protino®Ni 2000 prepacked columns

kit

MWG Biotech (Ebersberg) Synthetische Oligonukleotide

New England Biolabs (Frankfurt) Restriktionsenzyme

Lambda DNA, BstEII geschnitten

Novagen (Schwalbach) Factor Xa Cleavage Capture

Kit

PeqLab (Erlangen) Protein-Molekulargewichtsstandards

Qiagen (Hilden) „QIAprep-Spin-Miniprep“-Kit

„DyeEx Spin“-Kit

(Penta-His)-Antikörper

Roche Diagnostics GmbH (Mannheim) NBT-BCIP Stocklösung

Schleicher & Schüll (Dassel) Nitrocellulose-Membran,

Membranfilter, Gel-Blotting-Papier

GB002, GB005

Serva (Heidelberg) Serva Blue Vertical 101

Sigma-Aldrich (Deisenhofen) Protease-Inhibitor-Mix P8849

20

Stratagene (La Jolla, USA) „QuickChange™” Site-Directed

Mutagenese Kit

2.2 Bakterienstämme, Plasmide und Oligonukleotide

In Tabelle 2.1 sind die in dieser Arbeit verwendeten Stämme aufgelistet. Es handelt sich

mit Ausnahme des E.coli B Derivates BL21(DE3)pLysS um E.coli K-12 Derivate.

Tabelle 2.2 gibt Aufschluss über die verwendeten Plasmide und in Tabelle 2.3 sind die

verwendeten Oligonukleotide aufgeführt.

Tabelle 2.1: Verwendete E.coli-Stämme

Stamm Genotyp Referenz

BL21(DE3)pLysS F- ompT hsdSB(rB- mB

-) gal

dcm (DE3) pLysS

Studier et al. (1991)

DH5α F- Ф 80dlacZ∆M15

∆(lacZYA-argF)U169 deoR

recA endA1 hsdR17 (rK-,

mK+)

Ausubel et al. (1991)

LB2003 F- thi metE rpsL gal rha

kup1 ∆kdpABC5 ∆trkA

Stumpe et al. (1997)

XL1-blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1

hsdR17 supE44 relA1 lac

[F’ proAB laclqZ∆M15

Tn10 (TetR)]

Bullock et al. (1987)

LB690 TK1001 ∆trkG :: KmR

∆trkH :: CmR ∆sapABCDF

Harms et al. (2001)

LB692 TK1001 ∆trkG :: KmR

∆trkH :: CmR ∆sapABCDF

∆atpB-C

Harms et al. (2001)

21

Tabelle 2.2: Verwendete Plasmide

Plasmid Resistenz Eigenschaften Referenz

pET16b ampR Klonierungs- und

Überexpressionsvektor

Novagen

pEL305 ampR ktrA aus V. alginolyticus in

pET16b

E. Limpinsel, Labor-

Sammlung

pHG165 kanR Klonierungsvektor Stewart et al. (1986)

pKT84 ampR pHG165, enthält ktrAB aus V.

alginolyticus

Nakamura et al.

(1998)

pNK11 ampR ktrA aus V. alginolyticus in

pET16b mit Mutation in ktrA

kodierend für G13→A

Diese Arbeit

pNK21 ampR pKT84 mit Mutation in ktrA


Diese Arbeit

pNK12 ampR ktrA aus V. alginolyticus in

pET16b mit Mutation in ktrA


Diese Arbeit

pNK22 ampR pKT84 mit Mutation in ktrA


Diese Arbeit

Tabelle 2.3 verwendete Primer

Oligonukleotid Sequenz

KtrAG13A_forw 5`-GCTGTTATTGCTCTTGGCCGA-3`

KtrAG13A_rev 5`-TCGGCCAAGAGCAATAACAGC-3`

KtrAG15A_forw 5`-ATTGGTCTTGCCCGATTTGGT-3`

KtrAG15A_rev 5`-ACCAAATCGGGCAAGAACAAT-3`

2.3 Anzuchtverfahren

Die Anzucht der in Tab. 2.1 aufgeführten E.coli-Stämme erfolgte in KML-Medium (1

% KCl, 1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt). Durch Zugabe von 1,5 % (w/v) Agar wurden

22

Nährböden hergestellt. Die Zugabe von Antibiotika richtete sich nach der

entsprechenden Resistenz des jeweiligen Stammes bzw. Vektors. Ampicillin

(100µg/ml) wurde wahlweise durch das komplementäre Carbenicillin (100µg/ml)

ersetzt. Für Komplementationsstudien und Transportstudien erfolgte das Wachstum in

phosphatgepuffertem Minimalmedium mit einer definierten K+-Konzentration nach

Epstein & Kim (1971), das mit 1mg/ml Thiamin, 20µg/ml Methionin und 10 mM

Glukose als C-Quelle versetzt wurde. K115- und K0-Medien wurden gemäß der

gewünschten K+-Konzentration gemischt. Die Bezeichnung dieser Medien bezieht sich

auf die vorliegende K+-Konzentration in Millimolar. Minimalmediumplatten wurden

nach Epstein & Davies (1970) hergestellt. Zellkulturen wurden aerob bei 30 bzw. 37°C

in einem „Rollordrum“ (New Brunswick Scientific Co.) oder einem Trockenschüttler

(New Brunswick Scientific GmbH, Nürtingen) sowie im Wasserbadschüttler

„Aquatron“ (Infors AG, Bottmingen, Schweiz) bei 180–220 rpm angezogen. Die

Kontrolle des Wachstums erfolgte durch Messung der optischen Dichte bei 578 nm mit

einem Shimadzu Spektralphotometer UV-120-02.

2.4 Molekularbiologische Methoden

2.4.1 Plasmidisolierung

Die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte aus 5ml Übernachtkultur mittels des

„QIAprep Spin Miniprep“-Kits der Firma Qiagen (Hilden) nach Angaben des

Herstellers. Die DNA wurde in 50µl H2O anstatt in dem im Kit enthaltenen Puffer

aufgenommen. Der DNA-Gehalt der Probe wurde mit einem „BioPhotometer“ von

Eppendorf bestimmt.

2.4.2 Gerichtete Mutagenese

Eine zielgerichtete Mutagenese wurde mittels „QuickChange“ Site Directed-

Mutagenesis Kit von Stratagene (La Jolla, USA) nach Angaben des Herstellers

durchgeführt. Kontrollrestriktionen mit entsprechenden Restriktionsendonuklease und

DNA-Sequenzanalysen dienten zur Verifizierung der Korrektheit der entstandenen

Plasmid-Konstrukte.

23

2.4.3 Herstellung kompetenter Zellen und Transformation

Die Herstellung kompetenter E.coli DH5 α-, BL21pLysS(DE3)-, LB692 und LB2000-

Zellen und die Transformation dieser Zellen erfolgte nach der CaCl2-Methode nach

Sambroock et al. (1989). Zu 250µl kompetenten Zellen wurden 100-200 ng Plasmid-

DNA gegeben und der Ansatz 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock

von 45 s bei 42°C erfolgte eine weitere Inkubation auf Eis für 20 Minuten.

Anschließend erfolgte eine phänotypische Expression nach Zugabe von 1 ml KML-

Medium für 60 Minuten bei 37°C in einem Inkubationsschüttler. Aliquots des Ansatzes

wurden auf KML-Platten mit entsprechendem Zusatz von Antibiotika ausplattiert und

bei 37°C über Nacht inkubiert.

2.4.4 Restriktion von DNA

Zur analytischen Spaltung von DNA wurden entsprechend den Angaben des Herstellers

ausgewählte Restriktionenzyme und entsprechende Zusätze zu der DNA hinzugegeben

und der Ansatz 2h bei der empfohlenen Temperatur inkubiert.

2.4.5 Elektrophoretische Auftrennung von DNA

Die Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte mittels Agarose-Gelelektrophorese. Es

wurden Gele mit 0,8 % (w/v) Agarose in TAE-Puffer (40 mM Tris; 40 mM Essigsäure;

1 mM EDTA) verwendet. Die Proben wurden versetzt mit 14 % DNA-Probenpuffer

(0,25 % Bromphenolblau (w/v); 0,25 % Xylencyanol FF (w/v); 15 % Ficoll (w/v)). Die

Elektrophorese fand bei Raumtemperatur und einer konstanten Spannung von 120 V in

einem „Easycast Electrophoresis System“ Modell #B1 oder #B2 (Peqlab, Erlangen) für

30-60 Minuten statt. Mit BstEII geschnittene λ-DNA der Firma New England Biolabs

(Frankfurt) diente als Größenstandard. Das Anfärben der DNA erfolgte für 10 Minuten

in einer Ethidiumbromidlösung (Roth, 250µg/l). Die DNA wurde anschließend mittels

eines UV-Transilluminators bei 340 nm sichtbar gemacht. Die Dokumentation erfolgte

mit einer Videoprintanlage mit E.A.S.Y-Software (Herolab, Wiesloch).

24

2.4.6 DNA-Sequenzanalyse

Die Sequenzierung doppelsträngiger DNA wurde nach dem Prinzip des „Cycle

Sequencing“ durchgeführt, welches auf dem von Sanger et al., (1977) beschriebenen

Kettenabbruchverfahren mit Didesoxynukleotiden basiert. Als Primer dienten

verschiedene synthetisch hergestellte Oligonukleotide der Firma MWG Biotech

(Ebersberg), die entweder komplementär zu bestimmten Abschnitten im ktrA-Gen oder

angrenzenden Bereichen waren. Die Sequenzierung wurde in einem Endvolumen von

15µl mit 400-800ng Plasmid-DNA, 5pmol Primer und 4µl „Big Dye Terminator Ready-

Reaction“-Mix (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) in einem Thermocycler der Firma

Eppendorf (Hamburg) durchgeführt. Eine Denaturierung der doppelsträngigen DNA

erfolgte dabei für 30 sek. bei 96°C pro Reaktionszyklus. Das Anlagern der Primer

geschah für 15 sek. bei 50°C, gefolgt von einer DNA-Amplifikation für 4 Minuten bei

60°C. Nach 30 Zyklen wurde die Reaktion beendet und die Reaktionsansätze bis zur

Weiterverarbeitung bei 4°C gelagert. Mittels des „DyeEx Spin“-Kits (Quiagen, Hilden)

wurden die Reaktionsansätze nach Angaben des Herstellers gereinigt und anschließend

in einer „DNA Speed Vac“ (Savant Instruments, Farmingdale, USA) getrocknet. Die

Proben wurden dann in einem „ABI Prism 377 DNA Sequencer“ oder einem „ABI

Prism 310 Genetic Analyser“ (PE Applied Biosystems) elektrophoretisch analysiert

(Serviceleistung der Abteilung Spezielle Botanik, Universität Osnabrück). Alternativ

wurden DNA zusammen mit den entsprechenden Primer an die Firma Seqlab zur

Sequenzierung versandt.

2.5 Komplementatiostest

Zur Überprüfung der Kaliumtransportfähigkeit verschiedener Konstrukte (Tab.2.2)

wurden die Stämme LB2003, LB690 und LB692 mit den Derivaten der Verktoren

pHG165 und pKT84 transformiert und auf K30-Platten vereinzelt. Das Wachstum

dieser transformierten Stämme wurde in einer Flüssig-Kultur aus Minimalmedium mit

unterschiedlichen K+-Konzentrationen (K0,1; K0,3; K1; K3; K10; K30 und K115; siehe

2.3) mittels Messung der optischen Dichte der Kultur bei einer Wellenlänge von 578nm

ermittelt. Durch das Auftragen der erreichten optischen Dichte nach 24h Inkubation bei

37°C gegen die Kaliumkonzentration wurde das Zellwachstum dargestellt.

25

2.6 Biochemische und analytische Methoden

2.6.1 Überexpression von 10xhis-ktrA

Für die Überexpression von 10xhis-ktrA wurde ein T7-Expressionssystem (Tabor et al.,

1985) in E. coli BL21(pLysS) entsprechend der Methode von Studier (1991) genutzt.

Das in diesem Stamm enthaltene pLysS-Plasmid kodiert das T7-Lysozym, welches ein

natürlicher Inhibitor der T7-Polymerase ist und so die Transkription von Zielgenen in

uninduzierten Zellen reduziert (Mierendorf et al., 1994). Die Überproduktion von

pEL305, transformiert in E. coli BL21(pLysS)-Zellen, erfolgte in einem Kulturvolumen

von 1 L, bei 30°C und unter aeroben Bedingungen. Das zur Anzucht verwendete KML-

Medium wurde mit Ampicillin (100µg/ml) und Chloramphenicol (1 mg/ml) versetzt. Zu

Beginn wurden Zellen aus einer ebenfalls in Anwesenheit von Ampicillin und

Chloramphenicol angezogenen Übernachtkultur dem Medium so zugegeben, dass sich

eine Anfangs-OD578 von 0,1 ergab. Nach Erreichen einer OD578 von 0,25 – 0,3 wurde

die Expression des lacUV5-Promotors mittels Zugabe von 1 mM IPTG gestartet. Nach

20 Minuten wurden 100µg/ml Rifampicin zugegeben, welches die Transkription

anderer Gene durch die zelleigene Polymerase hemmt und die Transkription der

Zielgene durch die T7-Polymerase begünstigt. Nach einer weiteren Inkubation für 2 – 3

h bei 30°C wurden die Zellen bei 10.000 x g für 15 Minuten und 4°C in einer Sorvall-

Zentrifuge vom Modell RC5C oder RC 5Cplus (DuPont de Nemours GmbH, Bad

Homburg) zentrifugiert. Das entstandene Zellpellet wurde in Puffer A (50 mM

Tris/HCL pH8,0; 1 mM EDTA; 0,3 M NaCL) resupendiert und erneut unter gleichen

Bedingungen zentrifugiert. Die pelletierten Zellen wurden bei -80°C gelagert. Eine

Kontrolle der Überproduktion wurde mittels SDS-PAGE (siehe 2.6.6) durchgeführt.

Dazu wurden während der Anzucht aus der Zellkultur zu verschiedenen Zeitpunkten 1

ml-Proben entnommen, welche 3 Minuten bei 10.000 x g in einer Eppendorf Zentrifuge

5415 D zentrifugiert und das Zellpellet anschließend in der entsprechenden Menge 2x

PAP (4 % SDS (w/v); 12 % Glyzerin (v/v); 50 mM Tris/HCl pH 6,8; 2 % β-

Mercaptoethanol (v/v); 0,01 % Serva Blau G (w/v)) und Tris/HCl (50 mM)

aufgenommen, dass der Proteingehalt bei 1 µg/µl lag (Umrechnungsfaktor: 0,15 mg

Protein/ml bei einer Zellkultur mit OD578 = 1).

26

2.6.2 Zellaufschluss

Das Aufschließen der Zellen erfolgte durch eine Ultraschall-Behandlung. Das Zellpellet

aus einer 1 l-Ernte (ca. 3 x 1010 Zellen) wurde dazu in 18 ml Puffer A aufgenommen,

1:100 mit Protease-Inhibitor Cocktail P8849 (Sigma) versetzt und in einem Branson

B15 Sonifier Cell Disruptor (Branson, Shelton, USA) beschallt. Durch vier- bis

siebenmaliges Beschallen bei einem Output von 7 für 30 sek. wurden die Zellen

aufgeschlossen. Dabei sollte der OD578 –Wert um das 5 – 10fache abgenommen haben.

Das Beschallen erfolgte unter Kühlung des Ansatzes in einem Eiswasserbad.

Zelltrümmer und nicht aufgeschlossene Zellen wurden bei einer folgenden

Zentrifugation für 15 Minuten bei 28.000 x g (Sorvall) und 4°C sedimentiert. Eine

Trennung der Membranfraktion von den löslichen Proteinen erfolgte mittels

Ultrazentrifugation für 45 Minuten bei 350.000 x g bei 4°C in einer Beckmann TL100-

Zentrifuge. Die KtrA enthaltende Fraktion der löslichen Proteine wurde bis zur

Weiterverarbeitung in flüssigem Stickstoff gelagert (Proteingehalt: 2-5 mg/ml).

2.6.3 Reinigung von 10xHis-KtrA mittels Ni2+- Affinitätschromatographie

Die Reinigung von 10xHis-KtrA erfolgte mittels „Protino®Ni 2000 prepacked columns

kit“ der Firma Macherey-Nagel (Macherey-Nagel GmbH & Co KG, Düren) nach

Angaben des Herstellers. Zusätzlich wurden dem Waschpuffer 5 mM Imidazol und 30

mM 2-Mercaptoethanol und dem Elutionspuffer ebenfalls 30 mM 2-Mercaptoethanol

beigefügt. Das Waschvolumen wurde auf 50 ml erhöht. Zur Kontrolle der Aufreinigung

von 10xHis-KtrA wurden von allen Teilschritten der Aufreinigung 10µl–Proben

genommen, mit 10µl 2x PAP versetzt und auf ein 10%iges Schägger-Glyzerin-Gel

aufgetragen.

2.6.4 Umpufferung von gereinigtem 10xHis-KtrA

Da Imidazol bei weiteren biochemischen Untersuchungen störend wirken könnte, wurde

10xHis-KtrA in einen Dialysepuffer ohne Imidazol (20 mM 2-Mercaptoethanol; 0,2 M

NaCl; 1 mM EDTA; 20 mM NaH2PO4; pH 7,0) umgepuffert. Dies geschah mit Hilfe

von NAP-5 columns der Firma Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg). Die Säule

wurde mit 10 ml Dialysepuffer äquilibriert. 500 µl einer Elutionsfraktion wurden auf

27

eine Säule aufgebracht und in 200 µl-Schritten wurde 10xHis-KtrA mit Dialysepuffer

elutiert. Der Proteingehalt in diesen Fraktionen wurde mittels Proteinbestimmung nach

Bradford und die Reinheit wurde über eine SDS-PAGE kontrolliert. Entsprechende

Fraktionen wurden vereinigt und für weitere biochemische Untersuchungen verwendet.

2.6.5 Proteinbestimmung

Die Proteinbestimmung wurde modifiziert nach Bradford (1976) durchgeführt. Hierbei

wurden 70 mg Coomassie Brilliant Blau G-250 (Serva) in 50 ml 96%igem Ethanol

gelöst. Zu dieser Lösung wurden 100 ml 85%ige Phosphorsäure gegeben und mit

H2Obidest auf ein Endvolumen von 1 l eingestellt. Für die Eichgerade wurde

Rinderserumalbumin (BSA) verwendet. Zu einem Probenvolumen von 20 µl wurde 1

ml Bradford-Reagenz gegeben, 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann die

Absorption mit einem Shimadzu Spektralphotometer UV-120-02 gemessen.

2.6.6 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen erfolgte durch SDS-PAGE nach

Schägger et al. (1987). Dazu wurden 0,75 mm dicke Flachgele der Größe 7 x 10 cm mit

einer 10 %igen Acrylamidkonzentration verwendet. Die Proteinproben wurden vor dem

Lauf mit SDS-Probenauftragungspuffer (PAP; Endkonzentration: 4 % SDS (w/v); 12 %

Glyzerin (v/v); 50 mM Tris/HCl pH 6,8; 2 % 2 - Mercaptoethanol (v/v); 0,01 % Serva

Blau G (w/v)) versetzt und für 30 Minuten bei 40°C inkubiert. Als Proteinstandard

wurde „peqGOLD Protein-Marker“ (Peqlab) verwendet. Der Gellauf wurde in der

Elektrophoresekammer „Blue Vertical 101“ von Serva (Heidelberg) für Minigele mit

einem Vorlauf bei 50 V für ca. 20 Minuten und einem Gellauf bei konstant 150 V

durchgeführt. Die aufgetrennten Proteine in den Gelen wurden anschließend mit Serva

Blau G-250 (Coomassie Blau) nach Weber & Osborn (1969) detektiert, wobei die

Färbelösung zur Fixierung der Proteine zusätzlich 10 % TCA (w/v) enthielt. Das

Entfärben der Gele erfolgte in 5 % Methanol (v/v) und 7,5 % Essigsäure (v/v).

Kurzzeitig wurden die Gele in einer Glyzerin-Ethanol-Lösung mit 2 % Glyzerin (v/v)

und 25 % Ethanol (v/v) aufbewahrt und zur längeren Konservierung anschließend

zwischen Folie oder auf Gel-Blotting-Papier GB002 (Schleicher & Schüll) in einem

28

„Slab Gel Dryer SE 1160“ Vakuumtrockner (Hoefer, San Francisco, USA) bei 80°C für

90 Minuten getrocknet.

2.6.7 Immunoblot

Gelelektrophoretisch aufgetrenntes 10xHis-KtrA, KtrA, bei dem der His-Tag mittels

Faktor-Xa abgespalten wurde, His-KtrB und Membranfraktionen, die His-KtrB

enthielten wurden mittels Western Blotting (auch Protein- oder Elektroblotting) via

Elektrotransfer mit Hilfe der Nassblotkammer der Firma BioRad (München) auf eine

„Protan Nitrocellulose Membran“ (Schleicher&Schüll) übertragen. Der

Elektrotransfer erfolgte bei 500 mA für 3h unter Verwendung des folgenden

Blotpuffers: 125 mM Tris-HCl pH 8,6; 192 mM Glyzerin; 20 % Methanol (v/v). Durch

die Übertragung auf die Nitrocellulosemembran wurden die Proteine für die folgende

Immundetektion immobilisiert. Die Visualisierung der übertragenden Proteinbanden

erfolgte durch kurzes reversibles Anfärben mit PonceauS-Lösung (0,2 % PonceauS

(w/v); 3 % TCA (v/v)) und anschließendes Spülen mit H2Odest zur Entfernung des

überschüssigen Farbstoffes. Im Folgenden wurde die Membran durch Waschen mit

TBS-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl) äquilibriert und unspezifische

Bindestellen durch Inkubation für 1 Stunde in Blocking-Puffer (3 % BSA (w/v) in TBS-

Puffer) bei Raumtemperatur blockiert. Den einstündigen Inkubationszeiten folgten

jeweils zehnminütige Waschschritte mit TBS-Puffer und mit TBS-TT-Puffer (20 mM

Tris-HCl pH 7,5; 500 mM NaCl; 0,2 % Triton X-100 (v/v); 0,05 % Tween 20 (v/v)) bei

Raumtemperatur. Die immunologische Detektion erfolgte mittels eigens für diese

Arbeit hergestellten Antiseren gegen 10xHis-KtrA und KtrA (Charles River, Kisslegg)

und mit dem Penta-His-Antikörper (1:2000) (Qiagen, Hilden). Als sekundärer

Antikörper diente bei Anwendung des KtrA-Antikörpers ein Goat Anti-Rabbit

Antibody labeled with alkaline Phosphatase“ (Sigma), bei Verwendung des Penta-His-

Antikörpers ein „ImmunoPure Antibody Goat Anti-Maus-IgG, gelabeld with alkaline

Phosphatase“ (Pierce, Rockford, USA). Diese wurden in Blocking-Puffer im Verhältnis

1:10.000 eingesetzt. Die Initiierung der Farbreaktion zur Visualisierung der spezifisch

detektierten Proteine erfolgte durch Inkubation mit 1 % NBT/BCIP-Lösung (v/v) in 100

mM Tris-HCl pH 9,5 mit 100 mM NaCl und 50 mM MgCl2. Durch Spülen der

Membran mit H2Odest wurde die Farbreaktion gestoppt.

29

2.6.8 UV-Spektroskopie

Im Zuge spektroskopischer Messungen wird die Intensität elektromagnetischer

Strahlung in Abhängigkeit der Wellenlänge gemessen werden. Der UV-

spektroskopische Bereich umfasst die Wellenlängen von 200 bis 400nm. Werden die

Elektronen eines Moleküls durch die UV-Strahlung angeregt, so kann dies in einem

Photometer gemessen werden. Enthält die Aminosäuresequenz eines Proteins

aromatische Aminosäuren, so ist es möglich, mittels des entsprechenden

Extinktionskoeffizienten und der Absorption bei der entsprechenden Wellenlänge die

Proteinkonzentration zu bestimmen. Die Messung von gereinigtem und umgepufferten

10xHis-KtrA und KtrA fand in einem „Uvikon 943 Double Beam UV/VIS

Spectrophotometer“ (Kontron Instruments, Watford, UK) in einem

Wellenlängenbereich zwischen 250 bis 400 nm statt. Das Daten-Intervall betrug 0,5 nm

bei einer Geschwindigkeit von 50 nm pro Minute.

2.6.9 Gelfiltration

Gereinigtes 10xHis-KtrA, 10xHis-KtrA nach Inkubation mit ATP und KtrA nach

Abspaltung des His-Tags mittels Faktor Xa wurden auf eine fertiggepackte 10 nm x 300

nm Gelfiltrationssäule (Superdex 200 HR 10/30, Amersham Pharmacia Biotech)

aufgetragen, die zuvor mit Dialysepuffer äquilibriert wurde. Die Säule hat ein

Trennungsvermögen von 10 bis 600 kDa und ein Bettvolumen von 24 ml. Die Säule

wurde für die Filtration entsprechend den Angaben des Herstellers vorbereitet und an

das FPLC-System „ÄKTA design“ (Amersham Pharmacia Biotech) angeschlossen. Die

Fließgeschwindigkeit betrug 0,05 ml/min. Der Durchfluss wurde in 0,5 ml-Fraktionen

fraktioniert. Die Eichung erfolgte mit Hilfe des „Gel Filtration Calibration Kits“,

Amersham Pharmacia Biotech), das Proteine mit bekannten Molekulargewichten

enthält. Die Eichung erfolgte unter identischen Bedingungen wie der Proben-Lauf.

2.6.10 Antikörperherstellung gegen 10xHis-KtrA und KtrA

Die Immunisierung und anschließende Serumgewinnung wurde durch die Firma

Charles River Laboratories (Kisslegg) durchgeführt. Hiefür wurde mittels Ni2+-

Affinitätschromatographie und Gelfiltration aufgereinigtes 10xHis-KtrA und KtrA nach

30

Entfernung des His-Tags durch Inkubation mit Faktor Xa und anschließender

Entfernung des His-Tags über Affinitätschromatographie zur Immunisierung verwendet.

2.6.11 Overlayblot

Das Prinzip des Overlayblots beruht auf der Durchführung des bereits beschriebenen

Immunoblots (2.6.6). 6xHis-KtrB enthaltende Membranfraktionen wurden mittels

Elektrotransfer aus einem SDS-Gel auf Nitrozellulose übertragen. Nach Trennung der

einzelnen Spuren wurden die einzelnen Fraktionen mit gereinigtem KtrA und

unterschiedlichen Konzentrationen von verschiedenen Nukleotiden für 1 Stunde bei

Raumtemperatur inkubiert. Der Nachweis von 6xHis-KtrB erfolgte mit einem Penta-

His-Antikörper (2.6.6) und von KtrA mittels des KtrA-Antikörpers (2.6.10).

2.6.12 Limitierte Proteolyse von 10xHis-KtrA und KtrA

Trypsin ist eine Endopeptidase, die Proteine hinter Lysin- oder Argininresten

proteolytisch spaltet. Das Temperaturoptimum von Trypsin liegt bei 37°C.

Entsprechend wurden diese Versuche bei dieser Temperatur durchgeführt. Aufgrund

von Vorversuchen wurde ein Trypsin (in 50 mM Tris/HCl pH 7,5)- KtrA-Verhältnis

von 1:50 gewählt. Die Probenentnahme erfolgte 5 Minuten vor der Trypsin-Zugabe

(Sigma-Aldrich) und dann jeweils nach 1, 10, 30, 60 und 120 Minuten nach Start der

Reaktion. Gestoppt wurde die Reaktion durch Zugabe von Trypsin-Inhibitor (Sigma-

Aldrich) und SDS-Probenauftragepuffer (2xPAP) (2.6.6). Der Trypsin-Inhibitor (in 50

mM Tris/HCL, pH 7,5) wurde in einem äquimolaren Verhältnis zu Trypsin eingesetzt.

Das Ergebnis der Proteolyse wurde mittels 12 %igem Schägger-Glyzerin-Gels

visualisiert.

2.6.13 Nukleotid-Bindestudien mittels Flowdialyse

Die Analyse des Bindungsverhaltens von verschiedenen Nukleotiden an 10xHis-KtrA

wurde mit Hilfe der Flowdialyse nach Colowick et al. (1969) durchgeführt. Die zwei

Kammern einer Dialyseapparatur (oberes Kammervolumen 1 ml, Abteilung

Mikrobiologie, Fachbereich Biologie/Chemie, Universität Osnabrück) waren durch eine

Dialysemembran (Spectra/Pro Biotech Cellulose Ester, MWCO100.000, Spectrum,

31

Kalifornien, USA) getrennt. Durch die untere Kammer floss Dialysepuffer (2.6.4) mit

einer Flussrate von 1 ml/min (Pumpe „RP G50“, Fa.Fluid Metering, Oyster Bank,

USA), der in einem mit Szintillationsröhrchen bestückten Fraktionssammler (SuperFrac,

Pharmacia) zu je 20 Tropfen gesammelt wurden. Zunächst wurde die Diffusion eines

Nukleotids in Abwesenheit von Protein gemessen. Hierzu wurden 1 ml Dialysepuffer

und 2 µCi eines radioaktiv markierten Nukleotids eingesetzt. Mit der Zugabe des

Nukleotids wurde die Fraktionierung gestartet. Danach wurden 0,5–0,8 mg/ml von

10xHis-KtrA in Dialysepuffer und 2 µCi des radioaktiv markierten Nukleotids in die

obere Dialysekammer gefüllt. Nach 10 Fraktionen wurde unmarkiertes Nukleotid

zugegeben, um das gebundene radioaktiv markierte Nukleotid von der Bindestelle zu

verdrängen. Alle Fraktionen wurden mit 4 ml Szintillationsflüssigkeit (EcoLume, ICN)

versetzt, gründlich gevortext und die enthaltene Menge an Radioaktivität in einem

Szintillations-Zähler („TriCarb 2300TR“, Fa. Hewlett-Packard, Merridan, USA)

ausgewertet (Messprotokoll: 10 Minuten Zählzeit je Probe, Einfachmessung, keine „2

Sigma Coincidence“, Quenching: SIS, Regionen-Limits: A 5,0 bis 1700, B 50 bis 1700,

C 0 bis 0). Für eine erste Auswertung wurde die Aktivität gegen die Fraktionsnummer

aufgetragen.

2.6.14 ATPase–Aktivitäts-Test

Die ATPase-Aktivitäts-Tests erfolgten mittels Pi – Nachweis nach Fiske & Subbarow

(1925) in einer „ATPase–Maschine“ nach Arnold et al., 1975. Alle Messungen fanden

bei 37°C statt. Zunächst wurde eine Standardlösung (5x 10-5 M KH2PO4) gemessen.

Danach wurden 9,8 ml einer Tris/HCl–Lösung (50 mM, pH 8,0) zu 0,1 ml MgCl2 (100

mM) und x µl Proben (hier 20 und 40 µg Protein) gegeben. Der Ansatz wurde kurz

gemischt und dann 2 Minuten bei 37°C vorinkubiert. Danach wurden 0,1 ml einer 100

mM ATP–Lösung zugegeben, kurz gemischt und direkt gemessen. Gemessen wurde bei

578 nm bei einer Schreibergeschwindigkeit von 5 mm/min.

32

2.6.15 Energiekopplung von KtrAB in vivo

2.6.15.1 Bestimmung der K+-Aufnahmaktivitäten in intakten Zellen

Ein Kulturvolumen von 400 ml (Minimalmedium, K30) wurde mit Zellen des Stammes

LB692(pKT84) aus einer stationären Übernacht-Kultur so angeimpft, dass ein Anfangs-

OD578 von 0,1–0,2 vorlag. Das Wachstum der Zellen erfolgte bei 37 °C aerob. Nach

Erreichen einer OD578 von 0,8 wurden die Zellen bei 10.000 x g für 10 Minuten bei 4

°C in einer Sorvall (SLA 3000-Rotor) geerntet und drei Mal in Minimalmedium (K0)

gewaschen. Um die Zellen von Kalium und Energie zu entleeren folgte eine Inkubation

in Minimalmedium (K0), Ampicellin (100 µg/ml) und 5 mM 2,4-Dinitrophenol bei 37

°C aerob (Rhoads & Epstein, 1977) für 150 Minuten. Im Anschluss an diese

„Hungerphase“ folgte eine erneute Ernte der Zellen. Es folgten drei Waschschritte in 75

mM NaPO4, pH 7,0, 0,4 mM MgSO4, 100 µg/ml Ampicellin. In Experimenten, in denen

der Effekt von Arsenat getestet wurde, wurden die Zellen nach der Hungerphase in 75

mM Hepes, pH 7,0, 0,4 mM MgSO4 und 100 µg/ml Ampicellin resuspendiert. Im Zuge

des letzten Waschschrittes wurden die Zellen auf einen OD578 = 30 eingestellt und im

Folgenden für den eigentlichen Transportversuch auf OD578 = 3 herunterverdünnt

(entspricht 1 mg/ml Trockengewicht). Der Transportversuch fand unter aeroben

Bedingungen bei Raumtemperatur statt. Es erfolgte eine Vorinkubation der Zellen mit

verschiedenen Energiequellen (Ansatz 1: Glukose; Ansatz 2: Glukose und 2,4-

Dinitrophenol; Ansatz 3: Succinat; Ansatz 4: ohne Energiequelle) für 30 Minuten. Die

Kaliumaufnahme wurde mittels Zugabe von 2 mM KCl gestartet und durch Entnahme

einer 1 ml Probe zu unterschiedlichen Zeitpunkten, gefolgt von einer zweiminütigen

Zentrifugation bei 5000 x g durch 200 µl Silikonöl mit einer Dichte von 1,04 (Serva,

Heidelberg) gestoppt. Das Silikonöl diente der Trennung der Zellen vom kaliumhaltigen

Medium. Anschließend wurden die Zellpellets in 1 ml 5 %-iger TCA-Lösung gevortext

und bei – 20 °C eingefroren. Nach 5 Minuten Inkubation bei 95 °C folgte eine Zugabe

von 3 ml 3,7 M CsCl-Lösung und kräftiges Vortexen des Ansatzes. Die so

aufgeschlossenen Zellen wurden im Folgenden 20 Minuten bei 5000 rpm (Adapter

Heraeus Variofuge RF, Rotor Sepatech Kat.Nr.: 5315) abgedreht. Der sich nun im

Überstand befindliche interne Kaliumgehalt via Elex 6361-Flammenphotometer der

Firma Eppendorf bestimmt. Der Kaliumgehalt in Bezug auf das Trockengewicht der

Zellen wurde gegen die Zeit aufgetragen.

33

2.6.15.2 Bestimmung des cytoplasmatischen ATP-Gehaltes

Zur Bestimmung des cytoplasmatischen ATP – Gehaltes (Kimmich et al., 1975) wurden

zeitgleich mit der K+-Probe 200 µl der Zellsuspension entnommen und mit 200 µl

eiskalter 12 %iger HClO4 mit 1 % Xylenecyanol gemischt. Nach 30 minütiger

Inkubation auf Eis wurde denaturiertes Protein abzentrifugiert und der Überstand mit 2

M KOH und 0,3 M MOPS auf pH 7,0 gebracht. Die neutralisierten Proben wurden

eingefroren, auf Eis wieder aufgetaut und zur Pelletierung des ausgefallenen Salzes

abzentrifugiert. Der ATP–Gehalt des Überstandes konnte dann mittels Luciferin–

Luciferase–Methode bestimmt werden. Dazu wurden 50 µl Proben–Überstand mit 50 µl

Luciferin–Lösung (Sigma, 1:5 mit H2O verdünnt) und 900 µl ATP–Puffer (20 mM

Glycylglycin, 5 mM Na–Arsenat und 4 mM MgSO4, pH 8,0) gemischt und die

Lumineszenz nach 10 Sekunden im Biolumineszenzgerät (Biolumal LB 9500T, Bertold)

abgelesen. Durch Vergleich der Lumineszenz der Proben mit einer parallel

aufgearbeiteten Eichreihe wurden die ATP–Gehalte der Proben bestimmt.

2.6.15.3 Bestimmung der Prolin und Glutamin Aufnahmaktivität

Das Wachstum der Zellen, die Ernte und Depletion der Zellen von K+ und ATP

erfolgten genau wie in 2.6.16.1. Für den eigentlichen Versuch wurden dann aber die

Zellen auf OD578= 2 herunter verdünnt. Der Transportversuch fand unter aeroben

Bedingungen bei Raumtemperatur statt. Es erfolgte eine Vorinkubation der Zellen mit

verschiedenen Energiequellen (Ansatz 1:Glukose; Ansatz 2: Glukose und 2,4-

Dinitrophenol; Ansatz 3: Succinat; Ansatz 4: ohne Energie) und 2 mM K+ für 30

Minuten. Bei t = 0 wurden 2 µM [14C]–Glutamin (40 nCi ml-1) oder 4 µM [14C] –Prolin

(100 nCi ml-1) zugegeben. Bei den Aufnahmeexperimenten mit Prolin enthielt der

Puffer A bereits 2 mM KCl. Für die Bestimmung der aufgenommenen Menge an

Glutamin oder Prolin wurden 0,3 ml Probe zu bestimmten Zeitpunkten entnommen und

durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,45 µm (Macherey & Nagel) filtriert. Die

Zellen auf dem Filter wurden zwei mal mit einer 100 mM LiCl–Lösung gewaschen,

getrocknet und die Menge an Radioaktivität mittels eines Szintillations-Zählers

(„TriCarb 2300TR“, Fa. Hewlett-Packard, Merridan, USA) bestimmt.

34

3. Ergebnisse

3.1 Overlay vorhandener Kristallstrukturen von verschiedenen KTN – und RCK–

Domänenstrukturen

Zu Beginn meiner Studien erstellte ich in Zusammenarbeit mit Herrn Dipl. Biol. Henrik

Strahl einen Overlay der beschriebenen Kristallstrukturen von KTN- und RCK–

Domänen (Abb. 3.1). Vergleicht man die vier zur Verfügung stehenden monomeren

Domänenstrukturen von verschiednen K+-Transportern, so lassen sich eben diese

Strukturen sehr gut übereinander legen, trotz ihrer Herkunft aus unterschiedlichen

Organismen und der Bindung verschiedener Liganden. Wegen kleiner Unterschiede im

Scharnierwinkel zwischen βF und αF divergieren die C-Termini der αF–Helices

räumlich.

Die beiden Strukturen, die als die aktiven Konformationen beschrieben wurden (Abb.

3.1, rot und lila), zeigen dabei den größten Winkelunterschied zueinander. Die beiden

Abb. 3.1 Vergleich von KTN– und RCK–Domänenstrukturen. Die unterschiedlichen Farben stellen die verschiedenen Proteinketten dar. Rot, KtrA–Fragment aus B. subtilis im Komplex mit NADH; blau, TrkA–Fragment aus M. jannasschii im Komplex mit NAD+; grün, Fragment der RCK - Domäne des Kch–Kanals aus E. coli; lila, Fragment einer RCK–Domäne des K+-Kanals aus M. thermoautotrophicum im Komplex mit Ca2+.

35

als inaktiv angenommenen Konformationen weisen einen mittleren Winkelunterschied

(Abb.3.1, grün und blau) im Vergleich zu den beiden angeblich aktiven Konformationen

auf. Dies könnte darauf hinweisen, dass nicht nur der Scharnierwinkel zwischen den

Dimeren aktivierend bzw. inaktivierend auf den K+-Transportprozess wirkt, wie es bei

dem „confo

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Nukleotidbindung an KtrA, der cytoplasmatischen Untereinheit des K-Aufnahmesystems ...... · 2018. 6. 6. · 3.7.1 Überexpression und Aufreinigung zweier KtrA–Varianten mit Aminosäureaustauschen