144 G. LOSE und H. WEDDIGE Bd. 636

NEUE M~GLICHKEITEN ZUR KNUPFUNG DER PEPTIDBINDUNG von GUNTER LOSSE und HORST WEDDIGE

Aus dem Institut fur Organische Chemie der Universitat Halle/Saale Eingegangen am 23. Mai 1960

Cbo-aminosauren reagieren bei Gegenwart von Cyanamid und seinen Sub- stitutionsprodukten mit Aminosaureestern unter Wasserabspaltung und Knupfung der Peptidbindung. - Es wird die Darstellung von a-Isothiocyan- fe t t shren und -fettsaureestern aus Aminosauren und ihren Estern mit Schwefel-

kohlenstoff beschrieben und ihre Anwendung fur Peptidsynthesen gezeigt.

In den letzten Jahren haben als Mittel zur Kniipfung der Peptidbindung wasser- abspaltende Verbindungen mit reaktionsfahigen C -C- oder C -N-Mehrfachbin- dungen wie Alkoxyacetylene, Carbodiimide oder Ketenimine 1) Bedeutung gewonnen. Verbindungen mit ahnlichen strukturellen Merkmalen sind die Cyanamide, welche aus Bromcyan und sekundaren Aminen leicht zuganglich sind; ihr Grundkorper reagiert in der tautomeren Form als Carbodiimid:NI C.NH2 + HN:C:NH.

Wie sich zeigte, liefern Cyanamid und seine Substitutionsprodukte wie Diathyl-, Diphenyl- und Dibenzyl.cyanamid in der Tat beim Umsetzen mit Cbo-aminosauren und Anilin oder Aminosaureestern die entsprechenden Carbobenzoxy-aminosaure- anilide oder Carbobenzoxy-dipeptidester. Die besten Ausbeuten von 60 -70 % werden erzielt, wenn die Reaktion 2 Stdn. ohne Losungsmittel bei 100” ausgefuhrt wird. Unter den verschiedenen Cyanamiden erwiesen sich dabei die Diathylverbindung und der Grundkorper als besonders wirksam.

Diese Umsetzung beruht, ahnlich wie bei der Carbodiimidmethode2), auf einer Addition der Carboxylgruppe der Aminosaure an die C = N-Dreifachbindung des Cyanamids unter Bildung eines substituierten Aminoacyl-isoharnstoffes, der dann aminolytisch zum Dipeptid- und Harnstoff-Derivat aufgespalten wird:

NH-Cbo C - N NH-Cbo I I I .R1

R-CH-CO2H + N --f R-CH-C02-C-N’ R1’ ‘R2 NH I \ ‘Rg

N

Die als Umwandlungsprodukte der Cyanamide anfallenden Harnstoffe konnten neben den Cbo-dipeptidestern isoliert und eindeutig identifiziert werden.

1 ) M. GOODMAN und G. W. KENNER, Advances Protein Chem. 12, 465 (1957). 2 ) J. C. SHEEHAN und G. P. HESS, J. Amer. chem. SOC. 77, 1067 (1955); J. C. SHEEHAN

und D.-D. H . YANG, ebenda 80, 1154 (1958).

1960 Neue Moglichkeiten zur Kniipfung der Peptidbindung 145

Zur Priifung der Methode haben wir auf diesem Wege eine Reihe inaktiver wie optisch aktiver Cbo-dipeptidester und Cbo-dipeptide synthetisiert. Ein Riickgang der optischen Aktivitat konnte dabei nicht festgestellt werden.

Eine zweite Moglichkeit zur Synthese der Peptidbindung wurde von uns in der Anwendung der a-Isothiocyan-fettsaureester gefunden. Aminosaureester setzen sich in bekannter Weise rnit Schwefelkohlenstoff zu den entsprechenden Dithiocarb- aminaten3-5) um. Hieraus erhielten wir durch Abspaltung von Schwefelwasserstoff mit Schwermetallsalzen, z. B. rnit Quecksilber(I1)-chlorid in acetonischer Lijsung, glatt und in guter Ausbeute die a-Isothiocyan-fettsaureester, Verbindungen, die bisher nur vereinzelt rnit Hilfe von Thiophosgen hergestellt wurden6).

NH2 NH- C S- SH N=C= S

R-CH-CO2R + CS2 ~ -+ R-CH-COzR' -~ R-CH-CO2R' I I - " 2 5 I

Bei mehrstiindigem Erhitzen auf 150" reagieren diese Senfole rnit Cbo-aminosauren entsprechend der GOLDSCHMIDTSChen Peptidsynthese'l), wobei unter Entwicklung von Kohlenoxysulfid der Cbo-dipeptidester in 80-proz. Ausbeute gebildet wird:

NH-Cbo NH-Cbo I

-+ R-CH-CO-NH f cos R-CH-COzH + N=C=S ~

I

I

R'-CH- C 0 2 R ' I

R - CH - C 0 2 R '

In den bisherigen Versuchen sind Racemisierungserscheinungen auch bei dieser Methode nicht nachweisbar.

Entsprechend den Aminosaureestern liefern auch die freien Aminosauren mit Schwefelkohlenstoff bei nachtraglichem Entzug von Schwefelwasserstoff Senfole. Diese sind jedoch sehr labil und nicht isolierbar. Sie reagieren als Aminosaurederivate rnit zwei aktiven Funktionen bereits bei Zimmertemperatur sofort weiter unter Bil- dung von Polyaminosauren:

R-CH-COzH R-CH-CO R-CH-CO-

I >o __ --t [ -AH -+ n

HN--CS n l

N=C= S

Die Methode eignet sich wie die Zersetzung der LEucHsschen Korper zur Poly- merisation der Aminosauren. Wahrscheinlich entsteht auch hier intermediar unter RingschluB des Senfols ein den LEucHsschen Korpern analoges schwefelhaltiges Anhydrid.

3) H. KORNER, Ber. dtsch. chem. Ges. 41, 1901 (1908). 4) E. FISCHER, Ber. dtsch. chem. Ges. 34, 433 (1901), und zwar S. 441. 5 ) R. ZAHRADNIK, Chem. Techn. 11, 546 (1959). 6 ) T. B. JOHNSON und A. A. TICKNOR, J. Amer. chem. SOC. 40, 636 (1918). 7) ST. GOLDSCHMIDT und M. WICK, Liebigs Ann. Chem. 575, 217 (1952).

Liebigs Ann. Chem. Bd. 636 10

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BESCHREIBUNG D E R V E R S U C H E *

Ausgangssiojje: Cbo-glycin, Schmp. 121"; Cbo-DL-ahin, Schmp. 114- 115"; Cbo-DL- phenylalanin, Schmp. 103"; Cbo-L-phenylalanin, Schmp. 123--125", = +5.0" (c = 5.0 in Eisessig), aus Chlorkohlensaurebenzylester und der entsprechenden Aminoslure 8). - Glycin-, DL-Ahin- , DL-Phenylahnin-, L-Alanin- und L-Leucin-athylester durch Veresterung der Aminosaure mit absol. ~thanol/Chlorwasserstoff 9) und Freisetzung des Esters aus seinem Hydrochlorid mittels ammoniakalischem k h e r 1 0 ) .

Cyanamid- Methode Cyanamid: Aus technischem Kalkstickstoff 11). - Diathylcyanamid: Aus Bromcyan und

Diathylamin 12). - Diphenylcyanamid: Durch Einwirkung von Bromcyan auf Diphenyl- ainin 1)). - Dibenzylcyanarnid: Durch Umsetzung von Kalkstickstoff mit Benzylchlorid 14).

1. Reaktionen mit Dibenzylcyanamid

Cbo-glycinanilid. - Ansatz I : 2.09 g Cbo-glycin, 0.93 g Anilin und 2.22 g Dibenzylcyanamid (je 0.01 Mol) wurden 2 Stdn. auf 95-100" erhitzt. Aus dem Reaktionsprodukt wurde nicht umgesetztes Cbo-glycin mit 10-proz. K2C03-Losung herausgelost und der Riickstand nach dem Trocknen aus Chloroform umkristallisiert. Ausbeute 1.2 g (40% d. Th.), Schmp. 145 bis 146.5".

N.N-Dibenzylharnstoff: Schmp. 122- 124'. Ansatz 2: Die Komponenten wurden im gleichen Mengenverhaltnis 5 Stdn. bei 80-85O

in 5 ccm Tetrahydrofuran erhitzt. Nach dem Abdestillieren des Losungsmittels wurde wie bei Ansatz I vorgegangen. Ausbeute 0.77 g (27% d. Th.), Schmp. 145-146" (aus Methanol).

2. DarstelIung von Cbo-glycinanilid mittels Diphenylcyanamid

Es wurde wie oben unter Verwendung von 1.67 g (0.01 Mol) Diphenylcyanamidverfahren. - Ansatr I: Ausbeute 0.74 g (26% d. Th.), Schmp. 145-146". N.N-Diphenyl-harnstoff: Schmp. 185-187". - Ansatz 2: Ausbeute 0.36 g (13% d. Th.), Schmp. 145-146".

C16H16N203 (284.3) Ber. C 67.58 H 5.67 N 9.85 Gef. c 67.61 H 5.88 N 10.00

3. Reaktionen mit Diathylcyanamid Cbo-glycinanilid. - 2.09 g Cbo-glycin, 0.93 g Anilin und 2.45 g Diaihylcyanamid (je

0.01 Mol) wurden unter den Bedingungen von Ansatz 1 umgesetzt und aufgearbeitet. Aus- beute 1.39 g (50% d. Th.), Schmp. 145-146.5".

C16H16N203 (284.3) Ber. N 9.85 Gef. N 10.28 N.N-Diathylharnstoff: Schmp. 74-75" (aus Ather).

*) Alle Schmelzpunkte sind korrigiert. 8) M. BERGMANN und L. ZERVAS, Ber. dtsch. chem. Ges. 65, 1192 (1932); W. GRASSMANN

und E. WUNSCH, Chem. Ber. 91, 462 (1958). 9) Zit."), dort S. 443.

10) S. M. MCELVAIN und J. F. VOZZA, J. Amer. chem. SOC. 71, 896 (1949). 11) F. KURZER und A. LAWSON, Org. Syntheses 34, 67 (1954). 12) 0. WALLACH, Ber. dtsch. chem. Ges. 32, 1872 (1899). 13) J. v. BRAWN, Ber. dtsch. chem. Ges. 33, 1438 (1900), und zwar S. 1450. 14) W. TRAWBE und A. ENGELHARDT, Ber. dtsch. chem. Ges. 44, 3149 (1911).

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Cbo- DL-phenylalanyl-DL-alaninathylesrer. - 5.7 g Cbo-DL-phenylalanin und 2.4 g DL-Aia- ninathylester (je 0.02 Mol) wurden in 5.0 ccm Diathylcyanamid 5 Stdn. auf 95- 100" erhitzt. Das Reaktionsprodukt wurde in Essigester aufgenommen, die Losung mit 10-proz. K2CO3-Losung, 5-proz. Salzsaure und Wasser gewaschen, dann mit NazSO4 getrocknet und der Cbo-dipeptidester mit Petrolather ausgefallt. Ausbeute 3.74 g (50 % d. Th.), Schmp. 100.5-101.5" (aus 10-proz. Athanol).

C22H26N205 (398.4) Ber. C 66.32 H 6.57 N 7.03 Gef. C 66.02 H 6.76 N 7.31

Cbo-glycyl-L-leucin. - 2.09 g (0.01 Mol) Cbo-glycin, 1.96 g (0.01 Mol) L-Leucinathyl- ester-hydrochlorid ([a]'," = +22.0", c = I .O in Wasser) und 2.86 ccm Diathylcyanamid wur- den 2 Stdn. bei 100" gehalten. Nach dem Aufarbeiten wurde der Cbo-dipeptidester als fast farbloses 0 1 in 70-proz. Ausbeute erhalten. - Zu seiner Verseifung wurde der Ester in der funffachen Menge Aceton gelost, mit etwas mehr als der aquiv. Menge 2n NaOH versetzt und 80 Min. auf der Maschine geschuttelt. Nach der Entfernung des Acetons i. Vak. und Aufnahme des Ruckstandes in wenig Wasser sauerte man unter Eiskuhlung an, wobei das Cbo-dipeptid in 80-90-proz. Ausbeute erhalten wurde. Schmp. 134- 136", [a]g = - 10.2" (c == 4.0 in Athanol).

C16H22N205 (322.4) Ber. C 59.61 H 6.88 N 8.69 Gef. C 59.81 H 6.81 N 9.00

Cbo-L-phenylalanyl-glycinathylester. - 1.89 g Cbo-L-phenylalanin ([a18 = -5.0", c = 5.0 in Eisessig), 0.70 g Glycinathylester-hydrochlorid und 2.8 ccm Diathylcyanamid wurden, wie vorstehend beschrieben, umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute an Cbo-L-phenylalanyl- glycin-athylester 70% d. Th., Schmp. 109-1 10" (aus Essigester/Petrolather), [a]&? = - 17.1" (c = 5.1 in Athanol).

C21H24N205 (384.4) Ber. N 7.30 Gef. N 7.38

4. Reaktionen mit Cyanamid

Cbo-glycinanilid. - Die Verbindung wurde bei Verwendung von Cyanamid unter den oben geschilderten Standardbedingungen (Ansatz 1) in 50-proz. und (Ansatz 2) in 49-proz. Ausbeute gewonnen. Schmp. 145- 146".

Cbo-L-phenylalanyl-glycinathylesfer. - 1.89 g Cbo-L-phenylalanin, 0.60 g Glycinathyl- ester (je 5 mMol) und 1.0 g Cyanamid lieferten beim 5stdg. Erhitzen auf 80-85" in 3 ccm Tetrahydrofuran und iiblicher Aufarbeitung in ca. 60-proz. Ausbeute den Cbo-dipeptidester. Schmp. 109- I lo"; nach dem Umkristallisieren aus Essigester/Petrolather [a]g = -16.4" (c = 2.0 in Athanol).

C21H24N~05 (384.4) Ber. N 7.30 Gef. N 7.40

Cbo-glycyl-L-alanin. - 2.09 g (0.01 Mol) Cbo-glycin, 1.2 g (0.01 Mol) L-Alaninathyl- ester und 1.6 g Cyanamid lieferten nach 2stdg. Erhitzen auf 100" und ublicher Aufarbeitung in ca. 50-proz. Ausbeute den Cbo-dipeptidester als schwach gefarbtes 01. - Die Verseifung wurde wie beim Cbo-glycyl-L-leucin-athylester durchgefuhrt. Schmp. 183 - 185", [ar]b* = -9.3" (c = 4.5 in Athanol).

C13H16N205 (280.2) Ber. N 10.00 Gef. N 10.19 10'

148 G. LOSSE und H. WEDDIGE Bd. 636

Peptidsynthesen mit a-Isothiocyan-fettsaureestern 1. Isothiocyan-fettsaureester aus den freien Arninosaureestern

a-lsothiocyan-[I-phenyl-propionsaureathylester. - 14.5 g (0.075 Mol) oL-Pheny~alaninathyl- ester werden mit 20 ccm Aceton verdiindt und unter Riihren tropfenweise 4.3 ccm (0.08 Mol) Schwefelkohlenstoff und 22.0 ccm (0.16 Mol) Triiithylarnin hinzugefiigt. Dann laRt man unter kriiftigem Riihren bei -10 bis -15" eine Losung von 21.8 g (0.08 Mol) HgClz in 30 ccm Aceton eintropfen. Nach Beendigung der Zugabe laBt man auf Zimmertemperatur erwarmen, wobei das Hg-Dithiocarbamat des Phenylalaninesters unter Ausscheidung von HgS und Triathylamin-hydrochlorid zum Sertfol zerfallt. Die Zersetzung wird durch halb- stiindiges Erwarmen auf 100" beendet. Zur Aufarbeitung wird das Aceton i. Vak. entfernt, der Riickstand viermal mit je 50 ccm absol. Ather extrahiert, die Atherlosung eingedampft und der Riickstand einer Vakuumdestillation unterworfen. Sdp.2 138", Ausbeute 60 -70% d. Th.

C12H13N02S (235.3) Ber. C 61.24 H 5.56 N 5.95 Gef. C 61.31 H 5.59 N 6.16

a-lsothiocyan-propionsaureathylester. - Seine Darstellung erfolgte entsprechend aus DL-Alaninathylester. Sdp.5 65".

C&N02S (159.2) Ber. C 45.27 H 5.70 N 8.80 Gef. C 45.28 H 5.77 N 9.08

2. a-lsothiocyan-fet tsaureester aus den Arninosaureester-hydrochloriden

a-Isothiocyan-isovaleriansaureathylester. - 18.2 g (0.10 Mol) DL- Valinester-hydrochlorid werden in 50 ccm Aceton aufgenommen. Unter Riihren gibt man tropfenweise 13.8 ccm (0.10 Mol) Triiithylamin und 10 Min. nach beendeter Triathylaminzugabe bei -10 bis - 15" 6.0 ccm (0.10 Mol) Schwefelkohlenstoff in 50 ccm Aceton im Verlaufe von 30 Min. tropfenweise und unter Riihren hinzu. Dann versetzt man die Losung bei 0" im Verlaufe von 30 Min. tropfenweise und unter Riihren mit 27.2 g (0.10 Mol) HgCI2 in 40 ccm Aceton und nach weiteren 10 Min. mit 27.6 ccm (0.20 Mol) Triiithylarnin. AnschlieBend erwarmt man 1 Stde. lang unter Riihren auf dem Wasserbad, filtriert und wascht den Riickstand mit Aceton und Ather aus. Die Ausziige werden mit dem Filtrat vereinigt; das Losungsmittel wird abdestilliert und der olige Riickstand i. Vak. destilliert. Sdp.4-5 83 --84", Ausbeute 60 % d. Th.

CgH13N02S (187.3) Ber. C 51.31 H 6.84 N 7.48 Gef. C 51.16 H 6.82 N 7.67

a-Zsothiocyan-essigsuureuthylester. - Die Darstellung erfolgte wie beim Valinesterhydro- chlorid aus dem Hydrochlorid des Glycinathylesters. Sdp.5 68".

C ~ H ~ N O Z S (145.2) Ber. C 41.36 H 4.86 N 9.76 Gef. C 41.25 H 4.87 N 10.03

3. Peptidsynthesen

Allgemeine Vorschrift: Cbo-aminosaure und Isothiocyan-fettsaureester werden in aqui- molaren Mengen 5 Stdn. auf 150-160" erhitzt. Man nimmt dann in Essigester auf, schiittelt mit 10-proz. K2CO3-Losung und Wasser, trocknet und dampft das Losungsmittel i. Vak. ab. Der Riickstand wird aus 50-proz. Athanol urnkristallisiert. Ausbeute 80-90% d. Th.

Cbo-DL-phenylalanyl-DL-alaninathylester. - Schmp. 100.5 - 101.5".

C22H26N205 (398.4) Ber. C 66.32 H 6.51 N 7.03 Gef. C 65.91 H 6.45 N 7.07

1960 Neue Moglichkeiten zur Knupfung der Peptidbindung 149

Cbo-glycyl- DL-phenyluluniriathylester. - Schmp. 91 -992".

C21H24N205 (384.6) Ber. C 65.29 H 6.29 N 7.29 Gef. C 65.26 H 6.44 N 7.36

Cbo-DL-ulunyl-DL-aluninathy~ester. - Schmp. 75" (aus Essigester/Petrolather).

C16H22N205 (322.4) Ber. C 59.61 H 6.88 N 8.69 Gef. C 59.48 H 6.80 N 8.85

Cbo-L-phenylulunyl-glycinathylester. - Schmp. 109 - 1 10" (aus Essigester/Petrolather), = -16.8" (c = 2.0 in Athanol).

C21H24N205 (384.4) Ber. N 7.30 Gef. N 7.38

4. Aminosaurepolymerisation Blei(II)-dithiocurbumat des Alunins. - Zur Losung von 4.5 g Alunin in 10 ccm Wasser

werden 33.0 g Bleiucetut in 100 ccm Wasser, 20 ccm Schwefelkohlenstof; 15 ccm Triathjdamin und zur besseren Phasenverteilung 50 ccm Aceton hinzugegeben. Nach 1 I/Zstdg. Schutteln bei Zimmertemperatur konnen 9.35 g und nach weiteren 7 Stdn. 3.9 g Bleisalz abfiltriert werden.

Zerlegung des Bleisalzes: 14.0 g Bleisalz werden mit 40 ccm Wasser unter Riihren 1 Stde. gekocht. Man filtriert vom Bleisulfid ab, befreit das Filtrat mittels H2S von Blei-Ionen und dampft bei 40-50" i. Vak. ein, wobei das Polyulnnin in 80-proz. Ausbeute als farbloser Ruck- stand erhalten wird.

Alanin C3H7N02 (89.1) Polyalanin (C~HSNO), (71.1),

Ber. C40.40 H7.91 N 15.70 Ber. C 50.80 H 7.04 N 19.70 Gef. C46.13 H7.62 N 16.35

Die Verbindung erwies sich als Ninhydrin-negativ. Nach 25stdg. Hydrolyse mit 6n HC1 bei 105" wurde ausschlieRlich Alanin erhalten, das papierchromatographisch identifiziert wurde. - Die Peptidbindung im Polyalanin zeigte sich ferner im IR-Spektrum.