Next-Generation Sequencingin der Immungenetik

1

Blutzentrale Linz

Martin Danzer, Susanne Süssner, Johannes Weinberger, Christian Gabriel

Sequenzierung (sequencing-based typing)

B*1801,5601

vs.B*1801,5502

163.2=Y

Exon 2 Exon 3Exon 1 Exon 4

Mutationen liegen außerhalb der sequenzierten Bereiche

– man kann den Polymorphismus nicht erkennen

Ambiguities

Polymorphic positions

Core heterozygous sequence data

Beispiel: HLA-B

B*0702, 4402

B*0702, 4419N

Beispiel: HLA-B

B*0702, 4402

B*0720, 4416

B*0724, 4421

AmbiguitiesStrangrekonstruktion durch Polymorphismen

an der gleichen Position nicht möglich

A+B=D+E

B*0724, 4421

TGGAGGGCSMGTGCGTGGA

TGGAGGGCSMGTGCGTGGA

S = G und C

M = A und T

-------------SM-------------

cis/trans Problematik

TGGAGGGCSMGTGCGTGGA -------------SM-------------

-------------GA--------------

-------------CT--------------

-------------GT--------------

-------------CA--------------

Anzahl der möglichen Kombinationen= 2n

n=2; 4 Kombinationen

n=4; 16 Kombinationen IUB Code K S W M Y R

Bases G,T G,C A,T A,C C,T A,G

BESSER TYPISIEREN

#

Ohne Ambiguities?

BESSER TYPISIEREN

Wie können wir schneller und

sicherer typisieren?

Pacific Biosciences

9

Johannes Weinberger

Genia

11

Johannes Weinberger

Oxford Nanopore

12

Johannes Weinberger

� Affymetrix� Agencourt Bioscience� Avantome� BioNanomatrix� Genizon Biosciences� Halcyon Molecular

� 454 (Roche)� Complete Genomics� Illumina� Intelligent BioSystems - Qiagen� Life Technologies - SOLiD

� Halcyon Molecular� Intelligent Biosystems� Lynx� Manteia� Nanofluidics� Pyrosequencing� Sequenom� Solexa� VisiGen

� Life Technologies - SOLiD� Life Technologies – Ion Torrent� Pacific Biosciences� Genia - Roche

StrategienB

LOO

D C

EN

TE

R F

OR

UP

PE

R A

US

TR

IA

Exon-based typing flexibility: highcapacity: gentlefull allele drop out: rareDNA quality: not criticalScabillity: medium/ high/ ultra highlibrary prep: complexautomation: yes

flexibility: highcapacity: gentlefull allele drop out: rareDNA quality: not criticalScabillity: medium/ high/ ultra highlibrary prep: complexautomation: yes ? Ambiguities

library prep

1

Gabriel C et al: Rapid high-throughput human leukocyte antigen typin g by massively parallel pyrosequencingfor high-resolution allele identification . Hum Immunol 2009, 70:960-964.

Bentley G et al: High-resolution, high-throughput HLA genotyping by next-generation sequencing .Tissue Antigens 2009, 74:393-403.

Shorter amplicons allow the complete coverage in reverse and forward direction !

BLO

OD

CE

NT

ER

FO

R U

PP

ER

AU

ST

RIA

Erlich RL et al: Next-generation sequencing for HLA typing of class I loci . BMC Genomics 2011, 12:42.

Moonsamy PV et al: High throughput HLA genotyping using 454 sequencing and the Fluidigm Access Array™System for simplified amplicon library preparation. TissueAntigens 2013 Mar;81(3):141-9.

Danzer M et al: Rapid, scalable and highly automated HLA genotyping using next-generation sequencing:A transition from research to diagnostics. BMC Genomics 2013, 14:221

Grumbt B et al: Diagnostic applications of next generation sequencing in immunogenetics and molecular oncology.Transfus Med Hemother. 2013 Jun

Trachtenberg EA et al: Next-generation HLA sequencing using the 454 GS FLX sys tem. Methods Mol Biol. 2013

Holcomb CL et al: Multi-site study using high-resolution HLA genotypi ng by next generation sequencing .Tissue Antigens 2011, 77:206-217.

Amplifikate

� HLA -A, -B, -C, -DP, -DQ, -DR� Klasse I:

- A: exons 2,3,4- B: exons 1,2,3,4 - C: exons 1,2,3,4,6,7

� Klasse II: - DP: exon 2- DQ: exons 2,3- DR: exons 2,3

LimitationenAmbiguities zwischen Exons B

LOO

D C

EN

TE

R F

OR

UP

PE

R A

US

TR

IA

B*15:01:01:01 Exon 2 Exon 3

Intron ~250bp

BLO

OD

CE

NT

ER

FO

R U

PP

ER

AU

ST

RIA

B*40:01:01 Exon 2 Exon 3

B*15:212

B*40:21

Exon 2

Exon 2

Exon 3

Exon 3

oder

StrategienB

LOO

D C

EN

TE

R F

OR

UP

PE

R A

US

TR

IA

cDNA-based typingflexibility: mediumcapacity: ideal full allele drop out: possibleRNA quality: very criticalScabillity: : medium/ highlibrary prep: reduced complexityautomation: yes

flexibility: mediumcapacity: ideal full allele drop out: possibleRNA quality: very criticalScabillity: : medium/ highlibrary prep: reduced complexityautomation: yes ? N- alleles

RNA quality

2

Lank SM et al: A novel single cDNA amplicon pyrosequencing method for high -throughput, cost -effective

BLO

OD

CE

NT

ER

FO

R U

PP

ER

AU

ST

RIA

Lank SM et al: A novel single cDNA amplicon pyrosequencing method for high -throughput, cost -effectivesequence-based HLA class I genotyping . Hum Immunol 2010, 71:1011-1017.

Lank SM et al: Ultra-high resolution HLA genotyping and allele dis covery by highly multiplexed cDNAamplicon pyrosequencing . BMC Genomics 2012, 13:378.

StrategienB

LOO

D C

EN

TE

R F

OR

UP

PE

R A

US

TR

IA

Full genomic typing

flexibility: lowcapacity: maxfull allele drop out: possibleDNA quality: criticalScabillity: ultra highlibrary prep: complex

flexibility: lowcapacity: maxfull allele drop out: possibleDNA quality: criticalScabillity: ultra highlibrary prep: complex

? DRB1,Software issues (phasing)cinical relevance

3

BLO

OD

CE

NT

ER

FO

R U

PP

ER

AU

ST

RIA

Lind C et al: Next-generation sequencing: the solution for high-r esolution, unambiguous human leukocyteantigen typing . Hum Immunol 2010, 71:1033-1042.

Wang C et al: High-throughput, high-fidelity HLA genotyping with deep sequencing . Proc Natl Acad Sci U S A 2012, 109:8676-8681.

Shiina T et al: Super high resolution for single molecule-sequence- based typing of classical HLA loci at the8-digit level using next generation sequencers . Tissue Antigens 2012, 80:305-316.

Hosomichi K et al: Phase-defined complete sequencing of the HLA genes by nex t-generation sequencing.BMC Genomics 2013, 28;14:355.

Ozaki Y. et al: HLA-DRB1, -DRB3, -DRB4 and -DRB5 genotyping at a sup er-high resolution level by long range PCR and high-throughput sequencing. Tissue Antigens 2014

ZusammenfassungZusammenfassungZusammenfassungZusammenfassung der der der der

TypisierungsergebnisseTypisierungsergebnisseTypisierungsergebnisseTypisierungsergebnisse

60.000

70.000

80.000

90.000

HQ HQ HQ HQ ReadsReadsReadsReads

GS Junior Performance

0

10.000

20.000

30.000

40.000

50.000

60.000

tiGS

j008

-201

1

tiGS

j009

-201

1

tiGS

j010

-201

1

tiGS

j011

-201

1

tiGS

j012

-201

1

tiGS

j013

-201

1

tiGS

j014

-201

1

tiGS

j016

-201

1

tiGS

j017

-201

1

tiGS

j018

-201

1

tiGS

j019

-201

1

tiGS

j020

-201

1

tiGS

j021

-201

1

tiGS

j022

-201

1

tiGS

j023

-201

1

tiGS

j024

-201

1

tiGS

j025

-201

1

tiGS

j026

-201

1

tiGS

j027

-201

1

tiGS

j028

-201

1

tiGS

j029

-201

1

tiGS

j030

-201

1

tiGS

j031

-201

1

tiGS

j032

-201

1

tiGS

j033

-201

1

tiGS

j034

-201

1

tiGS

j035

-201

1

tiGS

j036

-201

1

tiGS

j037

-201

1

tiGS

j038

-201

1

tiGS

j039

-201

1

tiGS

j040

-201

1

tiGS

j041

-201

1

BE4

BE3

BE2

BE1

AE4

AE3

AE2

Raw Amplicon Reads

Raw 454 reads – Validierungsstudie

DRBE3

DRBE2*1/5

DQB1E3

DQB1E2

DPB1E22

CE7

CE4

CE3

CE2

CE1

BE4

0 200 400 600 800

[reads]

olomouc 6th ewic / 02.03.2012

BE4

BE3

BE2

BE1

AE4

AE3

AE2 ATFraw

39.51%

61.80%

64.57%

81.38%

48.65%

59.73%

53.26%

Raw 454 reads vs used ATF reads –Validierungsstudie

Ursachen:ErkannteSequenzierfehler

median

DRBE3

DRBE2*1/5

DQB1E3

DQB1E2

DPB1E2

CE7

CE4

CE3

CE2

CE1

Am

plic

ons

0 20000 40000 60000 80000

58.08%

49.78%

52.63%

57.07%

46.60%

67.06%

59.99%

51.25%

68.41%

60.46%

79.37% SequenzierfehlerFilter settings,Coverage

olomouc 6th ewic / 02.03.2012

Anz

ahl d

er P

robe

n di

e m

it de

m

Mis

eq ty

pisi

ert w

urde

n

kein

Mis

eq E

rgeb

nis

mög

lich

Anz

ahl d

er in

itial

erf

olgr

eich

en

Mis

eq T

ypis

ieru

ngen

Anz

ahl d

er P

robe

n oh

ne

Ref

eren

z Ty

pisi

erun

g

Initi

al e

rfol

grei

che

Mis

eq

Typi

sier

ung

verg

liche

n m

it de

r R

efer

enz

Typi

sier

ung

Mis

eq T

ypis

ieru

ngsf

ehle

r ve

rglic

hen

mit

der

Ref

eren

z Ty

pisi

erun

g

Übe

rein

stim

mun

gsra

te M

iseq

vs

. Ref

eren

z

23

Locu

s

Anz

ahl d

er P

robe

n di

e m

it de

m

Mis

eq ty

pisi

ert w

urde

n

kein

Mis

eq E

rgeb

nis

mög

lich

Anz

ahl d

er in

itial

erf

olgr

eich

en

Mis

eq T

ypis

ieru

ngen

Anz

ahl d

er P

robe

n oh

ne

Ref

eren

z Ty

pisi

erun

g

Initi

al e

rfol

grei

che

Mis

eq

Typi

sier

ung

verg

liche

n m

it de

r R

efer

enz

Typi

sier

ung

Mis

eq T

ypis

ieru

ngsf

ehle

r ve

rglic

hen

mit

der

Ref

eren

z Ty

pisi

erun

g

Übe

rein

stim

mun

gsra

te M

iseq

vs

. Ref

eren

z

A 130 1 129 (99,2%) 4 125 0 100.0%B 130 1 129 (99,2%) 0 129 0 100.0%C 130 1 129 (99,2%) 9 120 0 100.0%DRB1 130 2 128 (98,5%) 6 122 0 100.0%DQB1 130 1 129 (99,2%) 11 118 0 100.0%DPB1 130 1 129 (99,2%) 36 93 0 100.0%DQA1 130 1 129 (99%) 111 19 0 100.0%all 910 8 902 (99,1%) 177 726 0 100.0%

Probleme der NGSHLA Typisierung

� Homopolymere� MID Interferenz beim Primer annealing� Genaue Quantifizierung und Normalisierung � Genaue Quantifizierung und Normalisierung

notwendig� Verlust von Sequenzen wegen der Effekte

der Qualitätsparameter der Software� HLA-edits immer noch (bis zu 80% der Loci)

notwendig� Repeats: notwendig in 3% (loci)

NGS HLA Typisierung

� Die Selektion der Exons und Primer kann variieren – es gibt noch keinen Standard

� NGS ist nur dann anwendbar, wenn:� NGS ist nur dann anwendbar, wenn:- Automation vor der Sequenzierung - hochwertige Bioinformatik vorhanden- Durchsatz hoch

Status der HLA Typisierung

� Anwendbar für Spender/Empfänger Typisierung

� Hochgradig zuverlässig� Hochgradig zuverlässig� Hohe Qualität der Ergebnisse in kürzerer Zeit

mit mehr Proben� Ideal für Nabelschnurblutbanken und

Registertypisierungen

TCR UND IGHSEQUENZIERUNG

27

Blutzentrale Linz

Struktur

28

Blutzentrale Linz

BCR TCR

Rezeptor-Rekombination

ca. 1012

Rezeptorvarianten

29

Blutzentrale Linz

EineRezeptorspezifitätpro Zelle

Klon Selektion und Proliferation

Zellen mit hoherAffinität zu Epitop

30

Blutzentrale Linz

Affinität zu Epitop� Proliferation

Klonalisierung des Repertoires

31

Blutzentrale Linz

Klonalisierung des BCR/TCR Repertoires durch gerichteteoder ungerichtete Proliferation

Workflow

DNA-

32

Blutzentrale Linz

B- und T-Zell IsolationDNA-Extraktion

NGS

Datenanalyse

NGS Sample Preparation

Materialgewinnung

� Blut

� Harn

� Nierengewebe� Nierengewebe

33

Library Preparation der rekombinierten IGH und TRB Loci

34

Amplifizieren der rekombinierten IGH und

TCRB Loci

35

ERGEBNISSE

36

Blutzentrale Linz

Anzahl unterschiedlicher VDJ Kombinationen und CDR3

Sequenzen

� 3527 unterschiedliche, auswertbare VDJ Kombinationen in 85763

Reads

�

Reads

� ca.19400 unterschiedliche, auswertbare CDR3 Sequenzen 85763 Reads

37

V Element Verteilung

38

D Element Verteilung

39

J Element Verteilung

40

CDR3 Verteilung bei gesundenProbanden

Sequence Count Percentage

ARVFRY 311 0,140360695

ARGIDY 261 0,117794667

AR 213 0,09613128

ARCYGMDV 203 0,091618074

Sequence Count Percentage

ACWSSDTLNSTGP 325 1,55405728

ASS*GEQSAPA 275 1,31497155

ASSETVDYGYT 182 0,87027208

ATEGYGYT 120 0,57380577

41

Blutzentrale Linz

ARCYGMDV 203 0,091618074

ARGGNSDY 196 0,088458831

ARWHDNIPADY 175 0,078981099

ARDVGTLERWYYFDY 164 0,074016572

ASTYYGMDV 155 0,069954687

AASSG 155 0,069954687

ARGYYGMDV 147 0,066344123

ARALDVDY 140 0,063184879

IGH

ATEGYGYT 120 0,57380577

ASSFLRGGYGYT 109 0,5212069

ASNQNTGAPYEQY 101 0,48295319

ASSHRDRGRSLKL 85 0,40644575

ASSYGRQAISPS 78 0,37297375

ASSPGLTVRSYEQY 78 0,37297375

ASRQSYGYT 77 0,36819203

TSS 74 0,35384689

TRB

Beispiel 1

� Nephrektomie rechts bei hydronephrotischerSackniere

� Histo: Nierenbiopsie mit dem Bild einer chronischen interstitiellen Nephritis, mit Tubulitis und interstitiellen Nephritis, mit Tubulitis und Tubulusatrophie, am ehesten sprechend für eine chronische Pyelonephritis

� Größe des Gewebeteils: 2x3cm

42

Blutzentrale Linz

CDR3 9N TCRB vs 9B TCRB

9NSequence Count Percentage

ASSPYTTGRKLF 12299 18,6249716

ASSKEYRGAGGYT 9588 14,519573

ASSPDRGGNQPQH 6352 9,61914136

ASSYSPTMNTEAF 3527 5,34110699

ASSYGGDGYT 1904 2,88331945

ASSATLEGAGYGYT 835 1,26448096

ATLNYGYT 599 0,90709472

43

Blutzentrale Linz

9B

ATLNYGYT 599 0,90709472

ASSSTA*GHNQPQH 595 0,90103733

ASSSILLRTLLRAV 486 0,73597335

Sequence Count Percentage

ASSKEYRGAGGYT 6170 4,79562254

ASSYSPTMNTEAF 5997 4,66115857

ASSPYTTGRKLF 5753 4,47150996

ASSYGGDGYT 5510 4,2826386

ASSATLEGAGYGYT 3311 2,5734694

ASSPDRGGNQPQH 847 0,65832938

ASSPRDS*TLKL 670 0,52075642

ASS*GC*QGMAT 622 0,4834485

ASSEGVGTFSAPLH 552 0,42904111

CDR3 9N IGH vs 9B IGH

9N

Sequence Count PercentageASVMGPLLWFGKSQHRYYFDY 22536 35,4256072MKRC*RSSD*SSYGP*L 382 0,60048731AREVGRRPPEAWEVWT 337 0,52974927ASVMGPLLWFGKSQHRYYFDS 257 0,40399277ASVMGPLLWFGKSQHTYYFDY 253 0,39770494ATSLI 174 0,2735204AKRVGAYSPFEY 169 0,26566061

44

Blutzentrale Linz

9B

Sequence Count PercentageASVMGPLLWFGKSQHRYYFDY 2164 6,69948299AKRVGAYSPFEY 1587 4,91316058IAVVTAFRLDVSDI 1168 3,61598712FYYDSGCLAGST 1018 3,15160521AKRVGASSPFEY 227 0,70276462GRDSVETGGLT 138 0,42723136ARV*TTMRVVGRFGGLT 108 0,33435497ASVMGPLLWFGESQRRYYFDF 102 0,3157797ARDWGIQLWLLGGMDV 101 0,31268382

AKRVGAYSPFEY 169 0,26566061TKTFSRLVKYFCRD*L 161 0,25308496F*LAAGAY*FDC 136 0,21378606

Beispiel 2: Proband 1

Sequence Count Relative Quantities

ASSVSGEGSDEQF 8437 8,96618419

ASSMGQNNEQF 4697 4,9916045

ASSGFGEVAPTMSS 2267 2,40919042

FNPASGNIQY 1273 1,35284491

Sequence Count Relative Quantities

ASSVSGEGSDEQF 10095 11,44739528

ASSMGQNNEQF 7747 8,784841131

ASSLRYNEQF 728 0,825527862

AWSALAGDYNEQF 608 0,68945184

45

Blutzentrale Linz

FNPASGNIQY 1273 1,35284491

ASLPGKLVRDPV 1264 1,34328041

AWSALAGDYNEQF 1081 1,14880231

ASSLSSGFASYNEQF 691 0,73434079

SVGFLAGSTDTQY 528 0,56111713

ASSISWVTDTQY 483 0,51329465

Proband 1 TRB Februar 2014

Proband 1 TRB November 2013

AWSALAGDYNEQF 608 0,68945184

ASSGFGEVAPTMSS 556 0,630485565

ASSLGGREQF 474 0,537500283

ASSLSSGFASYNEQF 448 0,508017146

ASSLGQNNEQF 438 0,496677477

ASSLAWLSSYNEQF 364 0,412763931

Beispiel 3: CLL Patient

Sequence Count Percentage

ARAGINWGPYFDC 17701 95,5158645

ARAGINWAHTLT 79 0,42628966

AKGLTTTGTTPDY 65 0,35074466

ARAGINWGPYFD 48 0,25901144

Sequence Count Percentage

ASSRGRGYEQY 2124 3,54035404

ASSIIGNQPQH 1496 2,49358269

ASVQVTMAT 942 1,57015702

ASSRGQSYGYT 584 0,97343068

46

Blutzentrale Linz

ARAGINWGPYFD 48 0,25901144

VKGLTTTGTTPDY 41 0,22123894

ARAGINWGPYLDC 24 0,12950572

ARAGINWGSYFDC 20 0,10792143

ARAGINWSPYFDC 17 0,09173322

ARVGINWGPYFDC 16 0,08633715

IGH

ASSRGQSYGYT 584 0,97343068

ASSRGQNYGYT 578 0,96342968

ASREDGRLRAV 472 0,78674534

ASSRGQGYEQY 444 0,74007401

ASSRGLSYEQY 438 0,73007301

ASSRGGSYEQY 381 0,63506351

TRB

V(D)J Kombination: Spectra IgH

2 V(D)J spectra desselben Patienten zu

verschiedenen Zeiten

DankeDanke

49

Blutzentrale Linz