This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

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Nucleinsäuren in Chloroplasten I. Charakterisierung der DNS und RNS von Antirrhinum majus

H A N S G E O R G R U P P E L

Botanisches Institut der Universität Köln

( Z . N a t u r f o r s c h g . 22 b, 1 0 6 8 — 1 0 7 6 [1967 ] ; e ingegangen am 9 . Januar 1967)

The occurrence of nucleic acids in chloroplast preparations and leaves of Antirrhinum majus has been investigated.

Chloroplast preparations isolated from freeze-dried leaves in a non-aqueous medium were found to contain DNA. Characterization of the DNA was based on chemical analyses and density gradient centrifugation. The chloroplast DNA has a density of 1.698 g/cm3 corresponding to a guanine-cytosine content of 37 — 38%. The hyperchromic effect of the DNA has shown its double-stranded structure. Leaf DNA has also been characterized by density gradient centrifugation and shown to contain as major component the nuclear DNA with a density of 1.689 g/cm3 which corresponds to a guanine-cytosine content of about 31% and a minor component identified as chloroplast DNA.

Extraction of the total nucleic acids of chloroplast preparations and their chromatographic separation on methylated serum albumin column yielded 5 fractions as follows: Soluble RNA (fraction I) with s = 3 . 8 —4.0, DNA (fraction II) containing small but detectable amounts of an unknown RNA component, two RNA fractions presumable of ribosomal origin with s = 17 (frac-tion III) and s = 2 6 (fraction IV), and a RNA fraction heterogeneous in molecular size (fraction V) with s = 2 3 — 50. The soluble RNA has a high GC-content whereas fraction V shows a relative high adenine content. Compared with the nucleic acids from leaves the chloroplast preparations contain the same fractions, differing only in the higher content of fraction III related to the amount of fraction IV. Beside the DNA fraction of leaf extract with the sedimentation coefficient of s = 12 — 13 a further UV-absorbing component with s = 5.0 — 5.5 has been found. Its character is unknown.

Wie aus zahlreichen Arbeiten der letzten Jahre hervorgeht, kommen in den Chloroplasten höherer und niederer Pflanzen sowohl DNS als audi RNS v o r ( L i t . b e i PARTHIER u n d WOLLGIEHN 1 ) . D i e Chloroplasten-DNS unterschied sich in allen bisher untersuchten Fällen von der Kern-DNS in ihrer Ba-senzusammensetzung. Da die Dichte der DNS eine Funktion des Guanin-Cytosin-Gehalts der betreffen-den DNS i s t 2 - 4 , konnte man die Plastiden-DNS und die Kern-DNS in einem CsCl-Dichtegradienten voneinander trennen (Lit. bei K I R K 5 ) . Von einigen Autoren 6 - 9 wurde mit Hilfe der Dichtegradient-Zentrifugation eine dritte DNS-Fraktion in pflanz-lichen Zellen nachgewiesen. Möglicherweise handelt es sich bei dieser DNS um Mitochondrien-DNS.

Da sich die Kern-DNS von der Chloroplasten-DNS in ihrer Dichte und in ihrer Basenzusammen-

1 B. P A R T H I E R U. R. W O L L G I E H N , in: Probleme der biologi-schen Reduplikation. Ed. P. SITTE, Springer-Verlag, Ber-lin, Heidelberg, New York 1966, S. 244.

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4 C . L. SCHILDKRAUT , J. M A R M U R , and P. D O T Y , J . molecular Biol. 4 , 4 3 0 [1962],

Setzung unterscheidet, und weil es möglich ist, kern-freie Plastiden-Präparate zu erhalten, ist eine Zu-ordnung der DNS-Fraktionen zu den entsprechenden Zellorganen verhältnismäßig einfach. Bei den ver-schiedenen RNS-Fraktionen ist es jedoch etwas schwierig zu entscheiden, ob sie wirklich in ihrer Ge-samtheit aus den Chloroplasten stammen, da es un-klar ist, in welchem Ausmaß unsere Plastiden-Prä-parate mit Cytoplasma verunreinigt sind. Verluste an Chloroplasten-RNS sind jedoch während der Ver-wendung organischer Medien bei der Isolierung der Chloroplasten kaum zu befürchten.

Für den Nachweis von Transfer-RNS in den Chloroplasten ist dieses Problem von besonderer Be-deutung. Schon früher konnten wir in den Piastiden, die mit organischen Lösungsmittelgemischen aus

5 J. T. O. KIRK, in: Biochemistry of Chloroplasts. Ed. T. W . GOODWIN, Academic Press, London and New York 1966, Vol. I, S . 319.

6 G . BRAWERMAN and J . M. EISENSTADT , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 91 ,477 [1964].

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Biol. 7 , 130 [1963]. 8 M . EDELMAN , J . A . SCHIFF , a n d H . T . EPSTEIN , J . m o l e c u l a r

Biol. 11 , 769 [1965]. 9 D. S. RAY and P. C. HANEWALT, J. molecular Biol. 11, 760

[1965].

Blättern isoliert worden waren, sowohl RNS als audi DNS nachweisen 10' n .

In dieser Arbeit wurde der Versuch unternom-men, die chemisch-analytischen Untersuchungen der Plastiden-DNS durch Dichtebestimmungen im CsCl-Dichtegradienten zu ergänzen und die in den Chloro-plasten vorhandenen RNS-Fraktionen näher zu cha-rakterisieren. Ferner wurden die gesamten Nuclein-säuren der Blätter von Antirrhinum majus extra-hiert und die RNS-Fraktionen mit denen aus den Chloroplasten isolierten verglichen.

Die Chloroplasten-DNS

Aus grünen Blättern von Antirrhinum majus wur-den nach der Methode von M A R M U R 12 ein DNS-Prä-parat isoliert. Dieses wurde in einem CsCl-Dichte-gradienten untersucht. Es wurden zwei DNS-Frak-tionen beobachtet, die als zwei UV-absorbierende Banden auf photographischen Platten dargestellt werden konnten. Die photometrische Auswertung der Aufnahmen ergab das in Abb. 1 a wiedergege-bene Bild. Die Dichte der DNS, die als Hauptfrak-tion mit „a" bezeichnet wurde, beträgt 1,688 bis 1,689 g/cm3 und die Dichte der als Nebenfraktion mit „ßu bezeichneten DNS 1,697 - 1 , 6 9 8 g/cm3. Ein DNS-Präparat aus Chloroplasten des gleichen Blattmaterials ergab nur eine DNS-Komponente mit der Dichte von 1,698 g/cm3 (Abb. I b ) . Die Neben-fraktion „ß" in dem Gesamt-DNS-Extrakt aus Blatt-material ist mit der Chloroplasten-DNS identisch. Sie besitzt eine höhere Dichte als die Kern-DNS, die durch die Hauptfraktion „a" dargestellt wird. In dem DNS-Extrakt aus Chloroplasten-Präparaten läßt sich mit dieser Methode keine Kern-DNS nachwei-sen. Daß bei höheren Pflanzen allgemein die Chloro-plasten-DNS schwerer ist als die Kern-DNS, geht aus Versuchen mit verschiedenem Pflanzenmaterial hervor7 '13. Untersuchungen an Chloroplasten-DNS aus Algen zeigten jedoch, daß hier die Kern-DNS eine höhere Dichte besitzt als die Plastiden-DNS 14. Nach Angaben von S C H I L D K R A U T et al. 4 läßt sich aus der Dichte der DNS von Chloroplasten (,o= 1,698 g/cm3) ein Guanin-Cytosin-Gehalt von 37 — 38% be-rechnen. Aus unseren chemischen Analysen ergab sich für den Quotienten (A + T) : (C + G) der Plasti-

Dichte 1,689 1,698 Gradient —

gern-

Abbn. Ia, b. Photometrische Auswertung der mit der UV-Optik aufgenommenen Zellenbilder nach 22 Stdn. Zentrifuga-tion von DNS-Präparaten in einem CsCl-Dichtegradienten (44770Upm, 20 °C) . a) DNS-Präparat aus Blattgewebe von Antirrhinum majus. b) DNS-Präparat aus Chloroplasten von

A. majus. a = Kern-DNS; ß = Chloroplasten-DNS.

den-DNS ein Wert von 1,65. Dieser entspricht einem prozentualen Anteil von Guanin und Cytosin an den Gesamtbasen von 38% und stimmt mit dem aus der Dichte erhaltenen Wert überein.

Ferner wurde die Basenzusammensetzung der Plastiden-DNS aus der durch thermische Denaturie-rung erhaltenen Schmelztemperatur (Tm ) der DNS bestimmt. In Abb. 2 wird der relative Anstieg der UV-Absorption einer DNS-Lösung bei 260 nm als Funktion der Temperatur dargestellt. Der zu beob-achtende hyperchrome Effekt von 23%, der sich durch ein Ansteigen der UV-Absorption bei 260 nm in einem relativ engen Temperaturbereich anzeigt, ist bedingt durch den Ubergang des Zustandes einer

10 H. G . R U P P E L , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 8 0 , 6 3 [ 1 9 6 4 ] ,

11 H. G . R U P P E L U . D. VAN W Y K , Z . Pflanzenphysiol. 5 3 , 3 2

12 J. M A R M U R , J. molecular Biol. 3 , 2 0 8 [ 1 9 6 1 ] . 1 3 N . K I S L E V , H . S W I F T , and L . BOGORAD, J . Cell Biol. 2 5 , 3 2 7

[ 1 9 6 5 ] . 14 D. S . R A Y and P. C. H A N E W A L T , J. molecular Biol. 9, 812

[1964],

% 2 5

20

o io E o i _ jc y &10

5

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 C °

Abb. 2. Thermisdie Denaturierung der DNS aus Chloropla-sten von Antirrhinum majus, dargestellt als relativer Anstieg der UV-Absorption bei 260 nm in Abhängigkeit von der Tem-peratur der DNS-Lösung. DNS in 0,15 M NaCl-, 0,015 M Na-

Citrat, pH-Wert 7,0; Tm = Schmelztemperatur.

Doppelhelix in den ungeordneteren Zustand eines Knäuels. Der Mittelpunkt des Absorptionsanstieges entspricht einer mittleren Schmelztemperatur Tm von 84 °C. Nach einer von M A R M U R und D O T Y 15 gefun-denen Beziehung zwischen Tm und dem Guanin-Cytosin-Gehalt einer DNS beredinet sich für die Plastiden-DNS von Antirrhinum ein Guanin-Cyto-sin-Gehalt von 36% der Gesamtbasen. Dieser Wert liegt etwas niedriger als die entsprechenden Anga-ben, die aus der Dichte und den chemischen Analy-sen berechnet wurden, und ist auf die relativ grobe

Temperaturkontrolle der verwendeten Meßeinrich-tung zurückzuführen.

Obwohl keine Zellkerne isoliert wurden, läßt sich aus der Dichte der Kern-DNS ihr Guanin-Cytosin-Gehalt von 31% berechnen. Nach chemischen Analy-sen 11 konnten wir in der Gesamt-DNS aus Antir-rhinum 5-Methylcytosin nachweisen. Da diese Base in der Chloroplasten-DNS nicht nachweisbar war, muß sie als Bestandteil der Kern-DNS angesehen werden. In Tab. 1 werden die uns zur Zeit bekann-ten Daten über die Plastiden-DNS von Antirrhinum zusammengestellt.

Aus dem DNS- und Chlorophyllgehalt der Blätter und Chloroplasten läßt sich der prozentuale Anteil der Plastiden-DNS an der Gesamt-DNS des Blattes abschätzen. Er betrug nach unseren Versuchen 12 Prozent16. Über den Anteil der Plastiden-DNS an der Gesamt-DNS einer Zelle liegen in der Literatur unterschiedliche Angaben vor. So finden S A G A R und I S H I D A 17 bei Chlamydomonas einen Wert von 6%, I W A M U R A und KUWASHIMA 1 8 bei Chlorella 1 0 % ,

G I B O R und G R A N I C K 19 für Euglena 1%, K I S L E V et al.13 für Beta 3 0 - 4 0 % und B Ö T T G E R und W O L L -

GIEHN20 bei Nicotiana 2 5 % Plastiden-DNS von der Gesamt-DNS der Zelle, wobei die zuletzt genannten Autoren ihren hohen Wert auf eine starke Vermeh-rung der Chloroplasten in sich nicht teilenden Zellen zurückführen.

Mit der in unseren Experimenten verwendeten Methode der Dichtegradient-Zentrifugation konnte in den Blättern eine dritte DNS-Fraktion, die mög-licherweise den Mitochondrien zuzuordnen wäre, nicht nachgewiesen werden.

Guanin-Cytosin-Gehalt in Prozent Plastiden-DNS DNS-Gehalt Dichte der Gesamtbasen A - f U j n Prozent der eines

nach chem. nach nach Tm G + C Gesamt-DNS Chloroplasten [g • c m - 3 ] Analyse Dichte

Plastiden-DNS 1,698 38 3 7 - 3 8 36 1,65 12 5,6 • 10~i5 g

Kern-DNS 1,689 - 31 - - - -

Tab. 1. Charakterisierung der DNS aus Chloroplastenpräparaten und Kernen von Antirrhinum majus nach physikalischen und chemischen Untersuchungen. Im Falle der Kern-DNS wurde nur die Dichte bestimmt.

15 J. M A R M U R and P. D O T Y , J. molecular Biol. 5, 109 [1962]. 1 6 H . G. R U P P E L , in: Croissance et le Vieillissement des

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Die Chloroplasten-RNS

Zur Bestimmung der RNS in den Chloroplasten von Antirrhinum majus wurden Chloroplasten-Prä-parate mit Tris-HCl-Puffer (pn 7,5) in Gegenwart von Bentonit und Dodecylsulfat extrahiert. Anschlie-ßend wurde die Suspension mit puffergesättigtem Phenol geschüttelt und zentrifugiert. Aus dem eiweißfreien wäßrigen Überstand konnte durch Zu-gabe von Äthanol ein Niederschlag erhalten wer-den, der in 0,05-m. Phosphatpuffer (pn 6,8, 0,01-m. NaCI) löslich war und nach Adsorption an eine Säule mit methyliertem Serumalbumin chromatogra-phisch untersucht wurde. Das Elutionsdiagramm eines solchen Versuchs wird in Abb. 3 a dargestellt. Eluiert wurden die einzelnen UV-absorbierenden Fraktionen mit 0,05-m. Phosphatpuffer (pn 6,8) steigender NaCl-Konzentration. Mit einer Puffer-lösung, die 0,30 — 0,48-molar an NaCI war, wurde Fraktion I eluiert, die im Elutionsprofil zwei Ma-xima besaß. Nach chemischer Analyse dieses Eluats

1,2-

1,0-

0 8 -

0,6- / 0,4- ' <

0,2- J

0 1 i i r—t 1 T 100 200 100 200 300 ml

I.Gradient H.Gradient

Abbn. 3 a, b. Fraktionierung der Nucleinsäuren aus a) Chlo-roplasten und b) aus Blattmaterial von Antirrhinum majus mit Hilfe der Säulenchromatographie an methyliertem Serum-Albumin. Elution mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 6,8, steigen-der NaCl-Konzentration. 1. Gradient von 0,2 — 0,5 M NaCI im Puffer; 2. Gradient von 0,5 — 1,1 M NaCI im Puffer, log / „ / / = UV-Absorption bei 254 nm ( o —O—), NaCl-Konzentra-

tion ( + - - - + ) .

besteht die Fraktion aus RNS, deren Nucleotidver-teilung in Tab. 2 wiedergegeben wird. Die Bestim-mung des Sedimentations-Koeffizienten der RNS ergab 520 = 3,8 — 4,0. Dieser Wert und der relativ hohe Guanin-Cytosin-Gehalt (59 — 60%) lassen ver-muten, daß es sich bei dieser Fraktion um lösliche RNS handelt. In der Nucleotidverteilung und im Sedimentations-Verhalten unterschieden sich die Eluate unter den beiden Maxima von Fraktion I nicht.

Fraktion II wurde mit einem Phosphatpuffer eluiert, der 0,58 — 0,60-molar an NaCI war. Nach saurer Hydrolyse des eingeengten Eluats mit 72-proz. Perchlorsäure konnte neben den Basen der DNS auch Uracil nachgewiesen werden. Demnach ent-hielt Fraktion II DNS und RNS, wobei wir nicht sagen können, ob die RNS als Partner eines RNS-DNS-Komplexes oder als selbständige RNS anzu-sehen ist. Für eine quantitative Bestimmung der Ba-sen bzw. Nucleotide war die verfügbare Substanz-menge zu gering. Aus gleichen Gründen unterblieb eine Bestimmung der Sedimentations-Koeffizienten.

Nach Elution mit Phosphatpuffer höherer NaCl-Konzentration erhielt man mindestens 3 UV-absor-bierende Fraktionen (III, IV, V ) , die sich an methy-liertem Serumalbumin nicht vollständig voneinander trennen lassen. Die Bestimmung ihrer Nucleotid-zusammensetzung wird somit problematisch. Wir versuchten diese Schwierigkeit dadurch zu umgehen, indem wir die Nucleotidverteilung im Eluat der 1. Hälfte der Fraktion III, in dem eines sehr engen Bereichs unterhalb des schwach ausgeprägten Maxi-mums der Fraktion IV und im Eluat der 2. Hälfte von Fraktion V durchführten.

Wie die Ergebnisse dieser Analysen und die Be-stimmung der Sedimentations-Koeffizienten zeigten (Tab. 2) , bestehen die Fraktionen III und IV aus zwei RNS-Komponenten von 5 = 17 beziehungs-weise 5 = 26. Sie besitzen möglicherweise den Cha-rakter ribosomaler RNS, da die Ribosomen pflanz-licher Gewebe in allen bisher untersuchten Fällen 2 verschiedene RNS-Arten enthalten, deren Sedimen-tations-Koeffizienten 5 = 17 — 18 bzw. 5 = 26 — 28 betragen21'22. Ebenso wie die RNS-Komponenten der pflanzlichen Ribosomen unterscheiden sich die RNS-Fraktionen III und IV in ihrer Nucleotid-zusammensetzung von der löslichen RNS durch einen höheren Gehalt von (AMP + UMP). Unter-einander gleichen sie sich in ihren Nucleotidverhält-nissen weitgehend, jedoch mit der einen Ausnahme,

0,8

-0.7

0,6

0,5

0,4

-0,3

-0,2

-0,1

daß nämlich Fraktion III („leichte" ribosomale RNS) einen etwas höheren UMP-Gehalt aufweist als Fraktion IV („schwere" ribosomale RNS).

Wie die Untersuchung des Sedimentations-Ver-haltens von Fraktion V ergab, bestand sie aus meh-reren RNS-Komponenten mit relativ hohen Sedi-mentations-Koeffizienten (s = 23 — 50). Möglicher-weise ist diese Fraktion mit der von CHROBOZCEK

und C H E R R Y 23 beschriebenen „m-RNS" aus Arachis-Cotyledonen zu vergleichen. Die an einer DNS syn-thetisierte Messenger-RNS besitzt eine der DNS ähn-liche Basenzusammensetzung und Basennachbar-schafts-Häufigkeit. Wenn im Fall von Antirrhinum sowohl die Kern-DNS als auch die Chloroplasten-DNS vom AT-Typus sind, so muß die von ihnen codierte Messenger-RNS einen relativ hohen AMP-und UMP-Gehalt besitzen. Tatsächlich zeichnet sich die heterogene Fraktion V durch einen hohen AMP-Gehalt aus. Erst Markierungsversuche und Prüfung ihrer Fähigkeit, Proteinsynthese in zellfreiem Ribo-somensystem zu stimulieren, könnten die Vermu-tung bestätigen, daß es sich hier um Messenger-RNS handelt.

Nach diesen Untersuchungen kommen in den Chloroplastenpräparaten von Antirrhinum majus vor: Säurelösliche RNS, wahrscheinlich Transfer-RNS (Fraktion I) , zwei RNS-Fraktionen (Fraktion III, IV), die wahrscheinlich aus Ribosomen stam-men, eine heterogene RNS-Fraktion (Fraktion V) , von der wir zur Zeit noch nicht sagen können, ob sie

Messenger-RNS darstellt und schließlich eine RNS-Komponente, die mit der DNS gemeinsam von me-thyliertem Serumalbumin eluiert wird.

Eine Verunreinigung der Chloroplastenpräparate mit Cytoplasma kann die Existenz bestimmter RNS-Fraktionen in den Chloroplasten vortäuschen. Der Verunreinigungsgrad unserer Präparate läßt sich nur sehr schwer abschätzen. Da es bisher nicht ge-lang, plastidenfreie Cytoplasmapräparate aus grü-nen Blättern zu erhalten, untersuchten wir die Nu-cleinsäuren aus Blättern und verglichen sie nach chromatographischer Auftrennung an methyliertem Serumalbumin mit den Nucleinsäuren aus Chloro-plasten des gleichen Blattmaterials. Abb. 3 b gibt ein solches Elutionsdiagramm der RNS und DNS aus Blättern von Antirrhinum wieder. Vergleichbar den Versuchen mit Plastiden-Nucleinsäuren wurden mit entsprechenden NaCl-Konzentrationen in Phos-phatpuffer (pn 6,8) 5 UV-absorbierende Fraktio-nen (I —V) erhalten. Wie die Nucleotid- und Basen-zusammensetzung zeigten, bestanden die Fraktionen I, III, IV und V aus RNS, Fraktion II aus DNS und RNS (Tab. 2) . Nach der Bestimmung der Nucleotid-zusammensetzung und der Sedimentations-Koeffi-zienten bestand Fraktion I aus säurelöslicher RNS, Fraktion III und IV möglicherweise aus den zwei ribosomalen RNS-Komponenten und Fraktion V aus mehreren RNS-Arten von unterschiedlichem Sedi-mentationsverhalten. Da wir in Fraktion II die DNS des Blattes vermuteten, wurde das zur Trockne ein-

Fraktion Mol/100 Mole Gesamtnueleotide A + U A + T Sedimentations -AMP UMP GMP CMP T * G + C G + C koeffizient (s20)

Chloroplasten I 21,8 ± 0 , 3 18,7 ± 0 , 2 31,5 ± 0,5 28,0 ± 0,2 - 0,68 3,8 - 4 , 0

I I I 23,6 ± 0 , 1 24,2 ± 0,3 30,4 ± 0,3 21,8 ± 0,2 0,91 17 I V 23,8 ± 0,5 21,8 ± 0,2 32,2 ± 0,6 22,2 ± 0,4 0,84 26 V 32,1 ± 0,2 23,3 ± 0,1 24,0 ± 0,3 20,6 ± 0,5 - 1,24 23-- 5 0

Blätter I 22,2 ± 0,3 18,3 ± 0,5 30,5 ± 0,4 29,0 ± 0,1 - 0,68 3,8 - 4 . 1

I I 34,1 ± 0,2 (3,3) 16,8 ± 0,3 16,1 ± 0,3 29,5 ± 0,4 1,93 12-- 1 3 , 5,0 I I I 23,0 ± 0,2 23,9 ± 0,6 30,8 ± 0,6 22,3 ± 0,2 0,88 17 IV 25,4 ± 0,7 21,1 ± 0 , 6 31,5 ± 0,3 22,0 ± 0,4 - 0,86 26 V 29,0 ± 0,3 23,4 ± 0,2 27,9 ± 0,3 19,7 ± 0,1 - 1,10 23 - 5 0

Tab. 2. Nucleotidzusammensetzung der Nucleinsäurefraktionen aus Chloroplastenpräparaten und Blättern von Antinhinum majus nach alkalischer Hydrolyse und zweidimensionaler Papierchromatographie bzw. nach Säulenchromatographie an Dowex-1 in der Formiat-Form. Mittelwerte aus je 8 Analysen mit Angabe des mittleren Fehlers des Mittelwertes. * Die DNS (Frak-

tion II) wurde mit 72-proz. HC104 hydrolysiert und ihre Basen in Mol/100 Mole Gesamtbasen angegeben.

21 P. 0 . P. Ts'O, R. SQUIRES, and J . BONNER, Federat. Proc. 1 8 , 23 H. CHROBOZEK and J . H. C H E R R Y , J . molecular Biol. 1 9 , 28 341 [1959]. [1966].

22 J. M. W A L L A C E and P. O. P. Ts'o, Biochem. biophysic. Res. Commun. 5, 125 [1961].

geengte Eluat dieser Fraktion mit 72-proz. Perchlor-säure hydrolysiert. Nach zweidimensionaler Papier-chromatographie konnten neben Uracil die Basen der DNS nachgewiesen werden. Nach dem Quotien-ten (A + T ) : (C + G) = 1,93 haben wir hier die Blatt-DNS (Kern-DNS und Plastiden-DNS) vom AT-Typus vorliegen. Die Uracilmenge in dieser Fraktion betrug durchschnittlich 3 - 4Mole/100Mole Gesamtbasen. Da wir Uracil auch nach einer RNase-Behandlung des Nucleinsäure-Extraktes in dieser DNS-Fraktion nachweisen konnten, scheint die RNS-Komponente der Fraktion II RNase-resistent zu sein und ist damit dem RNS-Partner eines DNS-RNS-Kom-plexes wie er mehrfach beschrieben wurde, vergleich-bar 23' 24. Für die DNS in Fraktion II bestimmten wir den Sedimentations-Koeffizienten 5 = 1 2 — 13.

Da eine nach M A R M U R 12 schonend extrahierte DNS aus Blattgewebe einen Wert von ungefähr 5 = 27 be-sitzt, muß angenommen werden, daß beim mecha-nischen Aufschluß der Zellen im Starmix die DNS in kleinere Bruchstücke zerschlagen wurde.

Nach unseren Sedimentations-Messungen konnten wir in Fraktion II eine weitere UV-absorbierende Komponente von 5 = 5,0 — 5,5 in geringer Konzen-tration nachweisen. Ihre Charakterisierung soll dem-nächst erfolgen.

Vergleicht man die Nucleinsäure-Fraktionen des Blattmaterials mit denen, die aus Chloroplastenprä-paraten extrahiert wurden, so fällt ein quantitativer Unterschied im Bereich der Fraktionen III und IV auf: Der Anteil der 175-RNS war im Plastidenprä-parat im Verhältnis zur 2Ö5-RNS höher als im Blatt-

l o g i *

-—Gradient

Abbn. 4 a, b. Zonenzentrifugation von RNS-Präparaten aus a) Chloroplasten und b) aus Blattmaterial von Antirrhinum majus. Ein 4 ml Saccharosegradient (5 — 15%) wurde mit 0,5 ml einer RNS-Lösung (0,05 M Phos-phatpuffer, p 6,8 und 0,1-molar an NaCI) überschichtet und 5 Stdn. bei 37000 Upm in einem Spinco SW 39 Rotor zentrifugiert. Durch Punktieren der Celluloseröhrchen am Boden wurden Tropfenfraktionen gesam-melt und ihre Extinktion (log / „ / / ) bei

260 nm gemessen.

2 4 G . R I C H T E R U . H . S E N G E R , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 9 5 , 3 6 2 [ 1 9 6 5 ] .

material. Daß ein solcher quantitativer Unterschied vorlag, zeigten auch die Sedimentationsversuche der RNS-Komponenten aus Blättern und Chloroplasten in einem Saccharose-Gradienten (Abbn. 4 a, b ) . Das Verhältnis der 175- zur 26s-RNS war in den Chloro-plastenpräparaten zu Gunsten der „leichteren" RNS verschoben. Ahnliche Verhältnisse fanden BRAWER-MAN und EISENSTADT 25 für die ribosomale RNS der Piastiden und des Cytoplasmas von Euglena.

Signifikante Unterschiede in der Nucleotidzusam-mensetzung und im Sedimentations-Verhalten der RNS-Fraktionen aus Blättern und Chloroplasten konnten nicht nachgewiesen werden.

Sehen wir zunächst von den etwas unübersicht-lichen Verhältnissen der Fraktion II ab, so konnten wir zeigen, daß alle RNS-Fraktionen des Blattes auch in unseren Chloroplastenpräparaten vorkamen. Dieser Befund erschwert eine genaue Lokalisation der einzelnen RNS-Komponenten, das heißt wir können aus diesen Ergebnissen nicht ohne weiteres folgern, daß die gefundenen RNS-Fraktionen in ihrer Gesamtheit aus den Chloroplasten stammen. Lassen wir diese Unsicherheit außer acht, so lassen sich die Befunde mit anderen an isolierten Chloro-plasten gewonnenen Ergebnissen in Einklang brin-gen. So fanden HEBER 26 und SISSAKIAN et al. 27 je-weils im 100 000 g-Uberstand aufgebrochener Chloroplasten von höheren Pflanzen eine „lösliche" RNS, deren Akzeptoraktivität mit markierten Aminosäuren überprüft wurde 27. Ebenso lassen die Untersuchungen von SPENCER und WILDMAN2 8 über die Proteinsynthese isolierter Spinatchloroplasten es als sicher erscheinen, daß die Piastiden als Zell-organe mit aktivem Proteinsynthese-System lösliche ( = transfer) RNS enthalten. Seit den Untersuchun-gen von LYTTLETON 29 wissen wir, daß Chloroplasten höherer und niederer Pflanzen Ribosomen enthal-ten. Sie unterscheiden sich von Cytoplasmariboso-men in ihrem Sedimentations-Verhalten und — spe-ziell bei Chloroplastenribosomen aus Algen — in

2 5 G . B R A W E R M A N and J. M . EISENSTADT, J. molecular Biol. 1 0 , 403 [1964].

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sterdam] 119,192 [1966]. 3 1 R . W O L L G I E H N , M . R U E S S U . D . M U N S C H E , Flora [Jena] 1 5 7 ,

92 [1966].

der Basenzusammensetzung ihres RNS-Anteils. BRAWERMAN und EISENSTADT 25 fanden in den Plasti-denribosomen von Euglena 2 RNS-Arten von s = 14 und 5 = 1 9 , während BALTUS und QUERTIER 30 in den Plastidenribosomen von Acetabularia 2 RNS-Kom-ponenten mit den Sedimentations-Koeffizienten 5 = 18 und 5 = 28 nachweisen konnten. Bisher fehlte ein soldier Nachweis von 2 Ribonucleinsäuren in den Ribosomen von Chloroplasten höherer Pflanzen. Unsere Ergebnisse deuten jedoch daraufhin, daß Ribosomen aus Chloroplasten den Cytoplasmaribo-somen entsprechend 2 RNS-Arten besitzen. Das Er-gebnis einer kürzlich veröffentlichten Untersuchung von WOLLGIEHN und Mitarbb. 31 läßt sich möglicher-weise in diesem Sinne deuten.

Der experimentelle Nachweis einer DNS-abhängi-gen RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten von Algen 3 2 - 3 4 spricht für die Existenz einer Messenger-RNS in den Piastiden.

Über den Anteil der Chloroplasten-RNS an der Gesamt-RNS der Zellen lassen sich nur schwer exakte Angaben machen. Das vollständige Erfassen der gesamten RNS eines pflanzlichen Gewebes ist sehr problematisch und die diesbezüglichen Angaben sind kritisch zu beurteilen35. Eine Überschlagsrech-nung mit Hilfe der uns zur Verfügung stehenden Daten ergab, daß ungefähr 15% der gesamten RNS von Antirrhinum-Blättern in den Chloroplasten lokalisiert sind. Das entspricht den Angaben von WOLLGIEHN36 für Tabakblätter ( 1 5 - 2 0 % ) und denen von BRAWERMAN et al. 37 für Euglena ( 1 0 bis 20%).

Experimenteller Teil

Herstellung der Chloroplastenpräparate. Die in die-sen Experimenten untersuchten Chloroplasten wurden mit Hilfe organischer Lösungsmittelgemische aus den Blättern von Antirrhinum majus Sippe 50 isoliert. Die-ses Verfahren wurde schon früher beschrieben 10.

32 J. T. O. K I R K , Biochim. biophysic. Res. Commun. 14, 393 [1964].

33 H. G. SCHWEIGER and S . B E R G E R , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 87, 533 [1964].

3 4 V . C . S H A H and H. L Y M A N , J. molecular Biol. 2 9 , 1 7 4 [ 1 9 6 6 ] . 35 H. N . M U N R O and A. F L E C K , in: Methods in Biochemical

Analysis. Vol . 14, Ed. G . G L I C K , Interscience Publ. (1966), S . 113.

36 R. WOLLGIEHN, Diplomarbeit, Halle 1958. 37 G. B R A W E R M A N , A. O. POGO, and E. C H A R G A F F , Biochim. bio

physica Acta [Amsterdam] 55,326 [1959].

Extraktion der DNS. Zur Extraktion der DNS wur-den Chloroplastenpräparate nach einer von M A R M U R 1 2

angegebenen Methode behandelt. 2 g isolierte Chloro-plasten wurden in 50 ml einer Lösung, die 0,15-molar an NaCI und 0,1-molar an EDTA (Äthylendiamin-tetraessigsäure) war, suspendiert. Nach Zugabe von 5 ml einer 25-proz. Na-Dodecylsulfatlösung wurde die Suspension 10 min bei 18 °C gerührt (zur Dichte-bestimmung der DNS wurde auf ein Erwärmen der Suspension auf 65 °C verzichtet). Danach wurden 15 ml 5-m. NaC104-Lösung und 70 ml einer Chloro-form/Isoamylalkohol-Mischung (24 : 1) hinzugegeben und 30 min gerührt. Bei dem darauffolgenden Zentri-fugieren (5000 g, 10 min) trennten sich die zwei Pha-sen, von denen die wäßrige Phase sorgfältig abgesaugt und die organische mit 25 ml einer 0,015-m. NaCl-Lö-sung, die zusätzlich 1,5 mMol Na-Citrat enthielt, ver-setzt und 30 min gerührt wurde. Anschließend wurde die Suspension zentrifugiert (5000 g, 15 min), die wäßrige Phase abgesaugt und mit der zuvor erhaltenen wäßrigen Phase vereinigt. Dieser wäßrige Rohextrakt wurde über Nacht gegen eine 0,015-m. NaCl-0,0015-m. Na-Citrat-Lösung dialysiert, anschließend einer RNAse-Behandlung (10 y RNAse/ml, 20 min bei 36 °C) unter-worfen und wiederum über Nacht gegen 0,015-m. NaCl-0,0015-m. Na-Citrat-Lösung dialysiert. Der so erhaltene Chloroplastenextrakt diente als Ausgangslösung für die Bestimmung der Dichte und des Hyperchromasie-Ef-fekts der Plastiden-DNS.

Die Extraktion der DNS aus Blattmaterial erfolgte nach der gleichen Methode.

Extraktion der RNS. 2 g isolierte Chloroplasten wur-den mit 10 ml eines Suspensionsmediums (Tris-HCl-Puffer, PH 7,5, 2-10-"3-m. MgS04 , 0,5% Na-Dodecyl-sulfat, 0,1% Bentonit) in einem Glashomogenisator (nach Potter-Elvehjem) 1 min homogenisiert. Das Ho-mogenat wurde mit einem Volumen puffergesättigtem Phenol 2 — 3 min geschüttelt und anschließend bei 2 °C zentrifugiert (3000 g, 20 min). Die wäßrige Phase wurde abgesaugt und die Phenolphase mit 5 ml 0,05-m. Tris-HCl-Puffer (pH 9,0, 2-10~3-m. MgS04) geschüt-telt. Nach Zentrifugation wurde wiederum die wäßrige Phase abgehoben und mit der zuvor erhaltenen ver-einigt. Dieser Rohextrakt wurde 15 Stdn. bei 4 °C ge-gen 0,05-m. Phosphat-Puffer, PH 6,8 und 0,1-molar an NaCI, dialysiert. Nach erfolgter Dialyse wurden die Nucleinsäuren durch Zugabe von 3 Volumen Äthanol bei —15 °C ausgefällt. Das abgetrennte Sediment wurde in Phosphatpuffer, PH 6,8, gelöst. Diese Lösung wurde säulenchromatographisch untersucht und diente als Ausgangslösung für die Zonenzentrifugation der RNS.

Die Extraktion der RNS aus Blattmaterial erfolgte nach der gleichen Methode.

Trennung der RNS-Fraktionen. Die säulenchromato-graphische Auftrennung der Nucleinsäuren erfolgte an methyliertem Serumalbumin mit Kieselgur als Träger-substanz 38. Jede Säulenpackung wurde nur einmal ver-

38 N. SUEOKA and T. Y. CHENG, J. molecular Biol. 4, 161 [1962],

wendet. Zur Trennung der Nucleinsäuren wurden 50 ml einer Nucleinsäurelösung, die mit 0,05-m. Phosphat-puffer auf den pH-Wert von 6,8 gebracht worden war, auf eine Säule gegeben (20,0*2,8 cm). Alle an Albu-min nicht adsorbierten Substanzen wurden mit 0,1-m. NaCI in 0,05-m. Phosphatpuffer, pn 6,8, ausgewaschen. Die Elution der Nucleinsäuren erfolgte in zwei Stufen: 1. Elution der niedermolekularen säurelöslichen RNS mit einem nicht-linearen Gradienten von 0,2-m. NaCI bis 0,5-m. NaCI in 0,05-m. Phosphatpuffer (PH 6,8). 2. Elution der höhermolekularen Nucleinsäuren mit einem linearen Gradienten von 0,5-m. NaCI bis 1,1-m. NaCI in entsprechendem Phosphatpuffer.

Die NaCl-Konzentration in den eluierten Fraktionen wurde refraktometrisch bestimmt. Die automatische Re-gistrierung der Absorption des Eluats erfolgte kon-tinuierlich bei 254 nm (Uvicord-LKB).

Bestimmung der Basenzusammensetzung der DNS und RNS. Die Bestimmung der Basenzusammensetzung der DNS erfolgte nach einer schon früher beschriebe-nen Methode 11.

Die RNS-Fraktionen, die von einer Methylierten-Albumin-Säule mit steigenden Salzkonzentrationen eluiert worden waren, wurden gegen dest. Wasser dia-lysiert, zur Trockne eingeengt und alkalisch (0,3-ra. KOH, 17 Stdn. bei 37 °C) hydrolysiert. Nach Neutrali-sation des Hydrolysats mit Dowex-50 (H®-Form) wur-den die Ribonucleotide an Dowex-1 (HCOOQ-Form) mit Ameisensäure steigender Konzentration chromato-graphisch aufgetrennt. Die Nucleotidfraktionen wurden zur Trockne eingeengt und ihre Absorption bei 260 nm (Zeiss-PMQ II) in 0,01 -n. HCl gemessen.

Die an methyliertem Albumin getrennten Nuclein-säuren wurden auch einer sauren Hydrolyse mit 72-proz. Perchlorsäure (90 min bei 100 °C) unterwor-fen. Nach Neutralisation mit 1-n. KOH wurde das aus-gefällte KC104 abgetrennt, der Überstand zur Trockne eingeengt und mit 0,5 ml 0,1-n. HCl aufgenommen. Die Basen wurden papierchromatographisch getrennt und durch ihre Absorptionsspektren charakterisiert.

Vitrazentrifugen-Analysen. Die Bestimmung der Sedimentationskoeffizienten der RNS-Fraktionen wurde mit einer Analytischen Ultrazentrifuge (Modell E-Beckman) mit UV-Absorptionsoptik (Monochromator, 260 nm) durchgeführt39. Die zu untersuchenden Nu-cleinsäuren wurden in gepufferter 0,1-m. NaCl-Lösung (pH 6,8) bei 50740 Upm und 20 °C zentrifugiert. Die Versuche wurden in einer Standardzelle des AN-D Ro-tors mit einem Kel-F-Zwischenstück (12 mm, 4°) durchgeführt. Die Aufnahme-Intervalle betrugen bei niedermolekularen Nucleinsäuren 4 min und bei höher-molekularen 2 Minuten. Bei Verwendung von „Com-mercial-Film"-Material (Kodak) und Ilford-Film FP 3 ergab sich eine Belichtungszeit von 7 Sekunden. Die Aufnahmen wurden mit einem Analytrol-Densitometer (Beckman) ausgewertet. Die Sedimentations-Koeffizien-ten werden als 520,Puf fer für eine bestimmte Nuclein-säure-Konzentration angegeben (log I j l aller unter-

39 H. G. ELIAS, in: Ultrazentrifugen-Methoden. Beckman Instruments GmbH, München 1961, 2. Auflage.

suchten Nucleinsäuren betrug bei 260 nm 0,5 — 0,6). Die Bestimmung der Dichte der DNS („buoyant den-sity") erfolgte gleichfalls in einer Analytischen Ultra-zentrifuge. Die zu untersuchenden DNS-Lösungen mit der optischen Dichte log 70// = 1,000 wurden durch Zu-gabe von festem CsCl (Merck) auf den Brechungs-index n2 = 1,3993 eingestellt. Aus der Beziehung zwi-schen Brechungsindex n™ und der Dichte £)20 ergibt sich 40:

£>20 = 11,15702-^-13,91225 .

/ig = 1,3993 entspricht somit einer Dichte von £)20

= 1,700. Die Zentrifugation erfolgte in einer Standard-zelle mit Kel-F-Zwischenstück (12 mm, 4°). Zur Kor-rektur der Lichtabweichung, bedingt durch den Bre-chungsindex-Gradienten des Salzes, wurde die Zelle mit einem Keilfenster von 2° versehen. Nach 22 Stdn. Zen-trifugation bei 44740 Upm und 20 °C wurden Aufnah-men gemacht: Belichtungszeit 60 —90 sec mit Licht der Wellenlänge 260 nm. Die Aufnahmen wurden mit einem Analytrol-Densitometer ausgewertet. Die Berechnung der Dichte der DNS erfolgte mit Hilfe eines Referenz-punktes bekannter Dichte innerhalb des ausgebildeten Gradienten. Unter diesem Referenzpunkt („isoconcen-tration point") versteht man den Punkt im Salzgra-dienten, der nach 22 Stdn. Zentrifugation die Anfangs-dichte (p20= 1,700) besitzt. Die Berechnung der Lage dieses Punktes im Gradienten erfolgte nach I F F T et al.41:

wobei ZR , und jeweils die Abstände des Refe-renzpunktes, des Meniscus und des Bodens der Zelle vom Rotationszentrum darstellen. Die Dichte der DNS läßt sich sodann aus folgender Beziehung berechnen 42:

4 0 D . J . M C C O R Q U O D A L E and Y . T . L A N N I , J . molecular Biol. 10,10 [1964].

41 J. B. IFFT, D. H. V O E T , and J. V I N O G K A D , J. physic. Chem. 65,1138 [1961].

, Ca) , 2 2 £>DNS = £ R + £ ß (XDNS — X R ) .

wobei £>DNS die Dichte der DNS, £>R die Dichte der Salzlösung im Referenzpunkt, co die Winkelgeschwin-digkeit, Z D N S der Abstand der DNS-Bande vom Rota-tionszentrum und ß eine Konstante, in welche die Kom-pressibilität der Lösung und die Form des Gradienten eingeht, darstellen.

Zur Zonenzentrifugation der aus Blättern und Chloroplasten extrahierten RNS wurde ein linearer Rohrzuckergradient (5 — 15% Rohrzucker in 0,05-m. Phosphatpuffer PH 6,8 und 0,1-m. NaCl) mit 0,5 ml eines RNS-Extraktes, wie er für die Säulenchromato-graphie verwendet wurde, überschichtet und 5 Stdn. bei 37000 Upm in einem SW 39 Rotor der Spinco Ultrazentrifuge zentrifugiert. Durch anschließendes Punktieren der Celluloseröhrchen am Boden wurden Tropfenfraktionen gesammelt mit 1 ml Phosphatpuffer versetzt und ihre Extinktion bei 260 nm im Spektral-photometer gemessen.

Thermische Denaturierung. Der bei thermischer De-naturierung der DNS zu beobachtende Hyperchromasie-Effekt, der sich durch ein rasches Ansteigen der Extink-tion (log I j l bei 260 nm) der DNS-Lösung in einem engen Temperaturbereich anzeigt, wurde mit Hilfe eines temperierbaren Küvettenhalters gemessen. Der Küvettenhalter wurde dabei an einen Ultrathermosta-ten angeschlossen und die Temperatur der zu prüfen-den Lösung direkt an einem in den Deckel des Küvet-tenhalters eingelassenen Thermometer abgelesen. Für diese Versuche wurde die DNS aus dem DNS-Roh-extrakt der Chloroplasten durch Zugabe von Äthanol ausgefällt und in 0,15-m. NaCl-0,015-m. Na-Citrat pH 7,0 gelöst.

4 2 J . E . H E A R S T , J . B . I F F T , and J . VINOGRAD, Proc. nat. Acad. Sei. [Washington] 47,1015 [1961].