This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Über die Bindung von 4-Hydroxy-2.3-enalen an Protein-SH-Gruppen E . S C H A U E N S T E I N u n d F . D O R N E R

Lehrkanzel für Biochemie der Universität Graz, Österreich

und

J . S O N N E N B I C H L E R

Max-Planck-Institut für Biochemie, München

(Z. Naturforsch. 23 b , 316—319 [1968]; eingegangen am 24. Ju l i 1967)

4-Hydroxy-pentenal und 4-Hydroxy-octenal reagieren prompt mit Glutathion, wobei es zur Addi-tion der SH-Gruppe an die Doppelbindung des Aldehyds kommt. Die Aldehyd-Gruppe bildet sodann im Sekundärschritt mit der Hydroxy-Gruppe an C4 ein zyklisches Halbacetal. Das Reaktionsprodukt liefert mit 2.4-DNP-Hydrazin das Hydrazon eines gesättigten Aldehyds und reagiert auch mit S c h i f f schem Reagenz positiv. Die Reaktion von Hydroxy-enalen mit Glutathion und das dabei gebildete Reaktionsprodukt dient als Modell fü r die Reaktion der Hydroxy-enale mit isolierten und zellständigen Proteinen.

4-Hydroxy-Zrans-2.3-octenal-l, ein wasserlösliches Autoxydationsprodukt von 9.12-Linolsäuremethyl-e s t e r 2 , zeigt, wie synthetisch hergestellte homologe Hydroxyenale, eine außerordentliche Affinität gegen-über — SH-Verbindungen 3 .

Charakteristisch ist die rasche Reaktion mit Cy-stein 3 oder Glutathion 4, ebenso wie die starke selek-tive Hemmung — zellständiger wie auch isolier-ter — funktioneller SH-Enzyme. Die Hemmung kann durch nachfolgenden Cystein-Zusatz wieder auf-gehoben werden 4 ' 5, ist also reversibel.

Bei GAPDH * konnte am isolierten Enzym die fü r die vollständige Blockade erforderliche Menge an Aldehyd bestimmt werden, wobei 4 Moleküle Aldehyd pro Enzymprotein gefunden werden, ent-sprechend der Zahl funktioneller — SH-Gruppen 4.

Auch Rinderserumalbumin bindet Hydroxyenale; hier ergab die quantitative Aldehydbestimmung ~ 2 - 1 0 - 5 M o l e Hydroxypentenal pro g Albumin 4 . Es ist zu vermuten, daß die Hydroxyenale an die — SH-Gruppen der Proteine gebunden werden, und damit erhebt sich die Frage nach der Art dieser Bin-dung.

Von besonderer Wichtigkeit war der Befund, daß Proteine, die mit dem Hydroxyenal gekoppelt hat-ten, nach Entfernung des überschüssigen Aldehyds durch Dialyse und nachfolgende Behandlung mit 2 .4-DNPH ein proteingebundenes Hydrazon geben 4.

1 E . SCHAUENSTEIN, H . ESTERBAUER, G . JAAG U. M . TAUFER, M h . Chem. 95, 182 [1964].

2 E. SCHAUENSTEIN U. H. ESTERBAUER, Fette, Seifen, Anstrich-mittel, im Druck (1967).

3 A. HUBMANN, Diss., Univ. Graz 1964.

Die Intensität des Absorptionsmaximums des Hydra-zons ermöglicht die Berechnung der angelagerten Aldehydmenge 4. Die Wellenzahl des Hydrazonmaxi-mums (27250) zeigt, daß es sich um das Hydrazon eines gesättigten Aldehyds handelt. Das bisher Ge-sagte erlaubt über die Art der Bindung des Hy-droxyenals an Eiweiß die Aussage, daß die Bindung reversibel ist und vermutlich unter Absätt igung der Doppelbindung verläuft.

Da die Aufklärung des Bindungsmechanismus der Hydroxyenale an Eiweiß zu kompliziert erschien, soll in der vorliegenden Arbeit versucht werden, die aufgeworfene Frage an einer Modellverbindung näher zu untersuchen.

Als Modell wurde Glutathion gewählt. Gegenüber dem Cystein entspricht es besser den Eiweißmolekü-len, insbesondere macht es Sekundärreaktionen mit benachbarten a-NHo-Gruppen 6 unmöglich.

Als Aldehyde wurden 4-Hydroxy-2.3-octenal (HOE) und 4-Hydroxy-2.3-pentenal (HPE) ver-wendet.

UV-Spektren

Die Hydroxyenale können auf Grund ihres typi-schen Absorptionsspektrums im UV leicht erkannt werden (Abb. 1 ) .

Aus dem Vergleich der Kurven geht eindeutig her-vor, daß die Reaktion mit Glutathion mit einem

4 F. DORNER, Diss., Univ. Graz 1967. 5 L. AUBÖCK, Diss., Univ. Graz 1965. * GAPDH = Glyceraldehydphosphatdehydrogenase: NAD. 6 K . WALLENFELS U. CH. STREFFER, B i o c h e m . Z . 3 4 6 , 1 1 9

[1966],

Verschwinden der konjugierten Doppelbindung des Aldehyds verbunden ist.

Kurve b weist eine schwache Absorptionsschulter auf, die auf das Vorhandensein eines geringfügigen Rests an freiem Aldehyd (schätzungsweise 5%) schließen läßt.

0.0

t

-1,0

~2'° 40000 45000 50000 v' [cm'1]

Abb. 1. UV-Spektrum des H P E in wäßriger Lösung vor (a) und nach (b) der Umsetzung mit Glutathion.

Die zeitliche Änderung der Extinktion bei 44750 v bietet ferner die Grundlage fü r eine Kontrolle des Reaktionsablaufes (vgl. hierfür Abb. 2 ) .

In die Meßküvette wird zum vorgelegten Gluta-thion das gleiche Volumen HPE im entsprechenden Molverhältnis hinzugefügt und der Reaktionsablauf bei eingestellter konstanter Wellenlänge von 44750 c m - 1 verfolgt. Die Reaktion lief in einem phosphatgepufferten wäßrigen Medium (pH 7,4) bei 20 °C ab.

|

| 0.7

3 0 , 6 iO J 0.5

^r o.4

0.3

0.2

0,1

Abb. 2. Extinktionsverlauf während der Reaktion von a) 1,2 • 10—4-m. Glutathion mit 1,2 -lO"4-™. HPE, b) 2,4 l O - 4 -m. Glutathion mit 1,2 • lO"4-™. HPE, c) l , 2 -10~ 2 -m. Glu-

tathion mit 1,2 •10~4-m. HPE.

Wie aus der Abbildung hervorgeht, ist nach 200 Min. Reaktionszeit beim Molverhältnis Glutathion : H P E = 1 : 1 rund 75%, beim Molverhältnis 2 : 1 rung 95% des HPE und beim Molverhältnis 100 : 1

bereits nach einigen Sek. der gesamte Aldehyd um-setzt.

Um das Reaktionsprodukt rein zu isolieren, ist es zweckmäßiger, mit überschüssigem Aldehyd zu arbei-ten, als mit überschüssigem Glutathion, da nicht um-gesetztes HE leichter abzutrennen ist: Das Gluta-thion * wird in Wasser aufgenommen und mit NaOH auf pH 7,4 eingestellt, hierauf mit dem a,ß-ungesättigten Aldehyd im Molverhältnis Glutathion : Aldehyd = 1 : 1,5 versetzt und einige Stdn. stehen gelassen. Der überschüssige Aldehyd wird mit CHC13

ausgeschüttelt und die vollständige Entfernung dünn-schichtchromatographisch geprüft (Fließmittel He-xan-Äther, Sprühreagenz 2 .4 -DNPH) . Die Einheit-lichkeit des Umsetzungsproduktes (Rf = 0,49) wird im Fließmittel n-Butanol : Eisessig : H 2 0 = 8 : 2 : 2 geprüft . Sprühreagenz: Phosphormolybdänsäure. Die wäßrige Phase wird am Vakuum zur Trockene gebracht und sodann über Kieselgel getrocknet. Durch Umfällen in Wasser wird ein hochreines Pro-dukt erhalten, Ausbeute 30 Prozent.

Glutathion-HOE-Addukt: weiß-kristallin Zp. 136 °C. Glutathion-HPE-Addukt: weiß-kristallin Zp. 176 °C.

Die Reaktionsprodukte Glutathion-HPE und Glu-thathion-HOE zeigen im mittleren UV kein Absorp-tionsmaximum mehr, sondern lediglich eine steile Grenzabsorption, die mit der Absorption des freien Glutathions praktisch zusammenfällt .

1.0

\ cc §>

0.0

40000 45000 50000 v'[cm-!]—*-

Abb. 3. UV-Spektrum von a = Glutathion, b = Glutathion-H P E .

Der £-Wert der Glutathion-HPE-Verbindung bei 45000 v beträgt nach unseren Messungen 4,52, der des freien H P E dagegen 130 7, d. h. es können vom

* Fa. Theodor Schuchardt, München. 7 H . ESTERBAUER U. W . WEGER, M h . C h e m . 9 8 , 1 8 8 4 [ 1 9 6 7 ] .

T

freien HPE maximal etwa 3% in der Lösung anwe-send sein. Da aber die Kurve b keinerlei Andeutung eines Maximums erkennen läßt, müssen die tatsäch-lich anwesenden Anteile von freiem H P E in der Lö-sung im Promillebereich liegen.

Das Hydrazon der Reaktionsprodukte

Das feste Reaktionsprodukt (20 mg) wird in 3,7 ml H 2 0 gelöst und im Molverhältnis 1 : 1,5 mit 3,7 ml Hydrazinreagenz versetzt. Hydrazinreagenz: 600 mg 2.4-DNPH, 4,5 ml konz. H 2 S 0 4 , 45 ml Äthanol, 102 ml Wasser.

Nach 2 Stdn. wird das überschüssige Hydrazin-reagenz (Rf = 0,23) dünnsdiichtchromatographisch abgetrennt (Kieselgel G, Fließmittel CHC13), das am Start verbleibende Produkt mit Alkohol eluiert.

Das Hydrazon der Glutathion-HPE-Verbindung wurde in reinem Wasser und in alkoholischer KOH spektrometrisch untersucht.

o.o

t Uj

I5

-1.0

-2.0

15000 20000 25000 30000 35000 40000 V'[cm-']

Abb. 4. Absorptionsspektren des Glutathion-HPE-Hydrazons in Wasser (a) und alkoholischer KOH (b), c) 2.4-DNPH des

n-Pentanals, d) 2.4-DNPH von 4-Hydroxy-2.3-enalen.

Man erkennt, daß das 2.4-DNPH der Glutathion-HPE-Verbindung bei 27250 v ein scharfes Ab-sorptionsmaximum und bei 32500 v das Absorp-tionsminimum aufweist. Diese Wellenzahlen stim-men mit denen des zum Vergleich aufgenommenen 2.4-DNPH von n-Pentanal ausgezeichnet überein, während das 2.4-DNPH von 4-Hydroxy-2.3-enalen wegen der zusätzlichen a,/?-Doppelbindung eindeutig rot verschoben liegt. Auch Kurve b entspricht den Absorptionsdaten des 2.4-DNPH eines gesättigten Aldehyds.

IR-Spektren

Im IR-Spektrum des Reaktionsproduktes ist die Abwesenheit der — SH-Bande bei 2530 c m - 1 beson-ders zu erwähnen, was den Befund stützt, daß die — SH-Gruppe des Glutathions reagiert hat. Die übri-

gen Banden zwischen 3300 c m - 1 und 2600 c m - 1

entsprechen in etwa den addierten Spektren der rei-nen Ausgangsverbindungen. Das Fehlen der Bande bei 1709 c m - 1 ist darauf zurückzuführen, daß nicht die freie Säure, sondern das neutralisierte Produkt aufgenommen wurde. Die Abwesenheit der im HPE-Spektrum scharf hervortretenden Bande bei 975 c m - 1

weist darauf hin, daß die a b s t ä n d i g e Doppelbin-dung des Aldehyds bei der Reaktion mit dem Glu-tathion verändert worden sein dürfte. Da aber im Bereich der isoliertständigen — C = O-Gruppen bei 1740 c m - 1 keine neue Bande auftritt, kann das ent-standene Produkt keine freie Aldehydgruppe be-

H I

sitzen. Interessant ist noch das Fehlen der — C — OH-Valenzschwingung bei 1110 c m - 1 , die im Spektrum

/ +

9 Xt r 7 / If A r

Abb. 5. IR-Spektrum des Umsetzungsproduk-tes Glutathion-HPE in KBr (2 mg/500 mg KBr) und von reinem Glutathion (2 mg/500 KBr)

und reinem H P E (NaCl-Aufstrich).

des H P E deutlich auftr i t t . Eine Beteiligung dieser 4 -Hydroxy lg ruppe des H P E an der Reaktion ist da-her wahrscheinlich.

Zusammenfassend läßt sich aus den bisherigen Daten sagen, daß bei der Reaktion zwischen Gluta-thion u n d Hydroxyenalen die — SH-Gruppe, die Doppe lb indung des a„/?-ungesättigten Aldehyds und die — OH-Gruppe des Hydroxyenals beteiligt scheint. Die Verb indung zeigt mit 2 .4-Dini t rophenylhydrazin die Reakt ion eines gesättigten Aldehyds, der aber nicht in f re ie r F o r m vorliegen kann. Die vollstän-dige S t ruk tur formel ergibt eine Analyse der NMR-Spektren (aufgenomemn in D 2 0 und d 6 DMSO bei 6 0 M H z ) :

Zusätzlich zu den unveränder ten Signalgruppen des Glutathions erscheinen im Spektrum des Gluta-th ion-HOE folgende Wasserstoffresonanzen ( D 2 0 -Spekt rum) :

[ppm] a) 0,88 In t . 3 Triplett C H 3 -b) 1,4 6 - ( C H 2 ) 3 -c) ca. 2,3 2 Multiplett - C H 2 -d) ca. 3 1 Multiplett — CH— 1 i s e) 3,75 1 Multiplett - C H -1

0 f ) 5,5 1 Multiplett — CH—0 i 1

0

Tab. 1. Wasserstoffresonanzen der Glutathion-HOE-Verbin-dung in D 20.

I m Spek t rum fehlt die typische Aldehydresonanz um 9 ,5 ppm, wie sie sichtbar wäre, wenn mehr als 5% Aldehyd in f re ier F o r m vorliegen würde .

Die Daten sind in Ubereins t immung mit einer Model lverb indung aus Glutathion und Pentena l :

(a) 0,95 (3) tripl.; (b) 1,65 (2) mult.; (c) 2,3 (2) mult.; (d) 3 (1) mult.

Das scharfe Dublett (7 = 7 Hz) der Glutathion — CH 2 — S-Gruppierung bei 2 ,95 ppm erleidet in

beiden Spektren weitere Aufspal tungen, was mit einer Behinderung der Rotat ion dieser — CH2-Gruppe verstanden werden kann.

Aus den NMR-Daten läßt sich folgende Struktur-formel f ü r das Glutathion-HOE aufstellen, wobei die tabellierten Wassers toffgruppierungen mit Buch-

8 W . BURKL, E . SCHAUENSTEIN U. I . KRAMER, Z . N a t u r f o r s c h g . 22 b, 763 [1967].

staben gekennzeichnet s ind :

Glutathion \ CH2 1

(d)ni cH2(c)

CH3—(CH2)3— c /CH— OH (a) (b) Diese S t ruk tur steht in Ubere ins t immung mit den

UV- und IR-spektroskopischen Daten. Daß das Reakt ionsprodukt mit 2 .4 -DNPH das

Hydrazon eines gesätt igten Aldehyds liefert, ist ver-ständlich. Das gleiche gilt auch f ü r die S c h i f f -sche Reakt ion, die mit dem Reakt ionsprodukt gleich-falls positiv ausfäl l t .

F ü r die Reakt ion zwischen Hydroxyenalen und Prote inen erscheint uns die beschriebene Additions-verb indung als geeignetes Model l : Wie bereits er-wähnt , l iefern isolierte Pro te ine sowie St rukturpro-teine intakter Zellen 8 nach Kopplung mit H E 2.4-DNP-Hydrazone ; ihre Absorpt ionsspektren entspre-chen vol lkommen den Spektren der Hydrazone der Gluta th ion-HE-Verbindung. Da raus darf geschlossen werden, daß die B indung der H E an die — SH-Grup-pen von Makropro te inen ebenso ver läuf t wie die B indung an das Glutathion.

Allerdings zwingt die Reversibil i tät der Addi t ion von H E an funkt ionel le — SH-Enzyme zur Annahme folgenden Gleichgewichts:

Protein-SH + HE ^ HE-Protein . I I I

Nach Kopp lung mit dem Aldehyd verliert bei-spielsweise das Enzym G A P D H seine Aktivi tät ; nach Zusatz von reichlich Cystein jedoch erscheint die Ak-tivität innerhalb von Sek. in vollem Ausmaße wie-der .

In diesem Fall stört das zugesetzte Cystein das Gleichgewicht u n d bewirkt die Ablösung des gebun-denen Aldehyds vom Pro te in . Allerdings kann ein solches Gleichgewicht n u r ex t rem auf Seiten des Re-akt ionsproduktes ( I I ) verschoben liegen, denn nach dem UV-Spekt rum der wäßr igen Lösung des reinen Reakt ionsproduktes (Abb. 3) können n u r Promil le freies H E nachgewiesen werden und auch das Po-l a r o g r a m m dieser Lösung zeigt keine meßbaren An-teile einer f re ien SH-Gruppe.

Die vorliegende Arbeit wurde teilweise mit Subven-tion des österreichischen Forschungsrates durchgeführt. Wir danken Herrn Prof. Dr. A. BUTENANDT für die För-derung der Arbeit. Frl . T. SCHILD danken wir für tech-nische Hilfe.