Orale, aktive Immunisierung neugeborener Ferkel gegen Escherichia coli: Wirksamkeitsnachweis im Darmligaturtest

Zbl. Vet. Med. B, 22,488--498 (1975) @ 1975 Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg ISSN 0044-4294/ASTM-Coden: ZVRBA2

Aus dem Institut fiir Mikrobiologie und Infektionskrankheiten der Tiere der Ludwig-Maximilians-Universitat Miinchen

Vorstand: Prof. Dr. Dr. h. c . Anton Mayr

Orale, aktive Immunisierung neugeborener Ferkel gegen Escherichia coli:

Wirksamkeitsnachweis im Darmligaturtest

Von

G. BALJER~, S. CHORHERR, E. SICKEL und D. GIESSEN

M i t 3 Abbildungen und 3 Tabellen

(Eingegangen am 1 I . November 1974)

Trotz jahrzehntelanger Forschung stellen die durch Escherichia coli her- vorgerufenen Erkrankungen nach wie vor fur die Schweinehaltung eine Be- lastung dar. Besonders gefahrdet sind die Tiere in den ersten 3 Lebenswochen. Mittlerweile sind zwar sehr unterschiedliche Bekampfungsverfahren entwickelt worden, restlos befriedigen konnte davon bisher aber noch keines. Der moder- nen Hygiene, dem gezielten Einsatz von Antibiotica und den verschiedenen Immunisierungsverfahren ist es jedoch zu verdanken, dai3 gegenuber fruher dennoch Fortschritte zu verzeichnen sind.

Seit man uber die Pathogenese der E. coli-Erkrankungen und uber die lokalen Schutzmechanismen im Darmkanal besser Bescheid weii3, hat es nicht an Versuchen gefehlt, Tiere oral gegenuber dem Erreger zu immunisieren (s. u.). Seit lingerer Zeit beschaftigen wir uns mit der oralen, aktiven Immuni- sierung neugeborener Ferkel. Ober die ersten Ergebnisse dieser Versuche sol1 in der vorliegenden Arbeit berichtet werden.

Schrifttum Die Moglichkeit einer oralen, aktiven Immunisierung gegen E. coli wurde

in Mauseversuchen schon wiederholt iiberpruft (4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19). Eine Wirksamkeit konnte vor allem nach intraperitonealer Belastung mit virulenten E. coli-Keimen nachgewiesen werden. Bei dieser Art der Belastung wurde die Mortalitat bei den Impflingen gegenuber den Kon- trolltieren um etwa 70 O/O gesenkt (6, 7, 8, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 19). Die Ergebnisse der serologischen Untersuchungen waren nicht so eindrucksvoll (4, 6, 7, 13, 18, 19, 20). Erst nach mehrmals wiederholten Impfungen mit

1 Diese Arbeit ist im Sonderforschungsbereich 147 Jungtierkunde Miinchen entstanden.

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hohen Antigendosen kam es zu unregelmai3igen und schwachen Antikorper- titeranstiegen. Im Anschlui3 an eine intraperitoneale Belastung reagierten die oral geimpften Mause aber stets mit einem deutlichen Boostereff ekt. Unter- suchungen am Menschen (5, lo), Kaninchen (4) und Affen (1) bestatigten die Ergebnisse der Mauseversuche. Eine spezifische Immunitat Lei3 sich im Be- lastungsversuch und bei Antikorperuntersuchungen nachweisen.

Bei Versuchen zur Schluckimpfung gegen E. coli wurden entweder Lebendimpfstoffe (1, 4, 5, 8, 9), Spaltimpfstoffe (11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18) oder Impfstoffe aus inaktivierten Bakterien (6, 7, 10, 20, 26) verwendet. Die Inaktivierung erfolgte meist durch Hitzeeinwirkung, gelegentlich auch durch Formalin und Aceton. Fur die Lebendimpfstoffe wurden Streptomycin-abhan- gige E. coli-Stamme verwendet. Bei den Spaltimpfstoffen handelte es sich um Natriumdesoxycholat-Extrakte der E. coli-Bakterien. Alle drei Impfstoff arten waren in ihrer Wirksamkeit im direkten Belastungsversuch annahernd gleich. Der Vorteil der Lebendimpfstoffe sol1 auf einer Ansiedlungshemmung (Keim- konkurrenz) der virulenten Impfbakterien im Darmtrakt beruhen (9). Die Immunisierung erfolgte in den meisten Versuchen einmal taglich an zehn aufeinanderfolgenden Tagen. Die Impfdosis lag bei der Maus zwischen lo9 und 1010, beim Affen und beim Menschen zwischen loll und lo1* lebenden oder inaktivierten E. coli-Keimen.

Die ersten Versuche mit einer oralen Immunisierung gegen E. coli beim Schwein wurden von STELLMACHER und MULLER (26) durchgefuhrt. Sie er- probten eine Schluckvakzine, die aus hitzeinaktivierten E. coli 01 39-Keimen bestand, im Feldversuch. Dieser Impfstoff wurde entweder in Magermilch oder in Tablettenform oral verabreicht. Nach einer zwei- bis dreimaligen Immuni- sierung im Abstand von je 8 Tagen konnten sie eine gute prophylaktische und anscheinend auch eine therapeutische Wirksamkeit egen die vor allem durch

PORTER (21) zeigte in Immunitatsstudien, daf3 auch beim Schwein ein lokal stimulierbares, hauptsachlich durch IgA bewirktes, sekretorisches Immun- system besteht. Seine Untersuchungen bestatigten die Auffassung, dai3 die IgA-Antikorper auf und im Schleimhautepithel wahrscheinlich eine wichtige Schranke bilden und somit als erste Verteidigungslinie gegen Krankheits- erreger wirksam werden. Durch die orale Verabfolgung eines E. coli-Antigens konnte die Bildung lokaler IgA-Antikorper im Dunndarm der Ferkel stimu- liert werden. Die Wirksamkeit einer oralen Iminunisierung wurde in einer Versuchsreihe ermittelt, in dem die Gewichtszunahmen von geimpften Ferkel und von ungeimpften Kontrolltieren miteinander verglichen wurden (20). Die oral, in der zweiten Lebenswoche uber das Futter geimpften Ferkel nahmen dabei signifikant hoher an Gewicht zu und lagen im Alter von vier Wochen urn 0,4 kg und im Alter von sechs Wochen um 0,95 kg uber dem Korpergewicht der ungeimpften Ferkel. Nach einer kunstlichen, oralen Infektion mit einem virulenten Impfstamm verzogerte sich bei den Impflingen die Besiedlung des Darmes mit E. coli-Bakterien. Die Dauer und die Starke der klinischen Sym- ptome waren dabei herabgesetzt (22).

Material und Methoden Versuchstiere: Fur die eigenen Untersuchungen standen insgesamt 55 Fer-

kel fur 8 Einzelversuche zur Verfugung. Dabei handelte es sich sowohl um konventionell gehaltene Tiere als auch um spf-Ferkel.

Die spf-Ferkel wurden nach Hysterektomie bei 112 bis 114 Tage trachti- gen Muttersauen gnotobiotisch in Isolatoren aufgezogen. Die Besiedlung des Darmes mit apathogenen E. coli-Keimen erfolgte am 10. Lebenstag. Danach

E. coli 01 39-Stamme verursachte Colienterotoxamie % eobachten.

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490 BALJER, CHORHERR, SICKEL und GIESSEN

wurden die Ferkel aus dem gnotobiotischen Milieu in einen geschlossenen Raumkomplex zur Adaption an den spf-Status gebracht und dort bis zur Durchfuhrung des Belastungstestes am 24. Tag gehalten.

Die konventionell aufgezogenen Tiere erhielten Kolostrum und blieben bis zur Belastung beim Muttertier.

Die Einzelversuche wurden jeweils an einem Wurf durchgefuhrt, um genetische Variationen und unterschiedliche Umwelteinflusse so weit wie moglich auszuschliefien.

Zmpfstof: Die Impfstoff herstellung erfolgte mit einem E. coli-Stamm 08 : K 87, K 88 ab : H 19l). Die Keime wurden im Fermenter vermehrt und in einem geschlossenen Durchlaufsystem durch Kurzzeiterhitzung auf etwa 98 OC uber 3 Minuten inaktiviert. Das E. coli-Vollantigen wurde dann abzentrifu- giert und mit phys. Kochsalzlosung auf eine Ausgangszahl von etwa loio Keime pro ml eingestellt. Sie entsprach einer Tagesdosis fur ein Ferkel.

Applikationsmodus: In allen Versuchen wurde das Antigen einmal taglich an den ersten zehn Lebenstagen den Ferkeln oral verabreicht. Die spf-Tiere erhielten die Schluckvakzine mit der taglichen Milchration. Den konventionell aufgezogenen Ferkeln wurde das Antigen einmal taglich mit der Sonde in die Backentasche appliziert.

Davmligaturtest: Am 14. Tag nach der letzten Immunisierung wurde die Darmimmuntiat ausgetestet. Als Teststamm verwendeten wir den gleichen E. coli-Stamm 08. Wir verimpften ihn fur die Herstellung der Testsuspension in Bouillon und bebruteten 24 Stunden bei 37 OC. In Vorversuchen wurde der Stamm im Darmligaturtest am Schwein nach der Methode von SMITH und HALLS (24, 25) auf Enterotoxinbildung gepruft. In allen Fallen wurde eine starke Enterotoxinbildung festgestellt.

Die Operationstechnik entsprach derjenigen von SMITH und HALLS (24, 25). Zur Narkose verwendeten wir HypnodiP nach Praemedikation von Stresnil”. Die Dunndarmligaturen lagen etwa 10-15 cm auseinander. In jedes zweite der vorbereiteten Segmente wurden 7 ml von unterschiedlichen Verdunnungen einer 24stundigen Bouillonkultur injiziert (angefangen von unverdunnt bis lo-’). Die Zwischenabschnitte blieben entweder als Kontroll- abschnitte unbehandelt oder erhielten phys. Kochsalzlosung eingespritzt. 24 Stunden nach der Operation wurden die Tiere getotet, der Dunndarm ent- nommen und die Flussigkeitsansammlung in den Dunndarmsegmenten ge- messen. Nach GEBHARDT (3) sol1 sich die Starke der Flussigkeitsansammlung zu der als Animpfmenge verwendeten Anzahl virulenter Keime annahernd pro- portional verhalten. Auf unsere Untersuchungen ubertragen bedeutet dies, je mehr sich E . coli-Keime vermehren konnten, um so mehr Enterotoxin wurde gebildet und um so grofier ist dann die gebildete Flussigkeitsmenge. Die Ent- stehung von Flussigkeit im Segment ist als Folge einer Kapillarschadigung durch das wahrend der E . coli-Vermehrung gebildete Enterotoxin zu werten.

Durch das Anlegen einer Verdunnungsreihe mit unterschiedlichen Be- lastungsdosen des enterotoxinbildenden E. coli-Impfstammes 08 erhoff ten wir uns so eine quantitative Aussage uber die E . coli-Vermehrung im Dunndarm bei oral geimpften Tieren im Vergleich zu ungeimpften Kontrolltieren. Das Ausmafi der E . coli-Vermehrung bewerteten wir dabei indirekt uber die Flussigkeitsmenge im abgebundenen Dunndarmsegment. Einen genauen Ober- blick uber das Bewertungsschema des Darmligaturtestes gibt Tabelle 1.

Eine Flussigkeitsansammlung uber 50 ml wurde rnit + + + + beurteilt. Diese Reaktion entspricht der hochsten E. coli-Vermehrung und damit auch

‘) Fur die Oberlassung des Stammes danken wir dem Statens Seruminstitut, Kopenhagen. z, Fa. Janssen GmbH, Dusseldorf.

Orale, aktive Immunisierung neugeborener Ferkel gegen Escherichia coli 49 1

50 und rnehr 35 bis 49 20 bis 34

7 bis 19 0 bis 7

der starksten Enterotoxinbildung. Als negativ wurde eine unter der Animpf- dosis von 7 ml liegende Flussigkeitsmenge im Darmsegment gewertet. Fur reproduzierbare Ergebnisse ist die Verwendung der gleichen Dunndarmab- schnitte und die jeweilige Gegenuberstellung von Impflingen und Kontroll- tieren, die unter gleichen Bedingungen gehalten werden, wichtig.

+ + + + + + + + + +

negativ

Tabelle 1 Schema zur Beurteilung der Reaktion im Darmligaturtest

Korpergewicht in kg nach Tagen , Angabe in Mittelwerten Status der Zahl der

Ferkel Ferkel 1 14 35 insgesamt

21 1,229 2,752 6,144 5,486 lmpflinge [E . coli 08 - Antigen)

Kontrolltiere 21 1,233 2,776 6,200 4,967 -

Bewer tung ( in m l )

Kontrolltiere und Impflinge hatten am ersten Tag annahernd das gleiche Korpergewicht. Auch am 14. Lebenstag war kein nennenswerter Gewichts- Unterschied zwischen den beiden Gruppen festzustellen. Am 35. Tag dagegen liei3 sich eine groi3ere Differenz erkennen, die geimpften Tiere befanden sich gegenuber den Kontrollen im Vorteil. Der Unterschied betrug etwa 0,5 kg. Die klinische Uberwachung ergab keine Beeintrachtigung des Allgemeinbefin- dens der Impflinge, so dai3 wir davon ausgehen konnen, dai3 das zehnmal oral verabreichte, hitzeinaktivierte E. coli 08-Antigen keine negativen Auswirkun- gen auf die Entwicklung der Ferkel zur Folge hat.

Wirksamkeitsuntersuchungen: Nach der Oberprufung der Unschadlichkeit untersuchten wir die spezifische Wirksamkeit der E. coli 08-Schluckvakzine durch den Nachweis einer lokalen Immunitat im Dunndarm. Hierzu verwendeten wir den Darmligaturtest. Die Versuche wurden dabei sowohl an spf-Ferkeln als auch an konventionell gehaltenen Ferkeln durchgefuhrt. Durch diese Einteilung sollte der Einflui3 des Kolostrums auf eine aktive, orale Immunisierung in den ersten Lebenstagen untersucht werden. Da ein Unter- schied bei unseren bisherigen Versuchen nicht besteht, ist eine gemeinsame Besprechung der beiden Gruppen moglich.

34'5

Ergebnisse Unschadlichkeitsuntersuchungen: Zur Oberprufung der Unschadlichkeit

des E. coli-Antigens verabreichten wir spf-Tieren das Antigen in den ersten zehn Lebenstagen taglich mit der Milch. Neben der klinischen Uberwachung diente die Gewichtszunahme der Tiere innerhalb von 35 Tagen als Indikator fur die Vertraglichkeit des Impfstoffes. In Tabelle 2 sind die Ergebnisse zusammengestellt.

Tabelle 2 Gewichtszunahme von spf-Ferkel wahrend des Versuchs


In den Abbildungen 1 und 2 sind zunachst als Beispiel zwei unterschiedliche Ergebnisse des Darmligaturtestes festgehalten. Die Abbildung 1 zeigt Dunndarmabschnitte eines ungeimpften Kontrollferkels. Die Reaktion nimmt von + + + + bei der 10-1 Verdunnung der Belastungsdosis gleichmaflig bis zu + bei der lo-' Verdunnung ab. Das entsprechend oral geimpfte Ferkel (Abb. 2) zeigte schon bei der 10-3 Verdunnung keine Flussigkeitsbildung und auch in den ersten beiden Verdunnungsstufen reagiert es nur mit einer + + + bzw. + Reaktion.

Abb. 1 (links). Ergebnis des Darmligaturtestes bei einem ungeimpften Kontrollferkel Abb. 2 (rechts). Ergebnis des Darmligaturtestes bei einem geimpften Ferkel

Einen Oberblick uber die Ergebnisse unserer bisherigen Untersuchungen mit dem Darmligaturtest gibt Tabelle 3. In dieser Tabelle ist die prozentuale Verteilung der Ferkel auf die funf verschiedenen Reaktionsstarken erfaflt, und zwar aufgeschlusselt nach den unterschiedlichen Belastungsdosen. Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, ergeben sich die deutlichsten Unterschiede zwischen Impflingen und Kontrolltieren bei den negativen- und + + + + -Reaktionen. Bei der Belastung mit der unverdunnten Bouillon-Kultur (ca. loe E. coli- Keime) besteht in der Flussigkeitsansammlung im Dunndarmsegment zwischen Impflingen und Kontrolltieren kein Unterschied. In beiden Gruppen liegt der prozentuale Anteil der Ferkel an der + + + +-Reaktion noch eng beieinander, und zwar bei 78 bzw. 80 O/o. Die negative und die +-Reaktion wurde sowohl bei geimpften als auch bei ungeimpften Tieren nicht festgestellt. Ein Unter- schied von 10 O / o zugunsten der Impflinge ergab sich nur bei der + +- und + + +-Reaktion. Mit fallender Belastungsdosis wird der Unterschied in der L. coli-Vermehrung im Dunndarm zwischen Impflingen und Kontrolltieren deutlicher. Bei den Impflingen ist eine gleichmaflige Steigerung des Prozent-

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satzes der Ferkel mit negativer Reaktion, die bei einer Belastung rnit los E . coli-Keimen ihren Hohepunkt mit 94 O/o erreicht zu verzeichnen. Nur 60 O/o

der Kontrolltiere zeigten bei dieser Challengedosis eine negative Reaktion. Dieser Anteil von 60 O / o stellt auch gleichzeitig den Hochstwert der negativen Reaktion dar. Die oral geimpften Ferkel erreichen diesen Prozentsatz schon bei einer Keimzahl von lo5 E. coli-Keimen pro Segment. Das bedeutet, dai3 die Impflinge sich erst bei einer Belastung mit einer 100fach hoheren Dosis pro Segment gleichartige Ergebnisse wie die Kontrolltiere lieferten.

Tabelle 3 Prozentuale Verteilung der Ferkel auf die verschiedenen Reaktionsstarken bei unterschied-

lichen Verdiinnungsstufen der E. coli 08-Bouillonkultur

Die Werte der + + + +-Reaktionen bei den verschiedenen Belastungs- dosen zeigen ebenfalls ein fur die Impflinge giinstigeres Ergebnis. Der Anteil der Reagenten nimmt bei dieser Gruppe gleichmai3ig ab und erreicht schon bei einer Verdiinnung von Werte unter 10 O / o . Bei der gleichen Verdiin- nungsstufe reagierten dagegen noch 30 O / o der Kontrolltiere mit einer Fliissig- keitsbildung starksten Ausmai3es (+ + + +). Prozentzahlen unter 10 O/o sind bei den Kontrollen erst bei einer 1 OOOfach geringeren Belastungsdosis namlich bei einer Verdiinnung der Bouillonkultur von 10-6 zu finden.

In Abbildung 3 werden die Ergebnisse der Tabelle 3 nochmals als graphische Darstellung wiedergegeben. Diesem Schaubild wurden die Prozent- zahlen der Impflinge und der Kontrolltiere mit negativen und ++++- Reaktionen bei den verschiedenen Belastungsdosen zugrundegelegt und danach der Verlauf der Kurven eingetragen. Der Unterschied zwischen den beiden Gruppen kommt hier noch deutlicher zum Ausdruck.

Die Kurve der negativen Reaktionen steigt bei den Impflingen schon bei einer Belastungsdosis von lo7 Keimen, bei den Kontrolltieren erst bei lo3 E. coli-Keimen pro Segment an. Auch erreicht sie bei der Kontrollgruppe einen Gipfel schon bei 60 O / o , wahrend er bei den Impflingen bei 94 O/o liegt.

Die Kurve der + + + f-Reaktion lauft entgegengesetzt, aber mit dem gleichen giinstigen Ergebnis fur die geimpften Ferkel. Die Kurve der Impflinge fallt friiher und steiler ab, als die der Kontrolltiere und der Anteil der


+ + + +-Reaktionen ist praktisch bei der Challengedosis von lo5 E. coli- Keimen bereits gleich Null. Die Kurve der Kontrolltiere verlauft flacher und erreicht den Nullpunkt erst bei der Belastungsdosis von 103 Keimen.

Dieser Kurvenverlauf zeigt, dai3 die Beurteilung der Wirksamkeit einer lokalen Immunitat nach einer oralen Immunisierung gegen E. coli am besten nach einer Belastung mit lo3 bis los E . coli-Keimen erfolgen kann. Hier ist der Abstand zwischen der Kurve der Kontrolltiere und der der Impflinge am groi3ten. Im Bereich einer hohen Belastung, also bei einer Challengedosis von 109 bzw. lo8 Keime pro Dunndarmsegment ist dagegen nur ein geringer Unterschied nach der Verteilung der gemessenen Fliissigkeitsmengen zwischen Impflingen und Kontrolltieren zu erwarten. Begriindet ist dies entweder durch eine zu starke Belastungsdosis, die die gebildete lokale Immunitat durchbricht, oder es liegt an einem zu hohen Enterotoxingehalt der unverdunnten Bouillon- kultur. Letzteres wurde fur eine spezifisch gegen die E. coli-Keime gerichtete lokale Immunitat sprechen. Diese konnte zwar verhindern, dai3 sich E. coli- Keime vermehren und Enterotoxin bilden, sie vermag aber nicht bereits vor- handenes Enterotoxin zu neutralisieren. Die zum Teil noch starken Reaktionen der Impflinge auf die hohen Belastungsdosen konnen auf das in der Belastungs- suspension enthaltene Toxin zuriickzufiihren sein. Die Frage nach der spe- zifischen Wirksamkeit des oralen Immunisierungseff ektes gegen E. coli mug deshalb durch erganzende Versuche noch weiter geklart werden.

Besprechung der Ergebnisse Die Untersuchungen dienten dam, bei Ferkeln die Starke der lokalen

Immunitat im Anschlui3 an eine zehnmalige orale Immunisierung gegen E. coli zu uberprufen. Hierzu verwendeten wir den Darmligaturtest, der bisher bei den Untersuchungen mit E. coli hauptsachlich zum Nachweis enterotoxinbil- dender E. coli-Stamme verwendet wurde. Nur SMITH und HALLS (24) haben

Zshl der Ferkel - - Reaktionskurver Impflinge - - - Reaktionskurve: Kontrolltiere ( i n % )

100

90

80

70

60 negative Reaktion

50

40

30

20

10

negative Reaktion

+ti+ Reaktion

VerdUnnung der E.coli Bouillonkultur

( Keimsahl ) unver- lo-l 10-2 10-3 10-4 lom5

(109) (108) (lo7) (lo6) (lo5) (lo4) -(lo3) (lo2) dtinnt

Abb. 3. Graphische Darstellung der negativen und der + + + +-Reaktion im Darmligatur- test (vgl. Tab. 3)


kurz angedeutet, dai3 sie versucht haben, mit diesem Test die lokale Immunitat nach einer parenteralen Impfung mit Coliantigen und nach Verfutterung lebender E. coli nachzupriifen. Ihre Ergebnisse waren jedoch nicht sehr viel- versprechend, so dai3 sie die Versuche in dieser Richtung nicht weiterfuhrten.

Bei unseren Untersuchungen erwies sich der Darmligaturtest dagegen als geeignete Methode zur Feststellung der Wirksamkeit einer oralen Immunisie- rung gegenuber E. coli. Bei entsprechender Versuchsanordnung kann im Dunn- darm von oral erfolgreich mit einem E. coli-Vollantigen immunisierten Ferkeln eine Hemmung der E. coli-Vermehrung nachgewiesen werden. In den ersten zehn Lebenstagen oral geimpfte Ferkel konnen nach dem Ergebnis des Darm- ligaturtestes am 24. Lebenstag mit einer 100- bzw. 1OOOfach hoheren Keim- zahl belastet werden als nicht geimpfte Kontrolltiere. Der Darmligaturtest ermoglicht direkte Ruckschlusse auf die Immunitatsverhaltnisse im Dunndarm. Alle bisher bei oralen Immunisierungen gegen E. coli verwendeten Nachweis- methoden wurden dagegen nur indirekt gefuhrt, z. B. durch eine intraperitoneale Belastung oder durch den Antikorpernachweis. Der direkte Nachweis war nicht moglich, da die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse immer an der fehlenden oralen Infektiositat der verschiedenen E. coli-Stamme fur Versuchs- tiere scheiterte. Der Darmligaturtest stellt aber eine direkte reproduzierbare Methode dar, um die Wirksamkeit einer oralen Immunisierung gegen E. coli am primaren Infektionsort Dunndarm zu uberprufen.

Die Untersuchungen von FRETER (2) und GEBHARDT (3) mit dem Darm- ligaturtest als Wirksamkeitsnachweis einer erfolgreichen oralen Impfung gegen Shigellen bestatigen unsere Ergebnisse. Auch sie stellten fest, dai3 die Flussig- keitsbildung und damit die Keimvermehrung in den belasteten Darmsegmen- ten bei oral immunisierten Tieren wesentlich geringer ist als bei Kontrolltieren. GEBHARDT hat zusatzlich als Kriterium fur den Impferfolg neben dem Vor- handensein makroskopisch sichtbarer Ansammlung von Exsudat im Darm- lumen auch die histo-pathologischen Veranderungen an der Darmschleimhaut ausgewertet. Die mikroskopismen Befunde sagten aber annahernd das gleiche aus wie die makroskopischen Feststellungen.

Eine Bekampfungsmai3nahme gegen die E. coli-Erkrankungen beim Fer- kel sollte auch moglichst schon in den ersten Lebenstagen wirksam werden. Aus diesem Grunde begannen wir mit der zehnmaligen, oralen Immunisierung bereits am ersten Lebenstag. RAETTIG (23) hat in seinen Modellversuchen an der Maus schon 24 bis 48 Stunden nach der ersten oralen Impfung zumindest eine unspezifische Wirkung nachweisen konnen, Auch die Beobachtung eines therapeutischen Eff ektes der oralen Immunisierung von STELLMACHER und MULLER (26) weisen auf die fruhe Wirksamkeit der Schluckimpfung hin. Wir konnen also von diesem Immunisierungsverfahren einen rechtzeitigen Schutz der Ferkel gegen die E . coli-Infektion erwarten.

Diese Untersuchungen waren als Modellversuche angelegt. Wir wollten grundsatzlich priifen, ob durch eine orale E . coli-Antigengabe eine lokale Immunitat ausgebildet wird, die sich mit dem Darmligaturtest uberprufen 1ai3t. Als Teststamm fur unsere Untersuchungeri verwendeten wir, wegen seiner starken Enterotoxinbildung, den E. coli Stamm 08. Welche Stamme aber fur eine Feldvakzine verwendet werden mussen, kann erst nach weiteren Unter- suchungen uber die Kreuzimmunitaten bei verschiedenen E. coli-Ferkeltypen entschieden werden.

Zusammenfassung Neugeborene Ferkel wurden an den ersten zehn Lebenstagen einmal tag-

lich oral gegen E. coli geimpft. Die Schluckvakzine bestand aus hitzeinaktivier- tem E. coli 08-Vollantigen.


Am 14. Tag nach der letzten Immunisierung wurde die Wirksamkeit mit dem Darmligaturtest gepruft. Geimpfte Ferkel konnten bei gleichem Ergebnis im Darmligaturtest mit einer 100- bis 1OOOfach hoheren Keimzahl belastet werden als nicht geimpfte Kontrolltiere.

Summary Active, oral immunisation of new-born piglets

against E. coli: Efficiency tests using the intestinal ligature test

New-born piglets were immunised orally once daily during their first ten days of life against E. coli. The oral vaccine was prepared from heat inactivated E. coli 08 complete antigen.

The efficiency of the vaccine was examined in the intestinal ligature test 14 days after the last immunisation. Results of challenge using the intestinal ligature test showed that vaccinated piglets resisted a 100 to 1,000 times higher dose of E. coli than non-vaccinated control animals.

Rksumk Immunisation orale active de porcelets nouveau-nks

contre E. coli: preuve de l’efficacitk dans le test de ligature de l’intestin

Des porcelets nouveau-nks ont Ctk vaccinks oralement une fois par jour pendant les dix premiers jours de vie contre E. coli. Le vaccin oral se compo- sait de l’antigkne complet 08 d’E. coli inactivk par la chaleur. L‘efficacitk fut kprouvk epar le test de ligature de l’intestin au quatorzikme jour suivant la dernikre immunisation. Les porcelets vaccinks donnant les m2mes rksultats au test de ligature ont support6 un nombre de germes de 100 A 1000 fois plus klevk que les animaux de contrBle non vaccinks.

Resumen Inmunizacih oral activa de lechones recikn nacidos frente

a Escherichia coli: demostracih de eficacia en la prueba de ligadura intestinal

Lechones recikn nacidos se vacunaron durante 10s diez primeros dias de vida, una vez por jornada, por via oral contra E. coli. La vacuna bebible consistia en antigen0 total E. coli 08 termoinactivado. El dia 14’ tras la inmunizaci6n dltima se contrast6 la eficacia con la prueba de intestino ligado. Los lechones vacunados se podian gravar, siendo el resultado similar en la prueba de intestino ligado, con una cantidad de gkrmenes de 100 a 1000 veces mayor que 10s animales testigos no vacunados.

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17. OCKLITZ, H. W., H. MOCHMANN, E. F. SCHMIDT, I. MARKUSE und H. SCHUBARTH, 1968: Laboratoriumsversuche uber die Moglichkeit einer oralen Immunisierung mit einem Natriumdesoxycholatextrakt aus Dyspepsiecoli-Stammen. VI. Mitt.. : Der EinfluB der oralen Immunisierung auf die Ausscheidung von oral eingegebenen Dyspepsiecoli-Keimen bei der weiBen Maus. Zbl. Bakt. I Orig. 207, 27.

18. OCKLITZ, H. W., H. MOCHMANN, L. HERING, E. F. SCHMIDT und U. RICHTER, 1969: Laboratoriumsversuche uber die Moglichkeit einer oralen Immunisierung mit einem Natriumdesoxycholat-Extrakt aus Dyspepsiecoli-Stammen. VIII. Mitt.: Serumantikor- per in der gemischten Haemadsorptionsreaktion nach Fagraeus bei immunisierten und belasteten Mausen. Zbl. Bakt. I Orig. 209, 161.


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Anschrift der Verfasser: Institut fur Mikrobiologie und Infektionskrankheiten der Tiere, 8 Munchen 22, Veterinarstrafie 13.

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Orale, aktive Immunisierung neugeborener Ferkel gegen Escherichia coli: Wirksamkeitsnachweis im Darmligaturtest