Embed Size (px)
Citation preview
�1
Aus der Klinik für Herz-, Thorax-, Transplantation und Gefäßchirurgie der
Medizinische Hochschule Hannover
Leiter: Prof. Dr. med. Dr. h. c. Axel Haverich
Orthotoper Aortenklappenersatz mittels Tissue-Engineerten Grafts
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der
Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von
Alexandru Florin Calistru
aus Bukarest, Rumänien
Hannover 2014
�2
Angenommen vom Senat der Medizinische Hochschule Hannover am 21.04.2015
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum
Betreuer: Prof. Dr. Dr. h. c. Axel Haverich
Referent: Prof. Dr. med. Heiko von der Leyen
Korreferent: Prof. ’in Dr. med. Renate Kaulitz
Tag der mündlichen Prüfung: 21.04.2015
Prüfungsausschussmitglieder:
Prof. Dr. med. Christian Krettek
Prof. Dr. med. Axel Stuart Merseburger
Prof. Dr. med. Dirk Berens von Rautenfeld
�3
Meinen Eltern
�4
Inhaltsverzeichnis
Dissertation 5 Zusammenfassung 14 Literaturverzeichnis 21 Lebenslauf 23 Danksagung 28 Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 6 und 7 29
�5
Dissertation
Orthotopic Replacement of Aortic Heart Valveswith Tissue-Engineered Grafts
Igor Tudorache, MD,1,* Alex Calistru, MD,1,* Hassina Baraki, MD,1 Tanja Meyer, DVM,1 Klaus Hoffler,1
Samir Sarikouch, MD,1 Christopher Bara, MD,1 Adelheid Gorler, MD,1 Dagmar Hartung, MD,2
Andres Hilfiker, PhD,1 Axel Haverich, MD,1 and Serghei Cebotari, MD1
Aims: Heart valve tissue engineering aims to create a graft with improved durability compared to routinely usedvalve substitutes. This study presents the function and morphological changes of a tissue-engineered aortic valve(TEV) compared to the cryopreserved valve (CPV), aortic valve (AV) allografts in an orthotopic position in sheep.Methods and Results: Ovine AV conduits (n = 5) were decellularized with detergents. Autologous endothelial cells(ECs) were seeded onto the valve surface and cultured under physiological conditions using a high pulsatile flow.Grafts were implanted as a root with reimplantation of coronary ostia in sheep. Crystalloid cardioplegia andisogenic blood transfusions from previous sacrificed sheep were used. Only antiplatelet aggregation therapy wasused postoperatively. CPVs (n = 4) served as controls. The grafts were investigated for function (echocardiography,magnetic resonance investigation), morpho/histological appearance, graft rejection, and calcification at 3 months.Decellularization led to cell-free scaffolds with preserved extracellular matrices, including the basement mem-brane. TEVs were covered with ECs expressing typical endothelial markers. Neither dilatation, stenosis, reductionsof cusp mobility nor a significant transvalvular gradient, were observed in the TEV group. Explanted valvesexhibited normal morphology without signs of inflammation. An endothelial monolayer covered cusps and thevalve sinus. In the CPV group, sporadic, macroscopic, calcified degeneration with mild AV insufficiency wasnoted. Histology revealed signs of rejection and incipient calcification of the tissue.Conclusion: Tissue-engineered AV based on decellularized valve allografts satisfy short-term requirements of thesystemic circulation in sheep. Although results of long-term experiments are pending, the lack of degenerativetraits thus far, makes these grafts a promising alternative for future aortic heart valve surgery.
Introduction
Valve replacement is the common treatment in ad-vanced aortic valve (AV) disease and biological and
mechanical valve prostheses are the most used substitutes.Limited durability of biological valves and life-long antic-oagulation therapy for mechanical prostheses are the majorconcerns in their clinical use.1,2 Accelerated degeneration ofbiological allo- and xenovalves is partially attributed to re-maining cells within the valve tissue, cytotoxicity of chemicalcrosslinking agents as well as incomplete biocompatibility ifreferred to aGal epitopes masking.3,4 Preserved antigenicityinduces a chronic inflammatory response with subsequentvalve failure.5,6 In addition, all described grafts have a lim-ited acceptance in patients that are still growing. Im-munological responses are avoided by the use of thepatient’s own pulmonary valve in replacement of the dis-eased AV, as in the Ross operation. The pulmonary autograft
is also advantageous, as it has been shown to grow alongwith the child, resulting in fewer reoperations. Factors con-tributing to a limited acceptance of this procedure includeoperation complexity and the replacement requirement ofboth aortic and pulmonary valves. Moreover, cryopreservedallografts undergo degenerative processes, the leading causefor reoperation in 20% of patients after 10 years.7,8 Subse-quently, implantation of acellular or with patients’ own cellsreseeded heart valves may solve the immune responseproblems and facilitate in vivo graft remodeling.
Over the last decade, tissue engineering (TE) has become apromising strategy by which to obtain such valves. The useof pulmonary valve homografts, proceeded by methods ofTE before implantation, showed excellent hemodynamicparameters in the pulmonary valve position, limited degen-eration and capacity to grow in pediatric patients.9,10 At theaortic position, AV replacements with TE grafts are currentlytested at the preclinical level. In sheep, a model considered to
Departments of 1Cardiothoracic, Transplant and Vascular Surgery, and 2Radiology, Hannover Medical School, Hannover, Germany.*Both authors contributed equally to this work.
TISSUE ENGINEERING: Part AVolume 19, Numbers 15 and 16, 2013ª Mary Ann Liebert, Inc.DOI: 10.1089/ten.tea.2012.0074
1686
�6
be the standard in predicting calcification of biological heartvalves, the decellularized AV demonstrated superior dura-bility as compared to unprocessed allografts in long-termexperiments.11 The aim of this study was twofold. First, tocreate a tissue-engineered aortic valve (TEV) based ondetergent decellularized ovine AV scaffolds reseeded withautologous endothelial cells (ECs) and second, to comparethe TEVs with standard cryopreserved allograft valves(CPVs) after orthotopic implantation at three months.
Materials and Methods
All animal experiments and surgical procedures wereperformed in compliance with the Guide for the Care andUse of Laboratory Animals as published by the US NationalInstitutes of Health (NIH Publication 85-23, revised 1996)and were approved by the local animal care committee(Experiment # 06/1186).
Aortic allografts
AV conduits were harvested from sheep (30–40 kg) understerile conditions and were either immediately decellularized(n = 5 for in vitro, n = 5 for in vivo experiments) or cryopre-served (n = 4).
Decellularization
Decellularization of AVs was performed as described.11
Cell source and culture
Isolation and cultivation of autologous ECs from ovinejugular veins were performed as previously described.12 Inbrief, jugular veins were harvested from future recipient ju-venile sheep. ECs were removed from the vessel wall bydigestion with 2% collagenase A and resuspended afterwardin a culture medium (CM) composed from the EndothelialCell Basal Medium-2 (Clonetics), supplemented with Sin-gleQuot Kit (Clonetics), 10% FCS (Biochrom), 100 mg/mL P/S (Biochrom), and finally seeded into a culture flask. Cellsfrom 2nd or 3rd passage were used for reseeding of the valveconduit. Prior seeding, cells were checked microscopicallyfor cobblestone morphology and expression of endothelialmarkers as endothelial nitric oxide synthase (eNOS) andCD31 (Polyclonal Rabbit IgG,) by immunohistochemistry(NOS Type III, BD Bioscience; CD31, Santa Cruz).
Reseeding and cultivation under pulsatile conditions
For recellularization of AVs, dynamic bioreactors wereused as described.12
Rotation conditions. Decellularized AVs (DAV; n = 10)were inserted into bioreactors and incubated in the CM for24 h. The lumen of the conduits was filled with the CMsupplemented with 500 ng of the recombinant humanproangiogenic factor CCN1. ECs (0.5 · 107 cells/valve) wereinjected precisely into the valve lumen through speciallydesigned cell-seeding inlets in two rounds. After the firstseeding, the bioreactor remained in the vertical position for6 h to allow the EC to attach in the valve sinuses. The secondreseeding step was followed by a slow rotation of the bio-reactor (0.05 rpm) for another 6 h, exposing the entire valvesurface to achieve optimal attachment conditions.
Dynamic conditions. Following the reseeding, the biore-actors were attached to a pulsatile pump. The pulsatile cir-culation was started at 0.1 L/min. The flow rate wasincreased by 0.05 L/min, twice a day, until day 4. After day4, a maximal flow of 1.0 L/min was achieved by repeatedlyincreasing the flow by 0.2 L/min/day until day 7. The meansystem pressure was maintained at 80 mm/Hg during theentire duration of dynamic cultivation. The morphology ofreseeded AVs (n = 5) was analyzed. The remaining AVs(n = 5) were transported to the operation room in closed, butdisconnected bioreactors at 37!C where they were removedfrom the bioreactor and used for implantation.
Cryopreservation and thawing
After harvesting, the grafts were placed in the cryopro-tectant solution containing 10% dimethyl sulfoxid and 20%FCS. AVs were cryopreserved at a controlled rate ( - 1!C/min) from 15!C to - 120!C, and then rapidly cooled, andfinally stored in the - 196!C gas phase of liquid nitrogen(Kryo 10/Serie III; Messer Griesheim). Thawing was per-formed in two steps. In step 1, the CPVs were placed in acooler containing dry ice without direct contact to the ice andwarmed slowly to - 100!C. In step 2, CPVs were placed in a37!C water bath, to obtain rapid warming until all ice mac-roscopically disappeared. This type of valve preservationfollows current clinical practice.13
Implantation of the AV conduits
TEVs and CPVs were implanted into young sheep (30–40 kg), obtained from the local breeder (Lower Saxony) in theorthotopic position as described.11 Through a left antero-lateral thoracotomy, a right atrial to the descending aortacardiopulmonary bypass was established. Crystalloid cardi-oplegia was introduced directly into the ostia. The valveconduit was sutured using single 5.0 polypropylene sutures(Ethicon). Coronary vessels were reimplantated using 6.0polypropylene sutures. Isogenic blood transfusions frompreviously sacrificed sheep were used. Daily aspirin (100 mg)was given orally to all animals.
Echocardiography
Transesophageal echocardiography was performed dur-ing the explantation operation and valve function was as-sessed as previously described.11
Magnetic resonance investigation
Cardiac magnetic resonance imaging was performed be-fore explantation under general anesthesia. Examinationswere completed in a standard 1.5 Tesla scanner (GE CV/I,General Electric) with retrospective peripheral pulse gating.Analysis was performed using dedicated software (QmassMR7.1; Medis).
Explantation of the AV conduits
The animals were euthanized by intravenous pentobarbi-tal (1 mL/kg body weight; WDT) following heparinization.The grafts were excised, examined macroscopically, andprepared for histological analysis.
AORTIC VALVE REPLACEMENT WITH TISSUE-ENGINEERED GRAFTS 1687
�7
Histology and immunohistochemistry
Formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections(6 mm thick) were stained by standard hematoxylin and eo-sin, Movat pentachrome, and von Kossa stains and visual-ized in a bright field using an Olympus BX40 microscope.Immunohistochemistry was performed as described.11,14 Inbrief, frozen tissue sections were investigated for extracel-lular matrix (ECM) integrity: collagen IV (clone CI22; Dako);
the presence of ECs: the von Willebrand factor (vWF)(polyclonal rabbit IgG; Dako), eNOS (clone 3/eNOS/NOSType III; BD Bioscience), CD31 (Polyclonal Rabbit IgG; SantaCruz); the presence of smooth muscle cells and myofibro-blasts: alpha-smooth muscle actin (a-SMA) (clone 1A4;Dako); and for inflammatory cells, CD45 (clone 1.11.32;Serotec). Furthermore, the stain against procollagen I (De-velopmental Studies Hybridoma Bank) stands for newlysynthetized collagen I and therefore for matrix remodeling.
FIG. 1. Complete re-en-dothelialization of the aorticvalve scaffold after cultiva-tion in a dynamic bioreactor.Hematoxylin and eosin andimmunohistochemical im-ages show complete coverageby cells expressing eNOS(red) and CD31 (green) on thesurface of the aortic wall (A,E), the edge of the leaflet (B,F), and the sinus of the valve(C, G). Cell nuclei positive forDAPI. (Bars 200mm) Phalloi-din stain shows homogenouscell distribution over thewhole leaflet surface (D, H).(Scale bars 50mm). eNOS,endothelial nitric oxide syn-thase. Color images availableonline at www.liebertpub.com/tea
1688 TUDORACHE ET AL.
�8
Phalloidin stain was used to show the subcellular, cytoskel-etal actin filaments of the cells. Tissue samples were fixedwith 4% paraformaldehyde, permeabilized with 0.5% Triton,and subsequently labeled with Alexa 488 phalloidin (Mole-cular Probes) as described.15 Frozen sections of ovine AVsserved as positive controls.
Statistics
All data are reported as the mean – SD. The unpairedstudent t-test was used to test for differences among groups.A p-value of less than 0.05 was considered significant. TheSPSS statistical software package 14.0 for Windows (SPSS)was used for all statistical analyses.
Results
Morphology of decellularized and re-endothelializedAV conduits
After detergent treatment of the AV followed by DNase Idigestion, samples showed < 5% of residual DNA as com-pared with native tissue samples. Histology and immuno-histochemistry revealed a preserved threedimensionalscaffold with preserved collagens, elastic fibers, and glycos-aminoglycans. Complete maintenance of the basementmembrane along the inner surface of the aortic wall and onboth sides of the leaflet was demonstrated by the presence ofCollagen IV.11
After re-endothelialization, the luminal surface of theDAV was covered with a confluent cell monolayer (Fig. 1A–C). Cobblestone-like morphology with phalloidin staining(Fig. 1D, H), expression of CD31 and eNOS (Fig. 1E–G)demonstrated an endothelial origin. No interstitial cells weredetected on the conduit surface or inside the scaffold (datanot shown).
Operative results
Both, TEVs and CPVs represent a stable tissue that enablesto perform appropriate surgical anastomosis. The cross-clamp time was 98 – 27 min. All animals survived the oper-ative procedure. In both groups, no signs of neurologicaldeficits were observed.
Echocardiography and magnetic resonanceinvestigation
Echocardiography showed a comparable mean diameterand an effective orifice area. Although the pressure gradient
Table 1. Functional Analysis of ImplantedTissue-Engineered Valves
and Cryopreserved Allograft Valves
TEVs CPVs p
Orifice area (cm2) 2.0 – 0.2 2.1 – 0.6 n.s.Mean transvalvular
systolic pressuregradient (mm/Hg)
0.5 – 0.5 2.1 – 0.6 < 0.006
Max. transvalvularsystolic pressuregradient (mm/Hg)
1.1 – 0.4 4.2 – 0.7 < 0.001
AV Insufficiency 0.2 – 0.4 1.5 – 0.6 < 0.001Mean AV diameter (mm) 19.0 – 2.0 19.8 – 1.7 n.s.Ejection fraction (%) 52.0 – 10.4 54.0 – 16.7 n.s.
AV, aortic valve; TEVs, tissue-engineered aortic valves; CPVs,cryopreserved allograft valves; n.s., not significant.
FIG. 2. Representativeechocardiography results fortissue-engineered aorticvalves (TEVs) and cryopre-served allograft valves(CPVs) at 3 months. De-generated aortic valve cuspsof CPV with vegetation (ar-row) (A) and valve insuffi-ciency (B). Thin aortic valvecusps of the TEV withoutsigns of degeneration (C) orinsufficiency (D). Colorimages available online atwww.liebertpub.com/tea
AORTIC VALVE REPLACEMENT WITH TISSUE-ENGINEERED GRAFTS 1689
�9
was low in both groups, it was significantly higher in CPVs(Table 1). In the CPV group, evident leaflet thickening andtrivial to mild insufficiency was observed (Fig. 2A, B). Incontrast, TEVs appeared normal with no valvular insuffi-ciency or stenosis (Fig. 2C, D). No signs of cusp thickening orreduction of cusp’s mobility were observed. This data cor-relate with magnetic resonance investigation results whereno aortic regurgitation was noticed on flow measurements inthe aorta. The volumetric analysis showed regular end-diastolic and end-systolic volumes of the left ventricles aswell as adequate ejection fractions. There were no signs ofleft ventricular hypertrophy. Stroke volumes by volumetrymatched stroke volume analysis by phase-contrast flowmeasurements, thereby, ruling out significant mitral regur-gitation (Fig. 3).
Characterization of the explanted grafts
None of the explanted conduits exhibited signs of rupture,aneurysmatic dilatation, or infection. By explantation, there
was a sizeable difference in the adhesion reaction with sur-rounding tissues. The CPVs showed more adhesions due toinflammation and the cusps were visibly thickened andshrunken (Fig. 4A, B). Vegetation spots, as well extensivemacroscopic calcification were observed in the wall and an-nulus of explanted CPVs (Fig. 4C, D). In contrast, the TEVshad a smooth aortic wall surface. The leaflets remainedtender, translucent, and without vegetations, calcification, orsigns of degeneration. (Fig. 4E, F). Some small hematomaspots were observed on the cusps surface of both types ofgrafts.
Histology and immunohistochemistry
Explanted grafts had the preserved, typical layered orga-nization of the leaflets and dense scaffold organization of thearterial wall. CPVs showed massive inflammation and leu-kocyte infiltration into the entire graft tissue (Fig. 5A, B).Over the luminal surface of CPVs, CD31- and vWF-positivecells could be identified (Fig. 5C, D). The explanted TEVs
FIG. 3. Direct planimetricanalysis of the aortic valveorifice area (red line) usinga modulus (A) and phase-contrast images (B), show-ing symmetric opening ofthe valve. Color imagesavailable online at www.liebertpub.com/tea
FIG. 4. Macroscopic morphology of explanted valves. Fibrous degeneration and thickening (A, B), as well as cusp vegetation(arrows) on the leaflet surface of the CPV (C). Macroscopic calcification (arrows) of the CPV wall (D). Translucent leaflets (E)and complete compliance of the valvular apparatus (F) of the TEV. Color images available online at www.liebertpub.com/tea
1690 TUDORACHE ET AL.
�10
revealed neither signs of rejection nor inflammation (Fig. 5E,F). The luminal surface of the aorta, sinus, and cusps re-mained covered by the endothelium. These cells expressedeNOS, CD31 (Fig. 5G), and vWF (Fig. 5H), supporting anendothelial character. The EC covered the luminal surfaceup to the free margin of the leaflet as a monolayer (Fig. 6).The area around all suture lines exhibited a typicalsubendothelial neointima formation (panus). The degree ofpanus was relatively equal in both groups. Cells expressinga-SMA and procollagen I repopulated approximately onethird of the TEV adventitial site (data not shown).
Von Kossa staining showed signs of leaflet calcificationand massive deposits of calcium in the wall of the CPVs (Fig.7A, C) In contrast, no histological signs of calcification wereobserved inside the explanted TEV cusps or the arterial wall(Fig. 7B, D).
Discussion
In this study, we show for the first time, the results of anorthotopic implantation of TE aortic allografts. Our conceptis based on the re-endothelialization of detergent DAV
FIG. 5. Immun-histochemical micrographsfrom explants. Massiveleukocyte infiltration of theCPV wall (A) and leaflet (B)with CD45 cells (red). Thepreserved endothelial celllayer over the CPV wall(C) positive for CD31/eNOS(green/red) and cusp(D)-positive for vWF (green).The TEV wall (E) and leaflet(F) without leukocyte infil-tration (red—classified asbackground staining in theabsence of concomitantstaining of cell nuclei in blue).The TEV cusp (G) covered byCD31/eNOS (green/red)-positive cells. Expression ofvWF by cells over the TEVwall (H). (Scale bars 200 mm).vWF, von Willebrand factor.Color images available onlineat www.liebertpub.com/tea
AORTIC VALVE REPLACEMENT WITH TISSUE-ENGINEERED GRAFTS 1691
�11
conduits with the vascular EC. We demonstrated in ourprevious study that the DAVs, possess excellent hemody-namic parameters and are able to withstand systemic pres-sures without suffering structural dilatation or deteriorationfor as long as 9 months.11 However, the process of in vivoremodeling that occurs after implantation required a longerperiod of time for complete re-endothelialization of the graftlumen. In the pulmonary position, in vitro cultivation of theEC seeded onto decellularized pulmonary valve scaffoldsusing a pulsatile bioreactor system improves graft compati-bility and shows the maintenance of an EC monolayer afterimplantation.14 Subsequent to these data, we used the sameprinciple to obtain a TE aortic graft. We used the sheepmodel as considered to be ideal to test heart valve durability,as these animals exhibit increased calcium metabolism andreach full size by 2 years of age. Consequently, estimation ofcardiovascular implant durability is possible in a shorterperiod of time.16
Autologous venous ECs were used to have cells with astable and unvariable phenotype for reseeding procedures.Because of the invasiveness, this method of cell acquisition is
not ideal, since the TE grafts should be primarily used inpediatric patients. To this point, several groups have dem-onstrated the use of human marrow stromal cells, amnioticfluid, and blood-derived progenitor cells for heart valveTE17,18; however, the use of these cells in the sheep modelremains to be determined. Currently, method developmentfor the isolation and stable cultivation of ovine blood-derivedECs for TE purposes is underway.
To avoid the wash-off of the reseeded cells from the lu-minal surface, we slowly increase the flow in the pulsatilebioreactor system trying to adapt ECs to higher shear stress.The final protocol, used in this study, resulted in the main-tenance of a confluent EC layer at flows up to 1.0 L/min. Inour previous studies, we demonstrated persistence of the EClayer after transportation in the operating room as well asoperative stress for 24 h (data not shown).
Since Dr. Ross implanted the first aortic allograft in 1961,19
the methods of valve procurement and graft preservationhave changed substantially. Maintenance of the graft via-bility appears to have a major importance in long-termfunctionality of cryopreserved or homovital allografts.20 In
FIG. 6. Phalloidin stain ofthe TEV leaflet. Homoge-nous cells cover the cuspsurface (A) and free edge(B). (Scale bars 100 mm). Colorimages available online atwww.liebertpub.com/tea
FIG. 7. Von Kossa stainshows calcium spots (ar-rows) within the CPV cusp(A) and massive CPV wall(C) calcification. In contrast,no signs of calcification wereobserved in TEV tissue(B, D). (Scale bars 100 mm).Color images availableonline at www.liebertpub.com/tea
1692 TUDORACHE ET AL.
�12
this study, cryopreserved allografts were used as controls.Although functional investigations did not reveal majordifferences in hemodynamic parameters between the graftsin both groups, considerable signs of degeneration, bothmacro- and microscopically, in the CAVs were observed asearly as 3 months following implantation. These data con-firm that the presence of allogenic cells and disorganizationof ECM components as a result of storage or mechanicalstress can predict tissue degeneration and secondary graftfailure. Lack of calcification in TEV grafts, can be explainedin part by an effective decellularization process and scaffoldpreservation. Previously, we noted that mechanical stress, atthe level of leaflet coaptation, did not permit complete re-endothelialization of cusp edges in unseeded grafts.11 Thisobservation may be correct as the leaflets of TEVs in thisstudy, showed ECs covering the entire cusp surface. Lack ofthrombotic formation in grafts of both groups, highlights theimportance of a functional endothelial layer before implan-tation. This is in line with our findings with implanted TEpulmonary valves.14 Coverage of the matrix with cellsdemonstrates once again that the use of detergents for de-cellularization of allografts is feasible, even supposed thattraces remain likely entrapped in the matrix. Intimal hyper-plasia observed predominantly in coronary sinuses and inclose proximity to anastomoses was in a decreasing thicknessfrom the suture lines. This occurred in both types of graftsand was interpreted as a physiological panus, secondary tosurgical trauma.
This study has a limitation. Implantation for three monthsin the ovine model provided considerable immunological-related data and was sufficient to identify calcification trendsin different valvular grafts. However, susceptibility of TEAVs to growth was not determined in this study. Long-termimplantations in lambs are pending. Here the in vivo re-population of the grafts by interstitial cells might have anessential role in graft remodeling.
In conclusion, the protocol used for TE of the pulmonaryvalve was successfully used in this study for engineering ofAVs based on allograft scaffolds reseeded with venous ECs.Despite comparable short-term functionality, cryopreservedallografts revealed considerable degeneration, compared tothe tissue-engineered grafts. The lack of degenerative signsmakes the TE AV a promising alternative for use in futureAV surgery.
Acknowledgments
We are grateful to Rosalinde Katt, Astrid Diers-Ketterkat,Karin Peschel, Slavica Schumann, Petra Zieme, and Jost Dorrfor their technical assistance. We give special thanks to Do-reen Unger for her excellent and careful completion of his-tological and immunohistochemical staining. This study wassupported, in part, by the Cortiss Foundation.
Disclosure Statement
No competing financial interests exist.
References
1. Carrier, M., Pellerin, M., Perrault, L.P., Page, P., Hebert, Y.,Cartier, R., Dyrda, I., and Pelletier, L.C. Aortic valve re-
placement with mechanical and biologic prosthesis in mid-dle-aged patients. Ann Thorac Surg 71, 253, 2001.
2. van Geldorp, M.W., Eric Jamieson, W.R., Kappetein, A.P.,Ye, J., Fradet, G.J., Eijkemans, M.J., Grunkemeier, G.L., Bo-gers, A.J., and Takkenberg, J.J. Patient outcome after aorticvalve replacement with a mechanical or biological prosthe-sis: Weighing lifetime anticoagulant-related event riskagainst reoperation risk. J Thorac Cardiovasc Surg 137, 881,2009.
3. Konakci, K.Z., Bohle, B., Blumer, R., Hoetzenecker, W., Roth,G., Moser, B., Boltz-Nitulescu, G., Gorlitzer, M., Klepetko,W., Wolner, E., and Ankersmit, H.J. Alpha-gal on bio-prostheses: Xenograft immune response in cardiac surgery.Eur J Clin Invest 35, 17, 2005.
4. Kasimir, M.T., Rieder, E., Seebacher, G., Nigisch, A., Dekan,B., Wolner, E., Weigel, G., and Simon, P. Decellularizationdoes not eliminate thrombogenicity and inflammatorystimulation in tissue-engineered porcine heart valves.J Heart Valve Dis 15, 278, 2006.
5. Hawkins, J.A., Hillman, N.D., Lambert, L.M., Jones, J., DiRusso, G.B., Profaizer, T., Fuller, T.C., Minich, L.L., Wil-liams, R.V., and Shaddy, R.E. Immunogenicity of decel-lularized cryopreserved allografts in pediatric cardiacsurgery: comparison with standard cryopreserved allografts.J Thorac Cardiovasc Surg 126, 247, 2003.
6. Shaddy, R.E., Hunter, D.D., Osborn, K.A., Lambert, L.M.,Minich, L.L., Hawkins, J.A., McGough, E.C., and Fuller, T.C.Prospective analysis of hla immunogenicity of cryopre-served valved allografts used in pediatric heart surgery.Circulation 94,1063, 1996.
7. Horer, J., Hanke, T., Stierle, U., Takkenberg, J.J., Bogers, A.J.,Hemmer, W., Rein, J.G., Hetzer, R., Hubler, M., Robinson,D.R., Sievers, H.H., and Lange, R. Homograft performancein children after the ross operation. Ann Thorac Surg 88, 609,2009.
8. Boethig, D., Goerler, H., Westhoff-Bleck, M., Ono, M., Dai-ber, A., Haverich, A., and Breymann, T. Evaluation of 188consecutive homografts implanted in pulmonary positionafter 20 years. Eur J Cardiothorac Surg 32, 133, 2007.
9. Cebotari, S., Tudorache, I., Ciubotaru, A., Boethig, D., Sar-ikouch, S., Goerler, A., Lichtenberg, A., Cheptanaru, E.,Barnaciuc, S., Cazacu, A., Maliga, O., Repin, O., Maniuc, L.,Breymann, T., and Haverich, A. Use of fresh decellularizedallografts for pulmonary valve replacement may reduce thereoperation rate in children and young adults: early report.Circulation 124, 115, 2011.
10. Dohmen, P.M., Lembcke, A., Holinski, S., Pruss, A., andKonertz, W. Ten years of clinical results with a tissue-en-gineered pulmonary valve. Ann Thorac Surg 92, 1308, 2011.
11. Baraki, H., Tudorache, I., Braun, M., Hoffler, K., Gorler, A.,Lichtenberg, A., Bara, C., Calistru, A., Brandes, G., He-wicker-Trautwein, M., Hilfiker, A., Haverich, A., and Ce-botari, S. Orthotopic replacement of the aortic valve withdecellularized allograft in a sheep model. Biomaterials 30,6240, 2009.
12. Lichtenberg, A., Cebotari, S., Tudorache, I., Sturz, G., Win-terhalter, M., Hilfiker, A., and Haverich, A. Flow-dependentre-endothelialization of tissue-engineered heart valves.J Heart Valve Dis 15, 287, 2006.
13. Fischlein, T., Schutz, A., Uhlig, A., Frey, R., Krupa, W., Ba-bic, R., Thiery, J., and Reichart, B. Integrity and viability ofhomograft valves. Eur J Cardiothorac Surg 8, 425, 1994.
14. Lichtenberg, A., Tudorache, I., Cebotari, S., Suprunov, M.,Tudorache, G., Goerler, H., Park, J.K., Hilfiker-Kleiner, D.,
AORTIC VALVE REPLACEMENT WITH TISSUE-ENGINEERED GRAFTS 1693
�13
Ringes-Lichtenberg, S., Karck, M., Brandes, G., Hilfiker, A.,and Haverich, A. Preclinical testing of tissue-engineeredheart valves re-endothelialized under simulated physiolog-ical conditions. Circulation 114, 559, 2006.
15. Small, J., Rottner, K., Hahne, P., and Anderson, K.I. Visua-lising the actin cytoskeleton. Microsc Res Tech 47, 3, 1999.
16. Ali, M.L., Kumar, S.P., Bjornstad, K., and Duran, C.M. Thesheep as an animal model for heart valve research. Cardio-vasc Surg 4, 543, 1996.
17. Hoerstrup, S.P., Kadner, A., Melnitchouk, S., Trojan, A., Eid,K., Tracy, J., Sodian, R., Visjager, J.F., Kolb, S.A., Gru-nenfelder, J., Zund, G., and Turina, M.I. Tissue engineeringof functional trileaflet heart valves from human marrowstromal cells. Circulation 106, 143, 2002.
18. Schmidt, D., Achermann, J., Odermatt, B., Genoni, M., Zund,G., and Hoerstrup, S.P. Cryopreserved amniotic fluid-de-rived cells: a lifelong autologous fetal stem cell source forheart valve tissue engineering. J Heart Valve Dis 17, 446,2008.
19. Ross, D.N. Homograft replacement of the aortic valve.Lancet 2, 487, 1962.
20. Yacoub, M., Rasmi, N.R., Sundt, T.M., Lund, O., Boyland, E.,Radley-Smith, R., Khaghani, A., and Mitchell, A. Fourteen-year experience with homovital homografts for aortic valvereplacement. J Thorac Cardiovasc Surg 110, 186, 1995.
Address correspondence to:Igor Tudorache, MD
Department of Cardiothoracic, Transplant and Vascular Surgery,Hannover Medical School
Carl-Neuberg-Str. 130625 Hannover
Germany
E-mail: [email protected]
Received: February 7, 2012Accepted: February 20, 2013
Online Publication Date: April 26, 2013
1694 TUDORACHE ET AL.
�14
Zusammenfassung
Herz-Kreislauferkrankungen sind die weltweit häufigsten Todesursachen. Angeborene
oder erworbene Herzklappen Pathologien gehören zu den bedeutendsten Subgruppen
dieser Erkrankungen. Weltweit finden etwa 280.000 Herzklappenoperationen pro Jahr
statt. Derzeit stehen zum Ersatz von Herzklappen mechanische oder biologische
Prothesen sowie kryokonservierte Allografts zur Verfügung. Die mechanischen Prothesen
haben den Vorteil einer langen Haltbarkeit, aber den Nachteil, dass sie eine lebenslange
Antikoagulation erforderlich machen. Die Hauptrisiken hierdurch sind Thromboembolien
und Blutungen. Diese Klappentypen werden vor allem bei jüngeren Patienten (<60 Jahre)
eingesetzt. Im Gegensatz hierzu erfordern biologische Prothesen keine Antikoagulation,
haben bessere hämodynamische Eigenschaften, neigen aber zu rascher Degeneration,
die je nach Patientenalter und Komorbiditäten unterschiedlich schnell abläuft und im
weiteren Lebensverlauf mitunter einen erneuten Klappenersatz notwendig macht. Die
strukturellen Veränderungen liegen bei etwa 70% bei den 20-40 jährigen und etwa 10%
bei über 70 jährigen Patienten. Biologische Klappenprothesen sind aus porcinen
Herzklappen, bovinen Perikard oder Jugularvenen hergestellt. Biologische
Klappenprothesen werden vor allem bei älteren Patienten (>65 Jahre) und bei Patienten
implantiert, bei denen eine orale Antikoagulation nicht erwünscht ist (z.B. Schwangere und
Frauen mit Kinderwunsch). Langfristig weisen sowohl die mechanische Prothesen als
auch die biologische Prothesen ein erhöhtes Infektionsrisiko und kein Wachstum auf.
Als in mehrerlei Hinsicht vorteilhafte Alternative zu mechanischen oder biologischen
Xenografts stehen humane Allografts (Homografts) zur Verfügung. Es gibt homovitale und
kryopräservierte Homografts. Homovitale Homografts bestehen aus vitalem Gewebe und
sind daher resistenter gegenüber Infektionen und haben auch den Vorteil, dass sie
physiologische hämodynamische Eigenschaften besitzen. Kryopräservierten Homografts
�15haben den Nachteil, dass sie, ähnlich den biologischen Xenografts, zu Degeneration
neigen, mit der Konsequenz, dass etwa 20% der Patienten nach 10 Jahre re-operiert
werden müssen. Ein weiterer Nachteil kryokonservierter Grafts ist, dass auf Grund ihrer
fehlenden Wachstumsfähigkeit die Verwendung in der pädiatrischen Herzchirurgie
eingeschränkt ist, und implantierte Grafts daher regelmäßig in Folgeoperationen ersetzt
werden müssen. Diese rezidivierenden Re-Operationen sind mit einem signifikant
erhöhten Mortalitätsrisiko für die Patienten verbunden.
Die ideale Klappenprothese soll deshalb eine exzellente Hämodynamik, hohe
Thromboseresistenz und Infektionresistenz, soll wachstumsfähig und nicht immunogen,
nicht hämolytisch und wegen fehlender mechanischer Teile geräuscharm sein. Neuste
Entwicklungen deuten darauf hin, dass mittels des sogenannten Tissue Engineerings ein
solch idealer Klappenersatz hergestellt werden kann. Dies beinhaltet die in vitro
Kultivierung verschiedener organotypischer Zelltypen auf dreidimensionalen
Herzklappenmatrices. So kann unter kontrollierten Bedingungen eine biokompatible
Klappenprothese mit o.g. Eigenschaften erzeugt werden. Zurzeit stehen verschiedene
Matrices zur Verfügung, wie biodegradable Polymerstrukturen oder allogene und
xenogene dezellularisierte Herzklappen. Dezellularisierten biologische Klappen zeigten
eingesetzt in der Pulmonalposition im Tierexperiment gute Ergebnisse. Massgeblich für die
Nichtthrombogenität ist das Endothel, das entweder in vitro aufgebracht werden kann oder
sich in vivo wieder bildet.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war eine präklinische in vivo Testung im Schafmodell von
mit Detergenzien dezellularisierten, in vitro reendothelialisierten Aortenklappenallografts im
Vergleich zur Verwendung von kryokonservierten Aortenklappen.
Alle Tierversuche und chirurgischen Eingriffe wurden nach der Deutsche Tierschutzgesetzt
und Europäische Richtlinie 2010/63/EU und in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die
�16Pflege und Nutzung von Labortieren (National Institutes of Health Publication No. 85 - 23,
revidiert 1996) durchgeführt und vom zuständigen Landesamt des Landes Niedersachsen
LAVES genehmigt.
Klappenkonduits mit Herzmuskelrand, Klappenannulus, Klappensegeln, kurzen
Koronararterienansätzen (etwa 3-4 mm Länge) sowie Aortenwand (5 cm Länge) wurden
von erwachsenen Schafen mit einem Körpergewicht zwischen 30 und 40 kg unter sterilen
Bedingungen entnommen. Sofort erfolgte die Spülung für 24h in einer Mischung aus zwei
Detergenzien (0,5% Natrium-Deoxycholat und 0,5% Natrium-Dodecylsulfat) für die
Dezellularisierung. Um Zellreste und Detergenzien zu entfernen wurden die
dezellularisierte Aortenkonduits (AK) im Anschluss mit PBS mit zusätzlich 100IE/ml
Penicillin-Streptomycin gewaschen.
Nach Dezellularisierung der AK gefolgt von DNase I-Verdauung zeigten die Materialproben
unter 5% verbliebene DNA im Vergleich mit nativen Gewebe.
Mittels Histologie und Immunhistochemie wurde das erhaltene dreidimensionale
Klappengerüst mit präservierten Kollagen, elastischen Fasern und Glykosaminoglykanen
nachgewissen. Um autologe Endothelzellen (EC) für die Re-Besiedlung des
Klappengerüsts zu erhalten wurden den zukünftigen Empfängerschafen eine Jugularvene
entnommen, und die EC daraus mittels Kollagenaseverdaus gewonnen (2% Kollagenase
A in Medium M199). Isolierte Zellen wurden in EGM-2 ergänzt mit Wachstumszusätzen
(SingleQuot mit 10% fötalem Kälberserum (FCS)) und 100 µg/ml Penicillin-Streptomycin in
Kulturflaschen eingesät.
Die Re-Besiedlung wurde mittels eines Bioreaktorsystems durchgeführt, das speziell für
die dynamische Kultivierung entwickelt wurde und das die hämodynamisch bedingte
Klappenbewegungen ähnlich wie unter physiologischen Bedingungen imitiert. Die AK
wurden steril im Bioreaktorsystem eingenäht. Im ersten Schritt der Besiedlung wurden die
�17dezellularisierten AK mit 500 ng CCN1 imprägniert, um die anschliessende Zellenadhäsion
positiv zu beeinflussen. Diese Inkubation dauerte 12h im Brutschrank bei 37°C mit 0,05
rpm in horizontale Position rollend, um eine homogene Bedeckung mit CCN1 zu erreichen.
In der zweite Phase wurden Endothelzellen (0,5 x 107 Zellen/AK) durch einen speziell
entwickelten Zellbesiedlungszulauf in das Klappenlumen injiziert. Nach der Re-Besiedlung
wurde der Bioreaktor für 6h senkrecht in einen Brutschrank gestellt. Im Anschluss wurde
der Bioreaktor nach der Re-Besiedelung für eine homogene Adhäsion der Zellen für
weitere 6h bei 37°C auf einen Rollator (0,05 Umdrehungen/min) installiert.
Nach der Besiedelung wurde der AK enthaltende Glasreaktor an eine pulsatile Pumpe
angeschlossen. Nach einem initialen pulsatilen Kreislauf von 0,1 l/min wurde der
Flussstrom bis zum vierten Tag zweimal täglich um je 0,05 l/min erhöht. Danach wurde bis
zum siebten Tag der Fluss täglich um 0.2 l/min erhöht und erreichte am Ende 1l/min.
Während der Kultivierung wurden der Medium - Kreislauf bezüglich Leckagen (kann die
Sterilität kompromittieren), Fluss, Druck und Temperatur kontrolliert und reguliert. Der
Gasaustausch im Bioreaktor fand durch eine andauernde Belüftung in der
Austauschkammer statt. Das Frischgas (94% Luft und 6% CO2) wurde mittels einer Roller-
Pumpe transportiert. Während der dynamischen Kultivierung wurden pO2, pCO2, Laktat,
Glukose wiederholt kontrolliert. Während der dynamische Kultivierung wurde der Druck bei
80 mmHg gehalten. Parallel konnten so zwei Bioreaktoren im gleichen Zellkulturschrank
betrieben werden, so dass am Ende der Kultivierung mit einem die morphologischen
Aspekte der Besiedlung analysiert werden konnte. Die AK, die für die in vivo Testung
vorgesehen war, wurde mitsamt dem Glasreaktor in den Operationssaal transportiert und
dort direkt vor Implantation aus dem Reaktor entnommen. Reendothelialisierte (tissue
engineered valves, TEV) und kryopräservierte Aortenklappen wurden in
Schwarzkopfschafe orthotop implantiert.
�18Die Kryopräservierung der Aortenconduits wurde nach dem für die klinische Anwendung
etablierten Protokoll durchgeführt. Die frisch explantierten Allografts wurden in eine
kryoprotective Lösung aus 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) and 20% FCS eingebettet. Die
Aortenconduits wurden kontrolliert kryopräserviert mit einer Kühlrate von -1°C/min von
15°C bis -120°C und anschließend rasch stickstoffgekühlt und in der Gasphase über
flüssigem Stickstoff bei -196°C gelagert. Das Auftauen erfolgte in zwei Schritten. Als erstes
wurden die kryopräservierten Aortenklappen (CPV) unter sterilen Bedingungen langsam
bis -100°C erwärmt Als nächstes wurden die CPV in einem Wasserbad (37°C) erwärmt,
bis makroskopisch kein Eis mehr beobachtet werden konnte.
Alle Tierversuche wurden unter tiefe Allgemeinnarkose durchgeführt. Die Einleitung der
Narkose erfolgte mittels Midazolam, Propofol und Atracurium gefolgt von endotracheale
Intubation des Tiers. Die Aufrechterhaltung der Narkose während des Eingriffs wurde mit
einer Mischung aus Narkosegas - Isofluran und Sauerstoff gewährleistet. Die perioperative
Schmerztherapie wurde mit der Gabe eines Opiats - Fentanyl, interkostale
Nervenblockade mit Carbostesin sowie Gabe von Temgesic und Capriofen durchgeführt.
Eine ausreichende Analgesie wurde durch klinische Untersuchung der Tiere überprüft. Alle
Tiere überlebten die Implanationsoperation. Die mittlere Klemmzeit der Aorta war 98 ± 28
min. und bei keinem Tier kam es zu neurologischen Ausfällen. Mittels transösophagealer
Echokardiographie (TEE) wurden die hämodynamischen Eigenschaften der implantierten
Klappenprothesen quantifiziert. Hier zeigte sich bei den CPV ein deutlich erhöhter
transvalvulärer Gradient verglichen mit den TEV.
Nach 3 Monaten, bei Versuchsende, die Entnahme der Herzklappen für die
Laboruntersuchungen erfolgte nach oben beschriebene Narkoseeinleitung und balancierte
Anästhesie. Die Tötung des Tiers erfolgte mit Eutha-77.
Die CPV Gruppe zeigte eine Eindickung der Klappensegel und eine geringe bis mäßige
Klappeninsuffizienz. Im Gegensatz hierzu zeigten sich die TEV morphologisch normal und
�19ohne Insuffizienz oder Stenose. Die Klappensegel in dieser Gruppe zeigten keine
pathologische Veränderungen. Diese Daten, ergänzt durch Magnetresonanztomographie
zeigen, dass es keine Aortenklappeninsuffizienz gab. Es gab keine Zeichen der
linksventrikulären Hypertrophie und ergab keine signifikante Mitralklappeninsuffizienz.
Keine der implantierten Aortenklappenconduits zeigten Risse, aneurysmatische
Dilatationen oder Infektionen. Bei den CPV zeigten sich bei der Explantation deutlich mehr
Adhäsionen und die Klappensegel waren geschrumpft und verdickt. Verkalkungen und
Vegetationen konnten auch beobachtet werden. Im Gegensatz hierzu zeigten die TEV
eine feine Aortenwand. Die Klappensegel waren fein und durchsichtig ohne Zeichen von
Verkalkungen, Fensterungen oder Vegetationen.
Die nach drei Monaten explantierten CPV zeigten eine schwere Leukozyteninfiltration und
Inflammation sowie Zeichen von Klappensegelverkalkungen und in der Wand
Kalziumablagerungen. Die luminale Oberfläche war mit CD31 und vWF-positiven Zellen
bedeckt. Auf der luminösen Seite der explantierten TEV konnten keine Zeichen der
Inflammation beobachtet werden und die Aortenwand, Sinus und Segel waren mit eNOS,
CD31, vWF-positive Zellen bedeckt, was die Zellschicht als es als Endothel identifiziert.
Mit Hilfe der Phalloidin - Färbung konnte die typische kopfsteinpflasterartige EC-
Morphologie dargestellt werden.
Diese Beobachtung deutet daraufhin, dass unsere Dezellularisierungsmethode zusammen
mit unserer Wiederbesiedelungstechnik eine zuverlässige Methode der in vitro
Reendothelialisierung der Aortenconduits mit ausgezeichneten Ergebnisse drei Monate
nach der Implantation ist und dass sie hinsichtlich Inflammation gegenüber
kryopräservierten Aortenconduits bessere Ergebnisse zeigt. In dieser Studie präsentierten
wir den Unterschied zwischen CPV und TEV drei Monate nach Implantation. Obwohl in
der CPV-Gruppe funktionell keinen großen Nachteile beobachtet werden konnten, konnten
mikroskopisch und makroskopisch Degenerationszeichen dargestellt werden. In der TEV-
�20Gruppe zeigten sowohl die funktionellen Tests als auch die makroskopischen und
mikroskopischen Beobachtungen eine fast komplette endotheltypische Bedeckung der
Graftwand, Sinus und Klappensegel.
�21
Literaturverzeichnis
1. Carrier, M., Pellerin, M., Perrault, L.P., Page, P., Hebert, Y., Cartier, R., Dyrda, I., and Pelletier, L.C. Aortic valve replacement with mechanical and biologic prosthesis in middle-aged patients. Ann Thorac Surg 71, 253, 2001.
2. van Geldorp, M.W., Eric Jamieson, W.R., Kappetein, A.P., Ye, J., Fradet, G.J., Eijkemans, M.J., Grunkemeier, G.L., Bogers, A.J., and Takkenberg, J.J. Patient outcome after aortic valve replacement with a mechanical or biological prosthesis: Weighing lifetime anticoagulant-related event risk against reoperation risk. J Thorac Cardiovasc Surg 137, 881, 2009.
3. Konakci, K.Z., Bohle, B., Blumer, R., Hoetzenecker, W., Roth, G., Moser, B., Boltz-Nitulescu, G., Gorlitzer, M., Klepetko, W., Wolner, E., and Ankersmit, H.J. Alpha-gal on bioprostheses: Xenograft immune response in cardiac surgery. Eur J Clin Invest 35, 17, 2005.
4. Kasimir, M.T., Rieder, E., Seebacher, G., Nigisch, A., Dekan, B., Wolner, E., Weigel, G., and Simon, P. Decellularization does not eliminate thrombogenicity and inflammatory stimulation in tissue-engineered porcine heart valves. J Heart Valve Dis 15, 278, 2006.
5. Hawkins, J.A., Hillman, N.D., Lambert, L.M., Jones, J., Di Russo, G.B., Profaizer, T., Fuller, T.C., Minich, L.L., Williams, R.V., and Shaddy, R.E. Immunogenicity of decellularized cryopreserved allografts in pediatric cardiac surgery: comparison with standard cryopreserved allografts. J Thorac Cardiovasc Surg 126, 247, 2003.
6. Shaddy, R.E., Hunter, D.D., Osborn, K.A., Lambert, L.M., Minich, L.L., Hawkins, J.A., McGough, E.C., and Fuller, T.C. Prospective analysis of HLA immunogenicity of cryopreserved valved allografts used in pediatric heart surgery. Circulation 94,1063, 1996.
7. Horer, J., Hanke, T., Stierle, U., Takkenberg, J.J., Bogers, A.J., Hemmer, W., Rein, J.G., Hetzer, R., Hubler, M., Robinson, D.R., Sievers, H.H., and Lange, R. Homograft performance in children after the ross operation. Ann Thorac Surg 88, 609, 2009.
8. Boethig, D., Goerler, H., Westhoff-Bleck, M., Ono, M., Daiber, A., Haverich, A., and Breymann, T. Evaluation of 188 consecutive homografts implanted in pulmonary position after 20 years. Eur J Cardiothorac Surg 32, 133, 2007.
9. Cebotari, S., Tudorache, I., Ciubotaru, A., Boethig, D., Sarikouch, S., Goerler, A., Lichtenberg, A., Cheptanaru, E., Barnaciuc, S., Cazacu, A., Maliga, O., Repin, O., Maniuc, L., Breymann, T., and Haverich, A. Use of fresh decellularized allografts for pulmonary valve replacement may reduce the reoperation rate in children and young adults: early report. Circulation 124, 115, 2011.
10. Dohmen, P.M., Lembcke, A., Holinski, S., Pruss, A., and Konertz, W. Ten years of clinical results with a tissue-engineered pulmonary valve. Ann Thorac Surg 92, 1308, 2011.
11. Baraki, H., Tudorache, I., Braun, M., Hoffler, K., Gorler, A., Lichtenberg, A., Bara, C., Calistru, A., Brandes, G., Hewicker-Trautwein, M., Hilfiker, A., Haverich, A., and Cebotari, S. Orthotopic replacement of the aortic valve with decellularized allograft in a sheep model. Biomaterials 30, 6240, 2009.
�2212. Lichtenberg, A., Cebotari, S., Tudorache, I., Sturz, G., Winterhalter, M., Hilfiker, A., and Haverich, A. Flow-dependent re-endothelialization of tissue-engineered heart valves. J Heart Valve Dis 15, 287, 2006.
13. Fischlein, T., Schutz, A., Uhlig, A., Frey, R., Krupa, W., Babic, R., Thiery, J., and Reichart, B. Integrity and viability of homograft valves. Eur J Cardiothorac Surg 8, 425, 1994.
14. Lichtenberg, A., Tudorache, I., Cebotari, S., Suprunov, M., Tudorache, G., Goerler, H., Park, J.K., Hilfiker-Kleiner, D., Ringes-Lichtenberg, S., Karck, M., Brandes, G., Hilfiker, A., and Haverich, A. Preclinical testing of tissue-engineered heart valves re-endothelialized under simulated physiological conditions. Circulation 114, 559, 2006.
15. Small, J., Rottner, K., Hahne, P., and Anderson, K.I. Visualising the actin cytoskeleton. Microsc Res Tech 47, 3, 1999.
16. Ali, M.L., Kumar, S.P., Bjornstad, K., and Duran, C.M. The sheep as an animal model for heart valve research. Cardiovasc Surg 4, 543, 1996
17. Hoerstrup, S.P., Kadner, A., Melnitchouk, S., Trojan, A., Eid, K., Tracy, J., Sodian, R., Visjager, J.F., Kolb, S.A., Grunenfelder, J., Zund, G., and Turina, M.I. Tissue engineering of functional trileaflet heart valves from human marrow stromal cells. Circulation 106, 143, 2002.
18. Schmidt, D., Achermann, J., Odermatt, B., Genoni, M., Zund, G., and Hoerstrup, S.P. Cryopreserved amniotic fluid-derived cells: a lifelong autologous fetal stem cell source for heart valve tissue engineering. J Heart Valve Dis 17, 446,2008
19. Ross, D.N. Homograft replacement of the aortic valve. Lancet 2, 487, 1962.
20. Yacoub, M., Rasmi, N.R., Sundt, T.M., Lund, O., Boyland, E., Radley-Smith, R., Khaghani, A., and Mitchell, A. Fourteen-year experience with homovital homografts for aortic valve replacement. J Thorac Cardiovasc Surg 110, 186, 1995.
�23
Lebenslauf
Name: Dr. Medic Alexandru Florin Calistru Eltern: Petre Iacob Calistru Elena Calistru Geburtsdatum: 22.Oktober 1979, Rimnicu Vilcea, Rumänien Staatsangehörigkeit: Rumänisch Familienstand: Ledig Anschrift: Sommerberg 20
35394 Gießen Handy: +49 – 1523 7040996
Email Arbeit: [email protected] Email Privat: [email protected] Institution: Klinik für Anästhesiologie und operative Intensivmedizin Universitätsklinikum Gießen und Marburg Rudolf-Buchheimstr. 7 35392 Gießen Sprachen: Rumänisch – Muttersprache Deutsch – Fortgeschritten English – Fortgeschritten Französisch – Anfänger Ausbildung:
1994-98 „Matei Basarab“ High School, Bukarest, Rumänien 1998-2004 Medizinische Fakultät – Universität „Titu Maiorescu“, Bukarest, Rumänien
Sept. 2004 Diplomarbeit: „Histopathologische Aspekte in HCV Hepatitis“ Berufsausbildung:
Januar 2013 – Assistenzarzt in der Klinik für Anästhesiologie, Operative Intensivmedizin und Schmerztherapie, Universitätsklinikum Gießen und Marburg, Standort Gießen
August 2011 – Dezember 2012 Assistenzarzt auf der Intensivstation der Klinik für Herz-, Kinderherz-
und Gefäßchirurgie, Universitätsklinikum Giessen und Marburg, Standort Gießen
April 2009 – Dezember 2010 Assistenzarzt in der Klinik für Herz-, Thorax, Transplantations- und
Gefäßchirurgie, Medizinische Hochschule Hannover • Assistenzarzt: Forschung (LEBAO: April 2009 – November 2009)
Normal Station (November 2009 – März 2010) Privatassistent (April 2010 – Oktober 2010) Stationsarzt (November 2010 – Dezember 2010)
�24
• Chirurgische Erfahrung: Erste und zweite Operationsassistent für Herzchirurgische Eingriffe, Thoraxchirurgische Eingriffe, Herz- und Lungentransplantationen, sowie Re-Eingriffe
• Forschungsrotation:
o In vitro Rebesiedelung der Pulmonal- und Aortenklappen
o Implantation von tissue engineerte Pulmonalklappen im Schaf
o Explantationen und Auswertung der implantierten Klappen
April 2008 – März 2009 Wissenschaftlicher Mitarbeiter im Leibniz Forschungslaboratorien für
Biotechnologie und künstliche Organe (LEBAO), Medizinische Hochschule Hannover, Deutschland
• Organentnahme (Schwein und Schaf) für Laboratorienzwecke (z.B. BioVAM, Aorta, a. Thoracica interna (ATI), Aortenklappen, Pulmonalklappen)
• Operateur und Assistent in der tierexperimentelle chirurgische Eingriffe Implantation von tissue engineerte Pulmonalklappen und Aortenklappen im Schaf, vaskularisiertes Magenpatch im Schwein
• ATI: Entnahme beim Schwein und beim Schaf • Etablierung des Dezellularisierungsprotokoll der ATI • Tissueengineerte ATI Implantationen • Explantierung sowie Assistent der ATI Explantationen,
Bearbeitung und Lagerung der Proben März 2007 – März 2008 Forschungsstipendiat im Leibniz Forschungslaboratorien für
Biotechnologie und künstliche Organe, Medizinische Hochschule Hannover, Deutschland
• E n tn a h m e u n d D e z e l l u l a r i s i e r u n g d e r A o r t e n u n d Pulmonalklappen vom Schaf
• In vitro Rebesiedlung der dezellularisierten Aorten und Pulmonalklappen
• Organentnahme für Laboratorienzwecke (z.B. BioVAM, Aorta, a. Thoracica interna, Aortenklappen, Pulmonalklappen) Raster Elektronen Mikroskopie (Tracheen, Haut, Herzklappen)
• Endothelzellenisolation vom Blut, Arterien und Venen Okt. 2006 – März 2007 Thoraxchirurgische Rotation, Institut für Pneumologie „Marius Nasta“,
Bukarest, Rumänien
�25
April 2006 – Sept. 2006 Intensivmedizin Rotation, Institut für kardiovaskuläre Krankheiten, „C. C.
Iliescu“, Bukarest, Rumänien April 2005 – März 2006 Allgemeinchirurgische Rotation: mit mehr als 380 Operationen als
Operateur, 1.Assistent und 2.Assistent: klassisch oder laparoskopisch in der Abteilung für Allgemeinchirurgie und Lebertransplantation, Klinische Institut Fundeni, Bukarest, Rumänien
April 2005 – September 2011 Assistenzarzt für Herzchirurgie in dem Institut für kardiovaskuläre
Krankheiten, „C. C. Iliescu“, Bukarest, Rumänien März 2005 – September 2011 Universitätsdozent für Chirurgie, Medizinische Fakultät, Universität
„Titu Maiorescu“, Bukarest, Rumänien
Teilnahme an Konferenzen, Symposien: Februar 2013 Echokardiographie in Anästhesiologie und Intensivmedizin - TEE Kurs,
Uniklinikum Gießen und Marburg August 2012 Echokardiographie-Grundkurs - Pörtschach am Wörthersee Januar 2012 Intensivmedizin Kompakt – HIFIT 2012 (Heidelberger Interdisziplinäres
Forum Intensivtherapie) Juni 2006 International Conference „Romanian Transplantation“, Klausenburg,
Rumänien März 2006 International Symposion of Romanian Cardiovascular Surgery Society
„Endovascular Procedure – Pros and Cons“, Bukarest, Rumänien Mai 2005 – April 2006 Vorlesungen und Debatte der rumänische Gesel lschaft für
Allgemeinchirurgie, Bukarest, Rumänien
Mitgliedschaft: Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefäßchirurgie
Veröffentlichungen:
Succesful matrix guided tissue regeneration of decellularized pulmonary heart valve allografts in elderly sheep K. Theodoridis, I. Tudorache, A. Calistru, S. Cebotari, T. Meyer, S. Sarikouch, C. Bara, R. Brehm, A. Haverich, A. Hilfiker Biomaterials (52), 221-228, 2015
�26Orthotopic replacement of Aortic Heart Valves with Tissue-Engineered Grafts I. Tudorache, MD1a, A. Calistru1a, MD, H. Baraki1, MD, T. Meyer, DVM1, K. Höffler1, S. Sarikouch, MD1, Christopher Bara, MD1, Dagmar Hartung, MD2, Andres Hilfiker, PhD1, Axel Haverich, MD1, and Serghei Cebotari, MD1
1 Division of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Hannover Medical School 2 Radiology, Hannover Medical School a Both authors contributed equally to this work
Tissue Engineering Part A, vol. 19(15-16), 1686 - 1694, 2013
Autologous vascularised gastric tissue is suitable for myocardial restoration in the left ventricle T. Meyer, A. Calistru, M. Pichlmaier, G. Brandes, D. Hartung, K. Theodoridis, K.H. Waldmann, A. Hilfiker, A. Haverich, S. Cebotari 78. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie 2012, Mannheim
An Analysis of Tissue-Engineered Pulmonary Valves Implanted in the Elderly Ovine Model Karolina Theodoridis1, Alexandru Calistru1, Tanja Meyer1, Igor Tudorache1, Serghei Cebotari1, Samir Sarikouch1, Christoph Bara1, Ralph Brehm2, Andres Hilfiker1, Axel Haverich1
1 Division of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Hannover Medical School 2 Anatomic Institute, Veterinary School of Hannover 5th Biennial Conference on Heart Valve Biology and Tissue Engineering, May 18th-20th 2012, Myconos Island
Aortic Valve Tissue Engineering Using Progenitor Cells in Dynamic Bioreactor: Construction and Mechanical Testing A. Calistru, T.Meyer, M.Braun, I. Tudorache, S. Cebotari, B. Richter, A. Haverich and A. Hilfiker Awardwinner Borst Preis 2010 - Best Ranked Abstract 39th Annual Meeting of the German Society Thoracic and Cardiovascular Surgery, Stuttgart, Germany, February 2010
Orthotopic replacement of the aortic valve with decellularized allograft in a sheep model Hassina Baraki, Igor Tudorache, Maike Braun, Klaus Höffler, Adelheid Görler, Artur Lichtenberg, Christopher Bara, Alex Calistru, Gudrun Brandes, Marion Hewicker-Trautwein, Andres Hilfiker, Axel Haverich, Serghei Cebotari Biomaterials (30), 6240-6246, 2009
�27Positive Influence of the Proangiogenic Factor CCN1 on in vitro Reendothelialization of Pulmonary Valves with Endothelial Cells Differentiated from Ovine EPC Alexandru Calistru, Igor Tudorache, Serghei Cebotari, Greta Tudorache, Axel Haverich and Andres Hilfiker 75th Annual Meeting of the German Society of Cardiology, Mannheim, Germany, April 2009
In Vitro Re-endothelialization of Decellularized Heart Valves Using EPCs A. Calistru, I. Tudorache, G. Tudorache, S. Cebotari, A. Haverich, A. Hilfiker 38th Annual Meeting of the German Society Thoracic and Cardiovascular Surgery, Stuttgart, Germany, February 2009
Creation of Valves Grafts Using Detergent Decellularization of Human Pulmonary Conduits A. Calistru, I. Tudorache, S. Cebotari, A. Hilfiker, A. Batrinac, O. Repin, G. Tudorache, A. Ciubotaru , A. Haverich; Fourth National Conference of Cardiovascular Surgery, Sibiu, Romania, October 2007
Analysis of decellularised pulmonary heart valve allografts in the elderly sheep model K. Theodoridis, A. Calistru, T. Meyer, I. Tudorache, S. Sarikouch, C. Bara, R. Brehm, A. Hilfiker, A. Haverich, S. Cebotari 78. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie 2012, Mannheim
Besondere Kenntnisse: Keynote, Powerpoint, Pages, Word, Numbers, Excel Hobbys / Interessen: Sport (Tennis, Ski, Schwimmen), Reise, Geschichte
Hannover, den 21.04.2015 _____________________(Alexandru Florin Calistru)
�28
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich besonders meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. Axel
Haverich, für die Bereitstellung und Betreuung des Themas und Unterstützung für diese
Promotionsarbeit in seiner Klinik danken.
Für die Belehrung, Unterstützung und Betreuung meiner wissenschaftlichen Tätigkeit im
Laboratorium, möchte ich mich ganz herzlich bei den Herren Dr. med. Igor Tudorache, Dr.
med. Serghei Cebotari und Dr. phil. Andres Hilfiker bedanken.
Ein besonderer Dank gilt für Tanja Meyer und Doreen Unger für die freundliche und
außergewöhnliche Mitarbeit, sowie die Unterstützung und Betreuung dieses Projektes.
Für die Hilfestellung und Betreuung der Arbeit möchte ich den LEBAO-Mitarbeitern und
Mitglieder der „Experimentelle Chirurgie“ Abteilung Karin Peschel, Astrid Dierks-Ketterkatt,
Rosalinde Katt und Petra Ziehme danken.
Für die exzellente Beratung und Mitarbeit bei den operativen Durchführung der Versuche
möchte ich Herrn Klaus Höffler danken.
Die Laborarbeiten fanden im Leibniz Forschungslaboratorium für Biotechnologie und
Künstliche Organe (LEBAO) - Klinik für Herz,- Thorax-, Transplantations- und
Gefäßchirurgie der Medizinische Hochschule Hannover statt.
�29
Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 6 und 7
Ich erkläre, dass ich die der Medizinische Hochschule Hannover zur Promotion
eingereichte Dissertation mit dem Titel "Orthotoper Aortenklappenersatz mittels
Tissue-Engineerten Grafts“ in der Klinik für Herz-, Thorax-, Transplantations- und
Gefäßchirurgie der Medizinische Hochschule Hannover unter der Leitung und Betreuung
von Prof. Dr. Dr. h. c. Axel Haverich und in Zusammenarbeit mit Dr. med. Igor Tudorache
und Unterstützung durch Dr. med. Serghei Cebotari sowie ohne sonstige Hilfe
durchgeführt und bei der Abfassung der Dissertation keine anderen als die dort
aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe.
Die Gelegenheit zum vorliegenden Promotionsverfahren ist mir nicht kommerziell
vermittelt worden. Insbesondere habe ich keine Organisation eingeschaltet, die gegen
Entgelt Betreuerinnen und Betreuer für die Anfertigung von Dissertationen sucht oder die
mir obliegenden Pflichten hinsichtlich der Prüfungsleistungen für mich ganz oder teilweise
erledigt.
Ich habe diese Dissertation bisher an keiner in- oder ausländischen Hochschule zur
Promotion eingereicht. Weiterhin versicherte ich, dass ich den beantragten Titel bisher
noch nicht erworben habe.
Ergebnisse der Dissertation wurden in folgendem Publikationsorgan Tissue Engineering Part
A, vol. 19(15-16), 1686 - 1694, 2013 unter dem Titel „Orthotopic replacement of Aortic Heart
Valves with Tissue-Engineered Grafts“ veröffentlicht.
Hannover, den 21.04.2015
_____________________
(Alexandru Florin Calistru)
