Folie 1

Pestizidrückstandsanalytik unter Einsatz der LC-MS

Ellen Scherbaum

Möglichkeiten und Limitationen

Folie 2

Gliederung

Ziele des CVUA StuttgartGerätetechnik LC-MSApplikationen (Möglichkeiten)ValidierungSchwierigkeiten (Limitationen)Ergebnisse aus der Lebensmittelüberwachung

Folie 3

Ziele

So einfach wie möglich, so viel wie möglich, so gut wie nötig

Möglichst viele Stoffe mit einer einfachen Multimethode erfassenEinen Extrakt sowohl für die GC- als auch für die LC-BestimmungenMatrix-orientiertes StoffspektrumMatrixeinflüsse bei der Chromatographie berücksichtigen (Standard-Addition bei HMÜ)

Folie 4

Multi

Einwaage von 20 g Probe Zugabe von 50 ml Aceton

Extraktion mit dem Ultra-Turrax Abnutschen

Zugabe von gesätt. NaCl-Lösung und von Wasser

Flüssig-flüssig-Verteilung mit 20 ml Cyclohexan/Ethylacetat 1:1

pH-Wert-Einstellung auf pH etwa 8,5 und 9,5

2 mal Flüssig-flüssig-Verteilung mit Cyclohexan/Ethylacetat 1:1

Trocknen mit Na2SO4 und Einengen

Auffüllen auf ein definiertes Volumen z.B. 10 ml

GC-MS LC/MS

DLR 93 316-327 (1997)

Folie 5

Mini-Multi

Anastassiades et al.EPRW 4, Rom 2002

10 g Probe in ein 50 ml Zentrifugenglas einwiegen Zugabe von 10 ml Acetonitril

1 min kräftig schütteln

Zugabe von 4 g MgSO4 und 1 g NaCl rasch 1 min schütteln

Zugabe von 100 µl ISTD-Lösung

30 sec kräftig schütteln

5 min zentrifugieren

Aliquot des Extraktes mit PSA und MgSO4 versetzen, 30 sec schütteln

1 min zentrifugieren etwa 1 ml in 1 GC-Vial überführen

GC-MSD und LC-MS

Folie 6

LC-MS - Schematischer Aufbau der API-ES

HP 1998

Nebulizer

+ + ++

+++ + + ++ +

+

QuadrupoleLensesFragmentation zone (CID)

Capillary Octopole

3 Torr 1 x 10-5 Torr

Folie 7

ESI

Flüssigkeitströpfchenvon der Säule

+ ++

++

++

++

+-

--

-

-

+ ++

++

++

++

+----

-+

+

++++ --

+

+

++++ --

+

+

from column+ +

++

+

+

+

++

++

++ ++

++

TaylorCone

Nebulizing Gas

+ ++++++

+

+

+++++

+ +++

+ +

+

++

+

++ +

++++ +

+

+

+ +

+

+

+

+

+

++ ++ +

+

+ ++

+

++

+

+

++

+

+

+++

+

+

+

+

+ +++

LM-Verlust durch Verdampfung

Rayleigh Limiterreicht

Analytion

Solvent Ion Cluster

Folie 8

Solution Chemistry

PositiverModus

Negativer Modus

R1 R1| |

:N - R2 + HA +HN - R2 + A-

| |R3 R3

Base Säure Analytion

O O|| ||

R-C-OH + :B R-C-O- + H:B+

Säure Base Analytion

Elektrospray: Analytionen müssen in Lösung vorliegen!

Folie 9

Solution Chemistry

l Positive IonendetektionpH-Wert erniedrigen durch Zusatz

vonè Ammoniumacetat pH 4-5è Essigsäure pH 3-4è Ameisensäure pH 2-3è Trifluoressigsäure pH 1-2

l Negative IonendetektionpH-Wert erhöhen durch Zusatz

vonè Ammoniumhydroxidè Triethylamin

++

++

++

++ + + + + + + + + + + + +

+

+

-5,000 V

Folie 10

CID – collision induced dissoziation

M n [M] +1

[M]2

+

Fragmentor-Voltage

QuatrupolOctopol

Fragmentierungs-zone, 3 Torr N2 439

467

684.65Fragmentor = 175 V

Folie 11

Methodenentwicklung LC-MS

FIAsFlow injection analysis:

Methamidophos1 µg/ml

Fragmentor V variabel

TIC

m/z 125

m/z 112

m/z 94

m/z 142

2 4 60

10000

20000

30000

*MSD1 TIC, MS File (FIA\FIA00009.D) API-ES, Pos, Scan, Frag: Var

VCap

: 1000

VCap

: 1000

VCap

: 1000

VCap

: 1000

VCap

: 1000

VCap

: 1000

VCap

: 1000

VCap

: 1000

VCap

: 1500

0.1

85

0.9

76

1.7

58

2.5

47

3.3

16

4.1

52

4.9

95

5.8

11

2 4 60

5000

10000

15000

*MSD1 142, EIC=141.7:142.7 (FIA\FIA00009.D) API-ES, Pos, Scan, Frag: Var

0.1

84

0.9

70

1.7

58

2.5

47

3.3

20

4.1

55

4.9

94

2 4 60

2000

4000

*MSD1 125, EIC=124.7:125.7 (FIA\FIA00009.D) API-ES, Pos, Scan, Frag: Var

2.5

43

3.3

16

4.1

51

4.9

98

5.8

24

2 4 60

250

500

750

*MSD1 112, EIC=111.7:112.7 (FIA\FIA00009.D) API-ES, Pos, Scan, Frag: Var

2 4 60

250050007500

10000

*MSD1 94, EIC=93.7:94.7 (FIA\FIA00009.D) API-ES, Pos, Scan, Frag: Var

2.5

46

3.3

07

4.1

48

4.9

92

5.8

12

30 40 80 90 10050 60 70

Folie 12

Methodenentwicklung LC-MS

- H-S-CH3100M-47 Ê94

- NH370M-16 Ê125

40M+1 Ê142

OptimaleFragmentor V

Ionm/z

Methamidophos5 mmol NH4Ac/Acetonitril

H3NP

O

OS CH3

CH3

Folie 13

Methodenentwicklung LC-MS

H3NP

O

OS CH3

CH3

M-47

M-16

M+1

Folie 14

GC oder LC-MS?

API Electrospray

Mo

lekularg

ewich

t

Analyt-Polarität

1000

100,000

10,000

unpolar stark polar

APCI

GC/MS

Folie 15

Routine-Applikationen

N-MethylcarbamateBenzoylharnstoff-InsektizideDiacylhydrazineOrganozinn-VerbindungenAcephat/MethamidophosChlormequat/MepiquatBasische FungizideImidacloprid(Phenylharnstoff-Herbizide)

CCl

H

H

C

H

H

N

CH3

CH3

CH3 Cl

Chlormequat chloride

Folie 16

Säulen / mobile Phasen

Aqua C18150 x 2 mm 3 µ

5 mmol NH4AcetatAcetonitril

NMC SulfoneSulfoxide

Macroshere WCX 300 A 150 x 2,1 mm 7 µ

25 mmol NH4Acetat0,025 % HAc (60 %), Methanol

ChlormequatMepiquat

Zorbax XDB C1850 x 2,1 mm 3,5 µ

H2O:MeCN:HAc(90:7:3 – 7:90:3)

Organozinns

Zorbax XDB C18150 x 2,1 mm 3,5 µ

5 mmol NH4AcetatMethanol

Basische Fungizide

Synergi Polar RP150 x 2 mm 4 µ

5 mmol NH4AcetatAcetonitril

MethamidophosAcephat

Zorbax XDB150 x 2 mm

5 mmol NH4AcAcetonitril

Standard Methode

Folie 17

NachweisgrenzenBG mg/kgNG mg/kgStoffe

0,010,003

0,008-0,010,002-0,0040,004-0,008

0,01 Phenylharnstoffe0,01 Imidacloprid

0,001-0,01 Basische Fungizide0,02 Chlormequat/Mepiquat

0,005 Acephat/Methamidophos0,013-0,02 Organozinn-Verbindungen

0,003-0,007 Diacylhydrazine0,008-0,014 Benzoylharnstoff-Insektizide0,002-0,01 N-Methylcarbamate

Folie 18

Beispiel-ChromatogrammPaprika 2 g/ml Benzoyl-Harnstoff-Pestizide 0,1 ppm

min4 5 6 7 8 9

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

Flufenoxuronm/z 487

IS PCPm/z 265

Diflubenzuronm/z 309

Teflubenzuronm/z 379

Lufenuronm/z 509

Triflumuronm/z 357

Hexaflumuronm/z 459

Folie 19

Validierung

Teilnehmer: 111 Labors

EU-PT 4Pestizid Anwen-

dung Dotiert mg/kg

CVUA S mg/kg

Median mg/kg

Azinphos-methyl ja 0,29 0,21 Azoxystrobin 0,34 0,31 0,26 Brompropylate 0,48 0,47 0,38 Carbofuran 0,14 0,15 0,13 Chlorpyriphos ja 0,082 0,072 Chlorpyriphos-me 0,19 0,175 0,152 Cypermethrin ja 0,35 + A 0,43 0,38 Diazinon 0,14 0,14 0,12 Imazalil 0,94 0,76 0,69 Imidacloprid ja 0,15 + A 0,2 0,16 Mecarbam 0,14 0,14 0,12 Methamidophos ja 0,11 0,09 Methidathion ja 0,43 0,39 Omethoate 0,14 0,145 0,11 Parathion 0,20 0,19 0,15

Folie 20

Matrixeffekte

Massenspektren verändern sich u.U.

Massenspektren konstant

Zeitlich konstantZeitlich nicht konstant

Stark abhängig von chromat. Trennung

Chromat. Trennung ohne Einfluss

MatrixabhängigMatrixabhängig

Vom Analyt abhängigVom Analyt abhängig

SignalsuppressionSignalerhöhung

Nach der SäuleIm Injektor

LC-MS (ESI)GC-MSD (Quadrupol)

Folie 21

Matrixeffekte - Beispiel

0

50

100

150

200

250

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

2 g/ml

1 g/ml

0,5 g/ml

0,25 g/ml

0,125 g/ml

ohne Matrix

TPP Konzentration [µg/ml]

Fläche

Matrix

Folie 22

Matrixeffekte - Abhilfe

Flächenverhältnis Analyt/ISTD

zugegebene Menge an Analyt (Aufstockung)|x|

|x|: absolute Menge an Analyt im Probenextrakt vor der Dotierung (y=0)

y-Achsenabschnitt?x? =

Steigung der Geraden

Folie 23

0 5 10 15 20 25

Carbendazim

Chlormequat

Chlorpyrifos

Captan

Pirimicarb

Imazalil

Cyprodinil

Procymidon

Pyrimethanil

Endosulfan

Dichlofluanid

Brompropylat

Dithiocarbamate

Tebufenozid

Thiabendazol

0 5 10 15 20 25 30

Carbendazim

Procymidon

Chlorpyriphos

Dichlofluanid

Imazalil

Thiabendazol

Brompropylat

Pyrimethanil

o-Phenyl-Phenol

Endosulfan

Vinclozolin

Iprodion

Captan

Prochloraz

Dicofol

Befunde – LC-Stoffe

Obst 1997 Obst 2001Top 15 Top 15

Folie 24

Befunde - HMÜs

72 (55 %)

150 (60 %)

56 (35 %)

davon LC-Substanzen

NMC, Basische, CCC, Ozinn, Ozide, BUs,

Methamidophos

1322002 (bis August)

NMC, Basische, CCC, Ozinn, Ozide, BUs,

Methamidophos

2482001

Basische, Ozinn, BUs,

Methamidophos

1582000

Erfasste Stoffklassen

Stoffe über Höchstmenge

Jahr

Folie 25

Befunde - Benzoylharnstoffe

2000

2001 25 HMÜ

Gruppe Probenzahl mit Rückständen

>HM

Zitrusfrüchte 82 1 Trauben 69 9 (13 %) 8 (12 %) Pilze 65 4 Andere 12 1 Kernobst 88 28 (32 %) 7 (8 %) Solanaceen 91 27 (30 %) 9 (10 %) Steinobst 42 1 Tee 18 1 1 Alle Proben 680 80 (12 %) 25 (3,7 %)

Folie 26

Befunde - NMCStoff Anzahl

Proben mit Rückständen

HMÜ Lebensmittel

Carbaryl 13 0 Paprika, Salat, Trauben, Kernobst

Carbofuran 2 1 Paprika, Clementinen Isoprocarb 1 1 Kiwis Methiocarb 13 1 Erdbeeren, Trauben,

Auberginen, Paprika, Salat, Kohl

Methomyl 5 3 Trauben, Aprikosen, Salat, Auberginen

Propoxur 6 1 Äpfel, Johannisbeeren, Salat

Summe 40 7

2001

Folie 27

Befunde - Diacylhydrazine2001

2002 Aktuell:Stachelbeeren >HM

Herkunft Probenzahl Tebufenozid untersucht mit

Rückständen

Min (mg/kg)

Max (mg/kg)

Äpfel Argentinien 1 1 0,03 Chile 4 3 0,007 0,05 Deutschland 150 33 (22 %) 0,003 0,1 Summe 155 37 (24 %) 0,003 0,1 Birnen Argentinien 2 1 0,1 Deutschland 49 2 0,01 0,06 Italien 14 2 (14 %) 0,03 0,06 Summe 65 5 (8 %) 0,01 0,1 Paprika Griechenland 1 1 0,004 Spanien 24 13 (54 %) 0,003 0,02 unbekannt 2 1 0,003 Summe 27 15 (56 %) 0,003 0,02

Folie 28

Befunde - Chlormequat

05 FälleBabynahrung

6 %013 %Tomaten (I) 2002

27 %039 %Paprika (ES) 2002

64 %064 %Karotten (I)2001/2

je 16 %18 %58 %Birnen (D) 2001

HMÜsProben mitMepiquat

Proben mitChlormequat

Matrix

Folie 29

Befunde - OZinns

NL,BE,FR,IT,MARFBO0,01-0,0511Solanaceen

IT,TRFBO0,01-0,093Melonen

COLFentin0,031

BRAFBO0,171Exot. Früchte

ES,IL,TR,IT,CUBFBO0,01-0,6445Citrusfrüchte

IT,ESFBO0,02-0,052Steinobst

IT,ESCyhexatin0,022

IT,GRFBO0,02-0,133Trauben

DEFBO0,02-0,213Beeren

DE,IT,NL,FRFBO0,01-0,126Kernobst

HerkunftStoffBereich mg/kg

N pos. Proben

Matrix2000-2002

Folie 30

Literatur- www.cvua-stuttgart.de

- Analysis of Diacylhydrazines – Methodology and Residue Data E Scherbaum, M Anastassiades 4th European Pesticide Residue Workshop in Rom, Mai 2002 - Chlormequat and Mepiquat – Residue Data for Various Commodities E Scherbaum, E Schüle, C Wauschkuhn, R Perz 4th European Pesticide Residue Workshop in Rom, Mai 2002

- Entwicklung schneller Verfahren zur Rückstandsanalytik von Pflanzenschutzmitteln in Obst und Gemüse unter Einsatz der SFE – ein Beitrag zur Beseitigung analytischer Defizite, Dissertation M. Anastassiades, Shaker Verlag Aachen, 2001

- Analysis of Benzoylphenylurea Insecticides in Fruits and Vegatables – Methodology and Residue Data M Anastassiades, E Scherbaum und W Schwack Dtsch. Lebensm. Rdsch. 97 (2001) 176-190

- Multimethode zur Bestimmung von Pflanzenschutz- und Oberflächenbehandlungsmittel-Rückständen in Zitrusfrüchten mittels GC-MSD, M Anastassiades und E Scherbaum Teil 1: „Theoretische Grundlagen und Methodenentwicklung“, Dtsch. Lebensm. Rdsch. 93 (1997) 316-327 Teil 4: Bestimmung von Organozinn-Pestiziden (weiterer Autor: W Schwack) Dtsch. Lebens. Rdsch. 96 (2000) 466-477

- Analysis of Several N-Methyl-O-Aryl-Carbamates in Fruits and Vegetables after Supercritical Fluid Extraction, M Anastassiades, E Scherbaum, W Schwack 2nd European Pesticide Residue Workshop in Almería, Mai 1998

Folie 31

...herzlichen Dankm. anastassiades

j. wendtdem pestis-team am

cvua stuttgart