Roux' Archiv ffir Entwicklungsmechanik 153, 486--491 (1962)

Aus dem Zoologisoh-vergleichend-an~tomischen Institut der Universit~t Ziirich (Direktor: Prof. Dr. E. HADOg~)

PHALANGENWACHSTUM IN INTAKTEN EXTREMITJ~TEN NACI-I AMPUTATION AUF DER G E G E N S E I T E

Von CI-IRISTOPH ZELLER

Mit 3 Text~bbildungen (4 Einzelbflder)

(Eingegangen am 9. November 1961)

Einleitung Di~xE~ (1911) exstirpierte bei Larven yon Rana temporaria eiuseitig

Extremit~tenanlagen und land, da~ dieser Eingriff oft Veranderungen im Riickenmark, im Daeh des Mittelhirns and an der kontralateralen Extremita t zur Folge hat. Zur Erklartmg dieser Befunde postuliert er eine , ,Korrelationskette": Bein ~spinales Nervensystem ~ Gehirn @- spinales Nervensystem @ Bein (Di~KE~ 1928).

Anderen Autoren (vgl. HA~U~G]~ 1925) gelang die Reprodul~tion yon D~Kv.~s Experimenten nur selten. Es ware denkbar, daft Verande- rungen der Extremit~t nach Amputation aaf der Gegenseite regelm~ig vorkommen, dab diese abet normalerweise dureh Regulationsvorgange korrigiert werden, und dal~ nur unter besonderen Versuehsbedingungen die Regulation ausgeschaltet wfirde. HAMBURGEI~ (1925) versuchte ab- zukl~ren, welches die Bedingungen ffir Mi~bi]dungen auf der Gegenseite sind, kam aber zu keinem Resultat.

In der vorliegenden Arbeit soll nun untersucht werden, ob vielleieht, bevor eine Regulation wirksam wird, ein Effekt der Amputation auf der Gegenseite entdeckt werden kann. Ein soleher Effekt wfirde wahrsehein- lieh nur sehr klein sein. Es ist deshalb wichtig, daI3 die Ma~e, welehe zum Vergleich von operierten Tieren und Kontrollen dienen sollen, m6glichst genau shad. Gut definierte MeBpunkte lassen sieh bei den Extremit~ten am Skele~ finden. In den im folgenden beschriebenen Experimenten wird deshalb erst ira sp/~ten Palettenstadium (Abb. 1) amputiert; im Zeit- punkt der Untersuchung ist dann das Phal~ngenskelet bereits knorplig dif- ferenziert. Es wurde lediglich ein Strahl des Ful]es entfernt, um die Verletzung auf ein Minimum zu besehr/~nken und um Anhaltspunkte ffi_r die Spezifit/~t eines allfalligen Effektes auf der kontralateralen Seite zu gewhanen.

Material und Methode Zu den Versuchen wurden Larven yon Rana esculenta verwendet, die sich im

Labor aus im Freien gesammelten Lalchballen entwickel~en. Die Larven wurden paarweise in paraffinierte Kartonbecher yon etwa 10 cm Durchmesser gebracht

PhMangenwaehstum in intakten Extremitiiten 487

und regelm~Big mit Brennesselpulver geffittert, bis die Zehen der Hinterbeine etwas fiber des PMettenstadium her~usgewaehsen waren. Dieses Stadium ent- sprieht etwa der Stufe 24 in der Normentafel yon Korsc~I (1952). Dann wurde bei einer der beiden Larven en~weder reehts oder links die IV. Zehe amputiert (Abb. 2). Die andere Lurve diente Ms Kontrolle. Vier Tage naeh der Operation wurden beide Beine bei operierten Tieren und Kontrollen abgesehni~ten, in Bouin oder Formol (10%) fixiert und das Skelet mit Methylgriin im Totalpr~parat gefErbt (t~ONEIS 1948, w 1596). Die PrEparate wurden mit Cementit so auf einen Objekttr~ger festgeklebt, dab Mle Zehen flaeh ausgestreekt waren, und dana in Euparal eingesehlossen. Zur Untersuehung gelangten nur solehe Pr~parate, die

vSllig gestreekt und so gef~rbt waren, dab die MeB- punkte einwandfrei festgestell~ werden konnten. Diese Auswahl ist yore sgatistisehen Standpunkt aus erlaubt, wenn sie unabhgngig yon der zu messenden Gr58e getroffen wird. Die Vergleieh-

Abb, 1 Abb. 2 Abb. 1. MeBstrecken fiir Zehen- ~nd PhMangenl~ngen. 28lathe Vergr61~erung

Abb. 2. Operationsskizze: Amputation der IV. Zehe, links ein typisches ~lteres (Serie 2), rechts ein Wpisches jiingeres Stadimn (Serie 1). 28fache Vergr51~erung

barkeit der Messungen wird im n~chsten Abschnitt noch wei~er diskutiert. In Abb. 1 sind die verwendeten MaBe eingezeichnet. Das Entwicklungsstadium, in welchem die Extremitiiten zur Untersuehung gel~ngen, entsprieht n~eh KoPscg (1952) der Stufe25.

Ergebnisse

Die Amputa t ionen wurden in zwei Serien mi t etwas verschiedenen Entwicklungss t~dien vorgenommen (Abb. 2). Die im welter fortge- schr i t tenen S tad ium (Serie 2) operierten FtiBe haben im Vergleich mi t den Kont ro l len n icht nu r einen verkiirzten IV. Strahl, sondern aueh der

I I I . und I I . Strahl erreichen die L~nge der Kont ro l len nicht, t i ingegen ist die totale Lgnge der Zehen auf der nich~operierten Seite n icht signi- f ikant verschieden von derjenigen der Kontrol l t iere (Abb. 3).

Bei den Tieren, die im frtiheren S tad ium operiert warden {Serie 1), ist n a r d e r operierte IV. Strahl des operierten Fuges ktirzer als bei den

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Kontrollen. Jedoch zeigt sich bei dieser Serie auf der Gegenseite eine Verkiirzung des IV. Strahls.

Fiir eine genauere Untersuchung der Wachstumsverhiiltnisse sollen nun die einzelnen Phalangen verglichen werden. Es soll gepr~ft werden, ob einzelne Glieder eines Strahles auf der nichtoperierten Seite als Reaktion auf die Amputation in ihrem Waehstum spezifisch beeinflugt werden, d. h. ob die Proportionen ver~ndert sind. Deshalb werden nieht

z Ierie: Z. ,retie: / l / I l l

IN IIIIIIII :

Abb. 3. 3/iilbtelwerte der Zehenl~ng'en (II . , I I I . , IV. Zehe). WeiB: Kontro l len; sehraffiert : n ichtoper ier te Seite der oper ier ten Tiere; schwarz : operier te Seite der oper ier ten Tiere. U n t e r den S~ulen ist die Anzahl der gemessenen Zehen angegeben. Die S t reuungen sind

durch St recken a n den oberen S~ulenenden maxkie r t

absolute MaBe, sondern Ls vergliehen; dadureh wird die Streuung, die auf Untersehieden der GrSge der Versuehstiere beruht, vermindert. Ganz ausgeschaltet wird sie nieht, denn der FuB w/iehst allometriseh, indem die L/~ngenzunahme beim langen IV. Strahl gr6Ber ist als e~wa beim kfirzeren II. Ein Quotient, der z.B. gebildet wird aus der L~nge eines Gliedes des IV. Strahles und der Ls des III . S~rahles darf also nut vergliehen werdeu mi~ einem entsprechenden Quotienten yon MaBen eines FuBes, der gleich grog ist. Wie Abb. 3 zeigt, stimmen die Mi~telwerte der II . und der III . Zehe bei Versuehstieren (nichtoperierte Seite) und Kontrollen gut fiberein, so dab ein solcher Vergleich zuls ist. Trotzdem soil, um sieher zu gehen, ein Untersehied erst dann als signifikant angesehen werden, wenn die Wahrscheinlichkei~ dafiir, dab zwei MaBzahlen aus der gleichen Grundgesamtheit stammen, kleiner als 0,01 is~.

Phalangenwachstum in intakten Extremiti~ten 489

Tabelle. Differenzen der verschiedenen Phalangenquotienten

Phalangen - Serie 4o -- ~ F G t quotient

IV4/III i v 3 / I I I i v 2 / i I I IV 1/III 1113/11 1112/11 1111/11 IV4/III IV3/III IV2/III IV1/III 1113/11 1112/11 1111/I1

IV4/III = X 0 =

;~ =

FC-- = t .p =

1 + 0,0342 :k 0,0186 22 1,84 > 0,05 1 --0,1150 • 0,0394 20 2,92 1 q- 0,0124 • 0,0996 26 0,13 > 0,80 1 --0,0312 :~ 0,0144 24 2,17 > 0,01 1 -}- 0,0013 • 0,0160 27 0,08 > 0,90 1 -- 0,0031-4- 0,0181 23 0,17 > 0,80 1 q- 0,0148 + 0,0186 21 0,80 > 0,40 2 --0,0409 -4- 0,0097 37 4,24 2 --0,0225 -4- 0,0360 35 0,63 > 0,50 2 --0,0067 -b 0,0096 37 0,70 > 0,40 2 -]- 0,0253 :~ 0,0180 38 1,41 > 0,10 2 --0,0135 :~ 0,0175 37 0,77 > 0,40 2 q- 0,0151 • 0,0161 37 0,94 > 0,30 2 + 0,0515 -4- 0,0242 32 2,13 > 0,025

L~nge des 4. Gliedes der IV. Zehe, bezogen auf die L~nge der III . Zehe Mittel der Ph~langenquotienten, gemessen auf der unoperierten Seite

der operierten Tiere Mittel der Phal~ngenquotienten der Kontrollen Freiheitsgrade t-Weft ffir Studenttest Wahrscheinlichkeit fiir einen nur zuf~lligen Unterschied der beiden

Mittelwerte

I n der Tabel le s ind die Differenzen der versehiedenen Phalangen- quot ien ten zusammenges te l l t . Bei der 1. Serie (vgl. Tabelle) is t das 3. Glied des IV. St rahls auf der n ich toper ie r ten Seite im Vergleieh mi t den Kon t ro l l en verk/ i rz t . I n der 2. Serie is t es das 4. Glied des IV. Strahls , das verkf i rz t ist. In bei&n Serien ist also eine signi/ikante Verkiirzung au/ der nichtoperierten Seite in einer der beiden distalsten Phalangen des IV. Ntrahls /estzustellen. Es sind dies die Phalangen, deren Anlagen bei tier Amputation au/ &r anderen Seite ent/ernt wur&n (vgl. Abb. 2). Alle anderen Pha langen sind f iberhaupt nicht , nur wenig oder aber n ich t s igni f ikant kfirzer als bei den Kontro l len .

Diskussion

Die A m p u t a t i o n einer Zehe ergab haupts~chl ich zwei Resu l ta te , die ge t renn t d i sku t i e r t werden sollen: eine W i r k u n g auf die homola te ra le und eine W i r k u n g auf die kon t ra l a t e ra l e Seite.

Auf der homola te ra l en Seite b le ib t die dem a m p u t i e r t e n IV. S t rah l benachba r t e I I I . und I I . Zehe im W a c h s t u m bei der 2. Serie zurfick, n ich t aber bei der 1. Serie . Die 2. Serie war bei der Opera t ion e twas / i l t e r , der IV. S t rah l somi t 1/~nger und der Mater ia lver lus t gr6Ber (vgl. Abb. 2). Es l iegt nahe, sich als Erk l~rung vorzustel len, dab die Regenera t ion des IV. S t rahls auf Kos t en yon Ze l lmate r ia l der benachba r t en Zehen erfolgt.

490 C ~ s T o P ~ Z]ELLE~ :

Tsc•uMI (1954) konnte zeigen, dal~ bei Hinterbeinen yon Xenopus naeh einer Chlor~thylaminbehandlung im Blastemstadium eine der beiden Endphalangen verkiirzt wird. Er erkl/~rt die spezifische Wirkung auf bestimmte Phalangen dureh physiologische Konkurrenz, die sich darin s dab kleine oder sich spat differenzierende Anlagen in ihrer Ent- wicklung benachteiligt sind. Auf ~thnliehe Weise kSnnte in unseren Ver- suchen der bereits weiterentwickelte IV. Strahl dureh die Regeneration seiner distalen Glieder zu einem Konkurrenten f/ir die Nachbarstrahlen werden.

Die Untersuchung der Wachstumsverh~ltnisse des Ful~es mit ampu- tierter Zehe war bei der Planung der Experimente nieht vorgesehen. Aus diesem Grunde wurde nicht notiert, welcher operierte Fu~ und wel- eher niehtoperierte Fu6 zum selben Tier geh6rt, was ffir eine genauere Analyse nStig ware. Auf eine weitere Diskussion des Effektes der Ampu- tation auf die homolaterale Seite sell deshalb verziehtet werden.

Die Fragestellung, die dieser Arbeit zugrunde liegt, bezieht sieh auf die Wirkung der Amputation auf die kontralaterale Seite. Es wnrde in der Einleitung die Vermutung ge~ul~ert, dal~, bevor Regulationsvor- g~nge zum Zuge kommen, eine solehe Wirkung regelm~13ig vorkommen kSnnte. Die Ergebnisse der Messungen haben diese Vermutung best~tigt. Eine Amputation im fr/ihen Stadium (]. Serie) bewirkt auf der Gegen- seite eine Verkiirzung der zweitletzten Phalange. Eine Amputation im sps Stadium (Serie 2) bewirkt eine Verkfirzung der sieh sp/~ter diffe- renzierenden letzten Phalange. Daraus kann also gesehlossen werden, dal~ die Amputation einer in Bilclung begri/fenen Zehe auf der gegeniiber- liegenden Seite einen spezifisehen Ef:[ekt erzeugt; es werden Phalangen jener Zehe verktirzt, die auf der anderen Seite entfernt wurde, und zwar werden ?'e nach dem Operationsstadium verschiedene Phalangen betro//en.

Die spezifische Wirkung beruht wohl auf einem stofflichen Einflul~, der auf zwei grundsgtzlich versehiedene Weisen zustande kommen kann. Entweder wird dureh die Amputation ein ortsspezifiseher Stoff in Zir- kulation gesetzt, der auf der nichtoperierten Seite ebenso ortsspezifiseh wirkt, oder ein Agens wird nur an der reagierenden Stelle frei und wirk- sam. Als Vermittler ffir ein solches Agens wiirde sich das Nervensystem eignen. Man kSnnte bier an eine Entwicklungskorrelation etwa im Sinne Dt~RK]~s (vgl. Einleitung) denken.

Die vorliegenden Untersuchungen lassen keine eindeutigen Sehl/isse fiber den Mechanismus zu, der zu den beobaehteten Resultaten ffihrt, und damit kSnnen sie auch keinen Beitrag zur Abklgrung der Frage liefern, warum Dt~I~KENS Experimente nieht regelm~ig reproduzierbar waren. Immerhin lgl~t sieh festhalten, dad ein Mechanismus existiert, der die beiden gegen/iberliegenden Extremitgten in ihrer Entwicklung zuein- ander in Beziehung bringL

Phalangenwachstum in intakten Extremit~ten 491

Summary 1. I n a young l a rva of Rana esculenta, the budd ing four th d ig i t of

a h ind l imb is cu t off un i la te ra l ly . Af te r 4 days , before regenera t ion has proceeded apprec iab ly , the h ind

l imbs are r emoved on bo th s ides , f ixed and compared wi th l imbs of cont ro l l a rvae of ident ica l stage.

2. I t is found t h a t one p h a l a n x of the four th d ig i t is s igni f icant ly shor te r on the nnope ra t ed side t h a n the corresponding pha l a nx of the controls .

3. The second and th i rd digi t , ad j acen t to the a m p u t a t e d four th , lag beh ind in the i r g rowth compared wi th the controls.

Literatur ])ffRKEN, B. : ~ber frfihzeitige Exstirpation yon Extremit/itenanlagen beim Frosch.

Z. wiss. Zool. 99, 189--355 (1911). - - Lehrbuch der Experimentalzoologie, 2. Aufl. Berlin: Gebriider Borntr/~ger 1928. H~r~v~G~, V. : Uber den Einflul3 des 7Nervensystems auf die Entwicklung der

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Stuttgart: Georg Thieme 1952. Ro~rEIs, B.: Mikroskopische Technik, 15. Aufl. Mfinehen: Leibnitz 1948. Tsc~u~I, P.: Konkurrenzbedingte Rfickbildung der Hinterextremit~ten yon

Xenopus nach Behandlung mit einem Chlor~thylamin. Rev. suisse Zool. 61, 177--270 (1954).

Dr. C~ISTOPE ZELLER, Zfirich/Schweiz, Zoologisch-vergleichend-anutomisches Institut der Universit~t

Wilhelm Roux' Arch. ]~ntwiekl.-Mech. Org., Bd. ]53 33