Photochemisfry andPhobiolofy, 1963. Vol. 2, pp. 461-470. Pergamon Press Lid. Printed in Great Britain

PHOTOREVERSION VON VIER GRUPPEN

GIFTRESISTENZ I M NICHTPHOTOREAKTIVIERBAREN E. COLt

UV-INDUZIERTER MUTATIONEN ZUR

R. W. KAPLAN Institut fur Mikrobiologie, Universitat FrankfurtIMain

(Received 1 March, 1963)

Abstract-In the non-photoreaclivable bacterial strain E. coli B/phr-/MC2 the photoreversion of four groups of u.v.-induced mutations were investigated. They lead to resistance to Chloramphenicol (2 mg/l ; ‘‘C‘’), Penicillin (13 or 16 mg/l; “P13” and “P16”) or Strepto- mycin (3 mg/l; “S”). The u.v.-dose curve is concave for the C-mutations (two to three hits), about linear for PI3 and S, and they reach peaks and decrease at high u.v..-doses. Though no photoreactivation of killing (PR) is present there is photoreversion of all four types of muta- tions (PRM). At u.v.-doses below the peaks in average about 43 per cent mutations are photoreversible. At high u.v.-doses the curves with light-post treatment (L) cross the dark- curves (D). In the photoreactivable strain B/r (by the spontaneous mutation MC2 to Mitomycin-resistance strain B/phr- was made about as u.v.-resistant as B/r is) the photo- reversion of the mutation groups C, P13 and P16 (S was not investigated here) was much higher, in average about 77 per cent at low doses. It is assumed that the difference in PRM of about 34 per cent between both strains is due to a PRM-mechanism present in B/r hut not in B/phr-/MC2; this mechanism may be the photoreactivating enzyme that opens thymine-dimers. The PRM in B/phr-/MC2 must then be due to a second mechanism which is probably not the dimer opening enzyme. It may be the same mechanism as in the case of mutations of phage kappa which are induced by U.V. and reversed partially by light, both extracellularly. The premutations giving this second type of PRM may perhaps be cytosine- hydrate in the DNA. Tn average about 23 per cent mutations of B/r are photostable. Since this ratio decreases with low u.v.-doses in the C-mutations and increases in P13 and in PI6 probably two types of photostable premutations seem to exist.

I . PROBLEMSTELLUNG DIE Tnaktivierung wie auch Mutationsauslosung nach U.V.-Bestrahlung von Zellen wird nach verbreiteter Annahme z.gr.T. durch photochemische Veranderungen in der DNS verursacht. Diese Veranderungen scheinen fur beide Vorgange zwar ahnlich zu sein, wie z.B. die (teilweise) Verminderung beider Effekte durch Nachbehandlung der U.V.- bestrahlten Zellen mit Blaulicht anzeigt; jedoch sind sie nicht vollig gleich, was z.B. durch unterschiedliches Verhalten bei hohen U.V.-Dosen (Hochdosisreversion nur der Mutationen) oder verschiedene Temperaturabahngigkeit der Nachbelichtungswirkung (Qlo- 1,3 fur Photoreaktivierung, Qlo-l ,O fur Photoreversion der Mutationen) beim Bakterium Serratia anzeigt (Kaplan und Gunkel@)). Die Entdeckung eines Enzyms in Zellextrakten, welches U.V.-inaktivierte Transformations-DNS in vitro photoreaktiviert (RupertW), und Ahnlichkeiten dieser Enzymwirkung (2.B. QlO-1,4) mit der PR* von Zellen macht es

*PR =Photoreaktivierung der Zelltotung PRM -Photoreversion der Mutationen

46 1

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wahrscheinlicli, dass dies Enzyin auch fur die intrazellulare PR wenigstens z.T. verant- wortlich ist. Wichtige chemische Veranderungen in der DNS durch U.V. sind die Bildung von Dimeren aus zwei benachbarten Thyminen sowie die Addition von Wasser an eine Doppelbindung des Cytosin (Beukers und Berendsc’) ; Sinsheimer(14) ; Shugar und Wierz- c h ~ w s k i ( ~ ~ ) ) . Das photoreaktivierende Enzym verinindert in vitro die U.V.-induzierten Thymindiniere in der DNS(g, 1 5 9 17), hat also wohl diese Dimere in der DNS zum Substrat und offnet sie bei Belichtung. Man darf daher annehmen, dass die Zellinaktivierung durcli U.V. wenigstens z.T. die Folge solcher Dimerbildung in der DNS ist und dass die intra- zellulare PR mindestens z.T. in der Offnung dieser Dimere und Ruckbildung normalen Thymins durch das PR-Enzym der Zelle besteht.

Die vielfach beobachtete Photoreversion der Mutationen (PRM) sclieint wegen der o.a. Unterscliiede hochstens z.T. auf dieseni Enzym beruhen zu konnen. An ihr mag vielleicht ein zweiter Mechanismus der Lichtwirkung beteiligt sein. Dies wurde deutlich in Studien am Serratia-Phagen Kappa ( K ) ‘ 4 9 8). In diesem Phagen werden Mutationen, vorwiegend vom Klarplaquetyp, bei extrazellularer U.V.-Bestrahlung bis ca. 2 Prozeiit ausgelost. Extrazellulare Nachbelichtung verrnindert die Zahl dieser Mutationen auf ra. 3, verursacht aber nur eine geringe, eben merkliche Erhohung des Plaqueiiberlebens. Geschieht die Belichtung jedocli nach der lnfektion intrazellular, so zeigt sich eine iiur geringe PRM bei selir starker PR der Plaquebildung. Die rnutativen Veranderungen (Pramutationen) im extrazellularen Phagen, wohl in dessen DNS, sind also zu etwa 4 photoreversibel ohne intrazellularen PR-Apparat, wahrend die weitaus meisten Tnakti- vierungslasionen intrazellular, also wohl voin PR-Enzym, photoreaktiviert wcrden und also vielleiclit Thyinindimere darstellen, dagegen nur ein kleiner Teil der Prainut a t ionen. ‘

Da die PrEmutationen in freien Phagen aucli zu etwa $ warmereversibel sind, konnte mall vermuten, dass dieser Anteil auf U.V.-induziertem Cytosinhydrat in der DNS beruht, welclies als in vitro warmeinstabil bekannt ist (Sin~heimer(’~)). Allerdings ist dieses U.V.- Produkt ausserhalb der DNS in vitro nicht photoreversibel (Park und Kaplan(ll)).

Zur weiteren Kliirung der Probleme der PRM kam das Auffinden eiiier nichtphoto- reaktivierbaren Mutante von E. coli B durch Harin und Hillebrandtc2) gelegen. Da sie wahrscheinlich kein PR-Enzym besitzt, konnte in ihr eine “nichtenzymalische” PRM nachgewiesen werden, falls eine solche auch bei Bakterienzellen, nicht nur bei jenem Phagen, existiert. In der vorliegenden Arbeit wird iiber die Ergebnisse mit vier Sorteii von Giftresistenzmutationen (Resistenz gegen Chloramphenicol, Penicillin 12y/ml und I (iylrnl, sowie gegen 3y/mI Streptomycin) berichtet. Harm untersuchte gleichzeitig Phagenresistenz-Mutationen, woriiber von ilim spater berichtet wird. Da der Stanim B von E.coli, aus dem die phr--Mutante stammt, sehr U.V.-sensibel ist, was fur die Muta- tionsstudien etwas ungiinstig erschien, wurde aus ihm von Winkler(ls) nach dessen Methode eine gegen Mitomycin resistente Mutante, MC2, isoliert, deren U.V.-Sensibilitiit etwa der des bekannten Stammes B/r entspricht. Zum Vergleich mit phr-/MC2 wurden auch die Mutationen des pliotoreaktivierbaren Stammes B/r untersucht.

11. METHODIK Das Bakteriuni E. coli B/phr- stamint von Harm. Es wurde zunachst durch Auslese

einer gegen Mitomycin resistenten Spontanmutante MC2 U.V.-resistent wie der bekannte Stamm B/r gemacht(16) uin schon bei geringer Totung durch. U.V. eine hohe Ausbeute an induzierten Mutationen zu erhalten. Die U.V.-Resistenz dieses weiterhin verwendetcn Stammes E. coli B/phr-/MC2 ist ein wenig hoher als der von E. coli B/r.

Photoreversion von vier Gruppen UV-induzierter Mutationen 363

*\Is Nahrboden zum Halten der Stamme uiid zur Zahlung des Titers der unmutierteii uberlebenden Zellen als Kolonien in den Versuchen diente Difco-Nutrientbroth-Agar (NB-Agar). Zuin Zahlen der Giftresistenzmutationeii wurden je 0,l mI der unverdiinnten Bestralilungssuspension (=Verdiinnung 1 0”, ca. lo7 Zellen/O, 1 ml) auf NB-Agar mit Giftzusatz ausgespatelt (drei Parallelplatten). In Vorversuchen wurden die geeigneteii Ciftkonzentrationen ermittelt :

Cl~lorampl~enieol (Fa. Bayer, Leverkusen) 2y/m 1 NB :Mutationstyp “C”. Penicillin (Fa. Dauelsberg, Gottingen) 13yiiilNB :Mutationstyp “P13”. Penicillin (Fa. Dauelsberg, Gottingen) 16ylmlNB :Mutationstyp “P16”. Streptomycin (Farbwerke Hoechst) 3ylmlNB :Mutationstyp “S”.

Die Vorversuche init Streptoniycinresistenz ergaben zunaclist keine brauchbareii Resultate, da die Hochresistenten (5y/nil) spoiitaii zu haufig erscheinen (ca vor allelii aber ilire Rate mit der U.V.-Dosis schnell absank. Dies beruht auf verminderter U.V.- Resistenz dieser Mutanten und verbarg ilire U.V.-Induktion ganz. Diese S-Mutationeii wurden dalier in die Hauptversuche nicht eingeschlossen. Nur eiii unerwartetes Phaiiomen, die teilweise wiedererlangte Photoreaktivierbarkeit von S-Resistenzmutanten aus phr-/ MC2, wurde weiterstudiert. Die Ergebnisse daruber sollen spater veroffentlicht werden. Nach Abschluss der funf Hauptversuche ergab sich dann, dass schwach gegen Strepto- mycin resistente Mutanten (3y/ml) trotz ihrer hohen spontanen Rate (cn 5 sehr stark U.V.-induziert wurden uiid dalier fur PRM-Versuche brauchbar sind; insbes. stieg ilire Absolutzahl schon bei scliwach inaktivierenden U.V.-Dosen stark an, sodass jeiie Mutanteneliniination nicht storte. Es wurden daher noch zwei grossere PRM-Versuche mi t ihneii ausgefiihrt.

Die Bestrahlungssuspeiisionen wurden durch Suspendieren von Oberflachenkolonieii in Puffersaline gewonnen, welche ca I* Tag auf NB-Agar gewachsen waren uiid also Zellen der Ruhephase enthielten. Da die Suspensionen so dicht sein mussten, dass sic11 die Zellen schon nierklich gegenseitig gegen das U.V. abschirmten, wurde der Zelltiter moglichst gleich gehalten (ca. 2-3 .lO’/O,l ml). Zur U.V.-Bestrahlung wurden 20 nil Suspension in einer Petriplatte unter einer Entkeimungslampe “Osram HNS 12 ozonfrei” (vorwiegend Wellenlange 254 mp) geruhrt und die Intensitat auf 20 erg/mm2sec eingestellt. Uiiverdunnte Proben von 2 ml wurden in Reagensrohrchen dann bei 25°C im Dunkel- wasserbad oder im Liclztwasserbad 20 min nachbelichtet zur maximalen PR. Das Lichtbad bestand aus einer grossen I0 cm dicken Glaskuvette, die zwischen Leuchtstoffrohren “Osram HNP 20 Watt”, vier auf jeder Seite, stand und im Umlauf mit dem Dunkelbad temperaturgleich gehalten wurde. Die “Dunkelreaktivierung” durch Stehen der Zellen in Puffersaline bei Dunkelheit und 25°C war nur sehr gering. Nach der Belichtung mit diesem blauvioletten Licht kamen die Suspensionen in Eiswasser, wurden dann nach Bedarf verdunnt und auf Agarplatten ausgespatelt. NB-Platten wurden 24 hr, Giftplatten 40 hr bei 37” bis zur Zahlung der Kolonien bebriitet. Die Kolonien der Mutanten gaben schon durch ihr unterschiedliches Aussehen (Grosse, Wolbung, Umriss, Transparenz) ihre Heterogenitat, also Beteiligung wohl mehrerer Gene, zu erkennen. Unter den PI3 zeigten vereinzelte einen Hof kleiner unmutierter Kolonien, wohl durcli Ausscheidung eines penicillin- hemmenden Stoffes (Penicillinase?). Die P13 umfassen naturlich auch die Mutanten P16 von holier Resistenz. Letztere sind aber spontan mehr als zehn mal, in- duziert mindestens vier ma1 seltener als jene, sie konnen daher als 2.gr.T. besondere Mutationsgruppe angesehen werden.

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111. ERGEBNISSE A. Stamm Blphr-lMC2

Wie Abb. 1 und 2 sowie Tabelle I , zeigen (IgN=Logarithmus des Keimtiters / 0,1 ml Bestrahlungssuspension), ist der Stamm MC2 nicht photorecrktivierbar, wie es von Harm und Hillebrandt(2) beschrieben wurde. Jedoch zeigt die geringere Haufigkeit aller vier Mutationstypen (C, P13,P16 in Abb 1 und Tabelle 1, S in Abb. 2) unter den 'Uberlebenden nach Belichtung deutliche Photoreversion der Mutationen (PRM) an. Tabelle 1 und Abb. 1 geben die Zahlen je eines der fiinf Versuche mit C , PI3 and P16-Mutationen.* Die in Tabelle 1 in Klammer eingetragenen Absolutzahlen der Mutantenkolonien, welche auf drei Parallelplatten nach Ausplattung von 0,l ml der unverdunnten Bestrahlungssuspension erschienen, sind in der Licht(L)-Reihe ebenfalls deutlich geringer als in der Dunkel(D)- Reihe. Die Differenz zeigt wegen der gleiclien uberlebensrate infolge FehIens von PR

u.v.. sec

ABB. 1. Tnaktivierung (oben, Log Uberlebende) und Mutationen (unten) von E. coli B/phry/ MC2 in Abhangigkeit von der U.V.-Dosis mit und ohne Nachbelichtung.

C : Mutationcn zur Resistenz gegen 2y/ml Chloramphenicol P13 : Mulalionen zur Resistenz gegen 13ylml Penicillin P16: Mutationen zur Resistenz gegen 16y/ml Penicillin volle Symbole: ohne Nachbelichtung (D) leere Symbole: mit 20 min Nachbelichtung (L)

*Das Licht allein ohne U.V.-Bestrahlung beeinflusste die Keimzahl oder den Mutantengehalt nicht merklich. Daher wurde in den weiteren Versuchen auf die Werte fiir 0 U.V.+20 min Licht verzichtet (Tabellen 1 und 2).

Photoreversion von vier Gruppen UV-induzierter Mutationen 465

erg, mm-2

8 , 2yO 4y 6y 8 p O

i . ‘

I I I

“ I /

n 4 -

I I I I I ~ I I I 0 I0 20 30 40

u.v.. sec

ABB. 2. U.V.-Dosiskurven der Inaktivierung (oben) und Mutation zur Resistenz gegen 3y/ml

gestrichelt: Absoluttiter der Mutanten {rechte Skala) durchgezogen: Mutanten pro Uberlebende (linke Skala), volle undleere Symbole wie Abb. 1,

Streptomycin (unten) von E. coli B/phr-/MC2 mit und ohne Nachbelichtung.

direkt den Grad der Reversion an. Fur die S-Mutationen geben die gestrichelten Kurven der Abb. 2 diese Absolutzahlen wieder. Ca diese wie jene Mutantenzahlen pro, 0,lml Sus- pension (=ca. 2-3.10’ bestrahlte Zellen) mit der U.V.-Dosis schnell und hoch uber den Spontanwert steigt, wahrend das Uberleben (a bis 3 Zehnerpotenz) sinkt, muss die Zunahme auf Auslosung von Mutationen durch das U.V. beruhen. Zunahme durch selektiv besseres Uberleben von Spontanmutanten kann hochstens ganz untergeordnet sein. Fur die S-Mutanten wurde sogar eine geringe Abnahme durch selektive Elimination festgestellt (s. Abschnitt 11). Ein Vortauschen der Mutationsinduktion wie auch der PRM durch Selek tionsvorgange ist dami t ausgesch lossen.

Die in den Tabellen in Klammer eingetragenen Absolutzahlen gezahlter Mutanten- kolonien zeigen die Genauigkeit der Mutationsraten an. Die Fehlerspannen dieser Zahlen ergeben sich naherungsweise als deren Quadratwurzeln, da Poissonverteilung zutrifft. Es wurde daher auf Eintragung von Fehlerspannen in die Abb. verzichtet. Die statistische Sicherung der meisten Unterschiede zwischen den Absolutzahlen fur D und L ist schon fur die Einzeldosis hoch, fur alle Versuche zusammen ist sie sehr hoch. Z.B. ergibt das

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TABELLE I . PHOTOREVERSION DER MUTATIONEN NACH ~.V.-BESTRAHLUNG VON E. co/i B/phr-/MC2

IgN C PI 3 P16 SCC .low +10-7 - 1 0 - 7

U.V. D L D L D L D L

0 7,53 0,47 (48)

3,23 (33)

0,26 (2)

20 7,30 7,32 20,3 9 3 44,4 20,3 10,6 0,6 (1207) (614) (264) (127) (63) (4)

40 7,09 7,08 37,O 36,8 52,5 20,o I5,8 2.3 (1309) (881, (185) 172) (56) (8)

2P1.)

- 60 h,38 6,49 183 38,7 28,2 734 875 (1295) (361) (20) (7) (6) (0)

(2) (0) (0) (0) .- - _ _ 80 5,49 5,70 92,O 51 1 26

_ _ _ ~ ~ . ~ - (85) (76%

. - LgN -Logarithmus d. Kolonietiteis (Keime/O,l nil) D = ohne I4-mit Nachbelichtung (20 rnin bei 25”C, Verdiinnung 10” i n Saline) Mutationstypen : C=Resistenz gegen 2y Clilora~iiplie~iicol/nil NB-Agar

PI3 TResistenz gegen I3y Penicillin/nil NB-Agar PI 6 =Rcsistenz gegen 16y Penicillin/nil NB-Agar

Zahlen -Mutantenkolonien .lO-$(C) bzw. lo-‘ (P) pro uberlebende (O)-Absolutzahlen an Mutantenkolonien auf drei Parallelplatten der Verdunnung 10 ’

Wertepaar in Tabelle 1, 20 sec U.V. fur PI3 x=(264-127)/1/264+ 127=6,9 entsprechend P<IO-lo; fur P16 ist ~=(63-4)/.\/67=7,2; fur C ist ~=(1207-614/1/1821=14,3.*

Die U. V.- Dosiskurven aller vier Mutationsgruppen steigen in allen Versuchen bis zu eineni Gipfel und fallen danach schnell, wie dies von den meisten U.V.-Mutationen berichtet wird. Die Ursache des Abfalls der Mutationsrate bei hohen U.V.-Dosen ist noch wenig gekliirt ; sie durfte rneist in Reversion der Mutationsvorstufen (Pramutationen) durch hohe U.V.-Dosen (“Hochdo~i~rever~ion”, HDR(3-5)) liegen. Der Gipfel liegt fur PI3 und PI6 imnier deutlich bei niedereren Dosen als fur die C-Mutationen; die HDR ist also bei den Mutationstypen verschieden (elektiv). Auch im Anstieg der Kurven bei niederen U. V.-Dosen sind Unterschiede deutlich. Die Kurve der C verlauft immer deutlich konkav, die der P13 sowie S mehr geradlinig, bei PI6 ist dies nicht entschieden. Die Zahl der U.V.-Treffer scheint also bei P13 und S etwa 1, bei C etwa 2-3 zu betragen.

Das Ausniass der PRM kann durch den Anteil lichtstabiler Pramutationen L/D gemessen werden (L=Zahl Mut. mit, D=ohne Nachbelichtung). Dieser hangt insofern von der U.V.-Dosis ab, als er mit Erreichen des Gipfels der U.V.-Dosiskurve und vor allem danach sinkt und schliesslich bei hohen Dosen die L- uber die D-Kurve steigt. Ahnlich wie bei den Farbmutationen von Serratia@) konnte durch die PRM der Gipfel nach hohen U.V.-Dosen verschoben sein, was eine Reduktion der U.V.-Dosis durch Licht bedeuten wurde (die jedoch nicht U.V.-dosiskonstant sein muss). Jedoch bleibt

*Die fiinf Hauptversuche ergaben nicht genau iibereinstimmende Werte fur die Mutations- wie auch Totungsraten, wie es fiir Versuche mit Baktcrien ublich ist (Vergl. Tabelle I und Abb. 1). Ursachci~ fur diese ungenaue Reproduzierbarkeit sind wohl Schwankungen physiologischer Fdktoren. Jedoch waren die beschriebenen Eigenschaften der Kurven in allen Versuchen deutlich vorhanden.

Photoreversion von vier Gruppen UV-induzierter Mutationen 467

dies unentschieden, weil die L-Kurven nicht nach noch hoheren U.V.-Dosen verfolgt werden konnten. Berechnet man den Anteil lichtstabiler Pramutationen fur die U.V.- Dosen vor den Gipfeln, so ist eine Abhangigkeit von der U.V.-Dosis nicht festzustellen. Mittelung uber die vier Versuche und diese niederen Dosen (bei.C bis 60 sec, bei P13 und PI 6 bis 40 sec U.V.) ergibt L/D-Werte von 65,4&8,1 Prozent bei den C, 61 &5,8 Prozent bei den PI3 und 50f10,2 Prozent Photostabile bei den P16. Der Unterschied zwischen grosstem und kleiiistem Wert ist (t= 1,2, P=30 Prozent) statistisch nicht signifikant, es sind also keine Unterschiede der PRM der Mutantentypen nachweisbar, konnten sich aber in den Fehlerspannen verbergen. Wenn man den L/D-Wert von 52 Prozent fur die S-Mutationen mit heranzieht, ist der Mittelwert fur alle vier Typen 57 Prozent. Etwa 43 Prozent der U. V.-induzierten Mutationen des Stammes phr-/MC2 entstehen somit aus photoreversiblen Pramutationen.

B. Starnni Blr. Zum Vergleich des Ausmasses der PR und PRM eines normal photoreaktivierbaren

Stammes mit phr-/MC2 wurde Stamm B/r herangezogen. Die Mutation /r ist zwar nicht vollig mit der Mutation /MC2 identisch, wie die etwas starkere U.V.-Inaktivierung von B/r zeigt (vergl. Tabellen 1 und 2, Dosis 60 sec U.V.). Auch konnen bei der Stammhaltung weitere mutative Unterschiede entstanden sein. Ein erheblicher Unterschied in den drei Mutationsgruppen C,P13 und P16, die auf denselben Giftkonzentrationen wie die von MC2 gezahlt wurden, ist aber wohl nicht gegeben, wie z.B. die Hohe der Spontanraten

TAEiELLE 2. PHOTOREVERSION DER MUTATIONEN UND PHOTOREAKTIVIERUNG NACH U.V-BESTRAHLUNG VON E. coli B/r.

----I__

IgN C P13 P16 sec . I 0 - 6 -10-7 .10-7

U.V. D L D L D L D L

0 7,45 0,63 3,45 0,1 (53) (29) (1)

(276) (271) (142) (16) (1 3) (0)

30 6,78 7,I7 23,7 10,9 49 13,l 10,4 1,1 (428) (404) (88) (53) (1 9) (4)

[461 1271 [ I 11

(602) (496) (21) (38) (6) \4) [I 51 ~361 [I21

20 10 232 (104) (260) (0) (35) (1) (4)

[I 51 1221

2,3 (0) (336) (0) (25) (0) (3)

1s 7,20 7,30 5,8 3,6 23,8 2.7 8,2 <0,2

t621 [91 [<2,51

45 6,26 7,OO 111 16.5 39 14 11 1,3

60 5,54 6,78 97,s 14,6 -

75 4,24 6,65 - 25,3 - 18,7 -

Bereichnungen wie Tabelle 1 zusatzlich: Verminderung der Mutationshaufigkeiten unter den Uberlebenden durch Nachbelichtung (20

min bei 25°C) auf [ . . . 1 %

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anzeigt. Fur den beabsichtigten Vergleich des Ausmasses der PRM ist eine vollige Gleich- heit des “genetischen Hintergrundes” fur die Allele phr- (in MC2) und phr+ (in B/r) aber gar nicht notig, da der ungefare Mittelwert uber viele Mutationen interessierte. Die Ergebnisse eines Versuches enthalt Tabelle 2.

Die Uberlebenslogarithmen zeigen, wie envartet, eine deutliche PR an. Der Dosis- reduktionsfaktor ergibt sich zu etwa 2,1, ist also ein wenig geringer als der von Novick und Szilard (lo) gefundene von etwa 2,5. Dies mag z.B. an den unterschiedlichen physio- logischen Bedingungen (Ruhephasezellen!) liegen. Die hier untersuchten Mutationen C, PI3 and P16 erweisen sich wie bei MC2 infolge des starken Anstieges ihrer Absolutzahlen (in runden Klammern i.d. Tabelle 2) als sicher zumindest z.gr.T. als induziert, nicht selektiv angereichert. Die D-Dosiskurven zeigen ebenfalls Gipfel, welche bei etwas niederen Dosen liegen (S bei 45 sec, PI3 bei 30 sec, PI6 bei 30-45 sec U.V.) als bei MC2. Auch bei den C ist der Anstieg wie in MC2 deutlich konkav, der der P13 wohl auch gerader, der der 1’1 6 unklar.

Die Nachbelichtung bewirkte eine starke Verminderung der Mutationsraten bis zu den Gipfeln und uber diese hinaus. Bei kleinen Dosen sind in der L-Serie auch die Absolutzahlen der Mutantenkolonien etwas niedriger als in der D-Serie ; wegen der starken Erhohung der U berlebendenzahl infolge PR sind diese Differenzen natiirlich geringer ;ils beim Stamm MC2. Der Vergleich der Mutationsraten unter den Uberlebenden in L und D zeigt ein sehr hohes Ausmass der PRM an. In eckigen Klainmern sind in Tabelle 2 die Werte L/D der Mutationsraten in Prozent, also die Anteile photostabiler Prainuta- tionen eingetragen. Bei den C-Mutationen fallen sie von 62 Prozent auf 15 Prozent init der U.V.-Dosis, bei den beiden P-Mutationen steigen sie an. Die Mittelwerte aus den Dosen vor den Gipfeln betragen fur die C-Mutationen etwa 41 Prozent, fur die P13 etwa 18 Prozent und fur die P16 etwa 8 Prozent. Das Gesamtmittel ist 23 Prozent. Wahrend bei Starnm phr-/MC2 etwa 40 Prozent der U. V.-Mutationen photoreversibel sind, betragt dieser Anteil in B/r somit etwa 77 Prozent.

IV. FOLGERUNGEN Da sich im nichtphotoreaktivierbaren Stamm E. coli B/phr-/MC2 alle vier Mutations-

gruppen als teilwcise photoreversibel erwiesen, muss fur diese PRM ein besonderer Mechanismus verantwortlich sein, der sich von dem, wohl, z.T. enzymatischen, PR- Apparat normal photoreaktivierbarer Zellen, z.B. des Stammes B/r, unterscheidet. Das Ausmass dieser PRM “2. Art” betragt etwa 43 Prozent der U.V.-induzierten Pramuta- tionen; dabei sind Unterschiede zwischen den Mutationstypen moglich, wenn sie auch nicht signifikant nachweisbar waren. Im photoreaktivierbaren Stamm B/r war das Ausmass der PRM erheblich hoher als in phr-/MC2, der Anteil photoreversibler Pramutationen betrug im Mittel 77 Prozent. Es liegt nahe, den Unterschied von ca 34 Prozent zwischen beiden Stiimrnen zuriickzufuhren auf eine Sorte Pramutationen, die auch in plir-/MC2 crzeugt wird, hier aber nicht photorevertiert werden kann, weil dcr PRM-Apparat “1 .Art” dort fehlt. Als fehlender Apparat kommt am ehesten das in phr-/MC2 wohl nicht oder kaum aktive PR-Enzym infrage. Dieses wurde dagegen in B/r vorhanden sein und die zusatzlichen 34 Prozent Pramutationen revertieren. Da das Enzym wahrscheinlich U.V.- induzierte Thymindimere in der DNS spaltet (s.Kap.I), wiirden also diese ca 34 Prozent Pramutationen “1 .Art” solche Dimere darstellen.

Die im Stamm phr-/MC2 auftretende PRM “2.Art” deutet auf eine 2. Sorte von Priimutationen, die unabhangig vom “Apparat 1 .Art”, also wohl dem dimerspaltenden

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Enzym, photorevertiert wird. Nimmt man sie auch fur den Stamm B/r an, so ergabe dessen hohere PRM sich also aus der Summe der beiden Priimutationssorten (34 Prozent 1 .Art+43 Prozent 2.Art). Da die 2.Sorte wohl ohne PR-Enzym photorevertiert wird, besteht sie wahrscheinlich nicht in Dimeren, sondern in einem chemisch anderen reversiblen U.V.-Produkt in der DNS; als solches kame nach heutigen Kenntnissen am ehesten das Cytosinhydrat infrage. Schliesslicli muss noch eine 3.Sorte von Pramutationen angenommen werden, die den ca 23 Prozent in B/r photostabilen Mutationen entspricht. Ihre chemische Natur ist vorerst unbestimmt; vielleicht sind es Bruche des Ruckgrates in eineni Strang der DNS.

Dieses hypothetische Modell dreier chemisch verschiedener Pramutationssorten passt gut zu den Befunden am Phagen Kappa (s.I.Kap.). Hier waren etwa 8 der Pramutationen extrazellular photoreversibel, sie entsprechen denen 2.Art in E. coli, also vielleiclit Cytosin- hydrat. Etwas weniger waren intrazellular photoreaktivierbare, die der 1 .Art und somit wohl Dinieren zuzuordnen waren. Im Phagen wurden jedoch die Pramutationen 2.Art nicht intrazellular photorevertiert, wie die geringe PRM bei Belichtung nach Infektion zeigte. In Bjr wurden dagegen sowohl die 1. wie die 2.Art durch Belichtung revertiert. Aus diesem Modell wiirden weiterhin friihere Befunde an Farbmutationen von Serratia erklzrlich sein, bei denen Nachbelichtung der Zellen im stark trockenen Zustand keine PR, jedoch deutlich. PRM ergab (Kaplan und Kaplanc7)): Bei Trockenheit diirfte das PR-Enzym in der Zelle unbeweglich und daher inaktiv sein hinsichtlich PR. Die Pramuta- tionen 2.Art bedurfen dagegen (als vielleicht Cytosin-Hydrate) nicht des Enzyms zur Photoreversion ; dieses ware ein monomolekularer photochemischer “Zerfall” ahnlich wie auch im extrazellular belichteten Phagen. Auch die in Kap.1 erwahnte Temperaturunab- hangigkeit der PRM der Farbmutationen von Serratia (Kaplan und Gunkel(‘+) wiirde durch vorwiegende Entstehung dieser Mutationen aus Pramutationen 2.Art mit nichtenzy- matiscjier PRM verstandlich sein.

Die bisher angegebenen Anteile der Pramutationstypen sind die Mittelwerte fur die niederen U.V.-Dosen und die vier Mutationsgruppen. Es sind jedoch, wenn auch insigni- fikante, Andeutungen unterschiedlicher PRM der Mutationsgruppen vorhanden, besonders bei B/r. Dies wurde durch eine im Mittel etwas verschiedene chemische Struktur der U.V.-mutablen Stellen (hot spots, etc.) in den Gengruppen und damit der Verhaltnisse der Pramutationssorten verstandlich sein. Im niederen U.V.-Dosisbereich war b:i phr-/ MC2 nicht, wohl aber bei B/r eine Dosisabhangigkeit das Anteils lichtstabiler Mutationen angezeigt; bei den C-Mutationen nahm L/D ab, bei P13 und P16 nahm der Wert zu (Tabelle 2), Zahlen in eckiger Klammer). Anscheinend verhalten sich die P-Mutationcn ahnlich wie die Farbmutationen von Serratia(*). Bei diesen entstehen die lichtstabilen Pramutationen (also obige dritte Sorte) durch zwei Treffer, die lichtreversiblen durch einen (also L/D nimmt zu) und letztere werden anscheinend durch einen zweiten U.V.-Treffer in erstere uberfuhrt. Die C-Mutation von B/r (wie auch von MC2) werden jedoch durch mehrere, wohl2-3, U.V.-Treffer erzeugt. Und die Abnahme des Anteils der Photostabilen mit der U.V.-Dosis bedeutet, dass die L-Kurve weniger konkav ist und also weniger U.V.-Treffern entspricht. Daraus folgt aber, dass die photostabilen C Pramutationen nicht durch weitere TreKer aus den photoreversiblen entstehen konnen, sondern un- abhiingig von diesen, wohl an anderer Stelle im Gen, erzeugt werden. Damit ware also die dritte Sorte Pramutationen in zwei Gruppen aufzuteilen, durch Trefleriiberlagerung und eine unabhangig von den Lichtreversiblen entstehende. Die Versuche wurden somit vier Arfen prumutativer DNS-Anderungen anzeigen.

470 R. W. KAPLAN

Nachdem unter den Pramutationen eine 1. “enzymatisch” und eine 2. “nichtenzy- inatisch” photoreversible Sorte unterschieden werden kann, ist zu fragen, ob nicht auch unter den Inaklivierungslasionen, die vorwiegend der I .Art zuzuordnen sind, soIche 2.Art nachweisbar sind. Dies scheint zuzutreffen, da Streptomycinresistenzmutanten von phr-/MC2 z.T. PR zeigen, jedoch nur auf Streptomycinboden, nicht auf NB. Daruber wird anderweitig berichtet werden.

Parallel zu den vorliegenden Untersuchungen wurden von Harm(2) Versuche an E. coli B und B/phr- iiber Mutationen zur Resistenz gegen die Phagen TI und T4 gemacht. Sie zeigen PRM zwischen 80 und 100 Prozent im Stamm phrf und unter 50 Prozent in phr-, stimmen also in den wesentlichen Punkten n i t den hier mitgeteilten Befunden iiberein. Dariiber wird Harrnc2) spater unabhangig berichten.

Anerkennung-Die vorliegende Arbeit wurde unter der sorgfaltigen, urnsichtigen und selbstandigen tech- nischen Assistenz von Frau H. Stoye durchgefiihrt; dieser sei dafiir bestens gedankt.

Der Deutschen Forschungsgeineinschaft danke ich fur Unterstiitzung durch finanzielle Beihilfe, den Farbwerken Hoechst fur eine Gabe Streptomycin, Herrn Dr. U. Winkler fur die Isolation der mitornycin- resistenten Mutante MC2, Herrn Prof. Dr. W. Harm fur den Stamm B/phr- sowie fur fruchtbare Diskussionen.

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