Phototransduktion in Invertebraten und Vertebraten

Einige wichtige Merkmale der Phototransduktionbei Invertebraten und Vertebraten

•Das Lichtsignal (Photon) wird von einem Rhodopsin Molekül

absorbiert und letztendlich in ein elektrisches Signal umgewandelt, das

von der Photorezeptorzelle gebildet wird, und über Interneurone an

das Gehirn weitergeleitet wird.

•Die Photorezeptoren sind in der Lage einzelne Photonen war

zunehmen

•Photorezeptoren können adaptieren—d.h. bei andauernder

Lichtreizung wird die Verstärkung der Signale reduziert

Phototransduction in Drosophila: Phototaxis and das Elektroretinogram

(ERG) als Mittel um die beteiligten Gene zu identifizieren.

Isolierung einer Vielzahl nicht-postiv-phototaktischer Drosophila Mutanten

.....gefolgt von der Analyse der Photorezeptorströme im Auge nach Lichtreizung

(Elektroretinogramm, oder ERG)

Was ist ein Elektroretinogramm (ERG)?

• Drosophila Rezeptorzellen depolarisieren auf Lichtreize,

wodurch Aktionspotentiale ausgelöst werden können.

•Das ERG misst die synchrone Antwort vieler Rezeptorzellen,

die als Antwort auf einen Lichtreiz gemeinsam depolarisieren

•Das ERG wird extrazellulär, mit einer Elektrode direkt unter

der Augenoberfläche gemessen

Das ERG set-up

Stark lab

Elektrode

Stark lab

Das ERG set-up

Der Verlauf von ERG’s im wildtyp und in Mutanten

3 sec

5 mV

on-transient

off-transient

Depolarization

on- and off

transients slowly

disappear

wild type

norpA

trp (1969)

light

nonA

quick return to baseline

Receptor component

1 µm

(submicrovillar cisternae, Ca2+ stores) (Bestehend aus dicht gepackten Mikrovilli--

Membranausstülpungen, die Rhodopsin

enthalten)

Drosophila Phototransduktion: Where does it happen?

Photoreceptor Cell

I: DER entscheidende Schritt der Rhodopsin Phototransduktion

(oder 11-cis-3 hydroxy retinal in Fliegen)

Rhodopsin=Opsin + Retinal

II: Rhodopsin* ist ein 7TM Rezeptor

‘serpentine’, oder 7TM Rezeptoren

III: Rhodopsin aktiviert ein G-Protein

Licht

Rhodopsin (R)

Meta-Rhodopsin (M)

Cytosol

ninaE

IV: G-Protein aktiviert Phospholipase C (PLC)….

in Fliegen und vielen Invertebraten!

•PLC generiert die 2nd

messenger Inositol

triphosphate (IP3) und

Diacylglycerol (DAG) durch

Hydrolyse des Phospholipids

PIP2

•Daraufhin strömt Ca2+ in die

Photorezeptor Zelle, aber es ist

nicht klar wie

•Ca2+ Einstrom führt zu

Depolarisation und löst ein

Aktionspotential aus

•PLC (kodiert von nonA) ist

essentiell für diesen Ablauf

norpA

trp; trpl

Das Ergebnis: Calcium Einstrom in eine Drosophila Photorezeptor Zelle

C. Zuker

Response to a 33 millisecond light-flash

Aber was genau bewirkt die Öffnung der

trp/trpl Kanäle???

•PLC ist essentiell

•PLC generiert IP3 (insositol triphosphat) und DAG (diacylglycerol)

aus PIP2 (phosphatidylinositol biphosphate )

•Sind IP3 und/oder DAG wichtig für die Öffnung der Kanäle?

Experimente mit IP3

Modell 1: IP3-induzierte Ca2+

Release aus internen Stores aktiviert

Trp durch einen ‘store operated’

Mechanismus

ABER:

•Experimentelle Freisetzung von caged

Ca2+ in Dunkel-adaptierten Zellen ruft

keine Aktivierung hervor

•IP3 Rezeptor Mutanten haben keinen

Effekt auf die normale

Phototransduction

Modell kommt nicht in Frage

Experimente mit DAG

Modell 2: DAG aktiviert PKC

(gemeinsam mit Ca2+, das aus

internen Stores freigesetzt wird),

und aktive PKC öffnet dann den Trp

Kanal

ABER:

•PKC Mutanten betreffen nur

Adaptation und Inaktivierung der

Kaskade, nicht aber die Anregung durch

Licht!

Modell 2 kommt auch nicht in Frage……

Experimente mit DAG

DAG

DAG-LipasePoly unsaturated fatty acids (PUFAs)

z.B. arachidonic acid

TrpTrpl

DAG turnover ist wichtig für die Terminierung der Kaskade. Trp Kanäle sind

konstitutiv geöffnet in rdgA Mutanten, was zu Degradation der

Photorezeptorzellen führt (retinal degeneration)

DAG-Kinase

Phosphatid Säure

(Vorläufer von PIP2)

rdgA

Die neueste Hypothese:

TRP Kanäle werden durch mechanische Kräfte und Protonen geöffnet

(Roger Hardie, University of Cambridge, UK)

Emily R. Liman Science 2012;338:200-201

Published by AAAS

Adaptationsmechanismen:

•Die normale Anpassung des Auges an sich ändernde

Lichtintensitäten.

•Die Reduzierung der ‘firing Frequenz’ eines Neurons,

insbesondere eines Rezeptorneurons, unter Bedingungen

konstanter Stimulierung

Adaptation

Licht-induzierte Translokation in den Rhabomeren

Trpl und Gqα lokalisieren in

Rhabdomeren dunkel-adaptierter

Fliegen, aber nach 1-hr

Lichtexposition translozieren sie

in den Zellkörper

Das Myosin III Protein (kodiert

vom ninaC Gen) ist für diese

Translokation essentiell

Wie konnte das gezeigt werden??

Modell von eGFP-getagten TRP und TRPL Kanälen

A. Huber

Lokalisation von TRPL-eGFP in dunkel-und licht-adaptierten Drosophila

Licht Dunkel

A. Huber

dark

light

TRPL (aber nicht TRP) transloziert in

den Zellkörper

TRPL-HcRed TRP-eGFP overlay

A. Huber

Der Signalplex: Proteine bilden mit Hilfe des INAD

Proteins ein Cluster

•Trp, PLC, und PKC, benötigen

INAD zur Lokalisation in den

Rhabdomeren

•Trpl, Rhodopsin, NinaC, und

CaM kinase lokalisieren ohne

INAD in den Rhabdomeren

•Ermöglicht (im Prinzip) Licht-

regulierte Lokalisation dieser

Proteine

Signalplex trägt zur Schnelligkeit der Phototransduktionskaskade bei

(schnellste bekannte G protein-gekoppelte Signalskaskade überhaupt!)

Rhabdomere membrane

Ca2+

CytosolicExtracellular

R Gq

InsP3

DAG PUFAPIP2

Ca2+

Ca2+

TRPSMC

TRPL

Na+

Zusammenfassung: Drosophila Phototransduktionskaskade

A. Huber

DAG

Lipase

PLUS: Membran Kontraktion und Azidifizierung (H+) der TRP Kanäle

Warum muß die Phototransduktionskaskade

wieder inaktiviert werden??

•Um die maximale zeitliche Auflösung der Antwort auf

Lichtreize zu gewährleisten

•Konstitutive Aktivierung führt zur Degeneration der

Photorezeptoren (z.B., rdgA Mutanten)

I: Meta-Rhodopsin* wird durch Bindung an Arrestin inaktiviert

After C. Zuker

All-trans Retinal bleibt an

Rhodopsin gebunden und

photo-isomerisiert zu 11-cis-3

hydroxy-retinal (durch länger

welliges Licht verglichen mit

dem induzierenden

Lichtstimulus).

Die Funktion der Rhodopsin

Phosphorylierung ist nicht

bekannt, aber RK Mutanten

beeinflussen ERG Amplitude

PUFA’s

DAG-Lipase

Trp/Trpl

Calcium Einstrom/Depolarization

II. Arrestin Transport erfolgt entgegengesetzt zu Trpl

ArrArr

ArrArr

ArrArr

ArrArr

Arr

ArrArr

Arr

Arr

ArrArr

Arr

Arr

Arr

ArrArr

light

dark

III. PLC erhöht die endogene GTPase Aktivität von Gqα

PLCnorpA

GDPGTPase

•Fliegen mit sehr wenig PLC (z.B. hypomorphe norpA Mutanten), zeigen

drastisch verlängerte Antworten auf einen Lichtreiz

•PLC deaktiviert Gqα und dadurch sich selbst

•Elegante Logik: Das aktivierte G Protein bleibt aktiv, bis es sein Target (in

diesem Fall PLC) gefunden und aktiviert hat.

IV: Calcium wir aktiv aus der Zelle transportiert

durch den Na+/Ca2+ transporter CalX

Extrazellulär

Cytosol

C. Montell

•Durch reduzierte trp Funktion induzierte Retinale Degeneration kann

durch gleichzeitige Reduktion der CalX Function ‘gerettet’ werden

•Durch konstitutive trp Funktion (Kanäle immer offen) induzierte Retinale

Degeneration kann durch Überexpression von CalX gerettet werden

Phototransduktion in Vertebraten

Nur ein kleiner Ausschnitt des elektromagnetischen Spektrums kann von

unseren Photorezeptoren detektiert werden (zwischen 300 und 850 nm)

Phototransduktion in Vertebraten: Einige wichtige

Fakten

•Zapfen (cones): Farbsehen und helles Licht

•Stäbchen (rods): Schwarz/Weiss und Dämmerungslicht

•Die menschliche Retina enthält 6 Millionen Zapfen und 125 Millionen

Stäbchen

•Eine Stäbchenzelle kann ein EINZELNES Photon wahrnehmen, und das

Gehirn benötigt nur < 10 Antworten einer Zelle um sie als Lichtblitz

einzuordnen

Phototransduktion in Vertebraten: Where does it happen?

Stäbchenzellen

Photorezeptoren

Stäbchen Zapfen

Aufbau einer Stäbchenzelle im Detail

Die Phototransduktionskaskade in Vertebraten

•Die Phototransduktionskaskade von Invertebraten wurde in der

Hauptsache durch Genetik entschlüsselt (z.B., norpA, trp, trpl

Mutanten).

•Die Phototransduktionskaskade der Vertebraten wurde in der

Hauptsache biochemisch entschlüsselt.

•Rinderopsin war das erste Protein der 7TM-Rezeptor Familie, und die

Struktur wurde im Jahr 2000 gelöst.

I: Der wichtigste Schritt bei der Rhodopsin Photorezeption……ist sehr ähnlich bei Vertebraten und Invertebraten

Die Lichtenergie eines Photons wird in atomare Bewegung umgesetzt (5 Ǻ

Drehung des N Atoms, das Retinal und Protein über eine Schiff’sche Base

verbindet)

Licht

In Vertebraten muß all-trans Retinal enzymatisch reisomerisiert werden

Enzymatischer Prozeß im

Retinalen Pigment Epithelium

Rhodopsin=Opsin + Retinal

II: Durch die Konformationsänderung entsteht aktives

Meta-Rhodopsin*, das dem Liganden-gebundenen

Zustand anderer 7TM-Rezeptoren entspricht

III. Meta-Rhodopsin* aktiviert das G-protein

Transducin

….bisher alles wie in Fliegen

Transducin

……..aber Transducin aktiviert eine cGMP

Phosphodiesterase und nicht PLC

IV: In Vertebraten aktiviert das G-Protein eine Phosphodiesterase

•Aktivierte Gα Subunit bindet die inhibitorische -Untereinheit der PDE, wodurch

diese entfernt wird

•Aktivierte PDE hydrolysiert cGMP zu GMP

•Führt zur SCHLIESSUNG von cGMP-abhängigen Ionenkanälen und dadurch zur

Hyperpolarisation der Photorezeptormembran

Fundamentaler Unterschied zu den

depolarisierenden Photorezeptoren der

Invertebraten

Dunkelstrom

Na+ InfluxK+ Efflux

Dunkelheit

Kein Na+ Influx

K+ EffluxLicht

Depolarisierung

Hyperpolarisierung

Wie kann Hyperpolarisierung zur Weiterleitung des

elektrischen Signals an das Gehirn führen?

Bipolar Zellen werden aktiviert, wenn weniger (in diesem Falle

inhibierendes) Glutamat von den Stäbchen und Zapfen

ausgeschüttet wird

Signalverstärkung

•In Vertebraten aktiviert ein Rhodopsin Molekül bis zu 800 G-Proteine

•Ein PDE Molekül katalysiert die Hydrolyse von bis zu 6 cGMP

Molekülen

•In der Summe führt die Aktivierung von einem Rhodopsin Molekül zur

Schließung von ~200 Ionenkanälen (entspricht einer Membranpotential

Änderung von 1 mV)

Inaktivierung und Adaptation in Vertebraten

I: Rhodopsin Phosphorylierung und Arrestin

•jedes Opsin Molekül hat 3

Serin Phosphorylierungsstellen

•Je höher die

Phosphorylierungsstufe, je

geringer die G-Protein

Aktivierung

•Wenn alle 3 Serine

phosphoryliert sind bindet

Arrestin an Opsin, so dass das

Opsin nicht mehr an das G-

Protein binden kann.

Inaktivierung und Adaptation in Vertebraten

II: Translokation von Phototransduktion Molekülen

•Retinas Dunkel-adaptierter

Ratten vor und nach kurzer

Lichtexposition gefärbt mit

anti -Gα and Gβ Antikörpern

•Nur im outer segment (OS)

kann das G-protein mit

Rhodopsin interagieren

•Wie in Fliegen transloziert

Arrestin in die

entgegengesetzte Richtung

III. PDE erhöht die intrinsische GTPase Aktivität von Gα

PDE

GTPaseGDP

Gα-GDP re-assoziiert mit Gβγ

Ähnlich wie PLC in Fliegen!

IV: Um die cGMP-abhängigen Kanäle wieder zu

öffnen, muss die cGMP Konzentration erhöht werden

GTP

[cGMP]guanylate cyclase

Ca2+

Ca2+

Schließung der cGMP Kanäle nach Lichtexposition

verringert die [Ca2+]i, wodurch Guanylat Cyclase

aktiviert wird

open

[cGMP] closed

Einige Hauptunterschiede zwischen Vertebraten

und Invertebraten Phototransduktion

Vertebraten Invertebraten

G-protein aktiviert PDE G-Protein aktiviert PLC

c-GMP abhängige

Ionenkanäle schließen;

Photorezeptorzellen

hyperpolarisieren

Trp, Trpl Kanäle öffnen;

Photorezeptorzellen

depolarisieren

all-trans Retinal dissoziiert

vom aktiven Opsin und muss

enzymatisch reisomerisiert

werden. Trägt zu langsamer

Dunkeladaptation bei.

all-trans Retinal bleibt Opsin-

gebunden und wird schnell

photoisomerisiert. Trägt zu

schneller Dunkeladaptation

bei

Farbensehen

Stäbchen exprimieren Rhodopsin Zapfen exprimieren 3 Farbopsine

Für die unterschiedlichen spektralen Eigenschaften der ‘grün’ und ‘rot’

Opsine sind nur einige wenige Aminosäuren verantwortlich

identische Reste

unterschiedliche Reste

unterschiedlich und verantwortlich

für Absorptionsspektrum

Farbblindheit—ein genetischer Defekt

•Die Gene für rote und grüne Opsine liegen benachbart auf dem X-Chromosom

•Homologe Rekombination zwischen den 2 Genen führt zur Farbblindheit

Wie häufig ist Farbblindheit? 1/12 Männern (8%) und 1/200 Frauen (0.5%) sind

rot/grün farbenblind.

Defekte in blauen Zapfenzellen (Typ 3: Tritanopes) sind sehr selten (Blaues Opsin liegt auf Chromosome 7)

Rot-Grün Blindheit ist sehr häufig (bei Männern). In

einem Raum mit 25 Menschen, sollte sich im

Durchschnitt eine farbenblinde Person befinden….

Typ 1 (Protanopes) und Typ 2

(Deuteranopes):

Defekte in roten und grünen

Zapfenzellen

Doppelfärbung mit roten and grünen Farbstoffen.Kann von farbenblinden

Personen nicht unterschieden werden!

Protanop (rot) Deuteranop (grün)

Welche Farben sehen sie hier?

Simulation wie farbenblinde Personen dieses Bild sehen

Ein typisches Fluoreszenz Bild aus dem Labor

Ein kleiner Exkurs über nicht-visuelle Photorezeptoren

Schlaf-Wach Rhythmus eines französichen Höhlenforschers (Michel Siffre, 1962)

t = 24,8 h

Circadiane Rhythmen in Menschen

Tageszeit

“Bunker Experimente”(418 Experimente mit 447 Freiwilligen

[Studenten] zwischen 1964 - 1989)

Erling-Andechs

Jürgen Aschoff (1913 – 1998)

Rütger Wever(1923 – 2005)

Schlaf-Wachrhythmen im Bunker

Kontakt mit der

Außenwelt?

Organismen besitzen eine innere Uhr, die mit der Umwelt synchronisiert werden kann

Moore & Eichler (1972)

Intakte Synchronisation nach Trennung des optischen Trakts

KEINE Synchronisation nach Trennung des RHT

Circadiane Photorezeptoren müssen innerhalb der Augen lokalisiert sein

Lichteingang in die innere Uhr von Säugern

Roelof Hut

Wie kann man testen, ob der Lichteingang in die innere Uhr funktioniert?

Laufaktivität

Visuelle Photorezeptoren sind für die Synchronisation nicht essentiell

‚Phase shift‘ des Schlaf-Wach Rhythmus nach 15 min Lichtexposition (509 nm)

Andere Photorezeptoren im Auge müssen für die Synchronisation verantwortlich sein

Freedman et al., 1999

Ein Subset (1-2%) der RGC exprimieren Melanopsin

1-2% Melanopsin positiv

MELANOPSIN: Guter Kandidat für ein circadianes Photopigment

Melanopsin Expression in Retinal Ganglion Cells (RGCs).....

cross sectionsof retinas

flat-mounted retinas

Hattar et al., 2002

...Melanopsin RGCs projizieren zum SCN

lacZ Färbung der RHT Projektionenin den SCN

tau-lacZ Reporter inseriert im Melanopsin Gen

Hattar et al., 2002

RGC cell

Science; 295(5557):1065-70.

MELANOPSIN: Guter Kandidat für ein circadianes Photopigment

... RGCs sind intrinsisch photosensitiv (unabhängig von Stäbchen und Zapfen)

Spektrale Sensitivität passt auf ein 484nm Opsin

Einzelne RGC depolarisieren nach Lichtexposition

Berson et al., 2002

Science; 295(5557):1070-3.

MELANOPSIN: Guter Kandidat für ein circadianes Photopigment

Melanopsin, aber auch Stäbchen und Zapfen tragen zur Licht-Synchronisation bei!

Panda et al., 2003

100 lux

100 lux100 lux

100 lux

800 lux

Science; 301(5632):525-7

Wildtyp Maus Kein Melanopsin in RGCs

Keine Stäbchen und ZapfenWeder noch

Melanopsin ist enger verwandt mit Rhodopsinen der Invertebraten als mit den visuellen Opsinen der Vertebraten

Langer cytoplasmatischer C-terminus: existiert nicht in den visuellen Opsinen der Vertebraten

Cytoplasmatische Loops vermitteln G-Protein Bindung: ähnlich zu Fliegen Rhodopsinen

Nayak et al., 2007

Melanopsin Phototransduktion gleicht der von Invertebraten Rhodopsinen

Hyperpolarisierung

Depolarisierung

Nayak et al., 2007(Nummern 1-4 sind nachgewiesene Schritte für Melanopsin Phototransduktion)

Eigenschaften von Melanopsin und RGCs

•11-cis Retinal Photo re-isomerisiert (……..wie in Fliegen)

•RGC depolarisieren nach Lichtreizung (…..wie in Fliegen)

•Melanopsin wird nicht in spezialisierten Membranstrukturen (z.B., ‘discs’) exprimiert, sondern gleichmäßig verteilt in der RGC Plasmamembran von Soma, Axon und Dendrit

•Ablation der Melanopsin RGC führt zum totalen Verlust der Synchronisation. D.h. die zur Synchronisation beitragenden Stäbchen und Zapfen sind mit diesen RGC verschaltet.