27.05.2016

1

Vorlesung „Zellbiologie Physiologie und Genetik “

SoSe 2016

Wege des Kohlenstoffs 1

Prof. Dr. Antje von Schaewen

30.05. „Aufbau pflanzlicher Kohlenhydrate“

Pflanzliche Kohlenhydrate

� Transportzucker (Di- und Oligosaccharide)

� Glucose-Polymere

Stärke (Speicherkohlenhydrat)

Cellulose (Zellwandstruktur)

Callose (zelluläre Abdichtung)

� Komplexe Oligo- und Polysaccharide

Hemicellulosen (Linker zwischen Cellulose-fribrillen)

Pektine (Zellwandmatrix)

Glykane (Bestandteil glykosylierter Proteine)

27.05.2016

2

Alle Kohlenhydrate stammen aus dem Calvin-Zyklus

Primäre Produkte sind Triose-P, Stärke und Saccharose

Merke:

Stärke dient als lokaler Speicher,

ABER

Saccharose dem Ferntransport!

Triose-P

Translokator

Calvin

Zyklus

1. Lichtreaktionen

(Bildung von ATP, NADPH)

2. Dunkelreaktionen

(Bildung von Triose-P/Stärke)

3. Triose-P Transport in das Cytosol

(Bildung von Saccharose)

4. Export von Saccharose

Export

SaccharoseTransport-Kohlenhydrat

der Pflanzen

27.05.2016

3

Kranz-Anatomie

Woher stammt der Zucker

den wir kaufen und essen?

Rohrzucker

Würfelzucker (Saccharose)

Raffinade (gebleicht)

Zuckerrohr

Zuckerrohr ist eine bekannte C4-Pflanze aus der Familie

der Süßgräser. Bildquelle: © iStockphoto.com/ Amandaliza

27.05.2016

4

Saccharose (ein Disaccharid aus Glc und Fru) ist das

wichtigste pflanzliche Transport-Kohlenhydrat

Saccharose

ist ein „nicht-reduzierender“ Zucker

(reduzierende Enden → glykosidische Bindung)

Vorlesung E. Weis (modifiziert)

GlucoseFructose

α- und β-Stereo-Isomere von

D-Glucose, d.h. Stellung der

Hydroxylgruppe (-OH) am

anomeren C1-Atom

oci.uzh.chGleichgewicht zwischen zyklischer bzw. offener Form von Maltose

(Disaccharid aus Glucose, das bei Getreide-Vermalzung frei wird)

offen

(Aldose)

zirkulär

(Halbacetal)

„Sessel“-Darstellung

H2O anomeres

C-Atom

Reduzierende und nicht-reduzierende Zucker Reduzierende Zucker tragen freie Aldehyd- oder Ketogruppen und sind relativ reaktionsbereit

(besonders in Bindung mit Phosphat!)

Beispiele: Glucose, Galactose (= Aldosen), Fructose, Ribulose (= Ketosen).

Funktion: Speicherstoffe bzw. Stoffwechsel-Intermediate

(z.B. als Zuckerphosphate: im Calvin-Zyklus, in der Glykolyse, im oxidativen Pentosephosphatweg)

Nicht-reduzierende Zucker sind dagegen chemisch sehr stabil! Z.B. Zuckeralkohole (wie

Mannitol, Sorbitol) oder Di- bzw. Oligosaccharide mit Keto- bzw. Aldehyd-

gruppe in glykosidischer Bindung).

Vertreter: Saccharose und davon abgeleitete höherwertige Zucker (Saccharose + Gal1-3)

Funktion: „Transportzucker“, in Ausnahmefällen auch Speicherkohlenhydrate (in Vakuolen).

Reduzierende Zucker Nicht-reduzierende Zucker

CH2OH

D-Mannitol

CH2OH

Alkohol

27.05.2016

5

Saccharose-Synthese findet im Cytosol statt

Kohlenstoffbausteine werden aus dem Chloroplasten-Stroma abgezogen

Dort wird aus Triose-Phosphat

Hexose-Phosphat synthetisiert und als

Saccharose aus den „source“-Zellen

exportiert und über das Phloem zu

Verbrauchsorganen transportiert

(„sink“-Gewebe: Wurzeln, wachsende

junge Blätter, Blüten, Samen)

Pi Pi

Export

Triose-Phosphate werden im

Gegentausch mit Phosphat (Pi) aus

den Chloroplasten in das Cytosol

transloziert

TPTTPT

TPT: Triose-Phosphat/Pi-Translokator

Triose-Phosphat

Fructose-1,6-bis-Phosphat (FBP)

Pi

Saccharose-Synthese 1. Schritt: Bildung von Hexosen

exergonische

Reaktion

(irreversibel)

Triose-Phosphat

Fructose-6-Phosphat

Fru-1,6-bis-Phosphatase

(FBPase)

Aldolase

Vorlesung E. Weis (modifiziert)

Quasi Glykolyse rückwärts

⇒ Gluconeogenese

27.05.2016

6

Fructose-6-P

Fructose-1-P UDP-Glucose

Saccharose-P

Saccharose

UTP

PPi

UDP

Pi

Saccharose-Phosphat-

Synthase (SPS)

Glucose-6-P

Fructose-6-P

Saccharose-Synthese2. Schritt: Bildung von Saccharose (via SPS)

UDP-„aktivierte“ Glucose

exergonische

Reaktionen

(irreversibel)

Saccharose-

Synthase (SuSy)

Vorlesung E. Weis (modifiziert)

Fructose + UDP-

Glucose

Saccharose

Saccharose-Spaltung

Zwei Wege - Invertase und Susy

Saccharose-Synthase

(engl. sucrose synthase „Susy“)

Fructose +

Glucose

Hydrolytische Spaltung

(durch Invertase)

reversibel!irreversibel!

Vorlesung E. Weis (modifiziert)

UDPH2O

Cellulose

27.05.2016

7

StärkeSpeicher-Kohlenhydrat

der Pflanzen

α1�4-Bindung

α1�6-Bindung ⇒ Verzweigung!

Stärke - ein verzweigtes Polymer aus GlucoseDie α1�4 Ketten sind spiralig gewunden (vgl. gestreckte β1�4 Kette von Cellulose!)

27.05.2016

8

Stärke dient als Kohlenhydrat-Speicher

Stärkepolymere können viele Millionen Glucose-Einheiten enthalten

(in Form von Stärkekörnern)

In seiner verzweigten, hochpolymeren Form ist Stärke nicht mehr löslich

(� osmotisch inaktiv!)

MERKE: In dieser Bindung ist Glucose extrem stabil

Vorlesung E. Weis (modifiziert)

Chloroplast

mit transitorischer

Stärke

Amyloplast

mit vielen

Stärkekörnern

In Höheren Pflanzen wird Stärke in Plastiden

gebildet - über „aktivierte Glucose“

unverzweigte

Stärke

verzweigte

Stärke

Abb. aus: Buchanan et al., „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“; Amer. Soc. of Plant Physiol.

27.05.2016

9

Die AGPase-Reaktion ist prinzipiell reversibel

die angekoppelte exergone Pyrophosphatase-Reaktion treibt die Bildung

von ADP-Glucose und damit die gesamte Stärkesynthese an

AGPase

irreversibel!

Zusätzlich redox-reguliert über das

Ferredoxin/Thioredoxin-System

Elektronen werden zu Regulationszwecken

„abgezweigt“

Stroma

Beispiele

Fd FTR TRX target enzyme(s)

Lumen

Fd: Ferredoxin (Fd)

FTR: Fd/Trx-Reduktase

FNR: Fd/NADP-Reduktase

TRX: Thioredoxin (Trx,

verschiedene Isoformen)

27.05.2016

10

…und in der Nacht? Ohne den Licht-getriebenenen Elektronentransport werden Enzyme

des Calvin-Zyklus (= reduktiver Pentose-Phosphatweg) inaktiviert

PRK und GAPDH werden zusätzlich via CP12 komplexiert

CP12 N-terminal

peptide loop

C-terminal

peptide loop

Nach: Wedel et al. (1997) und Wedel & Soll (1998) PNAS USA

Fd/Trx

system

Evolutionär konserviert!

Auch in Moosen, Grünalgen und Cyanobakterien!

Platform

for enzyme

complex

formation

NADP(H)

NADPH-Bildung in der Nacht erfolgt durch den

Oxidativen Pentose-Phosphatweg (OPP)

• OPP und RPP teilen sich mehrere reversible Enzym-Reaktionen im Stroma

• G6PDH (OPP Startenzym) wird über das Fd/Trx-System gegenläufig reguliert

→ tags

→ nachts

↑an ↓aus

Vorteil dieser Regulation: Minimiert sinnlose Zyklen (NADPH↔NADP) und ATP-Verbrauch

27.05.2016

11

SH

SH

S

S

Redox-Wechsel

H2O1/2 O2

Light (Fd red→FTR)

2 e- + 2 H+

EE

Trxox

Trxred

Post-translationale Regulation von Enzymen

De-/Phosphorylierung

E

ATP ADP

H2OPi

Kinase

Phosphatase

E P

Ob ein Enzym (E) in seiner Aktivität durch diese posttranslationalen Regulationsmechanismen

positiv oder negativ beeinflusst wird, muss immer experimentell geklärt werden!

chloroplastidäre

G6PDH „aus“

(Scheibe & Anderson,

1981)

cytosolische

G6PDH „aktiviert“

(Dal Santo et al.,

2012)

Calvin-Zyklus

Enzyme „an“

(Crawford et al.,

1989)

Vorlesung E. Weis (modifiziert)

In Amyloplasten stammen die Hexosen aus

importiertem Glucose-6-Phosphat sowie

importiertem ATP

MERKE:

In Chloroplasten stammen die Hexosen zur

Stärkebildung aus dem Calvin-Zyklus

GPT

OPP NADPH

ATP/ADP

Translokator

27.05.2016

12

In Amyloplasten gespeicherte Stärke wird bei keimenden

Samen durch spezielle Enzyme mobilisiert

Nach der Quellung wird zunächst das Hormon Gibberellinsäure

(Gibberellic acid = GA3)

1) vom Embryo ausgeschüttet und induziert so die

2) Expression von α-Amylasen und Proteasen, aber

(in der Aleuronschicht)

3) β-Amylasen sind bereits im Samen vorhanden und

werden durch Protein-Prozessierung aktiv

⇒ Unser KURSVERSUCH mit Getreide-Koleoptilen

GA3

Abb. aus: Buchanan et al., „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“; Amer. Soc. of Plant Physiol.

Abbildungen aus W. Nultsch, „Allgemeine Botanik“, Thieme Verlag; Vorlesung E. Weis (modifiziert)

In Chloroplasten wird Stärke tagsüber aufgebaut und nachts abgebaut

⇒ „transitorische“ Stärke

In Amyloplasten dient sie der ⇒ langfristigen CHO-Speicherung

„sink“ Organe

(Metabolismus)

„source“-Zellen

„sink“ Organe

(Speicher)

NachtTag

In Chloroplasten „wachsen“ Stärkekörner

tagsüber und „schrumpfen“ nachts.

Die Produkte der Stärke-Mobilisierung

(Maltose und Glucose) können über einen

Facilitator (konzentrationsausgleichend)

in das Cytosol entlassen und dort nach

Aktivierung (Hexokinase, ATP) in die

Saccharose-Synthese eingeschleust

werden

27.05.2016

13

Zwei Wege der Stärke-Spaltung:

Hydrolyse oder PhosphorolyseHydrolyse durch α- und β-Amylasen

Energie bleibt erhalten

Energie geht verloren

Endoenzym

Exoenzym

Export-

+Saccharose-

Phosphat

Synthase (SPS)

In den Chloroplasten wird das Gleichgewicht zwischen Stärke- und

Saccharose-Synthese über den Phosphat-Translokator (TPT) eingestellt

TPT

27.05.2016

14

Regulation von Glykolyse und Gluconeogenese in Pflanzen

Saccharose

Triose-P

G6PF6PF2KP

ATP

+

Pi

PPi

F2,6P2

6PG

+

ADP

-

ATP

Pi PFK

-PFPFBP6PG

Pi

F1,6P2

Ru5P

CO2

3

2

NADPH

NADP

1

Triose-P

Glc/Mal

ATP

ADP

HK

ADP

3PGA

Cytosol

ChloroplastMitochondrium

Pi

HK: Hexokinase

SPS: Sucrose-P-Synthase

OPPP steps:

1 = G6PDH

2 = 6PGL

3 = 6PGDH

Fructose 2,6-bisphosphate (F2,6P2) and carbon partitioning in source leaves. Control of carbon fluxes in the Cytosol of source leaves.

In plant cells, the step to/from fructose-1,6-bis-phosphate (F1,6P2) can be catalyzed by 3 different enzymes: uni-directional PFK (Phospho-fructo-

kinase), unidirectional FBP (fructose-bis-phosphatase), or bi-directional PFP (fructose-6-phopshate 1-phospho-transferase). Only FBP and PFP

(but not of PFK) are influenced by F2,6P2 levels: FBP negatively and PFP positively (indicated by light blue minus and plus signs). F2,6P2 levels

are adjusted by bifunctional fructose 2,6-bisphosphate kinase/ phosphatase (F2KP). High levels favor glycolysis over gluconeogenesis. Conversion

of F2,6P2 is influenced by multiple effectors, amongst others OPPP intermediate 6-phosphogluconate (6PG). 6PG and pyrophosphate (Pi) dampen

F2,6P2 destruction and promote F2,6P2 formation (indicated by dark blue minus and plus signs). Scheme modified after Nielsen et al. (2004).

Stärke

PEP

Pi

TP

TX

PTXu5P

PP

TG

lcT

F2,6P2 als wichtige

Stellschraube im

Cytosol: Bei Zucker-

Rückstau hemmt das

Metabolit FBP

(Zuckerexport) und

aktiviert PFP

(Zuckerrückhalt).

Dies resultiert in

allosterischer

Aktivierung von

AGPase in

Chloroplasten

(Stärke-Synthese)

SPS

Pi

Photo-

synthese

CO2

CO2

Cellulose

Gerüst der pflanzlichen

Zellwand

27.05.2016

15

Cellulose bildet die Grundlage

der Zellwandstruktur

Vergleich:

Cellulose(gestreckt)

Stärke(spiralig)

27.05.2016

16

Richmond, Genome Biol 2000Richmond, Genome Biol 2000Richmond, Genome Biol 2000

Struktur der Cellulose-Synthase (Monomer)

UDP-Glc(Cytosol)

Kettenverlängerung

Cellulose-Synthase Rosettenkomplex

Mehrere Cellulose-Synthase-Untereinheiten bilden

jeweils einen Komplex mit Saccharose-Synthase

(SuSy) und lagern sich zu „Rosetten“ zusammen

(Rosettenkomplex).

Die Celluloseketten werden in den Apoplasten

(Zellwandraum) abgeschieden und bilden

parachristalline „Mikrofibrillen“ (durch H-Brücken).

Abb. Aus Buchanan et al., Biochemistry & Molecular Biology of Plants. Vorlesung E. Weis (modifiziert)

Cellulose - ein unverzweigtes Glucose-Polymer

(β1�4 Verknüpfung)

Die Bildung von Cellulose erfordert

Bereitstellung von UDP-Glucose

Susy =

27.05.2016

17

Erinnerung:

Die Orientierung der peripheren

Mikrotubuli legt die Orientierung

der Cellulosefibrillen (Wandtextur)

und damit die Dehnungsrichtung

expandierender Zellen fest.

Cellulosetextur und Mikrotubuli

Callose

Zelluläres Dichtungsmaterial

27.05.2016

18

� Callose fungiert als Abdichtungsmaterial und dient der Verfestigung

von zellulären Strukturen

� Dies spielt eine wichtige Rolle bei:

- Zellteilung (Zellplatte)

- Wundreaktion

- Abwehr (nach Infektion)

- Verschluss (von Siebröhren u. Plasmodesmata)

Die Bildung von Callose-Ablagerungen kann sehr schnell, d.h. innerhalb

von Minuten, induziert werden (z.B. bei der Wundreaktion ≥ 30 min).

Callose - ein stark gewundenes Glucose-Polymer

(β1�3 Verknüpfung)

Vorlesung E. Weis (modifiziert)

Cellulose (β1�4 Glucan) ist gestreckt

und kann sich zu parakristallinen

Mikrofibrillen zusammenlagern

Callose (β1�3 Glucan, teilweise

1�6 verzweigt) ist eng helikal

gewunden und bildet Knäuel

Callose- und Cellulose-Bildung an der Plasmamembran erfolgt ähnlich

(siehe frühere VL-Folien), die Synthasen sind evolutionär verwandt)

Cellulose und Callose sind verwandte Strukturen

1 4

5

6

1 3

46

5

27.05.2016

19

• Callosebildung ist schnell

(ca. 1 h nach Verwundung)

• Verantwortliche Isoform:

GSL5 (= CalS12)

• Suppression von GSL5

mittels RNAi-Technik

(GSL5-RNAi)

� keine Callosebildung

Callose-Färbung mit Anilinblau

(sichtbar durch hellblaue Fluoreszenz der

Wundränder)

Jacobs et al. (2003)

Beispiel 1: Callose-Bildung nach Blatt-Verwundung

(Arabidopsis)

Callose-Ablagerungen an den Plasmodesmata von Schwammparenchym-Zellen

nach Infektion von Tabakblättern mit dem Pathogen Phytophthora nicotianae

Beispiel 2: Abwehr-induzierte Callose-Ablagerungen

(Plasmodesmata)

In situ-Callose-Nachweis (≥ 30 min) mittels Anilinblau-Fluoreszenz unter Confokalmikroskop (AG Weis)

Callose-Verschluss

der symplastischen

Zell-Verbindungen

⇒ Zuckerstau in

„source“-Zellen

(exportieren Zucker)

Abwehr

verbraucht

Energie!

27.05.2016

20

„Komplexe“ Oligosaccharide

� Festigungselemente (in der Zellwand)

� Erkennungsignale (Arabinogalaktan-Proteine)

� „Dekoration“ der Zelloberfläche (sekretierte Proteine)

Bildungsorte: ER & Golgi-Apparat (� 1. Vorlesung, A. von Schaewen)

„Komplex“ bedeutet:

Die Oligosaccharide setzen sich aus einer variablen Sequenz verschiedener

Zuckereinheiten zusammen (z.B. N-acetylglucosamin = GlcNac, Mannose,

Glucose, Xylose, Fucose, Galactose) und sind mehr oder weniger verzweigt.

MERKE:

Durch Variation in Kettenlänge, Verzweigung und Abfolge ergibt sich eine

schier unbegrenzte Variationsvielfalt!

Xyloglucan- (links) und Pektin- (rechts) Polysaccharide (Zellwandbestandteile)

Abb.: Buchanan et al., „Biochem. & Mol. Biol. of Plants“, Kap. 1 (American Society of Plant Physiologists, ASPP)

Synthese und Sekretion komplexer Oligosaccharide

27.05.2016

21

Kommunikation in der Zellwand (Apoplast)

AGP (Arabinogalaktan-Proteine, Proteoglykane)

Abb.: Buchanan et al., „Biochem. & Mol. Biol. of Plants“, Kap. 1 (American Society of Plant Physiologists, ASPP)