Das Proteom

Vorlesung: Gene und Genome

Proteom -1-

g

Wintersemester 2006 / 2007

Kristian Müller

Institut für Biologie III, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg

Ziele der Vorlesung

• Interesse am Proteom wecken

• Einführung in experimentellen Methoden zur Erforschung des Proteoms

• Einführung in bioinformatische Methoden zur Analyse von Proteom Daten

• Vorstellung von bioinformatischen Analysewerkzeugen

• Wege durch den Informationsdschungel aufzeigen

structural biology

geneticssequencinginformation

Proteom -2-

molecularbiology

medicine

physiology toxicologygene

expression

Proteom, was ist das?

Proteom -3-

Vom Gen zum Proteinkomplex

Proteom -4-

Curr Opin Chem Biol 2003, 7, S. 21

Die Größe von Proteinen und Proteinkomplexen

Domänen ~ 1 - 3 nm

Proteine ~3 - 10 nm

Proteom -5-

Protein Komplexe ~ 50 - 100 nm

Organellen ~ 500 - 1000 nm

Proteine im Größenvergleich

Proteom -6-Koolman, Color Atlas of Biochemistry, 2nd edition © 2005 Thieme

Vom Gen zum Proteinkomplex

Proteom -7-Curr Opin Cell Biol 2003 15, S. 199

Umfassende Ansichten: “…omics”

Genomics: Das Genom und die Gene eines Organismus

Proteomics: Die Proteine eines Organismus

Proteom -8-

Metabolomics: Die Stoffwechselwege eines Organismus

Functomics: Funktion und Interaktion der Proteine eines Organismus

Structural Genomics: Die räumliche Struktur der Moleküle eines Organismus

Systems Biology: Ganzheitliche Biologie der Zelle

Genom, Proteom, Phosphoproteom, Interaktom, Metabolom, ...

Experimentelle Methoden

Wie entstehen Daten zum Proteom?

• S i j kt O i

Proteom -9-

• Sequenzierprojekte von ganzen Organismen

• Viele einzelne Experimente zu den jeweiligen Proteinen

• Proteomics Experimente

Methoden des Proteomics

• 2D Gelelektrophorese (das ursprüngliche Proteomics)Auftrennung von Gesamtzelllysaten in der ersten Dimension nach demisoelektrischen Punkt (isoelektrische Fokussierung) und in der zweitenDimension nach dem Molekulargewicht. Die Proteinflecken können anhandIhres Laufverhaltens mit Datenbanken abgeglichen werden oder aus demGel zur weiteren Charakterisierung (z.B. MS) isoliert werden.

• Protein Sequenzierung (Edman Abbau)Die N-terminale Sequenz eines Proteins kann bis zu einigen Aminosäurenbestimmt werden.

Proteom -10-

• MassenspektrometrieBestimmung der Masse eines Proteins. Proteine werden häufigbiochemisch (Proteolyse) oder physikalisch (MS-MS) zerkleinert. Sokönnen auch große Proteine bestimmt werden. Die Ergebnisse können mitberechneten Massen aus Genomdatenbanken verglichen werden. Bereitsgrob vorgetrennte Zellysate können bestimmt werden.

• Bibliotheken Technologien / Repertoire TechnologienMit molekularbiologischen in vivo Testmethoden können genomorientierteProteinfunktionsanalysen vorgenommen werden. Z.B. wurden alle 6000open reading frames der Hefe mit dem Yeast-two-Hybrid System aufinteraktion getestet.

Proteom Fraktionierung und Analyse

Zellulär

Bestandteile

Biochemisch

2- 3-D Chromatographie2-D ElektrophoreseAffinitätsreinigung

Chemische

Aktivität

Proteom -11-

BestandteileOrganellen

AktivitätPost Translationale ModifikationenAminosäure Reaktivität

Physikalisch

Massenspretrometrie

Proteomics - der Ursprung:2D Gelelektrophorese

2D Gel: Hela Nucleus Extrakt

Proteom -12-

Quantitative 2D-Gel Analyse

Proteom -13-

Beispiel für 2D-Gel Daten

www.expasy.ch/ch2d

Proteom -14-

weitere Datenbanken:

NCI 2DWG Image Meta-Databasehttp://www-lecb.ncifcrf.gov/2dwgDB/

Identifikation von Proteinen in 2D Gelen

Proteom -15-

LC MS MS Proteom Analyse

LC: Liquid ChromatogarphyMS: Mass SpectrometryHPLC: High Performance (High Pressure) Liquid Chromatography

Proteom -16-

Post Translationale Modifikationen (PTM)

Proteom -17-

Nature Reviews Molecular

Cell Biology, 2006, 7, 391-403

• Nitrosylation

• Glycation

• ADP-ribosylation

• O-GlcNAc

Isotope-Coded Affinity Tag (ICAT) für MS

Proteom -18-

Isotope-Coded Affinity Tag

Proteom -19-

mRNA durch Microarray verglichen mitProtein durch ICAT

Proteom -20-Science 2001 292, S. 929

Proteom Daten durch Genomsequenzierung

Proteom -21-

Wie erhalte und verarbeite ich Daten eines Proteoms ?

Datenbanken auf dem Internet

Primärdatenbanken

• DNA-Sequenzdatenbanken z.B. EMBL, GenBank (weitestgehend automatisierte Datenbanken, Eingabe durch Wissenschaftler und überwiegend Sequenzierprojekte)

• Proteindatenbanken z.B. TrEMBL, Swissprot (automatische und manuelle Eingabe durch C t )

Proteom -22-

Curatoren)

• Strukturdatenbanken z.B. PDB (Eingabe durch Wissenschaftler)

Abgeleitete Datenbanken

• Sequenzorientierte Datenbanken

– z.B. Interpro (Metadatenbank für Proteome)

– z.B. CluSTr, Pfam, Prosite, ProDom ...

• Strukturorientiere Datenbanken

– z.B. SCOP, CATH

Literaturdatenbanken z.B. PubMed

European Bioinformatics Institute (EBI)www.ebi.ac.uk

Proteom -23-

NCBI

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Proteom -24-

There are approximately 65,369,091,950 bases in 61,132,599 sequence records in the traditional GenBank divisions and 80,369,977,826 bases in 17,960,667 sequence records in the WGS division as of August 2006.

Glycolyse Vergleich mit BioCyc

Escherichia coli

Proteom -25-

Picrophilus Torridus(lebt bei pH 0, 65°C)

Natronomonas pharaonis(liebt 3.5 M NaCl , pH 8.5, kann auch bei pH 11 leben)

Beispiel für Proteom Datenbank: Integr8

Integr8

• is a browser for information relating to completed genomes and proteomes,

• based on data contained in Genome Reviews and the UniProt proteome sets

• provides access to species descriptions, literature, statistical analysis and summary information about each complete proteome

• integrates data from a variety of sources, including InterPro, CluSTr and GO.

Proteom -26-

• integrates data from a variety of sources, including InterPro, CluSTr and GO.

Integr8 Database 2007Integr8 Database 2005

http://www.ebi.ac.uk/integr8/

Gene und Proteine im Vergleich

Component name Protein count

Length (bp) Gene count

Chromosome 1 5525 245522847 2304

Chromosome 2 3039 243018229 1800

Chromosome 3 2424 199505740 1386

Chromosome 4 1604 191411218 1041

Chromosome 5 1973 180857866 1227

Chromosome 6 3450 170975699 1713

Chromosome 7 2529 158628139 1575

Chromosome 8 1592 146274826 1008

Chromosome 9 2346 138429268 989

Chromosome 10 2403 135413628 951

Chromosome 11 2721 134452384 1628

Chromosome 12 2171 132449811 1286

Homo Sapiens

Component name

Protein count

Length (bp)

Av. CDS Length

GC content

CDS coverage

Gene count

Chromosome 4276 4639675 962.216 50.8% 88% 4276

E. coli K-12

Proteom -27-

Chromosome 12 2171 132449811 1286

Chromosome 13 907 114142980 445

Chromosome 14 1553 87191216 789

Chromosome 15 1446 100338915 933

Chromosome 16 1855 88827254 916

Chromosome 17 2573 78774742 1487

Chromosome 18 1074 76117153 378

Chromosome 19 2697 63811651 1349

Chromosome 20 1669 62435964 666

Chromosome 21 577 33543332 328

Chromosome 22 1247 49554710 629

Chromosome X 2129 154047547 1030

Chromosome Y 310 57701691 184

Mitochondrion 18 16569 15

Plasmid F 106 99159 787.486 48.2% 83% 106

4337

Integr8 Database 2006

Das Proteom in Zahlen

Die Größe der Proteine (Integr8 Database 2006)

Proteom -28-

Homo Sapiens E. coli K-12

Die häufigsten Proteine

InterPro top 30 entries for H. sapiens

InterProProteins matched(Proteome coverage)

RankName

IPR007110 1191 (3.1%) 1 Immunoglobulin-like

IPR007087 1057 (2.8%) 2 Zinc finger, C2H2-type

IPR003599 987 (2.6%) 3 Immunoglobulin subtype

IPR011009 902 (2.4%) 4 Protein kinase-like

IPR000276 896 (2.4%) 5 Rhodopsin-like GPCR superfamily

Proteom -29-

IPR000719 808 (2.1%) 6 Protein kinase

IPR013106 634 (1.7%) 7 Immunoglobulin V-set

IPR011993 596 (1.6%) 8 Pleckstrin homology-type

IPR000725 510 (1.3%) 9 Olfactory receptor

IPR007086 491 (1.3%) 10 Zinc finger, C2H2-subtype

IPR001909 467 (1.2%) 11 KRAB box

IPR011992 440 (1.2%) 12 EF-Hand type

IPR008271 430 (1.1%) 13 Serine/threonine protein kinase, active site

IPR012677 420 (1.1%) 14 Nucleotide-binding, alpha-beta plait

IPR001680 417 (1.1%) 15 WD-40 repeat

IPR13032 336 (0.9%) 29 EGF-like region

Interaktomdas Yeast-Two-Hybrid System

zur Interaktionsanalyse

Köder (Bait)

Binding Domain (BD)

Proteom -30-

Nature 1989 340, S. 245PNAS 1991 88, S. 9578

Beute (Prey) Activation Domain (AD)

Yeast-Two-Hybrid Analyse des Drosophila Proteoms

Proteom -31-Science 2003 302, S. 1727

Klonierung des humanen "ORFeomes"

Proteom -32-Genome Research, 2004, 14, 2128

Yeast two hybridAnalyse des humanen ORFeomes

Selektionstrategie Ausgewählte Interaktionen

Proteom -33-Nature 2005, 437, 1173

Verknüpfung biochemischer Daten

Proteom -34-Curr Opin Chem Biol 2003 7, S. 44

Beispiel: Epidermal Growth Factor Receptor (EGF-R) und Epidermal Growth Factor (EGF)

PI3-K

EGF-R, erbB1, HER1Ligand

EGFR-TKKK

pYpY SOS

GRB2pY

EGFTGF-α

Amphiregulinβ-cellulinHB-EGF

Epiregulin

Proteom -35-

Survival(anti-apoptosis)

PTEN AKT

STAT3

MEK

Gene transcriptionCell cycle progression

DNA Myc

Myc Cyclin D1JunFos

P P

MAPK

Proliferation/maturation

Chemotherapy /radiotherapyresistance

AngiogenesisMetastasis

Cyclin D1

p

RAS RAF

adapted from AstraZeneca

einfache Darstellung

EGF Signalverschaltung - Das Leben ist Komplex

Proteom -36-http://www.hprd.orgHuman Protein Reference database

Suche nach einem bekannten Protein

Proteom -37-

Die Suche nach einem bestimmten Gen / Protein:Sequence Retrieval System (SRS) Oberfläche

http://srs.ebi.ac.uk/

Proteom -38-

Auswahl an Datenbanken im SRS

Proteom -39-

Vernetzung der Protein-Datenbanken

Proteom -40-Verschachtelung der Datenbanken: z.B. PDB - SCOP – Superfamily – Interpro; UniProt – InterPro – UniProt

InterPro 2006

Proteine finden: UniProt

Proteom -41-

Ergebnis der Suche nach “EGF”

Treffer Liste

UniProt Eintrag EGF_Human

Proteom -42-

Eigenschaften des Proteins

Proteom -43-

Die Sequenz

ID EGF_HUMAN_3; parent: EGF_HUMANFT CHAIN 971 1023 Epidermal growth factor.SQ Sequence 53 AA;

NSDSECPLSH DGYCLHDGVC MYIEALDKYA CNCVVGYIGE RCQYRDLKWW ELR

Querverweisen in der UniProt Datenbank

Proteom -44-

InterPro Eintrag für EGF Typ 1

Proteom -45-

InterPro Datenbank: EGF Vergleich in verschiedenen Organismen

Proteom -46-

Wo ist der Unterschied?type I EGF, EGF subtype II, EGF like

• Der Abstand der Cysteine variiert.• Die Aminosäure Komposition variiert.• Es gibt verschiedene Ausgangs-Sequenzabgleiche.

• EGF

Proteom -47-

•+-------------------+ +------+| | | |

C-x(7)-C-x(4-5)-C-x(10-13)-C-x-C-x(8)-Cx| | +---------------+

• Ca-binding EGF+------------------+ +---------+| | | |

nxnnC-x(3-14)-C-x(3-7)-CxxbxxxxaxC-x(1-6)-C-x(8-13)-Cx| | +------------------+

Pfam

Proteom -48-http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/

LTB1_RAT/1462-1497 CQDPN...SCID...GQCVNTEG........SYNCFCTHP.MVLDASEKRCLTB1_RAT/185-212 CVP.....PCQNG..GMCLRPQ...........FCVCKPG.....TKGKACLTBS_HUMAN/77-104 CHL.....PCMNG..GQCSSRD...........KCQCPPN.....FTGKLCO01768/1993-2029 CHQL....ECKNG..GYCLKPDPS...ANRTSPTCLCSPG.....FKGLLCCRB_DROME/1919-1950 CEIT....PCDNG..GLCLTTG........AVPMCKCSLG.....YTGRLCCRB_DROME/1763-1794 CFQS....DCKND..GFCQSPSD........EYACTCQPG.....FEGDDCCRB_DROME/984-1020 CDQN....PCLNG..GACLPYLINE...VTHLYTCTCENG.....FQGDKCCRB_DROME/310-342 CAKN....PCENG..GSCLENSE.......GNYQCFCDPN.....HSGQHCNOTC_XENLA/260-291 CPSN....NCRNG..GTCVDGVN........TYNCQCPPD.....WTGQYCURT2_DESRO/87-120 CSEL....RCFNG..GTCWQAAS......FSDFVCQCPKG.....YTGKQCTENA_CHICK/187-218 CSEPACPRNCLNR..GLCVRG............KCICEEG.....FTGEDCFA12_HUMAN/98-130 CSKHS...PCQKG..GTCVNMP........SGPHCLCPQH.....LTGNHCO01768/1799 1833 CVGH ECLNG GFCSYANS NRSLPHCICPSG FTGDHC

Pfam: EGF Motiv Sequenzabgleich

seed 73representative 1025full 5323

Proteom -49-

O01768/1799-1833 CVGH....ECLNG..GFCSYANS.....NRSLPHCICPSG.....FTGDHCNOTC_XENLA/22-56 CTQTA..EMCLNG..GRCEMTPG.......GTGVCLCGNL.....YFGERCO01768/1878-1912 CQKQP..NWCHNG..GRCLDTPGY.......PGKCKCLPR.....FAGPRCCRB_DROME/2034-2069 CNATD...LCLNG..GRCVESCG.....AKPDYYCECPEG.....FAGKNCCRB_DROME/549-580 CNATN..GKCLNG..GTCSMNG..........THCYCAVG.....YSGDRCNOTC_DROME/100-135 CNSM....RCQNG..GTCQVTFRNG....RPGISCKCPLG.....FDESLCPGH2_HUMAN/22-54 CSH.....PCQNR..GVCMSVG.......FDQYKCDCTRT....GFYGENCPGH1_HUMAN/36-68 CYY.....PCQHQ..GICVRFG.......LDRYQCDCTRT....GYSGPNCDL_DROME/378-415 CSDK....PCHQ...GICRNVRPGLGS.KGQGYQCECPIG.....YSGPNCSLIT_DROME/1052-1085 CSPEF..NPCANG..AKCMDHFT........HYSCDCQAG.....FHGTNCSLIT_DROME/935-967 CFEQ....PCQNQ..AQCVALPQ.......REYQCLCQPG.....YHGKHCMFGM_MOUSE/68-107 CSPN....PCYND..AKCLVTLDTQRGDIFTEYICQCPVG.....YSGIHCO01768/1955-1985 CSE......CSNE..AKCIKKPS.......GTVICQCPQG.....LGGEYCGRFA_VARV/45-80 CGPEG.DRYCFH...GICIHARD......IDGMYCRCSHG.....YTGIRCAGRI_CHICK/1489-1521 CDPT....PCHIS..ATCLVLPE.......GGAMCACPMG.....REGEFCMEPA_MOUSE/675-710 CDPN....PCQNE..GTCVNVKG........MASCRCVSG.HAFFYAGERCAGRI_CHICK/1450-1482 CHPN....PCHHG..ASCHVKEA.......EMFHCECLHS.....YTGPTCFA12_HUMAN/178-209 CRTN....PCLHG..GRCLEVE........GHRLCHCPVG.....YTGPFCAGRI_CHICK/1233-1264 CDSH....PCLHG..GTCEDDG........REFTCRCPAG.....KGGAVCDL_DROME/260-288 CVLEP...NCIH...GTCNKP...........WTCICNEG.....WGGLYCPRTS_BOVIN/121-154 CNPL....PCNEDGFMTCKDGQ........ATFTCICKSG.....WQGEKCAMPR_HUMAN/146-181 CNAEF.QNFCIH...GECKYIEH......LEAVTCKCQQE.....YFGERCEGF_HUMAN/976-1012 CPLSH.DGYCLHD..GVCMYIEALD......KYACNCVVG.....YIGERC

Suche nach dem Gen zum Protein

Proteom -50-

SRS Suche in Gen-Datenbanken

Datenbank auswählenRefSeq - nicht redundant- bekannte Gene- nachbearbeitet

Suchworte

Proteom -51-

14 Treffer

Genomdatenbank: Ensembl

Proteom -52-

Stand der Human-Genom Sequenzierung

Ensembl (Januar 2007)

Proteom -53-

Nature Oktober 2004 Band 431 Seite 931

EGF Eintrag in Esembl

Proteom -54-

Proteom -55-

Ensembl vom Chromosom zum

Protein

NCBI Map viewer - EGF

Proteom -56-

Suche nach sequenzähnlichen Proteinen

Proteom -57-

• Vorgefertigte Sequenzvergleichsdatenbanken

• z.B.– Pfam

– ClusTr

• Eigene Suche mit Sequenzvergleichsprogrammen

• z.B.– BLAST

– FastA

Beziehung zwischen Proteinen

Ortholog = gemeinsamer Ursprung, Evolution der SpeziesParalog = Gendublikation, Evolution in einer SpeziesAnaloge = Koevolution

Nahe Homologe

Entfernte Homologe

Proteom -58-

weit entfernte Homologe Analoge

Annu Rev Biochem, 2005, 74, 867

Alignment, Identity, Homology, Similarity

• Alignment: The process of lining up two or more sequences to achieve maximal levels of identity (and conservation, in the case of amino acid sequences) for the purpose of assessing the degree of similarity and the possibility of homology.

• Conservation: Changes at a specific position of an amino acid (or less commonly, DNA) sequence that preserve the physico-chemical properties of the original residue

Proteom -59-

the original residue.

• Homology: Similarity attributed to descent from a common ancestor.

• Identity: The extent to which two (nucleotide or amino acid) sequences are invariant.

• Similarity: The extent to which nucleotide or protein sequences are related. The extent of similarity between two sequences can be based on percent sequence identity and/or conservation. In BLAST similarity refers to a positive matrix score.

Die Suchprinzipien in Sequenzdatenbanken –wie finde ich eine ähnliche Sequenz (DNA/Protein)?

logische Algorithmen

Smith-Waterman Algorithmusmathematisch vollständige Suchel iefert exakt nur die gegebenen Parameterlangsam

heuristische Algorithmen

BLAST ("Basic Local Alignment and Search Tool")neuere Varianten BLASTP für Proteine in Protein Datenbanken

BLASTX für DNA in Protein DatenbankenBLASTN für DNA in DNA Datenbanken

Proteom -60-

BLASTN für DNA in DNA Datenbanken

PSI BLAST ("Position Specific Iterated BLAST)Weiterentwicklung von BLAST, erlaubt Lücken,erstellt intermediäres Profil (eine Art Konsensus-Sequenz)

FASTAPrinzip Punkt-Grafikschnell (ca. 10 bis 100 mal schneller als exakte Suche)beste Übereinstimmung wird durch Parameter festgelegt

Profil gestützte Algorithmen

Hidden Markov Modelle (HMM)aus paarweisen Sequenzabgleichen wird ein Profil erstellt mit Positions-spezifischer Informationmeist Suche mit bereits vorhandenen HMMErstellung eigener HMM möglich

Suche auf DNA oder Protein-Ebene?

• DNA: nur 4 Nukleotide - Protein: 20 Aminosäuren, ähnliche Austausche

• Suche auf Aminosäure-Ebene besser geeignet für funktionale Vergleiche

• Gendatenbanken werden automatisch übersetzt z.B. TrEMBL

Proteom -61-

• Die Wahrscheinlichkeit für einen Aminosäureaustausch muss mathematisch erfasst werden.

Abfrage: DNA Protein

Datenbank: DNA Protein

Lokaler und Globaler Sequenzabgleich

Proteom -62-

NCBI BLAST

Proteom -63-Altschul et al., J Mol Biol 1990 215:403-10

BLAST auf der EBI Webseite

Proteom -64-

http://www.ebi.ac.uk/blast2/

BLAST Ausgabe

Score ESequences producing significant alignments: (bits) Value

gi|208343|gb|AAA72563.1| epidermal growth factor >gi|208520... 186 1e-46 gi|46242544|gb|AAS83395.1| epidermal growth factor [Homo sa... 186 1e-46 gi|4503491|ref|NP_001954.1| epidermal growth factor (beta-u... 186 1e-46 gi|55623060|ref|XP_517395.1| PREDICTED: epidermal growth fa... 186 1e-46 gi|11225524|gb|AAG33031.1| PR-S/epidermal growth factor fus... 186 1e-46 gi|207908|gb|AAA72814.1| epidermal growth factor 186 1e-46 gi|40288425|gb|AAR84237.1| truncated epidermal growth facto... 186 1e-46 gi|16975129|pdb|1JL9|B Chain B, Crystal Structure Of Human ... 180 8e-45 gi|37927454|pdb|1P9J|A Chain A, Solution Structure And Dyna... 169 2e-41 gi|938287|emb|CAA42102.1| epidermal growth factor [Sus scro... 145 3e-34

Proteom -65-

...insgesamt 117 Treffer

Ein Treffer als Beispielgi|47522862|ref|NP_999185.1| epidermal growth factor [Sus scrofa]

gi|13324649|gb|AAK18830.1| epidermal growth factor precursor [Sus scrofa]

gi|55977733|sp|Q00968|EGF_PIG Pro-epidermal growth factor precursor (EGF)

Length = 1214

Score = 145 bits (335), Expect = 3e-34

Identities = 45/53 (84%), Positives = 48/53 (90%)

Query: 1 NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR 53

NS SECP SHDGYCLH GVCMYIEA+D YACNCV GY+GERCQ+RDLKWWELR

Sbjct: 970 NSYSECPPSHDGYCLHGGVCMYIEAVDSYACNCVFGYVGERCQHRDLKWWELR 1022

Der E-Wert (expectation value)

• Der Treffer einer Suchanfrage ist gut, wenn die Wahrscheinlichkeit ihn zufällig zu finden gering ist. Diese Eigenschaft wird durch den E-Wert beschrieben.

• Der E-Wert hängt von dem Suchalgorithmus und der Größe der Datenbank ab.

• Je kleiner der E-Wert desto besser.

Proteom -66-

• Durch Probieren lassen sich für eine Abfrage sinnvolle E-Werte ermitteln.

Die Vergleichsmatrix

Scoring matrices appear in all analysis involving sequence comparison. The choice of matrix can strongly influence the outcome of the analysis. Scoring matrices implicitly represent a particular theory of evolution. Understanding theories underlying a given scoring matrix can aid in making proper choice.

Types of matrices

PAM BLOSSUM (GONNET, DNA Identity Matrix)

PAM matrices are based on an explicit evolutionary model (that is, replacements are counted on the branches of a h l i )

Proteom -67-

phylogenetic tree)

Blosum matrices are based on an implicit rather than explicit model of evolution.

The PAM matrices are based on mutations observed throughout a global alignment, this includes both highly conserved and highly mutable regions.

The Blosum matrices are based only on highly conserved regions in series of alignments forbidden to contain gaps.

The Blosum procedure uses groups of sequences within which not all mutations are counted the same.

Te following matrices are roughly equivalent...

PAM100 ==> Blosum90 PAM120 ==> Blosum80 PAM160 ==> Blosum60 PAM200 ==> Blosum52 PAM250 ==> Blosum45

A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V B Z X *A 4 -1 -2 -2 0 -1 -1 0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 0 -3 -2 0 -2 -1 0 -4R -1 5 0 -2 -3 1 0 -2 0 -3 -2 2 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 -1 0 -1 -4N -2 0 6 1 -3 0 0 0 1 -3 -3 0 -2 -3 -2 1 0 -4 -2 -3 3 0 -1 -4D -2 -2 1 6 -3 0 2 -1 -1 -3 -4 -1 -3 -3 -1 0 -1 -4 -3 -3 4 1 -1 -4

Die PAM Vergleichsmatrix

PAM scale (Percent Accepted Mutation) von Margaret O. Dayhoff 1978:

- Abgeleitet aus den bekannten Austauschen nahe verwandter Proteine - Gibt die Wahrscheinlichkeit für den Austausch einer Aminosäure gegen eine andere während derEvolution wieder.

- Ursprünglich 1572 Austausche in 72 Proteinfamilien mit je >= 85% Ähnlichkeit- Für evolutionär unterschiedlich entfernte Proteine gibt es angepasste Varianten (PAM 60, PAM 250)

Proteom -68-

C 0 -3 -3 -3 9 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 -3 -3 -2 -4Q -1 1 0 0 -3 5 2 -2 0 -3 -2 1 0 -3 -1 0 -1 -2 -1 -2 0 3 -1 -4E -1 0 0 2 -4 2 5 -2 0 -3 -3 1 -2 -3 -1 0 -1 -3 -2 -2 1 4 -1 -4G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2 0 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -1 -4H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8 -3 -3 -1 -2 -1 -2 -1 -2 -2 2 -3 0 0 -1 -4I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4 2 -3 1 0 -3 -2 -1 -3 -1 3 -3 -3 -1 -4L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4 -2 2 0 -3 -2 -1 -2 -1 1 -4 -3 -1 -4K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5 -1 -3 -1 0 -1 -3 -2 -2 0 1 -1 -4M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5 0 -2 -1 -1 -1 -1 1 -3 -1 -1 -4F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6 -4 -2 -2 1 3 -1 -3 -3 -1 -4P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 -1 -1 -4 -3 -2 -2 -1 -2 -4S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4 1 -3 -2 -2 0 0 0 -4T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5 -2 -2 0 -1 -1 0 -4W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11 2 -3 -4 -3 -2 -4Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7 -1 -3 -2 -1 -4V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4 -3 -2 -1 -4B -2 -1 3 4 -3 0 1 -1 0 -3 -4 0 -3 -3 -2 0 -1 -4 -3 -3 4 1 -1 -4Z -1 0 0 1 -3 3 4 -2 0 -3 -3 1 -1 -3 -1 0 -1 -3 -2 -2 1 4 -1 -4 X 0 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -2 0 0 -2 -1 -1 -1 -1 -1 -4* -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 1

Die BLOSUM Vergleichsmatrix

BLOSUM (BLOcks Amino Acid SUbstitution Matrices) von Henikoff und Henikoff 1992

• Basiert auf den Austauschen in 2000 konservierten Aminosäuremustern aus 500 Proteinfamilien

• Je nach Ähnlichkeit gibt es angepasste Matrices z.B. Blosum60 für 60% identische Proteine.

• Die Werte der Matrix sind Logarithmen zur Basis 2 der Wahrscheinlichkeitsverhältnisse aus der Wahrscheinlichkeit einer richtigen Übereinstimmung geteilt durch die Wahrscheinlichkeit einer zufälligen Übereinstimmung, die mit dem Faktor zwei multipliziert wurden .

Beispiel: Sequenz A: Val Cys Asp AlaSequenz B: Val Met Glu Gly

Proteom -69-

C 9S -1 4T -1 1 4P -3 -1 1 7 BLOSUM62 Substitution MatrixA 0 1 -1 -1 4G -3 0 1 -2 0 6N -3 1 0 -2 -2 0 6D -3 0 1 -1 -2 -1 1 6E -4 0 0 -1 -1 -2 0 2 5Q -3 0 0 -1 -1 -2 0 0 2 5H -3 -1 0 -2 -2 -2 1 1 0 0 8R -3 -1 -1 -2 -1 -2 0 -2 0 1 0 5K -3 0 0 -1 -1 -2 0 -1 1 1 -1 2 5M -1 -1 -1 -2 -1 -3 -2 -3 -2 0 -2 -1 -1 5I -1 -2 -2 -3 -1 -4 -3 -3 -3 -3 -3 -3 -3 1 4L -1 -2 -2 -3 -1 -4 -3 -4 -3 -2 -3 -2 -2 2 2 4V -1 -2 -2 -2 0 -3 -3 -3 -2 -2 -3 -3 -2 1 3 1 4F -2 -2 -2 -4 -2 -3 -3 -3 -3 -3 -1 -3 -3 0 0 0 -1 6Y -2 -2 -2 -3 -2 -3 -2 -3 -2 -1 2 -2 -2 -1 -1 -1 -1 3 7W -2 -3 -3 -4 -3 -2 -4 -4 -3 -2 -2 -3 -3 -1 -3 -2 -3 1 2 11

C S T P A G N D E Q H R K M I L V F Y W

BLOSUM62 matrix value: 4 -1 2 0

Total score for alignment: 4 - 1 + 2 + 0 = 5

d.h. die Übereinstimmung ist 2(5/2) = 5,7 mal wahrscheinlicher als eine zufällige Übereinstimmung

FastA – Prinzip des Algorithmus

Sequence A

1. Ein Suchalgorithmus findet Identitäten größer einer minimalen Länge.

Sequence A

2. Eine Punktzahl wird berechnet und die 10 Besten erhalten

Proteom -70-

Sequence A

3. Übereinstimmungen, die nicht zum Treffer gehören, werden eliminiert.

4. Durch dynamische Programmierung wird der Abgleich optimiert.

Sequence A

W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988) PNAS 85:2444- 2448, W. R. Pearson (1990) Methods in Enzymology 183:63- 98).

Sequenzabgleich Darstellung

Proteom -71-

Sequenzabgleich mit ClustalW: EGF

Proteom -72-

Suche nach der Struktur von einem Protein

Proteom -73-

Protein Data Bank PDB

www.pdb.org

Proteom -74-

Klassifizierung von Proteinenz.B. CATH

Proteom -75-

http://cathwww.biochem.ucl.ac.uk/

Klassifizierung von Proteinenz.B. SCOP

Proteom -76-

http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/

Vector Alignment Search Tool VAST

Protein structure neighbors in Entrez are determined by direct

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml

Proteom -77-

NCBI's structure database is called MMDB (Molecular Modeling DataBase), and it is a subset of three-dimensional structures obtained from the Protein Data Bank (PDB), excluding theoretical models.

Protein structure neighbors in Entrez are determined by direct comparison of 3-dimensional protein structures with the VAST algorithm. Each of the more than 87,804 domains in MMDB is compared to every other one. From the MMDB Structure summary pages, retrieved via Entrez, structure neighbors are available for protein chains and individual structural domains. If you already know a PDB/MMDB-Id you can try this at once

VAST 3D Strukturabgleich1IVO:C (=EGF) ausgewähle Ergebnisse RMSD <=1A

10 20 30 40....*....|....*....|....*....|....*....|....*..

1IVO_C 5 ECPLSHDGYCLHDGVCMYIEA---LDKYACNCVVGYIGERCQYRDLK 481IVO_D 5 ECPLSHDGYCLHDGVCMYIEA---LDKYACNCVVGYIGERCQYRDLK 481XDT_R 38 dpclrkykdfcihgECKYVKE---LRAPSCICHPGYHGERCHGLS-- 791J9C_L 1 --dqcasSPCQNGGSCKdql-----qsyICFCLPAFegRNCETHKdd 40

Proteom -78-

1JL9_A 5 ecplshdGYCLHDGVCMYIEA---LDKYACNCVVGYIGERCQYRDlk 481DAN_L 46 dgdqcasSPCQNGGSCKDql-----qsYICFCLPAFEGRNCETHKdd 871FSB 1 -tascqdmscskqGECLEtig-----nytCSCYPGFYGPECEYVre- 401AUT_L 13 plehpcaslccghGTCIxgi-----gsFSCDCRSGWEGRFCQREVsf 541QFK_L 1 ---qcasSPCQNGGSCKDql-----qsYICFCLPAFEGRNCETHKDd 391O5D_L 46 dgdqcaSSPCQNGGSCKDql-----qsYICFCLPAFEGRNCETHKdd 871HAE 5 kcaekekTFCVNGGECFMvkdlsnpsRYLCKCQPGFTGARCTENVpm 511MOX_D 6 ndcpdshtqfcfhGTCRFLVQ---EDKPACVCHSGYVGARCEHADLL 491NQL_B 5 ecplshdgyCLHDGVCMYIEA---LDKYACNCVVGYIGERCQYRDLK 481FAK_L 46 dgdqcasSPCQNGGSCKDql-----qsYICFCLPAFEGRNCETHKdd 871HAF 5 kcaekekTFCVNGGECFMvkdlsnpsRYLCKCQPGFTGARCTENVpm 511FFM_A 2 dgdqcassPCQNGGSCKDQl-----QSYICFClpAFEGRNCETHKDd 43

EGF-TGFa-Betacellulin-Epiregulin

Proteom -79-

EGF-TGFa-Betacellulin-Epiregulin

Proteom -80-

Gene Ontology Nomenklaturdatenbank

Current Ontologies:The three organizing principles of GO are molecular function, biological process and cellular component.

Proteom -81-

Gene Ontology of EGF-R signaling pathway

Proteom -82-

GO - Übersicht Molekulare Funktion

Proteom -83-

Wo kann man das in Ruhe nachlesen?

Proteom -84-

National Center for Biotechnological Information NCBI

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/index.html

Proteom -85-

EBI -Datenbank Einführung

Ensembl

Proteom -86-