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Johannes Gutenberg Universität Mainz
Institut für Mikrobiologie und Weinforschung
Mikrobiologische Übung
FI – Protokoll
Teil 2a
Identifizierung, Wachstum und Regulation
06.02. – 10.02.2006
korrigierte Fassung vom 09.03.2006
Inhaltsverzeichnis
_________________________________________________________________________
Inhaltsverzeichnis
A. Bilanz der alkoholischen Gärung........................................................................... 1
1. Einleitung ........................................................................................................... 1
2. Material und Methode......................................................................................... 2
3. Ergebnisse ......................................................................................................... 2
3.1 Verfolgung des Gärablaufs ........................................................................... 2
3.2 Colorimetrische Zuckerbestimmung ............................................................. 5
3.3 Enzymatische Ethanolbestimmung............................................................... 6
3.4 Trübungsmessung........................................................................................ 7
3.5 Soll- und Ist-Werte der Gärung..................................................................... 9
3.6 C-Umsätze, Ausbeuten, Bilanzen und Erträge ............................................. 9
3.6.1 C-Umsätze................................................................................................. 9
3.6.2 Molare Ausbeuten [mmol/ml] ................................................................... 10
3.6.3 Oxidations-Reduktions-Bilanz.................................................................. 10
3.6.4 Ermittlung der Ertragskoeffizienten.......................................................... 11
4. Diskussion........................................................................................................ 11
B. Herstellung, Isolierung und Nachweis von atmungsdefizienten Mutanten........... 13
1. Einleitung ......................................................................................................... 13
2. Material und Methode....................................................................................... 14
3. Ergebnisse ....................................................................................................... 14
3.1 Stempelmethode nach Lederberg .............................................................. 14
3.2 TTC-Nachweis............................................................................................ 14
4. Diskussion........................................................................................................ 15
4.1 Stempelmethode nach Lederberg .............................................................. 15
4.2 TTC-Nachweis............................................................................................ 15
C. Kreuzfütterungstest mit Tryptophanmangelmutante............................................ 16
1. Einleitung ......................................................................................................... 16
2. Material und Methode....................................................................................... 17
3. Ergebnisse ....................................................................................................... 17
3.1 Kreuzfütterungstest..................................................................................... 17
3.2 Wachstumstest ........................................................................................... 18
Inhaltsverzeichnis
_________________________________________________________________________
4. Diskussion........................................................................................................ 18
4.1 Kreuzfütterungstest..................................................................................... 18
4.2 Wachstumstest ........................................................................................... 18
D. Ames-Test........................................................................................................... 20
1. Einleitung ......................................................................................................... 20
2. Material und Methoden..................................................................................... 22
3. Ergebnisse ....................................................................................................... 22
4. Diskussion........................................................................................................ 22
E. Literatur ............................................................................................................... 23
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Seite 1 von 26
A. Bilanz der alkoholischen Gärung
1. Einleitung Die Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae, gehört systematisch zu der Gruppe der
Schlauchpilze (Ascomyceten). In der Industrie wird die Bäckerhefe auch zur
Herstellung von Alkohol genutzt. Unter aeroben Bedingungen kann die Hefe
Substrate, wie Glucose, über die Glycolyse und den Citratzyklus abbauen und die
gebildeten Reduktionsäquivalente in die Atmungskette einschleusen. Die Hefe ist
dann in der Lage zu wachsen und sich zu vermehren.
Bei Abwesenheit von Sauerstoff kann sie Glucose zu Ethanol und Kohlenstoffdioxid
vergären.
C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2
Allerdings findet unter diesen Bedingungen nur ein geringes Wachstum statt.
Bei der Gärung werden die in der Glycolyse gebildeten Reduktionsäquivalente auf
Acetaldehyd übertragen und dadurch Ethanol gebildet.
Bei den Versuchen soll durch die Bestimmung des Verbrauchs an Zucker, der
gebildeten Zellmasse, der Bildung von Kohlenstoffdioxid und Ethanol die
Reaktionsgleichung durch das Aufstellen einer Bilanz kontrolliert werden.
Weiterhin kann durch diese Parameter die Effizienz der Gärung ermittelt werden.
Zur Bestimmung des Glucoseverbrauchs und somit eigentlich der Bildung von
Kohlenstoffdioxid wird der Gärkolben über 4 Tagen gewogen. Der
Masseverlust kann so in die Kohlenstoffbildung pro Stunde oder zwischen den
Wägungen umgerechnet werden.
Die Zuckerbestimmung erfolgt colorimetrisch. Die Glucose hat die Eigenschaft als
reduzierender Zucker ein zugesetztes Kupfer-II-Reagenz zu einem Kupfer-I-Oxid zu
reduzieren. Dieses Kupfer-I-Oxid reagiert mit Arsen-Molybdat-Reagenz zu einem
grünblauen Farbkomplex, dessen Menge photometrisch bestimmt werden kann.
Anhand einer aufgestellten Kalibrierungsgeraden kann die Glucosekonzentration am
Anfang und am Ende der Gärung ermittelt und der Glucoseverbrauch berechnet
werden.
A. Bilanz der alkoholischen Gärung Einleitung
_________________________________________________________________________
2
Die Bildung von Ethanol wird enzymatisch durch die Alkohol Dehydrogenase
katalysiert. Bei der Reaktion:
,
werden die Protonen im alkalischen Bereich durch Hydroxidionen und das
Acetaldehyd durch Semicarbazid abgefangen und das Gleichgewicht somit fast
vollständig auf die rechte Seite verlagert.
Die gebildete Menge an NADH ist dann der Menge an Ethanol äquivalent. NADH
kann photometrisch bei 366nm gemessen werden.
Die Zellzahl wird durch eine Trübungsmessung der Lösung im Gärkolben bestimmt.
Als Referenz wird eine Kalibrierungsgerade aus bekannten Verdünnungen von
Hefezelllösungen aufgestellt. Die optische Dichte wird bei 600nm in einer Küvette
gegen Wasser gemessen.
2. Material und Methode Eine genaue Beschreibung des Versuchs, die eigentliche Durchführung sowie die
Zusammensetzung der verwendeten Lösungen und Medien sind im Kursskript zu
finden.
3. Ergebnisse
3.1 Verfolgung des Gärablaufs
Während der Versuchsdauer wurde der Gäransatz regelmäßig gewogen und die
Gewichte notiert. Aus dem Gewichtsverlust kann man die gebildete Menge an CO2
berechnen.
Ethanol + NAD+ Acetaldehyd + NADH + H+Alkohol-DH
A. Bilanz der alkoholischen Gärung Ergebnis
_________________________________________________________________________
3
Tab. 1: Verfolgung des Gärablaufs
Wägung Gewicht Zeitdifferenz [min] Gewichtsdifferenz zum Anfangswert
Gewichtsdifferenz zw. den
Wägungen
Durchschnitt: CO2-Bildung / h
Datum Zeit [g] zw. den Wägungen
zum Anfangswert [g] [mg / ml] [mg / ml] [mg / ml]
6.2.06 11:40 527,2 0 0 0 0 0 0,000 15:19 527,2 219 219 0 0 0 0,000 18:40 527,2 201 420 0 0 0 0,0007.2.06 08:18 521,7 818 1238 5,5 18,33 18,33 1,344 12:15 518,1 237 1475 9,1 30,33 12 3,038 16:40 514,3 265 1740 12,9 43 12,67 2,8698.2.06 07:54 509,3 914 2654 17,9 59,67 16,67 1,094 12:00 508,5 246 2900 18,7 62,33 2,66 0,649 16:50 507,8 290 3190 19,4 64,67 2,34 0,4849.2.06 07:30 506,3 880 4070 20,9 69,67 5 0,341 10:00 506,3 150 4220 20,9 69,67 0 0,000
CO2-Bildung aus Gewichtsverlust insgesamt: 20,9 g = 69,67 mg/ml = 1,58 mmol/ml
Die höchste Gäraktivität wurde ca. 24-29 Stunden nach der Beimpfung erreicht.
y = -4E-08x6 + 8E-06x5 - 0,0006x4 + 0,0167x3 - 0,1298x2 + 0,2243x
R2 = 0,9986
-100
102030405060708090
0 20 40 60 80
Zeit [h]
f(x) =
Gew
icht
sdiff
eren
z [m
g/m
l]
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
f'(x)
= C
O2-P
rodu
ktio
n [(m
g/m
l)/h]
CO2-Produktion [mg/ml]Höchste GäraktivitätGäraktivität [(mg/ml)/h]Polynomisch (CO2-Produktion [mg/ml])
Abb. 1: Graphische Verfolgung des Gärablaufs
[mg
/ ml *
h]
A. Bilanz der alkoholischen Gärung Ergebnis
_________________________________________________________________________
4
Die Gleichung der CO2-Bildungskurve lautet:
f(x) = -4*10-8x6 + 8*10-6x5 - 0,0006x4 + 0,0167x3 - 0,1298x2 + 0,2243x
Die erste Ableitung der Gleichung lautet:
f’(x) = -24*10-8x5 + 40*10-6x4 – 0,0024x3 + 0,0501x2 – 0,2596x + 0,2243
Die Kurve der ersten Ableitung dient als Maß der Gäraktivität.
Den Zeitpunkt der höchsten Gäraktivität erhält man, wenn man den die zweite
Ableitung der Bildungskurve gleich null setzt.
f’’(x) = -120*10-8x4 + 160*10-6x3 – 0,0072x2 + 0,1002x – 0,2596
Somit liegt der Zeitpunkt der höchsten Gäraktivität 17,9 Stunden nach der
Beimpfung des Ansatzes.
Anhand der Daten aus Tabelle 1 würde man den Zeitpunkt der höchsten Gäraktivität
nach 24–29 Stunden erwarten. Da die Wägungen jedoch in relativ großem Abstand
zueinander durchgeführt wurden ist diese Abschätzung sehr wage. Der errechnete
Wert auf Basis der Bildungskurve ist auf jeden Fall als exakter einzustufen.
Stufendiagramm
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 20 40 60 80
Zeit [h]
CO
2-B
ildun
g / h
[mg/
ml]
Abb. 2: Stufendiagramm der CO2-Bildung
A. Bilanz der alkoholischen Gärung Ergebnis
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5
Eine andere Darstellungsform für die CO2-Bildung pro Stunde ist das
Stufendiagramm. Da diese Darstellung direkt auf den Werten aus Tabelle 1 beruht,
liegen hier der Zeitpunkt der höchsten Gäraktivität und die höchste Treppenstufe bei
24-29 Stunden nach Versuchsbeginn.
Unter idealen Bedingungen lösen sich ca. 0,759 ml CO2 in jedem Milliliter Medium.
Demnach wären in den 300 ml Medium 227,7 ml CO2 gelöst. Dies entspricht einem
Gewicht von 407,6 mg. Im Volumen über dem Medium (235 ml), das am Ende des
Versuches vollständig mit CO2 gesättigt vorliegt, befinden sich demnach 235 ml oder
422 mg CO2. Nachdem im Verlauf der Gärung ca. 21g CO2 produziert wurden und
den Kolben verlassen haben, ist der Einfluss der verbliebenen 829,6 mg auf die
Berechnung der Gärungsbilanz zu vernachlässigen.
Sauerstoff löst sich unter idealen Bedingungen mit 0,029 ml / ml Medium. Demnach
befanden sich zu Beginn des Versuches 8,7 ml in den 300 ml Medium. Dies
entspricht 11,36 mg. Im Volumen über dem Medium (235 ml) befinden sich bei 21%
Volumenanteil Sauerstoff in der Luft 49,35 ml oder 64 mg Sauerstoff. Die Menge an
Sauerstoff im Medium und in der Gasphase würde gerade einmal ausreichen um
71,1 mg Glucose zu veratmen. Da aber mehr als 160mg/ml Glucose eingesetzt
wurden, ist der Anteil der veratmeten Glucose sehr gering.
3.2 Colorimetrische Zuckerbestimmung
Mit Hilfe von Glucoseproben bekannter Konzentration wurde eine Glucose-
Standardkurve erstellt, mit der die Proben P1 und P2 des Gäransatzes bestimmt
werden können.
A. Bilanz der alkoholischen Gärung Ergebnis
_________________________________________________________________________
6
Tab. 2: Gemessene und berechnete Werte zur Bestimmung der Glucosekonzentration
Glucose- konzentration
[µg/ml]
E [λ:
546nm] ∆E x =
y/0,0063 VerdünnungsfaktorZuckergehalt
der Probe [mg/ml]
0 Blindwert 0,091 0 25 0,265 0,17450 0,39 0,29975 0,536 0,445100
Meßreihe
0,754 0,663
Probe A 0,519 0,428 67,937 2500 169,841 P1 unvergorene Nährlösung Probe B 0,518 0,427 67,778 2500 169,444
MW P1 169,643 P2 vergorene Nährlösung
0,205 0,114 18,095 200 3,619
Vor Beginn des Versuches befanden sich 169,643 mg Glucose pro ml Medium im
Ansatz. Am Ende des Versuches waren nur noch 3,619 mg/ml Glucose enthalten.
y = 0,0063xR2 = 0,99090
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 50 100 150
Glucosekonzentration [µg/ml]
OD
(546
nm)
StandardreiheMeßwerteKalibrierungsgerade
Abb. 3: Kalibrierungsgerade und graphische Darstellung der Glucosebestimmung
3.3 Enzymatische Ethanolbestimmung
Die Bestimmung des gebildeten Ethanols wird auf indirektem Wege über die
photometrische Messung von NADH durchgeführt. Die Menge an gebildetem NADH
ist dabei der Menge an Ethanol äquivalent.
A. Bilanz der alkoholischen Gärung Ergebnis
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Tab. 3: Enzymatische Ethanolbestimmung
E0 E1 ∆E1
(E1-E0) ∆E
(∆E1-∆E1 Leerwert)Ethanol [mg/ml]
Ethanol [mmol/ml]
Leerwert 0,087 0,202 0,115 0 Probe a 0,094 0,38 0,286 0,171 78,78 1,71 Probe b 0,087 0,387 0,3 0,185 85,23 1,85
Zur Berechnung der Ethanolmenge wurde die folgende Formel verwendet:
]/[**1000***
*)( lgFEvdMGVEthanolc ∆=
ε
]/[78,78]/[2000*171,0*1000*1,0*1*3,307,46*65,1)( lglgEthanolc ==
V: Testvolumen (1,65ml)
MG: Ethanol 46,07 g/mol
ε: Extinktionskoeffizient von NADH bei 366nm: 3,3 [l*mmol-1*cm-1]
F: Verdünnungsfaktor (2000)
d: Schichtdicke der Küvette (1cm)
ν: Probevolumen (0,1ml)
Bei der Vergärung von Glucose sind 1,78 mmol/ml Ethanol entstanden.
Berechnung: Ethanolmenge in mg/ml / MG (Ethanol) = 78,78 / 46,07 = 1,71 mmol/ml
3.4 Trübungsmessung
Mit Hilfe der Trübungsmessung wird die Masse der Mikroorganismen im
Gärungsansatz bestimmt. Dafür wurde zuvor eine Kalibrierungskurve mit
Hefesuspensionen unterschiedlicher Verdünnungsstufen aufgestellt.
A. Bilanz der alkoholischen Gärung Ergebnis
_________________________________________________________________________
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Tab. 4: Gemessene Extinktion der Kalibrierungskurve
Konzentration [mg/ml]
Optische Dichte
0 0 0,1 0,083 0,2 0,182 0,4 0,381 0,6 0,555 0,8 0,703 1 0,873 2 1,266 4 1,683 6 - 8 -
10 -
Trübungsmessung
y = 0,8894xR2 = 0,9977
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Hefekonzentration [mg/ml]
OD
(600
nm)
StandardreiheMeßwertKalibrierungsgerade
Abb. 4: Kalibrierungskurve der Trübungsmessung
In der Abbildung 4 ist die Kalibrierungsgerade graphisch dargestellt. Außerdem ist
der Messwert der Hefezellmassenbestimmung eingezeichnet.
Tab. 5: Bestimmung der Hefezellmasse
Extinktion [600nm]
Hefe [mg/ml] (Kalibrierungskurve)
Verdünnungs- faktor
Naßgewicht Hefe
[mg/ml] Gärlösung
TS [mg/ml]
GärlösungTS [mg/ml]
Literaturwert
0,958 1,077 10 10,77 3,23 3,39
Nach photometrischer Bestimmung des Nassgewichtes kann die Trockenmasse der
Hefezellen berechnet werden. Dafür werden 30% des Nassgewichtes veranschlagt.
Der Literaturwert der Trockenmasse berechnet sich aus der Annahme, dass
A. Bilanz der alkoholischen Gärung Ergebnis
_________________________________________________________________________
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100 mg/ml Glucose zur Bildung von 2mg Zellsubstanz verwendet werden.
Dementsprechend werden aus 169,643 mg/ml Glucose 3,39 mg/ml Zellsubstanz
gebildet.
3.5 Soll- und Ist-Werte der Gärung
Der gemessene Glucoseverbrauch lag bei 166,02mg/ml oder 0,92mmol/ml Glucose.
Aus der umgesetzten Glucose werden folgende Produkte gebildet:
Tab. 6: Soll- und Ist-Werte der Gärung
aus gemessenem Glucoseverbrauch berechneter Wert
Messwerte Differenz
mg / ml mmol / ml mg / ml
mmol / ml %
Ethanolbildung 84,86 1,845 82,005 1,78 3,4
Kohlenstoffdioxidbildung 81,14 1,845 78,32 1,78 3,5
TS aus Naßgewicht 3,23
Zur Berechnung der Differenz wurden die gemessenen Werte als 100% gesetzt.
3.6 C-Umsätze, Ausbeuten, Bilanzen und Erträge
3.6.1 C-Umsätze
a) Glucose 0,92 mmol/ml Glucose wurden verbraucht
Da ein Molekül Glucose 6 Atome Kohlenstoff enthält, wurden
5,52 mmol/ml Kohlenstoff umgesetzt.
b) Ethanol 1,78 mmol/ml Ethanol wurden gebildet
Laut Literatur sollten 1,66 mmol/ml Ethanol entstehen.
Da ein Molekül Ethanol 2 Atome Kohlenstoff enthält, wurden
im Versuch 3,56 mmol/ml Kohlenstoff umgesetzt
(Literatur: 3,32 mmol/ml).
A. Bilanz der alkoholischen Gärung Ergebnis
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c) CO2 1,58 mmol/ml Kohlenstoffdioxid wurden gebildet
Laut Literatur sollten 1,7 mmol/ml Kohlenstoffdioxid entstehen.
Da ein Molekül CO2 1 Atom Kohlenstoff enthält, wurden
im Versuch 1,58 mmol/ml Kohlenstoff umgesetzt
(Literatur: 1,7 mmol/ml).
Zur Errechnung der C-Bilanz wird die Summe aus b) und c) durch die umgesetzte
Glucosemenge (a) geteilt.
(3,56 + 1,58 / 5,52) * 100 = 93,1% Kohlenstoff wieder gefunden
Die gleiche Berechnung wurde auch für die Literaturwerte durchgeführt:
(3,32 + 1,7 / 5,52) * 100 = 90,9% Kohlenstoff wieder gefunden
3.6.2 Molare Ausbeuten [mmol/ml]
Die molare Ethanolausbeute wird wie folgt berechnet:
Ethanol gebildet / Glucose verbraucht = 1,78 mmol/ml / 0,92 mmol/ml = 1,93
Literaturwert: 1,8
Molare Kohlenstoffdioxidausbeute:
CO2 gebildet / Glucose verbraucht = 1,58 mmol/ml / 0,92 mmol/ml = 1,72
Literaturwert: 1,85
3.6.3 Oxidations-Reduktions-Bilanz
Die Oxidations-Reduktions-Bilanz errechnet sich wie folgt:
mmol oxidiert (CO2) * Statuszahl + mmol reduziert (Ethanol) * Statuszahl =
1,58 mmol/ml * 2 + 1,78 mmol/ml * (-2) = 3,16 + (-3,56) = -0,4
Literaturwerte:
1,7 mmol/ml * 2 + 1,66 mmol/ml * (-2) = 3,4 + (-3,32) = 0,08
Die Ermittlung der Statuszahlen erfolgt wie im Skript ausführlich beschrieben.
A. Bilanz der alkoholischen Gärung Ergebnis
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3.6.4 Ermittlung der Ertragskoeffizienten
a) Molarer Ertragskoeffizient
YGlc = TS [mg/ml] / Glucose Verbrauch [mmol/ml] = 3,23 / 0,92 = 3,51 mg/mmol
Literaturwert: 3,39 / 0,92 = 3,68 mg/mmol
b) Molarer Ertragskoeffizient (Energieertragskoeffizient)
YATP = TS [mg/ml] / ATP [mmol/ml] = 3,23 / 1,84 = 1,76 mg/mmol
Literaturwert: 3,39 / 1,84 = 1,84 mg/mmol
c) Ertragskoeffizient (Ökonomischer Koeffizient)
Y = TS [mg/ml] / Glucose Verbrauch [mg/ml] = 3,23 / 166,02 = 0,019
Literaturwert (Gärung): 3,39 / 166,02 = 0,02
Literaturwert (Atmung): 72,2 / 166,02 = 0,434
4. Diskussion Der Zeitpunkt der höchsten Gäraktivität konnte rechnerisch auf 17,9 Stunden nach
der Beimpfung festgelegt werden. Dies stimmt allerdings nicht mit dem aus Tabelle 1
ablesbaren Zeitintervall von 24-29 Stunden überein.
Der relativ große Unterschied von bis zu 11 Stunden zwischen dem errechneten und
dem beobachteten Wert könnte durch den großen Abstand der Messungen
zueinander erklärt werden. Weitere Messungen gerade in den ersten 24-36 Stunden
des Versuchsablaufs wären daher sinnvoll.
Der eingesetzte Zucker ist bis auf einen kleinen Rest vergoren worden. Von den
ursprünglichen 169,64 mg/ml waren am Ende nur noch 3,62 mg/ml vorhanden.
Aus dem vergorenen Zucker wurden 82 mg/ml Ethanol und 69,67 mg/ml CO2
gebildet. Zudem sind 3,23mg/ml Trockenmasse entstanden.
Dieser Wert stimmt gut mit dem errechneten Literaturwert von 3,39 mg/ml
Trockenmasse überein.
Beim Vergleich der gemessenen und berechneten Soll- und Ist-Werte der Ethanol-
und Kohlenstoffdioxidbildung treten nur geringe Abweichungen von 3,4-3,5% auf.
Bei der Berechnung der C-Bilanzen konnte festgestellt werden, dass 93,1% aller
Kohlenstoffatome in Ethanol und Kohlenstoffdioxidverbindungen wieder gefunden
werden konnten.
A. Bilanz der alkoholischen Gärung Diskussion
_________________________________________________________________________
12
Auch hier stimmt der ermittelte Wert gut mit dem Literaturwert von 91% überein. Die
fehlenden 6,9% der Kohlenstoffatome gehen entweder in Verbindungen der Zellen
oder andere Nebenprodukte über, die bei der Aufstellung der Gärbilanz
vernachlässigt wurden.
Die molare Ausbeute von Ethanol ist im Vergleich zum Literaturwert von 1,8 mit 1,93
geringfügig höher. Dagegen ist die molare Kohlenstoffdioxidausbeute von 1,72
etwas geringer ausgefallen als zu erwarten gewesen wäre (Literaturwert: 1,85).
Die ermittelte Oxidations-Reduktions-Bilanz von -0,4 ist nicht ausgeglichen. Im
Gegensatz zum Literaturwert von 0,08 wurde mehr Ethanol (Reduktion) als CO2
(Oxidation) gebildet.
Der molare Ertragskoeffizient liegt mit 3,51 mg Trockenmasse pro mmol
umgesetzter Glucose niedriger als der Literaturwert von 3,68 mg/mmol. Auch der
Energieertragskoeffizient (1,76 mg/mmol) liegt um 0,08 mg/mmol niedriger als der
Literaturwert von 1,84 mg/mmol.
Dass die beiden oben genannten Ertragskoeffizienten niedriger ausfallen als der
Literaturwert erwarten ließe, liegt auch an der im Bezug zum Literaturwert
niedrigeren Trockenmasseproduktion.
Der ökonomische Ertragskoeffizient liegt bei 0,019. Der Literaturwert des
ökonomischen Ertragskoeffizienten bei der Gärung (0,02) entspricht dem ermittelten,
während der Literaturwert bei der Atmung (0,434) wesentlich höher ausfällt. Anhand
dieser Werte wird offensichtlich, dass bei der Atmung wesentlich mehr
Trockenmasse pro Glucoseeinheit gebildet wird und dass der Vorgang der Atmung
effizienter als die Gärung ist.
Insgesamt gesehen stimmen die Ergebnisse des Versuches gut mit den errechneten
Literaturwerten überein. Trotz kleinerer Abweichungen wurde die Glucose
entsprechend der Stöchiometrie der Reaktionsgleichung zu Ethanol und CO2
umgesetzt. Somit wird 1 Mol (0,92 Mol) Glucose zu 2 Mol (1,78 Mol) Ethanol und 2
Mol (1,58Mol) CO2 umgesetzt.
B. Herstellung, Isolierung und Nachweis von atmungsdefizienten Mutanten Einleitung
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Seite 13 von 26
B. Herstellung, Isolierung und Nachweis von atmungsdefizienten Mutanten
1. Einleitung Die meisten Hefepilze haben sowohl die Fähigkeit zu atmen als auch zu gären.
Allerdings ist die Fähigkeit zur Atmung genetisch bedingt, so dass in einer normalen
Hefepopulation auch ca. 1% atmungsdefiziente Mutanten zu finden sind, die diese
Fähigkeit durch eine spontane Mutation verloren haben.
Man kann solche atmungsdefizienten Mutanten aber auch künstlich durch Zugabe
einer mutationsauslösenden Agenz erzeugen. Im vorliegenden Versuch wird
Ethidiumbromid (EB) eingesetzt um Mutationen im Genom der Hefezellen
(Saccharomyces cerevisiae) auszulösen. Ethidiumbromid ist ein Agenz, das sich
zwischen die Basen der DNA legt (interkaliert) und somit bei der Replikation zu
Baseninsertionen oder –deletionen führt. Dies führt zu einer Rasterschubmutation,
die sämtliche genetische Informationen hinter der Mutationsstelle unbrauchbar
macht. Die in diesem Versuch gebildeten Mutanten bilden auf dextrosehaltigen
Nährböden (YEPD-Agar) kleine Kolonien und können auf glycerinhaltigen
Nährböden (YEPG-Agar) überhaupt nicht wachsen.
Die Unfähigkeit auf Glycerinagar zu wachsen liegt an einem Mangel an freiem NAD+.
Bei der Glycerinverwertung entstehen neben Dihydroxyacetonphosphat zwei NADH,
von denen aber nur eines über die Gärung (Ethanolbildung) zu NAD+ oxidiert
werden kann. Damit steht der Zelle kein freies NAD+ mehr zur Verfügung und keine
ATP-Bildung ist mehr möglich. Zur Identifizierung der Mutanten wird die
Stempelmethode nach Lederberg verwendet. Dabei werden Hefekolonien von einer
Matrizenplatte auf YEPD und YEPG Agarböden gestempelt. Atmungsdefiziente
Stämme sind dann an einem Wachstum auf YEPD-Agar zu erkennen. Auf YEPG-
Agar wachsen sie nicht.
Des Weiteren werden atmungsdefiziente Mutanten mit Hilfe von EB hergestellt.
Diese können dann durch Überschichtung mit triphenyltetrazoliumchloridhaltigem
Agar (TTC-Agar) nachgewiesen werden. Die Mutanten sind aufgrund des defekten
Atmungskettenaparates nicht in der Lage TTC zu rotem Triphenylformazan zu
reduzieren.
B. Herstellung, Isolierung und Nachweis von atmungsdefizienten Mutanten Einleitung
_________________________________________________________________________
14
Dementsprechend erscheinen intakte Kolonien rötlich gefärbt, während mutierte
Kolonien weiß bleiben. Zur Versuchsauswertung wird der Prozentsatz der
geschädigten Zellen auf der YEPD-Agarplatte bestimmt.
2. Material und Methode Die genaue Versuchsbeschreibung sowie die Zusammensetzungen der
verwendeten Lösungen sind ausführlich im Skript beschrieben.
Für den Nachweis der Mutanten mit TTC wurden die YEPD-Agarplatten mit der
Bakterienverdünnungsstufe 10-7 verwendet.
3. Ergebnisse
3.1 Stempelmethode nach Lederberg
Abb. 5: Ergebnisse der Stempelmethode nach Lederberg
3.2 TTC-Nachweis Tab. 7 Ergebnisse des TTC-Nachweises
Anzahl der KBE auf YEPD - Agar Verdünnungsstufe:
10-7 weiß rot
Anzahl der geschädigten Organismen [%]
YEPD 0 39 0 YEPD + EB 52 2 96
YEPD-Agarplatte YEPG-Agarplatte
B. Herstellung, Isolierung und Nachweis von atmungsdefizienten Mutanten Diskussion
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4. Diskussion
4.1 Stempelmethode nach Lederberg
Auf der YEPD-Agarplatte waren alle vier Stämme zum Wachstum befähigt. Die in
der Grafik (Abb. 5) schwarz eingefärbten Stämme wuchsen dabei wesentlich stärker
als die weißgefärbten Stämme, die nur kleine Kolonien bildeten. Auf der YEPG-
Agarplatte wuchsen nur die Stämme, die auf der YEPD-Platte das stärkere
Wachstum aufwiesen. Die beiden anderen Stämme konnten nicht wachsen und sind
damit als atmungsdefizient einzustufen. Dass das Wachstum der
atmungsdefizienten Mutantenstämme auch auf der YEPD-Platte schwächer ausfällt,
liegt an ihrer Art der Energiegewinnung. Da sie nicht atmen können, müssen sie das
Substrat durch Gärung abbauen. Die Gärung zeichnet sich durch eine geringere
ATP- und Zellmassenbildung aus, was dann zu einem schwächeren Wachstum
führt.
4.2 TTC-Nachweis
Für den TTC-Nachweis wurden die YEPD-Agarplatten mit der Verdünnungsstufe
10-7 verwendet. Auf dem YEPD-Agar waren sämtliche Kolonien rot gefärbt und damit
als intakt gekennzeichnet. Die Rate der atmungsdefizienten Mutanten betrug hier
also 0%.
Auf dem mit Ethidiumbromid behandelten Agar betrug die Rate der Mutanten über
96%. Diese Kolonien zeichneten sich durch eine weiße Färbung aus. Mit dem
Versuch konnte bewiesen werden, welche mutagene Potenz EB besitzt.
C. Kreuzfütterungstest mit Tryptophanmangelmutante Einleitung
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C. Kreuzfütterungstest mit Tryptophanmangelmutante
1. Einleitung In diesem Versuch werden auxotrophe Tryptophanmangelmutanten verwendet. Die
auxotrophen Mutanten haben die Fähigkeit verloren ein Biosyntheseenzym zu bilden
und bedürfen daher für ein normales Wachstum des Endproduktes des blockierten
Syntheseweges. Der Enzymdefekt kann nun an verschiedenen Stellen des
jeweiligen Syntheseweges liegen. Aufgrund dieser Tatsache ist es manchen
Mutanten möglich mit Intermediärprodukten des Syntheseweges zu wachsen, die
nach dem Block in die Synthesekette eingeschleust werden. Bei sehr späten
Blöcken kann dann nur noch die Zugabe des Endproduktes der Synthesekette ein
Wachstum ermöglichen.
Durch den Enzymdefekt können Intermediärprodukte, die vor dem Block anfallen,
nicht mehr weiterverarbeitet werden und stauen sich auf (Akkumulation). Diese
Zwischenprodukte werden dann meist ausgeschieden. Befinden sich in der Nähe
des betroffenen Organismus andere Mikroorganismen mit einem anderen Block im
gleichen Syntheseweg, so können sie die ausgeschiedenen Zwischenprodukte
aufnehmen und in ihren eigenen Stoffwechsel einschleusen. In vielen Fällen wird
dadurch ein Wachstum der anderen Mikroorganismen ermöglicht, sie werden von
den ausscheidenden Mikroorganismen gefüttert. Durch Kombination von
Organismen mit verschiedenen Blocks in der gleichen Synthesekette kann die
Reihenfolge der einzelnen Blocks bei den Organismen bestimmt werden. In diesem
Versuch werden drei verschiedene Hefekulturen (Saccharomyces cerevisiae) mit
unterschiedlichen Blocks in der Tryptophansynthesekette eingesetzt. Dabei handelt
es sich um die Stämme HK51, HK78 und HK145.
Die Tryptophansynthese verläuft über folgende Zwischenprodukte:
Shikimisäure → Chorisminsäure → Anthranilsäure → Indol → Tryptophan
Im so genannten Kreuzfütterungstest werden tryptophanfreie Nährböden mit jeweils
einer Kultur versetzt. Auf die Nährböden werden alle Kulturen ausgestrichen. Wenn
nach der Bebrütung ein Wachstum der Stämme zu sehen ist, kann man davon
C. Kreuzfütterungstest mit Tryptophanmangelmutante Einleitung
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ausgehen, dass der im Agar vorhandene Stamm den ausgestrichenen, wachsenden
Stamm gefüttert hat.
Des Weiteren wird ein Wachstumstest durchgeführt, mit dem der Biosyntheseblock
der eingesetzten Mangelmutante lokalisiert werden kann. Die Mutanten werden
dafür in Minimalmedien kultiviert, denen jeweils ein Intermediärprodukt des
Tryptophansyntheseweges beigefügt ist (Chorisminsäure wird nicht eingesetzt!).
Liegt der genetische Block vor dem Intermediärprodukt kann es zur weiteren
Synthese verwendet werden und ein Wachstum ist möglich. Liegt der Block dahinter,
kann kein Wachstum stattfinden.
2. Material und Methode Die genaue Versuchsbeschreibung sowie die Zusammensetzungen der
verwendeten Lösungen sind ausführlich im Skript beschrieben.
Für den Wachstumstest wurde der Mutantenstamm HK78 verwendet.
3. Ergebnisse
3.1 Kreuzfütterungstest
Abb.6: Ergebnisse des Kreuzfütterungstests
C. Kreuzfütterungstest mit Tryptophanmangelmutante Ergebnis
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3.2 Wachstumstest Tab. 1: Ergebnisse des Wachstumstest mit der Mangelmutante HK78
a b c d e Zusatz zum
Minimalmedium Shikiminsäure Anthranilsäure Indol Tryptophan Kontrolle Wachstum der
Mutante (Trübung) HK 51
- - - + -
Wachstum der Mutante (Trübung)
HK 78 - + + + -
Wachstum der Mutante (Trübung)
HK 145 - - + + -
4. Diskussion
4.1 Kreuzfütterungstest
In Abbildung 1 ist zu erkennen, dass die Stämme HK78 und HK145 in der Lage sind
auf dem Nährboden mit dem Stamm HK51 zu wachsen. Das bedeutet, dass der
genetische Block des Stammes HK51 hinter denen der beiden anderen Stämme
liegen muss. Auf dem Nährboden mit dem Stamm 78 ist keinerlei Wachstum zu
erkennen. Das bedeutet, dass der Block des Stammes 78 am Anfang der
Synthesekette liegen muss und keine verwertbaren Intermediärprodukte
ausgeschieden werden. Auf dem Nährboden mit HK145 ist nur HK78 in der Lage zu
wachsen. Dementsprechend muss der Block des Stammes HK145 hinter dem des
Stammes HK78 liegen. Zusammengefasst ergibt sich folgende Reihenfolge der
Syntheseblocks:
HK78 → HK145 → HK51
4.2 Wachstumstest
Im Wachstumstest hat sich gezeigt, dass bei Zugabe des Endprodukts Tryptophan
alle Stämme gewachsen sind.
Mit Shikiminsäure als Intermediärprodukt waren die Zellen nicht in der Lage zu
wachsen. Bei Zugabe von Anthranilsäure und Indol war jedoch ein Wachstum des
Stamms HK78 festzustellen. Anhand der ermittelten Daten lässt sich in
C. Kreuzfütterungstest mit Tryptophanmangelmutante Diskussion
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Übereinstimmung mit dem Kreuzfütterungstest ein relativ früher Block in der
Synthesekette feststellen. Fraglich ist nun ob der Block des Stamms 78 zwischen
der Shikiminsäure und Chorisminsäure oder zwischen der Chorisminsäure und der
Anthranilsäure liegt, da Chorisminsäure beim Test nicht eingesetzt wurde.
Der Stamm HK51 weist den Block zwischen Indol und Tryptophan auf, da er bei
Zugabe mit Tryptophan wächst, allerdings Indol nicht zu Tryptophan umsetzen kann
und somit dort kein Wachstum aufweist.
Der Stamm HK145 wächst nur bei Zugabe von Indol und Tryptophan. Somit kann
man schlussfolgern, dass der Block des Stamms HK145 zwischen Anthranilsäure
und Indol liegt. Die Kontrolle ohne Intermediärprodukte war jeweils negativ.
D. Ames-Test Einleitung
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D. Ames-Test
1. Einleitung Der 1973 entwickelte Ames-Test dient zur Erkennung und Quantifizierung
mutagener Substanzen. Als Indikatororganismus dient eine auxotrophe his-
Mangelmutante von Salmonella typhimurium. Sie ist Aufgrund eines genetischen
Defektes in der Histidin Biosynthese (Punktmutation G46) nicht in der Lage auf
einem histidinfreien Minimalagar zu wachsen. Durch Kultivierung der
Mangelmutanten in Gegenwart der zu testenden mutagenen Agenzien kann es nun
zu weiteren Mutationen im Genom der Mutanten kommen. Wenn eine neue Mutation
genau in dem Bereich der DNA stattfindet, wo das defekte his-Gen liegt, kann die
zur his-Auxotrophie führende Mutation revertiert werden. Die Organismen sind dann
im Bezug auf die Histidin Synthese wieder prototroph und können nun auch auf dem
histidinfreien Minimalagar wachsen. Als Maß für die Mutagenität der getesteten
Substanz dient die Anzahl der Revertanten auf den Minimalagarplatten.
Damit das Testsystem so funktionieren kann, müssen die Indikatororganismen
neben der his-Mangelmutation noch andere Eigenschaften besitzen. So verfügen sie
auch über einen Defekt im Exzisions-Reparatursystem (∆uvrB-Mutation), dass
normalerweise dafür sorgt, dass fehlerhafte DNA-Sequenzen herausgeschnitten und
korrigiert werden. Des Weiteren sind sie Träger einer rfa-Mutation. Durch diesen
Defekt werden die Lipopolysaccharide der Zellwand so verändert, dass die
Permeabilität der Zellwand heraufgesetzt wird und eine Vielzahl von Substanzen
leichter in die Zelle eindringen kann.
Eine weitere wichtige Vorraussetzung für die korrekte Funktion des Testes ist das
Vorhandensein einer geringen Histidinmenge im eigentlichen
Histidinmangelmedium. Ohne Histidin sind die Organismen nicht in der Lage zu
wachsen. Wenn jetzt eine Mutation auftritt, die eine Reversion der Auxotrophie
bewirkt, wird diese erst in der folgenden Bakteriengeneration phänotypisch sichtbar.
Daher muss gerade soviel Histidin vorhanden sein, dass die Indikatororganismen
sich teilen können und die Reversion auf die folgenden Generationen weitergegeben
wird.
D. Ames-Test Einleitung
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Zur Durchführung des Testes wird ein histidinfreier Minimalagar in eine Petrischale
gegossen. Die Indikatororganismen werden in flüssigen Topagar suspendiert und
über die Agarplatte gegossen. Auf den so vorbereiteten Testagar wird nun die
Testsubstanz zentral aufgetragen.
Nach der Bebrütung erkennt man ringförmig um den Auftragspunkt herum eine
Hemmzone, die auf den toxischen Eigenschaften der mutagenen Substanz beruht.
In diesem Bereich ist kein Bakterienwachstum möglich. In der nächsten ebenfalls
kreisförmigen Zone befinden sich relativ viele Revertanten, bei denen die
Testsubstanz die revertierenden Mutationen ausgelöst hat. In einer dritten Zone
findet man vereinzelte Bakterien (-kolonien) die durch Spontanmutationen die
Fähigkeit zur Histidinsynthese zurückerlangt haben.
Folgende Substanzen werden auf ihre Mutagenität getestet:
EMS (Ethylmethansulfonat)
MMS (Methylmethansulfonat)
DMS (Dimethylsulfat)
DES (Diethylsulfat)
MNNG (N-Methyl-N’-Nitro-N-Nitrosoguanidin)
EB (Ethidiumbromid)
Glyoxylsäure
Natriumchlorid
Extrakt aus Zigarettenkippen
D. Ames-Test Diskussion
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2. Material und Methoden Die genaue Durchführung des Versuches ist im Kursskript beschrieben. Auch die
Zusammensetzungen der verwendeten Lösungen und Nährmedien sind dort zu
finden.
3. Ergebnisse Die Platten wurden zwei Tage bebrütet und dann ausgewertet. Tab. 8: Ergebnisse des Ames-Tests
Testsubstanz Durchmesser des
Hemmhofs [cm]
Revertanten-
Ring in cm
Ethylmetansulfonat 0,9 1
Diethylsulfat 0,7 1
Methylmethansulfonat 1,1 1,2
Dimethylsulfat 2,3 -
N-Methyl-N´-Nitro-N-
Nitrosoguanidin 2
0,9
Ethidiumbromid - -
Glyoxylsäure - -
Natriumchlorid - -
Zigarette (1:10) - -
4. Diskussion EMS, MMS, DMS, DES und MNNG bezeichnet man auch als alkylierende Agenzien.
Sie übertragen Ethyl- oder Methylgruppen auf Basen der DNA und bewirken damit
eine andere Basenpaarung. Dies führt zu einer Einzelbasensubstitution die als
Transition (Austausch einer Purinbase gegen eine Purinbase) oder Transversion
(Austausch eine Purin- gegen eine Pyrimidinbase) auftreten kann. Diese
Substitutionsmutation ist eine so genannte „missense Mutation“. Durch solche
Mutationen kann es auch zu einer Reversion der his-Mutation und dadurch
bedingtem Wachstum auf dem Minimalagar kommen. Die Ergebnisse zeigen auf,
dass genau dies eingetroffen ist. Zusätzlich kann man vermuten, dass die
methylierenden Agenzien stärker mutagen sind als die ethylierenden. Dies zeigen
die größeren Hemmhöfe auf, in deren Bereich durch die hohe Konzentration der
D. Ames-Test Einleitung
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Agenzien kein Bakterienwachstum möglich ist. Anhand der Revertantenringe kann
die mutagene Wirkung der Agenzien nachgewiesen werden.
Ethidiumbromid ist eine interkalierende Substanz. Sie legt sich zwischen die Basen
der DNA und führt im Rahmen der Replikation zu Baseninsertionen oder –
deletionen. Dies führt zu einer Rasterschubmutation, die sämtliche genetische
Informationen hinter der Mutationsstelle unbrauchbar macht. Ein Wachstum ist nicht
möglich (siehe auch Tabelle 8).
Glyoxylsäure und Natriumchlorid verfügen nicht über eine mutagene Wirkung.
Natriumchlorid (Kochsalz) spielt als Na+ und Cl- Ionen eine wichtige Rolle im
zellulären Ionenhaushalt.
Glyoxylsäure ist ebenfalls eine physiologisch in der Zelle vorkommende Substanz.
Sie spielt z.B. als Intermediärprodukt des Glyoxylatzyklus eine wichtige Rolle beim
Wachstum von Escherichia coli auf Acetat.
Das Extrakt aus Zigarettenkippen wird vermutlich auch eine mutagene Wirkung
haben. Allerdings scheint hier die Konzentration des Extrakts zu gering zu sein. Es
kommt zu keinem Wachstum. Da die Inhaltsstoffe des Extraktes nicht bekannt sind,
kann hier auch über den Wirkmechanismus keine Aussage getroffen werden.
E. Literatur
Schlegel „Allgemeine Mikrobiologie“, 7. überarbeitete Auflage, Thieme Verlag, 1992
Skript „Übungen in Mikrobiologie F1-Teil2a“
