Racematspaltung des D,L-Tryptophans und D,L=Tyrosins3

Von GiiNTER LOSE

Professor Franx Runge xum 65. Geburtstage gewidmet

Inhaltsubersieht D, L-Tryptophanmethylester wird mit Dibenzoyl-D-weinsaure im Molverhaltnis 2 : 1,

D, L-Tyrosinathylester mit D-Weinsaure im Verhaltnis 1 : 2 in athanolischer Losung iiber die diastereomeren Salze in die optischen Antipoden gespalten. Die Estertartrate beider Aminosauren lassen sich leicht in die antipodischen Esterhydrochloride iiberfiihren, aus welchen man nach dem Umkristallisieren die D- und L-Aminosaureester sowie die freien Aminosauren selbst in optisch reiner Form und guter Ausheute gewinnt.

D, L-Tryptophan ist bereits auf verschiedenen Wegen, chemisch uber die Acylverbindung rnit optisch aktiven Spaltbasen2), aber auch enzymatisch3) in die Antipoden gespalten worden. Seitdem es moglich ist, diese Aminosaure durch Kondensation von MANNIGH-Basen des Indols mit Acylaminomalonestern 4, in beliebiger Menge synthetisch herzustellen, ist die Gewinnung ihrer optischen Antipoden nach einem einfachen Verfahren mit leicht zuganglichen aktiven Hilfsstoffen zu besonderem Interesse gelangt. Auch das Tyrosin, dessen L-Verbindung hauptsachlich aus Naturprodukten isoliert wird, laBt sich heute leicht durch Kondensation von p-Methoxy-benzylchlorid mit Acetamino- malonester herstellen 5, und erfordert geeignete Methoden zur Trennung seiner Antipoden.

Mit vorliegender Arbeit sollen vorausgegangenel) Untersuchungen uber die Racematspaltung der Aminosaureester mit Weinsauren als

1) VI. Mitteilung iiber die Racematspaltung von Aminosiiureestern. - V. Mitteilung G . LOSSE und M. AUGUSTIN, Chem. Ber. 91, 157 (1958). - IV. Mitteilung G . LOSSE und H. JESCHKEIT, Chem. Ber. 90, 1275 (1957).

2) V. DU VIGNEAUD und R. R. SEALOCK, J. biol. Chem. 96, 511 (1932). - C. P. BERG, J. hiol. Chem. 100, 79 (1933). - A. C. SHABICA und M. TISHLER, J. Amer. chem. SOC. 71, 3251 (1949). - L. VELLUZ, G. AMIARD und R. HEYMES, Bull. SOC. chim. France 1953, 904.

3) M. BRENNER, E. SAILER und V. KOCHER, Helv. chim. Acta 31, 1908 (1948). 4) H. HELLHMANN, Hoppe-Seylers Z. physiol. Ch. 284, 163 (1949). 9 E. J. CHAPPEL, Engl. Pat. 651620 vom 8. 10.1948 (C. A. 1953, 1740 i).

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aktiven Hilfsstoffen erganzt werden. Man gewinnt bei dieser Methode die Moglichkeit, nicht nur die D- und L-Aminosauren, sondern auch deren Ester direkt aus den Tartraten zu isolieren und fur Peptidsynthesen einzusetzen.

Zur Auffindung der fur die Tryptophanspaltung gunstigsten Kristallisationsbedingungen wurde der D,L-Methylester mit D-Wein- same und Dibenzoyl-D-weinsaure im Molverhaltnis des sauren und neutralen Salzes in absolut methanolischer, athanolischer und propano- lischer Losung zur Reaktion gebracht. Als geeignetste der gepruften Kombinationen erwies sich Dibenzoylweinsaure mit dem Ester im Ver- haltnis des Neutralsalzes in absolut athanolischer Losung. Hierbei scheidet sich aber nicht das Neutralsalz Bus, sondern es kristallisiert annahernd 50 yo des eingesetzten Esters als L-Ester-dibenzoyl-D-hydro- gentartrat rnit einer optischen Reinheit von 80 %, wahrend freier D-Ester mit 70proz. optischer Reinheit in der Mutterlauge verbleibt. L-Ester- dibenzoyltartrat und D-Ester werden in die Esterhydrochloride uber- fuhrt, gereinigt, die Ester nach S. M. MCELVAIN und J. F. VOZZA~) oder G. HILLMAN") wieder freigesetzt und mit Barytwasser zum L- und D-Tryptophan verseift. Will man allein die Aminosaureantipoden gewinnen, so kann man auch das L-Ester-dibenzoyl-D-hydrogentartrat mit ammoniakalischem Ather oder Chloroform6) 7) zerlegen und den so erhaltenen rohen L- wie den aus der Mutterlauge isolierten D-Ester verseifen. Die Antipoden des Tryptophans werden dann aus heil3em Wasser umkristallisiert.

Die Moglichkeiten zur Antipodenspaltung des D, I;-Tyrosins wurden an Hand seines Athyl- und Benzylesters und beider Salzreihen der D-Weinsaure und Dibenzoyl-D-weinsaure in den niederen Alkoholen sowie in Aceton-Ather und Essigester-Ather studiert. Die besten Spaltungsergebnisse lieferte hier das D-Hydrogentartrat des Athylesters in Athanol, wenn ein Mol uberschussigc Weinsaure im Losungsmittel vorhanden ist. Ohne diesen Weinsaureuberschufl findet keine befrie- digende Auftrennung statt. Der gunstige EinfluIJ uberschussiger D- Weinsaure erklart sich wohl daraus, daB ihre alkoholische Losung wie ein optisch-aktives Losungsmittel auf das Hydrogentartrat wirkt und so die Loslichkeitsverhaltnisse stark verandert. Anwendung von Wein- sauremonomethylather a) an Stelle von D-Weiiisiiure hot keine Vorteile.

Auf diese Weise scheidet sich die Halfte des gebildeten Salzes als D-Tyrosinathylester-D-hydrogentartrat aus der Losung Bus, der Rest

6, S. M. MCELVAIN u. J. F. VOZZA, J. Amer. chem. Soc. 71, 896 (1949). ') G. HILLMANN, Z. Naturforschg. I, 682 (1946). 8) W. N. HAWORTH, J. chern. SOC. (London) 107, 8 (1915).

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verbleibt mit der uberschussigen Weinsaure als L-Esterhydrogentartrat in der Mutterlauge. Durch Behandlung der diastereomeren Tartrate rnit ammoniakalischem Chloroform erhalt man die Ester mit 6Oproz. optischer Reinheit, deren Hydrochloride gereinigt und zum D- und L-Tyrosinhydrochlorid verseift werden konnen.

Nach dieser Methode la& sich der zuerst und in reinerer Form kristallisierende D-Antipode des Tyrosins, welcher anderweitig schwer zuganglich ist, besonders gut gewinnen.

Besehreibung der Versuche 1. Racematspaltung des D, L-Tryptophans

A. Dars te l lung d e r Ausgangsstoffe

Dibenzoyl-D-TTeinsaure: Nach c. L. BUTLER und L. H. CRETCHER~); Schmp. 90"; [a]:: - 1 1 2 , l " (c = 1,15 in khanol).

D,L-Tryptop han: Durch Kondensation von Dimethylaminomethylindol mit Formamino-malonester und anschlieflende Verseifungk); Schmp. 293" (unkorr., Zer- setzung).

D, L - T r y p t o p h a n m e t h y les t e r - h y d r o c hl o r i d : Mittels Methanol-Chlorwasser- stoff nach E. ABDERHALDEN und M. KEMPE~O); Schmp.: 220-222" (korr.).

D,L-Tryptophanmethyles te r : Die absolut atherische Suspension des Hydro- chlorides wurde nach Zugabe von 2% absolutem Methanol als Losungsvermittler unter Eiskiihlung mit Ammoniak gesattigt iind das Losungsrnittel im Vakuum abgesaugt 6).

Ausbeute: SO-SO% d. Th. Schmp.: 71-73".

B. S p a l t u n g d e s D,L-Methyles te rs

7,5 g roher D, L-Tryptophanmethylester in 50 cm3 absol. Bthanol werden mit einer auf 50' erwarmten Losung von 6,4 g Dibenzoyl-D-weinsaure in 150 cm3 abs. Athano1 vereinigt. Nach einigen Stunden beginnen sich Kristallkeime abzuscheiden. Man ver- diinnt die LBsung mit dem gleichen Volumen (200 cm3) absol. Ather, der in 3-4 Portionen im Verlaufe eines Tages zugesetzt wird. Die Kristallisation des L-Tryptophanmethyl- ester-dibenzoyl-D-hydrogentartrates ist nach insgesamt 24 Stunden beendet.

Ausbeute: 8-9 g; Schmp. 179-181' (korr.); [a];: -65,2O (c = 0,52in Methanol).

~,,H,,O,oNz (57674) Ber. C 62,50 H 4,86 N 4,86 Gef. C 62,35 H 5,18 N 4,82

Die Mutterlauge des Spaltansatzes wird im Vakuum auf 20 om3 eingeengt, unter Kiihlung trockener Chlorwasserstoff bis zur deutlich sauren Reaktion eingeleitet und das rohe D-Tryptophanmethylester-hydrochlorid mit vie1 absol. Atlier ausgefgllt.

Ausbeute: 4 , l g; Schmp. 211-213' (korr.); [a]$: - 12,2' (c = 4,06 in Methanol).

9) C. L. BUTLER u. L. H. CRETCHER, J. Amer. chem. SOC. 55, 2605 (1933). lo) E. ABDERHALDEN u. M. KEMPE, Hoppe-Seylers Z. physiol. Ch. 52, 214 (1907).

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C. Gewinnung d e r re inen L- und D - T r y p t o p h a n m c t h y l e s t e r - h y d r o c h l o r i d e

L-Tryptophanmethylester-dibenzoyl-D-hydrogentartrat wird mit der vierfachen Menge absol. Methanol ubergossen und Chlorwasserstoff eingeleitet, bis eine klare, stark saure Losung entstanden ist. Durch Fallung mit vie1 absol. Ather gewinnt man das rohe L-Esterhydrochlorid.

Ausbeute: 3,6 g; Schmp.: 214-215' (korr.); [a]:: + 14,2" (c = 4,81 in Methanol). Die so gewonnenen rohen antipodischen Methylesterhydrochloride kristallisiert man

aus Methanol-Ather unter Gewinnung der leichter loslichen Anteile um. Man erhiilt so annahernd 50% dcr eingesetzten Rohhydrochloride optisch rein.

L-Tryptophanmethylester-hydrochlorid: Schmp.: 216-218" (liorr.); [a]:: + 18,2" (c = 3,16 in Methanol).

C,:,,H,O,N, . HC1 (254,7) Ber. C 56,47 H 5,88 N 10,98 Gef. C 56,41 H 6,13 N 11,29.

D-Tryptophanmethylcster-hydrochlorid: Schmp.: 217-219' (korr.); [a]:: -17,8" (e = 3,87 in Methanol)

Gef. C 06,16 H 6,OO N 11,32 Die optischen Reinheitsgrade der Rohesterhydrochloride betrugen somit 77 und 70%.

D. Gewinnung v o n L- u n d D - T r y p t o p h a n

Zur Aufarbeitung auf L- und D-Tryptophan wurden die Esterhydrochloride, wie bei der D, L-Verbindung beschrieben, mit ammoniakalischem Ather umgesetzt uud die freien Ester 15 Minuten mit 0,37 n Ba(OH), untcr Scliutteln bei 20' verseift. Nacli Neutralisation mit 0,37 ri H,SO, kocht man den Bariumsulfatniederschlag wiederholt init Wasscr aus und saugt unter Aktivkohle-Zugabe ab. Die gesammelten warjrigen Aus- ziige werden in1 Vakuum bis zur Trockne eingedampft nnd liefern in 70-80proz. Ausbeute hvzogen auf das Esterhydrochlorid praktisch reiries L- bzw. D-Tryptophan.

TJ-Tryptophan: Schmp.: 281-283" (korr.); [a];: -33,202) (c = 0,41 in Wasser).

CI,,H,,O,N, (204,2) Ber. C 64,69 H 5,90 N 13,72 Gef. C 64,31 H 6,28 N 13,56.

&Tryptophan: Schmp.: 280-282" (korr.); [a];: + 30,3' (e = 0,45 in Wasser).

Gef. C 64,40 H 5,90 N 13,46. Zur direliten Gewinnung der Antipoden des Tryptophans aus den Rohprodukten des Spaltansatzes wird das L-Estertartrat bzw. D-Esterhydrochlorid wic beschrieben, mit ammoniakalischem Ather zerlegt und der Aminosaureester mit Barytwasser verseift. Die so gewonnenen rohen Aminosaureantipoden besitzen optische Reinheitsgrade von i0-80% und werden aus heiaem Wasser umkristallisiert. Hierbei kristallisieren zuerst die racemischen Anteile, nach Einengen und Acetonzugabe die optisch reinen Kom- ponenten.

Ausbeutc 50% bezogen auf Rohaminosaure. L-Tryptophan: Schmp.: 279-280° (korr.); [a]:: -31,2" (c = 0,39 in Wasser)

Gef. N 13.84

1)-Tryptophan: Schmp.: 280-283' (korr.); [a];: + 31,l" (c =. 0,44 in Wasser)

Gef. N 13,52

G. LOSSE, Racematspaltung des D, L-Tryptophans und D, L-Tyrosins 145

2. Racematspaltung des D,L-Tyrosins A. D a r s t e l l u n g d e r Ausgangss tof fe

D,L-Tyrosin wurde durch Kondensation von p-Methoxyhenzylchloridll) mit Acet- amino-malonester12) und anschlieoender Verseifung des p-Methoxy-benzyl-acetamino- malonesters mit Bromwasserstoffsaure gewonnen5).

D , L - T y r o s i n a t h y l e s t e r - h y d r o c h l o r i d . Nach E. FIsCHER',) durch Ver- esterung mit absol. Athanol-Chlorwasserstoff. Das nach dem Vertreiben des Alkohols im Vakuum verbleihende Rohprodukt wurde aus wenig Alkohol unter Zugabe von Essig- estcr umkristallisiert.

Ausbeute: 85% d. Th.; Schmp.: 166-168" (korr.).

C,,H,,O,N * HCl (245,6) Ber. C 53,66 H 6,50 N 5,69 Gef. C 53,40 H 6,61 N 6,07.

D,L-Tyros inbenzyles te r -hydrochlor id . Die Aminosaure wurde bei 100" mit abs. Benzylalkohol-Chlorwasserstoff verestert, Reaktionswasser und Benzylchlorid im Vakuum abdestilliert und die Operation wiedcrholt. Nach Abdestillieren des Benzyl- alkohols bei 1-3 Torr kristallisiert man das Rohprodukt aus Alkohol-Ather um.

Ausbeute: 60% d. Th. Schmp.: 174-176" (korr.)

CI6Hl,O,N. HCl (307,5) Ber. N 4,55 Gef. N 4,55.

D , L - T y r o s i n a t h y l e s t e r ; cntsprechend der Vorschrift von G. HILLMANN') durch Oberschichtcn des Hydrochlorides mit mindestens der 30fachen Menge absol. Chloroform, Zugabe von etwas Natriumsulfat und Sattigen der Suspension mit Ammoniak. Anwen- dung ammoniakalischen Athers ist hirr nicht zweckmadig, weil der Ester in1 Ather zu schwer loslich ist. Ausbtwte: 80-90% d. Th.; Schmp.: 108-109" (korr.).

B. S p a l t u n g d c s D , L - A t h y l e s t e r s 6,6 g D, L-Tyrosinathylester werden in 30 om3 absol. Alkohol durch gelindes Erwar-

men in L6sung gebracht und rnit einer heiden Losung von 9,5 g D-Weinsaure in 35 om3 absol. Alkohol vereint. Nach zweitagigem Stehen hatten sich 5,2 g D-Tyrosinathylester- D-hydrogentartrat ausgeschieden, das ist 91% d. Th.; Schmp.: 83-85" (korr.); [a];: + 4,O" (c = 1,12 in Methanol). Nach dem Umkristallisieren aus absol. Alkohol: Schmp. ,92-94" (korr.); [a?;: -0,s" (c = 0,97 in Methanol).

C,,H,,O,N (3593) Ber. C 50,14 H 5,85 N 3,90 Gef. C 49,83 H 6,15 N 3,91

Durch portionsweisen Btherzusatz (insgesamt 100-120 cm3) zur Mutterlauge des Spalt- ansatzes werden weitere 4-5 g Salz als L-Tyrosinathylester-D-hydrogentartrat isoliert. Der WeinsaurciiberschuB verbleibt in der Mutterlauge. Schmp. : 82-84' (korr.); [a];: + 13,6" (c = 0,88 in Methanol)

Gef. N 4,03 .

11) A. MULLER, M. MESZAROS, &I. LEMPERT-SRETER u. I. SZARA, J. Org. Chemistry

12) H. R. SNYDER u. H. W. SMITH, J. Amer. chem. SOC. 88, 550 (1914). 18) E. FISCHER, Ber. dtsch. chem. Ges. 34, 451 (1901).

16, 2 1013 (1951).

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C. G e w i n n u n g v o n o p t i s c h r e i n e m D- u n d L-Tyrosinathylesterhydroehlorid

Rohes D-Tyrosinathylester-D-hydrogentartrat (das aus Alkohol umkristallisierte Salz besitzt keinen hoheren o p t i s c h e n Reinheitsgrad) bzw. das L-Ester-D-hydrogen- tartrat wird, wie beim D, L-Esterhydrochlorid beschrieben, in Suspension mit der 30fachen Menge Chloroform bei 0" mit Ammoniak behandelt, wobei 2% absol. Methanol als Losungs- vermittler und etwas wasserfreies Natriumsulfat zugesetzt werden. An Stelle des mit Ather isolierten L-Estersalzes kanii so auch das durch Eindampfen der Mutterlauge des Spaltansatzes gcwonnene Gemisch von L-Ester-D-hydrogentartrat und D-Weinsaure zersetzt werden.

Nach dem Vertreiben des Chloroforms im Vakuum gewinnt man die rohen Anti- poden des Esters in 70-80proz. Ausbeute.

D-Tyrosinathylester: Schmp.: 105-106" (korr.); [a]:: - 12,5" (c = 3,96 in Alkohol). L-Tyrosinathylester: Schmp.: 103-106" (korr.); [a]:: + 11,7" (c= 3,47 in Alkohol). E. FISCHER'~) gibt fur L-Tyrosinathylester einen Schmp. von 108-109° und eine

spez. Drehung yon [ Q ] ~ : + 20,4" (c = 4,9 in Alkohol) an, die Roliprodukte besitzen demnach optische Reinheitsgrade von etwa 60%.

Die Ester werden in wenig absol. Athanol gelost, Chlorwasserstoff bis zur sauren Reaktion eingeleitet und ihre Hydrochloride mit absol. Ather quantitativ gefallt.

D-Tyrosinathylester-hydrochlorid: Schmp. : 164-165" (korr.); [a]:: - 18,9" (c =

2,11 in Alkohol). L-Tyrosinathylester-hydrochlorid: Schmp.: 165-16i" (korr.); [a]:: + 17,6" (c =

1,86 in Alkohol). Durch ein- bis zweimaliges Umkristallisiercn aus absol. Alkohol-Ather gewinnt man

die Hydrochloride optisch rein: D-Tyrosinathylestcr-hydrochlorid: Schmp.: 169-171" (korr.); [a]%: -29,l" (c =

2,lO in Alkohol). L-Tyrosinathylester-hydrochlorid: Schmp. : 170-171" (korr.); [a];: - 28,9" (c =

1,98 in Alkohol). F. ROHMANNI~) gibt fur L-Tyrosinathylester-hydrochlorid eincn Schmp. volt 166" an.

CllH,,O,N. HCl (245,6) Ber. C 53,60 H 6,50 N 5,69

D Gef. C 53,73 H 6,72 N 5,91 L Gef. C 53,75 H 6,86 N 6,Ol.

Aus den reinen Hydrochloriden lassen sich nun praktisch quantitativ entweder wie bei der D,L-Verbindung beschriebcn, die reinen Ester in Freiheit setzen oder durch halbstiindigesKochen mit 20proz. Salzsaure die reinen Aminosaurehydrochloride gewinnen.

D-Tyrosinathylester: Schmp.: 108-109" (korr.); [ m ] g : - 19,2" (c = 4,20 in Alkohol). L-Tyrosinlthylester: Schmp. 108:-109" (korr.); [a]g: + 19,4" (c = 4,07 in Alkohol).

c,,H,,o,N ( 2 0 9 ~ ) Ber. C 63,16 H 7,17 N 6,69

D Gef. C 62,74 H 7,38 N 6,81 L Gef. C 62,80 H 7,06 N 6,41

D-Tyrosinhydrochlorid: [a]:: + 8,2" (c = 4,15 in 20proz. Salzsaure). L-Tyro~inhydrochlorid'~): [a]:: - 8,4O (C = 3,96 in 20proz. Salzsaure).

14) F. ROHMANN, Ber. dtsch. chem. Ges. 30, 1978 (189i). 15) E. FISCHER, Ber. dtsch. chem. Ges. 32, 3643 (1899).

G. LOSSE, Racrmatspaltung des D, L-Tryptophans und D, L-Tyrosins 147

Die hieraus suf iibliche Weise durch Neutralisation mit Ammoniak gegen Kongopapier gewonnenen freien Aminosaureantipoden lieferten folgende Daten :

D-Tyrosin: Schmp. : 294-300’ (korr., Zersetzung) L-Tyrosin: Schmp. : 294-300” (korr., Zersetzung)

C,H,, O,N ( 1 81 9 1) Ber. C 59,66 H 6,08 X i , i 3

D Gef. C 59,59 H 6,55 N 7,88 L Gef. C 59,43 H 6,15 N 7,83.

Herrn Professor Dr. W. LANGENBECK danke ich fur sein forderndes Interesse bei der Ausfuhrung dieser Arbeit.

Halle, Instilut fur organische Chemie der Martin-Luther- Universitai .

Bei der Redaktion eingegangen am 16. April 1958.