196 Carbohydkte Rexarch EIscvier Publishing Company. Amsterdam

Frimed in Belgium

REAKTIONEN ENOLISCHER ZUCKERDERIVATE

TEIL Iv*. DIE MARKWUNG VON ENOLISCHEN ZUCKERDERNATEN UND ACJZTYLIERTEN

ZUCKERN MIT TRTTIUM

JOCHEN LEHhfANN

Chemisches Laboratorium der Unioersirrif Freiburg i. B. (Deutschland)

(Eingegangen den 7. November, 1966)

EZNFUHRUNG

Von Helferich und Himmenl wurde 1928 festgesteht, da13 kFn.rfhches rohes Silberfluorid in Pyridin sich besonders gut znr ELiminierung von Jodwasserstoff oder Bromwasserstoff aus den entsprechenden 6-halogenierten Glucosidderivaten eignet. Mit Hilfe dieser Reaktion lassen sich in guter Ausbeute enolische Zuckerderivate darstellen, die zur Synthese spezifisch markierter Zucker verwendet werden kijnnen2. Bei dem Versuch, aus Methyl-2,3,4-tri-O-acetyl-6-desoxy-6-jod-a-~~ucopyranosid- 5-t (l), das durch Jodierung nach einer Methode von Raymond und Schroeder3 aus -Methyl-a-D-glucopyranosid-S-~z ohne Tritiumverlust gewonnen wurde, Jodwasser- stoff-r mit Silberfhrorid in Pyridin zu eliminieren, wurde festgestellt, dab im Reak- tionsproduktMethyI-2,3,4-tri-O-acetyl-6-desoxy-cx-D-xylo-hex-5-enopyranosid(2)noch 17% der in 1 tier-ten Tritiumaktivit%t enthalten waren4. Dieses Ergebnis lieD den SchluB ZU, da13 w%rend der Eliminierungs-reaktion eine Umgruppierungvon Wasser- stoffatomen erfolgte. Die Beweghchkeit oder Austauschbarkeit von Wasserstoff spielt bei der Verwendung tritiummarkierter Verbindungen zur Aufklanmg biochemischer Eliminiernngs- und Umlagerungs-reaktionen’ eine groge Rolle. Es ist zu erwarten, da13 Wasserstoffatome, die an einer tierten enolischen Doppel- bindung stehen, in Bezug auf ihre Bindungsfestigkeit eine Sonderstellung gegeniiber solchen an einer isolierten C-C-Doppelbindung einnehmen. Eine Beeinflussung durch geeignete Katalysatoren, die am Enolsauerstoff angreifen kiinnen, ist m8glich.

DISKUSSION

Die Tatsache, daf3 bei der Eliminierung von Jodwasserstoff aus 5-tritiertem 1 ein Teil des Tritiums im Reaktionsprodukt 2 verbleibt, lie13 es angebracht erscheinen, den Mechanismus dieser Reaktion &her zu untersuchen. Zungchst lag die Annahme nahe, die Reaktion kiinnte teilweise unter a-Eliminierung verlaufen, wobei das Tritium in 5-Stellung schlieBlich nach der 6-Stelhmg wandert. Diese Annahme erwies sich aber aIs nicht haltbar, da bei Verwendung von 6-tritiertem 1 vollst%dige Reten-

l Teil III : J. LEHMANN UND H. FRIEBOLIN, Carbohyd. Res., 2 (1966) 499.

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REMC’iTCNEN JZNOLISCHER ZUCKERDERIVATE. IV I97

tion von Tritium in 2 festgestellt wurde 4. Eine andere ErkKuung kijnnte durch einen nachtrgglichen Wasserstoffaustausch in 2 mit dem aus l-5-t quantitativ abgespaltenen Tritium gegeben werden. Die Retention von Tritium bei Verwendung von l-6-r w&e teilweise durch einen sehr hohen Isotopieeffekt zu deuten. Wie im folgenden gezeigt wird, lindet der Austausch in 2 an zwei voneinander unabhlngigen Stellen, und zwar vonviegend an Acetylgruppen* und in untergeordnetem MaBe an der enolischen Doppelbindung statt. Im FaIIe l-5-t ist der Effekt der Riicktritierung sehr grols, da die Acetylgruppen den grijl3ten Teil des wieder eingebauten Tritiums aufnehmen, wghrend im Falle l-6-t sich ein Austausch nur an der enolischen Doppelbindung abspielt, der aufgrund eines hohen Isotopieeffekts und des geringen Angebots an Wasserstoffionen (maxima1 ein Mol pro Mol Substrat) mu 3uDerst !gering sein kann.

Jch OR OCH,

OR

1

cz

C3H,

Pyriciin + AgF + 3H20 ‘0

-c?-

OR’ R’O OCH3

CH2 OR’

20 R

RO 0CH3 R = H-J-CO-

OR *Rr=%3C-CO-

2

Abb. 1

Die scheinbare Retention van Tritium bei der Dehydrohalogenierung von l-5-t beruht tats%hlich auf einer Riicktritierung des Reaktionsprodukts 2 durch die w-end der Reaktion eliminierten Tritiumionen. Fiihrt man ngmlich die Eliminie- rungsreaktion mit umnarkiertem 1 in F’yridin durch, dem eine Spur 3H20 hoher spezitischer Aktivitgt zugesetzt ist, werden 15-20% der im Pyridin vorhandenen

TritiumaktiviCt im kristallinen Reaktionsprodukt 2 fixiert. Naturgem%B schwanken die Tritiumausbeuten betr&htIich, da es sich urn eine heterogene Reaktion handelt und k%&ches Silberfiuorid keine definierte Verbindung ist. Die Bedingungen kijnnen daher nicht immer genau reproduziert werden. Eine 5bnliche Markierung durch Tritiumaustausch erfolgt, wenn unmarkiertes 2 mit Silberfluorid in Pyridin-3Hz0 geschiitteIt wird.

Aus einer Reihe von qualitativen Untersuchungen** kann zusammenfassend gefolgert werden : Der Einbau von Tritium in Verbindung 2 wird durch technisches Silberfluorid katalysiert. In Pyridin-3Hz0 oder Pyridin-3HCl allein erfolgt kein Tritiumaustausch, ebensowenig bei Verwendung von Silberacetat oder Silbernitrat.

*Es konnte nicht gel&&t werden, welche oder wieviel Acetylgruppen mit Tritium markiert werden. **Die verschiedenen Gemischkombinationen werden nach 20-stiindigem Schiitteln diinnschicht- chromatographisch anaIysiert.

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Auch verliefen Versuche in anderen Liisungsmitteln, z.B. N,N-Dimethylformamid, negativ. Vermutlich sind Silberfluorid und mit Spuren Wasser entstehendes, hydrati- siertes Silberoxid zusammen mit Pyridin fiir die Katalyse des Tritiumaustausches verantwortlich. Diese Annahme wird durch die Tatsache unterstiitzt, da0 frisch gef5lltes Silberoxid in mdin-3H20 eine, wenn such geringe, katalytische A&iv&it aufweist. Reines kristallines Silberfluorid in absolut trockenem Medium bewirkt eine Ver2nderung des Sub&rats und ist &her fti den Zweck der Markierung ungeeignet. Das nach der Tritienmg durch Extraktion mit &her isolierte 2a (Verbindung 2a bedeutet 2 nach der Tritierung, also mit vollem Tritiumgehalt; im Gegensatz zu 2b, in dem die tritierten Acetylgruppen durch unmarkierte ersetzt sind)* enthglt das Tritium fest gebunden. Nach wiederholter Chromatographie auf Papier mit I-Butanol-PropionsBure-Wasser oder auf KieseIgel mit Benzol-Methanol kann kein Aktivit2tsverlust beobachtet werden, ebensowenig bei wiederholter Kristallisation aus Methanol.

Bei der katalytischen Entacetylienmg von 2a erh5lt man sirupijses Methyl-6- desoxy-er-D-xyZ@he+5enopyranosid (3), das mu noch efzwa 1% des in 2a enthaltenen Tritiums aufweist. Auch diese RestaktivitZt bleibt nach Papier- oder Diinnschicht- chromatographie erhalten. Nur durch lzngere BehandIung mit einem grol3en Uber- schuB w%sriger Alkalilauge erfolgt quantitativer Verlust des Tritiums aus 3. Durch Addition von Natriumbisulfit kann 3 ohne AktivXitsverlust in das kristalline Natrium- salz der Methyl-6-desoxy-oc-D-glucopyranosid-6-sulfonsBnre6 und dieses wiederum ohne AktivitZitsverlust nach S2urehydrolyse in das kristalline Natriumsalz der freien 6-Desoxy-a-r+glucopyranose-6-sulfons2ure’ umgewandeh werden (Tabelle I).

TABELLE I

UhfWANDLfJNGSPRODUK’ AUS MARKlERTEhf METHYL-~,~,~-TRI-O-ACE~YL-~-DESOXY-~-D-X~~O-HEX-~-

ENOPYRANOSII) (2a)hm zUGEHBR~GENTR~UMAKII~~~

Umtvandlungsprodakre AktivihZi~ in cpmjmhfol

Methyl-2,3,4-tri-O-acetyl-&desoxy-cx-D-xylo-hex-5-enopyrnosid (2a) 1.26 x I@ Methyl-6-desoxy-a-D-xyio-hex-5-enopyranosid 3a 1.12 x 106 Methyl-2,3.4-tri-O-acetyl-6-desoxy-a-~-xyZo-hex-5-enopyranosid (2bb) 1.10 x 10s h~ethyl-6-desoxy-a-D-glucopyranosid-6-sulfonslure (Natriumsalz) 1.14 x 106 6-Desoxy-cr-D-glucopyranose-6-sulfonslure (Natriumsalz) 1.08 x 106

oPapierchromatographisch gereinigt. bDurch Acetylierung van 3 gewonnen.

Verse% man 2a mit wassriger Natronlauge, so tauscht ein Teil des Tritiums mit den Protonen des Wassers aus. Der Hauptanteil an Tritium Cadet sich jedoch in der

abgespaltenen EssigsZure (Tabelfe II). Da vermutet wurde, da13 die mit w&rigem

*Alle im experimentellen Teil unter &IO, 11,12 beschriebenen Umsetzungen wurden sowohl mit dem aus 1 wie dem aus 2 hergestellten 2a durchgefiihrt. Dadurch konnte gezeigt werden, daf3 die Tritium- verteilung in 2a unabhlnglg vom Ausgangsprodukt ist.

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REAKTIOhW ENOLISCHER ZUCKERDERIVATE. IV 199

Alkali austauschbare Aktivitgt in 6-Stellung von 2a, also in &Stellung der enolischen Doppelbindung lokalisiert ist, wurde 2a nach einer Methode von Pappo et aZ.* mit Osmiumtetroxid und Natriumperjodat in Wasser und &her unter Spaltung der Doppelbindung abgebaut. Der aus C-Atom 6 von 2a gebildete Formaldehyd, als Dimedonderivat isoliert, enthielt etwa 1.5% de: Aktivitiit von 2a. Die AktivitHt, die nach der katalytischen Entacetylierung von 2a in 3 gefunden wird, liegt bei etwa 0.9%. Diese Differenz deutet darauf hin, daB bei der katalytischen Entacetylienmg ein Teil des in 6-Stellung gebundenen Tritiums mit dem Liisungsmittel (Methanol), selbst unter milden Bedingnngen austauscht. In neutraler und schwach saurer Liisung findet kein Tritiumverlust aus 3 mehr statt.

Urn eine ausschliel3liche Markierung am C-Atom 6 von 3 zu beweisen, wurde dieses nach papierchromatographcher Reinigung von eventuell noch anhaftendem, unvollst?mdig entacetylierten Produkten mit unmarkiertem Acetanhydrid in Pyridin reacetyliert und mit unmarkiertem 2 verdtint. Nach Abbau mit Osmiumtetroxid und Natriumpejodat enthat der gewonnene Dimedon-Formaldehyd-Komplex fast dieselbe Tritiumaktivitgt wie das eingesetzte Produkt 2b* (Tabelle II). Daraus folgt, dal3 in 2 bei der Behandlung mit Silberfluorid und Pyridin-JH,O ein starker Austausch der Ace@-Wasserstoff-Atome neben einem geringeren Austausch der Wasserstoff- atome in /I-Stellung der enolischen Doppelbindung erfolgt. Wasserstoffatome an normalen C-C-Doppelbindungen, wie beispielsweise in /3-Pinen oder Cholesterin- acetat, werden unter den beschriebenen Reaktionsbedingungen nicht ausgetauscht.

Wie 2 konnten such Tri-0-ace@-D-glucal, Methyl-6-desoxy-2,3,4&i-O- methyl-cr-D-xylo-hex-5-enopyranosid2, Methyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-a-D-glucopyra- nosid und Methyl-2,3,4,6-tetra-0-acetyl-@-glucopyranosid markiert werden. Voll- acetylierte Pentosen und Hexosen werden zwar markiert, aber bei Bingerer Behandlung (20 Stunden) tritt teilweise Entacetylierung am anomeren C-Atom und Acetyl- wanderung em. Jedoch geniigt eine ein- bis zwei-stiindige Behandlung fur eine deut- lithe Markierung, wobei die eingesetzte Substanz chemisch nicht verandert wird, wenn sie keine sehr labile glykosidische Bindung enthslt. Eine solche Ausnahme ist Penta- 0-acetyl+D-mannopyranose, die nach einstiindiger Behandlung bereits teilqveise in eine zweite Substanz umgewandelt wird, bei der es sich aufgrund der diinnschicht- chromatographischen Analyse wahrscheinlich urn das konformativ weit stabilere a-D-Anomere handelt.

Wahrscheinlich hat Silberfluorid in Pyridin einen starken Effekt auf das glyko- sidische sowie das Ringsauerstoffatom. Dieser Einflul3 hangt sicher eng mit einer Labilisierung der C-H-Bindungen sowohl an enolischen Doppelbmdungen als such an der Acetylgruppe zusammen, die dem anomeren Zentrum benachbart ist. Eine Bnliche spezifische Reaktivitgt der Acetylgruppe in ZStellung von Penta-O-acetyl- D-glucose ist bei der Behandlung mit Phosphorpentachlorid in Tetrachlorkohlenstoff zu beobachtenl*. Hier wird ausschlieBlich diese Acetylgruppe perchloriert.

*Die gegeniiber 2b erhbhte Tritiumaktivitlt im Formaldehyd-Derivat ist wahrscheinlich auf Uber- oxidation des Formaldehyds zurilckzufiihren. Hierbei macht sich ein Isotopieeffekt bemerkbarg.

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TABELLE II

VEXTEILUNG DER TRlTIUhfAICTIVXT~T

Erfapte C-Afome ErfaJte Acetyl- cpm/mMoi im Zucker green

Methyl-2,3,4-tri-0-acetyl-6-desoxyu-o- xylo-hex-5-enopyranosid (Za) l-6

Natriumacetat aus 2a - Methyl-6-desoxy-a-D-xylo-hex-5-enopyranosid

(3) aus 2a durch katalytische Verseifung 1-6 Formaldehyd aus 2a 6 Methyl-~?,~tri-O-areryld-desoxy-a-o-

xylo-hex-5-enopyranosid (2b) aus 3 und nach Verdiinnung mit 2 1-6

Formaldehyd aus 2b Methyl-tetra-U-acetyl-cr-D-glucopyranosid (4) i-6 Methyla-D-ghtcopyranosid aus 4 durch

kataIytische Entacetylierung l-6 Natriumacetat aus 4 -

alle 1.26 x 10s alle 1.11 x 10s

keiue 1.12 x IO”” keine 2.10 x lose

keine 7.40 x 104

keine 9.20 x 104

alle 1.28 x 107

keine 0 alle 1.21 x 107

U’Der grol3e Unterschied im Tritiumgehalt van Fonnaldehyd aus 2a gegentiber dem in 3 ist auf eilweisen Verlust von Tritium am C-6 wlhrend der katalytischen Entacetylierung zuriickzufiihren.

Die Markierung von Acetylgruppen in Zuckeracetaten kann such zur quanti- tativen Analyse von acetylierten Zuckergemischen verwendet werden. Am Beispiel des Gemisches Penta-U-acetyl-/3-D-glucopyranose und Tetra-O-acetyl+D-xylose konnte gezeigt werden, dab der Tritiumeinbau, wenigstens fur das genannte Beispiel, stiichio- metrisch erfolgt.

TABELLE III

QUANTITATIVE BESTIMhIUNG EINES GEhiISCHES VON PENTA-O-ACETYL-B-D-GLUCOPYRANOSE (5) UND

TETRA-O-ACETYL-B-D-XYLOPYRANOSE (6) NACH TRITIERUNG hiIT SILBERFLUORII+PYRIDIN-3H~~

5 6 MolcerhcZtnis Akticirliten- c;erhiilmis

Eingewogene Menge, mMol 0.197 0.137 1.44 Tritiumaktivitlt nach chromatogra-

phischer Trennung; gemessen : integrierte Peaks in cm”- 4.56 3.07 1.49

Tritiumaktivitlt mit Hiffe der Isotopen- verdtinnungsmethode gemessen cpm 16.8 x 104 12.0 x 10-t 1.40

Die hier beschriebene Methode zur MarkienmgvonenolischenZuckerderivaten und acetylierten Zuckem bedient sich mit 3Hz0 einer der biigsten tritierten Sub- stanzen. Durch Verwendung eines nicht protischen Lbsungsmittels wird eine Verdiinung des tritierten Wassers vermieden. Die Anwendung der Methode ist

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REAKTIONEN ENOLISCHER ZUCKFRDERJVATE. IV 201

sehr einfach und bedarf keines besonderen Aufwands. Die Mijglichkeit der Direkt- markierung ist besonders im Fall der enolischen Zuckerderivate von Bedeutung, da verlustreiche Synthesen, ausgehend von markierten, einfachen Zuckern, vermieden werden.

Kenntnisse iiber den Wasserstoff-Tritium-Austausch sind vor allem bei der Aufklting biochemischer Vorgange unter Verwendung tritiummarkierter Substrate von groDer Bedeutung’. Es wird hier gezeigt, daB Protonen in &Stelhmg einer fizierten enolischen Doppelbindung bei geeigneter Katalyse zum Austausch befahigt sind.

ExPERIhazNTELLER TFz.

Allgemeine Methoden. (I) Papierchromatographie. - Papierchromatogramme wurden absteigend auf Whatman Nr. 1 - Chromatographiepapier in l-Butanol- Propions&xe-Wasser (142:71:100) angefertigt. Zur Entwicklung enolischer Zucker- derivate wird das Chromatogramm mit einer Liisung von Kaliumpermanganat (5% in Wasser) bespriiht. Im Bereich der Flecken erfolgt sofort Reduktion zu Braunstein. Nach zwei Minuten wird Permanganat mit Wasser ausgewaschen und das Chromatogramm getrocknet. Tritiummarkierte Substanzen werden mit Hilfe eines fensterlosen Isotopenzagergtes (Model1 380 der Packard Instrument Company) lokalisiert.

(2) Diinnschichtchromatographie. - Zur Anfertigung von Diinnschichtchro- matogrammen wurden “ Eastman Chromagram Sheets ” verwendet. Als Laufmittel dienen entweder Benzol-Methanol (9: 1) oder Ather-Petrolather-50-70” (1: 1). Entwicklung erfolgt mit Joddampf. Tritiummarkierte Substanzen werden wie unter (I) beschrieben lokalisiert. Tritierungsgemische (Sub&at oder Substratgemisch-Silber- fluorid-Pyridin-3H,0) werden mit einer feinen Pipette in mijglichst schmalem St&h auf eine 5-cm breite Platte aufgetragen, so&l3 an den Randern mindestens je 0.5 cm frei bleiben. Man lal3t die Platten etwa 0.5 Stunden in einem gut behifteten Abzug trocknen. Chromatographie soll vor allem bei vollacetylierten Zuckern mit kleinem RF Wert in Ather-Petrolather dreimal mit der gleichen Platte wiederholt werden, urn gute Trennungen zu gew%rleisten. Silbersalze, die einen grof3en Teil der Radioaktivitat enthalten, bleiben an der Starthnie zuriick. Die Radioaktivitat an der Startlinie nimmt im Gegensatz zu der im Substrat lixierten bei langerem Aufbewahren langsam ab. Bei Verwendung von Benzol-Methanol fmdet starker Austausch zwischen dem Losungsmittelgemisch und dem mit anorganischer Substanz assoziierten Tritium statt. Die im Sub&at frxierte Aktivitat bleibt such hier unver&dert. Ein ungef%hres Ma13 fi.ir die in das Sub&rat eingebaute Aktivitat ergibt ein Vergleich der AktivitHt an der Startlinie mit der an die Substanz gebundenen AktivitHt. Bei Verwendung des gleichen Reagenzgemisches [siehe (4)] und bei der Verwendung eines aprotischen Lijsungsmittels wie Ather-Petrolather bleibt die Startlinienaktivit&t etwa konstant. Die Messung sollte immer mit frisch angefertigten Chromatogrammen erfolgen.

(3) Quantitative Bestimmung der Tritiumaktivif&t. - Eine quantitative Bestimmung der in Substanzen fixiertea Tritiumaktivitat kann entweder mit Hilfe

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eines fensterlosen Isotopenzahlgerats [siehe (I)] direkt auf Chromatogrammen erfolgen oder nach Auf&en einer abgewogenen oder pipettierten Menge der zu messenden Substanz in Methanol (5 ml) und Scintillationsfliissigkeit (10 ml) (Basis Toluol) in einem ScintilIationsz%lger~t (720 Series, Liquid Scintillation System der Nuclear Chicago Company).

(4) Reagenzgemisch fiir die Markierung mit Tritium. - Uber Natriumhydroxid getrocknetes und destilliertes Pyridin (200 ml) wird mit ‘Hz0 (0.2 ml, spetiche Aktivitgt etwa l-4 curie/ml) vermischt und als StandardlGsung verwendet. Die Liisung wird im Dunkeln bei 0” aufbewahrt. Zur Markierung mischt man 1 mMo1 der zu markierenden Substanz mit Silberfiuorid (Th. Schuchhardt GmbH) (0.5 g), das iiber Phosphorpentoxid getrocknet und pulverisiert wurde, sowie Pyridin-3H,0 (3 ml Standardliisung).

(5) MethyZ-2,3,4-tri-O-acetyZ-6-desoxy-~-~xylo-hex-5-eno~yranosid-5-t (2a) aus

Methyl-2,3,4-tri-O-acetyZ-6-desoxy-6-jo (1). - Verbindung 1 (4.3 g) wird mit dem Markierungsgemisch (5 g AgF und 30 ml Pyridin-3H,0) 20 Stun- den in der Dunkelheit bei Zimmertemperatur geschiittelt. Die Reaktionsmischung giegt man langsam unter starkem Riihren in hither (500 ml) ein. 2u.r KKrung wird etwas Aktivkohle (5-10 g) zugegeben und nach 30 Minuten Riihren i?hriert. Die klare L&ung wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der sirupose Riickstand kristal- lisiert aus 800/ggem Methanol. Nach zweimaligem Umkristallisieren bleibt die speti- fische Aktivitgt konstant. (1.26 x 10’ cpm/mMol). Die Ausbeuten an reinem Produkt liegen zwischen 60 und 70% der Theorie. Die Ausbeuten an Tritium pro Mol 2a bezogen auf eingesetztes Pyridin-3H,0, bei 15-20x.

Bei der Markierung von kleineren Mengen (0.1 mMo1) wir d das Reaktionsgemisch dtinnschichtchromatographisch wie unter (2) beschrieben gereinigt, die Substanz 2a eluiert und mit unmarkiertem Produkt 2 cokristallisiert.

(6) Direkte Markierung van Methyl-2,3,4-tri-O-acetyl-6-desoxy-a-D-~ylo-hex-5-

enopyranosid (2)‘. - Die Behandlung von 2 (3.2 g) mit Markierungsgemisch (5 g AgF und 30 ml Pyridir~-~H~O) und Aufarbeitung nach den unter (5) beschriebenen Bedingungen ergibt wie dort Verbindung 2a (vgl. Fuf3note*, Seite 198). Die Ausbeuten an reiner Substanz und an eingebautem Tritium liegen ebenfalls innerhalb der unter(5) angegebenen Grenzen.

(7) Direkte Markierung von Methyl-terra-O-acetyZ-a-D-glucopyranosid (4). -

Markierung und Aufarbeitung von 4 (10 mMo1) erfolgt wit unter (5) beschrieben. Nach Umkristallisation aus Athanol erhalt man markiertes 4 mit einer Ausbeute von 85% der Theorie. Die Tritiumausbeute betrfigt 16%.

(8) Entacetylierung von 2a im wfissrigen Medium. - Verbindung 2a (0.243 g; 1.26 x 10’ cpm/mMol) werden in 2~ Natronlauge (20 ml) bei Zimmertemperatur geriihrt. Nach etwa 3 Stunden hat sich 2a vollstgndig gel&t. Nach insgesamt 20 Stun- den wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Die Tritiumaktivit~t im abdestillierten Wasser bctr&gt auf20 ml Wasser berechnet 6.25 x lo5 cpm und auf mMo1 Za bezogen 8.15 x lo5 cpm. Der trockene Rtickstand wird unter Kiihlung mit 2~ SchwefelsHure (21 ml) angesguert

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und die freigesetzte Essigsgure abdestilliert. Das Destillat wird mit 0.1~ Natronlauge genau titriert (Verbrauch 92% der Theorie). Die NatriumacetatlSsung wird zur Trockne eingedampft, der Riickstand mit wenig absolutem &.banol ausgewaschen und die Tritiumaktivitgt in einer iiber Phosphorpentoxid getrockneten, abgewogenen Menge Natriumacetat bestimmt. Umgerechnet auf drei Acetylgruppen pro Mol 2a ergibt sich eine Aktivitgt von 1.11 x lo* cpm. Ausgangsprodukt 2a: 1.26 x 10’ cpm/ mMo1; alkalilabiles Tritium: 8.15 x 10’ cpm/mMol; Acetyl-t: 1.11 x 10’ cpm/ 3 mMo1.

(9) Entacetylierung van 4 im wcitssrigen Medium. - Verbindung 4 (0.380 g; 1.28 x 10’ cpm/mMol) wird wie unter (8) beschrieben verseift und die Tritiumakti- vitzt im Wasser und im Natriumacetat bestimmt und auf eingesetztes Produkt umgerechnet. Ausgangsprodukt 4: 1.28 x IO’ cpm/mMol; alkalilabiles Tritium: 3 x 10’ cpm/mMol)*; Acetyl-t : 1.21 x 10’ cpm/4 mMo1.

(IO) fitalytische Entacetylierung von 2a und Reacetylierung von 3 zu 2b. -

Verbmdung 2a (0.5 g; 1.26 x lo* cpm/mMol) wird mit 0.01~ Natriummethylat- LSsung in absolutem Methanol (3.5 ml) 30 Minuten geschiittelt. Dann wird das Natriummethylat durch Zugabe eines Tropfens Wasser und einiger Kijrnchen Trockeneis desaktiviert. Die Lzjsung wird unter vermindertem Druck zum Sirup 3 eingedampft und iiber Phosphorpentoxid getrocknet. Ausbeute 0.260 g entsprechend 95% der Theorie; TritiumaktiviCit: 1.9 x lo6 cpm/mMol.

Zur Reindarstellung wird e&J_OJige Liisung von 3 auf Papier aufgetragen und chromatographiert. Auf einem Probestreifen wird die Verteilung der Radioaktivitgt bestimmt und anschlieI3end durch Bespriihen mit Kaliumpermanganat-Liisung die Substanz lokalisiert [siehe (I)]. Wlhrend die Analyse der Radioaktivitgt neben einer scharfen Zone A noch Substanzen mit hijherem RF Wert und geringerer Aktivitgt aufweist, zeigt die Entwicklung mil Kaliumpermanganat ein eintiges Produkt, dessen Lage mit Zone A iibereinstimmt. Bei den schneller wandernden markierten Substanzen handelt es sich wahrscheinlich urn Spuren von unvollkommen entacetyliertem 2a, die auf Grund der relativ hohen Tritiumaktivit%t in den Acetylgruppen noch erfaDt werden k&men. Elution der ausgeschnittenen Zone A mit Wasser bei Zimmertemperatur und lyophilisieren der Eluate ergibt 3 (0.22 g Sirup). Das durch Behandhmg _mit Acetan- hydrid (2 ml) und Pyridm (2 ml) und Aufarbeitung in gewohnter Weise in kristallines 2b mit einer Aktivitst von 1.1 x lo6 cpm/mMol umgewandelt wird.

(II) Abbau von 2a mit Osmiumtetroxid und Natriumperjodat *. - Verbindung 2a (1.02 g; 1.26 x IO* cpm/mMol) und Osmiumtetroxid (0.065 g) werden zu einem kraftig geriihrten Gemisch von &her und Wasser (je 15 ml) gegeben. Wzhrend die Reaktionsmischung auf 24-26” gehalten wird, gibt man in kleinen Portionen fein pulverisiertes Nat&m-meta-perjodat (2.3 g) zu. Danach wird noch zwei Stunden weitergeriihrt, die wgssrige Phase wird abgetrennt und im Hochvakuum lyophilisiert. Wasser und Formaldehyd werden in einer mit fliissigem Stickstoff gekiihlten Falle aufgefangen. Aus dem aufgetauten Lyophilisat wird Formaldehyd als Dimedon-

*Wert liegt innerhalb der BackgroundaktivitBt.

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204 J. LEXMANN

Derivat” abgeschieden. (Ausbeute 0.25 g). Die schlechte Ausbeute an Formaldehyd ist auf ungeniigenden Abbau von 2a zuriicluufiihren, von dem noch 0.4 g unverandert aus der Stherischen Phase isoliert werden konnten. Nach Umkristallisieren aus Ethanol-Wasser zeigte das Dimedon-Formaldehyd-Derivat eine Aktivitat von 2.1 x lo6 cpm/mMol.

(12) Abbau von 2b mir Osmiumtetroxid und Natriumperjodat. - Verbindung 2b (0.52 g; 7.4 x lo4 cpmjmMo1) wird wie unter (II) beschrieben in Ather-Wasser (je 10 ml) mit Osmiumtetroxid (0.038 g) und Natrium-meta-perjodat (1.2 g) abgebaut. Die Ausbeute an Dimedon-Formaldehyd-Derivat betragt 0.11 g. Die Tritiumaktivitat im Formaldehyd-Derivat be&&t 9.2 x lo4 cpm/mMol.

(13) Markierung von Penra-0-acetyl-B-D-glucopyranose (5) und Tetra-O-acetyZ- /?-D-xylopyranose (6) im Gemisch. - Verbindung 5 (0.0767 g; 0.197 mMo1) und 6 (0.0435 g; 0.137 mMo1) werden eine Stunde mit Silberfluorid (0.15 g) und Pyridin- 3H20 (1 ml) krXtig geschiittelt. Vom Reaktionsgemisch wird, wie unter (2) beschrie- ben, ein Diinnschichtchromatogramm angefertigt. Mit dem ZBhlgerSt werden zwei

Zonen Z (5) und Z (6) registriert. Die zugehiirigen Peaks werden planimetriert. Z (5): 4.56 cm’; Z (6): 3.07 cm*; MolverhHltnis 5/8: 1.44; Aktivitaten-Verhaltnis Z (5)/Z(6): 1.49.

Vom aufgeschiittelten Reaktionsgemisch werden 0.1 ml entnommen und zu einer Liisung von unmarkiertem 5 (3 g) in Chloroform (50 ml) gegeben und krzftig durchgeschiittelt. Man w%cht dreima1 mit je 100 ml Wasser aus, trocknet iiber Calciumchlorid, f%iert und dampft die LGsung zur Trockne ein. Der kristalline Riickstand wird aus iithanol bis zur konstanten spezifischen Aktivitat umkristallisiert (etwa dreimal). Eine abgewogene Menge (zwischen 0.15 und 0.05 g) wird im Scintilla- tionsz&lgerSt [siehe (3)] auf Tritiumaktivit5t untersucht. Die Zahlrate in cpm wird auf die urspriingliche Menge von 3 g 5 umgerechnet. Auf gleiche Weise werden 0.1 ml des Reaktionsgemisches mit unmarkiertem 6 (3 g) verrnischt, wie oben bescluieben aufgearbeitet und die Tritiumaktivit&, bezogen auf 3 g 6 bestimmt. Aktivitst fiir 5: 16.8 x IO4 cpm; Aktivitgt fiir 6: 12.0 x lo4 cpm; Molverhzltnis 5/6: 1.44; Aktivi- tgten-Verhatnis 5/6: 1.40.

DANK

Der Deutschen Forschungsgemeinschaft danke ich fti ein Habilitanden- Stipendium und eine Sachbeihilfe.

ZUSA-ASSUNG

Es wird gezeigt, da13 enolische Zuckerderivate wie beispielsweise Methyl- 2,3,4-tri-O-acetyl-6-desoxy-a-r-D=rylo-hex-5-enopyranosid mit einem Gem&h aus kgufhchem Silberlluorid und Pyridin, dem eine Spur 3H,0 zugesetzt wurde, mit Tritium markiert werden kijnnen. Die Markierung erfolgt in/&Stellung der enolischen Doppelbindung, d.h. am C-Atom 6 des erwghnten Substrats, und an den Acetyl-

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REZAKTIONEN ENOLISCHER ZUCKERDERJVATE. IV 205

gruppen. Es konnte nicht gekBi.rt werden, an welchen Acetylgruppen Markierung erfolgt. Diese neue Markierungsmethode scheint allgemein auf enolische Zucker- derivate und acetylierte Zucker anwendbar zu sein. Die AnwendungsmBglichkeiten der Methode fur die quantitative Bestimmung von acetylierten Zuckergemischen werden diskutiert.

SUMMARY

A mixture of commercial silver fluoride and pyridine with a trace of water-t was shown to be a good labelling reagent for such enolic sugar derivatives as methyl 2,3,4-tri-O-acetyl-6-deoxy-a-D-,uylo-hex-5-enopyranoside. Labelling takes place at the &position of the enolic double bond (position 6 in the case quoted), and in ace@ groups. It could not be established which acetyl groups undergo labelling. This new labelling technique seems to be generally applicable to enolic sugar derivatives and acetylated sugars. The potential usefulness of the technique for quantitative deter- minations of sugar acetates is discussed.

LITERATUR

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