Schwermetalle und Pflanzen - eine komplizierte Beziehung (II)

Schwermetall-Hyperakkumulation im Wilden Westenmodified from:

hem

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Effe

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Konzentration

nur Schadstoff (z.B. Quecksilber) Mikronährstoff (z.B. Kupfer)

Die Dosis macht das Gift - auch bei Schwermetallen!

Ein scheinbar intakter, natürlicher Bachlauf - die Elodea canadensisdarin war jedoch an Zn-Vergiftung eingegangen, die ihr Chlorophyll in Zn-Chlorophyll umgewandelt hatte.

Küpper H, Küpper F, Spiller M (1996) Journal of Experimental Botany 47 (295), 259-66

Umweltrelevanz von Schwermetall-Toxizität

Umweltrelevanz von Schwermetall-Toxizität (II)

Wo? Wodurch? Für Wen?

• Natürlicherweise auf schwermetallhaltigen Böden (Cu: z.B. in Zaire, Afrika; Zn/Cd: rel. häufig, auch in Mitteleuropa; Nickel: rel. häufig, Serpentinböden z.B. in Afrika, Australien, Nord- und Mittelamerika): Schwermetallkonzentrationen hoch genug für Toxizität gegen die meisten Organismen.

• Natürlicherweise in kupferhaltigen Bereichen der Ozeane (z.B. Sargasso-See): Kupferkonzentrationen im nanomolaren Bereich hemmen bereits empfindliche Cyanobakterien.

• Anthropogen wegen Einsatzes von Schwermetallsalzen (z.B. CuSO4, z.B. Zn-Phosphid, Zn-Borat, Zn-Fluosilikat): Konzentrationen im mikromolaren Bereich sind toxisch für viele Pflanzen, v.a. Wasserpflanzen in angrenzenden Gewässern

• Anthropogen durch Erz-Abbau und -Verhüttung, Konzentrationen in der Umgebung von Minen, Hütten und Abraumhalden können extrem hoch und für alle Organismen toxisch sein.

• Anthropogen in geringerem Umfang auch durch andere Industrien. Der Rhein enthielt in den 70er Jahren bis zu 0.5 µM Kupfer, was für empfindliche Wasserpflanzen wie Stratiotes oder Elodea bei längerer Einwirkung letal ist.

Wirkungsmechanismen von Schwermetall-Toxizitätund Resistenz-Mechanismen, die diese gezielt verhindern

--> direkte Hemmung der Photosynthese

--> oxidativer Stress, entweder direkt durch die Schwermetall hervorgerufen oder durch die Fehlfunktion der Photosynthese induziert.

--> Hemmung der Wurzelfunktion

--> Hemmung der Atmung und anderer weniger sensitiver Prozesse

--> Substitution von aktiven Zentren in Enzymen

1. Hemmung der Wurzelfunktion

Warum Wurzeln?

• Bei terrestrischen Pflanzen ist die Wurzel generell das erste Organ der Pflanze, das mit den Schwermetallen in Berührung kommt.

• Bei Schwermetallen mit relativ geringer Mobilität, z.B. Cu+, werden auch die höchsten Konzentrationen in der Wurzel erreicht

Mechanismen

• Kompetition in der Aufnahme mit weniger verfügbaren essentiellen Spurenelementen, da z.T. von denselben Proteinen transportiert: umstritten da widersprüchliche Daten

• Vermutlich Hemmung von Transportproteinen

• Diverse relativ unspezifische Inhibierungen von cytoplasmatischen Enzymen

• Hemmung der Zellteilung (Wirkmechanismus unbekannt)

• Also Folge der Wurzeltoxizität sterben zunächst die Wurzelhaare und Wurzelspitzen ab

1. Hemmung der Wurzelfunktion:Resistenzmechanismen

Strategien

• Verringerung der unspezifischen Durchlässigkeit der Wurzel für unerwünschte Schwermetalle: Expression von Peroxidasen verstärkt Lignifizierung

• Aktive (ATP-abhängige) Ausschleusung durch Efflux-Pumpen: Wurde für Cu in Silene vulgaris und für diverse Metalle in Bakterien gefunden.

2 H2O O2 + 4 H+

P700*

P700

A0 A1

P680*

P680

PheoQA QB

WSC 4 e-

EChlChlPQ FeS/

Rieske

PC

electron transport

Antenna Chl-proteincomplexes,

main protein:LHCII4 h·ν

excitation energy transfer

ChlChl

Chl

heavy metals

2.1. Angriffspunkte in den photosynthetischenLichtreaktionen

2. Direkte Hemmung der Photosynthese

“Sonnen-Reaktion”In hoher Lichtintensität ist dagegen nur ein kleiner Anteil der Chlorophylle der Mg-Substitution zugänglich, statt dessen findet die Hemmung direkt im PSIIRC statt. Der größte Anteil der Chlorophyllebleicht im Zusammenhang mit der Zerstörung des Photosyntheseapparatesaus.

“Schatten-Reaktion”Bei geringer Lichtintensität mit einer Nachtphase ist der größte Teil derAntennenchlorophylle (v.a. LHCII) der Mg-Substitution zugänglich. Werden dabei stabile Schwermetallchlorophylle wie z.B. Kupferchlorophyll gebildet, bleiben die Pflanzen auch nach ihrem Absterben grün.

Küpper H, Küpper F, Spiller M (1998) Photosynthesis Research 58, 125-33

2.1. Der Mechanismus der Hemmung der photosynthetischenLichtreaktionen ist in Chlorophyta lichtabhängig

Warum sind Schwermetallchlorophylle untauglich zur Photosynthese?

• Instabiler S1-Zustand

• Blauverschobene Absorptionsbande des S1-Zustandes

• Wegen der vorgenannten Gründe wirken Schwermetallchlorophylle in einem Mg-Chl-basierten System als „schwarze Löcher“ für Anregungsenergie

nur wenige (3-10) Prozent des Gesamtchlorophylls müssen inSchwermetallchlorophyll umgewandelt werden, um komplette Hemmung der Photosynthese zu erreichen.

• Schwermetall-Chlorophylle haben eine geringere Tendenz als Mg-Chl, eine Ladungstrennung durchzuführen.

• Schwermetall-Chlorophylle binden, im Gegensatz zu Mg-Chl, axiale Liganden nur schwach (z.B. Zn-Chl) oder gar nicht (Cu-Chl)

Vergleich von Gausaustausch und steady state-Fluoreszenz in Elodea gestresst mit 0.2 µM Cu2+ im Schwachlicht

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

-20

0

20

40

60

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100

photosynthesis

net p

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days of heavy metal stress

0

20

40

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µ y

fluor

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fluorescence

UV/VIS -Spektroskopie: Sonnen vs. SchattenreaktionSpektren von E. canadensis Extrakten

Küpper H, Küpper F, Spiller M (1996) Journal of Experimental Botany 47 (295), 259-66

In vivo Spektren von E. canadensis

Küpper H, Küpper F, Spiller M (1998) Photosynthesis Research 58, 125-33

Hemmung des PSIIRC

Diskutierte Mechanismen

• Hemmung des wasserspaltendenKomplexes

• Hemmung der primären Ladungstrennung:- durch Bindung ans D1-Protein- durch Insertion ins Pheophytin

• Hemmung des Elektronentransports- durch Bindung an Qa-Domänedes D1-Proteins- durch Bindung an nicht-Häm-Fe-Dömäne des D1-Proteins

2.2. Hemmung der Dunkelreaktionen der Photosynthese(Calvin-Cyclus)

• Indizien aus Messungen der Chlorophyll-Fluoreszenz-Kinetik

• Mechanismus und Bedeutung unklar

3. Oxidativer Stress

Mechanismen

• Direkt: Katalysiert von redox-aktiven Metallionen (Fe2+, Cu+) werden aus Wasserstoffperoxid durch die Fenton-Reaktion reaktive Sauerstoff-Radikale:

• Indirekt: Durch Fehlfunktion der Photosynthese und Atmungskette können reaktive Sauerstoff-Spezies entstehen. Deswegen kann auch bei in vivo redox-inerten Metallionen wie Zn2+ und Cd2+ oxidativer Stress auftreten.

• Oxidativer Stress kann zur Oxidation von Lipiden in Membranen und somit zu deren Undichtigkeit führen. Populärer aber in seiner Bedeutung in vivo umstrittener Mechanismus.

Bedeutung

• Umstritten: Studien mit geringen aber noch toxischen Schwermetall-Konzentrationen zeigen oft keinen oxidativen Stress

3. Resistenzmechanismen gegen oxidativen Stress

• Verstärkte Expression von Enzymen, die reaktive Sauerstoffspezies entgiften (Superoxid-Dismutase+Katalase. Problem: Hemmung der Zn-Aufnahme ( SOD) bei Cd-Stress.

• Synthese von nicht-Enzym-Antioxidantien, z.B. Ascorbat und Glutathion

• Umbau der Zellmembranen, um sie resistenter gegen den Angriff von reaktiven Sauerstoff-Spezies zu machen: - Lipide mit weniger ungesättigten Bindungen- Austausch von Phosphatidylcholin durch Phosphytidyl-Ethanolamin als Lipid-“Kopf“- Verringerter Anteil von Lipiden und erhöhter Anteil von stabilisierenden Proteinen in der Membran

4. GenotoxizitätRelevanz

Hängt STARK vom Metall ab:

• NICHT relevant für Kupfer und Zink-Toxicität, weil andere mechanismen (v.a. Photosynthese-Hemmung) VIEL effizienter sind

• SEHR relevant für Arsen, da effizient während andere Mechanismen hier wenig relevant sind.

•Relavant für Cadmium, da ähnlich effizient wie Photosynthese-Inhibition

• Nicht sehr effizient für Blei, aber andere Mechanismen der Toxizität sind hier bei Pflanzen noch weniger effizient Pb-Toxizität für Pflanzen ist generell NICHT umweltrelevant!

Also depends on the plant species!

From: Steinkellner H, et al., 1998, Env.Mol.Mutag. 31, 183-191

Micronucleus (MCN) -Bildung

5. Allgemeine Resistenz-Mechanismen5.1. Schwermetall-Entgiftung mit starken Liganden

Phytochelatine

• Binden mit sehr hoher Affinität Cd2+, andere Metallionen aber wenig

• Speziell zur Cd2+-Bindung synthetisiert von Phytochelatin-Synthase

• Sind der wichtigste Cd-Resistenzmechanismus in den meisten Pflanzen (außerHyperakkumulatoren) und vielen Tieren

• Phytochelatin-Synthase wird von (z.B. durch Cd-Bindung) blockierten Thiolen von Glutathion und ähnlichen Peptiden aktiviert

• Phytochelatine binden Cd2+ im Cytoplasma, dann Tranport des Komplexes in die Vakuole.

• In der Vakuole bilden sich große Phytochelatin-Cd-Aggregate

5. Allgemeine Resistenz-Mechanismen

5.1. Schwermetall-Entgiftung mit starken Liganden

Metallothionine

• MTs vom Typ I und II binden mit sehr hoher Affinität Cu2+ und scheinen an dessen Entgiftung beteiligt zu sein.

• Aber: Hauptrolle der MTs in Pflanzen vermutllich Metall-Verteilung während des normalen (nicht-gestressten) Stoffwechsels

Glutathion

• Auch Glutathion selbst, der Baustein der Phytochelatine, könnte Schwermetalle binden und somit entgiften - in vivo Bedeutung eher fraglich.

5. Allgemeine Resistenz-Mechanismen

5.1. Schwermetall-Entgiftung mit starken Liganden

Freie Aminosäuren

• Wie beim Metalltransport unter normalen physiologischen Bedingungen, scheinen freie Aminosäuren (v.a. Histidin+Nicotianamin) eine Rolle bei der Entgiftung von Schwermetallen zu spielen.

Andere Liganden

• Diverse Proteine

• Anthocyane: Scheinen in Brassicaceen Molybdän zu binden (Entgiftung oderSpeicherung?)

• Zellwand

• Manche Algen scheiden unter Cu-Stress noch unidentifizierte Thiol-Liganden aus

5.2. Schwermetall-Entgiftung durch Kompartimentierung

Mechanismen

• Generell: aktive Transportprozesse gegen den KonzentrationsgradientenTransportproteine beteiligt.

• Ausschluss aus der Zellen:- in Algen: bei Braunalgen beobachtet- in Wurzeln: siehe Wurzeln

• Einlagerung in die Vakuole: - Pflanzen-spezifischer Mechanismus (Tiere haben keine Vakuolen...)- sehr wirksam, da die Vakuole keine zu hemmenden Enzyme enthält- spart den Aufwand der Synthese von starken Liganden wie Phytochelatinen - wichtigster Mechanismus in Hyperakkumulatoren

• Einlagerung in wenig sensitive Gewebe, z.B. Epidermis ohne statt Mesophyll mit Photosynthese

--> Biologische Funktion der Hyperakkumulation

--> Mechanismen der Hyperakkumulation

--> Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Bodenreinigung und zur Erzgewinnung

Cadmium zu allen Mahlzeiten: Pflanzen mit einem ungewöhnlichen Appetit

Schwermetall-Hyperakkumulation

Effekte von Ni2+ auf das Wachstum und Ni2+ -Konzentrationen im Sproß

(a)

Ni added to the substrate (mg kg-1)

0 1000 2000 3000 4000

Shoo

t dry

wei

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g)

0

2

4

6

8

10

12

14 Thlaspi goesingenseAlyssum bertoloniiAlyssum lesbiacum

Alyssum lesbiacum

(b)

Ni added to the substrate (mg kg-1)

0 1000 2000 3000 4000

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(µg

g-1)

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000Thlaspi goesingenseAlyssum bertoloniiAlyssum lesbiacum

Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, Wieshammer G, McGrath SP (2001) J Exp Bot 52 (365), 2291-2300

Mechanismen der Hyperakkumulation: Komplexierung von Cadmium

hyperakkumuliert von Thlaspi caerulescens (Ganges-Typ)Analysiert mit Röntgenabsorptions-Spektroscopie

young mature senescent dead0

20

40

60

80

Perc

ent o

f all

ligan

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indi

ng to

Cd

Developmental stage of leaves sulphur ligands N/O ligands

stems petioles leaves0

20

40

60

80

Per

cent

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ll lig

ands

bin

ding

to C

d

Tissue

Küpper H, Mijovilovich A, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH (2003) Plant Physiology 134 (2), 748-757

Komplexierung von Kupferim Cu-sensitiven CdZn-hyperaccumulator T. caerulescens

Analysiert durch XAS von gefrorenen Blättern

Cd: Küpper H, Mijovilovich A, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH (2003) Plant Physiology 134 (2), 748-757Cu: Mijovilovich A, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH, Küpper H - unpublished

Cu-K-edge EXAFS

Akkumulation der Metalle in Hyperakkumulatoren

• Größter Bioakkumulationskoeffizient bei kleinen Schwermetall-Konzentrationen (--> Tafelbild)

• Akkumulation meist in Epidermis-Vakuolen

• Aktiv gegen Konzentrationsgradient durch natürliche Überexpression von Metall-Transportproteinen

• Viele Transporter überexprimiert, aber bisher unklar, was primäre und was dadurch verursachte sekundäre Überexpression ist

• Regulation der Überexpression unbekannt

• Gene der meisten Metalltransporter bekannt

• biochemisch-biophysikalischer Mechanismus der Funktion, und dreidimensionaleProteinstruktur bei keinem Schermetall-Transportprotein vollständig bekannt

Kompartimentierung der Metalle in BlätternZn/Cd/Ni -Akkumulation in Epidermis- Vakuolen

von Thlaspi und Alyssum -ArtenCompartmentation in leaves of Thlaspi caerulescens Alyssum bertolonii

Zn Mg P S Cl K0

2

4

6

8mature leaves

mM

/mM

Ca

Zn Mg P S Cl K0

2

4

6

8 young leaves

mM

/mM

Ca

upper epidermis upper mesophylllower mesophyll lower epidermis

Concentrations of elementsin leaf tissues

Zn K α line scan and dot map of a T. caerulescens leaf

Ni K α line scan and dot map of a A. bertolonii leaf

Zn: Küpper H, Zhao F, McGrath SP (1999) Plant Physiol 119, 305-11Ni: Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, Wieshammer G, McGrath SP (2001) J Exp Bot 52 (365), 2291-2300

Kompartimentierung von Metallen in BlätternKorrelation zwischen Metallkonzentrationen

im Mesophyll von Arabidospis halleri

0 2 4 6 8 100

5

10

15

20

25

data pointsregression line (R = 0.79; P < 0.0001) 95% confidence limits

Mg

/ mM

Cd / mM0 20 40 60

0

2

4

6

8

10

data points regression line (R = 0.94; P < 0.0001) 95% confidence limits

Cd

/ mM

Zn / mM

Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, McGrath SP (2000) Planta 212, 75-84

Cd-Stress im Zn-/Cd-hyperakkumulator T. caerulescens: Verteilung von Photosystem II-Aktivität

Cellular Fv/Fm distribution in a control plant

Distribution of Fv/Fm in a Cd-stressed plant

0

10

20

30

T. caerulescens

C

Con

trol

0

10

20 D

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0

10

20 EAc

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0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00

10

20 F

Fv / Fm

Acc

limat

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0

10

20

T. fendleri

Con

trol

A

0

10

20 B

Str

esse

dKüpper H, Aravind P, Leitenmaier B, Trtilek M, Šetlík I (2007) New Phytologist 175, 655-674

Regulation der ZNT1-Transkription analysiert durchquantitative mRNA in situ-Hybridisierung (QISH)

in einer nicht-hyperakkumulierenden und einer hyperakkumulierenden Art

Küpper H, Seib LO, Sivaguru M, Hoekenga OA, Kochian LV (2007) The Plant Journal 50(1), 159-187

spon

gy m

esop

hyll

phloe

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ndle

shea

thpa

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epide

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s

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rmal

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idiary

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cells

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

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)

10 µM Zn2+ Thlaspi caerulescens 10 µM Zn2+ Thlaspi arvense 1 µM Zn2+ Thlaspi arvense

Scheme from: Solioz M, Vulpe C 1996) TIBS21_237-41

Reinigung und Characterisierung einer Zn/Cd transportierenden P1B-typ ATPase aus natürlicher

Überexpression in Thlaspi caerulescens

Parameswaran A, Leitenmaier B, Yang M, Welte W, Kroneck PMH, Lutz G, Papoyan A, Kochian LV, Küpper H. (2007) BBRC 364, 51-56

Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Bodenreinigung:Phytoremediation

Aufnahme des Metalls in Hyperakkumulatoren. Nach diesemProzess ist das Metall durch den hohenBioakkumulations-Koeffizienten der Hyperakkus in einem viel kleineren Volumen konzentriert. Die geernteten Pflanzen werden verbrannt; die Asche wird entweder deponiert oder erneut zur Metallgewinnung eingesetzt.

Pflanzenart Max. Cd Biomasse Cd-Entfernungmg/kg DW t DM/ha g/(ha*Jahr)

Arabidopsis halleri 100 2 200Thlaspi caerulescens (Prayon) 250 5 1250Thlaspi caerulescens (S. France) 2500 5 12500Dichapetalum gelonoides 2.1 5 10Athyrium yokosense 165 2 330Arenaria patula 238 2 476Sedum alfredii 180 5 900Weide/Pappel 2.5 20 50Upland Rice 40. 10 400

Daten aus Feldexperimenten von Rufus Chaney (USA), präsentiert auf Konferenz in Hangzhou 2005

Vegetation auf natürlich nickelreichemBoden (Serpentin). Solcher Boden ist weder für die Landwirtschaft (Ni-Konz. viel zu hoch) noch für die konventionelle Erzgewinnung tauglich (Ni-Konz zu niedrig).

Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Metallgewinnung:Phytomining

Werden Nickel-Hyperakkumulatoren auf solchen Böden angebaut, reichern sie mehrere Prozent ihrer Trockenmasse an Nickel an. Nach Verbrennung enthält die Asche 10 bis 50% Nickel, so dass sie als “Bio-Erz”genutzt werden kann.

So eine “Pflanzenmine” kann, Feldstudien unter kommerziell anwendbaren Bedingungen zufolge, etwas 170 kg Nickel pro Hektar und Jahr produzieren. Beim derzeitigen (6.12.07) Nickelpreis von fast 18 € pro Kilo Rohnickel sind das etwa 3000 €.ha-1.

Phytomining pictures from R. Chaney

Alle Folien meiner Vorlesungen im Internet unter

http://www.uni-konstanz.de/FuF/Bio/kuepper/Homepage/AG_Kuepper_education.html

weiterführende Literatur als pdf auf Anfrage