Serotoninfreisetzung aus isolierten Granula enterochromaffiner Zellen

Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Path. u. Pharmak. 253, 409--420 (1966)

Serotoninfre i se tzung aus isol ierten Granula enteroehromaff iner Ze l l en* **

F. LEMBECK u n d H. HELD

Pharmakologisches Institut der UniversitEt Tiibingen (Direktor: Prof. Dr. F. LE~BECK)

Eingegangen am 15. Noveraber 1965

Die Granula der chromaffinen Zellen der Darmsch le imhaut s ind morphologisch den Nebennie rengranu la ~hnlich. Beide bestehen aus einem lockeren osmiophilen Gerfist u n d einer Membran. Beide speichern Amine. W~hrend die Aminabgabe aus den Nebenn ie renmarkgranu la und ihre Beeinflussung durch verschiedene Fak to ren eingehend untersucht wurden (EuLER 11. LISHAJKO, 1961 ; SCHOMA~ U. PHILIPPU, 1962 ; PHILIPPU U. SCHOMA•N, 1963; PHILIPPU, I:)AL~¢I U. S C l t 0 M A N N , 1965), ist fiber die Serotoninfreisetzung ans den isolierten Granula der enterochromaffinen Zellen wenig bekannt . I n den vorl iegenden Un te r suchungen interessier ten vor allem die Fragen, ob sich

1. die serotoninhal t igen Granula hinsichtl ich der Aminabgabe ghn- lich verha l ten wie die Granula aus dem Nebenn ie renmark u n d

2. ob P h a r m a k a durch direkte E inwi rkung auf die aus dem Zell- ve rband isolierten Granula Serotonin freisetzen k6nnen .

Methodik a) Gewinnung des 18000 g-Sediments. Kaninchen verschiedener Rassen wurden

durch Nackenschlag und Entbluten getStet, der Dfinndarm entnommen, der Lgnge nach aufgeschnitten, bei ~- 4 ° C mehrmals mit 0,9o/0 KochsalzlSsung gewaschen und dann die Schleimhaut mit einem Spatel abgeschabt. Alle weiteren Arbeitsg~nge bis zur Inkubation erfolgten im Kfihlraum bei ~- 4 ° C. Die Schleimhaut wurde mit der neunfachen Menge 0,32 M SaccharoselSsung homogenisiert (Glashomogenisator, Fa. Braun, Melstmgen). Bei 900 × g 10 min wurden Zellkerne und Zell~riimmer ab- zentrifugiert; dieses Sediment wurde in der fiinffachen Menge SaccharoselSsung suspendiert und erneut bei 900 × g 10 min lang zentrifugiert. Der erste und zweite Uberstand wurden vereinigt und bei 18000 × g 20 min lang zentrifugiert; das dabei gewonnene Sediment enth~lt neben Granula die Mitochondrien und andere Zell- bes¢andteile. Es wurde das aus der Schleimhaut eines Kaninchens gewonnene 18000×g-Sediment in 0,6 ml 0,32 M SaccharoselSsung pro Gramm Schleimhaut auspendiert und zur gleichm~igen Verteilung der Bestandteile nochmals homogenisiert. Diese Suspension wird im folgenden der Einfachheit halber als ,,Gramfla- suspension" bezeichnet.

* Herrn Prof. Dr. O. SCHAV~A~ zum 75. Geburtstag gewidmet. ** Kurzmitteilung: Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Path. Pharmak. 247,

309 (1964). Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Path. Pharmak., Bd. 253 28

410 F. LEMBECK und H. HELD:

b) Gradientenzentri/ugation des 18000 g-Sediments. Das 18000 g-Sediment aus ca. 30 g Schleimhaut wurde in der sechsfachen Menge SaccharoselSsung suspendiert. Je 1 ml dieser Suspension wurde einem Saccharosegradienten, bestehend aus 2,0 ml 1,8 M und 1,5 ml 1,2 M SaccharoselSsung fiberschichtet. Naeh Zentrifugieren bei 105000 X g 60 rain (SW 39-Rotor, Spinco) wurde in zwei RShrehen der Serotonin- gehalt der Fraktionen und in einem RShrchen der Stickstoffgehalt der Fraktionen nach KJELDAHL bestimmt.

c) ln]cubation der Granulasuspension. Je 1,0 ml der Granulasuspension wurde in ein ZentrifugenrShrchen pipettiert und mit je 1,0 ml ,,ZusatzlSsung" vermischt. Die ,,ZusatzlSsung" war entweder 0,32 M SaccharoselSsung oder isotonisehe Ka- liumphosphatpufferlSsung vom pH 6,8 und pH 7,2 (siehe Ergebnisse). Die gepriiften Pharmaka wurden in der ,,ZusatzlSsung" gel6st; ihre Konzentrationsangabe wird auf die Endkonzentration im RShrchen bezogen. Nur ATP wurde mit Riicksicht auf die rasche ZerstSrung alle 15 rain w~hrend der Inkubation zugesetzt (EuLER U. LISttAJKO, 1963).

Jede Substanz wurde in 4- -6 Ans~tzen, jeweils mit der Sehleimhaut ver- sehiedener Kaifinchen, untersueht. Die Inkubation erfolgte bei 0°C bzw. 31°C in einem Wasserbad mit einer Schiittelfrequenz yon 80/rain. Nach 25 bzw. 50 rain wurden die RShrehen bei 0 ° C abgekiihlt und bei dieser Temperatur bei 28000 × g 20 min lang zentrifugiert. Die Serotoninbestimmung erfolgte jeweils im Sediment dieses Zentrifugates.

Bei jedem Ansatz wurde der Serotoningehalt in einer Granulasuspension ohne In]cubation bestimmt ( : Kontrollwert). Dazu wurde die Granulasuspension saint ZusatzlSsung sofort bei 28000 × g 20 min und 0 ° C zentrifugiert. Der Mitte]wert der 54 Kontrollen betrug 3,43 tzg Serotonin]Probe.

Bei jedem Ansatz, der unter Zusatz yon Pharmaka inkubiert wurde, wurde eine Probe derselben Granulasuspension ohne Pharmakazusatz mitinkubiert, um die Spontan/reisetzung w~hrend der Inkubation zu ermitteln.

Die Bewertung der Serotonin/reisetzung erfolgte durch Vergleich der Spontau- freisetzung ( = Kontrollwert minus Inkubat ohne Pharmakazusatz) mit der Frei- setzung unter Pharmakazusatz ( = Kontrolhvert minus Inkubat mit Pharmaka). Die statistische Bewertung erfolgte nach dem t-Test in Paaren.

d) Serotoninbestimmung. Die Extraktion des Sediments und die spektrophoto- fluorimetrische Serotoninbestimmung erfolgte nach WEISS~ACH, WAALKES U.

UDENFI~IEND (1958). Von allen auf die Freisetzung yon Serotonin untersuchten Pharmaka wurde

bei der Anregungswe]lenlange 295 m[z ein vollstandiges Fluoreseenzspektrum ver- messen, um StSrtmgen im Bereieh der Emissionswellenli~nge des Serotonins (545 m~z) durch zugesetzte Stoffe auszuschlieBen. Nur bei Reserpin (LSsung pH 1,0, An- regung 295 m~z) wurde im Bereieh yon 495 m~z ein Emissionsmaximum beobaehtet, welches die Serotoninbestimmung stOrte. Reserpin wurde durch ffinfmaliges Aus- schiittehl mit 20 ml Chloroform entfernt; der Serotoningehalt in der wi~13rigen Phase blieb dabei unverandert erhalten. Bei den Inkubaten mit 0,25 [zM/ml Reserpin unter Luftzutri t t wurde ein Emissionsmaximum bei 440 mtz beobachtet; es ver- schwand dureh Aussehiitteln mit Chloroform nieht. Wurde die Inkubation unter N~ durchgefiihrt, dann wurde dieses Emissionsmaximum nicht beobaehtet.

e) Verwendete Substanzen. Aeetylcholinchlorid (Hoffmann-La Roche); 1-Adre- nalinbitartrat (Farbwerke ttoechst); ATPNa~H 2 • 3 H~O (C. F. Boehringer & Soehne); Eserinsulfat; Sebacyldicholln (Stickstoffwerke Linz); Hexamethonium (Stickstoffwerke Linz); Cocainhydrochlorid; Reserpin als lyophilisiertes Phosphat (CIBA) ; Guanethidin (Ismelin®) (CIBA); Prenylaminlaetat (Segontin®) (Farbwerke Hoeehst); P 286 (N,N-Diisopropyl-N'-isoamyl-N'-diathylaminoiithylharnstoff (Pit-

Serotoninfreisetzung aus isolierten Granula 411

man Moore); NasEDTA (Idranal III) (Riedel de Haen); Lipase (Pankreaslipase 2000 E]g) (Dr. Theodor Schuchardt); Chymotrypsin (8000 ATEE-Einheiten/mg) (Dr. Theodor Sehuehardt).

Die Mengenangaben yon Substanzen, die als Salze verwendet wurden, sind jeweils auf die Base bezogen.

Ergebnisse 1. Gradientenzentri/ugation des 18 000 g-Sedimentes (vgl. Methodik b)

In Anlehnung an die Methode yon PRUSOFF (1960) wurde eine Sac- charose-Gradientenzentrifugation des 18000 g-Sediments durehgeffihrt. Es ergaben sich vier Fraktionen (Abb. 1).

Die Suspension der Fraktion IV in 0,32 molarer SaceharoselSsung ergab beim erneuten Zentrifugieren bereits eine Freisetzung yon etwa

8 <'O5

/7

P B-

7 - i 0 1.2 0

- 1 m i l l IT 0.3 3.17 0.096

III 0.9 1.1 0.81

~ " ' ~ ' J IV 3.3 0.96 3.33 25"

Abb. 1 Abb. 2

Abb.l. GradienSenzentrifugation des 18000 g-Sedirnentes nach der Methode yon PRUSOI~F (1960)

Abb.2. Sero$oninabgabe aus isolierten Granula in 0,32 I~ Saccharose. ~ 0 ° C; ~ 31 ° C

d

50 m[n

der Hi~lfte des Serotonins aus den Granula. Diese offenbar sehr grebe Labiliti~t der Granula in dieser Fraktion und die langwierige Auf- bereitung schienen daher ffir eine breitere Untersuchung nicht geeignet. Die Inkubationen warden daher mit dem 18000 g-Sediment durehgeffihrt.

2. Ein/lufl der Temperatur (Abb. 2)

Je 1,0 ml der Granulasuspension wurden mit 1,0 ml 0,32 M Saccharose- 16sung versetzt und gleichzeitig jewefls bei 0°C und 31°C inkubiert. Bei 31°C warden in 25 min durchschnittlich 1,2 ~g Serotonin und in 50 rain 1,8 ~g Serotonin freigesetzt, was etwa 25°/0 bzw. 35°/0 des Se- rotoningehaltes der Granula des Ansatzes entspricht. Bei 0°C lag die Freisetzung im Bereich yon 5°/o des Serotoningehaltes dieses Ansatzes.

3. Einflufl yon isotonen Saccharose- und KaliumphosphatpuHerlSsungen (Abb. 3)

Zu je 1,0 ml Granulasuspension wurde 1,0 ml 0,32 M Saeeharose- 16sung oder Phosphatpufferl6sung (pH 6,8) zugesetzt und inkubiert. Die Freisetzung in beiden L6sungen wies keine Unterschiede auf.

28*

4 1 2 ]~. LEMBECK u n d H . H E L D :

27 P 3

8 8

>'7 >'7 8 S G 6

<'05 <'05 <'OS <'07 8 8

<'07 <'07

2# 5O 5mM Mg eL z

J 25 50

/OmlVl

Ca CL2

25 JOmin ,,4-m M

Na~ EDTA

Abb.3. Serotoninabgabe aus isolierten Granula bei deren Suspensionen in F--1 Kaliumphosphat- puffer p i t 6,8 ~ Saccharose und mit ~ Zus~tzen (MgCl,, CaCl~, Na,EDTA)

T a b e l l e . Beeinflussung der Serotonin/reisetzung aus der Granulasuspension Kursive ZiMer : Hemmung

Beeinflussung der Abgabe yon Serotonin Zusatz Spontan- mit pro ml n rain abgabe Zusatz p

A T P 1,5 ~ M 4 25 - - 0 , 92 - - 1 ,42 ~ 0 ,05 a l l e 4 5 0 - 1 ,54 - - 1 ,50 ~ 0 ,5 15 m i n 4 100 - - 2 , 5 0 - - 2 , 60 ~ 0 ,5

4 2 0 0 3 ,00 - - 2 ,82 ~ 0 ,5

A c e t y l c h o l i n ~ j e 6 2 5 - - 0 , 85 - - 0 , 65 ~> 0 ,1 E s e r i n 0 ,5 IzM 6 5 0 1 ,45 - - 1,01 < 0,05

0 ,5 izM 6 25 - - 0 , 85 - - 0 , 85 ~ 0 ,5 6 50 1 ,45 - - 1 ,36 ~ 0 ,5

A d r e n a l i n 5 ,0 tz)J[ 4 25 - - 0 , 65 - - 0 , 95 ~ 0 ,5

4 5 0 - - 1 ,27 1 ,60 ~ 0,1

S e b a c y l d i c h o l i n 1,2 tzM 6 2 5 - - 0 , 95 0 , 7 6 ~ 0 ,1 6 5 0 - - 1 ,76 - - 1 ,60 >- 0 ,1

H e x a m e t h o n i u m 0 ,5 ~zM 6 2 5 - - 0 , 85 - - 0 , 95 ~ 0 ,1

6 5 0 - - 1 ,45 1 ,56 ~ 0,1

C o c a i n 0 ,5 ~zM 6 2 5 - - 0 , 95 - - 1 ,20 ~ 0 ,1 6 5 0 - - 1 ,56 - - 1,71 ~. 0 ,5

R e s e r p i n 0 ,05 F M 6 2 5 - - 0 , 68 - - 0 , 46 ~ 0 ,1

6 5 0 - - 1 ,56 - - 1 ,33 ~ 0,05

G u a n e t h i d i n 0 ,5 F M 6 2 5 - - 1 ,33 - - 0 , 86 ~ 0 ,05 6 5 0 - - 1 ,60 - - 1 ,80 ~ 0 ,1

Serotoninfreisetzung aus isolierten Gramfla 413

4. Ein/lufl yon Ca ++, Mg ++, Na~EDTA (Abb. 3)

Die Inkubat ion unter Zusatz yon Ca ++ und Mg ++ mui~te wegen der Bildung unl5slicher Phosphatsalze in PhosphatpufferlSsung mit Sac- charoselSsung durchgefiihrt werden. Ca ++ fiihrte zu einer verst£rkten, Mg ++ zu einer verminderten Serotoninfrcisetzung. Der Zusatz yon NaeEDTA bewirkte eine deutliche Hemmung der Serotoninfreisetzung, wobei in diesem Falle Kaliumphosphatpuffer als ZusatzlSsung verwendet wurde.

5. Ein/lu]3 yon Pharmalca (Tabelle)

Es wurden l l Substanzen untersucht, yon denen 9 ohne wesent- lichen (p ~ 0,05) Einflui~ auf die Serotoninabgabe aus der Granula- suspension waren. Nur bei Inkubat ion mit Aeetylcholin ~ Eserin war

p <us <'os <':: <os >': yes >'1 >'s >'s >'7 <'os <~ >': >'os >'s >'s

2: so 2s :o 2s :o 2s so 2s so ~ so z~ :0 2s so

. Pnen~//~m/n , " P 28: :

O,5mM o, smI'i OJmM 0,05mM 1,~mM 1,~mM o,2emI"l o,1~mM O°C 81°C 37% 37°C 0 °C 37°C 37°C 01°C

Abb. 4. Serotoninabgabe aus isolierten Granula bei deren Suspension in 1"7 Kaliumphosphatpuffer pH 6,8; [ ~ mit Zusatz yon Prenylamin und P 286

eine geringe Hemmung zu sehen, ein Befund, dem aber nicht weiter nachgegangen wurde. Die Inkubat ion mit Reserpin und den dazu- gehSrigen Kontrollen erfolgte aus den unter Methodik (d) dargelegten Grfinden unter N2; aueh Reserpin ffihrte zu einer geringen Hemmung der Serotoninabgabe.

Zwei Substanzen, n~mlieh Prenylamin (0,5 mM) und P 286 (1,4 raM) ffihrten zu einer erhShten Serotoninfreisetzung bei 31 ° C. Inkubat ion bei 0°C zeigte, dab bei dieser Temperatur nur durch Prenylamin, nieht aber durch P 286 eine Freisetzung hervorgerufen wird (Abb.4).

6. Inkubation mit Enzymen Bei Inkubat ion mit Chymotrypsin wurde zu je t ,0 ml Granula-

suspension 1,0 ml Kaliumphosphatpuffer yon pH 7,2, bei Inkubat ion

414 F. LEMBEOK u n d H . HELD:

-

mit Lipase ein Katiumphosphatpuffer von 6,8 zugesetzt. Die Kontroll- ans/~tze enthielten Puffer mit jewefls gleiehem pH. Die Inkubationen erfolgten bei 31 ° C. Der Ansatz mit Chymotrypsin zeigte selbst bei der

verwendeten hohen Enzymkonzen- n 6 g' //

tration nur eine unbedeutende Er- P <0,o5 <o,o£ >o,5 >o, o5 hShung der Freisetzung. Unter Lipase kam es hingegen sehon naeh

I 25 min zu einer vollst/indigen Sero- toninfreisetzung (Abb. 5).

25 50 25 50 rain Z/'pc:se Ch~/mo/~:os/~

Abb. 5

I 2

o ~ °

2,5 5 10 20min

Abb. 6 Abb. 5. 8erotoninabgabe aus isolierten Granula bei Inkubation a) in Kaliumphosplmtpuffer pi t 6,8; I---7 ohne bzw. W mi~ 2 E/ml Lipase-Zusatz; b) in Kaliumphosphatpuffer pi t 7,2 ~ ohne bzw.

mit 2000 ATEE/ml Chymo~rypsin

Abb.6, Serotoningehalt der Granulasuspension yon zwei Ansittzen, jeweils bci Inkubation ohne (o, 4) und mit (o, A) 2 E/ml Lipase

Um einen Einbliek in die Gesehwindigkeit dieser Serotoninfrei- setzung dureh Lipase zu gewinnen, wurde in zwei Ans/itzen der in der abzentrifugierten Granulasuspension noeh vorhandene Serotoningehalt bestimmt; es wurde in zwei Ans/~tzen 2,5--20 rain lang mit und ohne Lipasezusatz bei 31°C inkubiert. In beiden Versuchen zeigte sich, dab schon nach 10 min eine vSllige Entleerung der Granula eingetreten war (Abb.6).

Diskussion

Die eatecholaminhaltigen Granula der Nebenniere (mittlerer Kugel- durchmesser: 175 m~ Maus, 200 m~ Hamster, 300 m~ Katze; WETZ- STEIN U. DOERFLER, 1961) sind yon /£hnlieher GrSBe wie die serotoninhaltigen Granula enteroehromaffiner Zellen (mittlerer Kugeldureh- messer: 330 m~x Hamster; WETZSTEI~, DOERFLER U. SCHWrNK, 1962. Kaninchen 100--270 m~; RATZ~NEOFER U. LEB, 1965). Die catecholaminhaltigen Granula in Nerven haben ein wesentlich kleineres Volumen


(;~ 40--50 m~, Rat te ; WOLFE u. Mitarb., 1962). Erstere kSnnen mit ganz ~hnlichen Methoden in Gewebshomogenaten angereichert werden. Allerdings ist dies bei Granula aus Nebennierenmark leiehter Ms bei denen aus Darmschleimhaut, da enteroehromaffine Zellen nur vereinzelt zwischen Tausenden yon anderen Zellen zu linden sind. Mit einer reinen Granulasuspension konnte daher im vorliegenden Falle nicht gearbeitet werden, da die weitgehende Abtrennung fiber Dichtegradientenzentrifu- gation zu aufwendig gewesen w/ire. Daher wurden die Versuche mit dem 18000 g-Sediment eines I{omogenates der Schleimhaut des Kaninchen- dfinndarmes durchgefiihrt.

Hierbei zeigte sich, dab die Serotoninfreisetzung aus den Granula enterochromaffiner Zellen temperaturabh/~ngig ist wie dies auch bei der Catecholaminabgabe aus Granula beobachtet wurde (ScHi~MANN U. W~IGMANN, 1960) ; letztere Granula verloren bei 37 ° C in 120 min etwa 200/0, erstere bei 31°C in 50 min etwa 350/0 ihres Amingehaltes. Bei beiden Granulaarten lag die Aminfreisetzung bei 0°C in 50 min unter 50/0 . In beiden Fallen ist der Aminverlust bei 37 ° bzw. 31 ° C geringer als der aus Herz- oder Nervengranula (ScrIOMA~N, SC~NS~LL U. PrnLIm, C, 1964). Zum Unterschied yon Nervengranula (EuLr~ u. LIS~AJKO, 1963) beeinfluitte ein ATP-Zusatz die Spontanabgabe aus serotoninhaltigen Granula nicht.

Calcinmionen ffihren zu einer Aminabgabe aus isolierten Neben- nierengranula (ScHi~MA~N U. PHrL~PPg, 1963). Die gleiehe Beobachtung konnte an serotoninhaltigen Granula gemaeht werden. Die Aminfrei- setzung durch hShere Mg-Konzentrationen wird yon dan eben genannten Autoren fiber eine intragranul/~re oder intraeellulare Calciumfreisetzung erkl/~rt. Zum Unterschied yon Nebennierenmarkgranula ba t aber Mg in gleieher Konzentrat ion (die an diesen zu einer Freisetzung ffihrt) eine Hemmung der Serotoninabgabe aus den Granula enteroehromaffiner Zellen zur Folge. Es ist bisher nieht bekannt, ob aueh fiir Serotonin ein ATP-Mg-Amin-Speieherkomplex (CAI~LSSO~, HILLARP U. WALD~CK, 1963) vorliegt. An Herz- oder Nervengranula ist Ca und Mg ohne Ein- flul~ auf die Aminabgabe ( S c H O M ~ , SC~ELL U. P~ILrePU, 1964).

EDTA verringert den Ca-Gehalt der Nebennierenmarkgranula; nach VordurchstrSmung der Nebennieren mit EDTA bewirkt Calcium nach wie vor eine Aminfreisetzung; Mg wird aber unwirksam (ScHt2MANN U. PI~ILr2PV, 1963). Die Inkubat ion serotoninhaltiger Granula mit Na~EDTA ffihrt zu einer Verminderung der Aminabgabe, so dab aueh in diesem Falle ein calcinmabhi~ngiger Abgabemechanismus anzunehmen ist.

Ahnlich wie bei den Nebennierengranula (Sc~ffMAN~ U. ~VEmMA~N, 1960) ist auch die Aminabgabe aus serotoninhaltigen Granula in Luft und N2-Atmosph~re gleich. Bei Suspension der Granula in Saccharose- und KaliumphosphatpufferlSsungen war kein signifikanter Untersehied


in der Spontanfreisetzung yon Serotonin zu erkennen. Auch ATP-Zusatz blieb, anders als bei Milznervcngranula (EuL]~R u. LISHAJKO, 1963) ohne Wirkung auf die Serotoninfreisetzung. Nur zwei Substanzen, n~mlich Prenylamin und P 286 ffihrten zu einer vermehrten Serotoninabgabe aus serotoninhaltigen Granula. Prenylamin setzt die Scrotoninmenge verschiedener Organe in vivo herab (Sc~6~E u. LL~DNER, 1960). Es ffihrt zur Abgabe von Ca, Mg, ATP und Catecholaminen bci Zusatz zu isolierten Nebennierengranula (CARLSSON, HILLARP U. WALDECK, 1963; I~ILIPPU U. SCHt~MANN, 1964; PmLH'PTJ, PALM U. SC~ffMANN, 1965), ebenso wie bei Zusatz zu isolierten Herz- und Nervengranula (ScHt)MA~N, SCHNELL U. PHILIPPU, 1964; EULER, STJA~NE U. LISltAJKO, 1964; GROBECKER, PALM U. SCHUMA~ 1965). In den Versuchen an serotoninhaltigen Granula war zu beobaehten, dal3 Prenylamin sowohl bei 31 + C als auch bei 0 ° C eine Aminabgabe bewirkt. Entsprechende Versuche an Catecholamingranula liegen nicht vor; doch wurde beobachtet, dab die Freisetzung von Catecholaminen durch Calcium sowohl bci 37°C als auch bei 0 ° C erfolgte. Aus Milznervengranula wird die Aminfreisetzung durch Prenylamin in niederer Konzentration gehemmt, in hoher Kon- zentration aber beschleunigt (EULER, STJXRNE U. LISttAJKO, 1964). P 286 sctzt den Catecholamingehalt der Nebennieren und anderer Or- gane in vivo herab, hat aber daneben eine hemmende Wirkung auf die durch elektrische Reizung der Splanchnikusnerven bewirkte Catechol- aminabgabe aus den Nebennieren (Sc]:[AEPDI~¥VER U. PREZIOSI, 1959; SCHAE~DRYVEn, 1959). Untersuchungen seiner Wirkung an isolierten Nebennierengranula liegen nicht vor. An serotoninhaltigen Granula fiihrte es nur bei 31 ° C, nieht aber bei 0 ° C zu einer Aminabgabe, woraus auf einen anderen Mechanismus als bei Prenylamin gesehlossen werden mu6.

Reserpin (0,2 ~Mol) setzt aus isolierten Nebennierengranula (Rind), ahnlich wie Segontin, neben Cateeholaminen aueh Calcium, Magnesium und ATP frei (tMrLirPv u. SCHt)~AN.~, 1964; P~rmr~u, PALM U. SCHU- MAnn, 1965). Hingegen beschrieben EULER U. LISHAJKO (1961) cine Hem- mung der Catecholaminabgabe aus Nebennierengranula (Katze, Ka- ninchen) und aus Nervengranula (Rind) unter Reserpin (16 ~Mol). STJJ~RNE U. SCttAPII~O (1959) fanden ebenfal]s keine Catecholamin- abgabe aus Nebennicrengranula bei Inkubat ion mit Reserpin (6 [zg/ml). An serotoninhaltigen Granula war in einer Konzentration bis zu 0,25 mMol Reserpin eine geringe Hemmung zu sehen.

Da Tyramin die Catecholamine aus isolierten Nebennierenmark- granula verdr/~ngen kann (ScHffMA~N U. PHrmrPv, 1962) und diese Granula andererseits auch in der Lage sind, Serotonin aufzunehmen (CAI%LSSOI~ ~, I:[ILLARP U. WALDECK, 1963), wurde gepriift, ob etwa Adrenalin zu einer Verdr~ngung des Amins aus serotoninhaltigen Granula fiihren k6nn~e, was aber nicht der Fall war.

Serotoninfreisetzung aus isolierSen Granula 417

Cocain war ohne Einflul~ an catecholaminhaltigen Granula (SCHO- ~ANN U. W]~IOMANN, 1960), was sieh auch an serotoninhaltigen Granula best~tigte. Guanethidin (1--3 ~zMol/ml) ffihrt zur Aminabgabe aus Nebennierengranula (PHILIPPg u. SCHOMANN, 1962), nicht abet aus serotoninhaltigen Granula.

Gangliongr erregende (Sebaeyldicholin, BRffCKE, 1960) und hemmende (Hexamethonium) Substanzen hat ten keinen Einflu] auf die Aminabgabe aus serotoninhaltigen Granula ebenso wie auf die Catechol- aminabgabe aus isolierten Nebennierengranula (CAxLSSON, HILLAI¢P U. WALDECK, 1963) und Milznervengranula (Evz]~R u. LIS~AJKO, 1961). Die geringe Abgabehemmung yon Serotonin unter dem Einflu{~ yon Acetylcholin und Eserin ist unklar; nur CARLSSO~, HILLAnP U. WALDEOK (1963) beobachteten einen geringen hemmenden EinfluB yon Eserin auf die Catecholaminaufnahme in Nebennierengranula. Die in vivo durch Acetylcholin hervorgerufene und fiber einen Calcium-Mechanismus er- folgende Catecholaminfreisetzung (ScHi2MA~N u. PHILIm'V, 1963), sowie die geringe Serotoninfreisetzung aus dem Darm in vivo mittels Lobelin (ScHIEVELBEIN, WERLE U. ECKERT, 1963) gehen also vermutlich auf eine Wirkung an der Zelle, nicht aber an den Granula zurfick.

Elektronenmikroskopische Bilder der serotoninhaltigen Granula (RATzENHOFER U. LEB, 1965) zeigen eine Membran, ~hnlich wie die der catecholaminhaltigen Granula. Die Membran letzterer besteht wahr- scheinlich nur aus Lipoproteinen (KLEINSCHMIDT U. SCHUMANN, 1961); der Gehalt der Granula an Lipoiden ist sehr hoeh; n~mlich 38°/0 des Trockengewiehts (tt~LLAm" U. NILSO~, 1954).

Enzymatische Untersuchungen, die fiber den Aufbau der serotoninhaltigen Granula AufschluB geben sollten, ergaben keine nennenswerte Wirkung des Chymotrypsins, abet eine sehr rasche Serotoninfreisetzung aus den Granula durch Lipase, woraus auf eine vorwiegende Lipoid- s t ruktur der Granulamembran geschlossen werden kann. Ffir einen hohen Lipoidgehalt in serotoninhaltigen Zellen sprechen auch die Be- funde der Thionin-Einschlul3f~rbung an Carcinoidgewebe. F]~YRTE~ (1953) beschrieb metachromasierende Lipoidstoffe, RATZEN~O~ u. LEMm~CK (1954) sahen dunkelrote, s tark lichtbrechende und doppel- brechende Kristalle, die sich mit Sudanrot nur schwach br~unlich an- fi~rbten.

In Nebennierenmarkgranula fanden PHIL1TPU u. SCHOMA~ (1963~ 1964) neben RNS reichlieh Ribonuclease. Sie messen diesem Enzym eine ausl6sende Wirkung bei der Freisetzung yon Aminen, ATP und RNS aus isolierten Granula bei; fiber den RNS- und Ribonucleasegehalt serotoninhaltiger Granula liegen bisher keine Angaben vor.

Die Aminfreisetzung aus serotoninhaltigen Granula erfolgt somit in vielen Punkten gleich oder i~hnlieh wie die Aminfreisetzung aus


cateeholaminhal t igen Granula. Zum Unterschied von letzteren, bei denen angenommen wird, dal~ Acetylchol in-Einwirkung auf die Zclle fiber eine Verschiebung divalenter Ka t ionen die granul~re Freisetzung auslSst, ist n icht bckannt , welches der auslSsende Fak to r ist, der serotoninhal t ige Zelien zur Aminabgabe aus ihren Granula veranlaBt.

Summary 1. The release of 5-HT from the rabb i t ' s in tes t ina l mucosal granules

which were accumula ted in an 18000 × g sediment was studied in vitro under various conditions.

2. At 0°C within 50 nfin less t han 5°/o of the original 5-HT was released spontaneous ly when the sediment was resuspended in a potassium phosphate buffer. At 31°C, however, about 35°/0 of 5-HT were released spontaneous ly from the sediment resuspended either in sucrose or potas- s ium phosphate buffer.

3. Addi t ion of I0 mM Ca++ increased the spontaneous release of 5-HT, whereas 5 mM Na2EDTA or 20 mM Mg++ reduced it.

4. The release of 5-HT at 31°C was increased by prenylamine and compound P 286; with prenylamine the same effect was obta ined at 0°C.

5. The following substances were found to be wi thout significant effect on the release of 5-HT : ATP, adrenaline, sebacyldicholine, hexamethonium, guanethidine, cocaine and reserpine.

6. I n c u b a t i o n of the 18000 × g sediment with chymotryps ine was wi thout effect compared with spontaneous release of 5-HT at 31°C. After incuba t ion with lipase, however, 5-HT was released completely wi thin 10 min.

7. I t was concluded from these exper iments t ha t the storage and release mechanisms are similar for catecholamines and 5-HT and the mem- brane of 5 - I tT conta in ing cell granules is of a lipid structure.

Die Arbeit wurde mit Unterstiitzung der Deutschen Forschungsgemeinschaft durehgefiihrt.

Literatur BR~CKE, F. : Dicholinesters, ~,~o-dicarboxylic acids and related substances. Phar-

macol. Rev. 8, 265 (1960). CAI~LSSON, A., 17N ". A. HILLARP, and B. WALDECK: Analysis of the Mg ++ ATP de-

pendent storage mechanism in the amine granules of the adrenal medulla. Acta physiol, scand. 59, Suppl. 215 (1963).

EVLE~, U. S. v., and F. LIS]-IAJKO : Effect of some drugs on noradrenaline release from nerve granules. Biochem. Pharmacol. 8, 62 (1961).

-- -- Effect of reserpine on the release of catecholamines from isolated nerve and chromaffin cell granules. Acta physiol, scand. 5, °, 137 (1961).

-- -- Uptake of catecholamines by adrenergic nerve granules. Acta physiol, scand. 53, 196 (1961).


EUL~R, U. S. v., and F. LIsm~JXO: Effect of adenine nucleotides on catecholamine release and uptake in isolated adrenergic nerve granules. Acta physiol, seand. 59, 454 (1963).

-- L. S T J ~ E , and F. LIsm~Jxo: Effects of reserpine, segontin and phenoxy- benzamine on the catecholamines and ATP of isolated nerve and adreno- medullary storage granules. Life Sci. 8, 35 (1964).

F]~Y~TER, P. : ~ber die peripheren, endokrinen (parakrinen) Driisen des Menschen. Wien, Dfisseldorf: Maudrich 1953.

GROBECKER, I-[., D. PAL~ U. H. J. SCHi)MAN~: ~ber den Meehanismus der Frei- setzung yon Brenzcateehinaminen dureh Segontin. Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Path. Pharmak. 251, 158 (1965).

HILLA~P, N. A., and B. NILSO~: The structure of the adrenaline and noradrenaline containing granules in the adrenal medullary cells with reference to the storage and release of the sympathomimetic amines. Acta physiol, scand. 31, Suppl. 113, 79 (1954).

-- - - Some quantitative analyses of the sympathomimetic amine containing granules in the adrenal medullary cell. Acta physiol, scand. 82, 11 (1954).

KL]~I~SCH~ID~r, A., u. H. J . SChUmAnN: Strukturuntersuchungen fiber die Adre- nalin und Noradrenalin speichernden Granula des Hebennierenmarks. Haunyn- Schmiedebergs Arch. exp. Path. Pharmak. 241, 260 (1961).

PmL~PU, A., ]). PAL~, and H. J. SChUmANn: Effect of segontin and reserpine on isolated medullary granules. Nature (Lond.) 205, 183 (1965).

- - , u. H. J . SCHi~AN~: ])er Einflul~ yon Guanethidin und Bretylium auf die Frei- setzung yon Brenzcatechinaminen. Haunyn-Schmicdebergs Arch. exp. Path. Pharmak. 248, 26 (1962).

-- -- Die Bedeutung der Ribonucleins~ure ffir die Brenzcatechinamin- und ATP- Speicherung in den chromaffinen Granula des Nebennierenmarks. Haunyn- Schmiedebergs Arch. exp. Path. Pharmak. 246, 7 (1963).

-- -- Die Bedeutung divalenter Kationen fiir die Speicherung der Hebennieren- mark-Hormone in den chromaffinen Granula. NaunymSchmiedebergs Arch. exp. Path. Pharmak. 247, 295 (1964).

- - -- Ribonucleaseaktivit~t isolierter Hebennierenmarkgranula. Experientia (Basel) 20, 547 (1964).

PRUSO~', H. : The distribution of 5-hydroxytryptamine and ATP in cytoplasmic particles of the dog's small intestine. Brit. J. Pharmacol. 15, 520 (1960).

RATZEN~OFER, M., u. D. LEB: ~ber die Feinstruktur der argentaffinen und der anderen Erscheinungsformen der ,,hellen Zellen" Peyrters im Kaninchenmagen. Z. Zellforsch. 67, 113 (1965).

- - , u. F. L~MB~CK: ~be r den Gehalt an 5-Oxytryptamin in Carcinoiden des Darm- traktes. Z. Krebsforsch. 60, 169 (1954).

SCHAEPDRYV~.~, A. F. DE: Physio-pharmacological effects on suprarenal secretion of adrenaline and noradrenaline in dogs. Arch. int. Pharmacodyn. 121,222 (1959).

- - , and P. PREZIOSI: Pharmacological depletion of adrenaline and noradrenaline in various organs of mice. Arch. int. Pharmacodyn. 121, 177 (1959).

SC~IEVELBE~, H., E. WERLE U. J . ECKERT: Experimentelle Untersuchungen zur Wirkung des Lobelins bei der ~icotingewShnung. Arzneimittel-Forsch. 18, 211 (1963).

SCtt0NE, H. i . , u. E. LINDNER: Die Wirkungen des Segontins auf den Stoffwechsel yon Serotonin und Horadrenalin. Arzneimittel-Forsch. 10, 583 (1960).

S c ~ ( ~ A ~ , It . J., and A. P~ILIPPV: The mechanism of catecholamine release by tyramine. Int. J. Heuropharmacol. 1, 179 (1962).

420 F. LEMBECK und H. HELD: Serotoninfreisetzung aus isolierten Granula

SCrrtiMANN, H. J. , u. A. PHILIrPU: Zum Mechanismus der durch Ca ++ und Mg ++ verursachten Freisetzung der Nebennierenmarkhormone. Naunyn-Schmiede- bergs Arch. exp. Path . Pharmak. 244, 466 (1963).

---, K. SCIINELL U. A. PI=[ILIPPU: Subcellul/ire Verteilung yon Noradrenalin und Adrenalin im Meerschweinchenherzen. Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Path. Pharmak. 249, 251 (1964).

-- , u. E. WEIO~A~N: t~ber den Angriffspunkt der indirekten Wirkung sympatho- mimetischer Amine. Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Path. Pharmak. 240, 275 (1960).

STJA-RNE, L., and S. SCHArIRO: Effects of reserpine on secretion from the denerv- a ted adrenal medulla. Nature (Lond.) 184, 2023 (1959).

WEISSBACH, H.T . , P. WAALKES, and S. UDENFI~IEND: A simplified method for measuring serotonin in tissues. J. biol. Chem. 280, 865 (1958).

WETZSTEIN, R., u. W. DoEI%FLER: Elektronenmikroskopie enterochromaffiner Zellen. Verh. Anat. Ges., 57. Vers. in Hamburg v. 23.- -26.5 . 1961.

u. A. SCHWINK: Die Feins t ruktur der enterochromaffinen Zellen und ihrer spezifisehen Granula. Protoplasma (Wien) 55, 303 (1962).

WOLFE, D.E . , L .T . POTTER, K. C. RICHARDSON, and g. AXELROD: Localizing t r i t ia ted norepinephrine in synaptie axons by electron microscopic autoradio- graphy. Science 188, 440 (1962).

Prof. Dr. F. LEMBECK Pharmakologisches Ins t i tu t der Universi t£t 74 Tiibingen, Wilhehnstraf~e 56

Documents

Serotoninfreisetzung aus isolierten Granula enterochromaffiner Zellen