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Großes Hämatologisches Praktikum für Leistungskurse Biologie
© Gläsernes Labor, Helmholtz Zentrum München – Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt
Skriptum
Skriptversion: 17.06.2008
Großes Hämatologisches Praktikum für Leistungskurse Biologie Als „Saft des Lebens“ wurde das Blut früher auch bezeichnet und mit der Seele gleichgesetzt. Auf welchen biologischen Tatsachen beruht aber der mystisch verklärte Ruf des Blutes? Ziel der Versuche in diesem großen, hämatologischen Praktikum ist es, den Schülerinnen und Schülern die Zusammensetzung, die Funktionen und die Leistungsfähigkeit des Blutes zu vermitteln und auf gesundheitsrelevante Bezüge wie Doping und Rauchen aufmerksam zu machen. Über die Bestimmung der Immunzellen führt die Diskussion direkt zur Geißel des 20. und 21. Jahrhunderts, der Krankheit AIDS. Experimente
1. Blutausstrich 2. Dichtegradientenzentrifugation 3. Osmotische Erythrozytenresistenz 4. Hämatokritwertbestimmung 5. Gastransport 6. Sauerstoffaufnahmeminderung durch CO 7. Das ELISA-Verfahren 8. Bestimmung von Immunzellen - CD4 und CD8-Zellen per FACS 9. Kriminalistischer Nachweis von Blut
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Großes Hämatologisches Praktikum 1- Blutausstrich
Der Blutausstrich
A) Blutausstrich anfertigen Nach einer panoptischen Färbung ermöglicht der Blutausstrich Gestalt und Aussehen der Leukozyten (der Begriff Leukozyt kommt aus dem griechischen: leukos = weiss; kytos = Zelle; Synonym: Weißes Blutkörperchen) gut sichtbar zu machen und sie den verschiedenen Gruppen zuzuordnen. Parallel dazu betrachtet man auch die Erythrozyten (der Begriff Erythrozyt kommt aus dem griechischen: erythros = rot; kytos = Zelle; Synonym: Rotes Blutkörperchen) und beurteilt sie nach Größe, Form und Farbe. Diese Basisuntersuchung des Blutes wird als kleines Blutbild bezeichnet.
Material: entfettete und staubfreie Objektträger, Glasstab, Folienstift zum Beschriften der Ausstriche, EDTA-Blut, Alkohol
Versuchsablauf Bemerkungen
Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit Blut beachten! Handschuhe tragen!!
1. Legen Sie zwei Objektträger in einer Linie ausgerichtet nebeneinander
Unbedingt die Objektträger mit Alkohol reinigen!
2. Mischen Sie das Blut durch mehrmaliges Kippen des Blutröhrchens und geben Sie dann mit dem Glasstab einen kleinen Bluttropfen auf das äußere Drittel eines Objektträgers
Den Glasstab dazu schräg an den Objektträger heranführen!
3. Platzieren Sie die schmale Kante des zweiten Objektträgers vor den Blutstropfen auf den liegenden Objektträger
4. Ziehen Sie den Objektträger langsam auf den Blutstropfen und warten Sie, bis sich das Blut entlang der Glaskante verteilt hat
5. Stoßen Sie das Blut mit Hilfe des Objektträgers in einem Winkel von etwa 30° langsam über den liegenden Objektträger
Kontrollieren Sie die Qualität des Ausstrichs durch Betrachten im Gegenlicht (vergleiche unten!)
6. Beschriften Sie sofort den Ausstrich auf der matten Fläche mit Bleistift um Verwechslungen vorzubeugen
Folienstift löst sich bei der Färbung auf!
7. Der Blutausstrich wird anschließend zum Trocknen ausgelegt.
Die Trocknung des Ausstrichs lässt sich durch kurzes Wedeln beschleunigen
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Großes Hämatologisches Praktikum 1- Blutausstrich
B) Blutausstrich färben
In der Hämatologie hat sich die May-Grünwald-Giemsa-Färbung (Synonym: Pappenheim-Färbung oder panoptische Färbung) als Standardfärbung etabliert. Mit dieser Färbemethode ist es möglich, Blutzellen so anzufärben, dass alle geformten Blutbestandteile eines getrockneten Blutausstrichs unterscheidbar werden. Der Vorteil der Pappenheim-Färbung liegt in der sehr feinen morphologischen Differenzierung der Zellen, was ein hohes Maß an diagnostischer Sicherheit gewährleistet.
Material: gut getrockneter Blutausstrich, Schnellfärbeset bestehend aus Fixierlösung, zwei Färbelösungen und Pufferlösung, Fliesspapier zum Trocknen der gefärbten Ausstriche, Mikroskop
Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit Blut beachten! Handschuhe tragen!!
Versuchsablauf Bemerkungen
1. Sie können die Blutausstriche ihrer Gruppe alle zusammen färben, dazu stellen Sie sie, nachdem sie getrocknet sind, in den sog. Färbeschlitten, der zum Eintauchen in die Fixier- und Färbelösungen verwendet werden kann.
Beschriftung der Objektträger nicht vergessen!
Die Färbestation befindet sich an der vorderen Wand des Kurssaals
2. Tauchen Sie den Färbeschlitten 5mal je eine Sekunde in die Fixierlösung (Reagenz 1). Lassen Sie die überschüssige Fixierlösung auf mehreren Stücken Küchenrolle ablaufen.
Durch den in dieser Lösung vorhandenen Methylalkohol (giftig!) werden die Zellen fixiert.
3. Tauchen Sie den Färbeschlitten 3mal je eine Sekunde in Färbelösung 1 (Reagenz 2). Lassen Sie die überschüssige Färbelösung 1 auf dem Küchenpapier ablaufen.
4. Tauchen Sie den Färbeschlitten nun 6mal je eine Sekunde in Färbelösung 2 (Reagenz 3). Lassen Sie die überschüssige Färbelösung 2 auf dem Küchenpapier ablaufen.
Standardisierte und pH-eingestellte Färbelösungen mit Methylenblau (färbt saure Zellbestandteile blau), Methyl-Azur (färbt basische Zellbestandteile rot-violett) und Eosin (färbt basische Zellbestandteile orange-rot), wobei der pH-Wert der Lösung für das färberische Verhalten ausschlag-gebend ist. Da alle Zellbestandteile gefärbt werden, wird diese Färbung auch panoptisch genannt.
5. Geben Sie zum Abschluss den Färbeschlitten für 45 Sekunden in das Becherglas mit der Pufferlösung.
Auswaschen der überschüssigen Färbelösungen
6. Legen Sie den Objektträger zum Trocknen mit der Schichtseite (dort wo Sie den Blutausstrich gemacht haben) nach oben auf das Fliesspapier. Die Auswertung erfolgt anschließend mit dem Mikroskop.
Holen Sie sich einen Kursbetreuer zur Hilfe, wenn Sie noch nie mikroskopiert haben, oder sich nicht sicher sind.
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Großes Hämatologisches Praktikum 1- Blutausstrich
(C) Mikroskopische Beurteilung des Blutausstrichs
Es gibt verschiedene Arten von weißen Blutkörperchen, die sich in ihrem Aussehen unterscheiden. Versuchen Sie mit Hilfe der ausgelegten Folie („Die Leukozyten“) und dem Mikroskop (400-fache Vergrößerung) mindestens drei verschiedene Formen weißer Blutzellen zu unterscheiden. Skizzieren und beschreiben Sie diese.
Großes Hämatologisches Praktikum 2 - Dichte-Gradienten-Zentrifugation
2 - Trennung von Blutzellen durch Dichte-Gradienten-Zentrifugation
Die Dichte-Gradienten-Zentrifugation beruht, wie der Name schon sagt, auf der unterschiedlichen Dichte von Zellen. FICOLL (hydrophile Polysaccharoselösung) hat mit einem Dichtebereich von 1,077 g/ml eine größere Dichte als Lymphozyten und Monozyten. Diese Dichte ist jedoch kleiner als die von Erythrozyten und Granulozyten. Zur Separation gibt man in ein Universalröhrchen FICOLL-Lösung, welche vorsichtig mit heparinisiertem Blut überschichtet wird, so dass sich die zwei Lagen nicht vermischen. Anschließend zentrifugiert man das Röhrchen mit der Blut-Ficoll-Lösung. Während der Zentrifugation wandern Erythrozyten, Granulozyten, Thrombozyten und tote Zellen auf den Boden des Röhrchens. Lymphozyten und Monozyten reichern sich in einer Schicht zwischen FICOLL und Plasma im sog. „Lymphozytenring“ an. Diesen Lymphozytenring kann man vorsichtig abpipettieren. Anschließend werden die isolierten Zellen gewaschen und nach Bedarf verwendet.
Material: 50 ml und 15 ml Falcon-Röhrchen, Ständer, Pipetten, Spritze mit Kanüle, Pipettierhilfe, Zentrifuge, FICOLL, heparinisiertes Vollblut, PBS (phosphate buffered saline)
Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit Blut beachten! Handschuhe tragen!!
Versuchsablauf Bemerkungen
1. Heparinisiertes Vollblut (11ml) wird mit dem gleichen Volumen PBS verdünnt.
Benutzen Sie dazu ein 50 ml Falcon-Röhrchen.
2. Anschließend vier kleine Falcon-Röhrchen bereitsstellen, in die mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle jeweils 2,5 ml FICOLL gegeben wird.
Benutzen Sie dazu 15 ml Falcon-Röhrchen..
3. Von der Blutverdünnung werden jeweils 5 ml vorsichtig auf FICOLL geschichtet.
4. Zentrifugieren Sie bei 2000 U/min für 20 Minuten.
5. Einige Zellpopulationen verbleiben als sog. „Lymphozytenring“ an der Grenze zwischen der PBS-Plasma-Schicht (oben) und der FICOLL-Schicht (unten)
6. Pipettieren Sie die Lymphozyten vorsichtig ab und sammeln Sie sie in einem frischen Falcon-Röhrchen.
Vorsichtig und langsam am Rand einlaufen lassen.
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Großes Hämatologisches Praktikum 3- Osmotische Erythrozytenresiszenz
3 - Osmotische Erythrozytenresistenz
Eine ausreichende Zeitspanne vorausgesetzt, wird so gut wie jedes Molekül durch eine Plasmamembran in Richtung seines Konzentrationsgradienten diffundieren. Die Geschwindigkeit, mit der dies geschieht, variiert jedoch enorm, in Abhängigkeit von der Größe des Moleküls, hauptsächlich aber von seiner relativen Löslichkeit in Öl (d.h. je hydrophober oder unpolarer es ist). So sind Plasmamembranen für Wasser 109-mal durchlässiger als selbst für solch kleine Ionen wie Na+ und K+. Da die Plasmamembran für Wasser schwach durchlässig ist, fließt dies entsprechend seinem Konzentrationsgradienten langsam in die Zelle ein oder aus der Zelle heraus. Dieser Prozess wird als Osmose bezeichnet. Wird die Solutkonzentration im äußeren Milieu (hypotonische Lösung) erniedrigt, bedingt dies eine Gesamtbewegung von Wasser in die Zelle (die Zelle schwillt!). Umgekehrt führt eine hypertonische Lösung zum Austritt von Wasser aus der Zelle (die Zelle schrumpft!). In Abhängigkeit von einer sich ändernden Osmolarität der extrazellulären Flüssigkeit können solche Änderungen des Wasserflusses mikroskopisch sehr gut an Erythrozyten beobachtet werden. Wie lange ein Erythrozyt einem Wassereinstrom standhält, bevor er schließlich platzt (osmotische Hämolyse), ist Ausdruck seiner physiologischen Funktionsfähigkeit und damit von großem diagnostischen Interesse, denn es gibt Krankheiten, bei denen die osmotische Widerstandskraft der Erythrozyten erhöht ist und solche, bei denen sie vermindert ist. Besonders um die letzteren zu erkennen, misst man die osmotische Erythrozytenresistenz.
Material: Reagenzgläser, Reagenzglasständer, weißer Papierstreifen, Tropfpipette, 1% NaCl (Kochsalz)-Lösung, destilliertes Wasser, Folienstift, EDTA-Blut, Labortimer
Versuchsablauf Bemerkungen
Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit Blut beachten! Handschuhe tragen!!
1. Füllen Sie 3 ml NaCl-Lösung der unterschiedlichen Konzentrationen (0,2 – 0,9%) in acht Reagenzgläser (beschriften nicht vergessen!!)
2. Mischen Sie das frische Blut durch mehrmaliges Kippen des Blutröhrchens und geben Sie dann mit der Tropfpipette je 2 Tropfen Blut in jedes Reagenzglas.
3. Reagenzgläser durch hin und her schwenken gut schütteln und bei Zimmertemperatur 10 min stehen lassen.
4. Danach Zentrifugation der Reagenzgläser für 5 min bei 1370 U/min (entspricht 280 g).
5. Direkt nach der Zentrifugation feststellen, in welchen Reagenzgläsern Hämolyse auftritt (s. unten).
Um eine evtl. auftretende Trübung besser beurteilen zu können, empfiehlt es sich hinter die aufgereihten Reagenzgläser einen weißen Papierstreifen zu halten
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Großes Hämatologisches Praktikum 3- Osmotische Erythrozytenresiszenz
Auswertung:
• Man sucht das Röhrchen, in dem die Salzlösung nicht mehr ganz farblos sondern schon leicht rötlich ist. Das ist die Konzentration, bei der die ersten Erythrozyten zerplatzt sind. (Für normale menschliche Erythrozyten wäre das etwa bei einer NaCl-Konzentration von 0.46% der Fall).
• Dann sucht man das Röhrchen, in dem überhaupt keine Erythrozyten mehr am Boden des Röhrchens sind. In diesem Röhrchen sind offenbar alle Zellen zerplatzt. (Für normale menschliche Erythrozyten wäre das etwa bei einer NaCl-Konzentration von 0.3% der Fall).
Für normale menschliche Erythrozyten wird der Referenzbereich für diese Methode daher mit 0.30 und 0.46 angegeben.
Großes Hämatologisches Praktikum 4 - Hämatokritwertbestimmung
4 - Hämatokritwertbestimmung
Der Hämatokrit-Wert (der Begriff Hämatokrit kommt aus dem griechischen: haima = Blut und krinein= trennen, absondern) bezeichnet den Anteil der zellulären Bestandteile am Gesamtvolumen des Blutes und gibt Auskunft über die Fließeigenschaften des Blutes. Bestimmt wird der Hämatokrit-Wert, indem man eine ungerinnbar gemachte Blutprobe in einem Mikro-Hämatokritröhrchen zentrifugiert. Die schwereren Erythrozyten setzen sich dabei ab. Die so gebildete rote Blutsäule wird gemessen und als prozentuales Verhältnis der Gesamtblutsäule angegeben. Den Anteil der Leukozyten (ca. 1%) an den zellulären Bestandteilen des Blutes kann man dabei vernachlässigen. Der Hämatokrit ist sowohl von der Anzahl als auch vom Volumen der Erythrozyten abhängig. Allgemeine Durchführung einer Hämatokritwertbestimmung Material: entfettete und staubfreie Objektträger, Tropfpipette, Mikro-Hämatokritröhrchen, Verschlußkit, Zentrifuge, EDTA-Blut
Versuchsablauf Bemerkungen
Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit Blut beachten! Handschuhe tragen!! 1. Mischen Sie das Blut durch mehrmaliges Kippen des
Blutröhrchens und geben Sie auf die selbe Stelle mit einer Tropfpipette 2 große Bluttropfen auf einen Objektträger
2. Legen Sie sich ein Stück Küchenrolle und den Verschlußkit bereit.
2. Das Hämatokrit-Röhrchen waagrecht (parallel zur Tischoberfläche), mit der nicht markierten Seite an den Blutstropfen heranführen und durch Kapillarwirkung zu ca. ¾ füllen. Nachdem das Röhrchen gefüllt ist, mit Daumen oder Finger am hinteren Ende abdichten.
Keine Luftblasen einsaugen!
3. Reinigen Sie nun mit einem Tuch das vordere Ende des Hämatokritröhrchens
4. Um das Röhrchen zu verschließen drücken sie das vordere Ende mehrmals in den Verschlußkit, so dass am vorderen Ende ein kleiner weißer Pfropfen entsteht.
5. Legen Sie das Hämatokritröhrchen in die Zentrifuge Damit die Zentrifuge nicht unruhig läuft muss sie austariert sein, d.h., Sie müssen immer zwei Röhrchen gegenüber den Rotor einsetzen.
6. Setzen Sie den Rotor in die Zentrifuge ein (auf die Aussparungen unten am Rotor achten!) und schrauben Sie ihn mit dem Deckel fest.
7. Die Röhrchen werden für 15 min bei 5.000 U/min (entspricht 7 700 g) zentrifugiert.
8. Der prozentuale Anteil der Blutkörperchen kann direkt mit der Schablone (Deckel des Rotors ausgemessen werden). Direkt nach der Zentrifugation mit Hilfe der Schablone die verschiedenen Fraktionen ausmessen
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Großes Hämatologisches Praktikum 4 - Hämatokritwertbestimmung
Alternative Auswertung:
Die einzelnen Fraktionen ausmessen und den Anteil der festen Bestandteile in Prozent berechnen.
Plastikmasse
Plasmasäule
Leukozyten Erythrozyten
Auf dem Notebook finden Sie ein Lernmodul mit Fragen und Hintergrundwissen zum Hämatokrit!
Großes Hämatologisches Praktikum 5 - Gastransport
5 - Gastransport des Hämoglobins
Erythrozyten bestehen zu etwa 34% aus dem roten Blutfarbstoff Hämoglobin (der Begriff Hämoglobin kommt aus dem griechischen: haima = Blut und globus =Kugel, wobei mit Globinen kugelartige Eiweißstoffe gemeint sind), der große Bedeutung für den O2 und CO2-Transport und die Pufferfunktion des Blutes hat. Das Molekül setzt sich aus 4 Polypedtidketten mit je einer Farbstoffkomponente (Häm) zusammen, die zentral ein zweiwertiges Eisenatom trägt. Die rote Farbe des Hämoglobins und damit auch des Blutes ist dadurch bedingt, dass kurzwelliges Licht (blau) relativ stark, langwelliges Licht (rot) von Hämoglobin kaum absorbiert wir. Durch Anlagerung von O2 und CO2 verändert sich das Hb-Molekül, und damit sein charakteristisches Absorptionsspektrum, was sich photometrisch quantifizieren lässt, aber auch mit dem bloßen Auge als Farbänderung zu beobachten ist. Der reversibel an das Hämoglobin gebundene O2 führt zu einer hellroten Färbung, wohingegen desoxygeniertes Hämoglobin dunkelrot erscheint.
Material: 2 Stative mit Muffen und Klammern, Messzylinder (50 mL), Gaswaschflasche, Mikroliterpipette, Schläuche, 2 Bechergläser, Tiegelzange, Pinzette, Stoppuhr, Photometer, Küvetten, Blut, 0,9%-NaCl-Lösung, Alkohol, Kohlenstoffdioxid
Versuchsablauf Bemerkungen
Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit Blut beachten! Handschuhe tragen!!
1. Beide Gaswaschflaschen jeweils mit 0,5 ml (=500 µl) Blut und 50 ml 0,9%-NaCl-Lösung füllen.
Lassen Sie sich von einem Betreuer die Mikroliterpipette erklären.
2. Geben Sie jeweils eine Pipette voll Alkohol in die Gaswaschflasche.
Durch Zugabe von Alkohol wird die Oberflächenspannung des Blutes und damit die Schaumbildung verringert.
3. Die Gaswaschflasche mit Hilfe des Stativs fixieren, über die Schlauchverbindung an die Vakuumpumpe anschließen und dann für 30 Sekunden Luft durch das Blut leiten. Dabei permanent die Schaumbildung beobachten. Sobald der Schaum den kurzen Anschluss der Gaswaschflasche erreicht sofort die Pumpe ausschalten und weiteren Alkohol zugeben.
Vor Inbetriebnahme den jeweiligen Aufbau unbedingt von einem Betreuer kontrollieren lassen! Keinesfalls darf Blut in die Pumpe gelangen!
4. Nun fixieren Sie die zweite Gaswaschflasche in der Apparatur um CO2 durch das Blut zu leiten.
Machen Sie sich zuerst mit der CO2 Anlage vertraut, bevor Sie das Gas anschließen. Sie können das Gas entnehmen, in dem Sie den linken, oberen Hahn ganz öffnen und am rechten, unteren den CO2-Strom dosieren.
Schaumbildung beachten! Beachten Sie den Farbumschlag im Vergleich zu der Gaswaschflasche mit oxygeniertem Blut!
5. Prüfen Sie die Reversibilität der Vorgänge, in dem Sie nun wieder Sauerstoff (Luft) durch die zweite Gaswaschflasche leiten und bestimmen Sie die Zeit, die für die Oxigenierung (Stoppuhr!) notwendig ist.
6. Bestimmen Sie mit dem Photometer das Absorptionsspektrum des oxygenierten Blutes von 500 bis 600 nm. Notieren Sie die Maxima!
Die Bedienung des Photometers von einem Betreuer erklären lassen (Probenmenge 1ml).
Auswertung Beschreiben und erklären sie die Veränderungen des Blutes!
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Großes Hämatologisches Praktikum 6 – Sauerstoffminderung durch CO
6 - Sauerstoffminderung durch Kohlenstoffmonooxid
Zigarettenrauch ist ein chemischer Cocktail aus ca. 3.500 bis 4.000 verschiedenen Substanzen. Mehr als 40 Inhaltsstoffe, wie z.B. Teer, Arsen, Benzol und Cadmium, können Krebserkrankungen verursachen; andere Stoffe, wie z.B. Kohlenmonoxid, sind für ihre Giftigkeit bekannt. Aufgrund der größeren Affinität des giftigen Kohlenmonoxids (CO) zu Hämoglobin wird O2 aus der Bindung mit Hämoglobin verdrängt. Es entsteht das kirschrot aussehende CO-Hämoglobin. Der weitere O2-Transport wird dabei blockiert wird. Hierin liegt die Giftigkeit des farb- und geruchlosen CO-Gases begründet.
Material: 2 Stative mit Muffen und Klammern, Messzylinder (50 mL), Gaswaschflasche, Mikroliterpipette, Schläuche, 2 Bechergläser,
Tiegelzange, Pinzette, Stoppuhr, Photometer, Küvetten, Watte, Oxalatblut, 0,9%-NaCl-Lösung, Alkohol, Zigarette, Kohlenstoffdioxid
Versuchsablauf Bemerkungen
Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit Blut beachten! Handschuhe tragen!!
7. Anschließend werden die gesamten Schwelgase dreier Zigaretten durch das Blut gesaugt. Das Kondensat (Teer) soll durch den Filter der Zigarette und die Wattefüllung (auf Luftdurchlässigkeit achten) des dicken Gummischlauchs von Blut und Pumpe fern gehalten werden. Mit wenig (!) Silikonkautschuk am Mundstück die Zigarette zum Schlauch abdichten. Durch An- und Ausschalten der Pumpe ein möglichst realistisches „Paffen“ simulieren.
Es darf kein Rauch in den Laborraum gelangen! Wasserbefülltes großes Becherglas unter die Zigarette!
8. Leiten Sie eben so lange Luft durch das Blut, wie für die Oxygenierung des desoxygenierten Blutes nötig war.
9. Bestimmen Sie mittels Absorptionsspektrum, ob Sauerstoff aufgenommen wurde.
Reinigen Sie gründlich alle mit Blut in Berührung gekommenen Gegenstände! Besonders auf die „Blubberfläche“ der Gaswaschflasche achten: Wasser durchleiten! Entsorgen Sie die verteerte Watte in eine Plastiktüte, die Sie sofort verschließen!
Auswertung Beschreiben und erklären sie die Veränderungen des Blutes!
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Großes Hämatologisches Praktikum 7 – Das ELISA-Verfahren
7 - Diagnostischer Nachweis von Antikörpern: Das ELISA-Verfahren
Immer dann, wenn ein Mensch z.B. an einem bestimmten Virus (etwa Hepatitis B) erkrankt, dann reagiert das Immunsystem dieses Menschen und bildet spezifische Antikörper. Dasselbe gilt für den Fall, dass der betreffende Mensch aktiv gegen dieses Virus geimpft wird. Die gebildeten Antikörper verteilen sich im Blutplasma und in der extrazellulären Flüssigkeit der Gewebe. Dort binden/markieren sie z.B. Krankheitserreger um sie anschließend mit Hilfe von bestimmten Zellen und Proteinen des Immunsystems zu beseitigen. Das ELISA-Verfahren (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) ist eine immunologische Nachweistechnik.
Das Grundprinzip des ELISA-Verfahrens (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) ist die Bindung eines Antikörpers an ein Antigen. Dazu wird eine Mikrotiterplatte vorher mit dem zu bestimmenden Antigen, in unserem Fall das Hepatitis B-Virus, beschichtet. Das Blutserum des Patienten wird auf die Platten pipettiert und man wartet eine bestimmte Zeit ab (Inkubationszeit). Wie bei einer im Körper stattfindenden Antigen-Antikörper-Reaktion bindet in dieser Zeit der Antikörper aus der Serumprobe des Patienten an das Antigen an der Mikrotiterplatte an.
Diese Immunreaktion ist mit dem bloßen Auge nicht erkennbar. Sie muss deshalb über eine enzymatische Farbreaktion sichtbar gemacht werden. Nach Ablauf der Inkubationsphase wird ein Substrat zugegeben, das von dem an den Antikörper gekoppelten Enzym in ein Farbprodukt umgewandelt wird. Je nachdem, wie viel Antikörper in der Serumprobe des Patienten war, ist die Farbstärke unterschiedlich.
Mit Hilfe des ELISA Verfahrens können Bakterien, Viren, Proteine aber auch niedermolekulare Verbindungen wie Hormone, Toxine oder Pestizide in einer Probe (Blutserum, Urin, Milch etc.) nachgewiesen werden. Im medizinischen Alltag wird das ELISA-Verfahren z.B. für den Nachweis von Antikörpern verwendet. Durch diesen Antikörpernachweis kann man feststellen, ob und wie viele Antikörper ein Mensch gegen eine bestimmte Infektion oder nach einer Impfung gebildet hat. Material: Pipetten, Mikrotiterplatte beschichtet mit Antigen, Serumproben von Patienten, Waschlösung, Substratlösung
Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit Blut(produkten) beachten! Handschuhe tragen!!
Sie bekommen eine Serumprobe eines Patienten, von der Sie die Antikörper-konzentration bestimmen sollen. Zunächst müssen Sie eine Verdünnungsreihe dieser Serumproben herstellen.
Herstellung der Verdünnungsreihe
Versuchsablauf Bemerkungen
1. Bereiten Sie für jede Patientenprobe jeweils 10 Reaktionsgefäße vor und beschriften Sie diese.
Der Gebrauch der Mikropipetten wird von einem Kursbetreuer erklärt!
2. Pipettieren Sie in jedes dieser 10 Reaktionsgefäße 100µl Verdünnungslösung.
3. Anschließend nehmen Sie aus den Serumproben der Patienten 100 µl und pipettieren dieses Volumen in das jeweils 1. Reaktionsgefäß der Verdünnungsreihe.
4. Für die erste Verdünnungsreihe nehmen Sie 100 µl aus diesem Reaktionsgefäß Nr. 1 (gefüllt mit 200 µl) und pipettieren daraus 100 µl in das Reaktionsgefäß Nr. 2.
Gut vermischen (mit dem Vortex-Mixer!)
5. Anschließend werden 100 µl aus Reaktionsgefäß Nr. 3 in das Reaktionsgefäße Nr.4 pipettiert usw. bis zum Ende der Verdünnungsreihe.
Wiederum gut vermischen
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Großes Hämatologisches Praktikum 7 – Das ELISA-Verfahren
Durchführung des ELISA-Tests
1. Aus jedem Reaktionsgefäß pipettieren Sie nun 100 µl der jeweiligen Verdünnung in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte (in die 10. Vertiefung die 10. Verdünnung der Serum, in die 9. Vertiefung die 9. Verdünnung usw.)
Mit der größten Verdünnung beginnen!
2. Der Ansatz wird anschließend für mindestens 30 min bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Inkubationsphase Während der Inkubationsphase bindet der Enzym-markierte Antikörper an sein Antigen
3. Danach werden die Vertiefungen 5-mal mit PBS gewaschen Ungebunden Antikörper werden durch den Waschvorgang entfernt. In der Vertiefung verbleibt nur der gebundene Antikörper.
4. Anschließend werden werden jeweils 100 µl Substratlösung (Chromogen mit Wasserstoffperoxyd) in die Vertiefungen gefüllt und etwa 5 min inkubiert.
Enzymatische Nachweisreaktion!
Großes Hämatologisches Praktikum 8 – Bestimmung von Immunzellen
8 - Immunstatus: Bestimmung der Helfer-T-Zellen im FACS
Mit Hilfe des Mikroskops kann man die Leukozyten in Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten unterteilen. Man fand bald heraus, dass die im Mikroskop relativ einheitlich wirkenden Lymphozyten aus verschiedenen Populationen bestehen: B-Lymphozyten und T-Lymphozyten. Letztere unterteilen sich in zwei Subgruppen, die CD4+ Zellen (Helfer-T-Zellen) und die CD8+ Zellen (Killer-T-Zellen). Mit Hilfe von Fluorochrom-markierten Antikörpern und der Technik der Durchflusszytometrie (Fluorescence-Activated Cell-Sorting; FACS) gelingt es heute recht einfach diese Populationen im Blut eines Menschen qualitativ und quantitativ zu bestimmen. Werden Zellen eingesetzt, die mit Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern markiert sind, lassen sich diese Zellen über die emittierte Fluoreszenz des Farbstoffes genauestens zuordnen. Eine aktuelle Anwendung dieser Methode ist die Bestimmung des Immunstatus (Leistungsfähigkeit der Immunabwehr) von HIV-infizierten Patienten an Hand der CD4+-Zellen(Helfer-T-Lymphozyten im peripheren Blut). Eine HIV-Infektion führt zum Verlust von CD4+ T-Lymphozyten. Unterhalb eines kritischen Wertes (<200 CD4+ T-Lymphozyten pro µl Blut) versagt die Immunabwehr. Es kommt zu Infektionen mit einer Reihe opportunistischer Erreger (Opportunistische Krankheitserreger führen nur bei Patienten mit eingeschränkter Immunabwehr zu Erkrankungen (Beispiel AIDS)) und schließlich zum Tod des Patienten.
Material: FACS-Röhrchen, Einzelzell-Suspension, Eppendorf-Pipette, Vortex-Mixer, CD4 FITC-konjugierter Antikörper und CD8-PE-
konjugierter Antikörper, Zentrifuge, Durchflußzytometer
Bereiten Sie zusammen mit einem Kursbetreuer Mauslymphozyten für eine FACS-Untersuchung vor.
Versuchsablauf Bemerkungen 1. Die ausgegebenen FACS-Röhrchen nach Pipettierschema beschriften und auf Eis stellen.
2. Mischen Sie die bereitgestellte Zell-Suspension durch vortexen des Falconröhrchens und pipettieren Sie mit der Eppendorf-Pipette jeweils 50 µl Zellprobe in die Röhrchen.
Für jeden Versuchsansatz werden zwischen 5 x 105 und 106 Zellen eingesetzt
3. Je 50 µl der Antikörperlösungen bzw. der Pufferlösung nach Pipettierschema (auf den nachfolgenden Seiten) in die Röhrchen pipettieren und unter vorsichtigem Vortexen mischen.
Wichtig: Bei jedem Pipettiervorgang die Pipettenspitze wechseln!
4. Die Röhrchen im Dunkeln auf Eis 30 Minuten lang inkubieren.
Die Fluorochrom-konjugierten Antikörper sind lichtempfindlich und müssen im Dunkeln aufbewahrt werden
4. Zentrifugation der FACS-Röhrchen für 5 min bei 1370 U/min (entspricht 280 g).
Wird von der Kursassistenz durchgeführt!
5. Überstand absaugen, Röhrchen vortexen und das Pellet in 500 µl Pufferlösung resuspendieren. Die Auswertung erfolgt anschließend mit dem Durchflußzytometer.
Wird ebenfalls von der Kursassistenz durchgeführt!
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Großes Hämatologisches Praktikum 8 – Bestimmung von Immunzellen
Auswertung Bei der Auswertung wird der prozentuale Anteil der CD4- und CD8-positiven T- Lymphozyten an der gesamten Lymphozytenpopulation bestimmt und das Verhältnis von CD4+ zu CD8+ positiven T-Lymphozyten errechnet.
Pipettierschema
Röhrchen Nr.: 1 2 3 4
Zellsuspension 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl
Pufferlösung 50 µl
Antikörper 1 50 µl
Antikörper 2 50 µl
Antikörpergemisch 50µl
Großes Hämatologisches Praktikum 9 – Kriminalistischer
9 - Kriminalistischer Nachweis von Blut
Um kleinste Spuren von Blut nachzuweisen wird heutzutage bei der Spurensicherung der Polizei Luminol eingesetzt. Luminol reagiert mit Oxidationsmitteln (z.B. Wasserstoffperoxid) unter Abgabe eines bläulichen Lichtes (Chemolumineszenz). Allerdings läuft diese Reaktion nur im vorhandensein geeigneter Katalysatoren (z.B. Eisenionen) ausreichend schnell ab. Zur Spurensicherung wird Luminol mit Wasserstoffperoxid vermischt und auf verdächtige Flecken gesprüht. Wenn es sich bei dem Flecken um Blut handelt katalysiert das im Hämoglobin vorkommende Eisen die Reaktion und es kommt zu einem bläulichen Leuchten. Material: Sprühflasche mit Luminol – Lösung
Dieser Versuch muss unter Lichtausschluss stattfinden – fragen Sie einen Kursbetreuer nach dem Tatort! In der Vorbereitung zu diesem Praktikum haben wir einen Kanister Blut beim Metzger besorgt. Heute morgen war das Blut verschüttet und der Kanister leer. Es gibt zwei Verdächtige, die mit dem Blut gearbeitet haben - glücklicherweise haben wir ihre Labormäntel. Im Nebenzimmer sind sie aufgehängt. Finden Sie heraus, wer der Täter war!
Versuchsablauf Bemerkungen
1. Sprühen Sie im völlig lichtfreien Raum mit Luminol – Lösung aus der Sprühflasche auf die Labormäntel.
Beobachtung: Wer war der Täter?
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>Das Helmholtz-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit Das Helmholtz-Zentrum konzentriert die Forschungsarbeiten auf eine der wichtigsten Fragen unserer Gesellschaft, die Gesundheit des Menschen in seiner Umwelt. Ziel ist es, Risiken für die menschliche Gesundheit durch Umweltfaktoren zu erkennen, Mechanismen der Krankheitsentstehung zu entschlüsseln sowie Konzepte zu entwickeln, um die Gesundheit des Menschen und seine natürlichen Lebensgrundlagen auch für die Zukunft zu schützen. Als Forschungseinrichtung des Bundes und des Freistaats Bayern mit Sitz in Neuherberg, im Norden Münchens, sind wir Mitglied der Helmholtz-Gemeinschaft, der größten öffentlichen Forschungsorganisation Deutschlands. > Über das Gläserne Labor Das Gläserne Labor wurde speziell für Schülerinnen und Schüler eingerichtet. Hier sollen sie zu bestimmten naturwissenschaftlichen Themen möglichst eigenständig, aber natürlich nach Anleitung, experimentieren und dabei entdecken, wie faszinierend naturwissenschaftliche Phänomene sind und Spaß haben an der Experimentier- und Forschertätigkeit.
Zusätzlich sollen die Schülerinnen und Schüler das Helmholtz-Zentrum als Forschungseinrichtung kennenlernen und verstehen, wie Grundlagenforschung funktioniert und warum sie wichtig bzw. nötig ist. Je nach Thema werden aktuelle Forschungsprojekte des Helmholtz-Zentrums vorgestellt.
Das Helmholtz-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit übernimmt als Mitglied der Helmholtz-Gemeinschaft Verantwortung für die Qualität der naturwissenschaftlich-technischen Bildung unserer Kinder. Das Gläserne Labor dient als Institution, um dieser Anforderung durch unterrichtsergänzende Angebote gerecht zu werden. Es wurde am Helmholtz –Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit mit großzügiger finanzieller Unterstützung der Helmholtz-Gemeinschaft eingerichtet. > Weitere Informationen Besuchen Sie uns im Internet. Dort finden sie aktuelle Informationen und das Anmeldeformular: http://www.helmholtz-muenchen.de/schullabor/ Bei Fragen stehen wir telefonisch unter 089 3178 – 2725 zur Verfügung. Auf ein baldiges Wiedersehen freut sich ihr Team vom Gläsernen Labor! Gläsernes Labor Abteilung Öffentlichkeitsarbeit Helmholtz-Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit Ingolstädter Landstrasse 1 85764 Neuherberg
