Z. Lebensmittel-Untersuch. u. -Forsch., Band 142, Heft 2, 1970

Stoffwechseluntersuchungen an lebensmittehechnologisch wichtigen Mikroorganismen

VI I . Mitteilung***

Wei te re U n t e r s u c h u n g e n zur C02 -F ix i e rnn g d u r c h P e n i c i l l i n m c a m e m b e r t i , va r . c a n d i d u m

J. SCHORMt~LLER, und H.-J. STAN ~:

Mitteiluug aug dem Institut ]iir Lebensmittelchemie und Lebensmitteltechnologie der Technischen UniversitSt Berlin**

Eingegangen am 1I. April 1969

Metabolism o/Microorganisms Important in Food Technology

VI1. Additional Studies on C02-Fixation by Penicillium Camemberti, var. Candidum

Summary The incorporation of COa labeled with C-14 in single fractions of the mould Penicillium camem-

berti, var. candidum has been examined in incubation times between 15 see and 20 min. The fixed radioactivity was found until 4 rain only in the soluble fraction of the nonvolatile organic acids and amino acids. Later on the incorporation was detectable in the protein. The distribution of the radioactive carbon in the single dicarboxylic acids let us come to the conclusion that ob- viously in Penicillium camemberti a Ca -~ C~ fixation occurs.

Zusammen/assung Es wurde der Einbau von radioaktiv markiertem Kohlendioxid w~hrend Inkubationszeiten

yon 15 sec bis 20 min in einzelnen Fraktionen des Schimmelpilzes Penicitlium camemberti, var. candidum, untersucht. Die fixierte Radieaktivit~t wurde innerhalb yon 4 min ausschlieBlich in der 15slichen Fraktion der Carbon- und Aminos~uren gefunden. Danaeh war der Einbau in Protein nachweisbar. Die Verteilung des markierten Kohlenstoffs auf die einzelnen Dicarbons~uren legt den Schlul~ nahe, dab es sich hier offenbar um eine Ca -~ C~-Fixierung handelt.

I n frfiheren Arbei ten unseres Ins t i t u t s (1, 2) war gezeigt worden, dab der Sehim- melpilz Penicillium camemberti, var. candidum, der in der Kgseherstel lung zur Be- re i tung des Camernbertk/~ses dient, CO 2 aus dem umgebenden Medium zu fixieren vermag. Die Versuehe ergaben, dab der Pilz radioakt iv markiertes CO 2 besonders in des Prote in des Mycels e inbaut . Bei den 16sliehen F rak t ionen fend sieh markier ter Kohlenstoff vorwiegend in den S~urefraktionen. I m Prote in waren besonders Aspa- raginsgure, Glutamins/~ure und ihre biosynthet ischen Folgeprodukte Threonin, Isoleucin, Arginin, Prolin, dazu noch Glycin markiert . Eine Analyse der Verteilung der l~adioaktivit/~t auf die einzelnen C-Atome innerhalb der Aminos/~uren ffihrte zu folgender Vorstellung fiber den W e t des C02: Fixierung des C02 fiber einen Ca+Cl-Mechanismus in eine Ca-Diearbonsgure, U m w a n d l u n g fiber Zwisehenstufen des Citronens/~ureeyclus, Transamin ie rung zu Asparagin- und Glutamins/~ure, yon denen welter bekann te Biosynthesewege zu Prolin, Threonin, Arginin und Isoleucin ffihren. Von diesen Reaktionsfolgen war der Citronens/iureeyclus im Pflz bereits nachgewiesen worden (3). Es stellte sich die Frage, auf welche Weise der erste Sehrit t des be t rach te ten Stoffweehselweges, die C02-Fixierung, selbst vons ta t t en geht.

* Auszug aus der Promotionsarbeit yon H.-J. STA•: Pyruvatcarboxylase aus Penicillium camemberti, vat. eandidum - - Funktion und Eigenschaften. Diss. Teehn. Univ. Berlin 1968 (D 83).

** Herrn Kollegen Prof. Dr. S. W. Sovei zum 65. Geburtstag zugeeignet. *** VI. Mitt.: Seno~Mi~Lr,]~, J., u. L. G~oss?cER: Diese Z. 124, 432 (I964).

7 Z. Lebensmitt.-Unters~ch., Band 142

90 J. Schormiiller und H.-J. Stan:

Ein he te ro t ropher Mikroorganismus, der in der Lage ist, in e inem Medium zu wachsen, das nur eine einzige organische Verb indung als Kohlenstoff- und Ener- giequelle enth/~lt, mug fiber Stoffwechselwege verffigen, die ihm ges ta t ten , aus dieser Verb indung seine gesamte Energie zu gewinnen und alle ffir ihn lebensnotwendigen Stoffc zu synthet is ieren. Die ka t abo len Bahnen des Energiestoffweehsels werden an verschiedenen Stel len Ausgangspunk t ffir anabole Stoffwechselwege sein. Gehen die Biosynthesenwege yon Zwischengliedern cyclischer ka t abo lc r Bahnen aus, so mfigten diese Krcisprozesse in ihrer F u n k t i o n zum Erl iegen kommen, wenn sie n icht auf andere Weise mi t Zwischenproduk ten wieder aufgeffill t wfirden.

Diese Aufgabe f ibernehmen die yon KOI~NBEI~G (4) als anaplerot ische Stoff- weehselbahnen bezeiehneten Reak t ionske t t en . I m Fal le eines auf Glucose wachsenden Mikroorganismus ist a]s ka t abo le r H a u p t w e g der Emden-Meyerhof -Weg der Gly- kolyse, der im aeroben Fa l l in den Krebs-Cyclus mfindet , zu erwarten. Die Erg/~nzung der dem Krebs-Cyclus entzogenen Zwischenprodukte crfolgt durch F ix ie rung yon Kohlend iox id auf der Stufe der Q - V e r b i n d u n g e n Phosphoeno lpy ruva t oder P y r u v a t .

U m die Gfi l t igkei t der hier kurz entwickc] ten Vors te l lungen ffir den Stoffweehsel des in Rede s tehenden Schimmelpi lzes zu fiberprfifen, wurde in Kurzze i t -F ix ie rungs - versuchen am i n t a k t e n Kuge lmyce l der E i n b a u yon ma rk i e r t e m Carbona t in die F r a k t i o n der nichtf lf icht igen S/~uren, speziell der I~-rebs-Cyclus-Intermediate, unter - sucht.

A. Experimenteller Tell I . M a t e r i a l u n d M e t h o d e n

1. Ziichtung des Pilzmycels Der untersuchte Mikroorganismus war der Schimmelpilz Penicillium camemberti, vat. candi.

dam, Stamm 6732, aus dem Bakteriologischen Institut der Bundesforschungsanstalt fiir Milch- wirtschaft, Kiel*.

l a. Ziichtung au] Schr&jagarlculturen Die Weiterziichtung des Pilzes erfolgte auf einer Schrggagarkultur folgender Zusammenset-

zung: 8 g Bierwiirze-Agar (Brain, Berlin), 8 g D(~-)-Glucose pro anal. (Serva, Heidelberg), 84 ml dest. Wasser.

Die Mischung wurde auf einem siedenden Wasserbad gelfst und in Portionen yon ca. 10 ml in I~eagensglgser abgefiillt, die mit einem Wattestopfen verschlossen im Wasserdampfautoklaven bei 120 ° C 30 rain sterilisiert wurden. In den schrgggelegten Reagensglgsern erstarrte der Nghr- boden sehr bald. In einem mit UV-Licht sterilisierten Raum wurden die Sporen mit Hilfe eines ausgegliihten Platindrahtes auf die frischen N~hrbSden tibergeimpft. Die Kulturen wurden bei 26--27 ° C im Brutschrank inkubiert. Nach 12--14 Tagen war der Pilzrasen geniigend versport, so dab er zur Weiterztichtung eingesetzt werden konnte. Iris zur Weiterverwendung wurden die Kulturen bei 3 ° C in einem Kiihlschrank aufbewahrt. In der Regel wurden die Schrggagarkulturen innerhalb yon 4--6 Wochen weitergeziichtet.

I b. Ziichtung au/fliissigen NiihrbSden Zur Untersuchung des S~urestoffwechsels wurde ein kiinstlicher Nghrboden der folgenden

Zusammensetzung verwendet: 10 g D(-b)-Glucose, 8 g NH4NO3, 3 g (NH4)2HP04, 2 g KH~P04, 0,5 g NIgSO4 • 7 H20, 0,1 g FeS04 • 7 H20, je 0,01 g ZnSO4 • 7 H20, NnC12 • 4 H20 und CaC12 wurden in 1 1 Wasser gelSst. Der pH-Wert wurde auf 6,5 eingestellt und die LSsung aufgekocht. Der sich bildende Niederschlag wurde abfil~riert.

Fiir die Ziichtung des Pilzmycels in Submerskulturen wurden jeweils 100 ml N~hrboden in mit Wattestopfen (bzw. Steristopfen der Fa. Herenz, Hamburg) verschlossenen 500 ml-Erlen- meyerkolben bei I00 ° C im Wasserdampfautoklaven 25 rain sterilisiert. Dabei trat eine leichte Verfgrbung des Niihrbodens auf, die auf eine ZerstSrung yon Glucose zuriickzufiihren ist.

Die Beimpfung des N~hrbodens erfolgte unter sterilen Bedingungen (Raum, GefgBe, Wasser, Impfpipette) mit einer Conidienabschw~mmung der Sehr~gkultur. Bis zu 30 Kolben wurden bei 26--28 ° C auf einer l%otationsschfittelmaschine geschiittelt. Nach 36 Std trat eine sichtbare Pilz- kultur auf, im weiteren Verlauf des Wachstums bildete sieh ein feingriel3iges Kugelmycel aus. Die Wachstumskurve zeigte yore 3. bis zum 5. oder 6. Tag einen steilen Anstieg (log-Phase).

• Fiir die LJberlassung der Reinkulturen des Schimmelpilzes mSehten wir Iterrn Professor Dr. A. LEMBKE, Kiel, an dieser Stelle danken.

Stoffweehseluntersuchungen an lebensmitteltechnologisch wichtigen Mikroorganismen. VII 91

2. Analytik der Carbonsiiuren 2a. Abtrennung der Carbonsguren Zur Abtrennung der Carbons~iuren wurde der gesamte alkoholisehe Extrakt der Mycelprobe

(Filtrat) zuerst fiber eine Kationenaustauschers~ule (Dowex 50 W × 2, 20--50 mesh, H+-Form) gegeben, wobei die Kationen und die Aminos~uren fixiert wurden. Das saure Filtrat wurde mit NaOH neutralisiert und dann fiber eine Anionenaustauschers~ule (Dowex 2 ×8, 20--50 mesh, Carbonatform) gefiihrt; die S~urcn wurden fixiert, das Filtrat enthielt die Neutralstoffe. Die S~iu- ren wurden anschliel3end mit dem Ffinffachen des Harzvolumens m-NH4HCQ eluiert. Das Eluat wurde am Rotationsverdamp~er unter Vakuum bei 30 ° C zur Trockene gebracht, wobei NH~HCOs sublimierte. Zur vollst~ndigen Entfernung des I~I.Iai.IC03 wurde der Rfickstand noch mehrere Male mit wenig Wasser aufgenommen und erneut eingedampft. Die Ammoniumsalze wurden fiber eine Kationenaustauschers~ule wieder in die freien S~uren fiberffihrt oder bei Verwendung ammoniakalischer Laufmittel direkt zur Dfinnschichtchromatographie eingesetzt. Zur selektiven Elution der am Kationenaustauscher fixierten Aminos~uren war n-NH40H geeignet.

2 b. Diinnschichtchromatographie der nichtfliichtigen Siiuren Die Dfinnsehichtchromatographie (DC) wurde nach der in den Handbfichern yon STA~L (5)

und t~A~IDEI~ATK (6) beschriebenen Arbeitsmethodik durchgeffihrt. Die Platten wurden mit einem Streichger~t der Firma DESAGA, Heidelberg, in der angegebenen Schiehtdicke bestrichen. Die im folgenden genannten Mengen an Tr~germaterialien reichten zur Beschichtung yon 5 Platten des Formates 20 ×20 cm aus. Zur Chromatographie wurden die Glaskammern (DESAGA) mit 100--120 ml Laufmittel geffillt. Es wurde ohne Kammers~ttigung gearbeitet. Die S~uren wurden mit ausgezogenen SchmelzpunktrShrchen oder mit einer 10 ~l-Pipette aufgetragen und in einem Kaltluftstrom getrocknet. Die Flecke wurden 2 em yore unteren Rand aufgetragen, die LauC strecke betrug I6,5 cm.

Methode A : Eindimensionale DC nach K~!APPE u. ROHDEW2~LD (7). Schicht : 30 g Kieselgel G (Merck) wurden mit 60 ml dest. Wasser in einem Erlenmeyerkolben

30 sec stark gesehiittelt und dann aufgetragen. Sehichtdicke: 0,25 ram. Laufmitte]: Diisopropyl~ther/Ameisens~ure/Wasser (90 + 7 + 3).

Methode B: Zweidimensionale DC nach GOEB~LL U. KLINGENBERG (8). Schicht: 20 g Cellulosepulver MN 300 (Macherey & Nagel, Dfiren) wurden mit 120 ml dest.

Wasser zu einem Brei verrfihrt, der mit einem Homogenisator gut durchmischt und ansehliel~end mit 3 n-KOH mit Hflfe einer Glaselektrode auf pH 11,5 eingestellt wurde. Die Platten wurden an der Luft getrocknet.

Schiehtdicke: 0,3--0,4 ram. Laufmittel: 1. Richtung: ~thanol/Ammoniak (25%)/Wasser (80 ~- 20 + 10). 2. Richtung: Isobutanol/5n-Ameisensaure (80~-120). Dieses Laufmittel wurde nach

kr~iftigem Sehfitteln mehrere Stunden in einem Scheidetriehter belassen und in seine Phasen getrennt. Die obere Phase wurde als Laufmittel eingesetzt, w~ihrend die untere Phase in 2 kleinen GefiiBen zur Sattigung des Gasraumes zusatzlieh in die Kammer gebracht wurde.

Der Startfleck wurde in einer Ecke 15 mm yon beiden Riindem der Platte entfernt aufge- tragen. Die Entwicklung erfolgte zuerst mit dem ammoniakalischen Laufmittel; fiir die Lauf- strecke yon 16,5 cm wurden 3 ~ Std benStigt. Die Platte wurde darauf etwa 30 rain in einem Kaltluftstrom getrocknet und dann in der 2. l~ichtung mit dem sauren Laufmittel chromato- graphiert. Diese Entwicklung ben6tigte ebenfalls 3~Li Std. Nach Trocknung der Platte und Ent- fernung der Ameisens~iure wurde die Platte mit einer Bromkresolgrfin-LSsung besprfiht, die Flecken erschienen gelb auf blaugrfinem Grund. Indieatorsprfihreagens : 40 mg Bromkresolgrfin wurden in Isopropanol gel5st und mit 2 n-NaOH auf pH 7 eingestellt.

3. Messung radioalctiver Proben Zur Bestimmung der radioaktiv markierten Substanzen wurden folgende Methoden an-

gewandt. Die Lokalisierung der durch zweidimensionale Diinnschichtchromatographie aufgetrennten

markierten Verbindungen geschah mit Hilfe der Autoradiographie. Die quantitative Bestimmung der so gefundenen radioaktiven Substanzen wurde mit einem Dfinnschichtseanner durchgefiihrt, dieser wurde bei eindimensionalen Dfinnsehiehtehromatogrammen auch zum Nachweis des radio- aktiven Flecks eingesetzt.

3a. Autoradiographie Zur Autoradiographie wurden die nach zweidimensionaler Entwicklung getrockneten Dfinn-

sehichtplatten direkt mit dem R6ntgenfilm Agfa Structurix D 10 bedeckt und im Dunkeln 6 Tage 7*

92 J. Schormfiller und H.-J. Stan:

exponiert. Danach wurde der Film 5 min bei 20 ° C mit dem R6ntgenfilmentwickler G 150 (Agfa) entwickelt und I0 rain in einer LSsung des Fixiersalzes 334 (Agfa) fixiert. Zur Identifizierung der markierten S~uren wurde die Diinnsehiehtplatte mit IndieatorlSsung besprfiht und durch Auf- legen des entwickelten Films die Lage der angef~rbten S~ureflecken mit der Schwi~rzung ver- gliehen. Bei Identit~t stimmten diese in Lage, GrSBe und Form genau fiberein.

3 b. Messung mit dem Methandurchfluflz~hlrohr Die Bestimmung radioaktiver Proben wurde mit einer Ausrfistung der Fa. Frieseke & HSpfner,

Erlangen-Bruck, durchgeffihrt. Der MeBplatz bestand aus dem Methandurchflul3z/~hlrohr F H 407, das mit einem automatischen Probenwechsler F H 516 verbunden war. Die Hoehspannungs- versorgung des Methandurchflul3z~hlrohres und die Registrierung der Impulse besorgte das Z~hlger~t F H 49. Bei der automatischen Probenz~hlung wurde das Ziihlger~t mit dem Zeitdrueker F H 449 verbunden, der die ffir eine vorgesehene Impulszahl benStigte Zeit und die Probennummer auf einem Papierstreifen ausdruckte. Die Messung wurde mit einem Z~hlrohrfenster (0,8 mg/cm 2 Fliiehengewieht) bei einer Hochspannung yon 2,9 kV und einer Eingangsempfindlichkeit yon 10 mV durchgeffihrt. Dabei lag der Nulleffekt im Durchschnitt bei ISipm. Die Z~ihlausbeute betrug bei dieser Mel~anordnung etwa 3,5%.

Zur Herstellung der MeBproben wurden die UntersuehungslSsungen auf ein mit einem l~und- filter bedecktes Aluminium-Sch~lchen yon 3 cm Durchmesser pipettiert. Die LSsungen wurden an der Luft - - bisweilen auch in einem leichten Luftstrom - - eingetrocknet.

3c. Messung ~,it dem Di~nnschichtscanner Die Aktivitiitsmessung der durch Dfinnschichtehromatographie getrennten Verbindungen

effolgte mit einem Diinnsehichtseanner LB 2720 der Fa. Berthold, Wildbad. Es handelte sich dabei um einen fensterlosen MethandurchfiuBz~hler mit variierbarer Spaltblende, unter dem Diinn- schiehtplatten mit konstanter Geschwindigkeit vorbeigeffihrt wurden. Die gemessenen Impulse wur- den fiber einen Vorversti~rker (FH 524) an ein Z~hlger~t (FH 485) gegeben, dieses war parallel zu einem Ratemeter (FH 518) mit Schreiber geschaltet. Die Papiervorschubgesehwindigkeit des Sehreibers und die Bewegung der Platte waren parallel gesehaltet, so dab die Aktivit/itsverteilung durch direkten Vergleich mit den durch Sprfihreagens sichtbar gemachten Substanzflecken diesen zugeordnet werden konaten. Bei zweidimensionaler Entwicklung der Dfinnsehichtplatten war diese Zuordnung nicht eindeutig mSglich, so dab in diesen F/£11en die Autoradiographie eingesetzt wurde. Die quantitative Bestimmung wurde dann mit dem Scanner durchgeffihrt.

Die quantitative Auswertung der Aktivit~tspeaks wurde nicht durch Ausmessen der Peak- fl~chen vorgenommen, sondern durch Summation aller unter einen Peak fallenden Z~hlimpulse, und zwar derart, daB der digitale Zi~hler mit dem Zeitdrucker und einem Vorwahlimpulssehalter verbunden wurde. Der Z~hler registrierte alle Impulse, wi~hrend der Vorwahlimpulsschalter j eweils bei Erreiehung einer vorgegebenen Impulszahl sin Signal an den Zeitdrucker abgab. Dieser druekte daraufhin die zwischen zwei Signalen vergangene Zeit aus und begann sofort erneut ohne Zeit- verlust zu z~,hlen. Kfirzere Zeitspannen als solche, die dem :Nulleffekt entsprachen, zeigten Radio- aktiviti~t an. Die Summe aller Impulse unter einem Aktivit~tspeak ergab sich durch Multipli- kation der Zahl der ausgedruckten Zeitintervalle zwischen zwei Nulleffekten mit der vorgewi~hlten Impulszahl. Dieser Weft wurde um den Nulleffekt ffir die gesamte Peakzeit korrigiert. Die Mes- sung wurde mit einer Hochspannung yon 2,5 kV bei einer Eingangsempfindlichkeit yon 1 mV durchgefiihrt; die Vorschubgeschwindigkeit wurde ffir Ubersichtsbestimmungen 600 mm/Std und ffir quantitative Analysen bzw. Identifizierungen radioaktiver Substanzen 120 mm/Std ge- wKhlt. Der Nulleffekt lag bei ca. 40 ipm.

Quantitative Auswertungen bzw. Absch/£tzungen bei Dfinnschichtchromatogrammen erfolg- ten derart, dab die gemessene Aktivit/£t eines Substanzfleckes auf die Summe aller ausgemessenen Aktivit~ten bezogen und in Prozent dieser Gesamtaktivit~t ausgedriickt wurde. Es war bei den durehgeffihrten Analysen niemals mSg]ieh, die Radioaktivit~t eines Substanzfleckes nach der Dfinnsehiehtehromatographie in Beziehung zur Aktivit~t am Startfleck vor der Chromatographie zu setzen. Die Summe der an den dureh Chromatographie aufgetrennten Substanzen erhaltenen Aktivit~ten war stets wesentlieh hSher als die am Startfleck vor Beginn der Chromatographie. Der Grund daffir war in der erhShten Selbstabsorption der Probe am Startfleek zu suehen.

II. Versuehs~i~hrung Penicillium camemberti wurde 6 Tage auf Glucose-Iq~hrboden in Schfittelkultur gezfichtet.

Danach wurde das Kugelmycel unter sterilen Bedingungen abgetrennt, mit dest. Wasser gewaschen und in 50 ml sterilen Glucose-Phosphat-Puffer (10 g Glucose, 3 g NHaH~POa und 2 g KH~POa in 1 1 Wasser) von pH 6,8 gebracht und gerfihrt. Naeh 90 min wurden 50 tzmol Na~ ~COa (spezif. Aktivit~t 10 mCi/mmol) in 0,5 ml LSsung zugegeben, gemischt und nacheinander Proben yon je 5 ml der Mycelsuspension entnommen. Diese wurden in 20 ml siedendes Xthanol gebracht. Die Inkubationszeiten mit Na2 ~C03 waren 15 und 30 sec, 1, 2, 4 und 20 min. Die einzelnen Pro- ben wurden nach dem in Abb. I wiedergegebenen Schema aufgearbeitet.

Stoffwechseluntersuchungen an lebensmitteltechnologisch wichtigen Mikroorganismen. VII 93

Das Filtrat wurde unter Vakuum am Rotationsverdampfer bei 40 ° Czur Trockene eingedampft und in 1 ml Wasser aufgenommen. Davon wurden 0,I ml zur Radioaktivitiitsbestimmung auf ein mit einem l%undfilter bedecktes Aluminium-Seh~lchen plattiert. Der Rest (0,9 ml) wurde fiber etwas Celite 545 zur Entfernung einer yon Lipoiden hervorgerufenen Trfibung iiltriert und auf eine Kationenaustauschersiiule in der I-I+-Form (Dowex 50 W × 8, 2 0 0 ~ 0 0 mesh, 1,5 ml) gegeben. Nachgespfilt wurde mit 8 ml Wasser. Die L6sung der nicht fixierten Neutralstoffe und S~uren wurde zur Trockene eingedampft und mit 0,9 ml Wasser aufgenommen. Die an der S~ule fixierten Aminos~uren wurden mit 8 ml n-Ammoniak eluiert, eingedampft und ebenfalls mit 0,9 ml Wasser gelSst. Von beiden LSsungen wurde je 0,1 ml zur Radioaktivitiitsmessung plattiert. Der Rest des

I Filtrat

Kationenaustauscher

i I

Durchlau] J

Anionenaustauseher

Inlcubationsansatz I

abt6ten mit Alkohol filtrieren

I

I n-NH40H

A minosiiuren

Neutralsto~e Protein

[ m-NH4-HC03

1 S~iuren

Dfinnschichtchromatographie

einzelne S~iuren

I Mycel

Extraktion mit Alkohol/.~ther

+ Fette

Extraktion mit 5~o TCE

Nucleins~iuren

Abb. 1. Au/arbeitungsgang zur Gewinnung der einzelnen Fraktionen aus dem Inkubationsansatz /i~r die Radioa]ctivit~itsmessung

Durchlaufes (0,8 ml) wurde fiber eine Anionenaustauschers~ule in der Carbonatform (Dowex 2 × 8,200--400 mesh, 1,5 ml) aufgetrennt. Mit 8 ml Wasser wurden die :Neutralstoffe ausgewaschen; und mit I2 ml m-:NH~HCOs die SEuren eluiert. Beide L6sungen wurden zur Trockene eingedampft, die S~uren wurden bis zur vSlligen Entfernung des NI-I4HCO 3 6--8real mit wenig Wasser wieder aufgenommen. Am Ende wurden beide RfickstEnde in je 0,8 ml Wasser ge16st and davon je 0,I ml plattiert. Bei dieser Arbeitsweise waren die gemessenen Aktivit~ten untereinander direkt ver- gleichbar. Sie entsprachen jeweils dem Anteil der einzelnen Stoffklassen an der Gesamtaktivit~t im Filtrat der InkubationsansEtze. Die S~uren wurden anschlieBend noch dutch zweidimensionale Diinnschichtchromatographie auf Cellulose MN 300, p i t 11,5 aufgetrennt (Methode B). Mit Hilfe der Autoradiographie wurde die in den einzelnen SEuren auftretende Markierung zugeordnet und mit einem Dfinnschichtscanner anschlieBend die in den einzelnen Siiuren fixierte RadioaktivitEt quantitativ bestimmt. Da die auf die einzelnen Dfinnschichtplatten aufgetragenen Mengen unter- einander nicht gleich waren, wurden die in den einzelnen S~uren bestimmten Radioaktivitgten auf die Summe der auf einer Platte mit dem Scanner nachgewiesenen Radioaktivit~t bezogen und in Prozent angegeben. Damit wurden gleichzeit.!g die yon Platte zu Platte unterschiedlichen Selbstabsorptionswerte eliminiert. Eine sp~tere Uberprfifung einiger so erhaltener Ergebnisse dutch Abkratzen der Flecke und Messung der Radioaktivit~t in einem FlfissigscintillationszEhler (Tri-Carb 3375) ergab, dal3 die erhaltenen Ergebnisse ffir halbquantitative Aussagen tauglich waren. Die IdentitEt der dutch zweidimensionale Dfinnschichtchromatographie getrennten

94 J. Sehormiiller und H.-J. Stan:

Si~uren wurde durch Rechromatographie mit inaktiven Triigersubstanzen auf Kieselgel G iiber- priift (Methode A). Das Mycel wurde nacheinander mit ~thanol bei 60 ° C, dann dreimal mit _~thanol/~_ther (3 -[- I) und schlieBlich zweimal mit _~ther extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, eingedampft und vollstEndig als Lipidfraktion zur Radioaktivit~tsmessung plattiert. Der Rfickstand wurde I5 rain bei 90 ° C mit 5°/o iger Triehloressigsi~ure zur Entfernung der Nuclein- siiuren behandelt, danach wurde mit 5°/oiger TrichloressigsS~ure und Wasser gewaschen. Der ver- bleibende Riickstand war Protein. Dieses wurde bei 60 ° C im Vakuumtrockensehrank bis zur Gewiehtskonstanz getrocknet and das Trockengewicht ermittelt. Das Trockengewicht der Protein- fraktion lag bei aUen untersuchten Proben eines Inkubationsansatzes in einem Bereich zwischen 52 und 55 mg. Daraus folgt, dab die Genauigkeit der Probennahme und der Aularbeitung yon Parallelproben (grSBte Abweiehung yon Einzelproben 5%) wesentlich grSBer ist als die der Radio- aktivitEtsbestimmung, deren Fehler bei =~ 10% ]iegt. Aus diesem Grund wurde die gemessene RadioaktivitEt nicht auf das Proteintroekengewicht bezogen, sondern die Proben wurden direkt vergliehen.

8.10 5

ipm

6-10 s

4-10 5

2.10 5

Fiitrat

/ / Carbonsaure~n

2 4 rain 20 Inkubationszeit

Abb. 2. Abhiingigkeit des 14C02-Einbau~ in die einzelnen Fraktionen yon Pen. camemberti yon der Inkubationszeit. Die gemessene Radioaktivit~t (ipm) ist bezogen auf eine Mycelmenge mit einem Proteintrockengewicht yon 52 bis 55 rag. In den einzelnen MeBproben wurde der durch unter-

schiedliche Selbstabsorption hervorgerufene Fehler nicht korrigiert

B. I)iskussion der Ergebnisse

I n Abb. 2 is t der E i n b a u des r ad ioak t i v mark ie r t en CO 2 in verschiedene F r a k - t ionen des i n t a k t e n Mycels yon Pen . camember t i dargeste l l t , und zwar in Abh/~ngig- ke i t yon der Inkuba t ionsze i t . Es ergab sich, dab in den beschr iebenen Kurzze i t - versuchen eine Markierung nnr in der 15slichen F rak t i on , die als F i l t r a t bezeichnet wurde, zu f inden war. E r s t nach 20 rain t r a t eine deut l iche Markierung des Pro te ins auf, wi~hrend bis zu dieser Zei t in die F e t t - und Nucleinsi~urefraktion nur Spuren yon 14C e ingebaut worden waren. Von den 15slichen F ra k t i one n waren nur die Amino- s~uren und die Carbons~uren mark ie r t , in die Neutra ls toffe wurde kein r ad ioak t ive r Kohlens tof f e ingebaut . Bei kurzen Inkuba t ionsze i t en un te rha lb yon 2 min is t die F r a k t i o n der Carbons&uren a m s t~rks ten mark ie r t , w~hrend in der Folgezei t die Zunahme der Markierung in der Haup t s ache auf die Aminos&urefrakt ion entf&llt. Diese Befunde s tehen im Eink lang mi t der eingangs geschi lder ten Vorste l lung yon der anaplero t i schen Aufgabe der C02-Fixierung in P e n . camembert i . Es sei da rauf hingewiesen, dal~ bei li~ngeren Inkuba t ionsze i t en der Ante i l der un15slichen F r a k - t ionen - besonders des Prote ins - an der Gesamtmenge des f ix ier ten r a d ioa k t i v mark ie r t en CO~ sti~ndig wi~chst, w~hrend die Markierung der 15slichen F r a k t i o n e n e twa kons t an t bleibt . Daraus ergibt sich zwanglos das Bild, dab im s ta t ion~ren Fliel~gleichgewicht das gesamte aufgenommene CO~. in Pro te in als E n d p r o d u k t der Biosynthesen e ingebaut wird (9).

S~offwechseluntersuchungen an lebensmitteltechnologisch wichtigen Mikroorganismen. VII 95

Eine Analyse der lZadioaktivi tgtsvertei lung auf die einzelnen S/~uren in der 16sliehen F rak t ion ergab, dab Apfels&ure als erste markier te Sgure zu f inden ist (Abb. 3). Ih r Antei l an der Gesamtakt iv i t~ t der S/iurefraktion betrggt nach 15 see etwa 75% und s inkt d a n n langsam ab. Als weitere Sguren folgten Fumar - und dann Bernsteins~ture. Zwisehen diesen beiden erfolgt im Laufe der Zeit ein Ausgleich der Ak~iviti~t. Diese Befunde stt i tzen die Vorstellung, dab es sieh bei der CO2-Fixierung dutch Pen. camemberti u m vine C3 + C1-Fixierung auf der Stufe yon P y r u v a t odor

75

%

50

25

O

O O

AE

. . . . . . . .

1 2 4 min 20

[nkubati0nszeit

Abb. 3. A'nd~rung der prozentualen Verteilung der in die einzelnen S~iuren eingebauten Radioaktivit~it in Abhgngiglceit van der Inkubationszeit. Die Summe der gemessenen Ra~dioaktivitiit in der SKure- frak$ion wurde gleich I00 gesetzt. Die unbekannte Sgure verhglt sich im Autoradiogramm wie Glykolsgure (vgl. Abb. 4). und hat nach 20 rain einen Anteil yon 21% an der Gesamtaktivitgt der S~urefraktion. AE ~ ~pfels~ure, BE = Bernsteins/~ure, I~U = Fumarsiiure, CIT ~ Citronen-

s~ure

O

. . . . +

0 3

1

5 C2::.::

o

2. Isobutano[ - 5n Ameisensaure

80 + 120 . -

Abb. 4. Autoradiogramm der S~iuren nach 20 rain Inkubation 1 = Fumars~ure, 2 ~ Bernsteins~ure, 3 = Glycols~ure, 4 = _&pfels~ur% 5 = Citronensi~ure

96 F. Kiermeier und B. Picha:

Phosphoeno lpy ruva t handel t . Inzwischen konn ten wir nachweisen, dab es sieh bei Pen. camemberti um das E n z y m P y r u v a t c a r b o x y l a s e hande l t (10). Die Befunde bes tg t igen wei terhin die Ergebnisse einer frfiheren Arbe i t aus unserem Arbei t skre i s (2) fiber den E inbau des 14CO2 in die Aminos~uren der Pro te inf rak t ion . Dor t wurde zur Erkl~rung der Radioakt iv i t i~ tsver te i lung auf die einzelnen Kohlens tof fa tome der Asparaginsgure und ihrer Fo lgep roduk te Threonin und Isoleucin eine reversible Reduk t ion zu XpfelsKure, F u m a r - und Bernsteinsi~ure und eine dami t verbundene Isomeris ierung yon C 1 und C a i m Kohlenstoffgerf is t der Carbonsi iuren angenommen. Bemerkenswer t ist, dab Xpfel-, F u m a r - und Bernsteinsi~ure auch noch nach 20 rain die am s t~rks ten mark ie r t en S~uren dars te l l ten.

I n diesen Versuchen mi t 6 Tage a l tem Mycel wurde darf iberhinaus noeh eine weitere S~ure gefunden, die nach 20 min einen betr~tchtlichen Ante i l erreiehte (Abb. 4). Sie verhie l t sieh bei der 2-dimensionalen Df innschich tchromatographie wie Glykol- s/~ure, konnte aber in einem anderen Sys tem mi t inak t ive r Glykols/~ure als Tr/~ger- substanz n icht r ech romatograph ie r t werden. I n Versuchen mi t 3~/~ Tage a l tem Myce] ~,rat diese Si~ure n ieht auf. Wi r haben diesen Befund n icht wei ter verfolgt.

Literatur

1. SCI:J[OI~MULLER., J., W. HEPTNER U. H.-D. BELITZ: Diese Z. 115, 539 (1961). 2. SCHORMi)LLER, J., u. W. H]~PTNE~: Diese Z. 123, 409 (1964). 3. SCgORMi~LLE~, J., u. H. MAHLEX: Diese Z. 110, 183 (I959). 4. KO~NBXRG, H. L.: Angew. Chem. 77, 601 (I965). 5. STAlin, E. : Dfinnschichtchromatographie. 2. Aufl. Berlin-Heidelberg-New York: Springer

1967. 6. RANDEI~ATIt, K. : Dfinnschichtchromatographie. 2. Aufl. Weinheim/Bergstr. : Verlag Chemie

GmbH 1965. 7. KNAPPE, E., u. I. I~OHDEWXLD: Z. analyt. Chem. 210, 183 (1965). 8. GOEBE~,L, H., u. M. KLINGENBERG: Dfinnschichtchromatographie yon Tricarbonsaurecyclus-

Substraten mit Autoradiographie. In: Chromatographie-Symposium I I (Soc. Belge Sci. Pharmaceutiques, Bruxelles) 1962, 153--165.

9. SCHORMi~LLER, J., u. tt .-J. STAN: unverSffentlicht. 10. SC~ORMi)LLE~, J., u. H.-J. STAN: Diese Z. im Druck.

Verhahen der alkalischen Phosphatase der Milch gegeniiber organischen Phosphors~iureestern

F. KIERMEIER und BARBARA PIC~A*

Mitteilung aus dem Milchwissenseha/tlichen Institut der Technischen Hochschule in Freising**

Eingegangen am 24. M~trz I969

Reaction o/Alkaline Phosphatase in Mi lk with Organic Phosphoric Acid Esters.

Summary The reactions of alkaline phosphatase in cow's milk with organic phosphoric compounds

having insecticid effects were investigated. For the studies a high enzymatic activity was the prior condition. The alkaline phosphatase was isolated from cow's milk and its activity was increased 225-fold by freeze drying. The procedures for isolation and enrichment are described.

* Auszug aus der Dissertation yon B. PICHA: Zur Wirkung der alkalischen Phosphatase und Aryl-Esterase aus Milch gegeniiber insecticiden Phosphors~ureestern. TH Miinchen 1969.

** Herrn Prof. Dr. S. W. SoucI zum 65. Geburtstag gewidmet.