Technische Universität München

Max-Planck-Institut für Biochemie

Synthetische und natürliche Modellsysteme für die oxidative

Proteinfaltung

Alexander G. Milbradt

München 2005

Techn ische Univers i t ä t München

Max-Planck- Ins t i tu t fü r Biochemie

Synthetische und natürliche Modellsysteme für die oxidative

Proteinfaltung

Alexander G. Milbradt

Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Chemie

der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

genehmigten Dissertation.

Vorsitzender: Univ. Prof. Dr. St. J. Glaser

Prüfer der Dissertation: 1. apl. Prof. Dr. L. Moroder

2. Univ. Prof. Dr. H. Kessler

3. Univ. Prof. Dr. W. Hiller

Die Dissertation wurde am 13.1.2005 bei der Technischen Universität München

eingereicht und durch die Fakultät für Chemie am 15.2.2005 angenommen.

Meinen Eltern

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Dezember 2001 bis Januar 2005 am

Max-Planck-Institut für Biochemie in Martinsried unter Anleitung von Prof. Dr. Luis

Moroder angefertigt.

Mein besonders herzlicher Dank gilt meinem Doktorvater Prof. Dr. Luis Moroder, der

mir diese sehr abwechslungsreiche, interessante und vielfältige Aufgabe gegeben hat

und mir bei ihrer Bearbeitung immer hilfsbereit zur Seite stand. Er gab mir einerseits

immer ausreichend Freiräume, anderseits aber auch Lenkung und Zielorientierung, die

für einen erfolgreichen Abschluss jeder Arbeit nötig sind.

Des Weiteren möchte ich meinem Betreuer PD Dr. Christian Renner danken. Sein

fundiertes Fachwissen auf dem Gebiet der NMR und Physik gab mir unschätzbare

Hilfen. Seine klar strukturierte, logische und kompetente Herangehensweise an

wissenschaftliche Fragestellungen waren für mich Vorbild und Hilfe, aber auch

Motivation für die Durchführung meiner eigenen Arbeit.

Meinem Arbeitskollegen Markus Löweneck, geb. Schütt, danke ich für die gute

Zusammenarbeit, insbesondere für die Synthese so manches Azopeptids sowie für

seine humorvolle und unkomplizierte Art.

Ich möchte der gesamten Arbeitsgruppe Bioorganische Chemie für das angenehme

Arbeitsklima und die ständige ausdauernde Hilfsbereitschaft danken.

Elisabeth Weyher-Stingl danke ich für die unzähligen LC-MS-Analysen, die

Einführung in das UV-, CD- und Fluoreszenzspektrometer und die vielen analytisch-

chemischen Hilfestellungen.

Hans-Jürgen Musiol danke ich für sein umfangreiches, stets abrufbares chemisches

Wissen und sein freundliches und geduldiges Naturell, welches viel zur guten

Arbeitsatmosphäre beigetragen hat.

Dr. Cyril Boulegue danke ich für die Synthese der Cystein-reichen Rohpeptide. Sein

umfangreiches Wissen der Peptidchemie und der HPLC-Geräte gepaart mit seiner

ruhigen hilfsbereiten Art haben mir sehr geholfen.

Dr. Norbert Schaschke danke ich für die ausführlichen Erörterungen chemischer

Probleme sowie für manch unterhaltsame Kaffeerunde und Kongressfahrt.

Jose Pfizer danke ich für den unermüdlichen und aufopfernden EDV-Einsatz.

Bei Marion Götz, Alexandra Barazza, Ulrike Kusebauch, Leslie Hötzer und Dr. Stefan

Übel möchte ich mich für ihre Hilfsbereitschaft und das gute und kollegiale

Arbeitsklima bedanken.

Auch bei den vielen möchte Ehemaligen möchte ich mich bedanken.Sie haben mir ein

ums andere Mal bei Problemen geholfen und ihr Wissen uns Nachfolgenden

weitergegeben:

Dr. Markus M. Müller, Dr. Alina Ariosa Alvarez, Dr. Stella Fiori, Dr. Raymond

Behrendt, Dr. Frank Freudenmann, Drs. Barbara und Markus Kaiser und Dr. Dirk

Barth.

Bei Nicola Heim bedanke ich mich für die Hilfe bei der Benutzung des Programms

MS-Word und für die Unterstützung während der gesamten Arbeit.

Mein herzlicher Dank gilt meinen Eltern, die mich während des gesamten Studiums

und meiner Doktorarbeit finanziell und ideell unterstützt haben.

Die vorliegende Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft

(Sonderforschungsbereich 533) finanziell unterstützt.

Abkürzungen 1D eindimensional

2D zweidimensional

APB p-Aminophenylazobenzoesäure

AMPB p-Aminomethylphenylazobenzoesäure

COSY Correlated Spectroscopy

CD Circular Dichroismus

Da Dalton

DG Distanz Geometrie

DMSO Dimethylsulfoxid

HPLC High Performance Liquid Chromatography

Hz Hertz

IR Infrarot

K Kelvin

LC-MS Liquid Chromatography Mass Spectrometry

M Molar (mol/l)

Mr Molgewicht

MD Molecular Dynamics

NMR Nuclear Magnetic Resonance

NOESY Nuclear Overhauser Enhancement

Spectroscopy

PDB Protein Data Bank

PDI Proteindisulfidisomerase

ppm parts per million

ROESY Rotating Frame Overhauser Enhancement

Spectroscopy

RMSD Root Mean Square Deviation

RT Raumtemperatur

TOCSY Total Correlation Spectroscopy

TRR Thioredoxin Reduktase

TRX Thioredoxin

Abkürzungen

UV Ultraviolett

Θ /[Θ]R Elliptizität, Elliptizität pro Aminosäure

(Residue)

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits teilweise in folgenden

Fachzeitschriften veröffentlicht:

Milbradt AG, Kerek F, Moroder L, Renner C (2003) Structural Characterization of

Hellethionins from Helleborus purpurascens. Biochemisty 42: 2404-2411.

Kaiser M, Siciliano C, Assfalg-Machleidt I, Groll M, Milbradt AG, Moroder L (2003)

Synthesis of a TMC-95A ketomethylene analogue by cyclization via intramolecular Suzuki

coupling. Organic Letters 5: 3435-3437.

Barth D, Musiol HJ, Schütt M, Fiori S, Milbradt AG, Renner C, Moroder L (2003) The

Role of Cystine Knots in Collagen Folding and Stability. I. Conformational Properties of

(Pro-Hyp-Gly)5 and (Pro-(4S)-FPro-Gly)5 Model Trimers with an Artificial Cystine Knot.

Chemical European Journal 9: 3692-3702.

Schütt M, Krupka SS, Milbradt AG, Deindl S, Sinner EK, Oesterhelt D, Renner C,

Moroder L (2003) Photocontrol of cell adhesion processes: model studies with cyclic

azobenzene-RGD peptides. Chemistry & Biology 10: 487-490.

Barth D, Milbradt AG, Renner C, Moroder L (2004) A (4R)- or a (4S)-fluoroproline

residue in position Xaa of the (Xaa-Yaa-Gly) collagen repeat severely affects triple-helix

formation. Chembiochem 5: 79-86.

Kaiser M, Groll M, Siciliano C, Assfalg-Machleidt I, Weyher E, Kohno J, Milbradt AG,

Renner C, Huber R, Moroder L (2004) Binding Mode of TMC-95A Analogues to

Eukaryotic 20S proteasome. ChemBioChem 5: 1256-1266.

Kaiser M, Milbradt AG, Siciliano C, Assfalg-Machleidt I, Machleidt W, Groll M,

Renner C, Moroder L (2004) TMC-95A analogues with endocyclic biphenyl ether group as

proteasome inhibitors. Chemisty & Biodiversity 1: 161-173.

Pokidysheva E, Milbradt AG, Meier S, Renner C, Haussinger D, Bachinger HP,

Moroder L, Grzesiek S, Holstein TW, Ozbek S, Engel J (2004) The structure of the Cys-

rich terminal domain of Hydra minicollagen, which is involved in disulfide networks of the

nematocyst wall. Journal of Biological Chemistry 279: 30395-30340.

Ozbek S, Pokidysheva E, Schwager M, Schulthess T, Tariq N, Barth D, Milbradt AG,

Moroder L, Engel J, Holstein TW (2004) The glycoprotein NOWA and minicollagens are

part of a disulfide-linked polymer that forms the cnidarian nematocyst wall. Journal of

Biological Chemistry 279: 52016-52023.

Milbradt AG, Löweneck M, Krupka SS, Reif M, Sinner EK, Moroder L, Renner C

(2004) Photomodulation of Conformational States. IV. Integrin binding RGD-Peptides with

(4-Aminomethyl)phenylazobenzoic Acid as Backbone Constituent. Biopolymers in press.

Renner C, Kusebauch U, Löweneck M, Milbradt AG, Moroder L (2005) Azobenzene as

photoresponsive conformational switch in cyclic peptides. Journal of Peptide Research in

press.

Carstens H, Renner C, Milbradt AG, Moroder L, Tavan P (2004) Multiple loop

conformations of peptides predicted by molecular dynamics simulations are compatible with

NMR. Biochemistry submitted.

Fuhrmans M, Milbradt AG, Renner C (2004) Comparison of protocols for calculation of

peptide structures from experimental NMR data. submitted.

Inhaltsverzeichnis

1. EINLEITUNG 1

1.1. Das zentrale Problem der Proteinfaltung 1

1.2. Modelle der Proteinfaltung 1

1.2.1. Intermediate und Faltungsbarrieren 4

1.2.2. Bildung von Faltungsmotiven 5

1.2.3. Autonome Faltungseinheiten 6

1.2.4. Die Faltung großer Proteine 6

1.2.5. Faltung in der Zelle 7

1.2.6. Disulfidbrücken und oxidative Faltung 7

1.3. Thionine 8

1.4. Minicollagen 10

1.5. Lichtschaltbare Konformationszustände 13

1.5.1. Photoschalter 14

1.5.2. Azobenzol-enthaltende Photoschalter 16

1.5.3. Isomerisierungsmechanismen im Azobenzol 17

1.5.4. Lichtschaltbare Peptidsysteme 18

1.5.5. TRR und PDI 19

2. AUFGABENSTELLUNG 22

3. ERGEBNISSE 23

3.1. Azopeptide 23

3.1.1. bcAMPB 25

3.1.2. Azo-[Ser2, Ser5]-PDI 30

3.1.3. Azo-PDI 35

Inhaltsverzeichnis

3.1.4. Azo-NonaTRR 45

3.2. Minicollagen 51

3.2.1. C-terminale Domäne 51

3.2.2. N-terminale Domäne 64

3.2.3. N-terminale Domäne mit Propeptid 74

3.2.4. Modell des gesamten trimeren Minicollagen 1 78

3.3. Thionine 80

3.3.1. Hellethionin D 80

4. DISKUSSION 85

4.1. Azopeptide 85

4.2. Minicollagen 90

4.3. Hellethionin 93

5. ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 95

6. MATERIAL UND METHODEN 98

6.1. Allgemeiner Teil 98

6.1.1. UV-Spektroskopie 98

6.1.2. CD-Spektroskopie 98

6.1.3. Analytische HPLC 98

6.1.4. Präparative HPLC 99

6.1.5. Massenspektrometrie 100

6.1.6. NMR-Spektroskopie 100

6.2. Azopeptide 101

6.2.1. Azo-PDI 102

6.2.2. Azo-[Ser2, Ser5]-PDI 107

6.2.3. bcAMPB 108

Inhaltsverzeichnis

6.2.4. Azo-NonaTRR 109

6.3. Minicollagen 109

6.3.1. C-terminale Domäne 109

6.3.2. N-terminale Domäne 112

6.3.3. N-terminale Domäne mit Propeptide 113

6.4. Hellethionin D 114

7. LITERATUR 117

8. ANHANG A: RESONANZLISTEN 126

9. ANHANG B: NMR-RANDBEDINGUNGEN 132

10. ANHANG C: RECHENPROTOKOLLE 146

1. Einleitung

1.1. Das zentrale Problem der Proteinfaltung

Proteine sind an nahezu allen biologischen Prozessen beteiligt, die von motorischen

Funktionen des Organismus bis zu kognitiven Fähigkeiten reichen. Die

dreidimensionale räumliche Struktur des Proteins ist für seine Funktion

charakteristisch. Während der Entstehung eines Proteins faltet es sich von einer

linearen Aminosäuresequenz in die dreidimensionale Struktur. Die gesamte

Information für die Struktur muss in der Aminosäuresequenz enthalten sein. Dieser

Sequenz-Struktur Zusammenhang wird als Problem der Proteinfaltung bezeichnet und

stellt eine der zentralen Herausforderungen der Strukturbiologie bis zum heutigen Tag

dar. Bereits 1945 wurde dieser Zusammenhang von Anson (Anson, 1945) postuliert

und durch umfangreiche Arbeiten von Anfinsen bestätigt (Anfinsen et al., 1961), der

eine Rückfaltung denaturierter Proteine durch einfaches Verdünnen des Denaturants

verfolgte (Anfinsen, 1973). Seit der Formulierung der Postulate durch Anfinsen

Anfang der 60iger des letzten Jahrhunderts steht das Problem der Proteinfaltung im

Mittelpunkt der Strukturbiologie. Obwohl mittlerweile viele Einzelheiten der

Proteinfaltung bekannt sind und zahlreiche ausführliche Studien auf dem Gebiet

durchgeführt wurden (Jaenicke, 1991, Scheraga, 1996, Creighton, 1997, Dobson et al.,

1998), bleibt bis heute die Vorhersage der räumlichen Struktur eines Proteins aufgrund

der Aminosäuresequenz im Allgemeinen unmöglich.

1.2. Modelle der Proteinfaltung

Die meisten Proteine lassen sich reversibel durch Temperaturerhöhungen,

denaturierende Reagenzien wie Harnstoff oder Guanidiniumhydrochlorid, durch pH-

Variation oder Reduktion der Disulfidbrücken entfalten. Sie besitzen im

Gleichgewicht nur zwei Zustände, die in nennenswerten Umfang populiert sind,

nämlich den nativen vollständig gefalteten Zustand und den ungefalteten Zustand

(Murphy and Gill, 1991). Die freie Energie des nativen Zustandes ist nur geringfügig

kleiner als die des ungefalteten Zustandes. Die größten energetischen Beiträge liefern

hierzu die Terme der van-der-Waals Energie und der Coulombenergie. Diese Terme

1

Einleitung

stabilisieren nur den nativen Zustand, wohingegen nicht native Zustände durch die

Wechselwirkungen destabilisiert werden.

Der ungefaltete Zustand eines Proteins lässt sich als „random coil“ beschreiben, in

dem die konformationellen Eigenschaften, insbesondere die Dihedralwinkel des

Peptidrückgrats, jeder einzelnen Aminosäure unabhängig von anderen Aminosäuren in

der Proteinsequenz sind. Es existieren keine weitreichenden Wechselwirkungen außer

lokalen sterischen Abstoßungen. Der ungefaltete Zustand ist ausgesprochen heterogen

und entspricht eigentlich einer astronomisch großen Zahl an unterschiedlichen

konformationellen Zuständen (Murphy and Gill, 1991). Der ungefaltete Zustand

zeichnet sich durch einen größeren hydrodynamischen Radius aus, da die

Polypeptidkette eine ausgedehntere Konformation annimmt als im gefalteten Zustand.

Für ungefaltete Proteine in stark denaturierenden Medien wie einer 8 M

Harnstofflösung konnte gezeigt werden, dass die Polypeptidketten tatsächlich die

durchschnittlichen hydrodynamischen Eigenschaften eines „random-coil“ besitzen

(Miller and Flory, 1966). Es gibt jedoch eine Vielzahl von Hinweisen, dass ungefaltete

Proteine unter Bedingungen wie extremen pH und Temperaturwerten in Abwesenheit

von denaturierenden Reagenzien keine wirklichen „random-coil“ Zustände annehmen

(Dobson et al., 1984). Diese Zustände unterscheiden sich aber in ihren physikalischen

und thermodynamischen Eigenschaften nicht messbar vom echten ungefalteten

Zustand und sind eventuell nur Zwischenzustände des ungefalteten Zustandes.

Für eine korrekte Faltung muss eine Proteinsequenz ein thermodynamisches und ein

kinetisches Kriterium erfüllen (Karplus and Sali, 1995). Das thermodynamische

Kriterium fordert, dass das Protein im nativen Zustand nur eine einzige Konformation

annimmt, die unter physiologischen Bedingungen stabil ist. Das kinetische Kriterium

fordert, dass die ungefaltete Polypeptidkette sich in einer akzeptablen Zeit, d.h. in

einer Größenordnung von Millisekunden bis zu Sekunden, in die native Konformation

faltet. Eine Polypeptidkette kann sehr viele Konformationen annehmen, so dass es

einen Weg geben muss, den nativen Zustand in einer Zeit zu erreichen, die

Größenordnungen unter der Zeit liegt, die für eine rein stochastische Suche des

Konformationsraums benötigt würde. Ein 100 Aminosäuren langes Protein würde

durch rein stochastisches Suchen des Konformationsraums die native Konformation

nach durchschnittlich 1027 Jahren finden und bräuchte damit unendlich länger als die 2

Einleitung

beobachtete Faltungsdauer. Diese offensichtliche Diskrepanz wird als das

Levinthalsche Paradoxon bezeichnet. Levintahl postulierte daher bereits 1968 einen

Faltungsweg (Levinthal, 1968), in dem das Protein nur bestimmte Konformationen auf

seinem Weg vom ungefalteten zum nativen Zustand annimmt.

Durch eine Fülle von theoretischen, meist auf Gittersimulation basierenden

statistischen Mechanikmodellen und experimentellen Studien (Dobson et al., 1998)

kann heute davon ausgegangen werden, dass das Protein während der Faltung

tatsächlich bestimmten Pfaden durch die hochdimensionale Energieoberfläche folgt

und sich nicht stochastisch bewegt. Da zwischen der Kondensierung von

Atomclustern, beim Übergang vom gasförmigen über den flüssigen in den festen

Zustand, und der Proteinfaltung Ähnlichkeiten bestehen und diese

Kondensierungsprozesse sehr detailliert bekannt sind, können diese Modelle auch auf

die Proteinfaltung angewandt werden. Hierbei geht man davon aus, dass der

ungefaltete Zustand mit seiner sehr hohen Anzahl von Konformationen, entsprechend

dem Gaszustand eines Stoffes, zuerst zu einem Zustand des „molten oder random

globule“ kondensiert, der dem kompakteren flüssigen Zustand eines Stoffes entspricht,

und erheblich weniger konformationelle Zustände erlaubt. Dieser „molten globule“

kondensiert nun zum nativen Zustand, der dem festen Zustand eines Stoffes entspricht

und nur noch aus einem einzigen konformationellen Zustand besteht. Die

Energieoberfläche bildet bei diesem Kondensationsprozess eine Art Trichter mit

abfallender freier Energie in Richtung des nativen Zustandes, in den das Molekül in

einer hierarchischen Folge von Zwischenzuständen hineingesogen wird. In Abbildung

1 ist die Energieoberfläche eines 27-Aminosäurepeptids gezeigt. Hierbei ist die

Energie zum einem gegen ein Maß der Entropie P und gegen die Vorschrittsvariable

Q, auch Ordnungsparameter genannt, aufgetragen; Q ist der Anteil der nativen

Kontakte an der gesamten Anzahl der Kontakte zwischen den Aminosäureresten. Die

Variable Q gibt somit in sehr kompakter Form den Fortschritt der Faltung wieder, die

eigentlich in einem hochdimensionalen Raum stattfindet. Gerade für die Beschreibung

der Proteinfaltung hat sie sich als sehr nützlich erwiesen. Sie variiert, je nach

Fortschritt der Faltung, zwischen einem Wert nahe null für den ungefalteten Zustand

und einem Wert von eins für den nativen vollständig gefalteten Zustand (Dobson et al.,

1998). 3

Einleitung

Abbildung 1: Gemittelte Energieoberfläche eines 27 Reste enthaltenden Peptids bei hoher Temperatur. E ist die Energie, Q der Anteil der nativen Kontakte und P ist ein Maß für die Entropie bei bestimmten Q. Links ist die gesamte Energielandschaft, rechts nur der zugängliche Teil der Energielandschaft, der nennenswert populiert ist, gezeigt (Dobson et al., 1998).

1.2.1. Intermediate und Faltungsbarrieren

Betrachtet man allerdings die freie Energie der Proteinfaltung aus Abbildung 1 stellt

sich heraus, dass die freie Energie, je nach genauem Faltungsmechanismus früher oder

später, auf dem Weg zum nativen Zustand ein lokales Maximum besitzt. Ein solches

Maximum entsteht durch die starke Entropieabnahme auf dem Weg zum nativen

Zustand und kann durch die energetischen Terme lokal nicht ausgeglichen werden.

Diese Barriere muss von Proteinen überwunden werden und stellt eine Art

Übergangszustand dar (Dobson et al., 1998). Vor dieser Barriere kann ein lokales

Minimum der freien Energie liegen, welches einem Intermediatzustand entspricht. Ein

solches Intermediat bildet der „molten globule“, der in der frühen Phase der

Proteinfaltung gefunden wird (Balbach et al., 1997). Er formt ein kompaktes Knäuel,

in dem die hydrophoben Gruppen vor der wässrigen Umgebung abgeschirmt werden,

und bildet bereits nativ-ähnliche Sekundärstrukturelemente aus, besitzt aber noch

keine spezifische Tertiärstruktur.

Die Stabilisierung solcher korrekter Zwischenprodukte verringert die Suchzeit der

Proteinfaltung erheblich. Die kumulative Selektion von stabileren Intermediaten führt

zu einer zunehmenden Stabilisierung und Kooperativität im Verlauf der Faltung des

Proteins. Allerdings beträgt der Gewinn der freien Energie für ein 100 Aminosäuren

4

Einleitung

großes Protein zwischen ungefaltetem und nativem Zustand nur etwa 40 kJ/mol

(Privalov, 1979). Der Beitrag der einzelnen Aminosäuren ist daher sehr gering. Dies

rührt daher, dass der native Zustand zwar energetisch günstiger, entropisch aber

ungünstiger als der ungefaltete Zustand ist und beide Terme sich größtenteils

aufheben.

1.2.2. Bildung von Faltungsmotiven

Ein weiterer zentraler Prozess im frühen Verlauf der Faltung ist die Bildung von α-

Helix, β-Faltblatt und β-Turn–Faltungseinheiten. Sie bilden einen Faltungskern, um

den herum sich der Rest der Struktur aufbauen könnte (Dobson et al., 1998). In diesem

Stadium der Faltung sind die bereits vorhandenen nativen Kontakte noch von kurzer

Reichweite und auf die Bildung von Sekundärstrukturelementen beschränkt.

Bestimmte Sequenzmuster und einzelne Aminosäuren treiben die Ausbildung dieser

Sekundärstrukturelemente voran. So begünstigen z.B. Alanin und Leucin die Bildung

von α-Helices, während Valin und Isoleucin β-Faltblattstrukturen stabilisieren

(Horovitz et al., 1992). Ebenso werden Positionen am Anfang (N-cap) und Ende (C-

cap) einer α-Helix durch Aminosäurereste besetzt, deren Seitenketten eine

Wasserstoffbrücke zum Peptidrückgrat ausbilden können. Die Aminosäuren Asn, Asp

und Thr werden vermehrt am Anfang, His und Asn vermehrt am Ende von Helices

gefunden. Diese Aminosäuren initiieren und stabilisieren die Bildung von α-Helices in

Peptiden und Proteinen (Munoz and Serrano, 1994). Experimentelle Studien an

Proteinen und Peptiden, sowie statistische Analysen von Protein-Datenbanken

(Richardson and Richardson, 1988) ergaben, dass negativ geladene Aminosäurereste

bevorzugt am N-Terminus einer α-Helix, positiv geladene Reste dagegen bevorzugt

am C-Terminus einer α-Helix vorkommen. Dadurch entsteht ein Dipol über den

Verlauf der Helix, der die Helix stabilisiert, das Gleichgewicht zwischen der α-Helix

und einer random-coil Konformation der Reste verschiebt und damit die Bildung des

Faltungsmotivs begünstigt. Durch Ultrakurzzeit-IR-spektroskopische Messungen an

Peptiden mit α-helikaler Strukturpräferenz konnte gezeigt werden, dass die

Sekundärstrukturbildungen schnell genug stattfinden, um eine wichtige Rolle in der

frühen Phase der Proteinfaltung spielen zu können (Williams et al., 1996).

5

Einleitung

1.2.3. Autonome Faltungseinheiten

Bei der Faltung von bestimmten Proteinen existieren Substrukturen, die sich

unabhängig vom Rest der Polypeptidkette in nativ-ähnliche Konformationen falten

(Peng and Wu, 2000). Durch CD- und NMR-Messungen konnte gezeigt werden, dass

ein synthetisches Disulfid-verknüpftes Peptidfragment des Trypsin-Inhibitors BPTI bei

4 °C die gleiche Sekundär- und Tertiärstruktur einnimmt wie das intakte Protein. Das

Fragment besteht aus den Aminosäureresten 43-58 und 20-33 des BPTI, wobei die

beiden Sequenzen durch eine Disulfidbrücke zwischen Cys 31 und Cys 51 verbunden

sind. Das erste Fragment bildet eine α-Helix und das zweite eine β-Haarnadelschleife.

Das Fragmentpaar ahmt damit einen Teil des nativen Proteins nach. Allgemein lässt

sich daraus folgern, dass der Faltungsweg durch die sequenzbedingte Neigung

bestimmt ist, Zwischenprodukte zu bilden, die dem nativen Molekül gleichen. Die

Proteinfaltung wird also durch gleiche Wechselwirkungen dirigiert, die auch zum

nativen Zustand führen und diesen stabilisieren.

1.2.4. Die Faltung großer Proteine

Je größer Proteine werden, desto komplexer und schwieriger wird es, den

Faltungsprozess experimentell zu verfolgen. So treten z.B. während der Faltung des

Lysozyms verschiedene Faltungsintermediate und verschiedene Faltungswege auf, da

sich die vollständige Struktur nicht in einem Schritt kooperativ aus dem „molten

globule“ der frühen Faltungsphase bildet (Kiefhaber, 1995). Es entwickeln sich

unabhängige nativ-ähnliche Strukturen in unterschiedlichen Domänen des Lysozyms.

Eine Domäne ist größtenteils α-helikal, wohingegen die andere Domäne größtenteils

β-Faltblattregionen enthält. Da sich eine Domäne schneller als die anderen Domänen

falten kann, entsteht ein partiell gefaltetes Intermediat, in dem die schneller faltende

Domäne bereits den nativen Zustand angenommen hat. Innerhalb jeder Domäne ist die

Bildung der endgültigen Struktur kooperativ und erfolgt in einem Zeitbereich, der dem

Faltungsprozess kleiner Proteine entspricht. Die vollständig native Struktur des

gesamten Proteins wird durch das Zusammenwirken der beiden Domänen in einem

langsamen, geschwindigkeitsbestimmenden Schritt gebildet, bei dem eine

Energiebarriere überwunden werden muss. In Übereinstimmung mit diesen

experimentellen Beobachtungen zeigen Gittersimulationen, dass bei längeren 6

Einleitung

Polypeptidketten mehrere Faltungsdomänen, die sich unabhängig falten, existieren

(Dinner et al., 1996). Die Domänenbildung ist daher eine wichtige Eigenschaft der

Faltung großer Peptide. Sie unterscheiden sich damit von kleinen Proteinen, in denen

die gesamte Polypeptidkette in einem einzigen kooperativen Schritt gefaltet wird.

1.2.5. Faltung in der Zelle

Der Faltungsprozess in der Zelle unterscheidet sich von den theoretischen und

experimentell in vitro bestimmten Mechanismen durch die hohe Proteinkonzentration

in der Zelle und durch die Anwesenheit von anderen, die Faltung beeinflussenden

Molekülen, so genannten Foldasen. Zum einen gibt es Enzyme, die, wie später

ausführlicher beschrieben wird, die Isomerisierung von Disulfidbrücken beschleunigen

und zum anderen Proteine, Chaperone genannt, die entfaltete Polypepdidketten und

Faltungsintermediate binden und damit deren Aggregation verhindern (Hartl, 1996).

Diese Chaperone besitzen auch eine Entfaltungsaktivität, mit der sie fehlgefalteten

Proteinen erlauben, die kinetischen Fallen wieder zu verlassen und den korrekten

Faltungsweg einzuschlagen.

Weitgehend unverstanden sind die Faltungsmechanismen von Membranproteinen

und Membran-assoziierten Proteinen, da hier die Faltung in hydrophober und nicht in

hydrophiler Umgebung stattfindet und die frühe und wichtige Phase des „molten

globule“ wahrscheinlich verändert ist oder gar nicht auftritt.

1.2.6. Disulfidbrücken und oxidative Faltung

Disulfidbrücken in Proteinen erniedrigen durch die Einschränkung des

Konformationsraums die Entropie des ungeordneten Zustandes und begünstigen den

nativen Zustand durch Stabilisierung energetisch bevorzugter Wechselwirkungen

(Darby and Creighton, 1997, Creighton, 1997). Reduziert man in kleinen nativen

Proteinen, wie BPTI, RNase A und α-LA die Disulfidbrücken, entfalten sie sich, da

die Bildung der Disulfidbrücken für die Stabilisierung des nativen Zustandes wichtig

ist. Daher kann die Faltung dieser Proteine über die Anwesenheit von oxidierenden

bzw. reduzierenden Reagenzien gesteuert werden. Faltungsintermediate können nach

der Methode von Creighton (Creighton, 1986) durch Alkylierung freier Thiolgruppen

der Cysteine abgefangen werden. Der Einfluss einzelner Disulfidbrücken kann durch

7

Einleitung

gezielte Mutation der Cysteine gegen Alanin, Serin (Staley and Kim, 1992) und

Selenocystein (Pegoraro et al., 1998) experimentell untersucht werden.

Die Bildung des nativen Zustandes unter Oxidation zu Disulfidbrücken wird als

oxidative Proteinfaltung bezeichnet. Der Mechanismus der oxidativen Proteinfaltung

wurde ausgiebig an den oben erwähnten Proteinen BPTI, RNase und α-LA untersucht.

In der Ribonuklease A bilden sich aus dem ungefalteten Zustand R erst Disulfid-

Ensembles nS, die schließlich im 3S-Intermediat unter einer langsamen Disulfid-

Austauschreaktion die Übergangszustände des [40-95] und des [65-72]-Intermediats

mit nativ-ähnlicher Struktur und ausschließlich nativen Disulfidbrücken ausbilden, die

sich dann schnell in den nativen Zustand N falten (Abbildung 2). Aufgrund der kleinen

Größe und der ungewöhnlich hohen Stabilität des BPTI mit seiner fast vollständigen

korrekten Faltung nach der Bildung einer einzigen Disulfidbrücke (van Mierlo et al.,

1993), könnte das Auftreten relativ ungeordneter Intermediate in der Faltung wie bei

der Ribonuklease A ein zweites Modell der disulfidstabilisierten Proteinfaltung

darstellen (Volles et al., 1999).

R 1S 2S 3S 4

des[40-95] des[65-72]3S*

N

S

Abbildung 2: Kinetisches Modell der oxidativen Faltung der RNase A mit DTTox. Die native RNase A enthält vier Disulfidbrücken an den Positionen [26-84], [40-95], [58-110] und [65-72]; nS symbolisieren Disulfid-Ensembles mit n = 1, 2, 3, 4 Disulfidbrücken, R den vollständig reduzierten und N den nativen Zustand (Rothwarf et al., 1998). In horizontaler Richtung ist die Verteilung der Disulfidbrücken und in vertikaler Richtung der Faltungsgrad aufgetragen.

1.3. Thionine

8

Thionine sind Cystein-reiche Peptide mit einer Größe von ca. 5 kDa, welche eine

wichtige Rolle in der Abwehrreaktion der Pflanzen gegen Pathogene spielen (Garcia-

Olmedo et al., 1998). Getreidepflanzen (Graminacea) bilden eine besonders reiche

Quelle an Thionin, z.B. wurden Purothionine aus Weizen (Triticum aestivum) (Balls et

Einleitung

al., 1942), Hordothionine aus Gerste (Hordeum vulgare) (Redman and Fisher, 1969),

Avenothionine aus Hafer (Avena sativa) (Bekes and Lasztity, 1981), Secalothionin aus

Roggen (Secale cereale) (Hernandez-Lucas et al., 1979) und kürzlich Thionine aus der

Augenbohne (Vigna unguiculata) (Melo et al., 2002) isoliert. Getreidethionine sind

gewöhnliche Bestandteile der Nahrung von Mensch und Tier und zeigen keinerlei

orale Toxizität, da sie bei der Verdauung leicht enzymatisch abgebaut werden. Andere

Quellen von Thioninen sind parasitär lebende Pflanzen. Viscotoxin wurde aus Misteln

(Viscum album) (Schaller et al., 1996), Pyruliathionin aus der Pyrulianuss (Pyrularia

pubera) (Vernon et al., 1985) und Crambin aus der Krambe (Crambe abyssinica)

(Teeter et al., 1981) isoliert.

Thionine besitzen in ihrer Sequenz sechs oder acht Cysteinreste, die drei bzw. vier

Disulfidbrücken bilden (Bohlmann and Apel, 1991). Obwohl alle bis heute bekannten

Thionine sich z.T. erheblich in ihrer Sequenz unterschieden, befinden sich sechs

konservierte Cysteinreste an den Positionen 3, 4, 16, 26, 32 und 40 mit einem

konservierten Disulfidverknüpfungsmuster, ein Arginin an Position 10 und eine

aromatische Aminosäure an der Position 13. Die Tatsache, dass fast alle Thionine

basische Peptide sind, wird mit ihrer Membranaktivität in Verbindung gebracht.

Während die Wechselwirkung mit Phospholipiden eine Vorraussetzung für die

Toxizität ist, reicht sie allein nicht aus, um die Zelle zu lysieren und zu töten. Das

Pyruliathionin behält nach Oxidation des Trp 8 zwar seine Membranaktivität, verliert

aber seine hämolytische Toxizität (Fracki et al., 1992). Thionine sind in vitro toxisch

für Bakterien, Pilze und Hefen, und es wird angenommen, dass sie dieselbe Toxizität

als Abwehrmoleküle in der lebenden Pflanze ausüben (Garcia-Olmedo et al., 1998).

Die isolierten Viscotoxine A1 und A2 können in Zellkultur die Apoptose von

menschlichen Lymphozyten auslösen, während das verwandte Viscotoxin B und das

Pyruliathionin diesen Effekt nicht hervorrufen (Bussing et al., 1999). Der genaue

Mechanismus der Interaktion zwischen den Thioninen und der Zellmembran ist noch

umstritten, es gibt aber eine hohe Korrelation zwischen der Zytotoxizität und der

Fähigkeit, Membrankanäle zu bilden (Hughes et al., 2000). Die antimikrobielle

Wirkung und die Zytotoxizität der Thionine ergeben zwei mögliche

Anwendungsgebiete. Zum einen können transgene Pflanzen mit Thioningenen erzeugt

werden, die dann erhöhte Resistenz gegen Pathogene besitzen (Ohashi et al., 1998). 9

Einleitung

Zum anderen können Thionine an tumorspezifische Antikörper gebunden werden und

so in der Krebstherapie Verwendung finden (Gasanov et al., 1995).

Die dreidimensionale Struktur von verschiedenen Thioninen wurde durch

Röntgenbeugung (Stec et al., 1995, Jelsch et al., 2000) und durch NMR-Spektroskopie

bestimmt (Clore et al., 1987, Romagnoli et al., 2000). Die Strukturen ähneln alle dem

griechischen Buchstaben Γ, in dem der vertikale Balken durch zwei antiparallele α-

Helices und der horizontale Balken durch ein kurzes antiparalles β-Faltblatt gebildet

wird. Die Fähigkeit der Thionine, Membrankanäle zu bilden, hängt wahrscheinlich mit

ihren strukturellen Eigenschaften zusammen, in der die geladenen Gruppen an der

Innenseite der Helices und des β-Faltblattes liegen und die hydrophoben Resten an der

Außenseite des Γ liegen.

Eine neue Familie von Thioninen, genannt Hellethionine, wurde aus der

Balkanlenzrose (auch Purpurnieswurz genannt) (Helleborus purpurascens) isoliert

(Milbradt et al., 2003). Die Balkanlenzrose gehört zu der Gattung der

Hasenfußgewächse (Ranunculaceae). Auf dem Balkan wird sie seit Jahrhunderten als

Heilpflanze für Nutztiere verwendet. Verschiedene pharmakologisch relevante Stoffe

wie das Herzglykosid Hellebrin (Cioca and Cucu, 1974), eine Bufadienolische

Verbindung (Muhr et al., 1994) und verschiedene andere Naturstoffe sind bereits aus

der Balkanlenzrose isoliert worden.

1.4. Minicollagen

Collagene sind essentielle Bestandteile des Bindegewebes. In Säugetieren sind bis

jetzt mehr als 20 verschiedene Collagene gefunden worden. Die Zahl der Collagen-

kodierenden Gene ist noch größer, da Collagene Trimere sind, und die einzelnen

Monomere zum Teil aus unterschiedlichen Polypeptidketten bestehen. Ketten, die den

charakteristischen Collagensequenzrepeat Gly-Xaa-Yaa besitzen, können eine

Tripelhelix bilden. Viele Collagene der Säugetiere können bis zu frühen Organismen

wie dem Süßwasserpolyp (Hydra), Muscheln und Würmern zurückverfolgt werden.

Beispiele sind das interstitielle Collagen I, II, III und V und das

Basalmembrancollagen IV. Obwohl das Bindegewebe der Wirbellosen und der

Säugetiere unterschiedlich aufgebaut sind, zeigt die hohe Konservierung der Collagene

ihre überragende Bedeutung. 10

Einleitung

Zusätzlich verfügen Wirbellose auch über nicht verwandte Collagene, die spezielle

Funktionen erfüllen. Ein interessantes Beispiel sind die sechs unterschiedlichen

Minicollagene von Hydra, die die kürzesten bis heute bekannten Collagene darstellen

(Kurz et al., 1991). Diese Collagene befinden sich in der Wand des Nematocysten,

einem hochspezialisierten kapselartigen Organell, welches seinen Inhalt

explosionsartig entleeren kann. Der Nematocyst kommt häufig in Nesseltieren

(Cnidaria) vor, ist aber in Säugetieren nicht existent. Der Nematocyst befindet sich in

der Nematocyte, einer Zelle die dem Beutefang, der Fortbewegung und der

Verteidigung der Nesseltiere dient. Die Entleerung der Nematocysten ist einer der

schnellsten Exocytoseprozesse in der Natur und ist nach 3 ms beendet (Holstein and

Tardent, 1984). Die maximale Geschwindigkeit des ausgestoßenen Tubulus beträgt 2

ms-1 und entspricht einer Beschleunigung von 40.000 g. Der sehr hohe osmotische

Druck in den Nematocysten, der den explosionsartigen Ausstoß bewirkt, wird auf 150

bar geschätzt und durch eine 2 M Konzentration an Poly-γ-Glutamat in der Matrix

aufgebaut (Weber, 1990). Die Wände des Organells müssen daher einem enormen

Innendruck widerstehen können. Nach der Entdeckung von sechs eng verwandten

Minicollagenen wurde spekuliert, dass diese für die außergewöhnliche Zugfestigkeit

der Nematocystenwand verantwortlich sind (Kurz et al., 1991).

Das Minicollagen 1 aus Hydra wird von dem N-COL-1 Gen kodiert und bildet

unter physiologischen Bedingungen ein Homotrimer. Die Sequenz (Abbildung 3)

enthält eine zentrale tripelhelikale Region mit 14 Gly-Xaa-Yaa Repeats. Die zentrale

Region wird an ihren N- und C-Termini durch Polyprolin-Bereiche unterschiedlicher

Länge flankiert, an die sich die Cystein-reichen N- und C-terminale Domänen

anschließen.

11

Einleitung

1 5 10 15 20 25 30 35 40

D A N P C G S Y C P S V C A P A C A P V C C Y

P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P A P L P

G N P G P P G R P G P P G A P G P A G P P G L P G P P G P P G A P G Q G G L P G Q P

A P P P P

P C P P V C V A Q C V P T C P Q Y C C P A K R K

Abbildung 3: Sequenz des Minicollagen-1 aus Hydra; oben ist die N-terminale Domäne gezeigt, (Cysteine sind gelb unterlegt) darunter befindet sich der N-terminale Polyprolin-Bereich; in der Mitte ist in grün die zentrale tripelhelikale Region dargestellt, und darunter befinden sich der C-terminale Polyprolin-Bereich (grau) und die C-terminale Cystein-reiche Domäne.

Aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen ist bekannt, dass die Wand der

Nematocystenkapsel aus Collagen-ähnlichen Fibrillen besteht (Holstein et al., 1994).

Diese Fibrillen werden wahrscheinlich aus disulfidverknüpften Polymeren des

Minicollagens gebildet. Die Biogenese des Nematocysten, in Abbildung 4 gezeigt,

folgt einem komplexen Entwicklungsweg, in dem es zur Proteinassemblierung kommt.

Der Nematocyst setzt sich in einer post-Golgi Vakuole aus Bestandteilen, die über

Vesikel vom ER geliefert werden, zusammen (A). An der inneren Wand der

Vakuolenmembran lagern sich zwei unterschiedlich dichte Schichten ab, die

zusammen die Nematocystenwand bilden (B). Anschließend wird ein zylindrischer

Tubulus am apikalen Ende der Kapsel geformt (C) (Holstein, 1981). Nach

Fertigstellung wird dieser Tubulus in die Kapsel hineingestülpt und dort mit einer Art

Gerüst umgeben (Engel et al., 2002) (D). In der letzten Entwicklungsphase wird die

Nemtocystenwand gehärtet, verringert sich auf 50 % ihrer ursprünglichen Dicke und

die Kapsel wird mit Poly-γ-Glutamat gefüllt (Weber, 1990) (E). Bei der Härtung der

Nematocystenwand werden die Minicollagenmoleküle über ihre Disulfidbrücken quer

vernetzt.

12

Einleitung

Abbildung 4: Biogenese eines Nematocysten in Hydra (Engel et al., 2002).

1.5. Lichtschaltbare Konformationszustände

Um Nichtgleichgewichtsdynamiken wie die der Proteinfaltung untersuchen zu

können, müssen die relevanten Prozesse zu einem definierten Zeitpunkt gestartet

werden (Volk, 2001). Induzierte Änderungen der Lösungsbedingungen wie pH-Wert,

Ionenstärke oder Konzentration von Entfaltungsreagenzien (Harnstoff,

Guanidiniumhydrochlorid) können mit speziellen Vorrichtungen („stopped flow“

Apparaturen) bis in den Millisekundenbereich verfolgt werden (Kiefhaber, 1995).

Temperatursprungexperimente sind schneller zu realisieren, aber oft schwieriger zu

kontrollieren bzw. zu analysieren, da der äußere Stimulus durch eine Reihe von

Zwischenschritten auf das zu beobachtende System übertragen wird (Phillips et al.,

1995). Die Kurzzeit- und Ultrakurzzeitspektroskopie hingegen erlaubt mittels sehr

kurzer Laserpulse sowohl eine spektral genau definierte Anregung des Systems als

auch die zeitaufgelöste Beobachtung der folgenden Prozesse im

Femtosekundenbereich. Deswegen können photoschaltbare Konformations-

änderungen, z.B. in Peptiden mit Photoschaltern, die Möglichkeit bieten,

Faltungsvorgänge im Femto- und Pikosekunden Bereich zu beobachten (Spörlein et

al., 2002).

13

Einleitung

1.5.1. Photoschalter

Jedes lichtschaltbare System benötigt einen Photoschalter, um auf entsprechende

Bestrahlung mit Änderungen seiner Eigenschaften reagieren zu können. Sowohl

organische Moleküle als auch Metallkomplexe können in verschiedenen

geometrischen Isomeren existieren, welche unterschiedliche physikalische

Eigenschaften und chemische Reaktivität besitzen (Dugave and Demange, 2003). Ein

Molekül, das zwei Atome besitzt, meist Stickstoff oder Kohlenstoff, die durch eine

Doppelbindung verbunden sind und zwei unterschiedliche Substituenten an dieser

Doppelbindung besitzt, kann in zwei Isomerenzuständen gefunden werden, wenn X ≠

W und Y ≠ Z ist (Abbildung 5)

Abbildung 5: Schematische Darstellung von Molekülen, die π-Elektronen-Systeme enthalten und eine E-Z Isomerie nach Cahn-Ingold-Prelog besitzen.

Unter der Voraussetzung das W = Y ist, werden A und B jeweils das cis- und das

trans-Isomer bezeichnet. Nach der Nomenklatur von Cahn-Ingold-Prelog wird A auch

als das Z-und B auch als das E-Isomer bezeichnet. Diese Nomenklatur gilt auch dann,

wenn ein oder zwei Stickstoffe das π-Elektronensystem bilden. Die entsprechenden

Substituenten sind in diesem Fall freie Elektronenpaare. Die Verbindungen A und B

sind Diasteromere. Sie haben verschiedene physikalische und chemische

Eigenschaften. Geometrische Isomere von Biomolekülen haben daher unterschiedliche

biologische Aktivitäten. So lange der Energieunterschied zwischen den Isomeren

gering ist, sind beide Isomere unter physiologischen Bedingungen existent und

können, falls die Energiebarriere nicht zu hoch ist, nach entsprechender Anregung

ineinander umgewandelt werden.

Für die Isomerisierung existieren, je nach chemischer Struktur und Art des

Photoschalters, eine ganze Reihe möglicher Mechanismen (Dugave and Demange,

2003). Einige von ihnen basieren auf der homo- oder heterolytischen Spaltung der 14

Einleitung

Doppelbindung. Andere Mechanismen basieren auf einer Schwächung des

Doppelbindungscharakters durch Konjugation, die eine Umwandlung erleichtert. Eine

schematische Übersicht ist in Abbildung 6 gegeben.

X

Y X

Y

. .X Y

++

. .

X Y

X Y + -

++

X

Y

+

-++

++

Pfad A

Pfad A'

Olefine

push-pullVerbindungen

X

YNu

Nu-

X

Y

-X

Nu

Y

-++++

RS.

X

RS Y

.X

RS

Y

.++ ++

X

Y

H H +H+ X Y

HH

+

++ ++

X YOlefine

Acrylate

Acrylate

N NX Y

N NY

X

++

N NX Y

++

N NX

Y Diazene

Y

OH

Y

O H

O Y

H

++

OH

YEnole

Pfad B

Pfad B'

Pfad B''

Pfad C

Pfad D

++

Abbildung 6: Mögliche Mechanismen der E-Z Isomerisierung.

Die homolytische Spaltung wurde bei der heterogenen Hydrierung,

Radikalreaktionen initiiert durch Radikalgenerierung (z.B. thermische Zersetzung von

Azoverbindungen), direkter Photoisomerisierung, durch paramagnetische Moleküle

induzierter Isomerisierung und bei der thermischen Isomerisierung beobachtet (Pfad

A). In anderen Fällen kann eine radikalische Addition/Eliminierung eine E-Z

Isomerisierung bewirken (Pfad B’). Außer für Reaktionen, die reaktive Nukleophile

(Pfad B) oder reaktive Elektrophile (Pfad B’’) als Reaktant benötigen, wird die

15

Einleitung

heterolytische Spaltung der Doppelbindung stark durch captodative Etyhlensysteme

mit Elektronendonatoren als Substituent (X) und Elektronenakzeptoren als Substituent

(Y) auf der anderen Seite getrieben. In ausgedehnten konjugierten Systemen, wie z.B.

in Farbstoffen, wird durch die Resonanzenergie die energetische Rotationsbarriere

erniedrigt. Stickstoff-enthaltende π-Systeme mit freien Elektronenpaaren können über

eine Doubletinversion isomerisieren. Der Mechanismus der Doubletinversion

konkurriert allerdings mit einer einfachen Rotation, die durch Tautomerie begünstigt

wird (Pfad D).

1.5.2. Azobenzol-enthaltende Photoschalter

In Gegensatz zu den photoschaltbaren Acrylaten, Enaminen und Iminen werden

Stickstoff-Stickstoff π-Systeme nicht in natürlichen Substanzen gefunden. Es wurden

zahlreiche photoschaltbare Azo-enthaltende Moleküle für die konformationelle

Kontrolle von Peptiden und anderen Biomolekülen entwickelt (Renner et al., 2004).

Auch in der Halbleiter- und Nanotechnologie werden verschiedene Azobenzol-

enthaltene Substanzen als Speichermoleküle verwendet (Kawata and Kawata, 2000).

Aufgrund ihrer breiten Anwendung sind Azobenzol-enthaltende Verbindungen

ausführlich untersucht worden (Suginome, 1995). Diarylazo-Verbindungen existieren

im Dunkeln in der stabileren trans-Form und isomerisieren leicht nach Bestrahlung bei

320 – 350 nm in eine 12 kJ/mol weniger stabile cis-Form (Rau, 1990). Die Reaktion

ist zum einen durch Belichtung bei 400–450 nm oder durch thermische Relaxation bei

erhöhter Temperatur vollständig reversibel. Die genaue Anregungswelllänge variiert je

nach Substituenten, wobei Azo-Verbindungen mit push-pull Substituenten

rotverschobene Anregungsmaxima zeigen (Renner et al., 2004). In unserer Gruppe

wurden die beiden Azobenzol-Bausteine APB (Behrendt et al., 1999) und AMPB

(Ulysse et al., 1995) als ω-Aminosäuren in der Peptidsynthese verwendet (Abbildung

7).

16

Einleitung

O

OH

NH2

NN

O

OH

NN

NH2

Abbildung 7: Azobenzol-Bausteine als ω-Aminosäuren. Links: 4’(Amino)-phenylazobenzoesäure (APB) und rechts 4’(Aminomethyl)phenylazobenzoesäure (AMPB).

Durch die konjugierten push-pull Substituenten sind die Anregungsmaxima des

APB-Bausteins im Vergleich zum AMPB-Baustein, in dem die Aminogruppe durch

Einführung des Methylspacers nicht mehr konjugiert ist, rotverschoben. Das

Anregungsmaximum der trans→cis Isomerisierung des APB-Bausteins in DMSO liegt

bei 370 nm bzw. für die cis→trans Isomerisierung bei 450 nm. Die Anregungsmaxima

des AMPB-Bausteins in einer Peptidkette liegen bei 335 nm für die trans→cis

Isomerisierung und bei 434 nm für die cis→trans Isomerisierung in Wasser (Behrendt,

2000).

1.5.3. Isomerisierungsmechanismen im Azobenzol

Bei der trans→cis Isomerisierung von Azobenzol-enthaltenden Verbindungen

ändert sich sowohl die Polarität als auch die Geometrie des Bausteins. In der planaren

trans-Form des Azobenzols beträgt der mittlere Abstand der beiden para C-Atome

etwa 9 Å und verringert sich in der abgewinkelten nicht-planaren cis-Form auf 6 Å

(Robertson, 1939).

NN R

RN N

RR

trans cis

hν

hν, ∆T

~9 A ~6 A

Abbildung 8: Änderung des Abstands der beiden para-C-Atome bei der Isomerisierung des Azobenzols.

17

Einleitung

Für die Isomerisierung von N=N π-Systemen sind zwei Mechanismen bekannt: i)

eine Inversion des Stickstoff-Doublets und ii) eine Rotation (Cimiraglia and Hofmann,

1994). Die Art der Isomerisierung hängt von dem eingeschlagenen Pfad durch die

Energielandschaft des S0, S1 und S2 Zustands ab.

Abbildung 9: Potentialkurven des S0, S1 und S2 Zustands des Azobenzols (Monti et al., 1982).

Die theoretischen berechneten Potentialkurven der verschiedenen Zustände sind in

Abbildung 9 gezeigt (Monti et al., 1982). Bei dem Inversionsmechanismus geht das

System nach Absorption eines Photons hν, sowohl im trans- als auch im cis-Isomer, in

den ersten elektronisch angeregten Zustand S1 über. Die Rückkehr in den

Grundzustand erfolgt zunächst entlang einer S1 Potentialkurve der Inversion in ein

Minimum bei φ = 0. Von dort kehrt das angeregte Molekül je nach φ Wert in den

trans- oder cis-Grundzustand zurück. Wird nach Absorption eines Photons hν das

System in den zweiten angeregten Zustand S2 angeregt, so wird das System mit Hilfe

des Rotationsmechanismus in den Grundzustand zurückkehren. Bei dem

Rotationsmechanismus wird ein Phenylring um die N=N-Bindungsachse rotiert (Monti

et al., 1982).

1.5.4. Lichtschaltbare Peptidsysteme

In vorhergehenden Arbeiten wurde bereits ein photoschaltbares zyklisches

Octaazopeptid entworfen und synthetisiert, das unterschiedliche Redoxpotentiale

seines Bis(cysteinyl)motivs, welches aus der Thioredoxin-Reduktase (siehe unten)

stammte, in der trans- und in der cis-Form besaß (Cattani-Scholz et al., 2002). Im 18

Einleitung

Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden konformationelle und Redoxeigenschaften

weiterer zyklischer Azopeptide, die das Bis(cysteinyl)motiv der Thioredoxin-

Reduktase oder der Proteindisulfidisomerase besaßen, untersucht.

1.5.5. TRR und PDI

Die beiden redoxaktiven Enyzme Thioredoxin-Reduktase (TRR) und

Proteindisulfidisomerase (PDI) gehören zur Superfamilie der Oxidoreduktasen. Die

Thioredoxin-Reduktase ist am Elektronentransport bei der Reduktion von

Ribonukleotiden zu Desoxyribonukleotiden beteiligt und besitzt neben zwei

redoxaktiven Cystein-Resten FAD/FADH2 als prosthetische Gruppe und eine NADPH

Bindungsstelle. Der Elektronenfluss vom NADPH zur Desoxyribose unter Beteiligung

der Thioredoxin-Reduktase ist in Abbildung 10 gezeigt. Daneben kann die

Thioredoxin-Reduktase aber auch Vitamin K, Dehydroascorbinsäure und freie

Radikale der Ascorbinsäure reduzieren.

NADPH + H+

NADP+ FADH2

FAD TRR

TRR

SH

SH

SH

SH

S

S

S

S

S

S

S

S

TRXSH

SH

SH

SH

TRX

RNR

RNRSH

SH

SH

SH

S

S

S

S

Ribose

Desoxyribose

Thioredoxin Redukatse

(TRR)

Thioredoxin

(TRX)

Ribonukleotid-

Reduktase (RNR)

Abbildung 10: Enzymatischer Elektronentransfer bei der Reduktion von Ribonukleotiden zu Desoxyribonukleotiden.

Die TRR aus E. coli ist ein 321 Aminosäurereste großes globuläres Protein, das aus

zwei Domänen besteht. Eine Domäne besitzt FAD als prosthetische Gruppe, die

andere bildet eine NADP Bindungsstelle. Die Cysteine sind im Bis(cysteinyl)motiv

Cys-Xaa-Yaa-Cys angeordnet, welches sich am N-Terminus einer α-Helix in der

NADPH Bindungsdomäne befindet. An der X-Position befindet sich ein Ala, an der Y-

Position ein Thr. Die Thioredoxin-Reduktase weicht allerdings von der für dieses

Bis(cysteinyl)motiv typischen Thioredoxinfaltung, die in einer ganzen Reihe von

redoxaktiven Enzymen gefunden wurde (Holmgren, 1995), ab (Waksman et al., 1994).

19

Einleitung

In Abbildung 11 ist die Struktur der Thioredoxin-Reduktase aus E. coli mit dem

hervorgehobenem Bis(cysteinyl)motiv gezeigt.

Abbildung 11: Struktur der Thioredoxin-Reduktase (PDB: 1TDE). Das Bis(cysteinyl)motiv ist durch blaue Seitenkettenbindungen gekennzeichnet. Die Disulfidbrücke ist gelb gezeichnet.

Die Proteindisulfidisomerase ist ein endoplasmatisches Reticulum-ständiges

eukaryotisches Enzym, das die Isomerisierung von Disulfidbrücken anderer Proteine

erleichtert und so nicht-native Disulfidverknüpfungen wieder lösen kann. Die

reduzierte Form der PDI wird durch Reduktion mit GSH wiedergewonnen. Neben der

Disulfidisomerase-Aktivität besitzt PDI auch eine Chaperon-Aktivität (Wang and

Tsou, 1993). PDI bindet eine ganze Reihe von ungefalteten Polypeptiden über

hydrophobe Regionen an der Proteinoberfläche. Die PDI besitzt zwei redoxaktive

Bis(cysteinyl)motive in zwei getrennten Domänen. An der X-Position befindet sich ein

Gly und an der Y-Position ein His. Im Vergleich zur Thioredoxin-Reduktase ist das

Redoxpotential des Bis(cysteinyl)motivs positiver. PDI nimmt als native Form die

weitverbreitete Thioredoxinfaltung an. In Abbildung 12 ist die Struktur der N-

terminalen Domäne der Proteindisulfidisomerase mit dem Bis(cysteinyl)motiv

abgebildet.

20

Einleitung

Abbildung 12: Struktur der N-terminalen Domäne der Proteindisulfidisomerase. Das Bis(cysteinyl)motiv ist durch blaue Seitenkettenbindungen gekennzeichnet. Die Disulfidbrücke ist gelb gekennzeichnet.

21

2. Aufgabenstellung Im Rahmen dieser Arbeit sollten Molekülsysteme untersucht werden, die sich als

Modelle für die (oxidative) Proteinfaltung eignen. Die erste untersuchte Klasse von

Molekülen bilden zyklische Azopeptide mit Sequenzen der Thioredoxin-Reduktase

und der Proteindisulfidisomerase. Die zweite Klasse von Molekülen wird durch kleine

natürliche vorkommende Cystein-reiche Peptide gebildet.

Die zyklischen Azopeptide sollten zunächst durch CD- und NMR-Spektroskopie

strukturell charakterisiert werden. Analog zu den Arbeiten über das Azo-TRR-Peptid

(Cabrele et al., 2002a) sollte für die wasserlöslichen bizyklischen (eine Disulfidbrücke

enthaltenden) Peptide auch das Redoxpotential in der cis- und in der trans-Form

gemessen werden. Falls möglich sollte auch die Strukturabhängigkeit des

Redoxpotentials untersucht werden. Anschließend sollten dann in Kooperationen die

sehr schnellen konformationellen Änderungen nach der Lichtschaltung experimentell

über Ultrakurzzeitspektroskopie und theoretisch über MD-Simulationen untersucht

und mit den statischen strukturellen Eigenschaften verglichen werden. Hiermit

erhoffen wir uns einen besseren Einblick in extrem schnelle Prozesse der

Proteinfaltung zu bekommen.

Für die Untersuchung der oxidativen Proteinfaltung ist eine vollständige strukturelle

Charakterisierung des nativen Zustandes und, falls möglich, auch des ungefalteten

Zustandes und Intermediatszuständen von großer Bedeutung. Die Cystein-reichen

Peptide aus der Sequenz des Minicollagens von Hydra und das Hellethionin D,

welches zu den pflanzlichen Abwehrmolekülen der Thionine gehört, sollten daher

durch CD- und NMR-Spektroskopie strukturell untersucht werden. Anschließend

sollten Rückfaltungsexperimente durchgeführt werden.

22

3. Ergebnisse

3.1. Azopeptide

Im Rahmen dieser Arbeit wurden monozyklische und bizyklische AMPB-Peptide

mit Sequenzen aus der Thioredoxin-Reduktase (TRR) und Proteindisulfidisomerase

(PDI) untersucht. In Tabelle 1 sind die verschiedenen Peptide und die jeweiligen

Originalsequenzen aus den Enzymen zusammengestellt.

Tabelle 1. Herkunft und Sequenz der verwendeten Azopeptide

Name Sequenz mit Numerierung Herkunft

bcAMPB Ala1-Cys2-Ala3-Thr4-Cys5-Asp6-Gly7-Phe8-AMPB TRR

Azo-PDI Lys1-Cys2-Gly3-His4-Cys5-Lys6-Lys7-Lys8-AMPB PDI

Azo-[Ser2, Ser5]-PDI Lys1-Ser2-Gly3-His4-Ser5-Lys6-Lys7-Lys8-AMPB PDI

Azo-TRR Lys1-Cys2-Ala3-Thr4-Cys5-Asp6-Lys7-Lys8-AMPB TRR

Azo-NonaTRR Lys1-Cys2-Ala3-Thr4-Cys5-Asp6-Lys7-Lys8-Lys9-AMPB TRR

Originalsequenz Trp35-Cys36-Gly37-His38-Cys39-Lys40-Ala41-Leu42-Ala43 PDI

Originalsequenz Ala134-Cys135-Ala136-Thr137-Cys138-Asp139-Gly140-Phe141-Phe141 TRR

Die Sequenz des bizyklischen (bc) Octapeptids bcAMPB stammt aus der

Thioredoxin-Reduktase. Die Sequenz wurde unverändert übernommen. Das Peptid ist

nicht wasserlöslich. In Abbildung 13 ist die chemische Struktur des bcAMPB Peptids

gezeigt.

Ala-Cys-Ala-Thr-Cys-Asp-Gly-Phe

N N CH2

NHC

O

Abbildung 13: bcAMPB.

Die Sequenz des bizyklischen Octapeptids Azo-PDI stammt aus der

Proteindisulfidisomerase. Nur die Aminosäuren zwischen den beiden Cysteinen

entsprechen noch der Originalsequenz. Um die Wasserlöslichkeit des Peptids zu

23

Ergebnisse

gewährleisten, wurden an den Positionen 1, 5, 6, 7 und 8 Lysine eingesetzt. In

Abbildung 14 ist die chemische Struktur des Azo-PDI Peptids gezeigt.

Lys-Cys-Gly-His-Cys-Lys-Lys-Lys

N N CH2

NHC

O

Abbildung 14: Azo-PDI.

Die Sequenz des monozyklischen Octapeptids Azo-[Ser2, Ser5]-PDI stammt

ebenfalls aus der Proteindisulfidisomerase. Das Azo-[Ser2, Ser5]-PDI Peptid ist das

diSerin-Analogon des Azo-PDI Peptids. In Abbildung 15 ist die chemische Struktur

des Azo-[Ser2, Ser5]-PDI Peptids gezeigt.

Lys-Ser-Gly-His-Ser-Lys-Lys-Lys

N N CH2

NHC

O

Abbildung 15: Azo-[Ser2, Ser5]-PDI.

Die Sequenz des bizyklischen Nonapeptids Azo-NonaTRR stammt aus der

Thioredoxin-Reduktase. Die Aminosäuren an den Positionen 2 bis 6 entsprechen der

Originalsequenz. Um die Wasserlöslichkeit des Peptids zu gewährleisten, wurden an

den Positionen 1, 7, 8 und 9 Lysine eingeführt. In Abbildung 16 ist die chemische

Struktur des Azo-NonaTRR Peptids gezeigt.

Lys-Cys-Ala-Thr-Cys-Asp Lys-Lys-Lys

N N CH2

NHC

O

Abbildung 16: Azo-NonaTRR.

24

Ergebnisse

3.1.1. bcAMPB

Die Strukturanalyse dieses Peptids wurde zwar bereits veröffentlicht (Renner et al.,

2000), allerdings zeigten sich Unterschiede zwischen der experimentell bestimmten

Struktur und der theoretisch vorhergesagten Struktur (Carstens, 2004). Daher wurden

die bereits aufgenommenen Spektren nochmals ausgewertet bzw. wurden zusätzliche

Spektren am 750 MHz Spektrometer gemessen und ausgewertet. Das monozyklische

Analogon des bcAMPB, als cAMPB bezeichnet, ist in (Renner et al., 2000)

beschrieben.

NMR-Messungen

1D-Spektren

In Abbildung 17 und Abbildung 18 sind die 1H-1D-Spektren des trans- und des cis-

Isomers des bcAMPB gezeigt. Nur die Resonanzen der Amidprotonen und die des

AMPB-Bausteins wurden gekennzeichnet. Beim Vergleich der beiden Spektren fällt

bereits eine Verschiebung der Amidprotonresonanzen zwischen dem trans- und dem

cis-Isomer auf. Besonders deutlich sind die Verschiebungen der Protonen des AMPB-

Bausteins. In beiden Spektren sind jeweils deutlich separierte Resonanzen zu

erkennen. Die direkt gegenüberliegenden Protonen in den Benzolringen sind entartet.

Durch Integration lässt sich leicht feststellen, dass die Signale jeweils zwei Protonen

entsprechen. Dieses Resonanzmuster wurde in allen untersuchten AMPB enthaltenden

Peptiden gefunden und ist charakteristisch für den AMBP-Baustein.

2D-Spektren

Eine detaillierte Auflistung aller Protonresonanzen des trans- und des cis-Isomers

ist in Tabelle 11 und in Tabelle 12 im Anhang A zu finden. Aus den ROESY-Spektren

des trans-Isomers wurden insgesamt 41 Protonenabstände gewonnen. Von diesen 41

Abständen waren acht intraresiduale und 33 interresiduale Abstände. Von den 33

interresidualen Abständen waren 21 sequentielle, vier mittlere und acht Abstände

zwischen Aminosäuren, die mehr als vier Reste in der Sequenz voneinander getrennt

sind. Aus den 1H-1D-Spektren wurden acht 3J Hα-HN-Kopplungen extrahiert und in

Torsionsrandbedingungen umgewandelt.

25

Ergebnisse

Aus den ROESY-Spektren des cis-Isomers wurden insgesamt 28 Protonenabstände

gewonnen. Keiner der Abstände war intraresidual. Von den 28 interresidualen

Abständen waren 20 sequentielle, fünf mittlere und drei Abstände zwischen

Aminosäuren, die mehr als vier Reste in der Sequenz voneinander getrennt sind. Aus

den 1H-1D-Spektren wurden neun 3J Hα-HN-Kopplungen extrahiert und in

Torsionsrandbedingungen umgewandelt.

Abbildung 17: 1H-1D-Spektrum in DMSO bei 295 K des trans-Isomers des bcAMPB. Die Resonanzfrequenzen der Amidprotonen und der Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet.

26

Ergebnisse

Abbildung 18: 1H-1D-Spektrum in DMSO bei 295 K des cis-Isomers des bcAMBP. Die Resonanzfrequenzen der Amidprotonen und der Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet.

Strukturbestimmung

In Abbildung 19 sind die NMR-Strukturfamilien der zehn energieärmsten

Strukturen des cis- und des trans-Isomers von bcAMPB in DMSO gezeigt. Der

strukturbestimmende Einfluss des AMPB-Bausteins im trans- und im cis-Isomer ist

deutlich zusehen. Wie bei ähnlichen Molekülen bereits beobachtet wurde, (Renner et

al., 2000) ist das trans-Isomer deutlich konvergenter als das cis-Isomer. Der RMSD-

Wert des Peptidrückgrats der zehn energieärmsten Strukturen beträgt für das trans-

Isomer 0,60 Å. Verglichen mit der reduzierten und mit StBu Gruppen geschützten

trans-cAMPB Form des Moleküls mit einem Rückgrat RMSD-Wert von 0,68 Å

(Renner et al., 2000) ist das trans-Isomer der bizyklischen Form etwas besser definiert.

Diese Beobachtung ist nicht weiter überraschend, da die geschlossene Disulfidbrücke

das Peptid stärker konformationell einengt. Offensichtlich ist die Turn-ähnliche

Struktur der Reste Cys-Ala-Thr-Cys-Asp hauptsächlich auf die Restriktion durch die

verknüpften Seitenketten von Cys 2 und Cys 5 zurückzuführen. Von den zehn

27

Ergebnisse

energieärmsten Strukturen bilden alle diese Turn-ähnliche Struktur aus. Die

Ausrichtung der Seitenkette des Asp 6 variiert jedoch bereits zwischen einer dem

AMPB-Baustein zugewandten, einer dem Baustein abgewandten und einer parallel zur

Ebene des AMPBs zeigenden Orientierung. Verantwortlich für die Variabilität ist

wahrscheinlich das Gly 7, das einen weiten Bereich der Peptidrückgratwinkel zulässt.

Mit einem RMSD-Wert des Peptidrückgrats von 1,60 Å ist das cis-Isomer ebenfalls

besser definiert als sein reduziertes und mit StBu geschütztes cAMPB Analogon mit

einem RMSD-Wert des Peptidrückgrats von 1,67 Å (Renner et al., 2000). Wie in

Abbildung 19 zu sehen, existieren im cis-Isomer, im Gegensatz zum trans-Isomer,

verschiedene Subkonformationen. Die Turn-ähnliche Struktur der Reste Cys-Ala-Thr-

Cys-Asp ist in allen Konformation durch den Einfluss der Disulfidbrücke zu finden.

Durch den abgewinkelten AMPB-Baustein werden die folgenden Reste allerdings

nicht wie im trans-Isomer in eine ausgestreckte Konformation gezwungen, sondern

können einen relativ großen Konformationsraum einnehmen. Trotzdem überwiegt eine

in Abbildung 19 B mit hellblauen Bändern skizzierter Konformation mit sieben von

zehn Strukturen.

28

Ergebnisse

Abbildung 19: NMR Strukturfamilien der zehn energieärmsten Strukturen des trans- (A) und cis-(B) Isomers des bcAMPB in DMSO. Für die Hauptkonformation wird der Verlauf des Peptidrückgrats durch blaue Bänder verdeutlicht, für eine zweite Konformation sind die Bänder dunkelblau gefärbt. Alle Atome außer Wasserstoff sind in den üblichen Atomfarben dargestellt. Die Disulfidbrücken sind in gelb gekennzeichnet.

29

Ergebnisse

3.1.2. Azo-[Ser2, Ser5]-PDI

Das Azo-[Ser2, Ser5]-PDI diente als Modellsystem für das reduzierte Azo-PDI,

welches in wässriger Lösung instabil ist.

NMR-Messungen

1D-Spektren

In Abbildung 20 und Abbildung 21 sind 1H-1D-Spektren des trans- und des cis-

Isomers des Azo-[Ser2, Ser5]-PDI gezeigt. Die Resonanzen der Amidprotonen und der

Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet. Die NMR-Spektren des cis-

Isomers wurden bei 288 K aufgenommen, da bei 283 K mehrere Signale im

NH/Aromatenbereich überlagerten. Das Muster der AMPB-Protonenresonanzen ist

ähnlich der des Musters im bcAMPB.

Abbildung 20: 1H-1D-Spektrum in H2O/D2O bei 283 K des trans-Isomers desAzo-[Ser2, Ser5]-PDI. Die Resonanzfrequenzen der Amidprotonen und der Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet.

30

Ergebnisse

Abbildung 21: 1H-1D-Spektrum in H2O/D2O bei 288 K des cis-Isomers des Azo-[Ser2, Ser5]-PDI. Die Resonanzfrequenzen der Amidprotonen und der Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet.

2D-Spektren

Eine detaillierte Auflistung aller Protonenresonanzen des trans- und des cis-Isomers

ist in Tabelle 13 und in Tabelle 14 im Anhang A zu finden. Aus den ROESY-Spektren

des trans-Isomers wurden insgesamt 42 Protonenabstände gewonnen. Keiner der

Abstände war intraresidual. Von den 42 interresidualen Abständen waren 20

sequentielle, sieben mittlere und 15 Abstände zwischen Aminosäuren, die mehr als

vier Reste in der Sequenz voneinander getrennt sind. Aus den 1H-1D-Spektren wurden

sieben 3J Hα-HN-Kopplungen extrahiert und in Torsionsrandbedingungen

umgewandelt.

Aus den ROESY-Spektren des cis-Isomers wurden insgesamt 49 Protonenabstände

gewonnen. Keiner der Abstände war intraresidual. Von den 49 interresidualen

Abständen waren 25 sequentielle, 15 mittlere und neun Abstände zwischen

Aminosäuren, die in der Sequenz mehr als vier Reste voneinander getrennt sind. Aus

den 1H-1D-Spektren wurden sechs 3J Hα-HN-Kopplungen extrahiert und in

Torsionsrandbedingungen umgewandelt.

31

Ergebnisse

Strukturbestimmung

In Abbildung 22 sind die NMR-Strukturfamilien des trans- und des cis-Isomers

gezeigt. Sowohl das cis- als auch das trans-Isomer sind im Vergleich zum

bizyklischen Azo-PDI, unter 3.1.3 beschrieben, weniger gut definiert. Der RMSD-

Wert des Peptidrückgrats der zehn energieärmsten Strukturen beträgt 1,37 Å für das

trans- und 1,33 Å für das cis-Isomer. Auffällig ist, dass das cis-Isomer einen leicht

geringeren RMSD-Wert hat als das trans-Isomer. Entfällt die zusätzliche

konformationelle Einengung durch die Disulfidbrücke, ist der Einfluss der

unterschiedlichen AMPB-Isomere vermutlich gering. Die Ringgröße ist bereits zu

groß, als dass die unterschiedlichen AMPB-Isomere das Peptid hinreichend

einschränken können. Beide Peptidisomere zeigen eine enge Schleife zwischen den

Resten Lys 1 und His 4. Danach verläuft das trans-Isomer in einer mehr

ausgestreckten Form, wohingegen das cis-Isomer nach der Schleife eine verwundene

Form annimmt. Um einen regulären Turn handelt es sich bei der Schleife allerdings

nicht, da sowohl die Temperaturverschiebung der Amidresonanzen als auch die D2O-

Austauschexperimente keinen Hinweis auf eine Wasserstoffbrücke ergaben.

32

Ergebnisse

Abbildung 22: NMR Strukturfamilien der zehn energieärmsten Strukturen des trans- (A) und cis- (B) Isomers des Azo-[Ser2, Ser5]-PDI in H2O/D2O. Der Verlauf des Peptidrückgrats wird durch blaue Bänder verdeutlicht. Alle Atome außer Wasserstoff sind in den üblichen Atomfarben dargestellt.

33

Ergebnisse

15N- Relaxationsmessungen

In Tabelle 2 sind die Ergebnisse der 15N Relaxationsmessungen gezeigt. Die

Korrelationszeit beträgt nur die Hälfte der des DMSO-löslichen cAMPB (Renner et

al., 2000). Dieses Ergebnis stimmt relativ gut mit dem Verhältnis der Viskositäten von

Wasser und DMSO überein.

Tabelle 2: 15N Relaxationsmessungen des Azo-[Ser2, Ser5]-PDI.

cis und trans T1 840 ms T2 694 ms Tc 0,804 ns Het NOE -0,64

Thermische Isomerisierung

In Tabelle 3 sind die thermischen Isomerisierungsraten des Azo-[Ser2, Ser5]-PDI

aufgelistet. Die thermischen Isomerisierungsraten und die Aktivierungsenergie sind

vergleichbar mit denen anderer AMPB-Baustein-enthaltender Peptide (Renner et al.,

2002).

Tabelle 3: Geschwindigkeitskonstanten der thermischen cis→trans Isomerisierung des Azo-[Ser2, Ser5]-PDI in H2O. Die Konstanten bei verschiedenen Temperaturen wurden mit UV-Spektren extrahiert.

Thermische Isomerisierung, kct (h-1) 293 K 303 K EA (kJ×mol-1) Azo-[Ser2, Ser5]-PDI 0,0015 0,0049 87,4

34

Ergebnisse

CD-Spektren

190 200 210 220 230 240 250-18000

-16000

-14000

-12000

-10000

-8000

-6000

-4000

-2000

0

2000

cis trans

[Θ] r [

deg

cm2 dm

ol-1]

λ [nm]

Abbildung 23: CD-Spektrum des trans- und des photostationären cis-Isomers des Azo-[Ser2, Ser5]-PDI in Wasser (pH 3,8).

In Abbildung 23 sind die CD-Spektren des trans- und des photostationären cis-

Isomers (ca. 80 % cis, 20 % trans) gezeigt. Sowohl das trans- als auch das cis-Isomer

zeigen einen ähnlichen Verlauf des Spektrums mit einem ausgeprägten Minimum bei

196 nm. Dies deutet auf eine ungeordnete Struktur hin, die auch durch die NMR-

Strukturbestimmung bestätigt wurde. Auffällig ist, dass das cis-Isomer ein deutlich

stärker ausgeprägtes Minimum besitzt, obwohl der RSMD Wert des Proteinrückgrats

des cis-Isomers leicht unter dem des trans-Isomers liegt.

3.1.3. Azo-PDI

Das bizyklische Azo-PDI Peptid besitzt das Bis(cysteinyl)motiv der

Proteindisulfidisomerase. Vor dem Motiv sind ein Lysin und nach dem Motiv drei

Lysine eingeführt worden, um die Wasserlöslichkeit des Peptids sicherzustellen.

35

Ergebnisse

NMR-Messungen

1D-Spektren

In Abbildung 24 und in Abbildung 25 sind 1H-1D-Spektren des trans- und des cis-

Isomers des Azo-PDI bei 283 K in Wasser gezeigt. Die Resonanzen der Amidprotonen

und der Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet. Das Muster der AMPB-

Protonenresonanzen ist ähnlich der des Musters in bcAMPB.

Abbildung 24: 1H-1D-Spektrum in H2O/D2O bei 283 K des trans-Isomers des Azo-PDI. Die Resonanzfrequenzen der Amidprotonen und der Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet.

36

Ergebnisse

Abbildung 25: 1H-1D-Spektrum in H2O/D2O bei 283 K des cis-Isomers des Azo-PDI. Die Resonanzfrequenzen der Amidprotonen und der Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet.

2-D Spektren

Eine detaillierte Auflistung aller Protonenresonanzen des trans- und des cis-Isomers

ist in Tabelle 15 und in Tabelle 16 im Anhang zu finden. Aus den ROESY-Spektren

des trans-Isomers wurden insgesamt 49 Protonenabstände gewonnen. Von diesen

waren drei intraresidual und 46 interresidual. Von den 46 interresidualen Abständen

waren 21 sequentielle, 14 mittlere und elf Abstände zwischen Aminosäuren, die mehr

als vier Reste auseinander lagen. Aus den 1H-1D-Spektren wurden acht 3J Hα-HN-

Kopplungen extrahiert und in Torsionsrandbedingungen umgewandelt.

37

Ergebnisse

Abbildung 26: Amidregion eines TOCSY-Spektrums des trans- und des cis-Isomers des Azo-PDI. Die HN-Hα Signale der jeweiligen Aminosäure und die Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet. Hierbei steht t für das trans- und c für das cis-Isomer.

Aus den ROESY-Spektren des cis-Isomers wurden insgesamt 27 Protonenabstände

gewonnen. Von diesen war ein Abstand intraresidual und 26 Abstände interresidual.

Von den 26 interresidualen Abständen waren 19 sequentielle, fünf mittlere und zwei

Abstände zwischen Aminosäuren, die mehr als vier Reste auseinander lagen. Aus den 1H-1D-Spektren wurden fünf 3J Hα-HN-Kopplungen extrahiert und in

Torsionsrandbedingungen umgewandelt.

Strukturbestimmung

Die NMR-Strukturbestimmung ergab zwei gut definierte, aber unterschiedliche

Strukturfamilien des trans- und des cis-Isomers, welche in Abbildung 27 gezeigt sind.

Im Gegensatz dazu ist das offenkettige Azo-[Ser2, Ser5]-PDI Peptid stärker ungeordnet

38

Ergebnisse

und entspannt. Der RMSD-Wert des Peptidrückgrats der zehn energieärmsten

Strukturen beträgt 0,61 Å für das trans- und 1,09 Å für das cis-Isomer.

Abbildung 27: NMR Strukturfamilien der zehn energieärmsten Strukturen des trans- (A) und cis- (B) Isomers des Azo-PDI in H2O/D2O. Der Verlauf des Peptidrückgrats wird durch blaue Bänder verdeutlicht. Alle Atome außer Wasserstoff sind in den üblichen Atomfarben dargestellt. Die Disulfidbrücken sind in gelb gekennzeichnet.

39

Ergebnisse

Beide Isomere zeigen einen verzerrten β-Turn für das Bis(cysteinyl)motiv, das

durch die Disulfidbrücke in seiner Geometrie stark eingeengt ist. Im cis-Isomer bildet

der hintere Teil des Peptids wiederum einen verzerrten β-Turn, der durch einen

regulären γ-Turn, zentriert auf Lys 6 und um 90° gegenüber der Ebene des ersten β-

Turns verdreht, mit dem ersten β-Turn verbunden ist. Im trans-Isomer besitzt das

Peptidrückgrat eine mehr ausgestreckte Form. Der auf Lys 6 zentrierte γ-Turn ist

stärker verzerrt und die Reste Lys 6, Lys 7 und Lys 8 nehmen eine ausgestreckte β-

Konformation an. Überraschenderweise befindet sich die Seitenkette des Lys 7

zwischen dem Peptidrückgrat und dem Chromophor. Weder in der Strukturfamilie des

cis-Isomers noch in der des trans-Isomers konnten Nebenkonformationen gefunden

werden. In Abbildung 28 sind diese Sekundärstrukturelemente noch einmal

schematisch gezeigt.

Abbildung 28: Schematische Darstellung der Sekundärstrukturelemente des trans- und des cis-Isomers des Azo-PDI. Die Elemente des cis-Isomers sind pink, die des trans-Isomers sind grün gezeichnet.

40

Ergebnisse

CD-Spektren

In Abbildung 29 sind die CD-Spektren des trans- und des photostationären cis-

Isomers gezeigt. Die beiden Isomere zeigen deutlich unterschiedliche Spektren. Das

trans-Isomer besitzt ein Minimum bei 220 nm, welches eine β-Faltblatt ähnliche

Struktur anzeigt. Das cis-Isomer besitzt ein Minimum bei 205 nm mit stark negativen

Werten zwischen 200 und 225 nm. Dieser Verlauf des Spektrums zeigt eine gemischt

α-helikale und β-Faltblatt-ähnliche Struktur an. Insofern bestätigen die CD-Spektren

die einerseits stärker ausgestreckte Konformation des trans-Isomers und die mehr

gewundene Struktur des cis-Isomers.

190 200 210 220 230 240 250-10000

-5000

0

5000

10000

15000

20000

cis trans

[Θ] r [

deg

cm2 dm

ol-1]

λ [nm]

Abbildung 29: CD-Spektrum des trans- (-) und des photostationären cis- (--) Isomers des Azo-PDI in Wasser (pH 3,8).

UV-Spektren

In Abbildung 30 ist das UV-Spektrum des cis- und des trans-Isomers des Azo-PDI

gezeigt. Da alle UV Spektren der wasserlöslichen AMPB-Peptide praktisch identisch

sind (Renner et al., 2002), stehen die Spektren in Abbildung 30 auch stellvertretend für

die der anderen Peptide. Das trans-Isomer zeigt hier ein ausgeprägtes Maximum um

335 nm, wohingegen das cis-Isomer ein schwächeres Maximum um 425 nm besitzt.

41

Ergebnisse

Isosbesten befinden sich bei ca. 280 nm und 395 nm. Die unterschiedliche Lage der

Absorptionsmaxima des trans- und des cis-Isomers erleichterten die Zuordnung in den

HPLC-Elutionsprofilen erheblich.

250 300 350 400 450 5000

5

10

15

20

25

30

cis trans

ε* 1

0-3 [M

-1 c

m-1]

λ [nm]

Abbildung 30: UV-Spektren des trans- (-) und des cis- (--) Isomers des Azo-PDI in Wasser.

Thermische Isomerisierung

In Tabelle 4 sind die thermischen Isomerisierungsraten des Azo-PDI aufgelistet.

Die thermischen Isomerisierungsraten und die Aktivierungsenergie sind vergleichbar

mit denen anderer AMPB-Baustein-enthaltenden Peptide (Renner et al., 2002).

Tabelle 4: Geschwindigkeitskonstanten der thermischen cis→trans Isomerisierung des Azo-PDI in H2O. Die Konstanten bei verschiedenen Temperaturen wurden mit Hilfe von 1H-1D-Spektren bestimmt.

Thermische Isomerisierung, kct (h-1) 283 K 293 K 303 K 313 K EA (kJ×mol-1) Azo-PDI 0,00044 0,0019 0,00672 0,0274 101

42

Ergebnisse

Bestimmung des Redoxpotentials

Wie bereits unter (Cabrele et al., 2002a) für ein zyklisches Azopeptid mit dem

Bis(cysteinyl)motiv der Thioredoxin-Reduktase beschrieben wurde, sollte für das Azo-

PDI der Einfluss der unterschiedlichen Konformationen des trans- und des cis-Isomers

auf das Redoxpotential des Bis(cysteinyl)motivs untersucht werden.

Das komplizierte Netzwerk von Edukten und Produkten der Reaktion mit

GSH/GSSG und dem Azopeptid ist in Abbildung 31 gezeigt. Zusätzlich zu den

oxidierten und reduzierten Spezies 1 und 2 treten die Monoglutathion-Peptid

gemischten Disulfide 3 und 4 sowie die Bisglutathion-Peptid gemischten Disulfide 5

auf. Die HPLC-Signale der trans-Isomere konnten eindeutig mit LC-MS-Analysen den

verschiedenen Spezies zugeordnet werden.

Abbildung 31: Thiol/Disulfidaustauschgleichgewicht des Azo-PDI im Glutathionredoxpuffer. Die Spezies des trans-Isomers befinden sich auf der linken Seite und sind mit einem (’) gekennzeichnet. Die Spezies des cis-Isomers befinden sich auf der rechten Seite.

In Abbildung 32 ist das Chromatogramm mit der Absorption bei 210 nm und der

Zuordnung der Signale zu den Spezies des trans-Isomers aus Abbildung 31 gezeigt.

43

Ergebnisse

Die beiden Monoglutathion-Peptid gemischten Disulfide 3 und 4 konnten nicht

unterschieden werden. Der Versuch wurde insgesamt mit drei unterschiedlichen

GSH/GSSG Konzentrationen durchgeführt: 10 mM GSH, 10 mM GSSG; 5mM GSH,

10 mM GSSG; 10 mM GSH, 3 mM GSSG. Die Peptidkonzentration betrug zwischen

0,1 und 0,3 mM. Die Signale der oxidierten und reduzierten Spezies 1 und 2 wurden

integriert und aus der Gleichgewichtskonstante Kox wurde das Redoxpotential E0

mittels der Nernstschen Gleichung, welche unter Gleichung (3) in 6.2 gegeben ist,

ermittelt. Dabei wurde ein Referenzpotential E’0 = -240 mV (Rost and Rapoport,

1964) verwendet. Die Werte wurden aus drei Experimenten gemittelt. Die Ergebnisse

sind in Tabelle 5 gegeben.

19 20 21 22

0,0

0,1

0,2

2'1'4' + 3'5'

AU b

ei 2

10 n

m

min

Abbildung 32: UV-Spur bei 210 nm eines HPLC-Chromatogramm nach Equilibrierung des trans-Isomers des Azo-PDI mit10 mM GSH und 3 mM GSSG. Gezeigt sind die Spezies des trans-Isomers mit Zuordnung.

Tabelle 5: Gleichgewichtskonstante und Redoxpotential der Thiol/Disulfid-Austauschreaktion des trans-Isomers des Azo-PDI, bestimmt mittels Glutathion. Für Glutathion wurde ein Referenzpotential von –240 mV bei pH 7 und 25 °C verwendet (Rost and Rapoport, 1964).

Isomer Kox [mM] E0’[mV]

trans 3,72 ± 0,08 -0,167

44

Ergebnisse

Die Bestimmung des Redoxpotentials des cis-Isomers wurde durch zwei

Nebenreaktionen erschwert. Zum einen neigt das cis-Isomer stärker zur Reduktion des

Azobenzols durch Glutathion, zum anderen wird durch Gegenwart von GSH/GSSG

die cis→trans Isomerisierung um Größenordnungen beschleunigt. Beide

Nebenreaktionen zusammen verhinderten, dass alle theoretisch vorhandenen Signale

der Spezies aus Abbildung 31 im HPLC-Chromatogramm gefunden und zweifelsfrei

zugeordnet werden konnten.

3.1.4. Azo-NonaTRR

Das zyklische Azopeptid Azo-NonaTRR besitzt das Bis(cysteinyl)motiv der

Thioredoxin-Reduktase.

NMR-Messungen

1D-Spektren

In Abbildung 33 und in Abbildung 34 sind 1H-1D-Spektren des trans- und cis-

Isomers des Azo-PDI Peptids bei 283 K in Wasser gezeigt. Die Resonanzen der

Amidprotonen und der Protonen des AMPB-Bausteins des trans-Isomers sind

gekennzeichnet. Das Muster der AMPB-Protonenresonanzen ist ähnlich dem Muster

des bcAMPB. Die Resonanzen des cis-Isomers sind aufgrund der Signalüberlagerung

nicht zugeordnet.

45

Ergebnisse

Abbildung 33: 1H-1D-Spektrum in H2O/D2O bei 283 K des trans-Isomers des Azo-NonaTRR. Die Resonanzfrequenzen der Amidprotonen und der Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet.

Abbildung 34: 1H-1D-Spektrum in H2O/D2O bei 283 K des cis-Isomers des Azo-NonaTRR.. Aufgrund der Signalüberlagerung sind die Resonanzzuordnungen nicht gezeigt.

46

Ergebnisse

2-D Spektren

Eine detaillierte Auflistung aller Protonenresonanzen des trans-Isomers ist in

Tabelle 17 im Anhang A zu finden. Aus den ROESY-Spektren des trans-Isomers

wurden insgesamt 66 Protonenabstände gewonnen. Von diesen war keiner

intraresidual. Von den 66 interresidualen Abständen waren 34 sequentielle, 14 mittlere

und 18 Abstände zwischen Aminosäuren, die durch mehr als vier Reste in der Sequenz

voneinander getrennt sind. 3J Hα-HN-Kopplungen wurden nicht extrahiert.

Aus den ROESY-Spektren des cis-Isomers konnten aufgrund der verstärkten

Signalüberlagerung nicht genügend eindeutige strukturbestimmende Protonenabstände

gewonnen werden. Daher wurde die Struktur des cis-Isomers nicht bestimmt.

Strukturbestimmung

In Abbildung 35 ist der Strukturfamilie des trans-Isomers von Azo-NonaTRR

gezeigt. Der RMSD-Wert des Peptidrückgrats der zehn energieärmsten Strukturen des

trans-Isomers beträgt 1,01 Å. Wie bei den anderen bizyklischen Azopeptiden hat die

Disulfidbrücke einen großen Einfluss auf die Konformation des Peptids. Die Position

der Cysteine ist identisch mit denen des Azo-PDI, daher wird auch wie in diesem eine

Schleife zwischen den Resten Cys 2 und Cys 5 ausgebildet. Das Peptid besitzt die

Sequenz des Azo-TRR-Peptids ist aber um ein Lysin am C-Terminus verlängert.

Bedingt durch die größere Ringgröße ist die Struktur weniger stark eingeschränkt und

im Vergleich zum Azo-TRR (Cabrele et al., 2002a) weniger definiert. Der RMSD-

Wert des Proteinrückgrats beträgt 1,13 Å.

47

Ergebnisse

Abbildung 35: NMR Strukturfamilien der zehn energieärmsten Strukturen des trans-Isomers des Azo-NonaTRR in H2O/D2O. Der Verlauf des Peptidrückgrats wird durch blaue Bänder verdeutlicht. Alle Atome außer Wasserstoff sind in den üblichen Atomfarben dargestellt. Die Disulfidbrücken sind in gelb gekennzeichnet.

Thermische Isomerisierung

In Tabelle 6 sind die thermischen Isomerisierungsraten des Azo-NonaTRR

aufgelistet. Die thermischen Isomerisierungsraten sind bei niedriger Temperatur

schneller als die anderer Azopeptide. Dafür ist die Aktivierungsenergie deutlich

niedriger als die bisher bestimmten Werte (Renner et al., 2002).

Tabelle 6: Geschwindigkeitskonstanten der thermischen cis→trans Isomerisierung des Azo-NonaTRR in H2O. Die Konstanten wurden mit Hilfe von 1H-1D-Spektren bei verschiedenen Temperaturen bestimmt.

Thermische Isomerisierung, kct (h-1) 283 K 293 K 303 K EA (kJ×mol-1) Azo-

NonaTRR 0,0036 0,0062 0,0091 33

48

Ergebnisse

Bestimmung des Redoxpotentials

Vorgehen und Auswertung der Experimente erfolgte analog dem Azo-PDI. In

Abbildung 36 ist das Chromatogramm mit der Absorption bei 210 nm und der

Zuordnung der Signale zu den Spezies aus Abbildung 31 gezeigt. Die beiden

Monoglutathion-Peptid gemischten Disulfide 3 und 4 konnten nicht unterschieden

werden. Der Versuch wurde insgesamt mit vier unterschiedlichen GSH/GSSG

Konzentrationen durchgeführt: 94 mM GSH, 32 mM GSSG; 85 mM GSH, 50 mM

GSSG; 70 mM GSH, 29 mM GSSG und 50 mM GSH, 50 mM GSSG. Die

Peptidkonzentration betrug zwischen 0,1 und 0,5 mM. Die Signale der oxidierten und

reduzierten Spezies 1 und 2 wurden integriert und aus der Gleichgewichtskonstante

Kox wurde das Redoxpotential E0 mittels der Nernstschen Gleichung, welche unter

Gleichung (3) in 6.2 gegeben ist, ermittelt. Dabei wurde ein Referenzpotential E’0 = -

240 mV (Rost and Rapoport, 1964) verwendet. Es wurden die Werte aus vier

Experimenten gemittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gegeben. Das

Redoxpotential des trans-Isomers ist mit -218 mV negativer als das des trans-Azo-PDI

(-167 mV) und des trans-Azo-TRR (-201 mV) (Cabrele et al., 2002a).

18 19 20 21 22

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

2'1'4' + 3'5'

AU b

ei 2

10 n

m

min

Abbildung 36: UV-Spur bei 210 nm eines HPLC-Chromatogramm nach Equilibrierung des trans-Isomers des Azo-NonaTRR mit 85 mM GSH und 50 mM GSSG. Gezeigt sind die Spezies des trans-Isomers mit Zuordnung.

49

Ergebnisse

Wie bei dem cis-Isomer des Azo-PDI war es aufgrund beschleunigter

Isomerisierung und Reduktion des Azobenzols nicht möglich, Kox und E0 für das cis-

Isomer zweifelsfrei zu bestimmen.

Tabelle 7: Gleichgewichtskonstante und Redoxpotential der Thiol/Disulfid-Austauschreaktion des trans-Isomers des Azo-NonaTRR bestimmt mittels Glutathion. Für Glutathion wurde ein Referenzpotential von –240 mV bei pH 7 und 25 °C verwendet (Rost and Rapoport, 1964).

Isomer Kox [mM] E0’[mV]

trans 188 ± 10 -0,218

50

Ergebnisse

3.2. Minicollagen

3.2.1. C-terminale Domäne

Die Sequenz der C-terminalen Domäne stammt aus dem Minicollagen 1 von Hydra.

In Abbildung 37 ist die Sequenz der C-terminalen Domäne gezeigt.

Ac-Pro-Cys-Pro-Pro-Val-Cys-Val-Ala-Gln-Cys-Val-Pro-Thr-Cys-Pro-Gln-Tyr-Cys-

Cys-Pro-Ala-Lys-Arg-Lys-NH2

Abbildung 37: Sequenz der C-terminale Domäne des Minicollagens.

Synthese

Die Synthese des Peptids erfolgte an einem continuous flow-Synthesizer auf einem

Fmoc-Rink-Amide Harz nach der Fmoc/tBu Strategie (Pokidysheva et al., 2004).

Oxidative Faltung

Für die oxidativen Faltung wurde das Oxidationssystem GSH/GSSG (Saxena and

Wetlaufer, 1970) verwendet, da durch die Gegenwart von GSH thermodynamisch

ungünstige Disulfidverknüpfungen wieder geöffnet und günstigere Verknüpfungen

gefunden werden können. Unter den experimentellen Bedingungen (4 °C etc.) war die

Reaktion nach ca. fünf bis sieben Tagen abgeschlossen. Die Reaktionsgeschwindigkeit

der Reaktion ist stark pH-abhängig. Dauert die Reaktion bei einem pH-Wert von 6

mehrere Tage, ist sie bei einem pH-Wert von 8 und höher bereits nach wenigen

Stunden abgeschlossen. HPLC, LC-MS und NMR bestätigen, dass neben

„gefangenen“ fehlgefalteten bis-Glutathionylderivaten weitgehend ein einziges

Topoisomer entsteht. Die analytischen HPLC-Chromatogramme des

Reaktionsgemisches zeigen bei ca. 50 % Eluent B ein scharfes und intensives Signal,

welches durch LC-MS-Analyse eindeutig dem vollständig oxidierten Peptid

zugeordnet werden konnte. Ein breites und wesentlich schwächeres Signal, welches

bei ca. 30 % bis 50 % B eluiert, besteht wahrscheinlich aus fehlgefalteten Peptiden und

gemischten Glutathiondisulfiden. Letztere konnte durch LC-MS-Analysen

nachgewiesen werden.

51

Ergebnisse

Überraschenderweise stellte das Lyophilisieren des Reaktionsgemisches den

Ausbeute-limitierenden Schritt da. Wurde das Reaktionsgemisch zu lange, in diesem

Falle über mehrere Tage, im lyophilisierten festen Zustand gelassen, nahm das Signal

des korrekt gefalteten Peptids ab, wohingegen die Signale der fehlgefalteten Peptide in

der analytischen HPLC zunahmen. Offensichtlich findet im festen Zustand des

Reaktionsgemisches eine Umlagerung der Disulfidbrücken statt. Daher wurden bei den

präparativen HPLC-Läufen nicht nur das korrekt gefaltete Peptid, sondern auch die

fehlgefalteten Peptide gesammelt. Wurden die Fraktionen mit fehlgefaltetem Peptid

lyophilisiert und anschließend mit dem Redoxpuffer inkubiert, konnte das korrekt

gefaltete Peptid zurück gewonnen werden. In Abbildung 38 sind die Chromatogramme

vor (links) und nach der Rückfaltung (rechts) der fehlgefalteten Peptide gezeigt. Unter

den Rückfaltungsbedingungen konnten die fehlgefalteten Spezies (A) in die korrekt

gefaltete Spezies (B) überführt werden. Es existiert eine Form des Gleichgewichtes, da

bereits in den eigentlich vollständig fehlgefalteten Fraktionen korrekt gefaltetes Peptid

entstanden ist (B linkes Chromatogramm). Andererseits bleibt ein kleiner Anteil des

fehlgefalteten Peptids auch unter den Rückfaltungsbedingungen bestehen (A rechtes

Chromatogramm). Mit dieser Form des Recyclings konnte die Ausbeute der

oxidativen Faltung merklich verbessert werden.

0 2 4 6 8 10 12-0,10

-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

B

A

AU

bei

210

nm

min0 2 4 6 8 10 12

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

A

B

AU b

ei 2

10 n

m

min

Abbildung 38: HPLC der fehlgefalteten Peptide vor (links) und nach Rückfaltung im Redoxpuffer (rechts).

52

Ergebnisse

NMR-Messungen

1D-Spektren

In Abbildung 39 ist das 1H-1D-Spektrum der oxidierten C-terminalen Domäne des

Minicollagens, gemessen am DRX 500 Spektrometer, in H2O/D2O gezeigt. Die

Amidregion ist vergrößert als Insert in der Abbildung gezeigt. Die Signaldispersion

der Amidresonanzen deutet eindeutig auf ein gefaltetes Peptid hin. Die Lage der

Amidresonanzen des oxidierten Peptids diente in den späteren Reduktions- und

Rückfaltungsversuchen als Referenz.

Abbildung 39: 1H-1D-Spektrum der C-terminalen Domäne des Minicollagens in H2O/D2O bei 283 K.

2D-Spektren

Aus den TOCSY- und NOESY-Spektren konnte eine eindeutige

resonanzspezifische Zuordnung getroffen werden. In Abbildung 40 ist die Amidregion

eines TOCSY-Spektrums mit den zugeordneten HN-Hα Signale gezeigt. Die

vollständige Zuordnung aller Protonenresonanzen ist in Tabelle 18 des Anhangs

aufgelistet.

53

Ergebnisse

Abbildung 40: Amidregion eines TOCSY-Spektrums der C-terminalen Domäne bei 283 K. Die HN-Hα Signale der jeweiligen Aminosäure sind gekennzeichnet.

Aus den NOESY-Spektren wurden insgesamt 173 Protonenabstände gewonnen.

Von diesen 173 waren 30 intraresiduale und 143 interresiduale Abstände. Von den 143

interresidualen Abständen waren 76 sequentielle, 51 mittlere und 76 Abstände

zwischen Aminosäuren, die in der Sequenz durch mehr als 4 Reste voneinander

getrennt sind. In Abbildung 41 sind die NOE-Kontakte der einzelnen Aminosäurereste

gezeigt. Zusätzlich konnten fünf Wasserstoffbrücken durch D2O Austausch- und

Temperaturverschiebungs-Experimente gefunden werden. In Abbildung 42 sind die

diagnostischen NOE-Kontakte und die H/D Austauschraten mit den zugehörigen

Sekundärstrukturelementen dargestellt.

54

Ergebnisse

NOE-Kontakte der Aminosäuren

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Aminosäure

Anz

ahl d

er N

OEs

Intra.Seq.Rest

Abbildung 41: Anzahl der ermittelten NOEs der einzelnen Aminosäurereste. Intraresiduale Kontakte sind in weißer, sequentielle Kontakte in hellgrauer und die übrigen Kontakte in dunkelgrauer Farbe dargestellt.

Abbildung 42: Sekundärstrukturdarstellung der C-terminalen Domäne. Die diagnostischen NOE Kontakte und die H/D Austauschraten (KNH) sind hier zusammengestellt. Die gefundenen Sekundärstrukturelemente sind über der Sequenz dargestellt. Helices sind als Röhren, gestreckte Bereiche als Pfeil und Turns als Bögen dargestellt. Langsame Austauschraten sind als großer Kreis, mittelschnelle als kleiner Kreis dargestellt.

Strukturbestimmung

Die Struktur der C-terminalen Domäne wurde unabhängig von der Arbeitsgruppe

von Stephan Grzesiek (Meier et al., 2004) und von uns bestimmt. Beide Strukturen

stimmen überein. In Abbildung 43 ist die Strukturfamilie der zehn energieärmsten 55

Ergebnisse

Strukturen gezeigt. In Abbildung 44 sind die Sekundärstrukturelemente anhand einer

Struktur aus der Familie hervorgehoben.

Abbildung 43: Die zehn energieärmsten Strukturen der C-terminalen Domäne des Minicollagens in Wasser. Wasserstoffatome sind nicht gezeigt. Die übrigen Atome sind in den üblichen Atomfarben dargestellt. Die Disulfidbrücken sind in gelb gekennzeichnet.

Abbildung 44: Darstellung der Sekundärstrukturelemente der C-terminalen Domäne. Die α-Helix und die drei Turns sind durch breite Bänder hervorgehoben. Die Abbildung wurde mit Hilfe des Programms Molmol (Koradi et al., 1996) erstellt.

56

Ergebnisse

Die C-terminale Domäne besitzt insgesamt eine kompakte Form und weist eine

Reihe von Sekundärstrukturelementen auf. Der N-Terminus bis Val 5 zeigt eine

ausgestreckte Konformation. Es folgt eine kurze α-Helix zwischen Val 5 und Gln 9.

Die Reste Gln 9 und Val 11 bilden einen inversen γ -Turn mit einer Wasserstoffbrücke

zwischen dem Amidproton von Val 11 und dem Carbonylsauerstoff von Gln 9. Darauf

folgt ein Typ I β-Turn, der von den Resten Val 11 bis Cys 14 ausgebildet wird. Der

Typ I β-Turn wird durch eine Wasserstoffbrücke zwischen dem Amidproton von Cys

14 und dem Carbonylsauerstoff von Val 11 stabilisiert. Ein Typ III β-Turn wird als

letztes Sekundärstrukturelement von Pro 15 bis Cys 18 ausgebildet. Dieser wird

ebenfalls durch eine Wasserstoffbrücke zwischen dem Amidproton von Cys 18 und

dem Carbonylsauerstoff von Pro 15 stabilisiert. Der C-Terminus bildet eine

ausgestreckte variable Konformation. Hier befinden sich alle drei positiv geladenen

Aminosäuren des Peptids.

Die Energien und RMSD-Werte der C-terminalen Domäne sind in Tabelle 8

aufgelistet.

Tabelle 8: Energien und RMSD-Werte der Strukturfamilie der C-terminalen Domäne.

RMSDs der Rest 1 bis 19 RMSD Proteinrückgrat 0,70 RMSD schwere Atome 0,99 RMSD alle Atome 1,17

Energien (CVFF Kraftfeld) kJ mol-1 ± Standardabweichung Gesamtenergie 1321,44 ± 28,44 Van der Waals Energie 514,92 ± 40,64 Coulombenergie 19,08 ± 0,96 Bindungsenergie 201,28 ± 3,71 Thetaenergie 580,46 ± 25,71 “Out of plane“ Energie 5,49 ± 0,85

Die RMSD-Werte wurden nur für die Reste 1 bis 19 berechnet, da der C-Terminus

variabel ist und die Werte verzerren würde. Die RMSD-Werte der einzelnen

Aminosäurereste sind in Abbildung 45 individuell aufgezeigt. Die RMSD-Werte des

variablen C-Terminus sind aufgrund der variablen Struktur deutlich im Vergleich zum

Rest des Peptids erhöht.

57

Ergebnisse

RMSD der Aminosäurenreste

0

2

4

6

8

10

12

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Aminosäure

RMSD

RückgratSeitenketten

Abbildung 45: RMSD-Werte der einzelnen Aminosäurereste. Die RMSD-Werte des Rückgrats sind schwarz, die der Seitenketten weiß dargestellt.

In Abbildung 46 ist ein Ramachandrandiagramm der Strukturfamilie gezeigt, in

dem die Aminosäuren entsprechend ihres Ψ und Φ-Winkels aufgetragen sind.

Lediglich die Aminosäuren des variablen C-Terminus liegen außerhalb der

bevorzugten Regionen.

58

Ergebnisse

Abbildung 46: Ramachandrandiagramm der Strukturfamilie der C-terminalen Domäne. Das Diagramm wurde mit Hilfe des Programms Procheck (Laskowski et al., 1996) erstellt.

59

Aus den Strukturrechnungen ergab sich eine eindeutige Disulfidverknüpfung der

sechs Cysteine: Cys 2-Cys 18, Cys 6-Cys 14 und Cys 10-Cys 19. Diese

Disulfidverknüpfung ist in Abbildung 47 schematisch gezeigt. Versuche, die

Disulfidverknüpfung durch enzymatischen Verdau mit anschließender LC-MS-

Analyse zu bestimmen, waren nicht erfolgreich. Aufgrund der äußerst kompakten und

stabilen Struktur des Peptids war das Peptid für eine proteolytische Spaltung nicht

zugänglich.

Ergebnisse

1 5 10 15 20 24P C P P V C V A Q C V P T C P Q Y C C P A K R K

Abbildung 47: Sequenz der C-terminalen Domäne mit der bestimmten Disulfidverknüpfung.

Die gefundene Disulfidverknüpfung entspricht einem von zwei vorgeschlagenen

Verknüpfungsmustern (Engel et al., 2002). Die erste Disulfidbrücke, Cys 2-Cys 18

klammert den N- und C-Terminus zusammen. Die zweite Disulfidbrücke Cys 6-Cys

14 verbindet die kurze α-Helix mit dem Typ I β-Turn zwischen Val 11 und Cys 14,

und formt so den Kern des Peptids. Die dritte Disulfidbrücke Cys 10-Cys 19 ist im

Vergleich zu den anderen beiden stärker dem Lösungsmittel ausgesetzt und zwingt

dem Peptid zwei aufeinander folgende Turns auf.

CD-Spektren

Die CD-Spektren bestätigen und ergänzen das Modell des Peptids. In Abbildung 48

ist ein CD-Spektrum einer 150 µM wässrigen Lösung der C-terminalen Domäne bei

pH 3,8 gezeigt. Dominiert wird das Spektrum durch ein ausgeprägtes Minimum bei

200 nm. Hierfür sind die variablen Bereiche des N- und vor allem des C-Terminus

verantwortlich. Der Verlauf des Spektrums zwischen 215 und 240 nm weist auf α-

helikale und Turn enthaltende Elemente hin. Dieses Resultat stimmt mit den aus den

NMR-Daten berechneten Strukturen überein.

60

Ergebnisse

190 200 210 220 230 240 250-16000

-14000

-12000

-10000

-8000

-6000

-4000

-2000

0

[Θ] [

deg

cm2 d

mol

-1]

λ [nm]

Abbildung 48: CD Spektrum der C-terminalen Domäne in H2O bei 10 °C.

Strukturelle Funktion und Stabilität der Disulfidbrücken

Mit Hilfe einer partiellen Reduktion und anschließender Vinylpyridin-

Derivatisierung des Peptids sollten präferentiell labile Disulfidbrücken bestimmt

werden. Eine Reduktion aller Disulfidbrücken führt zur vollständigen Entfaltung des

Peptids. In Abbildung 49 ist das 1H-1D-Spektrum der C-terminalen Domäne nach

Reduktion mit 5 Äquivalenten Phosphin gezeigt. Die für die definierte Faltung

charakteristische Dispersion der Amidprotonensignale ist im Vergleich zu den

Spektren des oxidierten Peptids verschwunden. Stattdessen überlagern die

Amidprotonensignale stark und zeigen damit einen charakteristischen ungefalteten

Zustand an.

In einem zweiten Versuch wurde, um eine komplette Entfaltung des Peptids zu

vermeiden, nur ein Äquivalent Phosphin verwendet. Die nachfolgende Behandlung mit

Vinylpyridin derivatisierte alle freien Thiolgruppen und erleichterte die Identifizierung

von Reaktionsprodukten sowohl durch die charakteristisch größere Masse von

reduzierten und teilreduzierten Spezies als auch durch eine deutliche Verschiebung der

Resonanzen der Cystein β-Protonen. In Abbildung 50 ist das 1H-1D-Spektrum der

partiell reduzierten derivatisierten C-terminalen Domäne gezeigt. Das dazugehörige

61

Ergebnisse

HPLC-Chromatogramm ist in Abbildung 52 gezeigt. Das 1H-1D-Spektrum in

Abbildung 50 und das zugehörige TOCSY-Spektrum kann in zwei Signalsätze zerlegt

werden. Subtrahiert man vom 1H-1D-Spektrum in Abbildung 50 das 1H-1D-Spektrum

des oxidierten und gefalteten Peptids (Abbildung 39), erhält man in Abbildung 51 das

Differenzspektrum. Vergleicht man das Differenzspektrum aus Abbildung 51 mit dem

Spektrum der vollständig reduzierten Spezies in Abbildung 49, zeigt sich, dass beide

Spektren praktisch identisch sind. Das Differenzspektrum gehört damit zur vollständig

reduzierten und ungefalteten Spezies. Die β-Protonen der gefalteten Spezies weisen

keine Resonanzverschiebungen im TOCSY-Spektrum auf. Somit ist die Spezies noch

vollständig oxidiert. Ein weiterer gefalteter Signalsatz existiert nicht, was darauf

schließen lässt, dass das Peptid nur in der vollständig oxidierten Form gefaltet ist.

Durch LC-MS-Analyse konnte gezeigt werden, dass die entfaltete Spezies aus

unterschiedlich reduzierten Molekülen besteht. In Abbildung 52 ist das HPLC-

Chromatogramm und die entsprechende Zuordnung des LC-MS-Laufes gezeigt.

Zusammenfassend lässt sich feststellen: Nur die komplett oxidierte Spezies ist

gefaltet, da sich in Abbildung 50 kein weiterer gefalteter Signalsatz finden lässt. Aus

dem zugehörigem TOCSY-Spektrum kann ausgeschlossen werden, dass der gefaltete

Signalsatz mit Vinylpyridin derivatisiert wurde. Folglich wurde die gefaltete Spezies

auch nicht teilreduziert. Aus den LC-MS-Analysen und dem HPLC-Chromatogramm

ist zu sehen, dass verschiedene teilreduzierte und die vollständig reduzierte Spezies

gebildet worden sind und mit Vinylpyridin derivatisiert wurden. Da aber kein weiterer

gefalteter Signalsatz in den NMR-Spektren existiert, müssen die vollständig

reduzierte, aber auch die teilreduzierten Spezies ungefaltet sein.

Daraus ergibt sich die Schlussfolgerung, dass bereits das reduktive Öffnen einer

Disulfidbrücke zur Entfaltung des gesamten Peptids führt. Die LC-MS-Analyse zeigte,

dass alle teilreduzierten Spezies etwa in gleichen Verhältnissen gebildet werden. Keine

der Disulfidbrücken scheint daher präferentiell labil zu sein. Andernfalls hätten alle

Moleküle teilreduziert werden müssen, da ein Äquivalent Phosphin eingesetzt wurde.

62

Ergebnisse

Abbildung 49: 1H-1D-Spektrum der reduzierten C-terminalen Domäne.

Abbildung 50: 1H-1D-Spektrum der mit einem Äquivalent Phosphin partiell reduzierten C-terminalen Domäne.

63

Ergebnisse

Abbildung 51: Differenzspektrum der teilreduzierten Spezies aus Abbildung 50 und der oxidierten und vollständig gefalteten Spezies aus Abbildung 39.

0 10 20 30 4-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0

ungefaltete Spezies

6x VP

4x VP2x + 4x VP

2 X VP

Oxidierte Spezies

AU

bei

210

nm

min

Abbildung 52: HPLC-Elutionsprofil der C-terminalen Domäne nach Teilreduktion und Vinylpyridin-Derivatisierung. Die Zuordnung der Signale erfolgte mittels LC-MS.

3.2.2. N-terminale Domäne

Die Sequenz der N-terminalen Domäne stammt aus dem Minicollagen 1 von Hydra.

In Abbildung 53 ist die Sequenz der N-terminalen Domäne gezeigt. N- und C- 64

Ergebnisse

Terminus wurden acetyliert bzw. amidiert, um eine fortlaufende Peptidkette

nachzuahmen.

Ac-Pro-Cys-Ser-Tyr-Cys-Pro-Ser-Val-Cys-Ala-Pro-Ala-Cys-Ala-Pro-Val-Cys-Cys-

Tyr-Pro-NH2.

Abbildung 53: Sequenz der N-terminale Domäne des Minicollagens.

Synthese

Die Synthese des Peptids erfolgte an einem continuous flow-Synthesizer auf einem

Fmoc-Rink-Amide Harz nach der Fmoc/tBu Strategie.

Oxidative Faltung und Reinigung

Das anfänglich verwendete Oxidationssystem GSH/GSSG erwies sich als wenig

geeignet, da sich zeigte, dass die N-terminale Domäne stärker zu Aggregation neigt

und die Ausbeuten an löslichem Produkt gering waren. Im Gegensatz zu der C-

terminalen Domäne besitzt die N-terminale Domäne keine Ladungen. Eine Oxidation

in DMSO ergab ebenfalls keine akzeptablen Ausbeuten. Daher wurde ein

Cystein/Cystin-Oxidationssytem in 2 M Guadinium HCl verwendet. Im Gegensatz

zum GSH/GSSG System wurden weniger Aggregationsprodukte gebildet, die

Ausbeute an löslichem Produkt somit entsprechend höher. HPLC, LC-MS und NMR

bestätigten, dass weitgehend ein einziges Topoisomer entsteht. Der Vergleich von 1H-

1D-Spektren der löslichen Produkte der GSH/GSSG und der Cystein/Cystin Oxidation

zeigte, dass die Faltung beider Produkte identisch ist.

NMR-Messungen

1D-Spektren

In Abbildung 54 ist ein 1H-1D-Spektrum der N-terminalen Domäne gezeigt.

Aufgrund der Signaldispersion der Amidprotonresonanzen kann von einem gefalteten

Peptid ausgegangen werden.

65

Ergebnisse

Abbildung 54: 1H-1D-Spektrum der N-terminalen Domäne des Minicollagens bei 283 K in H2O/D2O.

2D-Spektren

Aus den TOCSY- und NOESY-Spektren konnte eine eindeutige

resonanzspezifische Zuordnung getroffen werden. In Abbildung 55 ist die Amidregion

eines TOCSY-Spektrums gezeigt. Die zugeordneten HN-Hα Signale sind

gekennzeichnet. Die vollständige Zuordnung ist in Tabelle 19 des Anhangs A

aufgelistet.

Aus den NOESY-Spektren wurden insgesamt 118 Protonenabstände gewonnen.

Von diesen waren vier intraresiduale und 114 interresiduale Abstände. Von den 114

interresidualen Abständen waren 60 sequentielle, 36 mittlere und 18 Abstände

zwischen Aminosäuren, die in der Sequenz durch mehr als vier Reste voneinander

getrennt sind. In Abbildung 56 sind die NOE-Kontakte der einzelnen Aminosäurereste

gezeigt. Aus den D2O-Spektren und den Temperaturverschiebungen der

Amidresonanzen konnten keine eindeutigen Wasserstoffbrücken identifiziert werden.

In Abbildung 57 sind die diagnostischen NOE-Kontakte und die H/D Austauschraten

mit den zugehörigen Sekundärstrukturelementen dargestellt.

66

Ergebnisse

Abbildung 55: Amidregion eines TOCSY-Spektrums der N-terminalen Domäne. Die HN-Hα Signale der jeweiligen Aminosäure sind gekennzeichnet.

NOE-Kontakte der Aminosäuren

02468

101214161820

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Aminosäure

Anz

ahl d

er N

OEs

Intra.Seq.Rest

Abbildung 56: Anzahl der ermittelten NOEs der einzelnen Aminosäurereste. Intraresiduale Kontakte sind in weißer, sequentielle Kontakte in hellgrauer und die übrigen Kontakte in dunkelgrauer Farbe dargestellt.

67

Ergebnisse

Abbildung 57: Sekundärstrukturdarstellung der N-terminalen Domäne. Die diagnostischen NOE Kontakte und die H/D Austauschraten(KNH) sind hier zusammengestellt. Die gefundenen Sekundärstrukturelemente sind über der Sequenz dargestellt. Helices sind als Röhren, gestreckte Bereiche als Pfeil und Turns als Bögen dargestellt.

68

Ergebnisse

Strukturbestimmung

In der Abbildung 58 ist die Strukturfamilie der N-terminalen Domäne gezeigt. Die

Sekundärstrukturelemente sind in Abbildung 59 anhand einer Struktur dargestellt.

Abbildung 58: Die zehn energieärmsten Strukturen der N-terminalen Domäne des Minicollagens in Wasser. Wasserstoffatome sind nicht gezeigt. Die übrigen Atome sind in den üblichen Atomfarben dargestellt. Die Disulfidbrücken sind in gelb gekennzeichnet.

Abbildung 59: Darstellung der Sekundärstrukturelemente der N-terminalen Domäne. Neben dem kurzen helikalen Bereich sind auch die drei verschiedenen Turns und die Disulfidbrücken hervorgehoben. Die Abbildung wurde mit Hilfe des Programms Molmol (Koradi et al., 1996) erstellt.

69

Ergebnisse

Im Gegensatz zur C-terminalen Domäne ist das Peptid weniger kompakt gefaltet

und zeigt eine mehr gestreckte Form. Die ersten Reste besitzen eine ausgestreckte

Konformation wie in der C-terminalen Domäne, allerdings zieht sich dieser Bereich

bis zum Rest 7 hin. Darauf folgt ein Typ II β-Turn zwischen Pro 7 und Cys 10. Die

Reste Cys 10 bis Ala 13 bilden einen offenen Typ IV β-Turn. Die Voraussetzung für

diesen Turn ist eine cis-Peptidbindung zwischen Ala 11 und Pro 12. Ein irregulärer γ-

Turn zwischen Ala 13 und Ala 15 bewirkt einen Knick am Cys 14. Die letzten Reste

formen einen α-helikalen Turn zwischen den Resten Cys 18 und Tyr 21, der von

einem 310 Helix-Turn zwischen den Resten Pro 16 und Cys 18 gedeckelt wird.

In Tabelle 9 sind die Energien und RMSD-Werte der Strukturfamilie aufgelistet.

Der RMSD-Wert des Peptidrückgrats beträgt 0,81 Å. Die RMSD-Werte der einzelnen

Aminosäurereste sind in Abbildung 60 individuell gezeigt. In Abbildung 61 ist ein

Ramachandrandiagramm der Strukturfamilie gezeigt, in dem die Aminosäuren

entsprechend ihres Ψ- und Φ-Winkels aufgetragen sind. Die Ψ und Φ-Winkel aller

Aminosäuren liegen in den erlaubten Bereichen.

Tabelle 9: Energien und RMSD-Werte der Strukturfamilie der N-terminalen Domäne.

RMSDs RMSD Proteinrückgrat 0,81 RMSD schwere Atome 0,99 RMSD alle Atome 1,19

Energien (CVFF Kraftfeld) kJ mol-1 ± Standardabweichung Gesamtenergie 1231,78 ± 19,73 Van der Waals Energie 585,01 ± 16,07 Coulombenergie 12,43 ± 0,23 Bindungsenergie 207,34 ± 6,01 Thetaenergie 419,79 ± 23,09 “Out of plane“ Energie 7,47 ± 1,11

70

Ergebnisse

RMSD der Aminosäurenreste

00,5

11,5

22,5

33,5

4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Aminosäure

RM

SD

RückgratSeitenketten

Abbildung 60: RMSD-Werte der einzelnen Aminosäurereste. Die RMSD-Werte des Rückgrats sind schwarz, die der Seitenketten weiß dargestellt.

71

Ergebnisse

Abbildung 61: Ramachandrandiagramm der Strukturfamilie der N-terminalen Domäne. Das Diagramm wurde mit Hilfe des Programms Procheck (Laskowski et al., 1996) erstellt.

Aus den Strukturrechnungen ergab sich überraschend ein anderes Muster der

Disulfidverknüpfungen als in der C-terminalen Domäne, obwohl die Positionen der

Cysteine in beiden Peptiden identisch sind: Cys 2-Cys 14, Cys 6- Cys, 19 und Cys 10-

Cys 18. Die Disulfidverknüpfung ist in Abbildung 62 schematisch gezeigt.

72

Ergebnisse

1 5 10 15 20 21P C G S Y C P S V C A P A C A P V C C Y P

Abbildung 62: Sequenz der N-terminalen Domäne mit der gefundenen Disulfidverknüpfung.

Die erste Disulfidbrücke verknüpft den N-Terminus mit dem Knick an Position Cys

14. Der C-Terminus ist über die zweite Cysteinbrücke mit dem Typ II β-Turn

verbunden und bewahrt so den Zusammenhalt der Struktur. Die dritte Disulfidbrücke

verbindet den offenen Typ IV β-Turn mit dem α-helikalen Turn. Da im Gegensatz zur

C-terminalen Domäne die Struktur der N-terminalen Domäne keinen wirklichen Kern

besitzt, sind alle drei Disulfidbrücken lösungsmittelexponiert. Verantwortlich für die

abweichende Disulfidverknüpfung und Struktur ist wahrscheinlich die cis-

Peptidbindung zwischen Ala 11 und Pro 12, die eine Disulfidverknüpfung wie in der

C-terminalen Domäne verbietet.

CD-Spektren

In Abbildung 63 (links) ist das CD-Spektrum einer 171 µM wässrigen Lösung der

C-terminalen Domäne bei pH 5,4 gezeigt. In seinem Verlauf ähnelt es qualitativ dem

CD-Spektrum der C-terminalen Domäne in Abbildung 48. In Abbildung 63 (rechts)

sind die normierten CD-Spektren der N- und C-terminalen Domäne überlagert. Es fällt

auf, dass sich die Spektren im Bereich 190-200 nm und 215-245 nm unterscheiden. Im

Bereich 190–200 nm verläuft das Spektrum der C-terminalen Domäne unterhalb des

Spektrums der N-terminalen Domäne. Daraus lässt sich ableiten, dass die C-terminale

Domäne einen größeren „random coil“-Anteil als die N-terminale Domäne besitzt. In

den NMR-Strukturen sind die letzten Aminosäuren der C-terminalen Domäne

ungeordnet. Die N-terminale Domäne ist jedoch am C-Terminus verkürzt und besitzt

keine ungeordnete Konformation am C-Terminus. Im Bereich 215 – 240 nm verläuft

das Spektrum der C-terminalen Domäne ebenfalls unterhalb des Spektrums der N-

terminalen Domäne. Dieses Ergebnis sagt aus, dass die C-terminale Domäne mehr α-

Helices oder β-Faltblätter als die N-terminale Domäne besitzt. Auch ist das Resultat

mit den NMR-Strukturen konsistent, in denen die C-terminale Domäne eine α-Helix

73

Ergebnisse

und mehrere reguläre Turns besitzt. Die N-terminale Domäne hingegen hat nur einen

regulären Typ II β-Turn und besitzt keine Helices oder Faltblätter.

190 200 210 220 230 240 250

-28000

-24000

-20000

-16000

-12000

-8000

-4000

0

[Θ] [

deg

cm2 d

mol

-1]

λ[nm]

190 200 210 220 230 240 250

N- terminale Domäne C-terminale Domäne

λ[nm]

Abbildung 63: CD Spektrum der N-terminalen Domäne in H2O bei 10 °C (links). Rechts sind die normierten CD-Spektren der N- und C-terminalen Domäne übergelagert gezeigt.

3.2.3. N-terminale Domäne mit Propeptid

Mit Hilfe der um die Propeptidsequenz verlängerten N-terminalen Domäne sollte

untersucht werden, in wieweit die Anwesenheit des Propeptids die Faltung des

gesamten Peptids beeinflusst. Insbesondere wurde untersucht, ob die Strukturen

identisch sind.

Synthese

Die Synthese des Peptids erfolgte an einem continuous flow Synthesizer auf einem

Fmoc-Rink-Amide Harz nach der Fmoc/tBu Strategie.

Oxidative Faltung

Die N-terminale Domäne mit Propeptid wurde mit dem Cystein/Cystin System

oxidativ gefaltet. Durch die Gegenwart von mehreren geladenen Resten im Propeptid

neigt die N-terminale Domäne mit Propeptid weniger zu Aggregation als die N-

terminale Domäne, und die Oxidation ergab bessere Ausbeuten.

74

Ergebnisse

NMR-Messungen

1D-Spektren

In Abbildung 64 ist das 1H-1D-Spektrum der N-terminalen Domäne mit Propeptid

gezeigt.

Abbildung 64: 1H-1D-Spektrum der N-terminalen Domäne mit Propeptid des Minicollagens in H2O/D2O.

2D-Spektren

In Abbildung 65 ist eine Überlagerung von einem NOESY-Spektrum der N-

terminalen Domäne auf ein NOESY-Spektrum der N-terminalen Domäne mit

Propeptid gezeigt. Eine detaillierte Auswertung zeigt, dass zwar die

Protonenresonanzen, insbesondere der ersten Sequenzreste, leicht verschoben sind,

jedoch die NOE-Kontakte sowohl in ihrer Intensität als auch in ihrem Muster identisch

sind. Die Resonanzen der C-terminalen Amidprotonen sind praktisch identisch, was

zur Überlagerung der Signale führt. Daher besitzt die N-terminale Domäne mit und

ohne Propeptidsequenz dieselbe Struktur. Das Propeptid hat daher keinen Einfluss auf

das Faltungsprodukt selbst, erhöht aber zumindest in vitro die Ausbeuten, da weniger

fehlgefaltete Aggregationsprodukte entstehen. 75

Ergebnisse

Abbildung 65: Überlagerung eines NOESY-Spektrums der N-terminalen Domäne mit Propeptid (rote Signale) mit einem NOESY-Spektrum der N-terminalen Domäne (blaue Signale).

1 5 10 15 20 21

K T L H E M L K R D A N P C G S Y C P S V C A P A C A P V C C Y P

Abbildung 66: Sequenz der N-terminalen Domäne mit Propeptid mit Cysteinverknüpfung. Die zusätzlichen Aminosäuren sind rot unterlegt.

Da die Faltung der N-terminalen Domäne mit und ohne Propeptid identisch ist, ist

auch das Muster der Disulfidverknüpfung identisch. Die sich ergebende

Disulfidverknüpfung ist in Abbildung 66 gezeigt. Da keine NOE-Kontakte zwischen

Aminosäuren der N-terminalen Domäne und dem Propeptid gefunden wurden und die

Resonanzen der Amidprotonen des Propeptids nur eine kleine Dispersion zeigen, ist

davon auszugehen, dass das Propeptid selbst nicht strukturiert ist.

76

Ergebnisse

Tryptischer Verdau der N-terminalen Domäne mit Propeptid

Durch einen tryptischen Verdau der oxidierten N-terminalen Domäne mit Propeptid

sollte festgestellt werden, ob das entstehende Spaltprodukt ebenfalls dieselbe

Konformation annimmt wie die N-terminale Domäne. Anhand der Sequenz (siehe

Abbildung 66) werden nach einem tryptischen Verdau vier Spaltprodukte erwartet: die

beiden einzelnen Aminosäuren Lysin und Arginin, ein sieben-Reste langes Fragment

des Propeptids und die N-terminale Domäne mit Asp -3, Ala -2 und Asn -1. Die

beiden größeren Peptide konnten klar in der LC-MS-Analyse nachgewiesen werden.

Aufgrund ihrer sehr kleinen Retentionszeit wurden die beiden einzelnen Aminosäuren

nicht detektiert. Der problemlose Verdau des nativen Peptids deutet weiterhin darauf

hin, dass das Propeptid und der N-Terminus nicht gefaltet sind.

In Abbildung 67 ist das 1H-1D-Spektrum des gesamten Verdaus gezeigt. Ein

Vergleich mit dem 1H-1D-Spektrum der N-terminalen Domäne in Abbildung 54 zeigt,

dass alle Amidprotonenresonanzen der N-terminalen Domäne im Spektrum wieder

gefunden werden. Eine Überlagerung der entsprechenden TOCSY-Spektren bestätigt

dieses Ergebnis (Daten nicht gezeigt).

77

Ergebnisse

Abbildung 67: 1H-1D-Spektrum des tryptischen Verdaus der N-terminalen Domäne mit Propeptid.

3.2.4. Modell des gesamten trimeren Minicollagen 1

Minicollagen 1 kommt unter physiologischen Bedingungen wahrscheinlich als

nicht-kovalent gebundenes Trimer vor. In früher vorgeschlagenen Modellen ging man

von einer linearen Struktur der N- und C-terminalen Domäne aus (Engel et al., 2002).

Nachdem nun in der vorliegenden Arbeit die Strukturen der N- als auch der C-

terminalen Domäne bestimmt wurden, kann man das in Abbildung 68 gezeigte Modell

vorschlagen. Hierbei wurden die aus der Sequenz bekannten Domänen der

tripelhelikalen Repeats und der Polyprolinbereiche als Collagentripelhelix und als

Poly-Pro-II Helices (Bateman et al., 2004) modelliert. Die Struktur der einzelnen

Domänen kann als relativ wahrscheinlich angenommen werden. Spekulativ sind aber

die Winkel, die die einzelnen Domänen zueinander einnehmen.

78

Ergebnisse

Abbildung 68: Modell des gesamten trimeren Minicollagenmoleküls. Die N- und die C-terminale Domäne sind rot, die Poly-Pro-II Bereiche grau und die tripelhelikale Domäne grün gezeichnet.

79

Ergebnisse

3.3. Thionine

3.3.1. Hellethionin D

NMR-Messungen

Die NMR-Messungen und die Strukturbestimmung wurden bereits in meiner

Diplomarbeit durchgeführt (Milbradt, 2001). Dort sind die Ergebnisse der Messung

und der Strukturrechnung ausführlich beschrieben. In Abbildung 69 ist ein 1H-1D-

Spektrum des Hellethionin D gezeigt. Charakteristisch für die korrekte Faltung sind

die stark Hochfeld-verschobenen Signale des Val 35 bei 0,3 ppm und des Ile 33 bei 0,2

ppm.

Abbildung 69: 1H-1D-Spektrum des Hellethionin D in H2O/D2O.

Strukturbestimmung

Die Sequenz mit den gefundenen Disulfidverknüpfungen und weitere verwandte

Thionine sind in Abbildung 70 aufgeführt. Die Strukturfamilie ist in Abbildung 71

gezeigt. Die Sekundärstrukturelemente und wichtige funktionelle Aminosäuren sind in

Abbildung 72 dargestellt. Die Struktur wurde bei der PDB unter der Zugangsnummer

80

Ergebnisse

1NBL abgelegt. Hellethionin D besitzt eine typische Thioninfaltung, die dem

griechischem Γ ähnelt. Hierbei bilden die vertikalen Bestandteile zwei kurze

antiparallele α-Helices, und die horizontalen Bestandteile ein zweisträngiges

antiparalleles β-Faltblatt (Milbradt et al., 2003). Eine Überlagerung (Milbradt et al.,

2003) mit den Homologen Viscotoxin A3 (PDB 1EDO, (Romagnoli et al., 2000)), β-

Purothionin (PDB 1EJG, (Stec et al., 1995)) und Crambin (PDB 1BHP, (Jelsch et al.,

2000)) in Abbildung 73 zeigt, dass die vier Moleküle dieselbe globale Struktur

besitzen. Insbesondere die Sekundärstrukturelemente lassen sich gut überlagern. Der

RMSD-Wert der Proteinrückgratatome in den Sekundärstrukturelementen beträt 0,7 Å

bei Überlagerung mit dem Viscotoxin, 0,9 Å mit dem Purothionin und 0,92 Å mit dem

Crambin. Lokale Abweichungen existieren für die Schleife zwischen den Resten 19

bis 21, zwischen den beiden α-Helices und für den Bereich der Reste 36 bis 39, in dem

sich im Hellethionin D vier aufeinander folgende Threonine befinden.

1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 46

Alpha-1 Purothionin K S C C R T T L G R N C Y N L C R S R G A Q K L C S T V C R C K L I S S L S C P K G F P KBeta Purothionin K S C C K S T L G R N C Y N L C R A R G A Q K L C A N V C R C K L T S G L S C P K D F P KViscotoxin A3 K S C C P N T T G R N I Y N A C R L T G A P R P T C A K L S G C K I I S G S T C P S D Y P KCrambin B T T C C P S I V A R S N F N V C R L P G T P E A L C A T Y T G C I I I P G A T C P G D Y A NHelionin A K S C C R N T L G R N C Y N G C R F T G G S Q P T C G R L C D C I H V T T T T C P S S H P SHelionin D 1 K S C C R N T L A R N C Y N A C R F T G G S Q P T C G I L C D C I H V T T T T C P S S H P SHelionin E 1 K S C C R N T L G R N C Y A A C R L T G L F S Q E Q C A R L C D C I T V T T P T P C P R T H P S

Abbildung 70: Sequenzvergleiche verschiedener Thionine. Farbcode: grün = identische Aminosäure zu Hellethionin D, rot = Insertionen, gelb = konservierte Cysteine und türkis = funktionell wichtige Tyr 13.

81

Ergebnisse

Abbildung 71: Strukturfamilie der 20 energieärmsten Strukturen des Hellethionins D in Wasser. Wasserstoffatome sind nicht gezeigt. Die übrigen Atome sind in den üblichen Atomfarben dargestellt. Disulfidbrücken sind gelb gekennzeichnet.

Abbildung 72: Darstellung der Sekundärstrukturelemente des Hellethionins D. Die beiden α-Helices sind in rotgelb, das β-Faltbaltt in grün dargestellt. Aminosäuren mit möglicher biologischer Aktivität sind hervorgehoben. Die Abbildung wurde mit Hilfe des Programms Molmol (Koradi et al., 1996) erstellt.

82

Ergebnisse

Abbildung 73: Überlagerung des Peptidrückgrats der Sekundärstrukturelemente von Hellethionin D (rotes Band), Viscotoxin (blaues Band), β-Purothionin (grünes Band) und Crambin (violettes Band).

Bestimmung des oligomeren Zustandes von Hellethionin D in Wasser

Um sicherzustellen, dass Hellethionin D in Wasser als Monomer vorliegt, wurden

Verdünnungs- und NMR-Diffusionsexperimente durchgeführt. Eine leichte

Linienverschmälerung wurde nach Verdünnung einer Hellethioninlösung von 4 auf 2

mM beobachtet. Bei weiterer Verdünnung der Lösung bis auf 0,1 mM Protein trat

keine weitere Linienverschmälerung ein. Die Translationsdiffusionskonstante wurde

bei 300 K mit 1,4 × 10-10 m2 s-1 bestimmt. Sie liegt damit in einem typischen Bereich

für Proteine mit einer Größe von 5 kDa. Das Protein liegt somit in den verwendeten

Lösungen als Monomer vor.

Oxidative Rückfaltung des Hellethionin D

Um detaillierte Kenntnis über die Faltung des Hellethionins, insbesondere über den

Einfluss der Disulfidbrücken zu gewinnen wurde das Peptid reduktiv entfaltet und

83

Ergebnisse

anschließend wieder oxidativ rückgefaltet. Die Reduktion mit Tris(2-

carboxyethyl)phosphin erfolgte nur sehr langsam, wie durch 1H-1D-NMR-Spektren

und LC-MS-Analyse beobachtet wurde. Nach Inkubation bei 50 °C über Nacht war

das Protein komplett reduziert. Das reduzierte Peptid zeigt sowohl im CD-Spektrum

als auch im NMR-Spektrum, in Abbildung 74 gezeigt, keine geordnete Struktur mehr.

Insbesondere sind die Hochfeld-verschobenen Signale des Val 35 und des Ile 33

verschwunden. Es ist bekannt, dass reduzierte kleine Cystein-reiche Peptide unter

mehr oder weniger optimalen Bedingungen mit guten Ausbeuten oxidativ rückgefaltet

werden können. Insofern ist es wenig überraschend, dass durch Luftoxidation ca. 50 %

des nativen Peptids rückgefaltet werden konnten. Erfolgte die Oxidation mit Hilfe des

GSSG/GSH Systems, konnte das Peptid fast vollständig rückgefaltet werden.

Abbildung 74: 1H-1D-Spektrum des vollständig reduzierten und entfalteten Hellethionin D in H2O/D2O. Die für die korrekte Faltung charakteristischen Hochfeld-verschobenen Signale von Val 35 und Ile 33 sind verschwunden.

84

4. Diskussion

4.1. Azopeptide

Ein Vergleich der durch NMR-Spektroskopie bestimmten Strukturensembles des

bcAMPB als cis- und trans-Isomer mit den MD-bestimmten Strukturensembles ist in

Abbildung 75 gezeigt.

Abbildung 75: Vergleich der MD-Strukturensembles (links) mit den NMR-Strukturensembles (rechts) des bcAMPBs. Die links aufgeführten Strukturen gehören jeweils zum cis-, die rechts gezeigten jeweils zum trans-Isomer. Die freie Energie der MD-Strukturen ist durch Graustufen des Peptidrückgrats kodiert (Spörlein et al., 2002).

Sowohl die Strukturen des cis- als auch des trans-Isomers stimmen für beide

Methoden gut überein. In beiden Methoden ergeben sich ähnlich molekulare

Geometrien und vorhergesagte Strukturensembles, in denen das cis-Isomer nur eine

geringfügig höhere Flexibilität als das trans-Isomer zeigt. Für das monozyklische

Azopeptid-Analogon cAMPB, in dem die Cysteine durch StBu geschützt und nicht

verbrückt sind, sind die NMR-Strukturen kompakter und zeigen weniger Variabilität

als die MD-Strukturen. Die größere konformationelle Variabilität des monozyklischen

Peptids wird durch die NMR-Strukturbestimmung nicht so gut wie durch die MD-

Strukturvorhersage wiedergegeben (Carstens et al., 2004).

Vergleicht man die Rückgrat-RMSD-Werte der verschiedenen Azopeptide,

(Abbildung 76) fällt auf, dass der RMSD-Wert des trans-Azo-[Ser2, Ser5]-PDI deutlich

höher als der anderer trans-Isomere ist. Durch das Fehlen der Disulfidbrücke ist zwar

auch das trans-cAMPB etwas variabler als das trans-bcAMPB, allerdings ist die

Differenz eher gering. Zum einen ist hierfür die unterschiedliche Sequenz des cAMPB

und des Azo-[Ser2, Ser5]-PDI verantwortlich, zum anderen spielen die

85

Diskussion

unterschiedlichen Lösungsmittel, DMSO für cAMPB/bcAMPB und Wasser für Azo-

[Ser2, Ser5]-PDI /Azo-PDI, eine Rolle.

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

cAMPB

rb127

AzoPDIdi

Ser

AzoPDI

rb191

Rück

grat

-RM

SD[Ǻ

]

transcis

Abbildung 76: RMSD-Werte der jeweils zehn energieärmsten Strukturen der verschiedenen Azopeptide. Für die Ermittlung der RMSD-Werte wurden nur die Atome des Proteinrückgrats verwendet.

In Tabelle 10 sind die Redoxpotentiale von Peptidfragmenten verschiedener

Oxidoreduktasen und die der Oxidoreduktasen selbst zusammengestellt. Cystein-

enthaltende Oxidoreduktasen, wie Thioredoxin (TRX), Glutaredoxin (GRX),

Thioredoxin-Reduktase und Proteindisulfidisomerase unterscheiden sich signifikant in

ihrem Redoxpotential, welches von reduzierenden Werten von -270 mV für

Thioredoxin (Krause et al., 1991) bis zu eher oxidierenden Werten von -122 mV für

DsbA (Huber-Wunderlich and Glockshuber, 1998) reicht, obwohl alle, bis auf PDI, die

weit verbreitete Thioredoxin Faltung mit dem Cys–Xaa-Yaa-Cys Motiv am N-

Terminus einer α-Helix besitzen (Martin, 1995). Die großen Unterschiede im

Redoxpotential sind größtenteils der Sequenz des Dipeptids zwischen den Cysteinen

zugeschrieben worden (Huber-Wunderlich and Glockshuber, 1998). Gleichzeitig

wurden auch die Einflüsse von benachbarten geladenen Gruppen diskutiert (Jacobi et

al., 1997).

Die linearen Octapeptide (Siedler et al., 1993) besitzen, unabhängig von ihrer

Sequenzherkunft, Redoxpotentiale im Bereich von -200 mV. Durch die

86

Diskussion

konformationelle Einengung zu zyklischen Hexapeptiden (Cabrele et al., 2002b) wird

das Redoxpotential differenziert und zeigte eine stärkere Sequenzabhängigkeit.

Tabelle 10: Übersicht über die Redoxpotentiale verschiedener Fragmente aus verschiedenen Oxidoreduktasen.

Redoxpotentiale verschiedener Peptidfragmente

E0’ [mV] E0’ [mV] E0’ [mV] E0’ [mV]

Sequenz-

herkunft

Lineare

Octapeptidea

Zyklische

Hexapeptideb

Enzym Azopeptide

GRX -215 -179 -233c

TRX -190 -152 -270d

PDI -205 -130 -110e

-175f

-167 (trans)

TRR

Azo-

NonaTRR

-210 -204 -254/-271g

-200 (trans)h

-146 (cis)h

-218 (trans)

a: (Siedler et al., 1993); b: (Cabrele et al., 2002b); c: (Aslund et al., 1997); d: (Lin and Kim, 1989); e: (Hawkins et al., 1991); f: (Lundstrom and Holmgren, 1993); g: (O'Donnell and Williams, Jr., 1983); h: (Cabrele et al., 2002a).

In Studien (Cabrele et al., 2002a) über die Thioredoxin-Reduktasesequenz (TRR)

enthaltenden Azopeptide (Azo-TRR) konnte gezeigt werden, dass sich das trans-

Isomer des Azo-TRR-Peptids sehr gut auf das aktive Zentrum der Thioredoxin-

Reduktase überlagern lässt. Trotzdem beträgt der Unterschied des Redoxpotentials

zwischen Enzym und Azopeptid 50 mV. Dieser Unterschied kann auf die

Entropieabnahme bei Bildung des relativ rigiden Typ I β -Turn im Protein während

der Oxidation zurückgeführt werden.

Das Redoxpotential des Azo-PDI ist deutlich positiver als das des trans-Isomers des

Azo-NonaTRR und des trans-Isomers des Azo-TRR. Ähnlich wie für das Azo-TRR

beträgt das Redoxpotential des linearen Modellpeptids von PDI –205 mV. Das native

PDI Enzym hingegen hat ein deutlich positiveres Redoxpotential von –110 mV

(Hawkins et al., 1991). Offensichtlich hat auch im Falle der PDI die Proteinumgebung

einen dominierenden Einfluss auf das Redoxpotential. Die Sequenz des Dipeptids

87

Diskussion

beeinflusst das Redoxpotential allerdings auch, da gezeigt werden konnte, dass ein

Austausch des Dipeptids Pro-His im Enzym DsbA gegen das Dipeptid Gly-His aus der

PDI Sequenz das Redoxpotential des mutierten DbsA veränderte (Huber-Wunderlich

and Glockshuber, 1998). In diesem Fall wurde es negativer, was einem negativeren

Redoxpotential des PDI Enzyms im Vergleich zum DbsA Enzym entspricht. Wurde in

den Mutationsstudien das Dipeptid Ala-Thr eingesetzt, welches der Thioredoxin-

Reduktasesequenz entspricht, lag das Redox-potential noch unter der PDI Mutante

(Huber-Wunderlich and Glockshuber, 1998). Insofern gibt es also auch einen

Dipeptidsequenz–abhängigen Einfluss auf das Redoxpotential. Es wird angenommen,

dass die Sequenz Gly-His durch das bei physiologischem pH zumindest teilweise

positiv geladene Histidin ein Thiolat-Anion des N-terminalen Cysteins stabilisieren

kann. Die Bildung des Thiolat-Anions am N-terminalen Cystein ist für das

Redoxverhalten von großer Bedeutung. Bei der Thioredoxin-Reduktasesequenz Ala-

Thr fehlt eine solche stabilisierende positive Ladung.

Im Falle des trans-Isomers des Azo-PDI kann die günstige Orientierung des positiv

geladenen Histidins als wahrscheinlich angenommen werden. Eine Überlagerung der

Struktur des trans-Isomers und des cis-Isomers des Azo-PDI in Abbildung 77 zeigt,

dass sowohl das trans- als auch das cis-Isomer dieselbe Turnstruktur zwischen den

beiden Cysteinen ausbilden wie das native Enzym. Als weitere stabilisierende positive

Ladungen müssen aber auch die vier Lysine im Azo-PDI in Betracht gezogen werden.

Eventuell sind sie sogar die redoxbestimmenden Reste des Peptids. Das Azo-TRR und

das Azo-NonaTRR besitzen allerdings auch drei bzw. vier Lysine. Der deutliche

Unterschied zwischen dem Redoxpotential des trans-Azo-PDI einerseits und des

trans-Azo-TRR und trans-Azo-NonaTRR anderseits spricht gegen einen

dominierenden Einfluss der Lysine auf das Redoxpotential. Zusätzlich besitzen das

trans-Azo-NonaTRR und das trans-Azo-TRR ein leicht negativeres oder nahezu

gleiches Redoxpotential wie ihre linearen Octapeptidanaloga, welche keine Lysinreste

enthalten.

Über das tatsächliche Redoxpotential des cis-Azo-PDI kann nur spekuliert werden.

Abschätzungen deuten darauf hin, dass das Redoxpotential des cis-Isomers deutlich

negativer als das des trans-Isomers ist. Damit würde sich das Azo-PDI qualitativ

umgekehrt zum löslichen Azo-TRR verhalten (Cabrele et al., 2002a), bei dem das cis- 88

Diskussion

Isomer ein deutlich positiveres Redoxpotential besitzt. Anderseits zeigt die

Überlagerung in Abbildung 77, dass cis- und trans-Isomer im oxidierten Zustand eine

ähnliche Konformation des Bis(cysteinyl)motivs besitzen, die auch der lokalen

Konformation des nativen Enzyms entspricht.

Abbildung 77: Überlagerung der Strukturen des nativen PDI Enzyms (PDB Eintrag: 1MEK) (Kemmink et al., 1996) (grünes Peptidrückgratband) mit dem trans- (rotes Band) und cis-Isomer des Azo-PDI (blaues Band). Alle Atome außer Wasserstoff sind in den üblichen Atomfarben dargestellt. Die Disulfidbrücken sind in gelb gekennzeichnet.

89

Diskussion

4.2. Minicollagen

Obwohl beide Cystein-reichen Domänen dasselbe Cysteinmotiv besitzen,

unterscheiden sie sich in ihren Strukturen und ihrer Disulfidverknüpfung. Damit wird

die These bestätigt, dass Sequenz und Cysteinmotiv gemeinsam die Faltung

bestimmen, nicht aber das Cysteinmotiv allein (Creighton, 1997). Die These, dass

identische Cysteinverteilungen zu identischen Cysteinverknüpfungen führen (Gupta et

al., 2004), wird jedoch nicht bestätigt.

Die C-terminale Domäne ist vier Reste länger und die N-terminale Domäne ein Rest

länger als die eigentliche Kerndomäne von Position 1 bis Position 20. In der Struktur

der C-terminalen Domäne sind Pro 1 und die letzten drei Reste zufällig orientiert und

wahrscheinlich nicht für die korrekte Faltung verantwortlich, erhöhen aber die

Löslichkeit des Peptids und damit in vitro auch die Ausbeute der oxidativen Faltung.

Die restliche Struktur der C-terminalen Domäne ist definiert und besteht nur aus einem

einzigen Konformations-Isomer.

Die N-terminale Domäne ist insgesamt besser definiert, da ihr der flexible C-

Terminus der C-terminalen Domäne fehlt. Sie weist aber zwischen den Resten Gly 3

bis Tyr 5 eine variablere Region auf. Aus den HPLC-Läufen und den NMR-Spektren

der N-terminalen Domäne lässt sich vermuten, dass noch ein weiteres Konformations-

Isomer besteht. Der Anteil des zweiten Isomers ist mit 5 – 10 % aber relativ gering.

Detaillierte Untersuchungen wurden am zweiten Isomer nicht vorgenommen. Obwohl

das Propeptid der N-terminalen Domäne keinen Einfluss auf die Faltung hat, erhöht es

die Ausbeuten der oxidativen Faltung in vitro und möglicherweise auch in vivo.

Der Grund für den strukturellen Unterschied der beiden Domänen liegt

wahrscheinlich in der cis-Peptidbindung zwischen Ala 11 und Pro 12 begründet. Die

C-terminale Domäne besitzt zwar auch ein Prolin an Position 12, eine cis-

Peptidbindung wurde aber nicht beobachtet. Die Strukturen der N-terminalen und der

C-terminalen Domäne sind nach unserem Wissen singulär, da keine homologen

Strukturen bekannt sind.

Im reduzierten Zustand besitzt die C-terminale Domäne keine bevorzugte

Konformation und liegt in einem ungeordneten Zustand vor. Für die N-terminale

Domäne wurde entsprechendes nicht untersucht. Es ist allerdings sehr wahrscheinlich,

90

Diskussion

dass die N-terminale Domäne im reduzierten Zustand ebenfalls ungefaltet ist, da bei

vielen anderen Cystein-reichen Domänen das Öffnen der Disulfidbrücken zum Verlust

der Struktur führt. Wurden beispielsweise die Cysteine im Tachyplesin gegen Alanine

ausgetauscht, verlor das Protein seine Struktur (Laederach et al., 2002).

Interessanterweise konnte die Faltung durch den Austausch der Alanine gegen

Tyrosine wiederhergestellt werden (Laederach et al., 2002). Offensichtlich können die

hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den Tyrosinen die kovalenten Bindungen

der Disulfidbrücken ersetzen. Da auch das Öffnen nur einer Disulfidbrücke der C-

terminalen Domäne bereits zu einem Verlust der Faltung führt, erfolgt durch die freie

SH-Gruppe wahrscheinlich ein schneller intramolekularer Austausch aller

Disulfidbrücken. Die Verknüpfung der Disulfidbrücken erfolgt anschließend bis auf

Verknüpfungen, die energetisch stark benachteiligt sind, stochastisch, und ungefaltete

Zustände der Peptidkonformation resultieren daraus.

Erstaunlich ist, dass einige wenige nicht kovalente Wechselwirkungen in der N- und

C-terminalen Domäne die korrekte Verknüpfung der Cysteine bewirken, obwohl

statistisch gesehen eine große Anzahl von unterschiedlichen Verknüpfungen möglich

ist. Um die korrekte Disulfidverknüpfung zu formen, müssen ungünstige

Verknüpfungen vermieden und die korrekte Disulfidverknüpfung durch die Faltung

begünstigt werden, die dann wiederum die Faltung stabilisiert (Creighton, 1997). Die

jeweils drei zwischen den Cysteinen liegenden Aminosäuren machen eine

Verknüpfung von benachbarten Cysteinen energetisch ungünstig und schließen damit

bestimmte Verknüpfungsmuster aus (Zhang and Snyder, 1989).

Für die Faltung der C-terminalen Domäne ist möglicherweise die Bildung des Typ I

β-Turns mit der Wasserstoffbrücke zwischen dem Amidproton des Cys 15 und dem

Carbonylsauerstoff des Val 11 der entscheidende Schritt. Aus den Strukturen ist zu

erkennen, dass der Typ I β-Turn und der inverse γ-Turn die Cysteine in enge

Nachbarschaft für die korrekte Verknüpfung rücken. In diesem Fall würde der Bildung

der Disulfidbrücken und damit der nativen Faltung die Bildung von

Sekundärstrukturelementen vorausgehen.

91

Frühere Untersuchungen an Minicollagenen in der Nematocystenwand zeigten, dass

es einen Wechsel von einer löslichen Form, in der alle Disulfidbrücken intramolekular

verknüpft sind, zu einer nicht löslichen dichten polymeren Form, in der die

Diskussion

Disulfidbrücken intermolekular verknüpft sind, gibt. Ähnliche

Assemblierungsprozesse, welche eine Umlagerung der Disulfidbrücken beinhalten,

wurden vom Virus Capsid Protein (Li et al., 2002), dem Collagen IV (Gunwar et al.,

1998) und anderen Systemen berichtet (Knaus et al., 2001), (Wagner et al., 1987). Die

einzigen Cysteine des Minicollagens befinden sich in der N- und C-terminalen

Domäne. Daher wurde eine Disulfidumlagerung zwischen diesen Domänen

vorgeschlagen. In vivo ist die Situation sehr viel komplizierter, da auch

Verknüpfungen zwischen N- und C-terminalen Domänen verschiedener Proteine eines

Organismus möglich sind.

Es stellt sich die Frage nach dem funktionellen Grund für die unterschiedliche

Struktur der N- und C-terminalen Domäne, trotz identischer Cysteinverteilung.

Aufgrund ihrer verschiedenen Struktur und der unterschiedlichen Lagen der

Disulfidbrücken werden sich die N- und C-terminale Domäne während der

Disulfidumlagerung in der Quervernetzungsphase der Nematocystenbiogenese

unterschiedlich verhalten. Wie in Abbildung 68 des Ergebnisteils gezeigt wird, besitzt

das Minicollagen ebenfalls keine Symmetrie bezüglich der Polyprolindomänen. So

kann eine Kopf-zu-Schwanz-Verknüpfung verschiedener Minicollagene gewährleistet

und eine Kopf-zu-Kopf oder Schwanz-zu-Schwanz-Verknüpfung vermieden werden.

Die damit entstehende Orientierung der Minicollagene im Netzwerk der Zellwand

verleiht ihr möglicherweise ganz spezielle mechanische Eigenschaften.

Im Minicollagen der Korallen treten Cysteinreste interessanterweise besonders

häufig nach Glycinen in der tripelhelikalen Collagendomäne auf. Cysteinreste, welche

verschiedene Collagenstränge desselben Moleküls verbinden, befinden sich am Ende

der Tripelhelix (Bruckner et al., 1978) (Barth et al., 2003) oder in Unterbrechungen

der regulären Gly-X-Y Repeats (Kühn, 1995) und bilden dort einen stabilen

Disulfidknoten.

Cysteinreste in Position X der Tripelhelix sind sehr selten und dienen

wahrscheinlich der Verknüpfung von unterschiedlichen Collagenmolekülen. Es kann

spekuliert werden, dass zusätzlich zu den Verknüpfungen des Minicollagens über die

N- und C-terminalen Domänen die Nematocystenwand der Korallen über eine direkte

Disulfidverknüpfung der tripelhelikalen Domänen des Minicollagens verfügt und so

eine höhere Zugfestigkeit besitzt. 92

Diskussion

4.3. Hellethionin

Im Gegensatz zu den Cystein-reichen Domänen des Minicollagens, besitzen die α-

und β-Thionine (Garcia-Olmedo et al., 1998) identische Cysteinverteilungen und

identische Strukturen, wie sie in den meisten anderen Cystein-reichen Peptiden

gefunden werden.

Purothionin, Crambin und Viscotoxin, deren Strukturen in Abbildung 73 des

Ergebnisteils gezeigt sind, zeigen eine ähnliche Anordnung von Schleifen und Turns in

den letzten zwölf Aminosäureresten, wohingegen das Hellethionin D in den Resten

Thr 34 bis zum C-Terminus in der Struktur von den anderen Thionin abweicht. Nur

der C-Terminus selbst ist wieder ähnlich zum C-Terminus anderer Thionine.

Offensichtlich sind die Unterschiede durch die Gegenwart der konservierten

Disulfidbrücke zwischen Cys 3 und Cys 40 beschränkt. Obwohl das Strukturensemble

des Hellethionin D für die Reste Thr 36 bis Thr 39 weniger definiert ist, ist die

Spreizung der Konformation klein verglichen mit den Unterschieden der

Schleifenkonformationen innerhalb der anderen Thionine. Dies bedeutet, dass der

Unterschied nicht auf einen Mangel an experimentellen Daten zurückzuführen ist. Die

Existenz von zahlreichen mittellangen und weitreichenden NOE-Kontakten

unterstreicht diese Vermutung. Zusätzlich würde eine Konformation der Schleife

zwischen den Resten Thr 36 und Thr 39, die der anderen Thionine entspräche, die

Rückgratatome der Reste Thr 37 und Thr 38 sehr in die Nähe der

Seitenkettenaminogruppe des Lys 1 rücken. NOE-Kontakte zwischen diesen Resten

können jedoch ausgeschlossen werden. Obwohl die Bedeutung als auch der Ursprung

dieses Unterschiedes zum jetzigen Zeitpunkt unbekannt sind, kann spekuliert werden,

dass dafür die unterschiedliche Ladungsverteilung und die vier Threonine zwischen

den Resten 36 bis 39 verantwortlich sind.

Bei einem pH Wert von 7 ist das Hellethionin D positiv geladen. In der N-

terminalen Hälfte der Sequenz aller Hellethionine ist die Verteilung der geladenen

Aminosäuren identisch mit denen der anderen Thionine. Große Unterschiede

existieren in der zweiten Hälfte der Sequenz. Die positiven Ladungen, die in anderen

Thioninen gefunden werden, existieren im Hellethionin D nicht. Die Seitenketten der

93

Diskussion

Reste Asp 31 und Arg 5 sind in enger Nachbarschaft und bilden wahrscheinlich eine

Salzbrücke aus.

Das reduzierte Hellethionin D lässt sich in einem GSH/GSSG Redoxpuffer

problemlos und quantitativ rückfalten. Unter Luftoxidation ist die Ausbeute der

oxidativen Rückfaltung deutlich geringer, da fehlgefaltete Intermediate nicht aus den

lokalen Energieminima durch Umlagerung von Disulfidbrücken befreit werden

können. Für die korrekte Faltung ist die Ausbildung der Sekundärstrukturelemente,

zwei antiparallele α-Helices und ein antiparalles β-Faltblatt, die in allen Typ I, II und

IV Thioninen gefunden werden (Garcia-Olmedo et al., 1998), sehr wahrscheinlich

erforderlich.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Hellethionin D, als Repräsentant einer

größeren neuen Familie von Thionin, die typische Thioninstruktur zeigt und eine

Disulfidverknüpfung, die dem Typ II der Thionine (Garcia-Olmedo et al., 1998)

entspricht, besitzt. Trotz des gemeinsamen Faltungsmotivs bestehen Unterschiede

zwischen dem Hellethionin D und anderen Thioninen, welche wahrscheinlich auf die

ungewöhnliche Ladungsverteilung und die vier aufeinander folgenden Threonine im

C-terminalen Bereich zurückzuführen sind.

94

5. Zusammenfassung und Ausblick In der vorliegenden Arbeit wurden Moleküle untersucht, die Modellsysteme für die

(oxidative) Proteinfaltung sind.

Die erste untersuchte Klasse von Molekülen besteht aus zyklischen Azopeptiden,

deren Sequenzen aus den beiden Oxidoreduktasen Thioredoxin-Reduktase (TRR) und

Proteindisulfidisomerase (PDI) stammen. Durch den AMPB-Photoschalter lassen sich

die Peptide reversibel in das trans- und das cis-Isomer schalten. Die Isomere

unterscheiden sich sowohl konformationell als auch in ihren physikalisch-chemischen

Eigenschaften voneinander. Mit CD- und NMR spektroskopischen Untersuchungen

konnten die konformationellen Eigenschaften aufgeklärt werden. Das Redoxpotential

der wasserlöslichen Bis(cysteinyl)-Azopeptide wurde über die

Gleichgewichtskonstante mit Glutathion bestimmt.

Am DMSO-löslichen Azopeptid bcAMPB wurde bereits in vorhergehenden

Arbeiten die konformationelle Dynamik nach Schalten des AMPB Bausteins im

Bereich von Pikosekunden verfolgt (Spörlein et al., 2002). Eine verfeinerte NMR-

Struktur des bcAMPB zeigte eine bessere Übereinstimmung der NMR-Strukturen mit

theoretischen Strukturvorhersagen aus MD Simulationen (Carstens et al., 2004) als die

bereits veröffentlichten NMR-Strukturen (Renner et al., 2000).

Das bizyklische wasserlösliche Azo-PDI mit der Sequenz der

Proteindisulfidisomerase besitzt sowohl als trans- als auch als cis-Isomer gut

definierte, aber unterschiedliche Strukturensembles. Damit ist es für die

Ultrakurzzeitspektroskopie besonders interessant, da das Peptid von einem definierten

konformationellen Zustand in einen anderen konformationellen Zustand geschaltet

werden kann. Sein monozyklisches Analogon Azo-[Ser2, Ser5]-PDI besitzt weder als

trans- noch als cis-Isomer eine definierte Struktur und unterstreicht damit den

strukturbestimmenden Einfluss der Disulfidbrücke.

Das trans-Azo-PDI Peptid besitzt mit -167 mV ein positiveres Redoxpotential als

das trans-Isomer des Azo-TRR (Cabrele et al., 2002a) und als das trans-Isomer des

Azo-NonaTRR, dessen Sequenz ebenfalls aus der Thioredoxin-Reduktase stammt.

95

Zusammenfassung und Ausblick

Das Azo-TRR wurde in vorhergehenden Arbeiten bereits als Modulator der

oxidativen Proteinfaltung verwendet (Cattani-Scholz et al., 2002). Hieran könnte mit

Untersuchungen des Azo-PDI anknüpft und aufgeklärt werden, welchen Einfluss

Unterschiede des Redoxpotentials und der Konformation auf die oxidative

Proteinfaltung haben.

Die zweite Klasse von Molekülen als Modelle der Proteinfaltung stellen kleine

natürliche Cystein-reiche Peptide dar. In der vorliegenden Arbeit wurden die

strukturellen Eigenschaften und die Faltungseigenschaften der N- und C-terminalen

Cystein-reichen Domäne des Minicollagens aus Hydra und des Hellethionin D,

welches zu der Gruppe der Thionine zählt, untersucht.

Interessanterweise besitzen die N- und die C-terminale Domäne, obwohl sie

dasselbe Cysteinmuster besitzen, unterschiedliche Strukturen. Sie eignen sich damit

besonders gut als Modellsysteme der oxidativen Proteinfaltung, da an ihnen die

wechselseitige Beeinflussung der sequenzabhängigen Faltung und das Knüpfen von

Disulfidbrücken auf den gesamten Faltungsprozess untersucht werden kann. Die

durchgeführten Rückfaltungsexperimente der C-terminalen Domäne zeigen, dass die

native Faltung nur durch die Bildung aller Disulfidbrücken stabilisiert wird. Der

Prozess der Disulfidumlagerung der Cystein-reichen Domänen ist für die Härtung der

Nematocystenwand essentiell. Hierbei lagern sich die intramolekularen

Disulfidbrücken zu intermolekularen Disulfidbrücken um und verknüpfen so die

einzelnen Minicollagentrimere miteinander. Eine detaillierte Kenntnis der Stabilität

der einzelnen Disulfidbrücken in der N- und C-terminalen Domäne könnte diesen

Prozess durch einen molekularen Mechanismus im Detail aufklären. Interessant ist in

diesem Zusammenhang auch, inwieweit die unterschiedlichen Strukturen der N- und

der C-terminalen Domäne diesen Härtungsprozess beeinflussen oder sogar

Voraussetzung für die korrekte Verknüpfung der Minicollagene sind.

Zur zweiten Klasse von Modellsystemen der oxidativen Proteinfaltung gehört das

Cystein-reiche Hellethionin D, das zur Gruppe der Thionine zählt. Die ermittelte

NMR-Struktur des Hellethionin D weist dieselbe stabile Faltung wie andere homologe

Thionine, z.B. Crambin, auf. Obwohl die Sequenzhomologien zum Teil nur 30 %

betragen, nehmen alle Thionine dieselbe Struktur an. Die Thionine besitzen, wie auch 96

Zusammenfassung und Ausblick

die Cystein-reichen Domänen des Minicollagens, ein identische Cysteinmuster. Im

Gegensatz zu ihnen sind ihre Faltung und ihre Disulfidverknüpfung aber identisch. Die

Rückfaltung des Hellethionin D erfolgte im GSH/GSSG Redoxpuffer problemlos und

quantitativ. In zukünftigen detaillierten Rückfaltungsexperimenten wäre auch hier das

Wechselspiel von sequenzabhängiger Faltung und Knüpfung der Disulfidbrücken

interessant, allerdings mit umgekehrten Voraussetzungen im Vergleich zu den

Cystein-reichen Domänen des Minicollagens.

97

6. Material und Methoden

6.1. Allgemeiner Teil

6.1.1. UV-Spektroskopie

Die UV-Spektren wurden am Zweistrahlspektrometer Lambda19 (Perkin Elmer,

Überlingen) aufgenommen und mit dem Programm UV Winlab Version 2.7 (Perkin

Elmer) ausgewertet. Die Chromophorkonzentration wurde so gewählt, dass die

Absorption zwischen 0,1 und 2 Absorptionseinheiten lag. Zur Aufnahme der Spektren

wurden Quarzküvetten aus Quarzglas Suprasil® 114 QS (Hellma, Jena) mit einer

Schichtdicke von 10 mm und Volumina zwischen 200 und 850 µl verwendet. Die

Spektren wurden in einem Wellenlängenbereich von 210-600 nm aufgenommen.

6.1.2. CD-Spektroskopie

Die CD-Spektren wurden an einem J-715 Spektrapolarimeter (Jasco, Groß-

Umstadt) aufgenommen, welches mit einem thermostatisierbaren Küvettenhalter

ausgestattet ist. Prozessierung und Auswertung der Spektren erfolgte mit dem

Programm Spectra Manager for Windows95/NT (Jasco, Groß-Umstadt). Die

Messungen erfolgten im Bereich von 190–260 nm mit einer Quarzküvette aus

Quarzglas Suprasil® 110 QS (Hellma, Jena) mit 1 mm Schichtdicke. Im Bereich von

260–600 nm wurde eine Küvette Quarzglas Suprasil® 110 QS (Hellma, Jena) mit einer

Schichtdicke von 10 mm verwendet. Abhängig von der Konzentration der Proben

wurden die Spektren mit unterschiedlicher Anzahl von Scans aufgenommen. Die

Spektren im Bereich von 190 bis 250 nm wurden in Elliptizität pro Aminosäure

angegeben. Die Elliptizität pro Aminosäure wird mit folgender Formel aus den

Rohdaten berechnet:

[Θ]R = [Θ]/n [deg × cm2 × dmol-1] (1)

Hierbei ist n die Anzahl der Aminosäuren des Peptids.

6.1.3. Analytische HPLC

Für die analytische HPLC standen vier verschiedene Systeme (alle Waters,

Eschborn) zur Verfügung:

98

Material und Methoden

• System I: Pumpen: Waters 616 mit Controller 600S; Autosampler: Waters

717plus; Detektor: Waters 2487 Dual Absorbance Detector; Eluent A: 5 %

Acetonitril und wässrige 95 % H3PO4 (2 %); Eluent B: 90 % Acetonitril und

wässrige 10 % H3PO4 (2 %).

• System II: Pumpen: Waters 600 mit Controller 600E; Autosampler: Waters

717plus; Detektor: Waters 2487 Dual Absorbance Detector; Eluent A: wässrige

TFA (0,1 %); Eluent B: 100 % Acetonitril mit TFA (0,1 %).

• System III: Pumpen und Autosampler: Waters 2690 Alliance; Detektor: Waters

2996 Photo Dioden Array; Eluent A: 5 % Acetonitril und 95 % wässrige H3PO4

(2 %); Eluent B: 90 % Acetonitril und 10 % wässrige H3PO4 (2 %).

• System IV: Pumpen: Waters 515; Autosampler: Waters 717plus; Detektor:

Waters 996 Photo Dioden Array; Eluent A: 5 % Acetonitril und 95 % wässrige

H3PO4 (2 %); Eluent B: 90 % Acetonitril und 10 % wässrige H3PO4 (2 %).

Alle Systeme wurden mit der Millenium32 Software (Waters, Eschborn) bedient.

Auf diesen Systemen wurden folgende analytische Trennsäulen verwendet:

• Nucleosil 100-5 C 8 (Macherey & Nagel, Düren), 125 × 4 mm,

Flussgeschwindigkeit 1,5 ml min-1.

• Nucleosil 100-5 C 18 (Macherey & Nagel, Düren), 250 × 4 mm,

Flussgeschwindigkeit 1 ml min-1.

• Nucleosil 300-5 C 4 (Macherey & Nagel, Düren), 125 × 4 mm,

Flussgeschwindigkeit 1,5 ml min-1.

• Chromolith Performance 3 (Merck, Darmstadt), RP 18e, 100 × 4,8 mm,

Flussgeschwindigkeit 3 ml min-1.

6.1.4. Präparative HPLC

Für die präparative HPLC wurde das analytische System II verwendet, da es

Flussgeschwindigkeiten bis 15 ml min-1 erreicht, sowie ein Gilson System (Gilson,

Frankreich, Villiers le Bel) mit einer Gilson 321 Pumpe, einem Gilson 151 UV/Vis

Detektor und einem Gilson 202 Fraktionskollektor. Als Eluent A wurde wässrige TFA

(0,1 %) und als Eluent B Acetonitril mit TFA (0,1 %) eingesetzt. Das Gilson System

wurde mit dem Programm UniPoint V2.10 (Gilson, Frankreich, Villiers le Bel)

bedient. 99

Material und Methoden

Folgende Trennsäulen wurden verwendet:

• Nucleosil 100-5 C 8 (Macherey & Nagel, Düren), 250 × 21 mm,

Flussgeschwindigkeit 10ml min-1

• Nucleosil 100-5 C 8 (Macherey & Nagel, Düren), 250 × 10 mm,

Flussgeschwindigkeit 6ml min-1

Auf dem System II wurden die Fraktionen manuell anhand der UV-Absorption

gesammelt. Auf dem Gilson System konnten die Fraktionen automatisch gesammelt

werden.

6.1.5. Massenspektrometrie

LC-MS-Massenspektrometrie wurde an einem PE Sciex API165 (PE Sciex,

Langen) Massenspektrometer durchgeführt. Als HPLC-System wurde eingesetzt: Das

Microgradient System 140 C (Applied Biosystems, Forster City CA, USA), PE 785A

UV-Vis Detektor (Perkin Elmer, Überlingen), PE Series 200 Autosampler (Perkin

Elmer) und ein PE Nelson 200 Interface (Perkin Elmer, Überlingen). Als Software

wurde BioMultiView 1.3.1 (PE Sciex, Langen) und als HPLC-Trennsäule eine

Nucleosil 100-5 C 8, 125 × 2 mm mit einer Flussgeschwindigkeit von 250 µl min-1

verwendet. Dabei wurde ein Gradient von 5 % Acetonitril und 95 % wässrige TFA

(0,05 %) nach 90 % Acetonitril und 10 % wässrige TFA (0,05 %) gefahren.

6.1.6. NMR-Spektroskopie

Folgende NMR Spektrometer wurden verwendet:

AMX 400 (Bruker, Rheinstetten), DRX 500 (Bruker, Rheinstetten), DMX 750

(Bruker, Rheinstetten), DM 900 (Bruker, Rheinstetten).

Alle Spektrometer wurden mit dem Programm XWINNMR (Version 3.1 Bruker)

bedient und die Spektren prozessiert. Mit Ausnahme des AMX 400 war eine

Vorkühlung an die Spektrometer angeschlossen, so dass Spektren bis zu Temperaturen

von 0 °C gemessen werden konnten. Die Signalzuordnung wurde mit Hilfe des

Programms Sparky 3 (Goddard and Kneller, 2001) durchgeführt.

100

Material und Methoden

6.2. Azopeptide

Die Synthese und Reindarstellungen der mono- und bizyklischen Azobenzol-

Peptide wurden teilweise veröffentlicht oder werden anderswo beschrieben.

Oxidiertes bizyklisches c[Ala-Cys-Ala-Thr-Cys-Asp-Gly-Phe-AMPB-]

bcAMPB; (Behrendt, 2000): Mr = 1003,4; Peptidgehalt: 83 %.

Oxidiertes bizyklisches c[Lys-Cys-Gly-His-Cys-Lys-Lys-Lys-AMPB-]

Azo-PDI; (Loeweneck, 2005): Mr = 1147,6.

Monozyklisches c[Lys-Ser-(15N)Gly-His-Cys-Lys-Lys-Lys-AMPB-]

Der Amidstickstoff des Gly 3 wurde 15N markiert. Azo-[Ser2, Ser5]-PDI;

(Loeweneck, 2005): Mr = 1118,3.

Oxidiertes bizyklisches c[Lys-Cys-Ala-Thr-Cys-Asp-Lys-Lys-Lys-AMPB-]

Azo-NonaTRR, (Behrendt, unveröffentlichte Ergebnisse): Mr = 1241,5.

In den Fällen, in denen kein Peptidgehalt bekannt war, wurde die

Peptidkonzentration der AMPB-Peptide über den Extinktionskoeffizient des trans-

Isomers bei 335 nm in Wasser (ε = 25.000 M-1 cm-1) bestimmt.

Photoisomerisierung

Die Azopeptide wurden mit einer UV-Lampe (Firma Müller Elektronik-Optik,

Moosinning), ausgestattet mit einem Quarzkondensator, sphärischen Rückspiegeln

sowie einer Blende, belichtet. Als Strahlungsquelle diente eine 450 W XBO

Xenonlampe (Osram, München). Der Lichtstrahl wurde zunächst durch ein H2O-

Reservoir zur Filterung der IR-Strahlung geleitet, um die nachfolgenden UV/Vis-Filter

vor zu starker Erwärmung zu schützen. Anschließend wurde der Lichtstrahl durch

einen Glasfaserlichtleiter mit einer Länge von 3 m und einem Durchmesser von 3 mm

geführt. Für die cis→trans Isomerisierung wurden die Proben bei 450 nm mit einer

Kombination von GG 435 und BG12 Filtern (Itos, Mainz) belichtet. Für die trans→cis

Isomerisierung wurden die Proben bei 350 nm mit einem UG1 Filter (Itos, Mainz)

belichtet. Je nach Konzentration und Isomerenverhältnis betrug die Belichtungszeit

101

Material und Methoden

zwischen 30 sec und 10 min. Die Belichtung erfolgte entweder durch Platzierung der

Probe direkt hinter den Filtern, falls sich die Probe in einem NMR-Röhrchen befand,

oder über den Glasfaserlichtleiter, der auf die Probe gerichtet war. Die Leistung des

aus dem Lichtleiter austretenden Lichtstrahls bei unterschiedlichen Wellenlängen

wurde mit der Photodiode HT 90 (Firma HI-TOP international) bestimmt.

6.2.1. Azo-PDI

NMR-Spektroskopie

Für die Messung von 1H 1D- und 2D-NMR-Spektren wurde eine Peptidlösung mit

einer Konzentration von 3 mM in 450 µl H2O und 50 µl D2O (pH 2,6) verwendet. Für

reine D2O Proben wurde das Peptid lyophilisiert und in 100 % D2O gelöst. Die

Spektren wurden bei Temperaturen zwischen 283 K und 323 K aufgenommen.

1D-Experimente

Für die 1H-1D-Experimente in wässriger Lösung wurden die Pulsprogramme

cr1dwg, mit einer Watergatepulssequenz (Sklenar et al., 1993) zur

Lösungsmittelunterdrückung, oder zgpr (mit einer Vorsättigung zur

Lösungsmittelunterdrückung) verwendet. Im Falle der D2O Proben wurden die

Spektren mit einer schwachen Vorsättigung oder ganz ohne Wasserunterdrückung, je

nach Stärke des residualen Wassersignals, aufgenommen. Alle 1D-Spektren wurden

mit 32 K Datenpunkten aufgenommen und mit 32 K oder 64 K digitalen Datenpunkten

prozessiert. Das aufgenommene Signal wurde mit einer Fouriertransformation in die

Frequenzdomäne transformiert und mit einer Fensterfunktion gefaltet. Als

Fensterfunktion wurde typischerweise eine abfallende Exponentialfunktion mit einer

Zeitkonstante von 1–3 Hz verwendet. Die Signale wurden mit Hilfe der

Phasenkorrektur 0. und 1. Ordnung absorptiv phasiert. Die Basislinie wurde entweder

nach Augenmaß oder durch einen Algorithmus mit einem polynomialen Term 5.

Ordnung korrigiert. Zusätzlich wurde das Lösungsmittelsignal durch einen digitalen

Filter während der Transformation reduziert.

102

Material und Methoden

2D-Experimente

Für die Signalzuordnung der Signale wurden NOESY- (Jeener et al., 179), TOCSY-

(Bax and Davis, 1985a), DQF-COSY- (Rance et al., 1983) und ROESY- (Bax and

Davis, 1985b) Spektren verwendet. Die Wasserunterdrückung erfolgte durch

Vorsättigung des Wassersignals oder durch die Watergate Pulssequenz. Die TOCSY-

Spektren wurden mit acht Scans, 400 Experimenten und einer MLEV Mischsequenz

mit 75 ms Mischzeit auf genommen (Bax and Davis, 1985a). In der indirekten

Richtung wurden 400 Experimente aufgenommen. Auf dem DRX 500 Spektrometer

betrug die spektrale Breite in der direkten Richtung 6000 Hz und in der indirekten

Richtung 5500 Hz. Die ROESY-Spektren wurden mit 192 bzw. 256 Scans und einem

Spinlockpuls von 100 ms aufgenommen (Bax and Davis, 1985b). In der indirekten

Richtung wurden zwischen 800 und 1000 Experimente aufgenommen. Die spektrale

Breite betrug 6000 Hz in der direkten und 5500 Hz in der indirekten Richtung. Die

DQF-COSY-Spektren wurden mit einer spektralen Breite von 6000 Hz in der direkten

und 5500 Hz in der indirekten Richtung aufgenommen. In der indirekten Richtung

wurden 1000 Experimente aufgenommen. Phasensensitivität in der indirekten

Richtung wurde bei allen Spektren durch TPPI erreicht (Marion and Wüthrich, 1982).

Als Fensterfunktion in der direkten und indirekten Richtung wurde eine quadratische

Sinusfunktion bzw. eine Gausfunktion mit exponentiellen und quadratisch

exponentiellen Anteil verwendet.

Auswertung der Spektren

Die resonanzspezifische Zuordnung erfolgte nach der Methode von Wüthrich (Kurt

Wüthrich, 1986). Experimentelle Protonenabstände (ROE) wurden aus den 2D-

ROESY-Spektren gewonnen. 3J Hα-HN-Kopplungskonstanten wurden aus den 1D-

Spektren oder aus den DQF-COSY-Spektren extrahiert. Die Temperaturabhängigkeit

der chemischen Verschiebung wurde aus TOCSY-Spektren bei Temperaturen von 283

K, 293 K und 303 K bestimmt. Deuteriumaustauschraten wurden bei 277 K gemessen,

nachdem die lyophilisierte Probe in D2O auf Eis gelöst wurde. Die Wasserstoffbrücken

der Amidprotonen wurden anhand zweier Kriterien identifiziert:

1) Das Amidproton ist gegen den H/D-Austausch geschützt.

103

Material und Methoden

2) Die Temperaturabhängigkeit der chemischen Verschiebung des Amidprotons

ist weniger negativ als - 5 ppb K-1.

Strukturrechnungen

Die Strukturrechungen und Evaluation wurde mit dem INSIGHTII (Version 98)

Software Packet (Acceclrys, San Diego) auf Silicon Graphics O2 R5000 und Origin

200 Computern durchgeführt. Die ROE Intensitäten wurden mit Hilfe der folgenden

Klassifikation in Protonenabstände umgewandelt: sehr stark (vs) 1.7 -2.3 Å; stark (s),

2.2 -2.8 Å, mittel (m), 2.6 – 3.4 Å; schwach (w) 3.0 -4.0 Å; and sehr schwach (vw) 3.2

– 4.8 Å. Die Pseudoatomabstände wurden wie bei Wüthrich beschrieben (Kurt

Wütherich, 1986) korrigiert. Die 3J Hα-HN-Koppelungskonstanten wurden in

Randbedingungen für die φ-Dihedralwinkel des Peptidrückgrats unter Verwendung der

Karplusbeziehung umgewandelt. Verschiedene diskrete Bereiche wurden für die

Randbedingung der φ-Torsionswinkel verwendet, wenn verschiedene nicht

überlappende Lösungen für die Karplusgleichung existierten. Es wurde ein

experimenteller Fehler von 1 Hz und eine Ungenauigkeit von 5° von den

Karplusparametern angenommen. Die Kraftkonstante für die Distanzrandbedingung

betrug 50 kcal mol-1 Å-2 und 50 kcal mol-1 rad-2 für die Dihedralwinkelrandbedingung.

100 Strukturen wurden in 4 Dimensionen generiert, dann auf 3 Dimensionen mit dem

EMBED Algorithmus (Crippen and Havel, 1988) reduziert und unter Beachtung der

Randbedingungen mit einem „simulated annealing“ Schritt (Nilges et al., 1988)

optimiert. Hierfür wurden Standardprotokolle aus dem DG II Packet des INSIGHT 98

Programm verwendet. Abweichend von dem Standardprotokoll betrug die Temperatur

300 K und die Schrittlänge 1 × 10-14 s. Die 100 Strukturen wurden mit einem MDSA

Protokoll verfeinert. Die nachfolgende initiale Minimierung bestand aus 1000

Schritten mit dem „conjugated gradient“ Algorithmus und aus 500 Schritten mit dem

„steepest descent“ Algorithmus. Um das vorzeitige Abbruchskriterium der

Minimierung zu erfüllen, musste die größte Ableitung kleiner als 1.0 kcal Å1 im Falle

des ersten Algorithmus und 0.1 kcal Å im Falle des zweiten Algorithmus sein. Für die

Minimierung wurden weder ein Morsebindungspotential noch

Vielteilchenwechselwirkungsterme verwendet. Die initiale MD-Rechnung bestand aus

5000 Schritten bei einer Temperatur von 300 K. Danach wurde das System in 10000 104

Material und Methoden

Schritten mit einer Zeitkonstante von 1 ps auf 0 K abgekühlt. Für die MD Simulation

wurde eine Schrittdauer von 1 fs und das CVFF Kraftfeld (Dauber-Osguthorpe et al.,

1988) gewählt. Es wurden weder ein Morsebindungspotential noch

Vielteilchenwechselwirkungsterme verwendet. Die Randbedingungen wurden auf

jeder Stufe der Rechung berücksichtigt. Das Lösungsmittel H2O wurde durch eine

Dielektrizätskonstante von 80.0 simuliert. Um eine ungewollte cis→trans

Isomerisierung zu verhindern wurde ein zusätzliches Torsionspotential für die

Azobindung mit einer Kraftkonstante von 100 kcal mol-1 rad -2 definiert. So konnten

die Moleküle während der Rechung im cis- bzw. im trans-Zustand fixiert werden.

Messung der thermischen cis→trans Relaxation

Die thermische cis→trans Relaxation wurde mittels 1H-1D-Spektren bei 283 K,

303K, 313 K und 323 K bestimmt. Nach der Belichtung wurde die Probe im Magneten

bei konstanter Temperatur im Dunkeln gehalten. 10 bis 30 Spektren wurden innerhalb

der geschätzten Halbwertszeit bei einer Temperatur aufgenommen. Die Abnahme von

gut aufgelösten Signalen des cis-Isomers wurde an eine abfallende exponentielle

Kurve angepasst. Die Aktivierungsenergien wurden aus dem Arrhenius-Diagramm (ln

kcis→trans vs T-1) erhalten.

CD-Spektroskopie

Eine 50 µM Lösung des trans-Isomers in Wasser wurde bei 283 K im CD-

Spektrometer mit vermessen. Die Schichtdicke der Küvette betrug 1 mm. Das

Spektrum wurde zwischen 190-250 nm mit acht Scans aufgenommen. Anschließend

wurde die Probe solange belichtet bis der photostationäre Zustand erreicht wurde. Das

CD-Spektrum des cis-Isomers wurde analog dem des trans-Isomers aufgenommen.

Bestimmung der Gleichgewichtskonstante von Thiol/Disulfidaustauschreaktionen

105

Die Austauschreaktionen wurden in 1,5 ml Eppendorfgefäßen durchgeführt. Die

gewünschte konstante Reaktionstemperatur wurde durch ein mit einem Thermostat

verbundenem Wasserbad auf 0,2 °C genau gewährleistet. Für die Herstellung von

Stammlösungen von GSH, GSSG und Peptid wurden die Substanzen gewogen und in

einem entgasten und mit Argon gesättigten Redoxpuffer (1 mM EDTA, 100mM NaCl,

100 mM Phosphat Puffer, pH 7,0) gelöst. Anschließend wurden die Reaktionslösungen

Material und Methoden

in der gewünschten Konzentration vereinigt und das Reaktionsvolumen mit Puffer auf

300 µl aufgefüllt. Der pH - Wert wurde überprüft und gegebenenfalls mit NaOH und

HCl auf pH 7,0 eingestellt. Das cis/trans-Verhältnis wurde mittels HPLC-Analyse

(System II oder System IV) bestimmt. Um Lösungen des reinen trans-Isomers

einzusetzen, wurde die Peptidstammlösung mehrere Tage bei 30 °C inkubiert. Sollten

trans/cis-Mischungen eingesetzt werden, um simultan beide Isomere zu vermessen,

wurde die Peptidstammlösung für ca. 1-5 min wie oben beschrieben belichtet, und das

cis/trans-Verhältnis wurde mittels HPLC bestimmt.

Quantifizierung der Komponenten im Gleichgewicht

Die Reaktionslösungen wurden mittels HPLC (System II und IV) an einer C18

analysiert. Die UV Absorption wurde bei 210 und 335 nm auf einem dualen UV

Detektor und von 200-600 nm auf einem UV-Photodiodenarray verfolgt. Die

Retentionszeiten der Edukte wurden durch HPLC separat bestimmt. Um die UV-

Signale auf dem HPLC-Elutionsprofil einem Produkt zuordnen zu können wurden die

Reaktionslösungen parallel auf der LC-MS analysiert. Wurde ein Photodiodenarray als

Detektionseinheit verwendet (System IV), konnte anhand der UV-Spektren bereits eine

eindeutig Zuordnung der trans- oder cis-Spezies vorgenommen werden. Unter der

Annahme der gleichmäßigen Elution aller Reaktanten und identischer

Extinktionskoeffizienten der Isomere bei 210 nm, wurden die

Konzentrationsverhältnis aus den Signalintensitäten bei 210 nm berechnet.

Bestimmung der Gleichgewichtskonstante

Zur Bestimmung der Gleichgewichtskonstante wurde das oxidierte Peptid als trans-

oder als eine Mischung trans/cis-Isomer mit GSH/GSSG in verschiedenen

Verhältnissen und Konzentrationen in Redoxpuffer versetzt. Die Peptidkonzentration

betrug in der Reaktionslösung zwischen 0,3 und 0,1 mM bei einem Gesamtvolumen

von 300 µl. GSH/GSSG wurden in verschiedenen Verhältnissen (5, 2,5, 1, 0,5, 0,2)

und im großen Überschuss (40- bis 200 fach zum Peptid) eingesetzt. Die

Redoxreaktion fand unter Argonatmosphäre bei 25 °C statt. Zu unterschiedlichen

Zeitpunkten wurden Proben von 50 µl entnommen und unmittelbar mittels HPLC

analysiert. Je nach GSH/GSSG Konzentration wurde das Gleichgewicht relativ schnell

106

Material und Methoden

erreicht, so dass die Reaktion nach spätestens einer 1 h den Gleichgewichtszustand

erreichte. Obwohl die cis→trans Isomerisierungsraten temperaturabhängig sind und

zwischen den mono- und bizyklischen Peptiden variieren, wurde die

Isomerisierungsrate als langsam im Vergleich zur Austauschreaktionsrate

angenommen und daher von einem annährend konstantem cis/trans

Isomerenverhältnis ausgegangen.

Kox = ([Peptidox] × [GSH]2) / ([Peptidred] × [GSSG]) (2)

E’ = E0’ (Glutathion) – 0,03 × log Kox (3)

Die Gleichgewichtskonstante Kox wurde nach Gleichung 2 bestimmt, während die

Nernstsche Gleichung (Gleichung 3) zur Berechnung des Redoxpotentials eingesetzt

wurde. Dabei wurde als Standardredoxpotential des Glutathions ein Wert von –240

mV (Rost and Rapoport, 1964) verwendet. Die GSH und GSSG

Gleichgewichtskonzentration wurde aufgrund des großen Überschusses mit der

bekannten Anfangskonzentration gleichgesetzt.

6.2.2. Azo-[Ser2, Ser5]-PDI

NMR-Spektroskopie

Für die Messung von 1H-1D-und 2D-NMR-Spektren wurde eine Peptidlösung mit

einer Konzentration von 12 mM in 450 µl H2O und 50 µl D2O pH 2,6 verwendet. 1D-

und 2D-Spektren wurden wie für das Azo-PDI beschrieben aufgenommen. Die

Messung der Geschwindigkeit der thermischen cis→trans Relaxation erfolgte wie für

das Azo-PDI beschrieben.

15N Relaxationsmessungen

Die NMR Dynamik Messungen wurden bei einer Protonenfrequenz von 500 MHz

mit einem triple-Resonanzmesskopf am Bruker DRX 500 gemessen. Modifizierte

Versionen der Experimente von (Farrow et al., 1994) und (Tessari et al., 1997), bei

denen die Wasserunterdrückung durch die Watergate Pulssequenz anstatt durch

Gradientkohärenzenselektion erreicht wurde, wurden benutzt um 15N T1, T2-Zeiten und 107

Material und Methoden

den heteronuklearen NOE zu bestimmen. In den T1 und T2 Experimenten wurde durch

Verwendung von leistungsarmen water-flip-back Pulsen eine Sättigung des

Wassersignals vermieden. Den Richtlinien von (Jones et al., 1996) für 500 MHz

folgend, wurden Relaxationszeiten von 16 ms + n × 160 ms für T2 und 11 ms + n ×

220 ms für T1 mit n = 0, 1, 2, 3, 4 verwendet. Die Sättigung des Amidprotonensignals

im heteronuklearen Experiment wurde durch eine Serie von 120° Pulsen vor dem

eigentlichen Experiment erreicht (Markley et al., 1971).

Die NOE-Werte lassen sich leicht aus dem Verhältnis der Signale von

Experimenten mit und ohne Protonensättigung bestimmen. Um die T2-Werte zu

berechnen, wurden die experimentellen Datenpunkte (Signalhöhen) an eine abfallende

Exponentialfunktion angepasst.

6.2.3. bcAMPB

NMR-Spektroskopie

Für die Messung von 1D- und 2D-NMR-Spektren wurde eine 3 mM Peptidlösung

in deuteriertem d6-DMSO verwendet. Die Spektren wurden bei Temperaturen von 295

K bis 305 K aufgenommen.

1D-Experimente

Für die 1H-1D-Experimente in DMSO wurden die Pulsprogramme zg (ohne

Lösungsmittelunterdrückung) oder zgpr (mit einer Vorsättigung zur

Lösungsmittelunterdrückung) verwendet. Die 1H-1D-Spektren wurden mit 32 K

Datenpunkten aufgenommen. Das aufgenommene Signal wurde mit einer

Fensterfunktion multipliziert und mit einer Fouriertransformation in die

Frequenzdomäne transformiert. Als Fensterfunktion wurde typischerweise eine

abfallende Exponentialfunktion mit einer Zeitkonstante von 1 – 3 Hz verwendet. Die

Signale wurden mit Hilfe der Phasenkorrektur 1. und 2. Ordnung absorptiv phasiert.

Die Basislinie wurde entweder nach Augenmaß oder durch einen Algorithmus mit

einem polynomialen Term 5. Ordnung korrigiert.

108

Material und Methoden

2D-Experimente

Für die Signalzuordnung der Signale wurden NOESY-, TOCSY-, DQF-COSY- und

ROESY-Spektren verwendet. Die Unterdrückung von residualen

Lösungsmittelsignalen erfolgte durch Vorsättigung des Signals. Die TOCSY-Spektren

wurden mit acht Scans, 400 Experimenten und einer MLEV Mischsequenz mit 75 ms

Mischzeit aufgenommen. Die ROESY-Spektren wurden mit 160 bzw. 224 Scans und

einem Spinlockpuls von 100 ms aufgenommen. In der indirekten Richtung wurden

zwischen 600 und 850 Experimente aufgenommen. Die DQF-COSY-Spektren wurden

mit Vorsättigung und in der indirekten Richtung mit 850 Experimenten aufgenommen.

Phasensensitivität in der indirekten Richtung wurde bei den Spektren durch TPPI

erreicht.

Auswertung und Strukturrechnungen

Die Auswertung der Spektren und die Strukturrechnung und Evaluation wurden wie

für das Azo-PDI beschrieben durchgeführt. Abweichend wurde ein experimenteller

Fehler von 0,5 bis 1 Hz für die Kopplungskonstante angenommen. Das Lösungsmittel

DMSO wurde durch eine Dielektrizätskonstante von 46,7 simuliert.

6.2.4. Azo-NonaTRR

NMR-Spektroskopie

Für die Messung von 1H-1D- und 2D-NMR-Spektren wurde eine Peptidlösung mit

einer Konzentration von 5,3 mM in 450 µl H2O und 50 µl D2O (pH 2,6) verwendet,

die Aufnahme und Auswertung der Spektren sowie die Strukturrechnung erfolgte wie

für das Azo-PDI beschrieben. D2O Austauschexperimente wurden nicht durchgeführt.

Bestimmung der Gleichgewichtskonstante

Die Bestimmung des Redoxpotentials erfolgte wie für das Azo-PDI beschrieben.

6.3. Minicollagen

6.3.1. C-terminale Domäne

In Abbildung 78 ist die Sequenz der C-terminalen Domäne gezeigt. N- und C-

Terminus wurden acetyliert bzw. amidiert. 109

Material und Methoden

Ac-Pro-Cys-Pro-Pro-Val-Cys-Val-Ala-Gln-Cys-Val-Pro-Thr-Cys-Pro-Gln-Tyr-

Cys-Cys-Pro-Ala-Lys-Arg-Lys-NH2

Abbildung 78: Sequenz der C-terminalen Domäne des Minicollagens.

Synthese

Die Synthese des linearen reduzierten Rohpeptids erfolgte an einem continues flow-

Synthesizer auf einem Fmoc-Rink-Amide Harz nach der Fmoc/tBu Strategie

(Pokidysheva et al., 2004). Mr = 2633,3; HPLC (SystemI): tr = 8,1 min (>86 %); LC-

MS: m/z = 1317,0 [M+2H]2+, 878,4 [M+3H]3+.

Oxidative Faltung und Aufreinigung

100 mg (38 µmol) des entschützten Rohpeptids (M = 2633,28) wurden in 300 ml 25

mM NH4Ac, pH 8,0 mit 9 Äquivalenten GSSG (208 mg) und einem Äquivalent GSH

(11,6 mg) unter Rühren an der Luft bei 7 °C oxidiert. Der Fortschritt der Reaktion

wurde mittels HPLC (System I) und LC-MS verfolgt. Nach 7 d war die Reaktion

abgeschlossen, das Reaktionsgemisch wurde lyophilisiert, in 2 ml 5 % Essigsäure

gelöst und auf einer präparativen C 8 Trennsäule mit einem linearen Gradienten von

100 % Eluent A auf 100 % Eluent B in 60 min gereinigt und mittels HPLC (System I)

und LC-MS analysiert. Fraktionen mit homogenem Produkt (M=2627,23) wurden

vereinigt und lyophilisiert; Ausbeute 20 mg (20 %); HPLC (SystemI): tr = 6,4 min (70

%); LC-MS: m/z = 1314,4 [M+2H]2+, 876,8 [M+3H]3+.

NMR-Spektroskopie

Für die Messung von 1H-1D- und 2D-NMR Spektren wurde eine Peptidlösung mit

einer Konzentration von 3 mM und 2,3 mM in 450 µl H2O und 50 µl D2O (pH 3,5)

verwendet. Für reine D2O Proben wurde das Peptid lyophilisiert und in 100 % D2O

gelöst. Die Spektren wurden bei Temperaturen zwischen 283 K und 303 K

aufgenommen.

Die Aufnahme der 1H-1D- und 2D-Spektren erfolgte wie für das Azo-PDI

beschrieben. Es wurden TOCSY-, NOESY-, DQF-COSY- und ROESY-Spektren

aufgenommen. Die Spektren wurden bei Temperaturen zwischen 283 K und 303 K

110

Material und Methoden

aufgenommen. NOESY-Spektren wurden mit Mischzeiten von 75, 100 und 200 ms

Mischzeit aufgenommen. Die Anzahl der Scans variierte nach Spektrum und Gerät

zwischen 128 und 256 Scans. Zur Bestimmung des Aggregationsgrades des Peptids

wurden Diffussionsspektren aufgenommen.

Auswertung und Strukturrechnungen

Die Auswertung der Spektren und die Strukturrechungen erfolgten wie für das Azo-

PDI beschrieben. Dihedralwinkelrandbedingungen wurden nicht verwendet. Die

Protonenabstände wurden aus den NOESY-Spektren gewonnen. Zur Bestimmung der

Disulfidverknüpfung wurden zuerst die Strukturen mit offenen Disulfidbrücken

gerechnet. Aus den berechneten Strukturen mit offenen Disulfidbrücken konnte dann

die Disulfidverknüpfung eindeutig bestimmt werden.

CD-Spektroskopie

Die CD-Spektren wurden bei einer Konzentration von 150 µM in Wasser (pH 5) bei

283 K im Wellenlängenbereich von 190-250 nm aufgenommen mit vier Scans bei

einer Schichtdicke von 1 mm. Anschließend wurde eine Schmelzkurve von 283 K bis

363 K aufgenommen. Die Temperatur wurde um 10 K pro 1 h erhöht. Alle 10 K wurde

ein Spektrum von 190 – 250 nm aufgezeichnet.

Vinylpyridin-Derivatisierung

Zu einer 0,96 mM Minicollagen C Probe in 450 µl H2O und 50 µl D2O (pH 3,2)

wurde ein Äquivalent Tris(2-carboxyethyl)phosphin gegeben. Der Fortschritt der

Reduktion wurde mittels 1H-1D-Spektren verfolgt. Nachdem alles Tris(2-

carboxyethyl)phosphin umgesetzt worden war, wurde der pH auf 6,3 eingestellt. Zur

Derivatisierung der freien Thiolgruppen wurde Vinylpyridin im vierfachen Überschuss

zugegeben. Der Fortschritt der Reaktion wurde wiederum im NMR mit 1H-1D-

Spektren verfolgt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Produktverteilung mittels

HPLC, LC-MS und NMR-Spektren analysiert. Zur besseren Vergleichbarkeit mit den

anfänglichen NMR-Spektren wurde der pH-Wert wieder auf 3,2 eingestellt.

111

Material und Methoden

6.3.2. N-terminale Domäne

In Abbildung 79 ist die Sequenz der N-terminalen Domäne gezeigt. N- und C-

Terminus wurden acetyliert bzw. amidiert, um auch an den Termini Amidbindungen

zu erhalten.

Ac-Pro-Cys-Ser-Tyr-Cys-Pro-Ser-Val-Cys-Ala-Pro-Ala-Cys-Ala-Pro-Val-Cys-Cys-

Tyr-Pro-NH2.

Abbildung 79: Sequenz der N-terminalen Domäne des Minicollagens.

Synthese

Die Synthese des linearen reduzierten Rohpeptids erfolgte an einem continues flow-

Synthesizer auf einem Fmoc-Rink-Amide Harz nach der Fmoc/tBu Strategie. Mr =

2132,6; HPLC (SystemI): tr = 7,39; LC-MS: m/z = 1067,2 [M+2H]2+.

Oxidation und Aufreinigung

12 mg (8 µmol) des entschützten Rohpeptids wurden zuerst in 32 ml wässriger 6 M

Guanidiniumchloridlösung gelöst. Danach wurde die Lösung mit 2 Volumen wässriger

0,2 M NaHCO3-Lösung mit 4,5 mM Cystein und 0,45 mM Cystin verdünnt. Die

Reaktion verlief unter Rühren bei Raumtemperatur über Nacht. Der Fortschritt der

Reaktion wurde mittels HPLC (System I) und LC-MS verfolgt. Danach wurde das

Reaktionsgemisch mit Essigsäure angesäuert, filtriert und mittels HPLC (System II)

auf einer semipräparativen C 8 Trennsäule und einem linearen Gradienten von 0 %

Eluent B auf 100 % Eluent B in 60 min gereinigt. Die gesammelten Fraktionen wurden

mittels HPLC und LC-MS analysiert. Fraktionen mit homogenem Produkt

(Mox=2126,6) wurden vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 2 mg (16 %); HPLC

(SystemI): tr = 7,26; LC-MS: m/z = 1063,8 [M+2H]2+. Die Bestimmung der

Peptidkonzentration in Lösung erfolgte über die Tyrosinabsorption bei 275 nm in

Wasser (ε = 1375 M-1 cm-1 je Tyrosin).

112

Material und Methoden

NMR-Spektroskopie

Für die Messung von 1H-1D- und 2D-NMR-Spektren wurde eine Peptidlösung mit

einer Konzentration von 2 mM in 450 µl H2O und 50 µl D2O (pH 3,8) verwendet. Für

reine D2O Proben wurde das Peptid lyophilisiert und in 100 % D2O gelöst. Die

Spektren wurden bei Temperaturen zwischen 283 K und 303 K aufgenommen.

Aufnahme, Auswertung und Strukturrechnungen

Die NMR-Messungen, Auswertungen und Strukturrechnungen wurden wie für die

C-terminale Domäne beschrieben durchgeführt.

6.3.3. N-terminale Domäne mit Propeptide

Ac-Lys-Thr-Leu-His-Glu-Met-Leu-Lys-Arg-Asp-Ala-Asn-Pro-Cys-Gly-Ser-Tyr-

Cys-Pro-Ser-Val-Cys-Ala-Pro-Ala-Cys-Ala-Pro-Val-Cys-Cys-Tyr-Pro-NH2

Abbildung 80: Sequenz der N-terminalen Domäne mit Propeptid.

Synthese

Die Synthese des linearen reduzierten Rohpeptids erfolgte an einem continues flow-

Synthesizer auf einem Fmoc-Rink-Amide Harz nach der Fmoc/tBu Strategie. Mr =

3570,3; HPLC (SystemI): tr = 6,68 min (>90 %); LC-MS: m/z = 1785,8 [M+2H]2+,

1191,2 [M+3H]3+.

Oxidation und Aufreinigung

12 mg (3,3 µmol) des entschützten Peptids (Mr = 3570,3) wurden zuerst in 32 ml 6

M Guanidiniumchloridlösung gelöst. Danach wurde die Lösung mit 2 Volumen 0.2 M

NaHCO3 Lösung mit 4.5 mM Cystein und 0.45 mM verdünnt. Die Reaktion verlief

unter Rühren bei Raumtemperatur über Nacht. Der Fortschritt der Reaktion wurde mit

analytischen HPLC-Läufen auf System I und LC-MS verfolgt. Danach wurde das

Reaktiongemisch mit Essigsäure angesäuert, filtriert und auf dem System II mit der

präparativen C 8 Trennsäule und einem linearen Gradienten von 100 % Eluent A auf

100 % Eluent B in 60 min. gereinigt. Die gesammelten Fraktionen wurden über

analytische HPLC-Läufe und LC-MS geprüft. Fraktionen mit homogenem Produkt

(Mr=3564,3) wurden vereinigt und lyophilisiert. Zusätzlich wurde die korrekte Faltung

113

Material und Methoden

der Produkte mit 1H-1D-NMR Spektren überprüft. Ausbeute 6 mg (50 %). HPLC

(SystemI): tr = 6,76 min; LC-MS: m/z = 1189,2 [M+3H]3+. Die Bestimmung der

Peptidkonzentration in Lösung erfolgte über die Tyrosinabsorption bei 275 nm in

Wasser (ε = 1375 M-1 cm-1 je Tyrosin).

NMR-Spektroskopie

Für die NMR Experimente wurde eine 3,3 mM Proben in 450 µl H2O und 50 µl

D2O (pH 3,8) verwendet. Die 1H-1D- und die TOCSY-, DQF-COSY- und NOESY-

Spektren wurden wie für die C-terminale Domäne beschrieben aufgenommen.

Tryptischer Verdau

1 mg der oxidierten N-terminalen Domäne mit Propeptid wurde in 560 µl H2O/D2O

gelöst. Hierzu wurden 80 µl einer 1 µg/10µl konzentrierten Trypsinlösung (Modified

Sequencing Grade) gegeben. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 8,0 eingestellt. Die

Lösung wurde bei 37 °C über Nacht inkubiert. Die Produktverteilung wurde mittels

HPLC und eines LC-MS analysiert. Von einem Teil des Verdaus wurde direkt ein 1H-

1D- und ein TOCSY-Spektrum aufgenommen. Der andere Teil des Verdaus wurde auf

einer HPLC (System II) mit einer semipräparativen C 8 Säule aufgereinigt. Die

einzelnen Spaltungsprodukte wurden gesammelt und mittels LC-MS identifiziert. Die

Fraktionen des Restpeptids wurden vereinigt, lyophilisiert und in 500 µl H2O/D2O (pH

3,5) gelöst. Anschließend wurden 1H-1D-NMR Spektren aufgenommen.

6.4. Hellethionin D

In Abbildung 81 ist die Sequenz des Hellethionin D gezeigt.

H-Lys-Ser-Cys-Cys-Arg-Asn-Thr-Leu-Ala-Arg-Asn-Cys-Tyr-Asn-Ala-Cys-Arg-

Phe-Thr-Gly-Gly-Ser-Gln-Pro-Thr-Cys-Gly-Ile-Leu-Cys-Asp-Cys-Ile-His-Val-Thr-

Thr-Thr-Thr-Cys-Pro-Ser-Ser-His-Pro-Ser-OH

Abbildung 81: Sequenz des Hellethionin D

Isolierung und Charakterisierung

Das Hellethionin D wurde aus Helleborus purpurascens isoliert und in seiner

Primärstruktur charakterisiert (Kerek 2001, unveröffentlichte Ergebnisse).

114

Material und Methoden

NMR-Spektroskopie

Für die NMR-Experimente wurden 3-5 mM Proteinlösungen in 450 µl H2O und 50

µl D2O (pH 2,8) verwendet. Die Aufnahme der 1H-1D-Spektren erfolgte wie für das

Azo-PDI beschrieben. Bei 283 K, 293 K und 303K wurden die für das Azo-PDI

beschriebenen 1H-2D-Standardspektren zur Strukturbestimmung aufgenommen. Die

TOCSY-Spektren wurden mit einer MLEV Mischsequenz von 75 ms aufgenommen,

während die NOESY-Spektren mit Mischzeiten zwischen 50 – 150 ms gemessen

wurden. Mit Hilfe von NOE-Aufbaukurven von gut separierten Signalen konnte die

Spindiffusion in Abhängigkeit der Mischzeit abgeschätzt werden. Aus den 2D-DQF-

COSY-Spektren und den 1H-1D-Spektren wurden die Kopplungskonstanten extrahiert.

Die Bestimmung der D2O/H2O Austauschraten erfolgt wie für das Azo-PDI

beschrieben.

Die Translationsdiffusionskonstante des Moleküls wurde bei 300 K mit den

Standardspektren von XWINNMR unter Verwendung einer Diffusionverzögerung von

200 ms bestimmt. Die Diffusionskonstante wurde mit der bekannten Diffusion von

H2O in D2O bei 300 K von 18,7 × 10-10 m2 s-1 kalibriert.

Strukturrechnungen

Die Strukturrechnungen erfolgten wie für die C-terminale Domäne beschrieben.

Abweichend wurde das AMBER Kraftfeld (Weiner et al., 1986) für die Rechnungen

verwendet.

Oxidative Rückfaltung

Eine wässrige 1 mM Hellethionin D Lösung (500 µl) wurde durch Zugabe von 14

Äquivalenten Tris(2-carboxyethyl)phosphin quantitativ reduziert. Der Fortschritt der

Reaktion wurde durch 1H-1D-Spektren verfolgt und war nach 24 h bei 50 °C

abgeschlossen. Von verdünnten Lösungen (50 µM) wurden CD-Spektren vor und nach

der Reduktion aufgenommen. Für die Rückfaltungsexperimente wurde das

überschüssige Phosphin durch Gelchromatographie an einer NAP-5 Säule (Pharmacia,

Erlangen) entfernt und das Peptid mit 50 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,2) eluiert. Die

Rückfaltung der 0,5 mM reduzierten Proteinlösung erfolgte über Nacht bei 37 °C in 50

mM Tris-HCl Puffer an der Luft. Alternative erfolgte die Rückfaltung unter

115

Material und Methoden

identischen Bedingungen aber in Gegenwart von Glutathion mit einem

GSSG:GSH:Peptid-Verhältnis von 100:10:1. 1H-1D-NMR Spektren dienten zur

Bestimmung der Ausbeute, wobei die Spektren mit denen des gefalteten und

entfalteten Peptids verglichen wurden. Die Ausbeute wurde aus den Signalintensitäten

der HPLC (SystemI) Elutionsprofile bestimmt.

Proteasominhibitoren

TMC 416

NMR-Spektroskopie

Die NMR-Messungen wurden mit einer 2 mM Probe in 500 µl d6-DMSO

durchgeführt. Für die Strukturbestimmung wurden TOCSY-Spektren mit 75 ms

Mischzeit und einer MLEV Mischsequenz, DQF-COSY-Spektren, ROESY-Spektren

mit einer Mischzeit von 200 ms und 1D-Spektren mit Vorsättigung bei 295 K

aufgenommen.

Strukturrechnung

Die Strukturrechnung erfolgte wie für das Azo-PDI beschrieben. Das Lösungsmittel

DMSO wurde mit einer Dielektrizitätskonstante von 46,7 simuliert.

BIA 49

Die NMR-Messungen wurden mit einer 3 mM Probe in 300 µl d6-DMSO

durchgeführt. Aufnahme der NMR-Spektren und Strukturrechnung erfolgten wie unter

TMC 416 beschrieben.

116

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8. Anhang A: Resonanzlisten

Tabelle 11: Protonenresonanzfrequenzen des trans-bcAMPB in DMSO bei 295K in ppm

AS NH Hα Hβ Hγ andere Ala 1 8,86 4,49 1,32 Cys 2 7,48 4,57 3,28;

2,85

Ala 3 8,87 4,09 1,34 Thr 4 7,14 4,14 4,25 0,96 Cys 5 7,03 4,42 2,85 Asp 6 8,12 4,51 2,43 Gly 7 7,89 3,66;

3,46

Phe 8 8,31 4,45 2,95; 2,77

H�/H�/H� 7,22; 7,17

AMPB HN 8,71, HM1/HM2 4,53; 3,96, H2/H6 7,92, H3/H5 8,04, H8/H12 7,83, H9/H11 7,47

Tabelle 12: Protonenresonanzfrequenzen des cis-bcAMPBs in DMSO bei 295 K in ppm

AS NH Hα Hβ Hγ andere Ala 1 8,75 4,56 1,36 Cys 2 8,24 4,59 3,22;

3,13

Ala 3 8,96 4,16 1,41 Thr 4 7,24 4,26 4,17 1,05 Cys 5 7,11 4,59 3,13 Asp 6 8,44 4,55 2,73;

2,56

Gly 7 8,09 3,60; 3,82

Phe 8 8,17 4,57 3,07; 2,90

Hδ/Hε/Hζ 7,29

AMPB HN 8,59, HM1/HM2 4,31; 4,26, H2/H6 7,02, H3/H5 7,90, H8/H12 6,87, H9/H11 7,06

Tabelle 13: Protonenresonanzfrequenzen des trans-Azo-[Ser2, Ser5]-PDI in Wasser bei 283 K in ppm

AS NH Hα Hβ Hγ andere Lys 1 8,76 4,19 1,71 1,31 Hε 2,73 Ser 2 8,26 4,19 3,64 Gly 3 8,19 3,86

3,50

His 4 7,91 4,36 2,85; 2,75

Hδ 6,83, Hε 8,20

Ser 5 8,23 3,96 3,47; 3,41

126

Anhang A: Resonanzlisten

Lys 6 8,10 3,96 1,13 0,98; 0,89

Hε 2,52

Lys 7 7,79 3,92 1,38; 1,24

0,98 Hε 2,55

Lys 8 8,03 4,00 1,56; 1,50

Hε 2,71

AMPB HN 8,49, HM1/HM2 4,31; 4,08, H2/H6 7,60, H3/H5 7,89, H8/H12 7,64, H9/H11 7,22

Tabelle 14: Protonenresonanzfrequenzen des cis-Azo-[Ser2, Ser5]-PDI in Wasser bei 288 K in ppm

AS NH Hα Hβ Hγ andere Lys 1 8,64 4,31 1,73;

1,67 1,29 Hδ 1,48, Hε 2,78

Ser 2 8,29 4,26 3,65 Gly 3 8,40 3,80;

3,66

His 4 8,44 4,51 3,13; 2,95

Hδ 7,06, Hε 8,38

Ser 5 8,07 4,27 3,66; 3,57

Lys 6 8,34 4,07 1,65; 1,52

1,23 Hδ 1,44, Hε 2,76

Lys 7 7,89 4,01 1,43, 1,33

1,03 Hδ 1,30, Hε 2,61

Lys 8 8,14 3,97 1,55 1,18 Hδ 1,43, Hε 2,75 AMPB HN 8,28, HM1/HM2 4,19; 4,11, H2/H6 6,85, H3/H5 7,54, H8/H12 6,75,

H9/H11 7,01

Tabelle 15: Protonenresonanzfrequenzen des trans-Azo-PDI in Wasser bei 283K in ppm

AS NH Hα Hβ Hγ andere Lys 1 8,9 4,2 1,70 1,28 Hδ 1,50; Hε 2,77 Cys 2 7,7 4,5 3,28;

2,70

Gly 3 8,5 3,6; 3,5

His 4 8,4 4,5 3,11; 2,93

Hδ 7,04; Hε 8,35

Cys 5 7,4 4,3 2,81; 2,74

Lys 6 8,2 3,9 1,33 0,95 Hδ 1,33, Hε 2,65 Lys 7 7,8 3,9 0,79 0,62;

0,53 Hδ 0,96; 0,89, Hε 2,13

Lys 8 7,9 3,9 1,52; 1,43

1,10 Hε 2,73

AMPB HN 8,47, HM1/HM2 4,23; 4,10, H2/H6 7,70, H3/H5 7,81, H8/H12 7,68, H9/H11 7,30

127

Anhang A: Resonanzlisten

Tabelle 16: Protonenresonanzfrequenzen des cis-Azo-PDI in Wasser bei 283 K in ppm

AS NH Hα Hβ Hγ andere Lys 1 8,47 4,10 1,52;

1,41 1,06;

1,00 Hδ 1,26; Hε 2,54

Cys 2 8,00 4,32 2,87; 2,78

Gly 3 8,54 3,48; 3,40

His 4 8,24 4,36 2,94; 2,79

Cys 5 7,52 4,22 2,80; 2,59

Lys 6 8,18 3,75 1,41; 1,34

1,06; 0,98

Hδ 1,26; Hε 2,57

Lys 7 7,65 3,82 1,29; 1,23

0,88; 0,79

Hδ 1,11; Hε 2,44

Lys 8 7,97 3,81 1,30 0,92 Hδ 1,20; Hε 2,44 AMPB HN 8,10, HM1/HM2 3,94, H2/H6 6,64, H3/H5 7,31, H8/H12 6,54, H9/H11

6,80

Tabelle 17: Protonenresonanzfrequenzen des trans-Azo-NonaTRR in Wasser bei 283 K in ppm

AS HN Hα Hβ Hγ andere Lys 1 8,94 4,31 1,81;

1,71 1,35;

1,38 Hδ 1,49, Hε 2,75

Cys 2 7,50 4,77 3,11 Ala 3 8,87 3,98 1,28 Thr 4 7,60 4,27 4,25 0,89 Cys 5 7,23 3,93 2,60;

1,75

Asp 6 7,96 4,22 2,58 Lys 7 7,26 3,97 1,27;

0,86 0,76 Hδ 1,15, Hε 2,57

Lys 8 7,75 3,89 1,42; 1,30

0,95 Hδ 1,29, Hε 2,75

Lys 9 7,81 4,11 1,57; 1,47

1,20; 1,15

Hδ 1,42, Hε 2,75

AMPB HN 8,55, HM1/HM2 4,20; 4,10, H2/H6 7,74, H3/H5 7,84, H8/H12 7,72, H9/H11 7,23

Tabelle 18: Protonenresonanzfrequenzen der C-terminalen Domäne in Wasser bei 283 K in ppm

AS NH Hα Hβ Hγ andere PRO 1 4,22 2,04;

1,67 1,75 Hδ 3,39

Cys 2 8,63 4,70 2,65; 2,47

128

Anhang A: Resonanzlisten

Pro 3 4,52 2,27; 1,78

1,87 Hδ 3,92; 3,41

Pro 4 4,01 2,14; 1,75

1,84 Hδ 3,66

Val 5 7,71 3,86 2,02 0,81; 0,71

Cys 6 7,52 4,49 2,93; 2,59

Val 7 7,08 3,53 1,84 0,78; 0,73

Ala 8 7,81 4,02 1,25 Gln 9 7,85 4,09 1,72 2,04;

1,92

Cys 10 8,59 4,67 2,97; 2,72

Val 11 7,16 4,36 2,22 0,71; 0,64

Pro 12 4,13 2,17; 1,69

1,74 Hδ 3,62; 3,54

Thr 13 6,84 3,93 4,20 Cys 14 7,91 4,38 2,96;

2,39

Pro 15 4,07 1,82; 0,81

1,76 Hd 3,92; 3,23

Gln 16 8,82 3,67 1,85 2,18 Tyr 17 6,81 4,28 3,11;

2,68 Hδ 6,77; Hε 6,59

Cys 18 7,37 4,29 2,97; 2,62

Cys 19 7,28 4,64 3,14; 2,96

Pro 20 4,11 2,07; 1,67

1,76 Hδ 3,69; 3,42

Ala 21 8,22 4,60 1,14 Lys 22 8,11 4,04 n.a. Hε 2,75 Arg 23 8,13 4,06 1,60;

1,54 1,39 Hδ 2,95; Hε 6,96; Hζ 6,67;

6,24 Lys 24 8,26 4,60 1,53 1,20 Hδ 1,43 Hε 2,75; Hζ 7,34

Tabelle 19: Protonenresonanzfrequenzen der N-terminalen Domäne in Wasser bei 283 K in ppm

AS NH Hα Hβ Hγ andere Pro 1 4,23 2,26; 1,77 1,97 Hδ 3,55 Cys 2 8,51 5,02 3,27; 2,24 Gly 3 7,83 4,23;

3,73

Ser 4 8,60 3,95 3,36; 3,20 Tyr 5 8,13 4,52 3,16; 2,70 Hδ 6,95; Hε 6,68 Cys 6 7,06 4,78 3,06; 2,43

129

Anhang A: Resonanzlisten

Pro 7 4,22 2,28; 1,98 2,01 Hδ 3,98; 3,83 Ser 8 8,67 3,79 3,82 Val 9 7,58 4,01 2,15 0,82 Cys 10 7,53 4,61 2,20; 1,84 Ala 11 7,78 3,96 1,32 Pro 12 4,31 2,20; 1,84 2,03;172 Hδ 3,66; 3,30 Ala 13 8,71 4,01 1,40 Cys 14 8,56 3,56 2,99; 2,86 Ala 15 9,34 4,35 1,29 Pro 16 4,10 2,34 2,10 H� 3,83; 3,78 Val 17 7,63 3,86 1,98 0,84; 0,76 Cys 18 7,29 4,24 3,26; 2,81 Cys 19 8,23 4,40 2,39 Tyr 20 8,19 4,89 2,89; 2,81 Hδ 7,05; Hε 6,66 Pro 21 4,29 1,83 2,20 Hδ 3,43

Tabelle 20: Protonenresonanzfrequenzen des trans-rgd1 in Wasser bei 303 K in ppm

AS NH Hα Hβ Hγ andere Lys 1 8,8 4,49 1,96;

1,94 1,59 Hδ 1,77; Hε 3,02

Ala 2 8,03 4,50 1,35 Arg 3 7,88 4,07 1,65;

1,57 1,43; 1,29 Hδ 2,97 Hε 6,97

Gly 4 7,59 3,97; 3,43

Asp 5 8,08 4,42 2,55 d-Phe 6 7,98 4,41 2,88;

2,47 Hδ/Hε/Hζ 7,14

Val 7 7,98 3,91 1,96 0,89; 0,78 AMPB HN 8,70, HM1/HM2 4,52; 4,37, H2/H6 7,75 H3/H5 7,97, H8/H12 7,86,

H9/H11 7,50

Tabelle 21: Protonenresonanzfrequenzen des cis- rgd1 in Wasser bei 303 K in ppm

AS NH Hα Hβ Hγ andere Lys 1 8,56 4,34 1,91 1,50 Hδ 1,72, Hε 3,01 Ala 2 8,37 4,29 1,38 Arg 3 8,11 4,31 1,87; 1,71 1,50 Hδ 3,02, Hε 7,12 Gly 4 8,25 3,92;

3,86

Asp 5 8,20 4,57 2,67 d-Phe 6 8,09 4,55 3,06; 2,99 Hδ/Hε/Hζ 7,33 Val 7 7,80 3,96 1,99 0,74; 0,69 AMPB HN 8,52, HM1/HM2 4,37; 4,31, H2/H6 6,99, H3/H5 7,69, H8/H12 6,93,

H9/H11 7,25

Tabelle 22: Protonenresonanzfrequenzen des tmc416 in DMSO bei 295 K in ppm

130

Anhang A: Resonanzlisten

AS NH Hα Hβ Hγ andere Tyr 1 5,96 4,49 3,09; 2,96 Hδ 7,12, Hδ/Hε 6,95 Leu 2 8,75 4,23 1,59; 1,52 1,72 Hδ 0,87 Trp 3 8,20 3,86 2,49; 2,41 3,60 Hδ 7,12, Hε 6,95 NLeu 4 7,05 4,17 1,59; 1,45 1,18 Hδ 0,86 NH2 7,38

Tabelle 23: Protonenresonanzfrequenzen des bia49 in DMSO bei 295 K in ppm

AS NH Hα Hβ Hγ andere Phe 1 6,24 4,44 3,08; 2,78 Hδ 6,01; 6,66, Hε 7,81 Asn 2 8,26 4,53 2,43 Tyr 3 8,21 4,46 3,24; 2,55 Hδ 7,41; 7,30, Hε 7,09;

6,82 AP 4 8,10 3,08 1,47 0,86

Tabelle 24 Temperaturverschiebung von NH Protonen der C-terminalen Domäne, deren Temperaturverschiebung positiver als -4,5 bbp K-1 ist.

AS Temperaturverschiebung der NH Resonanz in ppb K-1

Cys 6 -3 Val 7 -3 Gln 9 -2,4 Val 11 -4,2 Thr 13 -1,7 Cys 14 -1,4 Cys 18 -1,0 Cys 19 -3,5

Tabelle 25: Temperaturverschiebung von NH Protonen der N-terminalen Domäne, deren Temperaturverschiebung positiver als -4,5 bbp K-1 ist.

AS Temperaturverschiebung der NH Resonanz in ppb K-1

Cys 6 -2,9 Glu 9 -2,4 Thr 13 -1,6 Cys 14 -1,3 Cys 18 -1,5 Cys 19 -3,5

131

9. Anhang B: NMR-Randbedingungen

trans -bcAMPB !BIOSYM restraint 1 #NOE_distance !Peaks aus dem 750MHz roesy !ATOM #1 ATOM#2 Distance Force Constant Max ! Lower Upper Upper Lower Upper Force ! +correction 1:BENZ_1F:H2,H4 1:ALA_1:HN 1 5.5 2.3 50 50 1000 1:CYS_2:HN 1:ALA_1:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:ALA_1:HA 1:CYS_2:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:ALA_1:HB* 1:CYS_2:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:CYS_2:HB2 1:CYS_2:HA 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:CYS_2:HB1 1:CYS_2:HA 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:CYS_2:HB2 1:CYS_2:HN 1 4 4 50 50 1000 1:CYS_2:HB1 1:CYS_2:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:CYS_2:HA 1:ALA_3:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:CYS_2:HB2 1:ALA_3:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:THR_4:HN 1:ALA_3:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:CYS_5:HN 1:THR_4:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:ALA_3:HA 1:THR_4:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:CYS_2:HB2 1:THR_4:HN 1 4 4 50 50 1000 1:ALA_3:HB* 1:THR_4:HN 1 3.9 2.8 50 50 1000 1:ALA_3:HA 1:CYS_5:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:THR_4:HA 1:CYS_5:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:THR_4:HB 1:CYS_5:HN 1 4 4 50 50 1000 !1:ASP_6:HN 1:CYS_5:HN 1 4.9 4.9 50 50 1000 1:CYS_5:HA 1:ASP_6:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:CYS_5:HB2 1:ASP_6:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:CYS_5:HB1 1:ASP_6:HN 1 4.9 4.9 50 50 1000 1:ASP_6:HA 1:GLY_7:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:CYS_5:HA 1:GLY_7:HN 1 4 4 50 50 1000 1:ASP_6:HB* 1:GLY_7:HN 1 5.8 4.9 50 50 1000 1:GLY_7:HA1 1:GLY_7:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:GLY_7:HA2 1:GLY_7:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:GLY_7:HA1 1:PHE_8:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:GLY_7:HA2 1:PHE_8:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:PHE_8:HB1 1:PHE_8:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:PHE_8:HB2 1:PHE_8:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:PHE_8:HA 1:AMDE_1B:H1 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:PHE_8:HB2 1:AMDE_1B:H1 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:AMDE_1B:H1 1:BENZ_1D:H5,H1 1 5 2.8 50 50 1000 1:METH_1C:H1* 1:BENZ_1D:H5,H1 1 5.9 2.8 50 50 1000 1:ASP_6:HA 1:BENZ_1D:H2,H4 1 6.2 4 50 50 1000 1:CYS_5:HB2 1:BENZ_1D:H2,H4 1 7 4.8 50 50 1000 1:ALA_1:HA 1:BENZ_1F:H2,H4 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:ALA_1:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.3 4 50 50 1000 1:CYS_5:HB2 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.2 4.0 50 50 1000 !1:CYS_5:HB1 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7 4.8 50 50 1000 !1:CYS_2:HB1 1:BENZ_1F:H2,H4 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:CYS_2:HB2 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7 4.8 50 50 1000 1:CYS_5:HB2 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7 4.8 50 50 1000 #mixing_times -9.990000E+02 ! #3J_dihedral 1:THR_4:HN 1:THR_4:N 1:THR_4:CA 1:THR_4:HA 9.30 0.50 50.00 50.00 500.000 152.0 -152.0 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:CYS_5:HN 1:CYS_5:N 1:CYS_5:CA 1:CYS_5:HA 7.50 0.50 50.00 50.00 500.000 134.5 163.2 -163.2 -134.5 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ASP_6:HN 1:ASP_6:N 1:ASP_6:CA 1:ASP_6:HA 8.20 0.50 50.00 50.00 500.000 140.4 170.8 -170.8 -140.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:GLY_7:HN 1:GLY_7:N 1:GLY_7:CA 1:GLY_7:HA1 4.70 1.00 50.00 50.00 500.000 16.5 57.3 109.0 144.5 -144.5 -109.0 -57.3 -16.5 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:GLY_7:HN 1:GLY_7:N 1:GLY_7:CA 1:GLY_7:HA2 4.70 1.00 50.00 50.00 500.000 16.5 57.3 109.0 144.5 -144.5 -109.0 -57.3 -16.5 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:PHE_8:HN 1:PHE_8:N 1:PHE_8:CA 1:PHE_8:HA 8.20 0.50 50.00 50.00 500.000 140.4 170.8 -170.8 -140.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500

132

Anhang B: NMR-Randbedingungen

1:AMDE_1B:H1 1:AMDE_1B:N1 1:METH_1C:C1 1:METH_1C:H12 5.80 0.50 50.00 50.00 500.000 8.4 41.1 121.5 149.0 -149.0 -121.5 -41.1 -8.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:AMDE_1B:H1 1:AMDE_1B:N1 1:METH_1C:C1 1:METH_1C:H11 5.80 0.50 50.00 50.00 500.000 8.4 41.1 121.5 149.0 -149.0 -121.5 -41.1 -8.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500

cis-bcAMPB !BIOSYM restraint 1 ! #remote_prochiral_center ! #NOE_distance 1:BENZ_1F:H2,H4 1:ALA_1:HN 1.000 4.400 2.200 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:CYS_2:HN 1:ALA_1:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:ALA_1:HA 1:CYS_2:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:ALA_1:HB* 1:CYS_2:HN 1.000 4.500 3.400 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:CYS_2:HA 1:ALA_3:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:CYS_2:HB* 1:ALA_3:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:THR_4:HN 1:ALA_3:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:ALA_3:HB* 1:THR_4:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:CYS_5:HN 1:THR_4:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:THR_4:HA 1:CYS_5:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:THR_4:HB 1:CYS_5:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:THR_4:HG2* 1:CYS_5:HN 1.000 5.900 4.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:CYS_5:HA 1:ASP_6:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:CYS_5:HB* 1:ASP_6:HN 1.000 3.700 2.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:THR_4:HN 1:ASP_6:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:GLY_7:HN 1:ASP_6:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:ASP_6:HA 1:GLY_7:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:ASP_6:HB* 1:GLY_7:HN 1.000 4.900 4.000 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:CYS_5:HB* 1:GLY_7:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:GLY_7:HA* 1:PHE_8:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:PHE_8:HA 1:AMDE_1B:H1 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:PHE_8:HB* 1:AMDE_1B:H1 1.000 4.900 4.000 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:BENZ_1D:H1,H5 1:AMDE_1B:H1 1.000 5.600 3.400 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:METH_1C:H1* 1:BENZ_1D:H1,H5 1.000 5.400 2.300 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:PHE_8:HB* 1:BENZ_1D:H1,H5 1.000 7.100 4.000 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:PHE_8:HA 1:BENZ_1D:H1,H5 1.000 6.200 4.000 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:ALA_1:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1.000 6.500 3.400 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:ALA_1:HB* 1:BENZ_1F:H1,H5 1.000 8.200 4.900 50.00 50.00 1000.000 0.00 ! #mixing_times -9.990000E+02 ! #3J_dihedral 1:ALA_1:HN 1:ALA_1:N 1:ALA_1:CA 1:ALA_1:HA 7.50 0.50 50.00 50.00 500.000 134.5 163.2 -163.2 -134.5 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:CYS_2:HN 1:CYS_2:N 1:CYS_2:CA 1:CYS_2:HA 7.30 0.50 50.00 50.00 500.000 132.9 161.3 -161.3 -132.9 -17.4 17.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ALA_3:HN 1:ALA_3:N 1:ALA_3:CA 1:ALA_3:HA 5.20 0.50 50.00 50.00 500.000 16.5 47.4 116.9 144.5 -144.5 -116.9 -47.4 -16.5 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:CYS_5:HN 1:CYS_5:N 1:CYS_5:CA 1:CYS_5:HA 7.50 1.00 50.00 50.00 500.000 130.6 168.4 -168.4 -130.6 -24.9 24.9 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ASP_6:HN 1:ASP_6:N 1:ASP_6:CA 1:ASP_6:HA 7.80 0.50 50.00 50.00 500.000 137.0 166.2 -166.2 -137.0 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:GLY_7:HN 1:GLY_7:N 1:GLY_7:CA 1:GLY_7:HA1 5.60 0.50 50.00 50.00 500.000 11.4 43.2 120.0 147.5 -147.5 -120.0 -43.2 -11.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:GLY_7:HN 1:GLY_7:N 1:GLY_7:CA 1:GLY_7:HA2 5.60 0.50 50.00 50.00 500.000 11.4 43.2 120.0 147.5 -147.5 -120.0 -43.2 -11.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:PHE_8:HN 1:PHE_8:N 1:PHE_8:CA 1:PHE_8:HA 8.00 0.50 50.00 50.00 500.000 138.7 168.4 -168.4 -138.7 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:AMDE_1B:H1 1:AMDE_1B:N1 1:METH_1C:C1 1:METH_1C:H12 5.80 0.50 50.00 50.00 500.000 8.4 41.1 121.5 149.0 -149.0 -121.5 -41.1 -8.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:AMDE_1B:H1 1:AMDE_1B:N1 1:METH_1C:C1 1:METH_1C:H11 5.80 0.50 50.00 50.00 500.000 8.4 41.1 121.5 149.0 -149.0 -121.5 -41.1 -8.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500

Azo-[Ser2, Ser5]-PDI

133!BIOSYM restraint 1

Anhang B: NMR-Randbedingungen

#NOE_distance !ATOM #1 ATOM#2 Distance Force Constant Max ! Lower Upper Upper Lower Upper Force ! +correction 1:BENZ_1F:H1,H5 1:LYS+_1:HN 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:BENZ_1F:H2,H4 1:LYS+_1:HN 1 4.5 2.3 50 50 1000 1:SER_2:HN 1:LYS+_1:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:LYS+_1:HN 1 4.9 4.0 50 50 1000 1:LYS+_1:HA 1:SER_2:HN 1 4.0 4.0 50 50 1000 1:LYS+_1:HB* 1:SER_2:HN 1 3.7 2.8 50 50 1000 1:LYS+_1:HG* 1:SER_2:HN 1 4.9 4.0 50 50 1000 1:BENZ_1F:H2,H4 1:SER_2:HN 1 6.2 4.0 50 50 1000 1:SER_2:HA 1:GLY_3:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:SER_2:HB* 1:GLY_3:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:BENZ_1F:H2,H4 1:GLY_3:HN 1 7.0 4.8 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:HIS+_4:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:SER_2:HA 1:HIS+_4:HN 1 4.0 4.0 50 50 1000 1:SER_2:HB* 1:HIS+_4:HN 1 4.9 4.0 50 50 1000 1:GLY_3:HN 1:HIS+_4:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:HIS+_4:HA 1:SER_5:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:SER_5:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:HIS+_4:HN 1:SER_5:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:LYS+_6:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HN 1:LYS+_6:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:LYS+_6:HA 1:LYS+_7:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:LYS+_7:HN 1 4.9 4.0 50 50 1000 1:LYS+_8:HN 1:LYS+_7:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HA 1:LYS+_8:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:LYS+_8:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_8:HA 1:AMDE_1B:H1 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:LYS+_8:HB* 1:AMDE_1B:H1 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_8:HN 1:AMDE_1B:H1 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:LYS+_6:HB* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HG* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_8:HA 1:BENZ_1D:H1,H5 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_6:HA 1:BENZ_1D:H2,H4 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:SER_5:HA 1:BENZ_1F:H1,H5 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:HIS+_4:HA 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.0 4.8 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_1:HN 1:BENZ_1F:H1,H5 1 5.0 2.8 50 50 1000 1:LYS+_1:HN 1:BENZ_1F:H2,H4 1 4.5 2.3 50 50 1000 1:LYS+_1:HA 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.2 4.0 50 50 1000 1:HIS+_4:HA 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.2 4.0 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.1 4.0 50 50 1000 ! #mixing_times -9.990000E+02 ! #3J_dihedral 1:LYS+_1:HN 1:LYS+_1:N 1:LYS+_1:CA 1:LYS+_1:HA 5.65 0.50 50.00 50.00 500.000 -180.0 180.0 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:SER_2:HN 1:SER_2:N 1:SER_2:CA 1:SER_2:HA 6.26 0.50 50.00 50.00 500.000 84.9 -84.9 -75.8 75.8 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:HIS+_4:HN 1:HIS+_4:N 1:HIS+_4:CA 1:HIS+_4:HA 6.71 0.50 50.00 50.00 500.000 88.3 -88.3 -69.8 69.8 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:SER_5:HN 1:SER_5:N 1:SER_5:CA 1:SER_5:HA 6.41 0.50 50.00 50.00 500.000 86.1 -86.1 -73.9 73.9 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_6:HN 1:LYS+_6:N 1:LYS+_6:CA 1:LYS+_6:HA 7.48 0.50 50.00 50.00 500.000 94.3 -94.3 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_7:HN 1:LYS+_7:N 1:LYS+_7:CA 1:LYS+_7:HA 6.41 1.00 50.00 50.00 500.000 82.3 -82.3 -79.9 79.9 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_8:HN 1:LYS+_8:N 1:LYS+_8:CA 1:LYS+_8:HA 6.71 1.00 50.00 50.00 500.000 84.6 -84.6 -76.4 76.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500

cis-Azo-[Ser2, Ser5]-PDI !BIOSYM restraint 1 #NOE_distance !ATOM #1 ATOM#2 Distance Force Constant Max ! Lower Upper Upper Lower Upper Force ! +correction 1:BENZ_1F:H2,H4 1:LYS+_1:HN 1 4.5 2.3 50 50 1000

134

Anhang B: NMR-Randbedingungen

1:SER_2:HN 1:LYS+_1:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:LYS+_1:HN 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:LYS+_1:HA 1:SER_2:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:LYS+_1:HB* 1:SER_2:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_1:HG* 1:SER_2:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_1:HE* 1:SER_2:HN 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:SER_2:HA 1:GLY_3:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:SER_2:HN 1:GLY_3:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:HIS+_4:HN 1 3.7 2.8 50 50 1000 1:SER_2:HA 1:HIS+_4:HN 1 4.0 4.0 50 50 1000 1:HIS+_4:HA 1:SER_5:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:SER_5:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:HIS+_4:HN 1:SER_5:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:SER_5:HN 1 4.9 4.0 50 50 1000 1:LYS+_6:HN 1:SER_5:HN 1 4.0 4.0 50 50 1000 1:HIS+_4:HA 1:LYS+_6:HN 1 4.8 4.8 50 50 1000 1:SER_5:HA 1:LYS+_6:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:LYS+_6:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HN 1:LYS+_6:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:LYS+_6:HA 1:LYS+_7:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:LYS+_6:HB* 1:LYS+_7:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_6:HG* 1:LYS+_7:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:LYS+_7:HN 1 4.9 4.0 50 50 1000 1:LYS+_8:HN 1:LYS+_7:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HA 1:LYS+_8:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:LYS+_8:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HG* 1:LYS+_8:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:BENZ_1D:H1,H5 1:LYS+_8:HN 1 6.2 4.0 50 50 1000 1:LYS+_8:HA 1:AMDE_1B:H1 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:LYS+_8:HB* 1:AMDE_1B:H1 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_8:HN 1:AMDE_1B:H1 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:BENZ_1D:H1,H5 1:AMDE_1B:H1 1 5 2.8 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HG* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HE* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:LYS+_8:HA 1:BENZ_1D:H1,H5 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HE* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HG* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:LYS+_8:HA 1:BENZ_1D:H2,H4 1 6.2 4.0 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.1 4.0 50 50 1000 ! #mixing_times -9.990000E+02 ! #3J_dihedral 1:LYS+_1:HN 1:LYS+_1:N 1:LYS+_1:CA 1:LYS+_1:HA 6.56 0.50 50.00 50.00 500.000 87.2 -87.2 -71.9 71.9 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:HIS+_4:HN 1:HIS+_4:N 1:HIS+_4:CA 1:HIS+_4:HA 7.48 0.50 50.00 50.00 500.000 94.3 -94.3 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:SER_5:HN 1:SER_5:N 1:SER_5:CA 1:SER_5:HA 7.17 0.50 50.00 50.00 500.000 91.9 -91.9 -61.2 61.2 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_6:HN 1:LYS+_6:N 1:LYS+_6:CA 1:LYS+_6:HA 6.87 0.50 50.00 50.00 500.000 89.6 -89.6 -67.2 67.2 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_7:HN 1:LYS+_7:N 1:LYS+_7:CA 1:LYS+_7:HA 6.71 1.00 50.00 50.00 500.000 84.6 -84.6 -76.4 76.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_8:HN 1:LYS+_8:N 1:LYS+_8:CA 1:LYS+_8:HA 6.56 1.00 50.00 50.00 500.000 83.4 -83.4 -78.2 78.2 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500

trans-Azo-PDI !BIOSYM restraint 1 #NOE_distance !ATOM #1 ATOM#2 Distance Force Constant Max ! Lower Upper Upper Lower Upper Force ! +correction 1:BENZ_1D:H1,H5 1:AMDE_1B:H1 0 5 2.8 50 50 1000 1:LYS+_1:HA 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.2 4 50 50 1000 1:LYS+_1:HA 1:CYS_2:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000

135

Anhang B: NMR-Randbedingungen

1:LYS+_1:HN 1:BENZ_1F:H2,H4 1 4.5 2.3 50 50 1000 1:METH_1C:H12,H11 1:BENZ_1D:H1,H5 1 4.5 2.3 50 50 1000 1:CYS_2:HA 1:GLY_3:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:CYS_2:HA 1:HIS+_4:HN 1 4 4 50 50 1000 1:CYS_2:HB* 1:GLY_3:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:CYS_2:HB* 1:HIS+_4:HN 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:CYS_2:HB* 1:CYS_5:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:CYS_2:HN 1:LYS+_1:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:CYS_2:HN 1:GLY_3:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:HIS+_4:HD2 1 4.9 4 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:HIS+_4:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:CYS_5:HN 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:HIS+_4:HA 1:CYS_5:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:HIS+_4:HA 1:LYS+_6:HN 1 4 4 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:HIS+_4:HD2 1 3.7 2.8 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:HIS+_4:HE1 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:CYS_5:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:HIS+_4:HN 1:HIS+_4:HD2 1 4 4 50 50 1000 1:CYS_5:HA 1:HIS+_4:HD2 1 4.8 4.8 50 50 1000 1:CYS_5:HA 1:LYS+_6:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:CYS_5:HB* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.1 4 50 50 1000 1:CYS_5:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.1 4 50 50 1000 1:CYS_5:HB* 1:CYS_2:HB* 1 5.8 4 50 50 1000 1:CYS_5:HB* 1:LYS+_6:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:CYS_5:HN 1:HIS+_4:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:CYS_5:HN 1:LYS+_6:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:LYS+_6:HB* 1:LYS+_7:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:LYS+_6:HG* 1:LYS+_7:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:AMDE_1B:H1 1 4.9 4 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:LYS+_8:HN 1 3.7 2.8 50 50 1000 1:LYS+_7:HD* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 7.1 4 50 50 1000 1:LYS+_7:HD* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.1 4 50 50 1000 1:LYS+_7:HD* 1:LYS+_8:HN 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:LYS+_7:HE* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:LYS+_7:HE* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.1 4 50 50 1000 1:LYS+_7:HE* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.1 4 50 50 1000 1:LYS+_7:HG* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:LYS+_7:HG* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:LYS+_7:HG* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:LYS+_7:HG* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:LYS+_7:HN 1:CYS_5:HN 1 4 4 50 50 1000 1:LYS+_8:HB* 1:AMDE_1B:H1 1 4.9 4 50 50 1000 1:LYS+_8:HB* 1:AMDE_1B:H1 1 4.9 4 50 50 1000 1:LYS+_8:HN 1:AMDE_1B:H1 1 3.4 3.4 50 50 1000 !BIOSYM restraint 1 ! #mixing_times -9.990000E+02 ! #3J_dihedral 1:LYS+_1:HN 1:LYS+_1:N 1:LYS+_1:CA 1:LYS+_1:HA 6.40 1.00 50.00 50.00 500.000 127.2 152.8 -152.8 -127.2 -35.0 35.0 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:GLY_3:HN 1:GLY_3:N 1:GLY_3:CA 1:GLY_3:HA1 5.50 1.00 50.00 50.00 500.000 9.9 44.4 120.4 145.6 -145.6 -120.4 -44.4 -9.9 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:GLY_3:HN 1:GLY_3:N 1:GLY_3:CA 1:GLY_3:HA2 5.50 1.00 50.00 50.00 500.000 9.9 44.4 120.4 145.6 -145.6 -120.4 -44.4 -9.9 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:HIS+_4:HN 1:HIS+_4:N 1:HIS+_4:CA 1:HIS+_4:HA 8.00 1.00 50.00 50.00 500.000 139.5 169.9 -169.9 -139.5 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:CYS_5:HN 1:CYS_5:N 1:CYS_5:CA 1:CYS_5:HA 6.00 1.00 50.00 50.00 500.000 124.2 149.5 -149.5 -124.2 -39.3 39.3 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_6:HN 1:LYS+_6:N 1:LYS+_6:CA 1:LYS+_6:HA 7.00 1.00 50.00 50.00 500.000 131.7 158.2 -158.2 -131.7 -27.7 27.7 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_7:HN 1:LYS+_7:N 1:LYS+_7:CA 1:LYS+_7:HA 8.50 1.00 50.00 50.00 500.000 143.7 -143.7 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_8:HN 1:LYS+_8:N 1:LYS+_8:CA 1:LYS+_8:HA 7.30 0.50 50.00 50.00 500.000 137.9 156.3 -156.3 -137.9 -12.4 12.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500

cis-Azo-PDI !BIOSYM restraint 1 !

136

Anhang B: NMR-Randbedingungen

#remote_prochiral_center ! #NOE_distance !ATOM #1 ATOM#2 Distance Force Constant Max ! Lower Upper Upper Lower Upper Force ! +correction 1:LYS+_8:HA 1:AMDE_1B:H1 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:METH_1C:H11,H12 1:BENZ_1D:H1,H5 0 5 2.8 50 50 1000 1:CYS_5:HA 1:BENZ_1D:H1,H5 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:BENZ_1F:H2,H4 1:LYS+_1:HN 1 4.5 2.3 50 50 1000 1:CYS_2:HN 1:LYS+_1:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:METH_1C:H11,H12 1:BENZ_1F:H2,H4 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:LYS+_1:HA 1:CYS_2:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:LYS+_1:HB* 1:CYS_2:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:CYS_2:HA 1:GLY_3:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:CYS_2:HN 1:GLY_3:HN 1 4 4 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:HIS+_4:HD2 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:HIS+_4:HA 1:HIS+_4:HD2 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:HIS+_4:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:GLY_3:HN 1:HIS+_4:HN 1 4 4 50 50 1000 1:CYS_5:HN 1:HIS+_4:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:CYS_2:HB* 1:CYS_5:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:CYS_5:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:HIS+_4:HA 1:CYS_5:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:CYS_5:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:CYS_5:HA 1:LYS+_6:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:CYS_5:HB* 1:LYS+_6:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:CYS_5:HN 1:LYS+_6:HN 1 4 4 50 50 1000 1:LYS+_7:HN 1:LYS+_6:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:CYS_5:HA 1:LYS+_7:HN 1 4.8 4.8 50 50 1000 1:CYS_5:HB* 1:LYS+_7:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:LYS+_6:HA 1:LYS+_7:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:LYS+_7:HN 1:LYS+_8:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 #mixing_times -9.990000E+02 ! #3J_dihedral 1:LYS+_1:HN 1:LYS+_1:N 1:LYS+_1:CA 1:LYS+_1:HA 7.30 1.00 50.00 50.00 500.000 134.0 161.2 -161.2 -134.0 -23.4 23.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:CYS_2:HN 1:CYS_2:N 1:CYS_2:CA 1:CYS_2:HA 7.00 2.00 50.00 50.00 500.000 124.2 169.9 -169.9 -124.2 -39.3 39.3 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:HIS+_4:HN 1:HIS+_4:N 1:HIS+_4:CA 1:HIS+_4:HA 8.30 1.00 50.00 50.00 500.000 142.0 175.5 -175.5 -142.0 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_7:HN 1:LYS+_7:N 1:LYS+_7:CA 1:LYS+_7:HA 6.00 1.00 50.00 50.00 500.000 124.2 149.5 -149.5 -124.2 -39.3 39.3 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_8:HN 1:LYS+_8:N 1:LYS+_8:CA 1:LYS+_8:HA 7.00 1.00 50.00 50.00 500.000 131.7 158.2 -158.2 -131.7 -27.7 27.7 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500

trans-RGD1 !BIOSYM restraint 1 ! #NOE_distance !ATOM #1 ATOM#2 Distance Force Constant Max ! Lower Upper Upper Lower Upper Force ! +correction 1:BENZ_1F:H1,H5 1:LYS+_1:HN 1 7 4.8 50 50 1000 1:BENZ_1F:H2,H4 1:LYS+_1:HN 1 5.5 2.3 50 50 1000 1:ARG+_3:HN 1:LYS+_1:HN 1 4 4 50 50 1000 1:LYS+_1:HB* 1:ALA_2:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_1:HG* 1:ALA_2:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:ALA_2:HA 1:ARG+_3:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:ALA_2:HB* 1:ARG+_3:HN 1 4.5 3.4 50 50 1000 1:ALA_2:HA 1:GLY_4:HN 1 4.8 4.8 50 50 1000 1:ARG+_3:HA 1:GLY_4:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:ARG+_3:HB* 1:GLY_4:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:ARG+_3:HG* 1:GLY_4:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:ASP_5:HN 1:GLY_4:HN 1 4.8 4.8 50 50 1000 1:PHE_6:HD* 1:GLY_4:HN 1 6 4.8 50 50 1000 1:PHE_6:HE*,HZ 1:GLY_4:HN 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:GLY_4:HA* 1:ASP_5:HN 1 3.2 2.3 50 50 1000 1:PHE_6:HN 1:ASP_5:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:ARG+_3:HA 1:PHE_6:HE*,HZ 1 6.2 4.0 50 50 1000 1:GLY_4:HA* 1:PHE_6:HE*,HZ 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:PHE_6:HA 1:PHE_6:HE*,HZ 1 6.2 4.0 50 50 1000 1:PHE_6:HB* 1:PHE_6:HE*,HZ 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:PHE_6:HE*,HZ 1 9.4 4.8 50 50 1000

137

Anhang B: NMR-Randbedingungen

1:GLY_4:HA* 1:PHE_6:HD* 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:PHE_6:HA 1:PHE_6:HD* 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:PHE_6:HD* 1 9.4 4.8 50 50 1000 1:GLY_4:HA* 1:PHE_6:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:ASP_5:HB* 1:PHE_6:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:PHE_6:HD* 1:PHE_6:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:PHE_6:HE*,HZ 1:PHE_6:HN 1 6.2 4 50 50 1000 1:PHE_6:HA 1:VAL_7:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:PHE_6:HB* 1:VAL_7:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:PHE_6:HD* 1:VAL_7:HN 1 7 4.8 50 50 1000 1:METH_1C:H1* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 5.4 2.3 50 50 1000 1:PHE_6:HB* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:METH_1C:H1* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 7.1 4 50 50 1000 1:PHE_6:HB* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:ARG+_3:HG* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:GLY_4:HA* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.1 4 50 50 1000 1:PHE_6:HA 1:BENZ_1F:H1,H5 1 6.2 4 50 50 1000 1:PHE_6:HE*,HZ 1:BENZ_1F:H1,H5 1 8.4 4 50 50 1000 1:ARG+_3:HD* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:VAL_7:HA 1:AMDE_1B:H1 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:VAL_7:HB 1:AMDE_1B:H1 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:AMDE_1B:H1 1 5.8 3.4 50 50 1000 1:VAL_7:HN 1:AMDE_1B:H1 1 3.4 3.4 50 50 1000! ! #3J_dihedral 1:LYS+_1:HN 1:LYS+_1:N 1:LYS+_1:CA 1:LYS+_1:HA 6.80 0.50 30.00 30.00 1000.000 134.0 152.0 -152.0 -134.0 -23.4 23.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ALA_2:HN 1:ALA_2:N 1:ALA_2:CA 1:ALA_2:HA 8.20 0.50 30.00 30.00 1000.000 145.4 165.8 -165.8 -145.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ARG+_3:HN 1:ARG+_3:N 1:ARG+_3:CA 1:ARG+_3:HA 5.80 1.00 30.00 30.00 1000.000 2.4 41.3 122.7 147.9 -147.9 -122.7 -41.3 -2.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ASP_5:HN 1:ASP_5:N 1:ASP_5:CA 1:ASP_5:HA 6.80 0.50 30.00 30.00 1000.000 134.0 152.0 -152.0 -134.0 -23.4 23.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:PHE_6:HN 1:PHE_6:N 1:PHE_6:CA 1:PHE_6:HA 5.30 1.00 30.00 30.00 1000.000 13.4 46.3 118.8 144.0 -144.0 -118.8 -46.3 -13.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 !

cis-RGD1 !BIOSYM restraint 1 ! #chiral 1:LYS+_1:CA S 1:ALA_2:CA S 1:ARG+_3:CA S 1:ASP_5:CA S 1:PHE_6:CA R 1:VAL_7:CA S ! #NOE_distance !ATOM #1 ATOM#2 Distance Force Constant Max ! Lower Upper Upper Lower Upper Force ! +correction 1:VAL_7:HA 1:AMDE_1B:H1 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:VAL_7:HB 1:AMDE_1B:H1 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:AMDE_1B:H1 1 6.4 4 50 50 1000 1:VAL_7:HN 1:AMDE_1B:H1 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:ALA_2:HN 1:LYS+_1:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:LYS+_1:HA 1:ALA_2:HN 1 4 4 50 50 1000 1:LYS+_1:HB* 1:ALA_2:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_1:HG* 1:ALA_2:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:LYS+_1:HD* 1:ALA_2:HN 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:ARG+_3:HN 1:ALA_2:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:ALA_2:HB* 1:ARG+_3:HN 1 4.5 3.4 50 50 1000 1:GLY_4:HN 1:ARG+_3:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:ARG+_3:HA 1:ARG+_3:HE 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:ARG+_3:HB* 1:ARG+_3:HE 1 5.2 3.4 50 50 1000 1:ALA_2:HB* 1:GLY_4:HN 1 5.9 4.8 50 50 1000 1:ARG+_3:HA 1:GLY_4:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:ARG+_3:HB* 1:GLY_4:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:ARG+_3:HG* 1:GLY_4:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:GLY_4:HA* 1:ASP_5:HN 1 3.2 2.3 50 50 1000 1:ARG+_3:HB* 1:ASP_5:HN 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:ARG+_3:HA 1:ASP_5:HN 1 4 4 50 50 1000 1:PHE_6:HN 1:ASP_5:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000

138

Anhang B: NMR-Randbedingungen

!1:ARG+_3:HA 1:PHE_6:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:ASP_5:HB* 1:PHE_6:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:VAL_7:HN 1:PHE_6:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:ASP_5:HB* 1:PHE_6:HD* 1 7.1 4 50 50 1000 1:PHE_6:HA 1:PHE_6:HD* 1 5 2.8 50 50 1000 1:PHE_6:HB* 1:PHE_6:HD* 1 5.9 2.8 50 50 1000 1:PHE_6:HN 1:PHE_6:HD* 1 5 2.8 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:PHE_6:HD* 1 7.4 2.8 50 50 1000 1:VAL_7:HA 1:PHE_6:HD* 1 7 4.8 50 50 1000 1:VAL_7:HN 1:PHE_6:HD* 1 6.2 4 50 50 1000 1:BENZ_1F:H2,H4 1:PHE_6:HD* 1 8.4 4 50 50 1000 !1:ASP_5:HB* 1:PHE_6:HE*,HZ 1 7.1 4 50 50 1000 1:PHE_6:HA 1:PHE_6:HE*,HZ 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:PHE_6:HB* 1:PHE_6:HE*,HZ 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:PHE_6:HN 1:PHE_6:HE*,HZ 1 7 4.8 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:PHE_6:HE*,HZ 1 8 3.4 50 50 1000 1:PHE_6:HA 1:VAL_7:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:PHE_6:HB* 1:VAL_7:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:PHE_6:HD* 1:VAL_7:HN 1 7 4.8 50 50 1000 1:AMDE_1B:H1 1:BENZ_1D:H1,H5 1 5 2.8 50 50 1000 1:METH_1C:H1* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 5.4 2.3 50 50 1000 !1:PHE_6:HA 1:BENZ_1D:H1,H5 1 6.2 4 50 50 1000 1:ASP_5:HB* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:VAL_7:HA 1:BENZ_1D:H1,H5 1 6.2 4 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 8 3.4 50 50 1000 1:ARG+_3:HG* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 7.9 4.8 50 50 1000 !1:ARG+_3:HD* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 7.1 4 50 50 1000 1:METH_1C:H1* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 7.1 4 50 50 1000 1:ASP_5:HB* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 7.1 4 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 9.4 4.8 50 50 1000 !1:ASP_5:HA 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7 4.8 50 50 1000 1:ASP_5:HB* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.1 4 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 9.4 4.8 50 50 1000 !1:ARG+_3:HD* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 7.1 4 50 50 1000 1:LYS+_1:HN 1:BENZ_1F:H2,H4 1 4.5 2.3 50 50 1000 1:ALA_2:HN 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.2 4 50 50 1000 1:ARG+_3:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:ARG+_3:HG* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 !1:ARG+_3:HD* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.1 4 50 50 1000 1:GLY_4:HA* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.1 4 50 50 1000 1:ASP_5:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.1 4 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 8.6 4 50 50 1000 !BIOSYM restraint 1 ! #mixing_times -9.990000E+02 ! #3J_dihedral 1:LYS+_1:HN 1:LYS+_1:N 1:LYS+_1:CA 1:LYS+_1:HA 5.50 0.50 30.00 30.00 1000.000 12.7 44.3 119.2 146.7 -146.7 -119.2 -44.3 -12.7 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ALA_2:HN 1:ALA_2:N 1:ALA_2:CA 1:ALA_2:HA 6.31 0.50 30.00 30.00 1000.000 125.3 153.0 -153.0 -125.3 -35.2 35.2 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ARG+_3:HN 1:ARG+_3:N 1:ARG+_3:CA 1:ARG+_3:HA 7.41 0.50 30.00 30.00 1000.000 133.8 162.4 -162.4 -133.8 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ASP_5:HN 1:ASP_5:N 1:ASP_5:CA 1:ASP_5:HA 7.41 0.50 30.00 30.00 1000.000 133.8 162.4 -162.4 -133.8 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:PHE_6:HN 1:PHE_6:N 1:PHE_6:CA 1:PHE_6:HA 7.14 0.50 30.00 30.00 1000.000 131.6 159.9 -159.9 -131.6 -22.0 22.0 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:VAL_7:HN 1:VAL_7:N 1:VAL_7:CA 1:VAL_7:HA 7.96 0.50 30.00 30.00 1000.000 138.3 167.9 -167.9 -138.3 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500

C-terminale Domäne Minicollagen !BIOSYM restraint 1 ! #remote_prochiral_center #distance 1:VAL_8:HN 1:PRO_4:O 1.000 2.500 50.00 50.00 1000.00 1:GLN_10:HN 1:VAL_6:O 1.000 2.500 50.00 50.00 1000.00 1:VAL_12:HN 1:GLN_10:O 1.000 2.500 50.00 50.00 1000.00 1:CYS_15:HN 1:VAL_12:O 1.000 2.500 50.00 50.00 1000.00 1:CYS_19:HN 1:PRO_16:O 1.000 2.500 50.00 50.00 1000.00 ! #NOE_distance

139

Anhang B: NMR-Randbedingungen

1:CYS_3:HB2 1:CYS_3:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_3:HB1 1:CYS_3:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_3:HB2 1:CYS_3:HA 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_3:HB1 1:CYS_3:HA 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HD2 1:CYS_3:HA 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HD1 1:CYS_3:HA 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HD1 1:CYS_3:HA 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HD1 1:CYS_3:HB1 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HG2* 1:CYS_3:HB1 1.000 5.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HG2* 1:CYS_3:HB2 1.000 5.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HB* 1:CYS_3:HB1 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HA 1:CYS_3:HB1 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_2:HA 1:CYS_3:HN 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_2:HB* 1:CYS_3:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HG* 1:CYS_3:HN 1.000 4.900 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_2:HD* 1:CYS_3:HN 1.000 4.900 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:TYR_18:HE* 1:CYS_3:HN 1.000 6.200 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_5:HD* 1:PRO_4:HA 1.000 3.200 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_3:HB1 1:PRO_4:HD2 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_7:HB1 1:PRO_4:HD1 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HA 1:PRO_4:HD1 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HD1 1:PRO_4:HD1 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_7:HB1 1:PRO_4:HG* 1.000 4.900 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HG2* 1:PRO_5:HA 1.000 3.900 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HB2 1:PRO_5:HD* 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:ALA_9:HB* 1:VAL_6:HA 1.000 4.500 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HA 1:VAL_6:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HB2 1:VAL_6:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HB1 1:VAL_6:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_5:HA 1:VAL_6:HN 1.000 4.000 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_5:HB* 1:VAL_6:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_5:HD* 1:VAL_6:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_6:HB 1:VAL_6:HA 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_6:HA 1:VAL_6:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_6:HB 1:VAL_6:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_7:HN 1:VAL_6:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HN 1:VAL_6:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_10:HB* 1:CYS_7:HA 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_10:HG* 1:CYS_7:HA 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_11:HA 1:CYS_7:HA 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 !1:VAL_12:HG2* 1:CYS_7:HA 1.000 5.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 !1:VAL_12:HG1* 1:CYS_7:HA 1.000 4.500 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 !1:PRO_4:HB1 1:CYS_7:HB1 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HB1 1:CYS_7:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HG* 1:CYS_7:HN 1.000 5.700 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_6:HA 1:CYS_7:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_6:HB 1:CYS_7:HN 1.000 4.900 4.900 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_6:HG* 1:CYS_7:HN 1.000 5.800 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HN 1:CYS_7:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_5:HA 1:VAL_8:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_6:HA 1:VAL_8:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_7:HA 1:VAL_8:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_7:HB1 1:VAL_8:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_7:HB2 1:VAL_8:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HB 1:VAL_8:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HA 1:VAL_8:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HG2* 1:VAL_8:HN 1.000 3.900 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_6:HA 1:ALA_9:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HA 1:ALA_9:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HB 1:ALA_9:HN 1.000 4.900 4.900 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HG1* 1:ALA_9:HN 1.000 5.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HN 1:ALA_9:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG1* 1:GLN_10:HB* 1.000 5.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG2* 1:GLN_10:HB* 1.000 5.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_6:HA 1:GLN_10:HN 1.000 4.900 4.900 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_7:HA 1:GLN_10:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HN 1:GLN_10:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:ALA_9:HB* 1:GLN_10:HN 1.000 3.900 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_10:HA 1:GLN_10:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_10:HB* 1:GLN_10:HN 1.000 3.700 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_11:HN 1:GLN_10:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HB1 1:CYS_11:HA 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG1* 1:CYS_11:HA 1.000 4.500 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG2* 1:CYS_11:HA 1.000 4.500 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_21:HD1 1:CYS_11:HB* 1.000 5.800 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_10:HA 1:CYS_11:HN 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_10:HB* 1:CYS_11:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG1* 1:VAL_12:HA 1.000 3.900 2.800 50.00 50.00 1000.00 0

140

Anhang B: NMR-Randbedingungen

1:VAL_12:HG2* 1:VAL_12:HA 1.000 5.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HB1 1:VAL_12:HG2* 1.000 5.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HB2 1:VAL_12:HG2* 1.000 4.500 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_7:HA 1:VAL_12:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_10:HA 1:VAL_12:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_10:HB* 1:VAL_12:HN 1.000 4.900 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_11:HA 1:VAL_12:HN 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_11:HB* 1:VAL_12:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HA 1:VAL_12:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HB 1:VAL_12:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HB1 1:VAL_12:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HN 1:VAL_12:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HA 1:PRO_13:HD2 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HA 1:PRO_13:HD1 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HB 1:PRO_13:HD1 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HB 1:PRO_13:HD2 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG2* 1:PRO_13:HD1 1.000 5.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG1* 1:PRO_13:HD2 1.000 4.500 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 !1:CYS_20:HA 1:PRO_13:HD* 1.000 4.900 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG2* 1:THR_14:HB 1.000 5.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HB 1:THR_14:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HA 1:THR_14:HN 1.000 4.900 4.900 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_13:HA 1:THR_14:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_13:HB1 1:THR_14:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_13:HB2 1:THR_14:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_13:HD2 1:THR_14:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_13:HD1 1:THR_14:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HN 1:THR_14:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HA 1:CYS_15:HB1 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HA 1:CYS_15:HB2 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_7:HA 1:CYS_15:HB1 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 !1:CYS_7:HB* 1:CYS_15:HB1 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HD2 1:CYS_15:HB1 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HD1 1:CYS_15:HB1 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG2* 1:CYS_15:HN 1.000 3.500 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG1* 1:CYS_15:HN 1.000 5.900 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 !1:VAL_12:HB 1:CYS_15:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_13:HA 1:CYS_15:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:THR_14:HA 1:CYS_15:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:THR_14:HB 1:CYS_15:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:THR_14:HG2* 1:CYS_15:HN 1.000 5.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HA 1:CYS_15:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HB1 1:CYS_15:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HB2 1:CYS_15:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HG* 1:PRO_16:HD1 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HA 1:PRO_16:HD1 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HA 1:PRO_16:HD2 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HB* 1:PRO_16:HD1 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HA 1:GLN_17:HN 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HB1 1:GLN_17:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HB2 1:GLN_17:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_17:HA 1:GLN_17:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:TYR_18:HN 1:GLN_17:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_2:HG* 1:TYR_18:HD* 1.000 7.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HB1 1:TYR_18:HD* 1.000 6.200 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HB2 1:TYR_18:HD* 1.000 5.600 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:TYR_18:HB1 1:TYR_18:HD* 1.000 4.500 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:TYR_18:HB2 1:TYR_18:HD* 1.000 4.500 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:TYR_18:HA 1:TYR_18:HD* 1.000 5.600 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HA 1:TYR_18:HD* 1.000 6.200 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_2:HA 1:TYR_18:HE* 1.000 7.000 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_2:HG* 1:TYR_18:HE* 1.000 6.500 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HA 1:TYR_18:HE* 1.000 7.000 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HB1 1:TYR_18:HE* 1.000 5.600 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HB2 1:TYR_18:HE* 1.000 5.000 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HA 1:TYR_18:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HB1 1:TYR_18:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_17:HA 1:TYR_18:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_17:HB* 1:TYR_18:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:TYR_18:HA 1:TYR_18:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:TYR_18:HB1 1:TYR_18:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:TYR_18:HB2 1:TYR_18:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HN 1:TYR_18:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HD2 1:CYS_19:HB* 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HB1 1:CYS_19:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HB2 1:CYS_19:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HD1 1:CYS_19:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_17:HA 1:CYS_19:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0

141

Anhang B: NMR-Randbedingungen

1:GLN_17:HN 1:CYS_19:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:TYR_18:HB1 1:CYS_19:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HB* 1:CYS_19:HN 1.000 3.200 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HA 1:CYS_19:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_21:HD2 1:CYS_20:HA 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_21:HD1 1:CYS_20:HA 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_21:HD1 1:CYS_20:HB* 1.000 3.700 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_17:HA 1:CYS_20:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_17:HA 1:CYS_20:HB* 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HA 1:CYS_20:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HB* 1:CYS_20:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HN 1:CYS_20:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 !1:TYR_18:HN 1:CYS_20:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_21:HA 1:ALA_22:HN 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_21:HB1 1:ALA_22:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_21:HB2 1:ALA_22:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_21:HD1 1:ALA_22:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:LYS+_23:HN 1:ALA_22:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_21:HB2 1:LYS+_23:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:ALA_22:HA 1:LYS+_23:HN 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:ALA_22:HB* 1:LYS+_23:HN 1.000 3.900 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:LYS+_23:HA 1:ARG+_24:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:ARG+_24:HA 1:LYS+_25:HN 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:ARG+_24:HN 1:LYS+_25:HN 1.000 4.900 4.900 50.00 50.00 1000.00 0 ! #mixing_times -9.990000E+02

N-terminale Domäne Minicollagen !BIOSYM restraint 1 ! #remote_prochiral_center ! #NOE_distance 1:ALA_12:HB* 1:PRO_2:HB* 1.000 4.800 2.800 50 50 1000 1:ALA_12:HB* 1:PRO_2:HD* 1.000 6.800 4.800 50 50 1000 1:CYS_7:HB* 1:CYS_3:HB* 1.000 4.100 2.300 50 50 1000 1:PRO_2:HA 1:CYS_3:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.0 1:PRO_2:HB* 1:CYS_3:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.0 1:PRO_2:HG* 1:CYS_3:HN 1.000 4.900 4.000 50.00 50.00 1000.0 1:GLY_4:HN 1:CYS_3:HN 1.000 2.300 2.300 50.0 50.00 1000.0 1:SER_9:HA 1:CYS_3:HN 1.000 4.000 4.000 50 50 1000 1:ALA_12:HB* 1:CYS_3:HN 1.000 5.900 4.800 50 50 1000 1:PRO_2:HG* 1:GLY_4:HN 1.000 4.900 4.000 50.00 50.00 1000.0 1:CYS_3:HA 1:GLY_4:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_3:HB* 1:GLY_4:HN 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:SER_5:HN 1:GLY_4:HN 1.000 4.000 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:GLY_4:HA* 1:SER_5:HN 1.000 3.200 2.300 50.0 50.00 1000.0 1:TYR_6:HN 1:SER_5:HN 1.000 2.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:SER_5:HB* 1:TYR_6:HD* 1.000 6.500 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:TYR_6:HA 1:TYR_6:HD* 1.000 5.000 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:TYR_6:HA 1:TYR_6:HE* 1.000 6.200 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:TYR_6:HN 1:TYR_6:HD* 1.000 5.000 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_7:HB* 1:TYR_6:HD* 1.000 7.900 4.800 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_20:HB* 1:TYR_6:HD* 1.000 7.900 4.800 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_20:HB* 1:TYR_6:HE* 1.000 6.500 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:TYR_6:HN 1:TYR_6:HE* 1.000 5.600 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_14:HB* 1:TYR_6:HE* 1.000 7.300 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_16:HB* 1:TYR_6:HE* 1.000 7.300 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:GLY_4:HA* 1:TYR_6:HN 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:SER_5:HA 1:TYR_6:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:SER_5:HB* 1:TYR_6:HN 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_7:HN 1:TYR_6:HN 1.000 2.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_8:HD* 1:CYS_7:HA 1.000 3.200 2.300 50 50 1000 1:CYS_20:HA 1:CYS_7:HA 1.000 3.400 3.400 50 50 1000 1:SER_5:HA 1:CYS_7:HN 1.000 4.000 4.000 50 50 1000 1:TYR_6:HA 1:CYS_7:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:TYR_6:HB* 1:CYS_7:HN 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_7:HB* 1:PRO_8:HD* 1.000 5.800 4.000 50 50 1000 1:CYS_20:HA 1:PRO_8:HD* 1.000 3.700 2.800 50 50 1000 1:PRO_8:HA 1:SER_9:HN 1.000 2.300 2.300 50 50 1000 1:PRO_8:HB* 1:SER_9:HN 1.000 4.300 3.400 50 50 1000 1:VAL_10:HG* 1:SER_9:HN 1.000 7.000 3.400 50 50 1000 1:VAL_10:HN 1:SER_9:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_8:HA 1:VAL_10:HN 1.000 3.400 3.400 50 50 1000 1:PRO_8:HB* 1:VAL_10:HN 1.000 4.300 3.400 50 50 1000

142

Anhang B: NMR-Randbedingungen

1:SER_9:HA 1:VAL_10:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:SER_9:HB* 1:VAL_10:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_8:HB* 1:CYS_11:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:SER_9:HA 1:CYS_11:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:SER_9:HB* 1:CYS_11:HN 1.000 5.700 4.800 50.0 50.0 1000.0 1:VAL_10:HA 1:CYS_11:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.0 1000.0 1:VAL_10:HB 1:CYS_11:HN 1.000 4.000 4.000 50.0 50.0 1000.0 1:VAL_10:HG* 1:CYS_11:HN 1.000 5.400 2.800 50.0 50.0 1000.0 1:ALA_12:HN 1:CYS_11:HN 1.000 2.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_13:HA 1:ALA_12:HA 1.000 2.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_13:HA 1:ALA_12:HB* 1.000 3.400 2.300 50.0 50.00 1000.0 1:SER_9:HA 1:ALA_12:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:SER_9:HB* 1:ALA_12:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:VAL_10:HA 1:ALA_12:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_11:HA 1:ALA_12:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_11:HB* 1:ALA_12:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_13:HA 1:ALA_12:HN 1.000 4.300 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_12:HB* 1:PRO_13:HD* 1.000 6.800 4.800 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_14:HB* 1:PRO_13:HD* 1.000 6.000 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_16:HA 1:ALA_14:HB* 1.000 5.100 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_16:HB* 1:ALA_14:HB* 1.000 5.000 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_12:HA 1:ALA_14:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_12:HB* 1:ALA_14:HN 1.000 5.900 4.800 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_13:HA 1:ALA_14:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_13:HD* 1:ALA_14:HN 1.000 3.700 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_13:HG* 1:ALA_14:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_15:HN 1:ALA_14:HN 1.000 2.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:SER_9:HA 1:CYS_15:HA 1.000 4.000 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:SER_9:HB* 1:CYS_15:HA 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_16:HB* 1:CYS_15:HA 1.000 5.100 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_3:HA 1:CYS_15:HB* 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_7:HB* 1:CYS_15:HN 1.000 4.600 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_12:HA 1:CYS_15:HN 1.000 2.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_12:HB* 1:CYS_15:HN 1.000 5.100 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_13:HA 1:CYS_15:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_14:HA 1:CYS_15:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_14:HB* 1:CYS_15:HN 1.000 3.900 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_16:HN 1:CYS_15:HN 1.000 2.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HD* 1:ALA_16:HA 1.000 3.200 2.300 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HD* 1:ALA_16:HB* 1.000 4.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_19:HB* 1:ALA_16:HB* 1.000 5.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_7:HB* 1:ALA_16:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_14:HB* 1:ALA_16:HN 1.000 4.500 3.400 50.0 50.00 1000.0 !1:ALA_14:HN 1:ALA_16:HN 1.000 4.000 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_15:HA 1:ALA_16:HN 1.000 2.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_15:HB* 1:ALA_16:HN 1.000 5.700 4.800 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_19:HB* 1:ALA_16:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_19:HN 1:ALA_16:HN 1.000 4.000 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_20:HN 1:ALA_16:HN 1.000 4.800 4.800 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_20:HB* 1:PRO_17:HA 1.000 3.700 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_16:HB* 1:VAL_18:HN 1.000 3.900 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HA 1:VAL_18:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HB* 1:VAL_18:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HG* 1:VAL_18:HN 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_19:HN 1:VAL_18:HN 1.000 2.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_20:HN 1:VAL_18:HN 1.000 4.000 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_16:HB* 1:CYS_19:HN 1.000 4.500 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HA 1:CYS_19:HN 1.000 4.800 4.800 50.0 50.00 1000.0 1:VAL_18:HA 1:CYS_19:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:VAL_18:HB 1:CYS_19:HN 1.000 4.000 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_20:HN 1:CYS_19:HN 1.000 2.300 2.300 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_7:HB* 1:CYS_20:HA 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_22:HD* 1:CYS_20:HA 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_7:HB* 1:CYS_20:HN 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_16:HB* 1:CYS_20:HN 1.000 5.100 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:VAL_18:HA 1:CYS_20:HN 1.000 4.000 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_19:HA 1:CYS_20:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_19:HB* 1:CYS_20:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_22:HD* 1:TYR_21:HA 1.000 3.200 2.300 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_20:HA 1:TYR_21:HN 1.000 4.000 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_20:HB* 1:TYR_21:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HA 1:TYR_21:HD* 1.000 4.000 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HB* 1:TYR_21:HD* 1.000 6.500 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:TYR_6:HB* 1:TYR_21:HE* 1.000 7.900 4.800 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HA 1:TYR_21:HE* 1.000 6.200 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HB* 1:TYR_21:HE* 1.000 7.100 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_20:HB* 1:TYR_21:HE* 1.000 6.500 3.400 50.0 50.00 1000.0

143

Anhang B: NMR-Randbedingungen

TMC416 !BIOSYM restraint 1 ! #remote_prochiral_center ! #chiral 1:TYR_1F:CA S 1:LEU_1G:CA S 1:TRP_1H:CA S 1:TRP_1H:CG S 1:LEUN_1D:CA S ! #NOE_distance 1:TRP_1H:HA 1:LEUN_1D:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HB2 1:LEU_1G:HA 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HG 1:LEU_1G:HA 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HB1 1:LEU_1G:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HB2 1:LEU_1G:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HG 1:LEU_1G:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HA 1:LEU_1G:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HB2 1:LEU_1G:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HN 1:LEU_1G:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HA 1:TRP_1H:HE1 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TRP_1H:HA 1:TRP_1H:HE1 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TRP_1H:HG 1:TRP_1H:HE1 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HN 1:TRP_1H:HE1 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TRP_1H:HA 1:TRP_1H:HE3,HZ3,HH2 1.000 5.600 3.400 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TRP_1H:HG 1:TRP_1H:HE3,HZ3,HH2 1.000 5.600 3.400 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEUN_1D:HN 1:TRP_1H:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HA 1:TRP_1H:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HB1 1:TRP_1H:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HB2 1:TRP_1H:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HG 1:TRP_1H:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HB1 1:TYR_1F:HA 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HB2 1:TYR_1F:HA 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HA 1:TYR_1F:HD1 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HN 1:TYR_1F:HD1 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TRP_1H:HA 1:TYR_1F:HD1 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TRP_1H:HE1 1:TYR_1F:HD1 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HA 1:TYR_1F:HD1 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HB1 1:TYR_1F:HD1 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HB2 1:TYR_1F:HD1 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HN 1:TYR_1F:HD1 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HB1 1:TYR_1F:HD2,HE2 1.000 4.100 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HB2 1:TYR_1F:HD2,HE2 1.000 6.100 4.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HN 1:TYR_1F:HD2,HE2 1.000 4.700 3.400 50.00 50.00 100.000 0.00 1:METH_1B:H1* 1:TYR_1F:HN 1.000 5.700 4.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HB1 1:TYR_1F:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HB2 1:TYR_1F:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 100.000 0.00 ! #mixing_times -9.990000E+02 ! #3J_dihedral 1:TYR_1F:HN 1:TYR_1F:N 1:TYR_1F:CA 1:TYR_1F:HA 7.50 0.50 50.00 50.00 100.000 139.5 158.2 -158.2 -139.5 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LEU_1G:HN 1:LEU_1G:N 1:LEU_1G:CA 1:LEU_1G:HA 7.50 0.50 50.00 50.00 100.000 139.5 158.2 -158.2 -139.5 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:TRP_1H:HN 1:TRP_1H:N 1:TRP_1H:CA 1:TRP_1H:HA 9.20 0.50 50.00 50.00 100.000 155.8 -155.8 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500

BIA49 !BIOSYM restraint 1 ! #chiral 1:PHE_1:CA S 1:ASN_1B:CA R 1:TYR_2:CA S ! #NOE_distance !ATOM #1 ATOM#2 Distance Force Constant Max ! Lower Upper Upper Lower Upper Force ! +correction 1:PHE_1:HA 1:ASN_1B:HN 1 3.4 3.4 50 50 100

144

Anhang B: NMR-Randbedingungen

1:PHE_1:HB2 1:ASN_1B:HN 1 3.4 3.4 50 50 100 1:PHE_1:HD1 1:ASN_1B:HN 1 4.8 4.8 50 50 100 1:PHE_1:HN 1:ASN_1B:HN 1 4.8 4.8 50 50 100 1:ASN_1B:HA 1:PHE_1:HD1 1 4 4 50 50 100 1:ASN_1B:HN 1:PHE_1:HD1 1 4 4 50 50 100 1:PHE_1:HA 1:PHE_1:HD1 1 4 4 50 50 100 1:PHE_1:HB2 1:PHE_1:HD1 1 2.8 2.8 50 50 100 1:METH_1E:H1* 1:PHE_1:HD2 1 3.2 2.3 50 50 100 1:PHE_1:HB1 1:PHE_1:HD2 1 2.8 2.8 50 50 100 1:PHE_1:HN 1:PHE_1:HD2 1 3.4 3.4 50 50 100 1:METH_1E:H1* 1:PHE_1:HN 1 5.7 4.8 50 50 100 1:ASN_1B:HA 1:TYR_2:HD1 1 4.8 4.8 50 50 100 1:ASN_1B:HB* 1:TYR_2:HD1 1 4.3 3.4 50 50 100 1:ASN_1B:HN 1:TYR_2:HD1 1 4.8 4.8 50 50 100 1:PHE_1:HD1 1:TYR_2:HD1 1 4.8 4.8 50 50 100 1:TYR_2:HA 1:TYR_2:HD1 1 2.8 2.8 50 50 100 1:TYR_2:HB2 1:TYR_2:HD1 1 2.8 2.8 50 50 100 1:ASN_1B:HA 1:TYR_2:HD2 1 4 4 50 50 100 1:PHE_1:HD1 1:TYR_2:HD2 1 4.8 4.8 50 50 100 1:TYR_2:HA 1:TYR_2:HD2 1 4.8 4.8 50 50 100 1:TYR_2:HB1 1:TYR_2:HD2 1 2.3 2.3 50 50 100 1:PHE_1:HD1 1:TYR_2:HE1 1 4 4 50 50 100 1:ASN_1B:HA 1:TYR_2:HE2 1 4.8 4.8 50 50 100 1:PHE_1:HD1 1:TYR_2:HE2 1 3.4 3.4 50 50 100 1:ASN_1B:HA 1:TYR_2:HN 1 4 4 50 50 100 1:ASN_1B:HB* 1:TYR_2:HN 1 4.3 3.4 50 50 100 1:TYR_2:HD2 1:TYR_2:HN 1 3.4 3.4 50 50 100 1:LEU_3:HN 1:TYR_2:HN 1 4 4 50 50 100 1:TYR_2:HA 1:LEU_3:HN 1 2.8 2.8 50 50 100 1:TYR_2:HB2 1:LEU_3:HN 1 4 4 50 50 100 ! #mixing_times -9.990000E+02 ! #3J_dihedral 1:PHE_1:HN 1:PHE_1:N 1:PHE_1:CA 1:PHE_1:HA 7.30 0.50 50.00 50.00 100.000 137.9 156.3 -156.3 -137.9 -12.4 12.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ASN_1B:HN 1:ASN_1B:N 1:ASN_1B:CA 1:ASN_1B:HA 8.80 0.50 50.00 50.00 100.000 151.2 175.5 -175.5 -151.2 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:TYR_2:HN 1:TYR_2:N 1:TYR_2:CA 1:TYR_2:HA 9.80 0.50 50.00 50.00 100.000 165.5 -165.5 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500

145

10. Anhang C: Rechenprotokolle

Azopeptide in trans ! INPUT FILE FOR DISCOVER GENERATED BY INSIGHT ! ! overlap = 0.01 begin simulation * add-automatic bond torsion valence out-of-plane reduce ! set dielectric = 80.00000 bzw. 46,7 für DMSO ! Assign the torsion name azo to * residue BENZ 1D atom C3 * residue AZO 1E atom N1 * residue AZO 1E atom N2 * residue BENZ 1F atom C6 Assign the torsion name phi1 to * residue BENZ 1D atom C2 * residue BENZ 1D atom C3 * residue AZO 1E atom N1 * residue AZO 1E atom N2 Assign the torsion name phi2 to * residue AZO 1E atom N1 * residue AZO 1E atom N2 * residue BENZ 1F atom C6 * residue BENZ 1F atom C5 ! force azo in AZO 1E to 180 using 100.000000 force phi1 in BENZ 1D to 180 using 100.000000 force phi2 in AZO 1E to 180 using 100.000000 ! CONSTRAIN ! DEMAX=100000 aloop=1 bloop=101 100 retrieve as file number aloop ! Minimize * no cross terms * no morse * for 1000 iterations * using conjugate gradients * until the maximum derivative is less than 1.0 kcal/A ! Minimize * no cross terms * no morse * for 500 iterations * using steepest descent * until the maximum derivative is less than 0.10 kcal/A ! initialize dynamics * for 5000 iterations * at 300.000 K * steps of 1.000 * no cross terms * no morse * write history file every 1000 steps * averages every 100 ! KTEMPB=1 TIMTMP=1.0 ! resume dynamics * for 10000 iterations * no cross terms

146 * no morse

Anhang C: Rechenprotokolle

* at 0.0 K ! archive as file number bloop aloop=aloop+1 bloop=bloop+1 ! if aloop.le.100 then 100 ! ! end

Azopeptide in cis ! INPUT FILE FOR DISCOVER GENERATED BY INSIGHT ! ! overlap = 0.01 begin simulation * add-automatic bond torsion valence out-of-plane reduce ! set dielectric = 80.00000 bzw. für 46,7 ! Assign the torsion name azo to * residue BENZ 1D atom C3 * residue AZO 1E atom N1 * residue AZO 1E atom N2 * residue BENZ 1F atom C6 force azo in AZO 1E to 0 using 100.000000 ! CONSTRAIN ! DEMAX=100000 aloop=1 bloop=101 100 retrieve as file number aloop ! Minimize * no cross terms * no morse * for 1000 iterations * using conjugate gradients * until the maximum derivative is less than 1.0 kcal/A ! Minimize * no cross terms * no morse * for 500 iterations * using steepest descent * until the maximum derivative is less than 0.10 kcal/A ! initialize dynamics * for 5000 iterations * at 300.000 K * steps of 1.000 * no cross terms * no morse * write history file every 1000 steps * averages every 100 ! KTEMPB=1 TIMTMP=1.0 ! resume dynamics * for 10000 iterations * no cross terms * no morse * at 0.0 K ! archive as file number bloop aloop=aloop+1 bloop=bloop+1 ! if aloop.le.100 then 100 !

147

Anhang C: Rechenprotokolle

! end

C- und N-terminale Domäne ! INPUT FILE FOR DISCOVER GENERATED BY INSIGHT ! ! overlap = 0.01 ! begin simulation * add-automatic bond torsion valence out-of-plane reduce ! set dielectric = 80.00000 ! ! CONSTRAIN ! DEMAX=100000 aloop=1 bloop=101 100 retrieve as file number aloop ! Minimize * no cross terms * no morse * for 1000 iterations * using conjugate gradients * until the maximum derivative is less than 1.0 kcal/A ! Minimize * no cross terms * no morse * for 500 iterations * using steepest descent * until the maximum derivative is less than 0.10 kcal/A ! initialize dynamics * for 5000 iterations * at 300.000 K * steps of 1.000 * no cross terms * no morse * write history file every 1000 steps * averages every 100 ! KTEMPB=1 TIMTMP=1.0 ! resume dynamics * for 10000 iterations * no cross terms * no morse * at 0.0 K ! archive as file number bloop aloop=aloop+1 bloop=bloop+1 ! if aloop.le.100 then 100 ! ! end

TMC416 und BIA 49 ! INPUT FILE FOR DISCOVER GENERATED BY INSIGHT ! ! overlap = 0.01 begin simulation * add-automatic bond torsion valence out-of-plane

148 reduce

Anhang C: Rechenprotokolle

! set dielectric = 46.7000 ! CONSTRAIN ! DEMAX=100000 aloop=1 bloop=101 100 retrieve as file number aloop ! Minimize * no cross terms * no morse * for 100 iterations * using conjugate gradients * until the maximum derivative is less than 1.0 kcal/A ! Minimize * no cross terms * no morse * for 100 iterations * using steepest descent * until the maximum derivative is less than 0.10 kcal/A ! initialize dynamics * for 5000 iterations * at 300.000 K * steps of 1.000 * no cross terms * no morse * write history file every 1000 steps * averages every 100 ! KTEMPB=1 TIMTMP=1.0 ! resume dynamics * for 10000 iterations * no cross terms * no morse * at 0.0 K ! archive as file number bloop aloop=aloop+1 bloop=bloop+1 ! if aloop.le.100 then 100 ! ! end

RGD-Modelling auf Integrinrezeptor

Minimierung des Komplexes mit Wasserhülle ! INPUT FILE FOR DISCOVER GENERATED BY INSIGHT ! ! overlap = 0.01 begin simulation * add-automatic bond torsion valence out-of-plane reduce ! set dielectric = 1.000000 ! Assign the torsion name azo to * residue BENZ 1D atom C3 * residue AZO 1E atom N1 * residue AZO 1E atom N2 * residue BENZ 1F atom C6 force azo in AZO 1E to 0 using 100.000000 ! tethered list * add side

149 * molecule 1 residue ARG+ 3 to ASP- 5

Anhang C: Rechenprotokolle

! ! Fixed atom list generation * add all * molecule 2 residue GL-n A121 to METH 1 ! ! template force with a force constant of 100.0 kcal/A2 * no cross terms * no morse * for 1000000 iterations * using steep descents * until the maximum derivative is less than 0.001000000 kcal/A ! ! end

Sampling bei hoher Temperatur ! INPUT FILE FOR DISCOVER GENERATED BY INSIGHT ! fuer AMPB Peptide in cis ! overlap = 0.01 CUTOFF=12.0 CUTDIS=10.0 SWTDIS=2.0 begin simulation * add-automatic bond torsion valence out-of-plane reduce ! set dielectric = 4.0*r ! CONSTRAIN ! DEMAX=100000 ! Assign the torsion name azo to * residue BENZ 1D atom C3 * residue AZO 1E atom N1 * residue AZO 1E atom N2 * residue BENZ 1F atom C6 Assign the torsion name a1 to * residue ALHD 1G atom O2 * residue ALHD 1G atom C1 * residue LYS+ 1 atom N * residue LYS+ 1 atom HN Assign the torsion name a2 to * residue GLY 2 atom HN * residue GLY 2 atom N * residue LYS+ 1 atom C * residue LYS+ 1 atom O Assign the torsion name a3 to * residue GLY 2 atom O * residue GLY 2 atom C * residue ARG+ 3 atom N * residue ARG+ 3 atom HN Assign the torsion name a4 to * residue ARG+ 3 atom O * residue ARG+ 3 atom C * residue GLY 4 atom N * residue GLY 4 atom HN Assign the torsion name a5 to * residue GLY 4 atom O * residue GLY 4 atom C * residue ASP- 5 atom N * residue ASP- 5 atom HN Assign the torsion name a6 to * residue ASP- 6 atom HN * residue ASP- 6 atom N

150 * residue ASP- 5 atom C

Anhang C: Rechenprotokolle

* residue ASP- 5 atom O Assign the torsion name a7 to * residue ASP- 6 atom O * residue ASP- 6 atom C * residue VAL 7 atom N * residue VAL 7 atom HN Assign the torsion name a8 to * residue AMDE 1B atom H1 * residue AMDE 1B atom N1 * residue VAL 7 atom C * residue VAL 7 atom O ! ! force azo in AZO 1E to 0.0 using 100.000000 ! force a1 in ALHD 1G to 180.0 using 100.000000 ! force a2 in GLY 2 to 180.0 using 100.000000 ! force a3 in GLY 2 to 180.0 using 100.000000 ! force a4 in ARG+ 3 to 180.0 using 100.000000 ! force a5 in GLY 4 to 180.0 using 100.000000 ! force a6 in ASP- 6 to 180.0 using 100.000000 ! force a7 in ASP- 6 to 180.0 using 100.000000 ! force a8 in AMDE 1B to 180.0 using 100.000000 ! ! ! ! ! Fixed atom list generation * add all * molecule 2 residue GL-n A121 to METH 1 ! ! initialize dynamics * for 50000 iterations * at 310.000 K * steps of 1.000 * no cross terms * no morse * write history file every 2000 steps ! KTEMPB=1 TIMTMP=1.0 ! resume dynamics * for 5000000 iterations * no cross terms * no morse * at 2000.0 K ! end Abkühlen des Komplexes ! INPUT FILE FOR DISCOVER GENERATED BY INSIGHT ! ! overlap = 0.01 CUTOFF=12.0 CUTDIS=10.0 SWTDIS=2.0 begin simulation * add-automatic bond torsion valence out-of-plane reduce ! set dielectric = 1.0 ! ! !

151

Anhang C: Rechenprotokolle

DEMAX=100000 ! Assign the torsion name azo to * residue BENZ 1D atom C3 * residue AZO 1E atom N1 * residue AZO 1E atom N2 * residue BENZ 1F atom C6 force azo in AZO 1E to 0 using 100.000000 ! ! ! Fixed atom list generation * add all * molecule 2 residue GL-n A121 to METH 1 ! Minimize * no cross terms * no morse * for 5000 iterations * using conjugate gradients * until the maximum derivative is less than 1.0 kcal/A ! initialize dynamics * for 5000 iterations * at 10.000 K * steps of 1.000 * no cross terms * no morse * write history file every 2000 steps ! KTEMPB=1 TIMTMP=1.0 ! resume dynamics * for 100000 iterations * no cross terms * no morse * at 300 K ! KTEMPB=1 TIMPTMP=1.0 ! resume dynamics * for 10000 iterations * no cross terms * no morse * at 0 K

152