38, Hef~ 14 G. SC~LLO~ und U. W~D~: Technik ffir die Eichung yon ~[e~hoden zttr Serumbilirubin-Bestimmung 703 15. ffuli 1960

W/ihrend bei Zugabe des Wirkstoffes yon Beginn des Versuches an noch eine deutliche Keimredukt ion zu beobachten war (Kontrolle: 10~, PMT nach 40 rain: 1,9 × 10 s, PMT nach 60ra in : 1,5 × 10% bestand zwischen den Wer ten der Kontrollbouil lon und dcnen der PMT-Probe, die 10ra in nach Einkippen ent- nommen waren, kein Unterschied: 1,6 × 107 (Kon- totle) und 1,5 × 107 (10rain-Bouillon). Die kurze Einwirkung yon 10 y/era ~ PMT ha t te also keine Be- einflussung im Sinne einer Bactericidie bewirkt. Da- gegen zeigte tier 20 ra in-Weft einen gewissen Effekt. Gegeniiber der Kontrol lkeimzahl yon 4,7 × 107 war der Ant ib iot icumwert any 8,4 × 106 abgesunken. Deut- licher war die Wirkung bei 35 min-Einwirkung. Die Kontrol lzahl lug bier bei 6,7 × 107 und der Antibioti- cumwert bei 4,3 × 10 s, d.h. , es lug eine Keimredukt ion um 2 Zehnerpotenzen vor. Die Konzent ra t ion 10 y/cm s PMT ha t te also ebenfalls eine gewisse bactericide Wir- kung auf die Xeime, die jedoch erst nach 1/~ngerer Einwirkungszei t (35 rain) deutlicb wurde. Bei kfir- zerer Einwirkungsdauer waren lediglieh bakteriostati- sche Effekte zu beobaehten.

Insgesamt zeigten die Ergebnisse der Warburg- Untersuchungen nnd der Keimzahtbes t immung die Tatsaehe eines deu~lichen baetericiden Effektes holler PMT-Dosierungen auf Staphytokokken. Die Resul- tare der in vitro-Versuehe lieSen jedoch nicht nu t mi t den hohen Konzentra t ionen, sondern auch bei gerin- gerer Antibiot icadosierung eine XeimabtS tung als mSglich erscheinen, wenn die Voraussetzung einer langeren Einwirkungszei t gegeben ist. Die hohen Konzent ra t ionen wirkten dagegen schon nach kurzer Zeit sicher bactericid. Die Frage naeh einer mSglichen ke imabt5 tenden Wirkung yon Tetracychnen, speziell yon PMT, auch im Organismus kann wohl dahin- gehend beantwor te t werden, da$ unter der Voraus- setzung einer m5glichst hohen Konzent ra t ion und einer gewissen Einwirkungszei t auch beim Pa t ien ten eine :Beeinflussung der Erreger sieher ist, die unter den bisherigen Bedingnngen als tetracyclinresistent anzusehen waren. Hierbei wird sich t ie r Klinik" er jedoch der Tatsache bewu~t sein, da~ die giinstige Wirkung der Tetracyclhm nur eine der Bedingungen ffir die erfolgreiche Therapie ist und da~ die Erfassung der Gesamtsi tuat ion einer Krankhe i t mal~gebend ist.

Zusammen/assung. Durch die Eflfffihrung i.v. applizierbarer Tet racycl in-Prapara te (PMT) ist die Voraussetzzung geschaffen worden, auch im mensch- lichen Organismus h6here Antibiot ica-Titer zu er- reichen, als es bisher mi t der Tetracycl iu-Gruppe mSglich gewesen ist. Die hohen Wirkstoffkonzentra- t ionen lassen eine bactericide Beeinflussung best imm- ter, oft therapieresistcnter Erregers t~mme zu. Erste oricntierende Resis tcnzuntersuchungen an 100 Staph. aur . -Stgmmen dcr Klinik crgaben sehr unterschied- liche Empfindlichkeitswerte. M]ttels Warburg-Metho- dik und Keimzahlbes t immung wurden d a r a ~ i n die bakteriostat isch und bactericid wirksamen PMT- Konzentra t i0nen bei Staph. aur. SG~ 511 festgestellt und die sich hieraus flit die Klinik ergebenden MSg- lichkeiten diskutiert. Die erzielten l~esultate besagen, da~ hohe Konzentra t ionen (50 und 25~,/cm ~ PMT) nach kurzer Einwirkungszeit in vitro bereits bacteri- cid wirken, wi~hrend nach lgngerem Einwirken yon lOy/cm a PMT mit einer Teilbactericidie gerechnet werden kann. Geringere Dosierungen wirken bakterio- statisch.

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TECHNIK F~R DIE EICHUNG VON METHODEN ZUR SERUMBILIRUBIN.BESTIMMUSTG V o n

G. SC~wLLO~G und U. W ~ D ~ Aus der Universit~ts-Xinderkltnik :~linster (WestL) (Direk~or: Prof. Dr. Dr. It . MAI)

Unlgngs t haben wir dargelegt, dal3 eine none, mit- tels einer s tandardisier ten Technik dnrchzufi ihrende Eichung aller gebr~uchtichen Methoden zur Bflirabin- bes t immung unerl~Blich ist, wenn t tberhaupt Serum- bilirubinwerte aus verschiedenen Kliniken vergleich- bur sein sollen (Sc~EnLO~G12). Bei Vergleichsmessun- gen an ikterischen Sercn ha t te sich n~mlich ergeben, da$ die in ciner Reihe yon Ins t i tu t cn nnd Kliniken ermittel ten Bilirubinwerte Unterschiede teilweise bc- tr/~chtlichen Ausmal3es zeigten.

Die wesentliche Ursachc ftir diese Abweichungen be- s tand - - wie wir feststellen konnten - - darin, dal~ die in den Arbeitsvorschrif ten zu einigen vie1 vei~-endeten Pho tome te r typen angegebenen Umrechnungsfak toren

(zur Bereehnung des Bilirubingehaltes in rag-% aus den abgelesenen Extinkt ionswerten) ialsch waren, und zwar in unterschiedlichem AusmaBe.

Das Auft re ten yon Fehlern bei der Eichung yon Bi l i rubinbesthnmungsmethoden ist nun allerdings leicht versti~ndtich, wenn die groBen Schwierigkeiten berficksichtigt werden, die beim Umgang mi t kristalli- siertem gf l i rubin bestehen und - - unbew$1tigt - - Mlzu- leicht das Eichergebnis beeinflusscn kSImen.

Bereits 1921 haben H. ~iseH~ und B ~ s c H ~ , ~ a an der Eichung der v .d . Berghsehen Bilirubinbestimmungs- methode 1 st~rkste Kritik geiibt ~ d mit eigenen Eichkurven um 60% geriugere Bilirubinwerte erhalten. Auch an der Eieh- methodik vieler in der Folgezeit entwiekelter Modifikationen des Diazoverfahrells ist manche Kritik laut geworden.

704 G. SC~LT,0~a und U. W~D~: Teehnik f/Jr die Eichung yon Methoden zur Serumbiiirubin-Bestimmung Ktinische Woehensehrift

700'

~0

G e g e n d i e E i e h u n g d e r i n A m e r i k a s e h r be l i eb~en 3/Ialloy- Evelynsehen Methode ~ fiihrten GR~Y und WH~)l~o~¢~ a an, dab der gerade Verlauf der Eiekkurve bei MAn~,oY und Ev~r~r~ nut dadureh zustande k~me, dab die Eiehung in einem ganz anderen IMilieu erfolgg sei ~ls die Routine-Bes~immungen. Sie erheben deshalb die - - eigen$1ich selbstverst~ndliche - - Forde- rung, dab bei der Eiehung das gleiehe Mitieu und der gleiehe ptf-Wer$ vorzuliegen babe wie bei der Routinebestimmung.

Ein wei~erer Angriff gegen die Eiehung der Malloy-Evelyn- schen Methode kam 1952 yon Wmr~ und D~rSCAN ~, die naeh ihreu eigenen Eiehkurven um 10% hhhere Bflirubinwerte erhiel~en.

Die rasehe Zersetzliehkei~ yon alkalisehen Bilirubinlhsun- gen zeigten J~ND~ssr~ und CL~¢~OaN 1936 ~. Sie versuehgen sine gewisse Stabilisierung fth. eine Dauer yon 5--10 rain dureh

|

0 7 d d g 5 Ze/7/~7 Std

Abb. I. Graphisehe Darstellung der Nrgebnisse wiederholter Bilirubin- bestim,mungen in Abh~ngigkeit yon der Zei~, die zwischen tterstellung der Bilirubtalhsung und Entnahme zur Bilirubtabestimmung verstriehen ist. Die ~[essungen ~ t r d e n an 2 alkalizehen. Bitirubinl~su~Ten versehiedener Ausgangdconzentrationen (d und 80 rag-% Bilirubin) sowie an etaer 10 mg- %igen Bilirubinl6sung, die nach der eigenen Arbeitsvorschrift in Serum hergestellt wurde, ausgeffihrt. Die Bestimraung erfolgt dabei dutch Ex- tink~ionsmessung des rof~n Azofarbstoffes des ~ilirubins. Die erste Be- stimmung jeder L(isung ist gleieh 100 gesetzt; die weiteren ~essungen stad aui den jeweiligen Ausgangswer~ bezogen. Bei den Bilirubta- Soda-Lhsungen wurde den Bestimmungsans~tzen etae der verwendeten AlkaIimenge ~tqui- valente ~fenge ]~ssigsi~ure zur Neutralisation zugesetzt. - - Bemerkenswert is~ die Konstanz der Bilirubinkonzentration in der Serum-Z6sung, w/i/trend eta deutlieher und ziemlich regelmiigiger Abfall in Sodalhsung zu verzeich- nen ist. 19ie Bilirubinkonzentration. der ~ rag- % igen Bilirubinl5sun9 in Soda fgllt etwa 3,5mal so schnel~ ab wie die der 80 mg-%igen Z~sung in Soda. o o 10 rag-% Bilirubin in Serum eingebracht (mit anschliegender Neutralisation der Soda16sung), o - - - - - - o 80 lng-% Bilirubta in 0,1 m

Sodal6sung, o . . . . . o 4 rag- % Bilirubta in 0,1 m Sodal6sung

Zugabe yon Coffeinkatalysator zu erreichen. Als eine andere Mhgliehkeit, die rasche Zerset, zung yon MkMisehen Bilirubin- lhsungen zu verhindern, gaben SIvo und F o ~ ~a die Zugabe yon EiweiB an.

Auf die hohe Lich~empfindlichkeit alkalischer Bilirubin- 15sungen m~chten E~zcsT und F O ~ s ~ ~ aufmerksam.

ManLo¥ und Ev~LY~ s w~esen 1937 auf Extinktionsunter- schiede bis zu 10% bei Verwendung yon BiHrubinsorten ver- sehiedener Firmen him

Um nun einen Weg aus der gegenw/irtigen Situation aufzeigen zu khnnen, in der BilirubinweI~e aus ver- sehiedenen Kliniken nur dann vergleichbar sind, wenn Methode, Photometer und Umrechnungsfaktor fiber- einstimmen, haben wit uns eingehend mi t der Eiehung yon Bilirubinbestimmungsmethoden befaBt. Dabei war es unser Ziel, eine m6glichst zuverlgssige und wenig anf~llige Teehnik auszuarbeiten, die sieh zur Eiehung aller gebr/iuchhehen Methoden eignen sollte.

Voraussetzungen /i~r die Herstellung einer stabilen Bilirubin-Lhsung

K/£uffiches, kristallisiertes ( ~ indirekt reagieren- des) Bilirubin ist nu t in alkalisehen L6sungsmitteln oder in Chloroform 15sheh. Die Chloroforml6sung jedoeh ist mi t den w/~Brigen Reagenzien ohne Lhsungs-

vermitt ler nicht mischbar. Bei den alkalischen L6sun- gen besteht die Hauptsdhwierigkeit darin, dab sich das Bflirubin in ihnen rasch zersetzt ( Jv.~D~ASSEK und CL~G- ~O1~6). U m dies weitgehend zu vermeiden, muB man folgende Punkte beaehten:

1. Da alkalische Bfiirubinl6sungen sehr lichtemp- ]indlich sind ( E ~ s T und FhRSTE~2), soll man bel gediimpftem kiinstlichen Licht und hie bei hellem Sonnenticht arbeiten.

2. Wie wir in eigenen Untersuehungen feststellten, sind hohe Bilirubinkonzentrationen in alkalischen L6sungsmitteln welt besser haltbar als niedrige (Abb. 1). Eine 80mg-%ige Bilirubinlhsung (Lhstmgsmittel: 0 , 1 m Na~C03) war nach 5 Std um etwa 1/7 der Aus- gangskonzentrati0n abgefallen, eine 4mg-%ige da- gegen bereits um die Hglfte. Bei der Eichung sollte daher nut yon relativ hoehkonzentrierten Lhsungen ausgegangen werden.

3. Das zum L6sen unumgKnghehe alkahsehe Milieu (Sodalhsung) daft nur so kurz wie rn5glich auf das Bflirubin einwirken, d .h . nur solange, bis eine klare Lhsung entstanden ist (max. 10 rain).

4. Eine Zersetzung des Bilirubins wird am sieher- sten dadurch verhindert, dab die Bilirubin-Sodalhsung in Serum eingebracht wird. Die Eiwei0k6rper fiben einen Sehutz auf das B'flirubin aus (Srvo und Fo~aAI13). Aul~erdem ist dann die Voraussetzung ffir eine Neu- trahsat ion der Sodal5sung (s. Punk t 5) gegeben, da das Bflirubin im Serum nicht mehr ausf~llt.

5. Wenn aueh das Einbringen in Serum sehon in- folge der Pufferwirkung der Eiweifik6rper eine gewisse Abschw/~chung der alkahschen Reaktion bewirk~, so seheint es doeh am zweckm~gigsten, die mit der Bili- rubinldsung in das Serum eingefiihrte Menge Alkali dutch eine &luivalente Menge S~iure zu neutralisieren. Wit verwenden dazu Essigs/iure.

Die Neutralisation ist vor allem deshalb empfeh- lenswert, weft der JFarbcharakter des Azobilirubins in starkem Marie p~-abhgngig ist. Diese Tatsaehe stellten wir dadurch lest, dab wir in dem nach J~D~ASSI~ und CT,~G~o.~¢ durehgeffihrten Bestimmmlgsansatz den 1 em 3 Serum durch 1 cm 8 Bilirubinlhsung in 0,2 m Na2CO ~ ersetzten. Dabei entstand, offenbar dureh das L6sungsalkah bedingt, kein rein roter, sondern ein braunroter Azofarbstoff des Bilirubins, der weniger als 50% der zu erwartenden ]3"arbstoffextinktion auf- wies. Neutrahsat ion des 1 cm ~ 0,2 m Sodalhsung (lurch die /~quivalente Menge 4 n Essigs/iure vor Zu- gabe des Diazogemisehes hebt die Wirkung des Lhsungs- alkalis weitgehend auf, so dab bei der Best immung ein roter Farbstvff yon 85% der zu erwartenden Extink- tion entsteht.

Berficksichtigt man die bier angef/ihi~en Gesiehts- punkte, so 1/igt. sich - - mi t der unten im einzelnen auf- gefiihrten Technik - - eine Bilirubinl6sung herstellen, die den Vorzug hat, das Bihrubin in seinem physio- logisehen Milieu ffir die Eichung zur Verffigung zu stellen und/~uBerst stabil zu sein. In Abb. I i s t neben den Zersetzungskurven einer hoch- und einer niedrig- konzentrierten Bilirubinl6sung in alkahsehem Milieu (0,1 m Sodal6sung) der fiber 5 Std verfolgte und voll- kommen konstant gefundene Bilirubingehalt einer Lhsung in Serum dargestellt. Eine weitere Messung 25 Std naeh Herstellung der Lhsung ergab wiederum ann/ihernd den gleichen Wert (98,4% der Ausgangs- konzentration).

,If. as, t[eft 1~ G. S e n ~ n o ~ and U. WE:~D~: Technik ffir die Eichung yon Methoden zur Serumbilirubin-Bestimmm~g 705 15. Juli 1960

Reagentien

150 mg Bilirubin (pro Versuch 40 rag) yon bekarm- tern P~einheitsgrad; z .B. 2 Packungen zu je 0,1 g Bi]irnbin Hoffmann-La Roche (Reinheitsgrad 96%).

Die t~Shrehen werden ge6ffnet in einem Exsiccator und vor Licht gesehfitzt aufbewahrt.

0,1 m Sodaldsunff : Natr. carbonic, anhydr. 10,6 g Aqua dest. ad 1000,0 ems

4 n Essigsiiure: Eisessig (96%) 25,0 g Aqua dest. ad 100,0 cm ~

30 cm ~/risches Serum (pro Versueh), das yon einer nfieh~ernen, gesunden Person gewormen worden isL Ben6tigt werden dazu etwa 70 em~ Blur, das man etwa 1 Std stehen l~g~ und dann zen~rifugierg. Das Serum wird abgehoben und noehmals ery~hroeytem frei zen~rifugiert.

ArbeitsvorsehriCt

I. Herstellung eine8 um lOmg-% Bilirubin an- gereieherten Serums:

13,9 cm ~ Serum werden in einen ldeinen Erlen- meyer-Kolben gegeben.

2,0era ~ einer soeben hergestellten 80mg-%igen BilirubinlSsung werden hinzugeffigt (fiir gutes Misehen sorgen !).

Herstellung der 80 rag- % igen BilirubinlSsung : 40 mg Bilirubin werden an der Analysenwaage in ein W/~ge- gl/~sehen eingewogen und mit 0,1 m SodalSsung in einen Mcgkolben yon 50 cm ~ gespfilt. Der MeBkolben wird zu etwa a/~ mit SodalSsung aufgef/illt umd vor- siehtig 5--10 rain gesehwenkt (nieht schfitteln, da zu starke Sehaumbildung !). Sobald eine Mare L6sung entstanden ist, wird mit SodMSsung bis zm ~ Eich- marke aufgeffillt und nach mehrfaehem Umdrehen des KoIbens sofort die f~r den Versuch benStigte Menge (2 em a) entnommen.

0,1 ems (:= eine BluSzuekerpipette) ~ n Essigsgure wird zur NeutrMisation dem Inhalt des Erlenmeyer- kolbens zugesetzt. Es muB gut umgeschfittelt und die CO~-Enbwicklung abgew~rtet werden (S~opfen lfiften).

11. Herstellung einer LSsung zur Kompensation des Serumeigengehalte8 an Bilirubin :

13,9 cm ~ desselben Serums, das bei I verwendet worden ist. 2,0 cm ~ 0,1 m Sodalgsung. 0,1 em~ ( : eine Blutzuekerpipe~te) 4 n Essigs5ure.

(Behandlung wie oben un%er I). I I I . Ermittlung des Umreehnungs/a/~tors U: (f/ir das

Verfahren nach JEND:~ASSIK und C L E ~ o ~ gelten be- sondere Verhi~ltnisse, so dab die Eiehung dieser Met;bode unten bei V gesondert besehrieben wird.)

1. Das naeh Verfahren I mit Bflirubin angereiche~e Serum wird nach der Arbeitsvorsehrift der zu eichen- den Methode wie ein Patien~enserum yon etwa 10 mg- % Bilb:ubingehal~ verarbeite~, so dab sieh Hanptansatz und VergleichslSsung in nichts yon den Routinemes- sungen unterseheiden. Die zwr Bestimmung verwen- dete Serummenge soll so bemessen werden, dag der am Photometer abgelesene Extinktionswert mSgliehst nieht fiber 0,6 liegg. F/Jr das auf 1 cm a Serum ein- gestellte Verfahren naeh J~NDaASS~X und G~6~ ~ emp- fiehlt es sieh, jeweils 0,1 em~ Serum zu nehmen (mit Blutzuekerpipette abmessen und in die vorgelegten LSsungen ausblasen trod naehspfilen!) tmd den An- s/itzen zur Auffiillung 0,9 em a physiologisehe NaC1-

Klin. Wsohr., 38. 5ahrg.

L6sung hinzuzuffigen. Der abgelesene Extinktions- wert (E) mug auf die in der verwendeten Methode vor- geschriebene Serummenge und auf 1 cm Cuvetten- sehiehtdicke umgerectmet werden. Der resultierende Wert wird mi~ Ez bezeichnet.

E . M

S = Cuvet~ensehiehtdieke in Zentime~er, M = in der ~ethode verlang~e Serummenge in Kubikzentimeter, m : bei der Eichung verwandte Serummenge in Kubikzen~imeter.

2. Das naeh Verfahren I I behandelte Serum (Eigen- gehalt des Serums an Bflirubin) wird in gleieher Weise unter Verwendung derselben Serummenge wie bei I I I , 1 verarbeitet. E~z ist die auf 1 cm Cuvetten- schichtdicke und die vorgeschriebene Serummenge be- zogene Extinktion.

3. Die Formel zur Erreehnung yon U laatet:

(rag- % Anreicherung) • (I~einheitsgrad des Bflirubin- U = pr~parates in %)~

Bei Verwendung yon Bflirubin I-Ioffmann-La Roche (96 %ig) :

10" 96 U =

100- (E± -- E ~ )

Es empfiehlt sich, zur gr613eren Genauigkeit mit jedem der Ans~tze I und I I 3real die 5Iessung fiir die Eichung durchzufiihren. Ferner ist es wiinschenswert, die An- s/~tze I u n d I I selbst 3mat mit jewefls neuer Einw/~gung yon Bilirubin herzustellen. Es ergeben sich somit ins- gesamt 3 X 3 Messungen. Von diesen 9 Bestimmungen wird daml der Mittelwert genommen.

Eichung de+" eigenen MiT~romethode zur Bestimmun9 des direkten Bilirubins~2% Da noch kein direk~ reagierendes Bili- rubin zu Eichzwecken zur Verfiigung s~eht, muI~ man auf das k/~ufliche indirel~ reagierende Bilirubin zuriickgreifen. Dieses benOtig~ aber fiir die Kupplung zu Azofarbs~off einen Kata- lysator. Deshalb mut~ man bei der Eichung der Methode so- wohl im Hauptansatz wie in der Vergleichsl6sung 2 cm s der KochsalzlOsung durch Coffeinkatalysatorgemisch (nach J ~ - D~ASSYK und Cr ,~no~ s) ersetzen (start 4,4 em a physiologische NaC1 also bei der Eichung: 2,4 cm ~ physiol. NaCI.~- 2,0 cm s Cotifeinkatalysator). Abgesehen yon dieser Xnderung werden die Eichl6sungen I und II genauso verarbeitet wie oben beschrieben.

I V. Bestimmung des Serumbilirubins mit Hil/e des ge/undenen Umrechnungs/aktors U:

1. Diazomethoden, die Serum in der Vergleichs- lgsung verwenden. (3/[ethoden nach MAv.~oY nnd Ev~- LY:N9~ PeW:ELL 11, HSIA e~5 8,1.5 JENDRASSIK Lu~d Gi~6F 7 sowie die eigene Nikkromodifika~ion zt~* Bestimmnng des direkten Bilirubins als ro~en Azofarbstoff l~a) sowie Aeetonmethoden (z. B. naeh M~TZ und W]~ST10). (Methode nach JE~DlCASSrK und Cn]~¢gOm< s s. unten bei V.)

Die Berechnung erfolgt gem/~l~ tier Formel:

rag-% : U. E

E ~- abgelesene Ex~inktionswerte, S = C, avettenschichtdicke in Zentimeter.

Bei tier Jendrassik-GrSfschen 5~ethode 7 maeht sich noch in sehr geringem ~age die Extinktion des getben Azofurb- stoffes bemerkbar, der durch Kupplung des Diazogemisehes in Gegenwart yon Coffein und Fehling II entsteht. Die Ex- tin.ktion, die diesem gelben Kupplungsprodukt zukommt, ist jedoeh so gering, dab sie anberiicksichtigt bleiben kann. Der Vollstgndigkeit halber sei die Bestimmung dieser GrSBe er- w~hnt: In tIauptansatz und VergleichslSsung wird das Serum fortgelassen und dutch dieselbe 3/lenge physiologiseher Koch- salzlSsung ersetz~. Die gemessene Extink~ion, auf 1 em Cuvet- tenlgnge bezogen, sei mlt E D bezeichnet. Die Kompensations-

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706 G. Se~ELLO~¢ m~d U. WE~D~: Teehnik fiir die Eiehung yon Methoden zur Serumbilirubin-Bes~immung Klinische W0chenschrift

gr61~e D, die man vom Ergebnis jeder Bilirubinbestimmung abziehen miiB~e, ergib~ sieh aus der Formel: D = U.E1). In eigenen Versuehen wax D ' = 0,00028.

2. Diazomethoden, bei denen Aqua dest. als Ver- gleichsldsunff verwendet wird (JEND~SS~K und G]~6~ ~, eigene Mikromodifikation zur Bes~immung des Ge- samtbil irubins~a). }Vird Aqua dest. an Stelle der Vergleiehsl6sung verwendet, so mfissen zus~tzlieh zu der oben entwickelten Formel noeh die Korre]~4ions- grdfien K~ und K~ berfieksiehtigt werden. K~ ergibt sieh aus der n icht kompensier ten Absorpt ion der I~eagenzmittel und des gelben Kupplungsproduktes des Diazogemisehes in Coffeinkatalysator. K~ ist auf Serumtrfibmagen und anf die im Serum auBer Bilirubin noeh vorhandenen Farbs~offe zurfickzuffihren.

Die Formel zur Bereehnung des Bilirubingehaltes laute t da~m bei Verwendung der vollen Serummenge yon 1 em ~ bei der Originalmethode a nd yon 0,1 ems bei der Mikromodif ikat ion:

mg-% - : U . - ~ - - K~ - - K~

zusammengefaBt: E

rag- % -- U- - ~ - - K , wobei K ---- K~ 4- Ke ist.

Steht bei einer Bestimmung nur wenig Serum zttr Ver- fiigung, so lautet die Formel bei der Originalmethode:

E K~ K~ rag-% == U- S - m m

und bei der eigenen Mikromethode:

m g - % = U - E K1 - - -K~. lO .S .m 10;m

Dabei ist m die zur Bestimmung verwandte Serummenge in Kubikzentimeter.

/ Zur Bestimmung von 1£1 verwende~ man folgenden A~satz :

1,0 em a physiol. NaC1 -t- 2,0 ems Coffeinkatalysator + 0,5 em a Diazogemiseh

n~ch 10 rain -t- 1,5 cm a l%hlmg I I . Die Messung erfolgt naeh weiteren 5 min gegen

Aqua dest. als VergMchslSsung bei Fil ter S 59 E. Der Mittelwert yon 5 solchen Messungen, bezogen ste~s auf eine Schichtdicke yon 1 era, sei E / h ; so ist K~ -= U, EK~.

Zur Beztimmung yon K~ werden 10 bil irubinarme Seren wie folgt behandel t :

~auptansatz Vergleichsl6suug

1,0 cm ~ Serum -~ 2,0 em a Coffeh~ka~alysa~or + 0,5 em a Aqua dest. nach 10 rain q- 1,5 cm a ~'ehling I I

1,0 cm a physiol. NaCI q- 2,0 em ~ CoffeinkaSalysator 4- 0,5 em a Aqua dest. naeh 10 rain -k 1,5 cm ~ ~'ehling I I

Die Messung erfolgt naeh weiteren 5 rain bei Fil- ter S 59 E. Der Mittelwert der 10 Messungen sei G. So ist bei der Originalmethode:

K~ = U . G , bei der Mikromethode:

K~ = U . ~--0- "

U sind die jeweiligen Umreehnungsfaktoren der Methode.

Eigengheh miiBte noch die durehschnitffiche Exgink~ion des in den 10 gemessenen Seren vorhandenen (nich~ zu Azo- farbstoff gekuppel~en) Bflirubins yon G subtrahier~ werden. Bei Nichtberiicksich~igung dieser GrOBe ents~eht jedoeh naeh eigenen Untersuehungen tedigllch ein ~eMer, der e~wa 2% yon 32 ausmaeh~ and infolgedessen vernaehlhssig~ werden darf.

V. Die Eichung der Methode nach JENDRASSIK und CL~G~OnX

Bei der Methode zur Serumbil i rubinbest immung von JENDR~_SSIK und CLEGHORN 6 wird zur Aussehal- tung der sog. , ,braunen Diazoreakt ion", die ve t allem bei Urgmikern stSrend des MeBergebnis beeinflugt, bei 2 F i l t em gemessen. Die Umrechnung in rag-% Bili- rubin effolgt nach einer yon den Autoren ermittel ten Formel. Eine neue Eiehung dieser in Deutschland sehr verbrei teten Methode erscheint dr ingend notwendig, da die Umreehnungsfaktoren der 0riginalarbei t am visuellen Pulfrieh-Pho~ometer mi t den daffir typischen Fil tern ($43 und $53) e~ni t te l t worden sind. Eine Ubernahme der MetJaode atff die modernen Elektro- photometer ist sehon wegen der Versehiedenheit der Filter nieht o lme neue Eichung m6glieh. Gem/iB den Angaben fiber die Eichung in der Originalarbeit yon J~D~ASSrK und C T . ~ G ~ o ~ und fiber die Verein- fachung zur Bes t immung yon z~ in der Arbeit yon JI~NI)tCASSIK und RI~I~¥-Sz~kB6 s sehlagen wir den im folgenden gesehilderten Vgeg zur Eichung der ~Iethode vor. Wir haben dabei die S-E-Fil ter yon Zeiss zu- grunde gelegt. Bei Verwendung yon Pho tomete rn anderer ~ i rmen sind die entsprechenden Filter (Ab- sorp t ionsmaximum bei 520--540 m# und 430--450 m/z) zu verwenden. V611ig ungeeignet ist naeh eigenen Untersuehungen das Filter S 42 E, da sieh bei dieser Wellenlgnge die ,,gelbe Diazoreakt ion" sehr stSrend bemerkbar maeht . Wir sckdagen deshalb als Ersatz f fir das alte Filter S 43 das Elektrophotometer-Fi l ter S 45 E v o r . t¥ei terhin ist bei der Eichung zu beachten, dab die Ablesung mi t dem S 45 E-Fi l ter genauestens zu dem vorgesehriebenen Zeitpunk~ effolgen muB (h6ch:stens bis zu 5see fffiher oder spgter!).

Bestimmung yon E~:

Hauptansa~ VergleichslSsung

2,4 cm s Aqua dest. ~- 2,0 em 3 Coffeingemiseh + 0,I em a EiehlSsung I + 0,5 cm 8 Diazogemisch

2,9 cm ~ Aqua. desk. + 2,0 am a Coffeingemisch + 0,1 cm a EichlSsung I

~Naeh 5 rain wird die Ext ink t ion des HauptansaVzes gegen die Vergleiehs16sung bei Filter S 45 E gemessen; man erh£1t EI/a5. Sofort ansch]ieBend wird dieselbe 5[essung bei Fil ter S 53 E ausgefiihrt; man erh~lt EI/5a.

Bestimmung von E H.

Hauotansatz VergIeichsl6sung

2,4 cm ~ Aqua dest. + 2,0 cm a Coffeingemisch ~- 0,1 cm a EichtSsung I I -t- 0,5 cm 3 Diazogemisch

2,9 cm a Aqua dest. -t- 2,0 cm a Coffeingemisch -t- 0,1 cm ~ EichlSsung I I

Nach 5 rain wird die Ext ink t ion des t Iaup tansa tzes gegen die VergleichslSsung bei Fil ter S 45 E und S 53 E gemessen. Man erhiilt EH/45 und EH/~s.

N u n ist E~153--EHIsa :=E~I5 a und weiterhin :

10. E~/a a • 100 ~]1 i~ • ~(Anreicherung der Eich15sung I (Reinheitsgrad des Bill

an Bilirubin in rag- %) xubinpr~parates inj %) Bei Verwendung yon BilJrubin Hoffm~nn-La Roche:

10. Ed/sa" I00 10- 96

Jg. 3S, Heft 1~ W. SerenADE et at. : Gaschromatographisehe Untersuchungen der Serumfetts~uren des Menschen 707 15. Jul i 1960

Ent sp rechend i s t Ez/~--EH/4~--:EA/45 und wei terhin 10" E ~ • 100

~ ~ (Anreicherung der Eich16sung I (l%einhei~sgrad des ]~ili- an Bilirubin in rag- % ) " rabinpraparates in % )

Bestimmung von ~. a) Zur Bes t immung yon ~ Wer- den mehrere Seren m i t s t a rker , ,brauner Diazoreak- t ion" ben6tig~. Geeignet dazu s ind Seren yon ur/~mi- schen Pa t i en t en m i t hohem l%est-N (fiber 100 rag-%) und n iedr igem Serumbi l i rub in (unter 1 rag-%). Jedes dieser Seren wird wie folgt behande l t :

Hauptansa tz VergleichslSsung

1,5 cm ~ Aqua dest. -~ 2,0 cm a Coffeingemisch -}- 1~0 cm s Serum -~- 0,5 cm a Diazogemiseh

2,0 cm s Aqua dest. + 2,0 cm a Coffeingemisch -}- 1,0 cm a Serum

Genau 4 rain ( ± 5 see) naeh der Diazozugabe wi rd der H a u p t a n s a t z gegen d ie VergleichslSsung bei F i l t e r S 4~5 E und danaeh be i S 53 E gemessen. Die Ex t ink - t ionswer te sollen m i t E~/~ und E~/~ bezeichnet wer- den. 30 rain nach der Diazozugabe werden die L6sun- gen noeh einmM bei be iden F i l t e rn gegeneinander ge- messen. Man erha l t d ie E x t i n k t i o n Eso/a s u n d E30/5 S.

b) We i t e rh in i s t zur Bes t immung yon ~ die K e n n t - his der E x t i n k t i o n s w e r t e der sog. , ,gelben Diazoreak- t ion" erforderl ieh, die m a n wie io lg t erh/~lt:

IIauptansatz VergleichslSsung

2,5 em 3 Aqua cles~. + 2,0 cm ~ Coffdngemisch + 0,5 cm ~ Diazogemisch

3,0 cm a Aqua dest. + 2,0 cm ~ Coffeingcmiseh

Wie bei a) wird aueh bier 4 und 30 rain nach der Diazo- zugabe jeweils bei F i l t e r S 45 E und S 53 E gemessen. E n t s p r e c h e n d e rha l t m a n die E x t i n k t i o n e n S~/~5 und S~/~a sowie $30/4 ~ und $30/~ S.

e r rechnet sieh dann folgendermaf~en:

Die endgi i l t igen Umreehnungs fak to ren U nnd F er- reehnen sich aus den gefnndenen W e r t e n ffir v ~, 7J und y~ nach den beiden F o r m e l n :

1 U ~- F - -

~'71--7~ ' ~'7~--7~ 3~ t diesen Umrechnungs i ak to ren l au t e t d ie endgfil t ige F o r m e l zur B i l i rub inbes t immung m i t der Jendrass ik- Cleghornsehen Methode :

rag-% ----- U-E53 - - F . (Ea~ - - S a / J . D~rin s ind U, F u n d $4/~ durch die vorangehende E ichung bes t immte Kons t an t en . E ~ bedeu te t die E x t i n k t i o n des zu un te r suchenden Serums bei F i l t e r S 53 E und Et~ die E x t i n k t i o n desselben Serums bei F i l t e r S 45 E.

Zusammen/assung. Es wi rd eine Teehnik angegeben, m i t deren HiKe es m6gl ieh ist , alle gebr/~ueh]iehen Methoden zur Se rumbf l i rub in -Bes t immung einer zu- verl/~ssigen Eiehung zu unterz iehen. Wieh t ige r Be- s tandtef l dieser Techn ik i s t d ie l=ierstellung einer s tabf len Bi l i rubinl6sung in Sermn, deren Bil i rubin- geha l t im Gegensatz zu dem rasehen Konzen t ra t ions - abfa l l der me]st ve rwende ten a lkal i sehen Bi l i rubin- 15sungen fiber viele S tunden k o n s t a n t b le ib t .

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GASCHROMATOGRAPHISCHE UNTERSUCHU~GE~ DER SERUMFETTS~UREN DES MENSCHEN

I I . Mi t te i lung

Beitr~ge zur Regula t ion der unveres ter ten Fetts~iuren

V o n

W. SC~ADE, E. B6HLE, 1%. BIEGLE~ a n d C. S~BEL

Aus der I. Medizinischen Universit~itsklinik

I .

I m J a h r e 1956 wurde yon DOLE, sowie yon Go~Do~ u. Mitarb. gezeigt, da~ die unveresterten Fetts~uren des Blutes (UFS) auf zahlreiehe Einilf isse m i t auBer- ordent l ieh groBer Geschwindigkei t reagieren.

Die b isher igen Beobach tungen seheinen d a r a u i hin- zudeuten , dab die U F S die jenige F o r m sind, in. der de r Organismus F e t t r e s e r v e n kurzf r i s t ig auf dem Blutwege ffir energet ische Zwecke zur Verffigung stell t . I m Hunge r s te igen sic an (DoL~, Go~Do~¢ u. Mitarb., LA'~'~ELL, AL~r~K u. IVlitarb., SGHI~ADE u. Mitarb.). I)urch k6rper]iche Arbeit werden sie ver- mindert (CAaLSo~ u. ~¢E.tarb.). Im ven6sen Blur des Coronarsinus ist ihr Gehalt niedriger als im arteriellen Blur (G0~DOI~ u. Mitarb.). Andererseits ~anden

Frankfur t a. ]~L (Direktor: Prof. Dr, F. ]to~F)

GogDo~- u. Mitarb . , sowie RO~EIM u. SPITZE~ im Blur der Vena saphena einen wesent l ieb h6heren UFS-Sp iege l als ira Blur der A. femora]is.

Die Abh/~ngigkeit der U F S - R e g u l a t i o n ve to Koh- lenhydra ts tof fwechse l dokume n t i e r t sich dar in , dab der U F S - G e h a l t be im nf ichterncn 1VIenschen p r o m p t erniedr ig t wird du tch Gaben yon Glucose (DOLE, GO~DO~ u. Mitarb.) , F ruc tose (BIE~a~A~ u. ~ l i ta rb . , ST~aLFAW~a U. Z6LL~E~), yon Insnl in (DOLE), Gluca- gon (BIE~M_~ u. Mitarb . ) und T o l b u t a m i d ( B I E ~ . ~ u. Mitarb.) . Diese Reak t ionen der U F S werden meis t so gedeute t , dal3 ihr AbfaI1 im Blu te dureh eine Drosse- lung des Naehschubs zus tande k o m m e n sell.

Der Nfiehternspiegel der U F S konn te auch dureh Gaben yon Aminos~u:ren (GogDo~¢ u. 1Kitarb.) und

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