Thermische Auffaltung von Myoglobin Optische Verfahren · 4 Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus • Allgemeines zum natürlichen Licht – elektromagnetische Wellen

Thermische Auffaltung von Myoglobin

Optische Verfahren

Thomas Riedel

Philipp Wölte

25.05.05

Apparative Methoden

2

Überblick

• Grundlagen der Optischen Rotationsdispersion und des Circulardichroismus

• Grundlagen der Fluoreszenzspektroskopie

• Anwendung dieser Optischen Methoden auf Myoglobin

Apparative Methoden

3

Grundlagen der Optischen

Rotationsdispersion und des Circulardichroismus

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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus

• Allgemeines zum natürlichen Licht

– elektromagnetische Wellen verschiedener Wellenlängen

– elektrische und magnetische Feldvektoren isotrop im Raum verteilt

– elektrischer und magnetischer Feldvektor stehen senkrecht aufeinander

– überlagerte Transversalwellen in verschiedenen Ebenen

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• Linear polarisiertes Licht

– elektrischer Feldvektor schwingt nur in einer Ebene mit einer Wellenlänge

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– Kann aus zwei linear polarisierten Wellen dargestellt werden

• Feldvektoren senkrecht aufeinander

• Schwingung mit gleicher Wellenlänge

• Schwingung in gleicher Phase

7



– Addition zweier in gleicher Phase schwingender Wellen:

8



aus Vektoraddition ergibt sich:

linear polarisiertes Licht in anderer Ebene:

9



– Erzeugung aus isotropen Licht durch Polarisationsfilter:

• Filter besteht aus Kunststoffolie mit eingelagerten dichroitischen Kristallen

• doppeltgebrochenes Licht kann nur in einer Orientierung durchtreten

• Licht in der anderen Orientierung wird absorbiert

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– kann aus zwei linear polarisierten Wellen dargestellt werden


• Schwingung in gleicher Phase

– kann auch aus zwei circular polarisierten Wellen entgegengesetzter Drehrichtung dargestellt werden

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• Circular polarisiertes Licht

– aus zwei linear polarisierten Wellen


• Schwingung mit gleicher Wellenlänge/Amplitude

• phasenverschoben um 90°( λ/4 )

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– Addition zweier um 90°-phasenverschobener Wellen liefert:

• rechtscircular polarisiertes Licht– in Ausbreitungsrichtung blickend im Uhrzeigersinn

• linkscircular polarisiertes Licht– in Ausbreitungsrichtung blickend gegen Uhrzeigersinn

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-rechtscircular polarisiert:

-linkscircular polarisiert:

mit Uhrzeigersinn

gegen Uhrzeigersinn

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– Erzeugung durch das λ/4-Plättchen:

• x- und y-Komponente eines linear polarisierten Lichts werden unterschiedlich stark gebrochen

� Phasenverschiebung um 90°

Eine Komponente gewinnt bei Durchtritt durch das λ/4-Plättchen zeitlichen Vorsprung ∆t

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• Optische Rotationsdispersion (ORD)

– Physikalisches Prinzip:

• unterschiedliche Brechungsindices in optisch aktiven (chiralen) Substanzen

• unterschiedliche Winkelgeschwindigkeiten für links- und rechtscircular polarisiertes Licht

• zeitlicher Vorsprung einer circular polarisierten Komponente nach Austritt aus der Substanz

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• Optische Rotationsdispersion

– Situation nach Austritt zweier circular polarisierter Wellen gleicher Amplitude aus einem optisch aktiven Medium

Änderung der Polarisationsebene um den Drehwinkel α

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• Optische Rotationsdispersion

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• Optische Rotationsdispersion– um α als spezifische Stoffkonstante angeben zu

können, bezieht man sich:• auf die Konzenration [c]

• auf die Schichtdicke d der Probe

– Angabe von Drehwert [α] explicit mit Temperatur und Wellenlänge

– Drehwert:

– bei Polymeren:

[ ]T

c dλ

αα =

⋅

3deg cm

g dm

⋅

⋅

[ ] [ ]T T MRWm MRW

c dλ λ

αα

⋅= ⋅ =

⋅

2deg cm

dmol

⋅

MRW: „mean residue weight“ (mittlere Molmasse)

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• Circulardichroismus (CD)

– Physikalisches Prinzip:

• zusätzlicher Effekt zur ORD

• ungleiche Absorption von links- und rechtscircularpolarisierten Licht durch optisch aktive Moleküle

• unterschiedliche Extinktionskoeffizienten (ε) der optisch aktiven Substanz bezüglich den links- und rechtscircularpolarisierten Wellen (εl≠εr)

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• Circulardichroismus

– Situation nach Austritt zweier circular polarisierter Wellen aus einem optisch aktiven Medium:

ungleiche Amplitude

Elliptizität Θ bei Austritt aus einem optisch aktiven Medium

21



22



– Elliptizität ist definiert als der Arcus-Tangens des Verhältnisses von kleiner Halbachse (b) zu großer Halbachse (a)

arctanb

aΘ =

b

aΘ =

,da b<<atan Θ = Θ

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– In Analogie zur ORD:

• spez. Elliptizität:

• Bei Polymeren:

2deg cm

dmol

⋅

2deg cm

dmol

⋅

:g

cmol

MRE: „mean residue ellipticity“

MRW: „mean residue weight“ (mittlere Molmasse)

[ ]T

c dλ

ΘΘ =

⋅

[ ]T

MRW

MRWMRE

c dλ

⋅Θ= Θ =

⋅

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• Schematischer Aufbau eines CD-Spektrometers:

L: Xenon-Lichtquelle

MC: Monochromator

P: Polarisator

Mod: Modulator

PR: Probenraum

PM: Photomultiplier

S: CD-Spektrum der Substanz

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Grundlagen der Fluoreszenzspektroskopie

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Fluoreszenzspektroskopie

• Fluoreszenz:

– Emission von Licht, die nur solange auftritt, wie die fluoreszierenden Moleküle durch Lichtabsorption angeregt werden

– fluoreszierende Moleküle werden Fluorophoregenannt

• in Proteinen: Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin

– Fluorophore absorbieren Licht spezifischer Wellenlänge für das jeweilige Molekül

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• Morsepotential

– für r � 0:

• E �∞

– für r �∞:

• E � Dissoziations-grenze

– Gleichgewichtsabstand (r0)

Dissoziation

Abstoßung Anziehung

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• Quantelung der Energie

Schrödingergleichung:

1

2n

E h nν

= ⋅ ⋅ +

H EΨ = Ψ

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• Quantelung der Energie

Schrödingergleichung:

Aufenthaltswahrscheinlichkeit:(„Born´sche Interpretation“)

(„Korrespondenzprinzip“)

1

2n

E h nν

= ⋅ ⋅ +

H EΨ = Ψ

*Ψ ⋅Ψ

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• Erster elektronisch angeregter Zustand (S1)

– um ∆E erhöhte Energie

– um ∆r erhöhter Gleichgewichtsabstand (r1) aufgrund einer größeren Elektronenwolke

∆∆∆∆E

∆∆∆∆r

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• Licht aus UV-Vis-Bereich wird vom Molekül mit spezifischer Wellenlänge absorbiert

• Elektronischer Übergang (Absorption nach „Franck-Condon“)

– S0 � S1

– gleichzeitige Anregung von Schwingungen

• Anteile der Schwingungsenergie können durch WW an Umgebungs-molekülen (z.B. Lösungsmittel) übertragen werden

• gelangt strahlungslos in den elektronisch angeregten Schwingungsgrundzustand

• Elektronischer Übergang unter Lichtemission („Franck-Condon“)

– S1 � S0

Absorption Emission

Schwingung

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Absorption Emission

• Licht aus UV-Vis-Bereich wird vom Molekül mit spezifischer Wellenlänge absorbiert

• Elektronischer Übergang (Absorption)

– S0 � S1

– gleichzeitige Anregung von Schwingungen

• Anteile der Schwingungsenergie können durch WW an Umgebungs-molekülen (z.B. Lösungsmittel) übertragen werden

• gelangt strahlungslos in den elektronisch angeregten Schwingungsgrundzustand

• Elektronischer Übergang unter Lichtemission

– S1 � S0

• Emissionswellenlänge immer größer als Anregungswellenlänge

Schwingung

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• Schema eines Fluoreszenzspektrometers

Fluoreszenzemission wird im 90°Winkel zur Ausbreitungsrichtung des Anregungsstrahls gemessen

Monochromatisierung des Lichtes

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Anwendung dieser Optischen Methoden auf Myoglobin

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Versuch

• Strukturen der Proteine

Primärstruktur (AS-Sequenz)

Sekundärstruktur(α-Helix; β-Faltblatt)

Tertiärstruktur(räumliche Anordnung)

Quatärstruktur

(Proteinkomplex)

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Versuch

• Strukturen der Proteine

Sekundärstruktur(α-Helix; β-Faltblatt)

Tertiärstruktur(räumliche Anordnung)


CD-Spektroskopie

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Versuch

• Untersuchung der thermischen Auffaltung von Proteinen

• Annahme: 2-Zustands-Modell

entweder:

– Nativ (biologisch funktionsfähig) N

oder:

– Denaturiert (biologisch inaktiv) D

DK

N=

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Versuch

• Anwendung dieser Methoden auf Myoglobin

• Myoglobin:

– Protein (Biopolymer) besitzt Chiralitätszentren

• chirales α-C-Atom

• axiale Chiralität (α-Helix, β-Faltblatt)

Optische Aktivität

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Versuch

• Optische Aktivität

[ ]Θ

Effekt ORD und CD stets gekoppelt

[ ]α

Versuch zur Bestimmung der Sekundärstruktur

40

Versuch

• Nativer Zustand

– Im N-Zustand ist Signal Θ relativ groß, da:

• Großteil optisch aktiver C-Atome in chiraler Umgebung

• Optisch aktive C-Atome räumlich nah beieinander

– unterschiedlich starke Absorption von links- und rechtcircular polarisiertem Licht

Starkes Signal

41

Versuch

• Denaturierter Zustand

– Im D-Zustand ist Signal Θ relativ klein, da:

• asymmetrische Umgebung geht verloren

– „random coil“

• Optisch aktive C-Atome räumlich weit voneinander entfernt

Schwaches Signal

42

Versuch

• Versuchsdurchführung:

– Bei der CD-Spektroskopie werden mit steigender Temperatur Werte für Θ gemessen

• Ausnutzung des Effektes, dass durch Verlust der Sekundärstruktur (Zerstörung von α-Helix und β-Faltblatt) die optische Aktivität verringert wird

43

Versuch

• Auswertung der CD-Messwerte

– Wellenlänge: 222 nm

– Fitten der Parameter: DK

N=

1m

DT K

N→ = =

( )m

H Steigung beiT°∆

( )p

C Krümmung der Kurve∆

Tm

44

-15

-10

-5

0

5

10

15

270 280 290 300 310 320 330 340 350

T [K]

∆∆ ∆∆G

° [k

J/m

ol]

Versuch


• Stabilitätsgleichung:

( )( ) ( ) ln

( )

mp m m

m m m

H T TG T C T T T T

T T T T

°°

∆∆ = + ∆ ⋅ − − ⋅ ⋅ −

Tm‘

(282K)

Tm

(334K)

}

}

Nativ

Denaturiert

45

Versuch


– Protein zwischen Tm‘ und Tm stabil

– Im Maximum der Stabilitätskurve ist das Gleichgewicht am weitesten auf der nativen Seite

• entspricht Körpertemperatur des Menschen

• Optimaler Wirkungsgrad

46

Versuch

• Versuchsdurchführung:

– bei der Fluoreszenz wird mit steigender Temperatur die Lichtemission gemessen

• Ausnutzung des Effektes, dass durch Verlust der Tertiärstruktur (Zerstörung der räumlichen Anordnung) vermehrt Schwingungsenergie auf Umgebungsmoleküle (Lösungsmittel) übertragen werden kann und das Signal der Fluoreszenz verringert wird

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Versuch

• Analog zur CD:– fitten der Kurve

• Werte für ∆H°und ∆Cpentsprechen denen der CD-Spektroskopie

• Tm um ~6K höher• gleiche

Messbedingungen– Gleichgewichtsreaktion– Druck

Auswertung der Fluoreszenz-Messwerte:

Werte vergleichbar

48

Versuch

• Vergleich der beiden Stabilitätskurven

temperaturabhängige Stabilitätskurve

-15

-10

-5

0

5

10

15

270 280 290 300 310 320 330 340 350 360

T [K]

DG

° [k

J/m

ol]

CD-Spektroskopie

Fluoreszenz-Spektroskopie

nicht identisch

49

Versuch

• Vergleich von CD- und Fluoreszenz-Spektroskopie:

– unterschiedliche Werte für Tm (~ 6 K Abweichung)

– 2-Zustands-Modell beschreibt die thermische Denaturierung von Myoglobin nicht korrekt

neues Modellsystem mit Zwischenstufe

N ZS D↔ ↔

50

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