Tierärztliche Hochschule Hannover · Umstellung ist, dass die Insulin- und Glukosekonzentrationen post partum drastisch sinken, wodurch die energetische Versorgung des peripheren

Tierärztliche Hochschule Hannover

Einfluss einer Supplementation mit konjugierten Linolsäuren auf die

Insulinsensitivität und pankreatische Insulin-Response bei primiparen Milchkühen

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin

-Doctor medicinae veterinariae-

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Cagri Binici

Mersin

Hannover 2015

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Jürgen Rehage

Klinik für Rinder

1. Gutachter: Univ. -Prof. Prof. Dr. Jürgen Rehage

Klinik für Rinder 2. Gutachter: Univ. –Prof. Dr. Gerhard Breves

Physiologisches Institut

Tag der mündlichen Prüfung: 14.08.2015

Eine Arbeit mit Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft.

Meiner Frau und meiner Tochter

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1.Einleitung 1

2.Literaturübersicht 2

2.1. Energiestoffwechsel des Rindes 2

2.1.1. Negative Energiebilanz 2

2.1.2. Besonderheiten der Glukose-Homöostase beim Wiederkäuer 3

2.1.3. Lipomobilisation in der Transitperiode 4

2.1.4. Ketose beim Rind 5

2.1.5. Erkennung der Hyperlipomobilisation und Ketose auf Herdenebene 8

2.2. Prinzipien des Insulinmechanismus 10

2.2.1. Struktur und Funktionen des Insulins 10

2.2.2. Insulinsekretion aus β-Zellen des Pankreas 12

2.2.3. Insulinresistenz 13

2.2.4. Insulinresistenz beim Rind 15

2.2.5. Methoden zur Untersuchung der peripheren Insulinsensitivität und pankreatischer

Insulinresponse 16

Inhaltsverzeichnis

2.3. Konjugierte Linolsäure (CLA) 17

2.3.1. Bildung 17

2.3.2. Einflüsse einer CLA-Supplementierung auf den Energiestoffwechsel beim

Wiederkäuer 18

2.4. Zielsetzung der Dissertation und die Arbeitshypothesen 19

3.Material und Methoden 21

3.1. Versuchstiere 21

3.2. Studienablauf 21

3.1.1. Kriterien für die Versuchstiere 22

3.1.2. Fütterung 23

3.1.3. Haltung 28

3.2. Experimentelles Design 28

3.2.1. Hyperglykämischer Clamp mit konstanter Infusionsrate 28

3.2.1.1. Katheterisieren der Venae jugulares externae 28

3.2.1.2. Ablauf der Hyperglykämischen Clamps mit konstanter Infusionsrate 29

3.2.3. Leberbiopsie 30

3.2.5. Kalkulationen 31

3.3. Analysen 32

Inhaltsverzeichnis

3.3.1. Insulin 32

3.3.2. Gesamtlipidbestimmung in Lebergewebe 33

3.3.3. Weitere Parameter 34

3.4. Statistik 35

4.Ergebnisse 36

4.1. Leistungsparameter 36

4.2. Parameter des Energiestoffwechsels 39

4.3. Untersuchungen zur Insulinsensitivität 41

4.3.1. Ergebnisse der hyperglykämischer Clamps mit konstanter Infusionsrate 41

4.3.2. Insulinsensitivitätsindizes 53

5.Diskussion 55

5.1. Diskussion der Methodik 55

5.1.1. Versuchstiere 55

5.1.2. Durchführung der Versuche 56

5.1.2.1. Hyperglykämischer Clamp mit konstanter Infusionsrate 56

5.1.2.2. Basalwerte von Insulin, Glukose, BHB, NEFA und die Insulinsensitivitätsindizes 58

Inhaltsverzeichnis

5.2. Diskussion der Ergebnisse 58

5.2.1. Hyperglykämischer Clamp mit konstanter Infusionsrate 58

5.2.1.1. Einflüsse der CLA-Supplementierung auf die periphere Insulinsensitivität und

pankreatische Insulinresponse 58

5.2.2. Insulinsensitivitätindizes 61

5.2.3. Basalwerte von Insulin, Glukose, BHB und NEFA 61

5.2.4. Leistungsparameter 62

5.2.5. Schlussfolgerungen 64

6.Zusammenfassung 65

7.Summary 66

8.Schrifttumsverzeichnis 67

Abkürzungsverzeichnis


a.p. ante partum

Abb. Abbildung

ADP Adenosindiphosphat

AMP Adenosinmonophosphat

ATP Adenosintriphosphat

AUC Fläche unter der Kurve (area under the curve)

BCS body condition score

BHB β-Hydroxybuttersäure

°C Grad Celsius

C Kohlenstoff

c cis

Ca Calcium

cAMP cylclisches Adenosinmonophosphat

CLA konjugierte Linolsäure (conjugated linoleic acid)

cm Zentimeter


CoA Koenzym A

Co Kobalt

Cu Kupfer

d Tag (Day)

dl Deziliter

EB Energiebilanz

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

FG Fleischgewicht

FCM Fett korrigierte Milch (fat-corrected milk)

g Gramm

g Erdbeschleunigung (9,82 m/s^2)

GD Glutamatdehydrogenase

GGT Gamma-Glutamyl-Transferase

GH Growth Hormon (Wachstumshormon)

GIT Gastro-Intestinal-Trakt (Magen-Darm-Trakt)

GLUT Glucose Transporter

h Stunde


HEC hyperinsulinämischer euglykämischer Clamp

HGC hyperglykämischer Clamp

HOMA Homeostatic model assessment

HF Holstein Friesian

HSL Hormon sensitive Lipase

IGF-1 Insulin-like-growth-Faktor 1

IGT Impaired glucose tolerance (verminderte Glucose-Toleranz)

ISI Insulinsensitivitätsindex

IU Internationale Einheit

IVGTT Intravenöser Glucose-Toleranztest

J Jod

kg Kilogramm

KGW Körpergewicht

LDL Low-density lipoprotein

LM Lebendmasse

log Logarithmus

ME metabolische Energie


Min. Minute

Mg Magnesium

mg miligramm

µmol mikromol

ml milliliter

mmol millimol

Mn Mangan

mRNA messenger Ribonucleic Acid

N Anzahl

Na Natrium

NaCl Kochsalz

Nadir Niedrigstwert

NEB negative Energiebilanz

NEFA nicht-veresterte Fettsäuren (non-esterified fatty acid)

NEL Netto-Energie-Laktation

OGTT oraler Glucose-Toleranztest

QUICKI quantitative insulin sensitivity check index


PCR Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction)

Peak Maximalwert

PI-3 Phosphoinositid-3-Kinasen

PMR partielle Mischration

p.p. post partum

RQUICKI revised quantitative insulin sensitivity check index

RFD Rückenfettdicke

RIA Radioimmunassay

Se Selen

SEM Standardfehler

SS Steady-State

SSGIR Steady-State Glukoseinfusionsrate

t trans

T Tag

Tab. Tabelle

TGL Triglyceride

TM Trockenmasse


TMA Trockenmasseaufnahme

TMR totale Mischration

T-Basis Trockensubstanz-Basis

µU Mikrounit

VK Variationskoeffizient

Vv. Venae

w/v Gewicht/Volumen (weight per volumen)

Zn Zink

Einleitung

1

1.Einleitung

Milchkühe erkranken am häufigsten in der Transitperiode. Die Transitperiode ist durch einen stark erhöhten Energiebedarf und adaptive Veränderungen des Organismus der Mutterkuh gekennzeichnet. Der erhöhte Energiebedarf beruht sowohl auf dem mit fortschreitender Trächtigkeit steigenden Bedarf des Fötus an Nährstoffen als auch auf die steigend intensive Milchleistung nach der Abkalbung.

Kühe mit einer Energie-Unterversorgung beginnen ihre eigenen Körperfettreserven zu mobilisieren. Erfolgt ein exzessiver Körperfettabbau, können die nicht-veresterten Fettsäuren (NEFA) zuerst zu einer vermehrten Akkumulierung der Triacylglyceride in der Leber und danach zu einer Leberverfettung führen. Eine mittel- bis hochgradige Leberverfettung kommt mittlerweile bei mehr als 50 % der Milchkühe vor. Die meisten Stoffwechselerkrankungen stehen im Zusammenhang mit exzessivem Körperfettabbau und verursachen somit erhebliche wirtschaftliche Verluste.

Konjugierte Fettsäuren (CLA) sind mehrfach ungesättigte langkettige Fettsäuren und entstehen im Pansen der Wiederkäuer im Rahmen der biologischen Hydrierung. Sie werden als Futterergänzungsmittel für Hochleistungsmilchkühe eingesetzt. Es ist nachgewiesen, dass CLA bei Milchkühen den Milchfettgehalt reduziert und die Milchleistung erhöht. Es wird von CLA-Herstellern erklärt, dass CLA die Energiebilanz verbessern, da der Organismus durch die Senkung des Milchfettgehalts Energie einsparen kann. Aktuelle Studien haben jedoch gezeigt, dass die Energie, die durch die Senkung des Milchfettgehalts gespart wird, nur für die Milchleistung verbraucht wird und somit keinen Einfluss auf die Energiebilanz des extramammären Gewebes hat. Außerdem löste eine CLA-Supplementierung in der Spätlaktation eine reduzierte Insulinsensitivität bei multiparen Milchkühen aus. Die Auswirkungen von einer CLA-Supplementierung auf die Insulinsensitivität und periphere Insulinresponse ist bei primiparen Milchkühen bisher nicht untersucht. Ziel der vorliegenden Studie ist es, die Auswirkungen einer postpartalen CLA-Supplementierung (100 g pro Tier und Tag) auf die periphere Insulinsensitivität und pankreatische Insulinresponse bei primiparen Milchkühen zu untersuchen.

Literaturübersicht

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2.Literaturübersicht

2.1. Energiestoffwechsel des Rindes

2.1.1. Negative Energiebilanz

Jede Milchkuh gerät in der Frühlaktation in eine negative Energiebilanz (NEB) bedingt durch hohe Milchleistung und eine verzögert steigende Futteraufnahme. Bereits in der sechsten bis siebten Woche p.p. wird die maximale Milchleistung erreicht, wodurch der Energiebedarf insbesondere bei den Hochleistungskühen erheblich steigt. Die maximale Futteraufnahme erfolgt deutlich später (erst in der zwölften bis sechszehnten Woche p.p.). Sowohl die Intensität als auch die Dauer der NEB variieren zwischen den einzelnen Kühen in Milchviehbetrieben sehr stark, abhängig von den Umweltbedingungen (Fütterung, Haltung) und interindividuell unterscheidenden Faktoren (z.B. genetisch). Die NEB kann je nach Einfluss der oben genannten Faktoren zwischen 5 und 14 Wochen dauern. Die hohe Milchleistung führt zu einer Zunahme der Höhe und zeitlicher Ausdehnung der NEB bei Milchkühen (SCHROEDER und STAUFENBIEL 2005). Die NEB ist bei den primiparen Kühen noch intensiver als bei den multiparen Kühen. Die Dauer der NEB ist jedoch bei den Kühen mit höherer Laktationszahl höher (OCYLOK 2007).

Obwohl die NEB mit Frühlaktation assoziiert ist, beginnt die NEB bereits mehrere Wochen ante partum. In der Spätträchtigkeit steigt der für die Fruchtreifung benötigte Energie- und Stickstoffbedarf erheblich (ca. 30 bis 50 %) und die NEB setzt sich nach der Kalbung mit Beginn der Laktation weiter fort. Post partum führen die Milchproduktion und die dafür benötigten Fettsäuren, Eiweiße und Glukose zu einer NEB der Milchkühe (BELL 1995).

Die NEB wird allerdings nicht nur aufgrund erhöhten Energiebedarfs und beschränkter Futteraufnahme ausgelöst, sondern auch aufgrund massiver Umstellungen des Energiestoffwechsels rund um die Kalbung. Eine der metabolischen Umstellungen ist, dass die Mutterkuh eine hohe Priorität auf die energetische Versorgung des Kalbes setzt und somit ihren eigenen Körper vernachlässigt. Die Glukoseaufnahme des Uterus- und Eutergewebe erfolgt insulinunabhängig, wobei das periphere Gewebe (Muskulatur, Fettgewebe, Leber u.a.) der Mutterkuh nur insulinabhängig Glukose aufnehmen kann (BAUMAN und CURRIE 1980; BELL und BAUMAN 1997; BOSSAERT et al. 2008). Eine weitere metabolische Umstellung ist, dass die Insulin- und Glukosekonzentrationen post partum drastisch sinken, wodurch die energetische Versorgung des peripheren Gewebes noch weiter verhindert (BOSSAERT et al. 2008; VAN KNEGSEL et al. 2007) und die NEB weiter begünstigt wird.

Literaturübersicht

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Einerseits vermindern die postpartal niedrigen Insulinkonzentrationen die energetische Versorgung des peripheren Gewebes und andererseits ermöglichen sie den Abbau eigener Körperreserven (insbesondere Fettgewebe), da Insulin antilipolytisch wirkt. Die Energieversorgung des peripheren Gewebes durch Oxidation der NEFA wird dadurch erhöht und die Mutterkuh kann dadurch ihre NEB teilweise abdecken. Zudem kann die Mutterkuh somit Glukose sparen, die für die fetale Entwicklung nötig ist (ALLEN und PIANTONI 2013).

2.1.2. Besonderheiten der Glukose-Homöostase beim Wiederkäuer

Einer der wichtigsten Besonderheiten hinsichtlich der Glukose-Homöostase beim Wiederkäuer ist, dass die über das Futter aufgenommenen Kohlenhydrate kaum in den Darm gelangen und dort nach der Spaltung aufgenommen werden, da sie schon größten Teils im Pansen zu flüchtigen Fettsäuren (FFS) fermentiert werden (BROCKMAN 1978; BASSETT 1971; LESCALE-MATYS et al. 1993; LINZELL 1967). Die FFS werden über die Pansenwand aufgenommen und gelangen dann in den Blutkreislauf. Sie decken ca. 70 % des gesamten Energiebedarfs über die Gluconeogenese und sind somit die wichtigste Energiequelle für Wiederkäuer (MCDOWELL 1983). Gluconeogenese ist ein Stoffwechselweg, der eine Neubildung der Glukose aus Nicht-Kohlenhydrat-Vorstufen (glukoplastische Stoffe) ermöglicht. Diese glukoplastischen Stoffe sind Propionat, Laktat, Alanin, Aminosäuren, Valeriansäure und Butyrat. Die Beteiligungsrate dieser glukoplastischen Stoffe an der Gluconeogenese ist abhängig vom Laktationsstadium, der Futteraufnahme und der Energiebilanz. Eine durchschnittliche Beteiligung dieser Stoffe an der Gluconeogenese wird als 60 – 74 % für Propionat, 16 – 20 % für Laktat, 3 – 5 % für Alanin, 5 – 6 % für Valeriansäure und Butyrat, 0,5 – 3 % für Glycerol und 8 – 11 % für andere Aminosäuren geschätzt (DRACKLEY et al. 2001; DE KOSTER und OPSOMER 2013). Bei Inappetenz sinkt die Beteiligung von Propionat an der Gluconeogenese drastisch und die Gluconeogenese erfolgt nun viel mehr aus Laktat und Glycerin (MCDOWELL 1983, BROCKMAN 1978). Beim Rind findet die Gluconeogenese zu 85 – 90 % in der Leber und zu 10 – 15 % in der Nierenrinde statt (LINDSAY 1978). Beim Monogastrier findet die Gluconeogenese in Hungerperioden und bei erhöhtem Energiebedarf statt. Beim Wiederkäuer ist die Gluconeogenese Hauptenergiequelle für den Körper und findet kontinuierlich statt. Jedoch bedeutet eine starke Beschleunigung der Gluconeogenese des Rindes auch eine Erschöpfung des Glykogenvorrates in der Leber (KANEKO und RHODE 1964), wobei der Glykogengehalt in der Leber des Rind im Vergleich zu Monogastrier sehr gering (2,5 g Glykogen / 100 g FG) ist (REHAGE 1996). Der Glucose-Spiegel im Blut des Wiederkäuers

Literaturübersicht

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steigt nicht wie beim Monogastrier innerhalb kurzer Zeit postprandial, sondern bei Verfügbarkeit der Substrate (beispielsweise Propionat) im Pansen (LINDSAY 1978; MCDOWELL 1983).

2.1.3. Lipomobilisation in der Transitperiode

Der Zeitraum zwischen 3 Wochen vor und 3 Wochen nach der Kalbung wird als Transitperiode beschrieben. Die tägliche Trockenmasseaufnahme (TMA) sinkt um ca. 30 % in den letzten drei Wochen ante partum (HAYIRLI et al. 2002; MCART et al. 2013). Dies führt zur Limitierung der Energiereserven, die die Mutterkuh insbesondere post partum braucht, da der Energiebedarf in der ersten Woche post partum um das Vier- bis Fünffache steigt (BELL 1995; MCART 2013). Eine Kuh braucht ca. 3 kg Glukose, um 40 Liter Milch zu produzieren (MEPHEM 1993). Das entstehende Energiedefizit ist deshalb sehr groß und führt zu Lipomobilisation nachdem die Glykogenreserven in der Leber verbraucht sind (NEZIFI et al. 2004). Die Lipomobilisation ist durch hohe Plasma-NEFA-Konzentrationen charakterisiert. Sie beginnt bereits in der Hochträchtigkeit und erreicht Ihr Maximum in der Frühlaktation (GRUMMER 1995; BELL 1995). Die Plasma-NEFA-Konzentrationen sollten ante partum (zwischen 3-14 Tage ante partum) 0,4 mmol/l (OETZEL 2003) und post partum 1 mmol/l nicht überschreiten (MCART et al. 2013; OPSINA et al. 2000).

Die Lipomobilisation beginnt meist im subkutanen Fett und die NEFA gelangen anschließend in die Blutbahn. Sie werden dann weiter ins periphere Gewebe (Muskulatur, Niere, Leber) transportiert und dort zwecks Energiegewinnung oxidiert (NAZIFI et al. 2004) oder zur Milchfettsynthese im Euter genutzt (SEGGEWIß 2004). Bei der Oxidation der NEFA unterscheidet sich der Vorgang der Oxidation je nach Kettenlänge der Fettsäure. Kurzkettige Fettsäuren (Länge <10 C-Atomen) können ohne Energieverlust frei in die Mitochondrien diffundieren. Fettsäuren ab 10 C-Atomen müssen zuerst (an Carnitin gebunden) unter mehreren energieaufwendigen Schritten in die Mitochondrien importiert werden. Die sehr langkettigen Fettsäuren (zwischen 20 und 26 C-Atomen) können nicht in die Mitochondrien diffundieren, sondern müssen zuerst in den Peroxisomen oxidiert werden. Hierbei werden sie zuerst in kurzkettige Fettsäuren abgebaut und anschließend in den Mitochondrien zu Acetyl-CoA oxidiert (RASSOW et al. 2012). Während der peroxisomalen Oxidation wird ein Teil der entstandenen Energie als Wärme abgegeben und es kommt zu einem Energieverlust (DRACKLEY 1999).

Literaturübersicht

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In der Leber gibt es verschiedene Stoffwechselwege für NEFA. Sie können zu Oxalacetat zwecks Energiegewinnung oxidiert oder zu Triacylglyzeriden (TAG) verestert werden. Die TAG werden entweder in der Leber gespeichert oder in Form von VLDL (very low density Lipoprotein) ins Blut exportiert (NAZIFI et al. 2004). Die exzessive Lipomobilisation (Hyperlipomobilisation) führt beim Rind zu einer Leberverfettung, da die Kapazität des Rindes dafür zu gering ist, die TAG in der Leber als VLDL in die Blutbahn zu exportieren. (GRUMMER 1995; ALLEN und PIANTON 2013). Eine mittelgradige bis hochgradige Leberverfettung kommt mittlerweile bei jeder zweiten Kuh vor (JORRISTMA et al. 2001). Der Grund ist möglicherweise die langfristige und einseitige Zuchtselektion auf Milchleistung (AGNEW und YAN 2000; JAAKSON et al. 2000; HAMMON et al. 2007; SINCLAIR 2010; BEERDA t al. 2007; JAAKSON et al. 2010). Der Energiebedarf wird dadurch automatisch höher und die Oxidation der organischen Stoffe (NEFA, Glycerol, Laktat, Aminosäuren, Propionat und Butyrat) wird zum Ausgleich des negativen Energiebedarfs beschleunigt. Die Studien haben gezeigt, dass die Oxidation der oben genannten organischen Stoffe zum Sättigungsgefühl bei den Milchkühen führt, das heißt, die Beschleunigung deren Oxidation infolge NEB kann eine Futterdepression auslösen, die wiederum die Lipomobilisation verstärkt (ALLEN und PIANTONI 2013). Dadurch erhöht sich das Risiko zahlreicher Gesundheitsstörungen (Ketose, Milchfieber, Lahmheit, Nachgeburtsverhalten, Mastitis) bei den Milchkühen (SINCLAIR 2010; BELL 1995; GRUMMER 1995).

2.1.4. Ketose beim Rind

Die Ketose wird definiert als der Stoffwechselzustand, indem sich Acetessigsäure (Acetoacetat), Aceton, Isopropanol und β-Hydroxybutansäure in Körperflüssigkeiten akkumulieren (KRONFELD 1997). Aceton entsteht aus Acetoacetat durch die Abspaltung von Kohlensäure, welche über Urin ausgeschieden bzw. abgeatmet wird und für den Stoffwechsel der Wiederkäuer keine Bedeutung hat (RASSOW et al. 2012). Acetat und β-Hydroxybutansäure (BHB) dienen außerdem zur de-novo-Synthese der kurz- und mittelkettigen Fettsäuren (C4-C16) durch die Milchdrüsen im Euter (SEGGEWIß 2004).

Ketonkörper entstehen aus NEFA und ausschließlich in den Mitochondrien der Leberzellen. Bis zu einem Maße ist die Entstehung von Ketonkörpern physiologisch normal. Ab 1 mmol/l BHB im Blut spricht man beim Rind von einer Ketose (OETZEL 2003). Die NEFA werden in den Mitochondrien durch einen biochemischen Abbaumechanismus (β-Oxidation) abgebaut. Das Ziel dieses Mechanismus ist die Bildung von Acyl-CoA aus NEFA. Acyl-CoA kann dann

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entweder in den Citratzyklus eingespeist und vollständig in Kohlensäure oxidiert werden oder unvollständig zu Ketonkörpern oxidiert werden (KRONFELD 1997). Es gibt verschiedene Meinungen darüber, welche Mechanismen dabei entscheidend sind, dass die NEFA nicht mehr in den Citratzyklus eingespeist und übermäßig in Ketonkörper umgewandelt werden:

- Oxalacetat (ein Glukosevorläufer) ist notwendig für die Einschleusung der NEFA in den Citratzyklus. Durch die exzessive Anflutung der NEFA kommt es zu einem Mangel an Oxalacetat, wodurch Acyl-CoA nicht mehr in den Citratzyklus eingeschleust wird. Das anflutende Actyl-CoA wird nun in den Leberzellen in Ketokörper umgewandelt (HOLTENIUS und HOLTENIUS 1996; DRACKLEY et al. 2001).

- Die Entstehung von Ketonkörpern ist mit dem Energiestatus der Kuh assoziiert. Es kommt zur Entstehung der Ketose, wenn der Plasma-Glukosespiegel sinkt, weil die Energiereserven der Milchkühe nahezu vollständig verbraucht werden (OETZEL 2004).

- Die NEFA können die Blut-Hirn-Schranke nicht überwinden. Zur energetischen Versorgung des Gehirns werden NEFA zu Ketonkörpern umgewandelt, da Ketonkörper die Blut-Hirn-Schranke überwinden können (RASSOW et al. 2012; MCART et al. 2013).

- Bei einer exzessiven Anflutung der NEFA kommt es zu einer Futterdepression. Um dies zu verhindern versucht der Körper die NEFA in Form von Ketonkörpern zu exportieren (ALLEN und PIANTONI 2013).

- Carnitine Palmitoyltransferase I (CPT I) ist eines der Enzyme, die den Transport der NEFA aus dem Cytosol in die Mitochondrien ermöglichen. Die CPT I in der Leber spielt möglicherweise eine Schlüsselrolle bei der Entstehung der Ketose (LIU et al. 2013; ALLEN und PIANTONI 2013; DRACKLEY 1999).

Wenn Ketonkörper entstanden sind, werden sie zuerst abgebaut, indem β-Hydroxybutansäure zu Acetoacetat oxidiert wird. Nach verschiedenen chemischen Reaktionen im Körper kommt es zur Bildung von Acetoacetyl-CoA, welches zu zwei Acetyl-CoAs umgewandelt wird. Nun kann das periphere Gewebe Acetyl-CoA in den Citratzyklus einspeisen und somit Energie

Literaturübersicht

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gewinnen. Aus diesem Vorgang ist herzuleiten, dass Ketonkörper letztendlich eine Transportform von Acetylgruppen sind, die in der Leber entstehen und in der Periphere in den Citratzykus eingespeist werden (RASSOW et al. 2012).

Die Ketose wird zuerst in subklinisch (BHB zwischen 1 und 3 mmol/l im Blut) und klinisch (BHB ab 3 mmol/l im Blut) unterteilt. Die subklinische Form der Ketose ist nur anhand der Ketonkörper-Bestimmung in Blut, Harn oder der Milch zu erkennen. Die Ketonkörperbestimmung im Blut hat die höchste Sensitivität und Spezifität der verschiedenen Bestimmungsverfahren der Ketonkörper. Die Bestimmung der BHB im Blut hat sich bewährt, da Aceton und Acetoacetat flüchtig und somit unstabil sind (OETZEL 2004). Außerdem primäre Ketose und sekundäre Ketose werden nach der Ätiologie unterschieden. Eine spontan auftretende Ketose (primäre Ketose) wurde als Type-I-Ketose beschrieben, welche in der Regel drei bis sechs Wochen post partum auftritt und nicht mit puerperal auftretenden Krankheiten (Endometritis, Mastitis, Laminitis usw.) einher geht. Kühe mit Type-I-Ketose zeigen häufiger Hypoglykämie und Hypoinsulinämie und entwickeln seltener Leberverfettung als Kühe mit Type-II-Ketose (HOLTENIUS und HOLTENIUS 1996; KRONFELD und RAGGI 1964). Allerdings kann es durch Hypoglykämie und hohe BHB-Konzentrationen bei dieser Ketose-Form zu Nervosität und vorübergehenden ZNS-Störungen kommen (NAZIFI et al. 2014). Die zweite Ketoseform (sekundäre Ketose oder Ketose-Typ-II) tritt meistens früher auf und geht mit puerperal auftretenden Krankheiten einher (KRONFELD 1997). Die Ursache für eine Type-II-Ketose ist meistens eine Überfütterung in der Trockenstehphase, wodurch die Anpassungsmöglichkeit der Mutterkuh in der Transitperiode gestört wird (HOLTENIUS und HOLTENIUS 1996). Kühe mit Type-II-Ketose zeigen meistens eine Hyperglykämie und Hyperinsulinämie und entwickeln häufig eine Leberverfettung (KRONFELD 1997; HOLTENIUS und HOLTENIUS 1996).

Oetzel 2003 teilt die Ketose in drei Formen nach Ätiologie bei den Milchkühen ein. Dabei unterscheiden sich auch Prognose und Präventionsmaßnahmen je nach Ketose-Form aufgrund unterschiedlicher Ätiologie. Ketose-Type-I tritt meistens drei bis sechs Wochen p.p. auf. Die Ursache der Ketose-Type-I ist eine starke NEB, die dadurch zustande kommt, dass der Energiebedarf durch die Futteraufnahme nicht abgedeckt werden kann. Dies liegt entweder an der hohen Milchleistung, die nicht mit einer adäquaten Futteraufnahme abgedeckt werden kann oder an der Fütterung, die nicht leistungsgerecht erfolgt. Diese Form der Ketose geht mit einer chronischer Hypoglykämie und niedriger Insulinkonzentrationen einher, hat jedoch eine gute Prognose, da diese Form der Ketose in der Regel nicht zu einer Leberverfettung führt. Die Type-II-Ketose tritt meistens in den ersten zwei Wochen p.p. auf. Dabei besteht das Hauptproblem bereits ante partum, da die Kühe, insbesondere mit Überkondition, eine Futterdepression erleben. Die Futterdepression führt dann zu einer exzessiven

Literaturübersicht

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Lipomobilisation und löst eine Leberverfettung aus. Solche Kühe zeigen zudem eine persistierende Ketose und neigen zu einer Insulinresistenz, wodurch die Aufnahme der Glukose durch das periphere Gewebe weiterhin erschwert wird. Die Prognose ist bei Type-II-Ketose schlechter als die Typ-I-Ketose und die Typ-III-Ketose. Bei der letzten Form der Ketose (Ketose-Type-III) handelt es sich um eine sogenannte ruminale Ketose. Durch einen hohen Gehalt an Buttersäure (> 50 g/ Kuh/ Tag) im Futter, meistens aus schlecht vorbereiteter Grassilage, kommt es zu Entstehung von Ketonkörpern. Die überschüssige Buttersäure wird zu 75 % in BHB konvertiert. Die Prognose bei der Typ-III-Ketose ist günstig, wenn entsprechende Änderungen in der Fütterung durchgeführt werden. (OETZEL 2003).

2.1.5. Erkennung der Hyperlipomobilisation und Ketose auf Herdenebene

Das Maß der Fettmobilisation lässt sich auf Herdenebene durch Body Condition Scoring (BCS) oder Rückenfettdicke (RFD) einschätzen. Die Bestimmung der BCS ist eine weit verbreitete Methode zur Beurteilung der Körperkondition bei Milchkühen. Die Bestimmung der RFD erfolgt durch eine sonographische Messung der Fettauflage zwischen Hüfthöcker und Sitzbeinhöcker. BCS ist eine subjektive Methode und ermöglicht nur eine grobe Differenzierung der Körperkondition. RFD hingegen ist ein objektives Maß für die Quantität der vorhandenen Körperfettreserven (STAUFENBIEL et al. 2003).

Eine BCS-Note (Benotung zwischen 1 und 5) entspricht ungefähr 10 mm RFD und ca. 56 kg Fettmasse bei einer Milchkuh. Ein Abfall der BCS-Note um höher als eine Note und RFD um mehr als 10 mm in der Frühlaktation deutet bereits auf eine Hyperlipomobilisation hin. Eine Unterkondition liegt dann vor, wenn die Milchkühe über weniger als BCS-Note 3 und RFD 20 mm in der Trockenstehzeit und BCS-Note 2,5 bzw. RFD 13 mm in der Frühlaktation verfügen. Eine Überkondition liegt vor, wenn die Milchkühe über mehr als 3,5 BCS-Note oder 30 mm RFD in der Trockenstehzeit und 3,5 BCS-Note oder 25 mm RFD verfügen. Diese Angaben gelten nur für die Milchkühe der Rasse Deutsche Schwarzbunt-Holstein, beim Fleckvieh gelten entsprechend höhere Referenzwerte. Eine Unterkondition kann zu einem Abfall der Milchleistung und des Milchfettgehalts mangels Körperenergiereserven führen. Eine Überkondition kann das Risiko metabolischer und infektiöser Erkrankungen erhöhen (SCHRÖDER und STAUFENBIEL 2005).

Bei Versuchen an Rindern zeigten Milchkühe mit Überkondition, gemessen anhand BCS und RFD, geringeren Leberglykogengehalt und höheren Leberfettgehalt, Hyperlipomobilisation, Ketose und ein zugunsten von Glukagon verschobenes Insulin-Glukagon-Verhältnis

Literaturübersicht

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(HAMMON et al. 2008; SCHULZ et al. 2014). Obwohl Unter- und Überkondition wie oben erwähnt zu unterschiedlichen Bestandsproblemen führen kann, ist die Kondition nicht allein entscheidend für die Maßnahmen zur Verhinderung metabolischer Störungen beim Rind. Ein starker Abbau der Körperfettreserven kann auch bei optimal konditionierten Tieren zu metabolischen Problemen führen (SCHRÖDER und STAUFENBIEL 2005). Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn die Kühe ein schlechtes Fressverhalten zeigen. Die Studie von OIKAWA und OETZEL 2005 bei nicht laktierend, nicht trächtigen Kühen macht dies deutlich. So führte ein 4-tägiges Fasten der Kühe mit unterschiedlicher BCS zu ca. einer dreifachen Erhöhung des Leberfettgehalts und deutlicher Steigerung der Plasma-NEFA- und BHB-Konzentrationen.

Zusätzlich zu den BCS- und RFD-Bestimmungen kann die Bestimmung der Plasma-NEFA- und BHB-Konzentrationen eine weitere Hilfe zur Einschätzung der Rate der Hyperlipomobilisation und Ketose auf Herdenebene schaffen (BORCHARDT 2010; OETZEL 2003; MCART et al. 2013). Zur Interpretation des Gesundheitsstatus der Herde wird es aus statistischen Gründen empfohlen, nicht den Durchschnittswert der NEFA- und BHB-Konzentrationen zu beurteilen, sondern den Anteil der Kühe mit erhöhten NEFA- oder BHB-Konzentrationen innerhalb einer Gruppe. Haben zwei Kühe oder mehr erhöhte Werte in einer Gruppe, so ist dies bereits alarmierend. Bei dem Screening sollte man auf die ausreichende Zahl der Tiere und entsprechende Gruppierung (mehrere Gruppen ante und post partum in der Transitperiode) achten. Nur so lässt sich feststellen, in welchem Zeitraum (ante- oder post partum) die Probleme liegen. Als nächster Schritt wird dann versucht, herauszufinden was für Probleme (Haltung, Fütterung, Management usw.) in diesem Betrieb existieren. Da die maximalen NEFA-Konzentrationen unmittelbar vor der ersten Futtervorlage erreicht werden, empfiehlt es sich zu diesem Zeitpunkt die Blutproben zu entnehmen, um die Peak-Werte der NEFA zu interpretieren. Die Bestimmung der NEFA-Konzentrationen in der Vorbereitungsphase (2 bis 3 Wochen ante partum) und BHB-Konzentrationen ab Tag 7 post partum ist am ausschlaggebendsten für die Präventionsmassnahmen in einer Herde (OETZEL 2003).

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2.2. Prinzipien des Insulinmechanismus

2.2.1. Struktur und Funktionen des Insulins

Insulin ist ein relativ kleines Protein mit einem molekularen Gewicht von 5802 Dalton bestehend aus zwei Polypeptidketten (A- und B-Kette), die miteinander über zwei Disulfid-brücken verknüpft sind (NELSON und COX 2004; SQUIRES 2003; WILCOX 2005). Insulin besteht aus 51 Aminosäuren und wird in den β-Zellen der Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse gebildet (WILCOX 2005). Die Bildung des Insulins in den β-Zellen erfolgt über mehrere Schritte. Zunächst wird ein inaktiver Vorgänger des Insulins (Präproinsulin) produziert. Präproinsulin enthält eine A-, B-Kette und einem C-Peptid, weitere Aminosäuren, eine Signalsequenz und drei Disulfidbrücken. Durch eine proteolytische Abtrennung der Signalsequenz entsteht nun Proinsulin, welches in den Golgi-Apparat von sekretorischen Drüsen der β-Zellen aufgenommen und dort gespeichert wird. Ist die Insulinsekretion durch Sekretagoge gereizt, so entsteht Insulin aus dem Proinsulin nach der Abspaltung des C-Peptids durch eine spezifische Protease und Bildung zweier Peptidbrücken. Zu den Sekretagogen gehören unter anderem Glukose, Aminosäure, Fettsäure, Acetylcholin, Hypophysen-Adenylatcyclase-aktivirendes Peptid (PACAP) und Peptidhormone wie z.B. Glukoseabhängiges insulinotropes Peptid (GIP) und Glucagon-like Peptid (GLP-I) (NELSON und COX 2004, SQUIRES 2003).

Insulin ist ein wichtiges Hormon für den Organismus und übernimmt zahlreiche Funktionen im Körper. Es reguliert einerseits den Blutglukosespiegel und andererseits das Wachstum und die Differenzierung von Zellen aufgrund seiner mitogenetischen Eigenschaften. (WILCOX 2005). Insulin senkt den Blutglukosespiegel, indem es die Gluconeogenese hemmt und gleichzeitig die Glykolyse und die Synthese von Glykogen, Eiweiß und Triacylglycerol fördert (Tab. 1) (SQUIRES 2003; NELSON und COX 2004; MCDOWELL 1983).

Literaturübersicht

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Tab. 1: Effekte des Insulins als Regulator des Blutglukosespiegels

Metabolischer Effekt Zielenzym

↑Glukose-Aufnahme (peripheres Gewebe) ↑Glukosetransporter (GLUT 4)

↑Glukoseaufnahme (Leber) ↑Glucokinase (erhöhte Expression)

↑Glykogensynthese (Leber, Muskel) ↑Glykogensynthase

↓Glykogenabbau (Leber, Muskel) ↓Glykogenphosphorylase

↑Glykolyse, Acetyl-CoA-Bildung

(Leber, Muskel)

↑Phosphofructokinase (PFK)-I

(durch ↑PFK-II)

↑Pyruvatdehydrogenase-Komplex

↑Lipogenese (Leber) ↑Acetyl-CoA-Carboxylase

↑Triacylglycerolsynthese ↑Lipoproteinlipase

Der wichtigste Gegenspieler des Insulins ist das Peptidhormon Glukagon, welches in den α-Zellen der Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse gebildet wird. Epinephrin, Wachstumshormon und Cortisol sind ebenfalls Gegenspieler des Insulins (NELSON und COX 2004).

Literaturübersicht

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2.2.2. Insulinsekretion aus β-Zellen des Pankreas

Die Hauptsignale zur Insulinsekretion werden aus dem Glukosemetabolismus abgeleitet. Bei einem hyperglykämischen Zustand kommt es zu Schwankungen in dem ATP-ADP-Verhältnis nach der Aufnahme von Glukose in die β-Zellen des Pankreas. Da die ATP-Konzentrationen mit der Aktivität von ATP-sensitiven Kaliumkanälen umgekehrt proportional korrelieren, kommt es dadurch zum Schließen der ATP-sensitiven Kanäle. Dies führt zur Depolarisation der β-Zelle und Aktivierung der Calciumkanäle. Letztlich strömen die Calciumionen in den intrazellulären Raum ein. Die Calciumionen bewirken zuerst die Wanderung insulinhaltiger Granula an die Zellmembran und dann die Exozytose von Insulin. Somit kann das Insulin mit dem Blutstrom in den Körperkreislauf gelangen (EFRAT et al. 1994; DEENEY et al. 2000).

Die Insulinsekretion erfolgt biphasisch aus den Inselzellen in die Portalvene. Die erste Phase der Insulinsekretion ist charakterisiert durch eine schnelle und kurz anhaltende Exozytose gespeicherter insulinhaltigen Granula, die auch fusionsbereite Vesikel („readily releaseble pool“) genannt werden. Die erste Phase der Insulinsekretion kann als Antwort auf Nährstoff-Sekretagogen oder Nicht-Nährstoff-Sekretagogen erfolgen. Die zweite Phase der Insulinsekretion ist durch eine geringere und länger andauernde Insulinausschüttung durch Exozytose neu gebildeter insulinhaltiger Granula gekennzeichnet. Die Insulinausschüttung steigt langsam an und dauert so lange an, wie der Glukosereiz besteht. Im Gegenteil zu der ersten Phase der Insulinsekretion erfolgt die zweite Phase der Insulinsekretion ausschließlich durch Nährstoff-Sekretagogen. (WILCOX 2005; NELSON und COX 2004). Glukose, Fruktose oder Galaktose gehören zu den Nährstoff-Sekretagogen und können in die β-Zellen insulinunabhängig eindringen. Cholinerge und adrenerge Neurostimulationen, Peptidhormone und kationische Aminosäuren gehören zu den Nicht-Nährstoff-Sekretagogen (WILCOX 2005).

Die Insulinfunktion der Monogastrier und Wiederkäuer sind einander sehr ähnlich. Beim Wiederkäuer führen hauptsächlich die FFS-Konzentrationen zu Schwankungen der Insulin- und Glukagonkonzentrationen im Blut (BROCKMAN 1978). Wiederkäuer sind jedoch generell insulinresistenter als Monogastrier (SINCLAIR KD 2010; SASAKI 2002; BROCKMAN 1978; HOCQUETTE et al. 1995).

Literaturübersicht

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2.2.3. Insulinresistenz

Die Insulinresistenz des Rindes ist bis jetzt nicht ausreichend untersucht, weshalb die Rolle von Insulinresistenz und Diabetes mellitus beim Rind unbekannt ist (DE KOSTER und OPSOMER 2013). Deshalb werden zuerst die Erkenntnisse aus den humanmedizinischen Studien unter diesem Kapitel erwähnt.

Insulinresistenz besteht dann, wenn normale oder erhöhte Insulinkonzentrationen im Blut eine verminderte Reaktion zeigen, welche durch eine gestörte Empfindlichkeit des peripheren Gewebes auf das Hormon Insulin (periphere Insulinsensitivität) und/oder eine verminderte Glukoseverwertung des peripheren Gewebes (periphere Insulinresponse) ausgelöst wird (WILCOX 2005).

Eine reduzierte insulinvermittelte Glukoseaufnahme kann aufgrund folgender Defekte auftreten;

- gestörte Insulin-Signalisierung

- vielfältige, postrezeptorische intrazelluläre Defekte

- gestörter Glukosetransport und Glukose-Phosphorylation

- reduzierte Glukosesynthese und Glukose-Oxidation

Obwohl unterschiedliche Defekte im Organismus der Patienten mit Insulinresistenz entdeckt wurden, ist die Ursache dieser multiplen Defekte (Tab. 2) und die genaue Pathogenese der Insulinresistenz nach wie vor ungeklärt (ABDUL-GHANI und DEFRONZO 2010).

Literaturübersicht

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Tab. 2: Multiple Defekte im Organismus infolge einer Insulinresistenz

Insulin-Signalisierung - Reduzierte Phosphorylierung der Insulinrezeptor-Tyrosinkinase

- Reduzierte Phosphorylierung des Insulinrezeptor-Substrats I

- Reduzierte Aktivität von Phosphoinositid-3-Kinasen

Glukosetransport - Reduzierte GLUT4-Translokation

- Reduzierte GLUT12-Translokation

Glukosestoffwechsel - Reduzierte Glukose-Phosporylierung

- Reduzierte Glukose-Oxidation

- Reduzierte Gylcogensynthese

Eine Insulinresistenz ist nicht immer pathologisch, sondern kommt auch physiologischerweise z.B. bei der Schwangerschaft, in der Pubertät oder im Alter vor. Bei der physiologischen Insulinresistenz kann eine Normoglykämie durch die β-Zellen aufrechterhalten werden. Die pathologische Insulinresistenz kommt bei Diabetes mellitus vor und ist durch Versagen der β-Zellen eine Normoglykämie aufrechtzuerhalten gekennzeichnet (LEAHY 2004). Es gibt drei Typen von Diabetes mellitus. Der Type-I-Diabetes beruht auf einem absoluten Insulinmangel infolge einer Zerstörung der insulinproduzierenden β-Zellen des Pankreas. Als Ursache des Typ-I-Diabetes gilt eine Autoimmunerkrankung oder auch unbekannte Ursachen (idiopathisch). Der Type-II-Diabetes beruht auf einem relativen Insulinmangel, infolge einer Insulinresistenz und Insulinsekretionsstörung, der sich im späteren Verlauf bis zu einem absoluten Insulinmangel erstrecken kann. In der Frühphase des Type-II-Diabetes wird die Insulinresistenz zuerst durch eine verstärkte Insulinsekretion (Hyperinsulinämie) kompensiert. Erst wenn der Kompensationsmechanismus versagt, kommt

Literaturübersicht

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es zu einer Hyperglykämie. In der Spätphase des Type-II-Diabetes kommt es zu einem relativen Insulinsekretionsmangel bzw. sogar einem absoluten Insulinsekretionsmangel (DE KOSTER und OPSOMER 2013).

Weitere Formen des Diabetes mellitus, die weder dem Type-I noch Type-II-Diabetes zugerechnet werden, werden als Type-III-Diabetes bezeichnet. Die Zahl der pankreatischen β-Zellen ist bei Patienten mit Type-II-Diabetes deutlich vermindert und liegt bei Patienten mit Type-I-Diabetes bei nahezu Null. Die Therapiemethoden bei beiden Diabetes-Typen beruhen auf der exogenen Verabreichung von Insulin oder Hypoglykämie auslösenden Substanzen. Die Transplantation von β-Zellen des Pankreas konnte zu einer deutlichen Verbesserung führen, wird aufgrund der Nebenwirkungen der Immunsuppressiva zur dauerhaften Unterdrückung der Abstoßungsreaktion, nur noch selten durchgeführt (SHAPIRO et al. 2000; BOUWENS und ROOMAN 2005; EDLUND 2002).

2.2.4. Insulinresistenz beim Rind

Auch beim Rind führt eine verminderte periphere Insulinsensitivität oder eine verminderte periphere Insulinresponse zu einer Insulinresistenz, wobei eine verminderte periphere Insulinsensitivität und Insulinresponse gleichzeitig im Organismus auftreten können. Die Insulinresponse wird als der maximale Effekt des Insulins definiert. Bei einer verminderten Insulinresponse verschiebt sich die Dosiswirkungskurve für Insulin nach unten (KAHN 1979; DE KOSTER und OPSOMER 2013; KUSENDA 2010). Bei einer verminderten peripheren Insulinsensitivität ist eine höhere Insulinmenge erforderlich, um einen halbmaximalen Effekt zu erzielen. Es kommt außerdem zu einer Rechtsverschiebung der Dosiswirkungskurve für Insulin (KAHN 1978; DE KOSTER und OPSOMER 2013; KUSEND 2010).

Es gibt unterschiedliche Faktoren, die zu einer Insulinresistenz beim Rind führen können. Die Hyperlipomobilisation wurde sowohl in zahlreichen humanmedizinischen Studien (HAYIRLI 2002) als auch in zahlreichen Studien beim Rind (BAUMAN und CURRIE 1980; TERAO et al. 2010; SINCLAIR 2010; BELL 1995; ALLEN und PIANTONI 2013; HOTAMISLIGIL et al. 1993) für die Entwicklung einer Insulinresistenz verantwortlich gemacht. Im gleichen Zusammenhang wurde eine verminderte periphere Insulinsensitivität bei Kühen mit Überkondition (HOLTENIUS und HOLTENIUS 2007; OHTSUKA et al. 2001; DE KOSTER und OPSOMER 2013) und Leberverfettung (KRÄFT 2004) beobachtet. Die verminderte periphere Insulinsensitivität ist hierbei nicht nur auf die erhöhten NEFA-Konzentrationen

Literaturübersicht

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zurückzuführen, sondern auch auf die metabolische Aktivität des adipösen Gewebes. Das adipöse Gewebe wird zu einem endokrin und autokrin wirksamen Organ und produziert Zytokine mit inflammatorischer Wirkung wie TNF-α. Die Gabe von TNF-α führte bei Schafen und Milchkühen (SADRI et al. 2010; BRADFORD et al. 2009;) zu einer Leberverfettung und bei Mastrindern zu einer verminderten peripheren Insulinsensitivität (KUSHIBIKI et al. 2001; ALLEN und PIANTONI 2013; HOTAMISLIGIL et al. 1993). Zu erwähnen ist ferner, dass die Hyperlipomobilisation bei Milchkühen zu einer Verschiebung des Insulin-Glukagon-Verhältnisses zugunsten von Glukagon führt (HAMMON et al. 2008).

Auch die Fütterungseinflüsse auf die Insulinsensitivität wurden untersucht. Eine energiereiche Fütterung führte zu einer verminderten peripheren Insulinsensitivität bei Färsen (GOERIGK 2011). Eine Reduzierung der Energieintensität der Fütterung führte bei Milchkühen zu einer verbesserten peripheren Insulinsensitivität (BJERRE-HARPOTH et al. 2012). Bei Kälbern hingegen führte eine energiereiche Fütterung zu einer verbesserten peripheren Insulinsensitivität und pankreatischen Insulinresponse (RADUNZ et al. 2012; RÖTTJER 2007). In einer weiteren Studie führte weder die Energieintensität der Fütterung noch die physikalische Aktivität zu einem Einfluss auf die periphere Insulinsensitivität bei Kälbern (STERNBAUER 2005). Neugeborene Kälber besitzen eine deutlich bessere periphere Insulinsensitivität, die mit dem Alter abnimmt (STERNBAUER 2005; STANLEY 2005).

2.2.5. Methoden zur Untersuchung der peripheren Insulinsensitivität und

pankreatischer Insulinresponse

2.2.5.1. Der hyperglykämische Clamp mit konstanter Infusionsrate

Der hyperglykämische Clamp wird beim Rind zur Bestimmung der peripheren Insulinsensitivität und pankreatischen Insulinresponse durchgeführt (STANLEY 2005; STERNBAUER und LUTHMANN 2002; STERNBAUER 2005; DEFRONZO et al. 1979). Die Versuchstiere enthalten zunächst zwei venöse Zugänge (links und rechts) an der Vena jugularis externa. Eine Glukoseinfusion über eine der venösen Zugänge führt zu einer Hyperglykämie im Organismus ohne die Nierenschwelle zu überschreiten. Diese Infusion dauert in der Regel mehrere Stunden. Während dieser Zeit werden Blutproben in regelmäßigen Abständen genommen. Aus diesen Proben werden primär die Glukose- und Insulinkonzentrationen bestimmt. Die Steady-State-Phase wird innerhalb von spätestens 60 Minuten nach Beginn der Infusion erreicht (HERZOG 2001). Durch die regelmäßige Entnahme der Blutproben während der mehrstündigen Infusion ergibt sich eine Kurve der

Literaturübersicht

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Blutparameter. Zur Auswertung der Ergebnisse wird die Fläche unter der Kurve (AUC) über die Trapezregel berechnet. Es werden die gesamte Fläche unter der Kurve, die Basalfläche (die Fläche unter dem Basalwert) und die Nettofläche unter der Kurve (die Differenz zwischen der gesamten Fläche und basal Fläche) berechnet, um die Interpretationsmöglichkeiten der Ergebnisse zu erweitern.

Die Bestimmung der pankreatischen Insulinreponse ergibt sich durch die Flächenberechnung unter der Insulinkurve. Die periphere Insulinsensitivität lässt sich durch die Interpretation der Parameter in der Steady-State-Phase einschätzen.

2.2.5.2. Basalwerte von Insulin, Glukose, NEFA, BHB und Insulinsensitivitätindizes

Die basalen Werte von Insulin, Glukose, NEFA und BHB sind Indikatoren für die Beurteilung des Energiestoffwechsels (STENGÄRDE et al. 2010). Aus diesen Parametern lassen sich die Insulinsensitivitätsindizes bestimmen. HOMA, 1/HOMA, QUICKI, RQUICKI und RQUICKIBHB sind Indizes, die in der Humanmedizin zur quantitativen Bestimmung der peripheren Insulinsensitivität berechnet werden. Diese Indizes scheinen ebenfalls für Rinder gut geeignet zu sein (KUSENDA et al. 2011; HAARSTRICH et al. 2011). Insbesondere RQUICKI wird häufig zur Bestimmung der peripheren Insulinsensitivität beim Rind bestimmt (HOLTENIUS und HOLTENIUS 2007; BOSSAERT et al. 2009; KERESTES et al. 2009). Allerdings ist die Zahl der Studien, in der die RQUICKI-Bestimmung durchgeführt wurden, nur gering und es gibt eine Diskrepanz zwischen den Ergebnissen dieser Studien (SCHÖNBERG und OVERTON 2011; KUSENDA et al. 2011).

2.3. Konjugierte Linolsäure (CLA)

2.3.1. Bildung

Konjugierte Linolsäuren sind zweifach ungesättigte Fettsäuren, die während der Fermentation als ein Stoffwechselprodukt der Biohydrierung von Linolsäuren im Wiederkäuerpansen

Literaturübersicht

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entstehen. Konjugierte Linolsäuren besitzen insgesamt 18 Kohlenstoffatome und die zwei Doppelbindungen befinden sich an zwei benachbarten Kohlenstoffatomen. Die häufigsten Isomere sind cis-9, trans-11-CLA und trans-10, cis-12-CLA, die zu den Transfettsäuren zählen (SQUIRES 2003; KRAFT et a. 2003; BAUMANN et al. 2008). Diese Isomere kommen besonders häufig in der Milch, im Rindfleisch und Käse vor (SQUIRES 2003).

2.3.2. Einflüsse einer CLA-Supplementierung auf den Energiestoffwechsel beim

Wiederkäuer

Eine CLA-Supplementierung führt zu einer Reduzierung der Milchfettproduktion und Milchfettmenge bei laktierenden Milchkühen (SAREMI et al. 2014; SINGH et al. 2014; HAN et al. 2012; PERFIELD et al. 2007; PAPPRITZ et al. 2011) und bei Ziegen (HUSSEIN et al. 2013). Diese Wirkung kommt dadurch zustande, dass CLA die de-novo-Fettsynthese in der Milchdrüse hemmt (HAN et al. 2012; HUSSEIN et al. 2013). Die de-novo-Fettsynthese ist die Bildung kurz- und mittelkettiger Fettsäuren in der Milchdrüse des Wiederkäuers aus Acetat und BHB, die aus dem ruminalen Kohlenhydratstoffwechsel stammen (SEGGEWEIß 2004). Die de–novo-Synthese wird dadurch inhibiert, dass die CLA die lipogenen Enzyme in der Milchdrüse hemmt (HAN et al. 2012; SAREMI et al. 2014; HUSSEIN et al. 2013).

Die CLA-Supplementierung steigert die Milchleistung bei Milchkühen (BERNAL-SANTOS et al. 2003, VETH et al. 2006, CASTANEDA-GUTIERREZ et al. 2007, MEDEIROS et al. 2010, VON SOOSTEN et al. 2011). Die Milchleistung steigt jedoch nicht aufgrund einer verbesserten Energiebilanz, da CLA-Supplementierung keinen Effekt auf die Energiebilanz hat (MEDEIROS et al. 2010, BERNAL-SANTOS et al. 2003; SELBERG et al. 2004; CASTANEDA-GUTIERREZ, 2005; PERFIELD et al. 2002). Dies bedeutet, dass die Energie, die durch eine verminderte Milchfettproduktion infolge des CLA-Einflusses gespart wird, nicht durch den Körper verwertet wird, sondern direkt zur Milchproduktion verbraucht wird (MEDEIROS et al. 2010).

Eine CLA-Supplementierung (100 g pro Tier und Tag) führte in der Spätlaktation zu einer verminderten Insulinsensitivität bei multiparen Milchkühen. Diese Wirkung war in der Frühlaktation nicht zu erkennen. Eine CLA-Supplementierung mit niedrigerer Dosis (50 g pro Tier und Tag) hatte keinen Einfluss auf die periphere Insulinsensitivität und periphere Insulinresponse in der Früh- und Spätlaktation (HAARSTRICH et al. 2011). Die

Literaturübersicht

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Auswirkungen einer CLA-Supplementierung auf die periphere Insulinsensitivität und pankreatische Insulinresponse in primiparen Kühen ist unbekannt.

2.4. Zielsetzung der Dissertation und die Arbeitshypothesen

Die Einflüsse einer CLA-Supplementation auf die periphere Insulinsensitivität bei primiparen Milchkühen wurde nach unseren Kenntnissen bis dato nicht untersucht. Es gibt jedoch diesbezüglich Untersuchungen bei multiparen Milchkühen und bei Ratten. Die Arbeitshypothesen lassen sich wie folgt begründen;

Die Begründung für die Entwicklung der ersten Arbeitshypothese:

CLA-Supplementation reduzierte in einer Langzeitstudie die periphere Insulinsensitivität bei multiparen Kühen (HAARSTRICH et al. 2011) und in zahlreichen Studien die periphere Insulinsensitivität auch bei Ratten (POIRIER et al. 2005; PRUSHOTHAM et al. 2007; CLEMENT et al. 2002; TSUBOYAMA-KASAOKA et al. 2000). Der gleiche Effekt einer CLA-Supplementation ist daher bei primiparen Milchkühen zu überprüfen.

Die Begründung für die Entwicklung der zweiten Arbeitshypothese:

CLA-Supplementation –wie bei der ersten Hypothese erwähnt- reduziert die periphere Insulinsensitivität bei multiparen Milchkühen und bei Ratten. Die Einflüsse einer CLA-Supplementation auf die pankreatische Insulinresponse wurden nach unseren Kenntnissen bei primiparen Milchkühen bis dato nicht untersucht. Deshalb ist eine Untersuchung der Einflüsse einer CLA-Supplementation auf die pankreatische Insulinresponse bei primiparen Milchkühen notwendig.

Die Begründung für die Entwicklung der dritten Arbeitshypothese:

Eine CLA-Supplementation hat keinen Einfluss auf die Energiebilanz bei multiparen Milchkühen (MEDEIROS et al. 2010, BERNAL-SANTOS et al. 2003; SELBERG et al., 2004; CASTANEDA-GUTIERREZ 2005; PERFIELD et al. 2002). Es gibt jedoch nach unseren Kenntnissen nur eine Studie, die diesen Einfluss bei den primiparen Milchkühen untersucht hat (SIGL et al. 2010). Aus diesem Grund ist es notwendig, den Einfluss einer CLA-Supplementation auf die Energiebilanz bei primiparen Milchkühen nochmals zu überprüfen.

Die Begründung für die Entwicklung der vierten Arbeitshypothese:

Die Änderungen des Energiestoffwechsels und der pankreatischen Insulinresponse wurden bereits sowohl bei primiparen als auch bei multiparen Milchkühen beschrieben. Es gibt

Literaturübersicht

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jedoch eine geringe Zahl von solchen Studien, die dies anhand der Clamp-Technik untersucht haben. Deshalb wird es in dieser Arbeit nochmals mit untersucht.

Das Ziel der vorliegenden Studie war die Arbeitshypothesen, die in der Tabelle 3 aufgelistet sind, zu bestätigen.

Tab. 3: Arbeitshypothesen

Arbeitshypothesen Literatur

CLA-Supplementation reduziert möglicherweise die periphere Insulinsensitivität bei primiparen Milchkühen

Die Literaturrecherche hat kein Ergebnis geliefert

CLA-Supplementation reduziert möglicherweise die pankreatische Insulinresponse bei primiparen Milchkühen

Die Literaturrecherche hat kein Ergebnis geliefert

CLA-Supplementation hat keinen Einfluss auf die Energiebilanz bei primiparen Milchkühen

SIGL et a. 2010

Es wird erwartet, dass sowohl der Energiestoffwechsel als auch die pankreatische Insulinresponse sich vor und nach der Kalbung stark unterscheiden

LOMAX et al. 1978; KERESTES et al. 2009; SANO et al. 1993

Material und Methoden

21

3.Material und Methoden

3.1. Versuchstiere

Die experimentellen Untersuchungen wurden in dem Zeitraum von Oktober 2008 bis März 2009 bei 16 primiparen Kühen (Färsen vor der Abkalbung) der Rasse Deutsche Schwarzbunt-Holstein im Versuchsstall des Instituts für Tierernährung des Friedrich-Loeffler-Instituts (Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, FLI) in Braunschweig durchgeführt. Die Tierversuche wurden von der zuständigen Behörde, dem Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) genehmigt (Az 33.11.42502-04-071/07). Die mittlere Lebendmasse der 16 Färsen lag bei 556,0 ± 5,0 kg. Das mittlere Kalbealter der Tiere lag bei 23,0 ± 0,2 Monaten.

3.2. Studienablauf

Die wichtigsten Ereignisse der vorliegenden Studie lassen sich in vier verschiedene Zeitpunkte einteilen;

Zeitpunkt 1:

(Tag 21 ante partum)

Die Färsen wurden 21 Tage vor dem voraussichtlichen Abkalbetermin mit der hyperglykämischen Clamp-Technik untersucht. Alle Tiere wurden unter gleichen Bedingungen im gleichen Stall gehalten und erhielten die gleiche partielle Mischration (PMR) und das gleiche Konzentrat, wie in der Tabelle 4 beschrieben wurde.

Zeitpunkt 2:

(Tag 1 post partum)

Die primiparen Kühe wurden in zwei unterschiedliche Gruppen eingeteilt. Sowohl die primiparen Kühe der CLA-Gruppe, die 100 g/Tag konjugierte Linolsäure im Konzentrat bekamen, als auch die primiparen Kühe der Kontrollgruppe, die 100 g/Tag Stearinsäure anstatt konjugierter Linolsäure im Konzentrat bekamen, wurden anhand der hyperglykämischen Clamps untersucht.


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Zeitpunkt 3:

(Tag 21 post partum)

Die primiparen Kühe der beiden Fütterungsgruppen wurden anhand der hyperglykämischen Clamps untersucht. Ein Teil der Tiere, die am 42. Tag p. p. geschlachtet wurden, wurden zum letzten Mal am Tag 21 p. p. anhand der hyperglykämischen Clamps untersucht. Nach dem Schlachten wurden die Schlachtkörper der Versuchstiere in einer parallel laufenden Studie auf weitere Parameter untersucht (VON SOOSTEN et al. 2011).

Zeitpunkt 4:

(Tag 80 post partum)

Die primiparen Kühe der beiden Fütterungsgruppen wurden anhand der hyperglykämischen Clamps untersucht. Nach dieser Untersuchung wurden die Kühe am 102. Tag p. p. geschlachtet.

3.1.1. Kriterien für die Versuchstiere

Alle Versuchstiere erfüllten folgende Kriterien:

● Klinisch gesund

● Unbeeinflusstes und ungestörtes Allgemeinbefinden

● Ungestörte, regelmäßige Futteraufnahme

Außerdem wurden den Versuchstieren auf keinen Fall Medikamente intravenös (außer Glukoseinfusion während der hyperglykämischen Clamps) appliziert oder zugeführt.


23

3.1.2. Fütterung

3.1.2.1. Fütterung der Färsen bis zur Kalbung

Bis zur Kalbung wurden die Färsen im gleichen Boxenlaufstall unter gleichen Fütterungs- und Haltungsbedingungen gehalten. Die Färsen erhielten 2 kg/Tag Konzentrat über automatische Kraftfutter-Abrufstationen (Hersteller: Insentec, B.V., Marknesse, Niederlande) und ad libitum eine PMR, die aus 37 % Konzentrat (Grundmischung) und 63 % Silage (60 % Mais- und 40 % Grassilage auf Trockenmasse (T)-Basis) bestand. Ante partum fiel die Erfassung der Futteraufnahme aus technischen Gründen aus. Die Komponenten des Konzentrates (Grundmischung) wurden in der Tabelle 4 mit deren Anteilen beschrieben. Für die Gesamtration wurde ein Grundfutter-Kraftfutter-Verhältnis von 50:50 auf T-Basis angestrebt.

Tab. 4: Komponenten von dem Konzentrat und der partielle Mischration (PMR1) ante partum

Komponenten [%] Konzentrat PMR

Weizen 25,0 -

Gerste 25,0 -

Sojamehl 20,0 -

Getrockneter Zuckerrübenbrei

11,0 -

Zeolith A 12,5 -

Vitamin/Mineral- Vorgemisch2

6,5 -

Trockenmasse (TM) [g/kg] 894,0 375,0 ± 21,0


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Nährstoffe [g/kg TM] Konzentrat PMR

Rohasche 155,0 56,0 ± 3,0

Roheiweiss 173,0 89,0 ± 3,0

Rohfett 22,0 29,0 ± 4,0

Rohfaser 51,0 232,0 ± 8,0

Säure-Detergenz-Faser 68,0 256,0 ± 7,0

Neutral-Detergenz-Faser 157,0 469,0 ± 19,0

Energie3 [MJ/kg TM]

ME 10,6 11,0

NEL 6,7 6,7

1 partielle Mischration auf TM-Basis (60% Maissilage, 40% Grassilage) 2 Per kg Mineralfutter: 60 g Ca; 105 g Na; 80 g P; 50 g Mg; 7 g Zn; 5. 4,8 g Mn; 1,25 g Cu; 100 mg I; 40 mg Se; 30 mg Co; 800 000 IU Vitamin A; 100 000 IU Vitamin D3; 1500 mg Vitamin E 3 Kaltulation basiert auf Nährstoff-Verdaulichkeit, die mit Wethers (GfE 1991) and DLG Futterwerttabellen Wiederkäuer (1997) gemessen wurden; Abkürzungen: ME = metabolisierbare Energie, NEL = Netto-Energie-Laktation

3.1.2.2. Fütterung der primiparen Milchkühen nach der Abkalbung

Erst nach der Abkalbung wurden die primiparen Kühe in zwei unterschiedliche Fütterungsgruppen eingeteilt. Die Einzelheiten zu den Gruppen sind unten im Detail aufgeführt:


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● CLA-Gruppe:

Die primiparen Milchkühe dieser Gruppe erhielten ad libitum eine Mischration, die aus 37 % Konzentrat (Grundmischung) und 63 % Silage (60 % Mais- und 40 % Grassilage auf Trockenmasse (T) -Basis) bestand, über computergesteuerte Wiegetröge (Hersteller: Insentec B.V., Marknesse, Niederlande). Die verzehrte Futtermenge konnte dadurch mittels elektronischer Tiererkennung täglich registriert werden. Zusätzlich bekamen die primiparen Kühe 4 kg/Tag ein Konzentrat mit einem pansengeschützten CLA-Gemisch (Lutrell® Pure, BASF SE, Ludwigshafen, Deutschland) (Tab. 5) über automatische Abrufstationen zugeteilt. Das CLA-Gemisch (Tab. 6) war in einer stabilen Form in dem pelletierten Kraftfutter enthalten. Für die Gesamtration wurde ein Grundfutter-Kraftfutter-Verhältnis von 50:50 auf T-Basis angestrebt.

Tab. 5: Komponenten von den Konzentraten und der partielle Mischration (PMR1) post partum

Komponenten

[%]

Konzentrat Konzentrat Konzentrat

in PMR

PMR

Kontrollgruppe CLA-Gruppe CLA- und Kontrollgruppe

Weizen 39,5 39,5 41,0 -

Getrockneter Zuckerrübenbrei

29,0 29,0 30,0 -

Rapsschrot 20,0 20,0 20,0 -

Sojamehl 6,5 6,5 6,5 -

Mineral-Vorgemisch2

2,0 2,0 2,0 -

Kontrollfett-Supplement

(Stearinsäure)

2,5 - - -


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Komponenten

[%]

Konzentrat Konzentrat Konzentrat

in PMR

PMR


CLA-Supplement

(CLA-Gemisch)

- 2,5 - -

Kalziumkarbonat 0,5 0,5 0,5 -

TM [g/kg] 873,0 ± 9,0 871,0 ± 9,0 870,0 ± 7,0 445,0 ± 54,0

Nährstoffe

[g/kg TM]

Rohasche 65,0 ± 1,0 69,0 ± 1,0 64,0 ± 1,0 62,0 ± 3,0

Rohprotein 182,0 ± 1,0 180,0 ± 2,0 182,0 ± 4,0 124,0 ± 12,0

Rohfett 50,0 ± 3,0 44,0 ± 4,0 20,0 ± 7,0 28,0 ± 2,0

Rohfaser 96,0 ± 3,0 97,0 ± 4,0 100,0 ± 5,0 183,0 ± 18,0

Säure-Detergenz-Faser

134,0 ± 4,0 133,0 ± 3,0 134,0 ± 8,0 208,0 ± 16,0

Neutral-Detergenz- Faser

259,0 ± 3,0 260,0 ± 10,0 265,0 ± 10,0 405,0 ± 33,0

Energie3

[MJ/kg TM]


ME 13,9 13,7 13,5 11,9

NEL 8,9 8,7 8,7 7,5

1 partielle Mischration (38% Grassilage, 25% Maissilage, 37% PMR-Konzentrat)


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2 Per kg Mineralfutter: 140 g Ca; 120 g Na; 70 g P; 40 g Mg; 6 g Zn; 5. 4 g Mn; 1 g Cu; 100 mg I; 40 mg Se; 5 mg Co; 1000000 IU Vitamin A; 100000 IU Vitamin D3; 1500 mg Vitamin E 3 Kalkulation basiert auf die Nährstoff Verdaulichkeit, die nach Wethers (GfE 1991) kalkuliert wurde Abkürzungen: ME = Metabolizierbare Energie, NEL = Netto-Energie-Laktation In unserem Versuch entfielen 10,4 % des Gemisches auf die milchfett-reduzierende CLA Isoform trans-10, cis-12-C18:2 (Tab. 6). Bei einer Dosierung des CLA-Fettsupplement-Gemisches von 100 g je Tier und Tag wurden ca. 10 g dieser Isoformen von CLA täglich von den Tieren aufgenommen. Der Kompromiss, ein CLA-Gemisch zu verwenden, war aus Kostengründen notwendig, da die Preise für reine CLA extrem hoch sind (> 1000 Euro/kg).

Tab. 6 : Fettsäure-Profil der CLA-Supplement und Kontrollfett-Supplement

Fettsäuren [%] Kontrollgruppe CLA-Gruppe

C16:0 10,89 10,89

C18:0 87,3 50,31

C18:1 c9 < 0.01 10,66

Konjugierte Linolsäure (CLA)

C18:2 c9, t11 0,06 11,99

C18:2 t10, c12 0,02 11,88

Sonstige CLA-Isomere 0,15 0,95

Sonstiges 1,58 3,32

● Kontrollgruppe:

Die primiparen Kühe dieser Gruppe erhielten ad libitum eine Mischration, die aus 37 % Konzentrat (Grundmischung) und 63 % Silage (60 % Mais- und 40 % Grassilage auf Trockenmasse (T)-Basis) bestand, über computergesteuerte Wiegetröge. Die verzehrte Futtermenge konnte dadurch mittels elektronischer Tiererkennung täglich registriert werden. Zusätzlich bekamen die primiparen Kühe der Kontrollgruppe über automatische


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Abrufstationen 4 kg/Tag ein Konzentrat mit Stearinsäure (Silafat, BASF SE®) anstatt CLA-Gemisch zugeteilt. Stearinsäure (Tab. 5) war in einer stabilen Form in dem pelletierten Kraftfutter enthalten. Für die Gesamtration wurde ein Grundfutter-Kraftfutter-Verhältnis von 50:50 auf T-Basis angestrebt.

3.1.3. Haltung

Die mit Gummimatratzen ausgestatteten Hochliegebuchten, die mit Hächselstroh eingestreut waren, waren zahlreich und ausreichend groß, so dass die Tiere genug Platz für Erholung und Komfort hatten. Der Laufgang ist mit Spaltenboden ausgerüstet und liegt zwischen den Liegebuchten und Futtergängen. Die Tiere bekamen Futter an den Futtergängen und die Entmistung erfolgte mit dem automatischen Mistschieber unter dem Spaltenboden.

3.2. Experimentelles Design

3.2.1. Hyperglykämischer Clamp mit konstanter Infusionsrate

3.2.1.1. Katheterisieren der Venae jugulares externae

Das Katheterlegen fand abends um 20.00 Uhr am Vortag der Clamps statt. Die Tiere wurden aus ihren Stallabteilungen in den Versuchsraum, der sich in dem großen Versuchsstall befindet, eingetrieben. Die Tiere wurden angebunden, rundum großflächig und beidseits im Halsbereich rasiert, mit Ethanol (LAT GmbH, Garbsen) entfettet und anschließend mit Jodlösung (Vet-sept Lösung, Konzentrat 10 %, A. Albrecht GmbH, Aulendorf) desinfiziert. Die Halsvenen wurden mit einer Staukette nach Witte am Hals gestaut. Je Vene wurde ein Venenverweilkatheter (Cavafix® Certo® Splittocan® 358, B. Braun, Melsungen AG, Melsungen) herzwärts eingelegt und jeweils mit drei einfachen Hautheften fixiert. An die Katheter wurde je ein Adapter (12,5 cm Luer Lock Adapter, Mila International Inc., Florence) und ein Dreiwegehahn (Conecta TM Plus 3, Becton Dickinson, Helsingborg) befestigt und mit einem vierten einfachen Hautheft fixiert. Schließlich wurde der Katheter mit 5 ml


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Kochsalzlösung mit Heparin (25 000 I. E. Heparin/l 0,9 % NaCl; Ratiopharm, Ulm) gespült. Die Tiere wurden anschließend zurück in ihre Ställe getrieben.

3.2.1.2.Ablauf der Hyperglykämischen Clamps mit konstanter Infusionsrate

Die bereits am Vortag katheterisierten primiparen Kühe wurden morgens um 7.00 Uhr in den Versuchsstall eingetrieben und dort ungefähr eine Stunde in Ruhe gelassen, während die Clampsmaterialen aufgebaut wurden. Bevor die Glucoseinfusionspumpe gestartet wurde, wurden bereits die drei basalen Blutproben entnommen. Nach der Entnahme der dritten basale Blutprobe wurde die Glucoselösung (Glucose-Lösung 40 % ad us. vet., Bela-pharm GmbH, Vechta) durch eine Infusionspumpe (Ismatec®, REGLO Digital 2 Kanal, Glattbrug ZH, Switzerland) über einen sterilen Infusionsschlauch (Prolonsed, Sendal, Cáceres, Espana) über den linken Katheter infundiert.

Nach jeder Blutentnahme wurde der Katheter mit 5 ml heparinhaltiger Kochsalzlösung (25 000 I. E. Heparin/l 0,9 % NaCl; Ratiopharm, Ulm) durchgespült und vor jeder Blutentnahme wurden jeweils 5 ml Blut weggespritzt. Die Infusionsgeschwindigkeit der Infusionspumpe wurde vor dem Infusionsbeginn nach Körpergewicht eingestellt und jedes Tier bekam somit 11 µmol Glukose/ kg Gewicht/ Min. (30 % w/v) pro Clamp infundiert.

Es wurden insgesamt 25 Blutproben pro Clamp und Tier entnommen und der gesamte Clamp dauerte insgesamt 270 Minuten. Die Blutproben wurden in folgenden Minuten: -20, -10, 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240 entnommen und wurden unverzüglich in ein Serumröhrchen (Röhre 10 ml, 95x16,8 mm, Z, Sarstedt AG&Co., Nümbrecht) und zwei Litium-Heparinröhrchen (Röhre 4,5 ml, 75x13 mm, LH, Sarstedt AG&Co., Nümbrecht)) überführt. Unmittelbar danach wurden die Röhrchen erst auf Eis gekühlt gehalten und am gleichen Tag nach Ende des hyperglykämischen Clamp 15 Minuten lang bei 3000 x g zentrifugiert (Megafuge 3,0R, Heraeus Sepatech, Hanau). Das Serum und das Plasma wurden anschließend in Eppendorfcups (Micro Tube 2 ml, PP, Sarstedt AG&Co., Nümbrecht) pipettiert und bei -80°C eingefroren. Der zeitliche Ablauf der Clamps wurde in der Tabelle 7 zusammengefasst.


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Tab. 7: Zeitlicher Ablauf der Hyperglykämischen Clamp-Versuche

Uhrzeit Versuchszeitpunkt

[Min.] Maßnahmen

06:45

Klinische allgemeine Untersuchung,

Verbringen des Tiers in den Versuchsstall

07:00 Katheterisierung der Vv.

Jugulares externae

08:00 -30 Entnahme der basalen Blutproben zur späteren Laboranalyse

08:20 0 Beginn der Glucoseinfusion und Entnahme von Proben

10:50 150 Ende der Glucoseinfusion

Weitere Probeentnahmen

12:20 240 Letzte Blutprobeentnahme

Entfernung der Katheter

12:30 Verbringen des Tieres in den

Stall

3.2.3. Leberbiopsie

Die Leberbiopsie erfolgte unter sonographischer Kontrolle am Tag 21 a.p. und Tag 1, 21, 42 und 105 p.p. im Anschluss an die Entnahme der Einzelblutproben. Auf der rechten Körperseite wurde im Bereich des 11. Interkostalraums, etwa eine handbreit unterhalb der Brustwirbelquerfortsätze die Haut zuerst rasiert, mit Ethanol entfettet und anschließend mit


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alkoholischer Jodlösung desinfiziert (MERTENS 1992). Die Haut wurde nach einer Lokalanästhesie (5 ml 2 % Isocain) mit einer weitlumigen Kanüle perforiert. Diese Kanüle wurde in der Haut belassen und diente als Leitschiene für die eigentliche Biopsiekanüle (14 G 2.1 x 152; Dispomed Witt oHG, Geinhausen). Diese wurde in craniodorsaler Richtung auf das gegenüberliegende Ellbogengelenk, durch Intercostalmuskulatur und Peritoneum, bis zur spürbaren Leberoberfläche vorgeschoben (SCHOLZ et al. 1989; DIRKSEN 1990). Es wurden 10 - 12 Bioptate gewonnen und unmittelbar nach der Entnahme in Eppendorfcups (2 ml; Eppendorf, Hamburg) bei -80 °C bis zur Analyse eingefroren. Die Entnahme der Leberbioptate verlief bei allen Tieren komplikationslos.

3.2.4. Weitere Datenerhebung

Die Milchmenge wurde täglich zu jeder Melkzeit erfasst. Die Kühe wurden zur Ermittlung der Lebendmasse nach jeder Melkzeit auf einer Durchlaufwaage gewogen. RFD und BCS wurden zu den Zeitpunkten Tag 21, 7 a.p. und Tag 1, 7, 14, 21, 28, 42 und 105 p.p. gemessen (SCHRÖDER und STAUFENBIEL 2006).

Zusätzlich zu den Clamps wurden zu den oben genannten Zeitpunkten Einzelblutproben von den Versuchstieren genommen und anschließend auf die Parameter Glucose, NEFA, BHB und Insulin untersucht.

3.2.5. Kalkulationen

Die gesamte Fläche unter der Kurve (area under curve) (Clamp-AUC), die basale Fläche unter der Kurve (baseline area under curve) (bAUC) und die Netto-Inkrementelle-Fläche unter der Kurve (net increment area under curve) (netAUC= tAUC - bAUC ) wurden für die Parameter von Insulin, Glukose, NEFA und BHB über die Trapezregel bestimmt. Die Mittelwerte von Insulin-, Glukose-, NEFA- und BHB-Konzentrationen zwischen 120. Minute und 150. Minute (insgesamt vier Zeitpunkte: 120. Min, 130. Min, 140. Min und 150. Min) des HGC während der Glukoseinfusion ergaben die Konzentrationen in der geschätzten Steady-State-Phase. Die Differenz zwischen die Steady-State-Konzentration (SS-Wert) und basale Konzentration ergibt die Netto-Inkrement-Wert (NET-SS-Wert) über die basalen Werte hinaus. Die Netto-Inkrementelle-Fläche unter der Kurve (net incremental AUC) wurde als


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Differenz zwischen gesamter Fläche unter der Kurve (Clamp-AUC) und basaler Fläche unter der Kurve (bAUC) berechnet.

Die Kalkulationen der Energiebilanz basieren auf den Gleichungen der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie (GfE, 2001) detailliert beschrieben von VON SOOSTEN et al. 2011.

Die Berechnungsformeln der Indizes sind wie folgt;

Homöostase-Modell-Assessment (MATTWHEWS et al., 1985):

HOMA = Glucose (mmol/l) x Insulin (µU/ml)

Die logarithmische Transformation von HOMA:

Log (HOMA) und reziproke HOMA:1/HOMA

Quantitativer Insulin-Sensitivitäts-Check-Index (KATZ et al., 2000):

QUICKI = 1/ (log (Glucose(mg/dl)) + log (Insulin(µU/ml))

Verbesserter quantitativer Insulin-Sensitivitäts- Check-Index (PERSEGHIN et al., 2001):

RQUICKI = 1/ (log (Glucose(mg/dl)) + log (Insulin(µU/ml) + log (NEFA(mmol/l))

Verbesserter quantitative insulin sensitivity check index einschließlich BHB (BALOGH et al., 2008):

RQUICKI-BHB = 1/ (log (Glucose(mg/dl)) + log (Insulin(µU/ml) + log (NEFA(mmol/l) + log (BHB(mmol/l))

3.3. Analysen

3.3.1. Insulin

Plasmainsulinkonzentrationen wurden mit der Technik des Insulin Radioimmunoassay (IM3210, Immunotech, Beckman Coulter, CA, USA) im Endokrinologischen Labor der Klinik für Rinder, Tierärztliche Hochschule Hannover gemessen. Die Durchführung erfolgte entlang der Herstellerangaben. Ein Radioimmunoassay (RIA) ist eine sehr sensitive Messmethode, die für die Bestimmung kleiner Substratmengen im Blut bestimmt ist. Dieser Assay funktioniert nach dem „Sandwich-Prinzip“. Die nicht radioaktiv markierten Mausantikörper befinden sich auf der Innenseite der Teströhrchen der Firma. Ein Antikörper haftet an dem Insulinmolekül an einem bestimmten Epitop. Anschließend kann nun ein 125I-


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markierter Antikörper an einer weiteren Epitopstelle des Insulins haften, somit entsteht ein Sandwich von zwei Antikörpern und dem Insulinmolekül. Die Radioaktivität dieses Sandwiches wird zur Bestimmung der Insulinmenge verwendet. Dazu wurde eine Insulin-Standardkurve, mittels verschiedener bekannter Insulinkonzentrationen erstellt. Der intra-assay-Variationskoeffizient betrug (VK) 7,6 % und inter-assay VK betrug 10,7 %.

3.3.2. Gesamtlipidbestimmung in Lebergewebe

Der Gesamtlipidgehalt wurde durch Extraktion der Fette aus dem Lebergewebe mittels eines Hexan / Isopropanol-Gemisches ermittelt.

Für jede Probe wurde ein Doppelansatz durchgeführt und daraus der Mittelwert berechnet. Danach wurde der Variationskoeffizienz (VK) ermittelt. Beide Werte wurden nur dann verwendet, wenn der VK geringer als 10 war. Bei einem VK über 10 wurde nur der Wert verwendet, bei dem keine Kontamination durch Natriumsulfat sichtbar war, bzw. keine anderen Fehler währende der Extraktion gemacht wurden. Falls dies bei beiden Ansätzen nicht der Fall war wurde der Wert komplett verworfen.

Das tiefgefrorene Lebergewebe (-85°C) wurde in flüssigem Stickstoff in einem Mörser gemahlen und 10 bis 40 mg wurden in vorher leer gewogene Pyrexröhrchen (Bibby Sterlin Ltd. Stone, England, UK) gefüllt. Die befüllten Pyrexröhrchen wurden erneut gewogen (Waage: SCALTEC GmbH, Heiligenstadt), um das Gewicht des eingewogenen Lebergewebes zu ermitteln. Zu dem Lebergewebe wurden 2 ml eines Hexan (Baker, Deventer) / Isopropanol (Omnichem Bremen)-Gemisches (Verhältnis 3:2 v/v) zugegeben. Danach wurden die Pyrexröhrchen per Hand und mit einem Vortexer (Vortex Genie 2, Scientific Industries, New York, USA) geschüttelt und auf einem Rollmischinkubator (Labor- und Analysetechnik, Garbsen-Berenbostel) für ca. 24 h inkubiert.

Im Anschluss wurde 1 ml Natriumsulfatlösung (0,455 mol/l) (AppliChem, Darmstadt) in die Pyrexröhrchen pipettiert, mit dem Vortexer geschüttelt und anschließend zentrifugiert (1500 U/min, 10 min bei Raumtemperatur; Heraeus Sepatech, Themo Electron, Langenselbold). Der Überstand (Hexanphase mit gelösten Lipiden) wurde vorsichtig (2 ml Spritze, Henke Sass Wolf, Tuttlingen; Kanüle 0,9 * 70, Witt OHG, Gelsenhausen) abgenommen und in zuvor leer gewogene Reagiergefäße (Sarstedt, Nürmbrecht) pipettiert. Mittels einer Vakuumzentrifuge wurde das Hexan verdampft (Vakuumzentrifuge, Eppendorf AG, Hamburg). Um das extrahierte Lipid in der Hexanphase vollständig in die Reagiergefäße überführen zu können


34

wurde erneut je 1 ml Hexan den Pyrexröhrchen hinzugegeben. Diese wurden anschliessend geschüttelt und zentrifugiert (1500 U/min, 5 Minuten, Raumtemperatur). Wieder wurde der Hexanüberstand mit dem darin gelösten Lipid vorsichtig abgenommen und in die oben genannten Reagiergefäße eingefügt. Die Reagiergefäße mit dem Hexan / Lipidgemisch wurden in der Vakuumzentrifuge zentrifugiert bis das Hexan vollständig verdampft war (ca. 2 h). Abschließend wurden die Reagiergefäße mit dem Lipidrückstand erneut gewogen. Zum Schluss ergab die Differenz zum leer gewogenen Reagiergefäß den Gesamtlipidgehalt des zuvor tatsächlich eingewogenen Leberfrischgewebes (WEBER noch nicht veröffentlicht).

3.3.3. Weitere Parameter

Die Bestimmung weiterer Parameter (Glukose, NEFA, BHB) erfolgte im Kliniklabor der Klinik für Rinder mit einem automatischen Analysensystem (Cobas Mira® , hoffmann La-Roche, Basel, Schweiz).

Tab. 8: Übersicht der angewandten Methoden und Testkits zur Bestimmung klinischer Parameter mit der Angabe des Variationskoeffizienten (VK) (modifiziert nach REHAGE 1996)

Parameter Methode Hersteller VK (%) (n=10)

Glukose Hexokinase-Methode Roche1, Art. 0715182 2,1

NEFA Enzymatischer Farbtest

Wako2, Art. 99475409

1,9

BHB Enzymatischer UV-Test

Sigma3, Art. 310-A 1,2

1Roche: Hoffmann La-Roche, Basel, Schweiz 2Wako: Wako Chemicals GmbH, Mannheim 3Sigma: Sigma Diagnostics, Deisenhofen


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3.4. Statistik

Die statistische Auswertung erfolgte mithilfe des Statistikprogramms SAS für Windows (Version 9.1, Statistical Analysis System Institute INC., Cary NC, USA). Zuerst wurden die Werte auf Normalverteilung anhand des Kolmogorov-Smirnov-Tests geprüft. Die überwiegende Mehrzahl der Stichproben erwies sich als nicht abweichend von der Normalverteilung. Der t-Test wurde durchgeführt, um den Zeiteffekt auszuwerten. Die Auswertung des CLA-Effektes erfolgte mittels einer zweifaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit Hilfe der Prozedur MIXED. Die Ergebnisse wurden als arithmetischer Mittelwert mit Standardabweichung angegeben.

Die angegebenen Variationskoeffizienten wurden als prozentualer Anteil der Standardabweichung vom arithmetischen Mittelwert angegeben. Außerdem wurden die Ergebnisse bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit p<0,05 als statistisch signifikant bezeichnet.

Ergebnisse

36

4.Ergebnisse

4.1. Leistungsparameter

Die Mittelwerte von Rückenfettdicke (RFD), fettkorrigierter Milch (FCM), Körpergewicht (KG), tägliche Trockenmasseaufnahme (TMA) und Energiebilanz (EB) unterschieden sich nicht signifikant zwischen CLA- und Kontrollgruppe (Abb. 1).

Die mittlere Milchleistung lag am Tag 105 p.p. (30,0 ± 1,5 l) in der CLA Gruppe signifikant höher als in der Kontrollgruppe (24,8 ± 1,5 l). Der mittlere Milchfettanteil am Tag 42 p.p. (3,2 ± 0,29 %) und am Tag 105 p.p. (3,09 ± 0,38 %) lag in der CLA Gruppe signifikant niedriger als am Tag 42 p.p. (4,1 ± 0,27 %) und am Tag 105 p.p. (4,3 ± 0,38 %) in der Kontrollgruppe.

Der Zeiteffekt auf die Leistungsparameter war erwartungsgemäß signifikant gewesen. Der Mittelwert von TMA lag in der ersten Woche p.p. am niedrigsten und die mittlere Energiebilanz ist erst ab Tag 42 p.p. gestiegen.

Die Mittelwerte von Lebendmasse und Rückenfettdicke sanken in den ersten zwei Wochen p.p. in den beiden Fütterungsgruppen.

Die Mittelwerte von Leistungsparameter zu unterschiedlichen Zeitpunkten und die signifikanten Unterschiede zwischen den Zeitpunkten sind in den Abbildungen 1a und 1b angegeben.

Ergebnisse

37

Abb. 1a: Leistungsparameter1 in der CLA2- und Kontrollgruppe3 1 Die Werte sind als Mittelwerte + SEM ausgedrückt. 2CLA Gruppe: 6 g/T beide Isomeren von trans-10, cis-12 CLA und cis-9, trans-11 CLA. 3Kontrollgruppe: Kontrollfettsupplement, in dem CLA durch Stearinsäure ersetzt wurde. Die Zeitpunkte, die sich signifikant von -18 (Tag 18 a.p.) unterscheiden wurden vertikal (Kontrollgruppe) oder horizontal (CLA) gestrichelt. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen wurden für jeweiligen Zeitpunkt mit p-Wert angegeben.

Ergebnisse

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Abb. 1b: Leistungsparameter1 in der CLA2- und Kontrollgruppe3 1 Die Werte sind als Mittelwerte + SEM ausgedrückt. 2 CLA Gruppe: 6 g/T beide Isomeren von trans-10, cis-12 CLA und cis-9, trans-11 CLA. 3Kontrollgruppe: Kontrollfettsupplement, in dem CLA durch Stearinsäure ersetzt wurde. Die Zeitpunkte, die sich signifikant von -18 (Tag 18 a.p.) unterscheiden wurden vertikal (Kontrollgruppe) oder horizontal (CLA) gestrichelt. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen wurden für jeweiligen Zeitpunkt mit p-Wert angegeben.

Ergebnisse

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4.2. Parameter des Energiestoffwechsels

Die mittlere maximale Konzentration von NEFA wurden am Tag 1 (CLA-Gruppe: 876,0 ± 82,0 µmol/l; Kontrollgruppe: 722,0 ± 82,0 µmol/l) und 7 p.p. (CLA-Gruppe: 718,0 ± 82,0 µmol/l; Kontrollgruppe: 676,0 ± 82,0 µmol/l) in den beiden Fütterungsgruppen beobachtet (Abb. 2). Zeit- und Fütterungseffekt hatten keine relevante Auswirkung auf die mittlere BHB-, Insulin- und Glukosekonzentrationen.

Der mittlere Leberfettgehalt stieg in beiden Fütterungsgruppen mit Beginn der Laktation signifikant und der maximale mittlere Wert wurde am Tag 1 p.p. (CLA-Gruppe: 58,0 ± 3,2; Kontrollgruppe: 53,0 ± 3,0 mg/g FG) beobachtet. Ab dem Tag 42 p.p. lag der mittlere Fettlebergehalt wieder im Bereich des mittleren Leberfettgehalts am Tag 21 a.p..

Die Mittelwerte von Parameter des Energiestoffwechsels zu unterschiedlichen Zeitpunkten sowie die signifikanten Unterschiede zwischen den Zeitpunkten sind in der Abbildung 2 angegeben. .

Ergebnisse

40

Abb. 2: Peripartale Stoffwechselparameter1 in der CLA2- und Kontrollgruppe3 1 Die Werte sind als Mittelwerte + SEM ausgedrückt. 2CLA Gruppe: 6 g/T beide Isomeren von trans-10, cis-12 CLA und cis-9, trans-11 CLA. 3Kontrollgruppe: Kontrollfettsupplement, in dem CLA durch Stearinsäure ersetzt wurde. Die Zeitpunkte, die sich signifikant von -18 (Tag 18 a.p.) unterscheiden wurden vertikal (Kontrollgruppe) oder horizontal (CLA) gestrichelt. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen wurden für jeweiligen Zeitpunkt mit p-Wert angegeben.

Ergebnisse

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4.3. Untersuchungen zur Insulinsensitivität

4.3.1. Ergebnisse der hyperglykämischer Clamps mit konstanter Infusionsrate

4.3.1.1. Insulin

Die mittleren basalen Insulin Konzentrationen, Clamp-AUC-Insulin, bAUC-Insulin, netAUC-Insulin, SS-Insulin, NET-SS-Insulin unterscheiden sich zwischen den Tieren der CLA und Kontrollgruppe in der gesamten Versuchsperiode kaum voneinander (Abb. 3). Die Höchstwerte aller insulinbezogenen Parameter wurden ante partum beobachtet. Insbesondere Clamp-AUC-Insulin, netAUC-Insulin, SS-Insulin und NET-SS-Insulin sanken mit Beginn der Laktation signifikant drastisch. Es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen den Zeitpunkten beider basalen Insulinkonzentration und bAUC-Insulin.

Die Mittelwerte aller insulinbezogenen Parameter zu unterschiedlichen Zeitpunkten sowie die signifikanten Unterschiede zwischen den Zeitpunkten sind in den Abbildungen 3a und 3b angegeben.

Ergebnisse

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Abb. 3a: Peripartale AUC-Werte und Plasma Insulinkonzentrationen in der CLA1- und Kontrollgruppe2 während der HGC3 1CLA Gruppe: 6 g/T beide Isomeren von trans-10, cis-12 CLA und cis-9, trans-11 CLA. 2Kontrollgruppe: Kontrollfettsupplement, in dem CLA durch Stearinsäure ersetzt wurde. Die Zeitpunkte, die sich signifikant von -18 (Tag 18 a.p.) unterscheiden wurden vertikal (Kontrollgruppe) oder horizontal (CLA) gestrichelt. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen wurden für jeweiligen Zeitpunkt mit p Wert angegeben. 3Hyperglykämische Clamps (HGC): Die Werte sind als Mittelwerte +SEM ausgedrückt.

Ergebnisse

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Abb. 3b: Peripartale relative AUC-Werte und Plasma Insulinkonzentrationen in der CLA1- und Kontrollgruppe2 während der HGC3 1CLA Gruppe: 6 g/T beide Isomeren von trans-10, cis-12 CLA und cis-9, trans-11 CLA. 2Kontrollgruppe: Kontrollfettsupplement, in dem CLA durch Stearinsäure ersetzt wurde. Die Zeitpunkte, die sich signifikant von -18 (Tag 18 a.p.) unterscheiden wurden vertikal (Kontrollgruppe) oder horizontal (CLA) gestrichelt. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen wurden für jeweiligen Zeitpunkt mit p Wert angegeben. 3Hyperglykämische Clamps (HGC): Die Werte sind als Mittelwerte +SEM ausgedrückt.

Ergebnisse

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4.3.1.2. Glukose

Die mittleren basalen Glukose-Konzentrationen, Clamp-AUC-Glukose, bAUC-Glukose, netAUC-Glukose, SS-Glukose, NET-SS-Glukose und NET-SS-Glukose in Prozent des Basalwertes unterschieden sich in allen Versuchsperioden nicht signifikant zwischen den Tieren der CLA- und Kontrollgruppe (Abb. 4).

Der Mittelwert von Clamp-AUC-Glukose, netAUC-Glukose und SS-Glukose lag in beiden Fütterungsgruppen post partum signifikant niedriger als ante partum.

Die mittleren basalen Glukosekonzentrationen lagen post partum in der CLA-Gruppe signifikant niedriger und in der Kontrollgruppe nicht signifikant niedriger als ante partum.

Die niedrigsten Werte von netAUC-Glukose wurden in den beiden Fütterungsgruppen am Tag 21 p.p. beobachtet.

Die Mittelwerte aller glukosebezogenen Parameter zu unterschiedlichen Zeitpunkten sowie die signifikanten Unterschiede zwischen den Zeitpunkten sind in den Abbildungen 4a und 4b angegeben.

Ergebnisse

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Abb. 4a: Peripartale AUC-Werte und Plasma Glukosekonzentrationen in der CLA1- und Kontrollgruppe2 während der HGC3 1CLA Gruppe: 6 g/T beide Isomeren von trans-10, cis-12 CLA und cis-9, trans-11 CLA. 2Kontrollgruppe: Kontrollfettsupplement, in dem CLA durch Stearinsäure ersetzt wurde. Die Zeitpunkte, die sich signifikant von -18 (Tag 18 a.p.) unterscheiden wurden vertikal (Kontrollgruppe) oder horizontal (CLA) gestrichelt. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen wurden für jeweiligen Zeitpunkt mit p-Wert angegeben. 3Hyperglykämische Clamps (HGC): Die Werte sind als Mittelwerte +SEM ausgedrückt.

Ergebnisse

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Abb. 4b: Peripartale relativeAUC-Werte und Plasma Glukosekonzentrationen in der CLA1- und Kontrollgruppe2 während der HGC3 1CLA Gruppe: 6 g/T beide Isomeren von trans-10, cis-12 CLA und cis-9, trans-11 CLA. 2Kontrollgruppe: Kontrollfettsupplement, in dem CLA durch Stearinsäure ersetzt wurde. Die Zeitpunkte, die sich signifikant von -18 (Tag 18 a.p.) unterscheiden wurden vertikal (Kontrollgruppe) oder horizontal (CLA) gestrichelt. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen wurden für jeweiligen Zeitpunkt mit p-Wert angegeben. 3Hyperglykämische Clamps (HGC): Die Werte sind als Mittelwerte +SEM ausgedrückt.

Ergebnisse

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4.3.1.3. NEFA

In der gesamten Versuchsperiode wurde kein statistisch signifikanter Unterschied von netAUC-NEFA und absoluter, sowie relativer NET-SS-NEFA zwischen den Fütterungsgruppen festgestellt (Abb. 5a und Abb. 5b).

Die mittleren basalen NEFA-Konzentrationen und Clamp-AUC-NEFA lagen in der CLA-Gruppe am Tag 1 p.p. tendenziell und am Tag 21 p.p. signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Der Zeiteffekt auf die NEFA-Parameter war deutlich signifikant. Die maximalen Mittelwerte von basalen NEFA-Konzentrationen, bAUC-NEFA und Clamp-AUC-NEFA wurden am Tag 1 und 21 p.p. und deren niedrigsten Werte wurden ante partum beobachtet.

Die Mittelwerte aller NEFA-bezogenen Parameter zu unterschiedlichen Zeitpunkten sowie die signifikanten Unterschiede zwischen den Zeitpunkten sind in den Abbildungen 5a und 5b angegeben.

Ergebnisse

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Abb. 5a: Peripartale AUC-Werte und Plasma NEFA-Konzentrationen in der CLA1- und Kontrollgruppe2 während der HGC3 1CLA Gruppe: 6 g/T beide Isomeren von trans-10, cis-12 CLA und cis-9, trans-11 CLA. 2Kontrollgruppe: Kontrollfettsupplement, in dem CLA durch Stearinsäure ersetzt wurde. Die Zeitpunkte, die sich signifikant von -18 (Tag 18 a.p.) unterscheiden wurden vertikal (Kontrollgruppe) oder horizontal (CLA) gestrichelt. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen wurden für jeweiligen Zeitpunkt mit p-Wert angegeben. 3Hyperglykämische Clamps (HGC): Die Werte sind als Mittelwerte +SEM ausgedrückt.

Ergebnisse

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Abb. 5b: Peripartale relative AUC-Werte und Plasma NEFA-Konzentrationen in der CLA1- und Kontrollgruppe2 während der HGC3

1CLA Gruppe: 6 g/T beide Isomeren von trans-10, cis-12 CLA und cis-9, trans-11 CLA. 2Kontrollgruppe: Kontrollfettsupplement, in dem CLA durch Stearinsäure ersetzt wurde. Die Zeitpunkte, die sich signifikant von -18 (Tag 18 a.p.) unterscheiden wurden vertikal (Kontrollgruppe) oder horizontal (CLA) gestrichelt. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen wurden für jeweiligen Zeitpunkt mit p-Wert angegeben. 3Hyperglykämische Clamps (HGC): Die Werte sind als Mittelwerte +SEM ausgedrückt.

Ergebnisse

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4.3.1.4. BHB

Die Mittelwerte von β-Hydroxybutyrat (BHB) Konzentrationen, Clamp-AUC-BHB, bAUC-BHB, netAUC-BHB, SS-BHB und NET-SS-BHB (absolut und relativ) unterschieden sich kaum in der gesamten Versuchsperiode zwischen den Fütterungsgruppen und Zeitpunkten (Abb. 6a und Abb. 6b).

TotalAUC-BHB sank mit Beginn der Laktation (nicht signifikant), während Nadir NET BHB nach der Kalbung allmählich (nicht signifikant) stieg.

Die niedrigsten basalen BHB-Konzentrationen (CLA-gruppe: 0,48 ± 0,12 mmol/l; Kontollgruppe: 0,47 ± 0,13 mmol/l) wurden nicht signifikant am Tag 80 p.p. in den beiden Fütterungsgruppen beobachtet.

Die Mittelwerte aller BHB-bezogenen Parameter zu unterschiedlichen Zeitpunkten sowie die signifikanten Unterschiede zwischen den Zeitpunkten sind in den Abbildungen 6a und 6b angegeben.

Ergebnisse

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Abb. 6a: Peripartale AUC-Werte und Plasma BHB-Konzentrationen in der CLA1- und Kontrollgruppe2 während der HGC3 1CLA Gruppe: 6 g/T beide Isomeren von trans-10, cis-12 CLA und cis-9, trans-11 CLA. 2Kontrollgruppe: Kontrollfettsupplement, in dem CLA durch Stearinsäure ersetzt wurde. Die Zeitpunkte, die sich signifikant von -18 (Tag 18 a.p.) unterscheiden wurden vertikal (Kontrollgruppe) oder horizontal (CLA) gestrichelt. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen wurden für jeweiligen Zeitpunkt mit p-Wert angegeben. 3Hyperglykämische Clamps (HGC): Die Werte sind als Mittelwerte +SEM ausgedrückt.

Ergebnisse

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Abb. 6b: Peripartale relative AUC-Werte und Plasma BHB-Konzentrationen in der CLA1- und Kontrollgruppe2 während der HGC3 1CLA Gruppe: 6 g/T beide Isomeren von trans-10, cis-12 CLA und cis-9, trans-11 CLA. 2Kontrollgruppe: Kontrollfettsupplement, in dem CLA durch Stearinsäure ersetzt wurde. Die Zeitpunkte, die sich signifikant von -18 (Tag 18 a.p.) unterscheiden wurden vertikal (Kontrollgruppe) oder horizontal (CLA) gestrichelt. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen wurden für jeweiligen Zeitpunkt mit p-Wert angegeben. 3Hyperglykämische Clamps (HGC): Die Werte sind als Mittelwerte +SEM ausgedrückt.

Ergebnisse

53

4.3.2. Insulinsensitivitätsindizes

Die niedrigsten mittleren RQUICKI und RQUICKI-BHB wurden am Tag 1 p.p. in beiden Fütterungsgruppen beobachtet (Abb. 7). RQUICKI-BHB lag am Tag 42 p.p. signifikant höher und am Tag 105 p.p tendenziell höher in der CLA-Gruppe als in der Kontrollgruppe. Außer am Tag 1 und 7 p.p. wurden keine relevanten Unterschiede von HOMA, Log (HOMA), 1/HOMA und QUICKI zwischen Fütterungsgruppen und Zeitpunkten festgestellt. Quicki-Werte blieben über den gesamten Zeitraum relativ unverändert.

Die Mittelwerte der Insulinsensitivitätsindizes zu unterschiedlichen Zeitpunkten sowie die signifikanten Unterschiede zwischen den Zeitpunkten sind in der Abbildung 7 angegeben.

Ergebnisse

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Abb. 7: Peripartale Insulinsensitivitätsindizes in der CLA1- und Kontrollgruppe2 während der HGC3 1CLA Gruppe: 6 g/T beide Isomeren von trans-10, cis-12 CLA und cis-9, trans-11 CLA. 2Kontrollgruppe: Kontrollfettsupplement, in dem CLA durch Stearinsäure ersetzt wurde. Die Zeitpunkte, die sich signifikant von -18 (Tag 18 a.p.) unterscheiden wurden vertikal (Kontrollgruppe) oder horizontal (CLA) gestrichelt. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen wurden für jeweiligen Zeitpunkt mit p-Wert angegeben. 3Hyperglykämische Clamps (HGC): Die Werte sind als Mittelwerte +SEM ausgedrückt.

Diskussion

55

5.Diskussion

5.1. Diskussion der Methodik

5.1.1. Versuchstiere

Versuchsergebnisse tierexperimenteller Studien lassen sich umso präziser auswerten, je homogener das Tiermaterial und je größer die Tierzahl in den unterschiedlichen Gruppen ist. Die Versuchstiere der vorliegenden Studie wiesen eine gute Homogenität auf. Die Tiere hatten ungefähr gleiches Alter und waren ungefähr zum gleichen Zeitpunkt besamt gewesen. Alle Kalbungen hochtragender Färse erfolgten innerhalb von 4 Wochen.

Die Abweichungen von BCS und Milchleistung zwischen den Versuchstieren waren nur gering. Dies ist deshalb von Bedeutung, weil die Milchleistung und BCS einen erheblichen Einfluss auf den Energiestoffwechsel haben (MEPHEM 1993; SCHULZ et al. 2014) und deren Heterogenität die Interpretation der Ergebnisse in einer klinischen Studie erschweren können.

Die Versuchstiere der vorliegenden Studie waren ausschließlich primipare Kühe. Es ist deshalb von Bedeutung, weil die Zahl der Laktationen ebenfalls einen Einfluss auf den Energiestoffwechsel hat. Bei primiparen Kühen ist der Energiebedarf aufgrund des Wachstums und der Milchleistung größer als bei den multiparen Kühen (WATLES et al. 2007). Jedoch erreichen primipare Kühe nach der Kalbung eine positive Energiebilanz deutlich schneller als multipare Kühe (OCYLOK 2007). Außerdem sind die Insulinkonzentrationen im Blut bei primiparen Kühen höher als bei multiparen Kühe (SAREMI et al. 2014).

Die Trockenstehphase wird entsprechend des metabolischen und endokrinologischen Status der Kühe in die „far-of period“ (acht bis drei Wochen ante partum) und die „close-up period“ (drei Wochen ante partum bis zur Abkalbung) eingeteilt (DRACKLEY 1999). Diese Einteilung ergibt sich aus dem unterschiedlichen Nährstoffbedarf (insbesondere Aminosäure und Glukose) des Fetus und berücksichtigt besonders die rasante Gewichtsentwicklung in den letzten Wochen vor der Geburt. Zu Beginn des Versuchs befanden sich alle Tiere in der „close-up period“. Die hyperglykämischen Clamps wurden vor und nach der Kalbung bei allen Versuchstieren zum gleichen Zeitpunkt (Tag 21 a.p., Tag 1, 21 und 80 p.p.) durchgeführt. Dies ist deshalb wichtig, da sich der Energiebedarf in der „close-up period“ aus oben genannten Gründen täglich ändert. Ebenfalls ändert sich der Energiebedarf in den ersten Wochen post partum aufgrund der allmählich steigenden Milchleistung (HOLTENIUS und HOLTENIUS 2007; BELL 1995).

Diskussion

56

5.1.2. Durchführung der Versuche

Die Untersuchungen der vorliegenden Studie wurden in der Transitperiode durchgeführt. Die Transitperiode ist mit adaptiven Veränderungen des Stoffwechsels gekennzeichnet (DUFFIELD et al. 2009; CHAPINAL et al. 2011; DRACKLEY 1999). Diese Veränderungen sind so intensiv, dass die Untersuchungen bereits ante partum beginnen müssen. Die Ergebnisse einer klinischen Studie bei Milchkühen können nur richtig interpretiert werden, wenn die adaptiven Veränderungen mit in Betracht gezogen werden und die Studie bereits ante partum und am besten in der Trockenstehphase beginnt.

Alle Tiere wurden leistungsgerecht gefüttert. Am Morgen des Versuchstages wurde kein Kraftfutter angeboten, um eine konsekutive Beeinflussung der Glukosehomöostase zu vermeiden. Nachdem die Tiere in den Versuchsstall eingetrieben wurden, wurde eine ausreichende Beruhigungs- und Gewöhnungsphase gesichert. Während der hyperglykämischen Clamps wurde den Tieren nur Heu zur Verfügung gestellt. Jegliche Stresssituation wurde vermieden. Dies war am Wiederkauverhalten der Tiere, welches bei allen Tieren während der Clamps dokumentiert werden konnte, zu erkennen. Das während der Clamps zur Verfügung gestellte Heu wurde vorher und nachher gewogen, um die TMA der Tiere richtig zu dokumentieren.

Außerdem erfolgte die Katheterisierung der Jugularvenen bereits am Vortag des Beginns der hyperglykämischen Clamps, um den Einfluss des Stresses auf den Stoffwechsel zu vermeiden.

5.1.2.1. Hyperglykämischer Clamp mit konstanter Infusionsrate

In der vorliegenden Studie wurde der hyperglykämische Clamp zwecks Bestimmung der peripheren Insulinsensitivität und pankreatischen Insulinresponse durchgeführt. Die hyperglykämischen Clamps sind prinzipiell ähnlich zu den Glukosetoleranztests. In erster Linie handelt es sich um einen Belastungstest zur Prüfung der pankreatischen Antwort auf einen hyperglykämischen Zustand (STAUFENBIEL et al. 1999; DJOKOVIC et al. 2009). Trotz der prinzipiellen Ähnlichkeit mit hyperglykämischem Clamp kann man mit einem Toleranztest den Steady-State nicht erreichen, weil die in der Regel durch einen Glukosebolus ausgelöste Hyperglykämie nicht lang genug besteht, um die endogene Glukoseproduktion zu inhibieren. Bei hyperglykämischen Clamps mit oder ohne konstante Infusionsrate wird der Steady-State innerhalb von spätestens 60 Minuten nach Start der Infusion erreicht (HERZOG 2001). Bei hyperglykämischen Clamps ohne konstante Infusionsrate wird der Blutglukosespiegel auf ein bestimmtes hyperglykämisches Level durch Justierung der Steady-State-Glukoseinfusionsrate (SSGIR) „geklemmt“. Während der Steady-State-Phase entspricht die Menge an Glukose, die zum „Klemmen“ des Blutglukosespiegels auf ein bestimmtes

Diskussion

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Level infundiert wird, der Glukosemenge, die durch das periphere Gewebe utilisiert wurde (HERZOG 2001). Hierbei wird die endogene Glukoseproduktion und Glykogenolyse im Körper in der Steady-State-Phase nahezu vollständig inhibiert (DEFRONZO et al. 1979). Bei einem hyperglykämischen Clamp mit konstanter Infusionsrate wird die Menge an Glukose, die durch das periphere Gewebe utilisiert wird, anderweitig berechnet, da der Glukosespiegel nicht durch Justieren der Glukoseinfusion „geklemmt“ wird. Dazu wird die Differenz zwischen Steady-State-Blutglukosespiegel und basalen Blutglukosespiegel berechnet. Je kleiner die Differenz, desto mehr Utilisation der Glukose wurde durch das periphere Gewebe ausgeführt. Wird die Menge an Glukoseutilisation des peripheren Gewebes durch die Differenz zwischen Steady-State-Blutinsulinspiegel und basalen Blutinsulinspiegel dividiert, so lässt sich die Glukoseutilisation pro Insulin-Einheit kalkulieren. Die Glukoseutilisation pro Insulin-Einheit entspricht der peripheren Insulinsensitivität (DE KOSTER und OPSOMER 2013).

Zusätzlich lassen sich die Flächen unter der Kurve (AUC) der Parameter, die während der Glukoseinfusion bestimmt wurden, berechnen. Die Fläche der Kurve ist Ausdruck der Reaktion der Parameter auf die Glukoseinfusion und dadurch ausgelöste Hyperglykämie. Je höher die Fläche unter der Insulinkurve ist, desto höher ist die pankreatische Insulinresponse. Andererseits ist die Fläche unter der Glukosekurve Ausdruck der Glukoseutilisation des peripheren Gewebes. Je höher die Fläche unter der Glukosekurve ist, desto niedriger ist die Glukoseutilisation des peripheren Gewebes (DE KOSTER und OPSOMER 2013).

Es besteht die Möglichkeit anhand eines hyperglykämischen Clamps oder Glukosetoleranztest die akute pankreatische Insulinresponse auf die Glukosebelastung zu bestimmen (DE KOSTER und OPSOMER 2013). Dabei handelt es sich um die erste Phase der biphasisch verlaufenden Insulinsekretion, die ca. 5 bis 10 Minuten dauert (NELSON und COX 2004). Die akute Insulinresponse ist bei einer Insulinresistenz reduziert (DE KOSTER und OPSOMER 2013). In der vorliegenden Arbeit wurde die erste Probe 10 Minuten nach Beginn der Glukoseinfusion entnommen. Um die akute Insulinresponse bestimmen zu können, müssten mehrere Blutproben in den ersten 10 Minuten nach Beginn der Glukoseinfusion entnommen werden. Dadurch lässt sich die akute Insulinresponse in der vorliegenden Arbeit nicht bestimmen.

Außer Glukosetoleranztest und hyperglykämischem Clamp gibt es weitere Methoden zur Erfassung der peripheren Insulinsensitivität. Unter den Methoden zur Erfassung der peripheren Insulinsensitivität ist der hyperinsulinämische euglykämische Clamp der Goldstandard. Diese Technik ist jedoch sehr zeit- und kostenaufwendig (WALLACE und MATTHEWS 2002; HAARSTRICH et al. 2011). Es besteht generell ein Problem bei der Erfassung der peripheren Insulinsensitivität der Milchkühe anhand des Glukosetoleranztest und der Clamp-Technik, da ca. 70 bis 80 % der Glukose in der Frühlaktation im Körper durch die Milchdrüse zur Laktatsynthese aufgenommen wird. Diese Aufnahme erfolgt insulinunabhängig und wird bei den oben genannten Techniken nicht berücksichtigt (MACKLE et al. 2000, HOLTENIUS und HOLTENIUS 2007). Deshalb scheint ein Vergleich der peripheren Insulinsensitivität bei Milchkühen mit unterschiedlicher

Diskussion

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Milchleistung anhand der Clamp-Technik und Glukosetoleranztests nicht möglich zu sein. Ein Vergleich durch diese Methoden sollte daher nur innerhalb einer Leistungsgruppe (Trockensteher, Frühlaktierend, Spätlaktierend) und nur unter Berücksichtigung der Milchleistung als Störfaktor in der statistischen Bewertung durchgeführt werden.

5.1.2.2. Basalwerte von Insulin, Glukose, BHB, NEFA und die Insulinsensitivitätsindizes

HOMA, 1/HOMA, QUICKI, RQUICKI und RQUICKIBHB sind Insulinsensitivitätsindizes, die in der Humanmedizin zur quantitativen Bestimmung der peripheren Insulinsensitivität berechnet werden. Diese Indizes sind für Rinder ebenfalls gut geeignet. Sie werden aus den basalen Werten von Glukose, Insulin, BHB und NEFA berechnet und sind deshalb weniger Zeitaufwendig und weniger laborintensiv (KUSENDA et al. 2011; HAARSTRICH et al. 2011). Insbesondere die RQUICKI-Bestimmung wurde bereits mehrmals zur Bestimmung der peripheren Insulinsensitivität beim Rind eingesetzt (HOLTENIUS und HOLTENIUS 2007; BALOGH et al. 2008; BOSSAERT et al. 2009; KERESTES et al. 2009; HAARSTRICH et al. 2011; KUSENDA et al. 2011). Allerdings ist die Zahl der Studien, in der RQUICKI-Bestimmung durchgeführt wurden, nur gering und es sind Diskrepanzen zwischen den Ergebnissen dieser Studien vorhanden (SCHÖNBERG und OVERTON 2011; KUSENDA et al. 2011). Die Aussagekraft der RQUICKI-Bestimmung über eine periphere Insulinsensitivität bei Milchkühen ist demnach nicht ausreichend untersucht und bedarf weiterer wissenschaftlicher Untersuchungen.

Die basalen Werte von Insulin, Glukose, NEFA und BHB werden zur Beurteilung des Energiestoffwechsels interpretiert. Insbesondere die NEFA-Konzentrationen und die Performance-Parameter (BCS, RFD, Milchleistung, FCM) ermöglichen die Einschätzung der Lipomobilisation beim Rind (OETZEL 2003).

5.2. Diskussion der Ergebnisse

5.2.1. Hyperglykämischer Clamp mit konstanter Infusionsrate

5.2.1.1. Einflüsse der CLA-Supplementierung auf die periphere Insulinsensitivität und

pankreatische Insulinresponse

Die CLA-Supplementierung (100 g pro Tier und Tag) zeigte in der Früh- und Spätlaktation keinen Einfluss auf die periphere Insulinsensitivität und pankreatische Insulinresponse bei

Diskussion

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primiparen Milchkühen in der vorliegenden Studie. Der Einfluss einer CLA-Supplementierung auf die periphere Insulinsensitivität und pankreatische Insulinresponse wurde bisher bei primiparen Milchkühen anhand der Clamp-Technik oder Glukosetoleranztest nicht untersucht. Bei multiparen Kühen führte eine CLA-Supplementierung (100 g pro Tier und Tag) in der Spätlaktation zu einer verminderten peripheren Insulinsensitivität. In der Frühlaktation zeigte die CLA-Supplementierung keinen Einfluss auf die periphere Insulinsensitivität. In dem gleichen Versuch zeigte eine CLA-Supplementierung in geringerer Menge (50 g pro Tier und Tag) keinen Einfluss auf die periphere Insulinsensitivität und pankreatische Insulinresponse bei multiparen Milchkühen (HAARSTRICH et al. 2011).

In einem weiteren Versuch bei multiparen Milchkühen (HOETGER 2013) zeigte eine CLA-Supplementierung (50 g pro Tag und Tier) keinen Einfluss auf die periphere Insulinsensitivität und pankreatische Insulinresponse. Die CLA-Supplementierung führte jedoch zu einer Reduzierung der endogenen Glukoseproduktion (eGP) und Erhöhung der Glukosekonzentrationen im Blut. Die Reduzierung der eGP durch die CLA-Supplementierung liegt vermutlich an der Autoregulationseigenschaft der eGP. Eine sichere Erklärung dafür kann jedoch nicht gegeben werden. Die Vermutung einer gestörten Insulinfunktion, die zur einen Reduzierung der eGP geführt haben könnte, ist jedoch sehr unwahrscheinlich (HOETGER 2013).

5.2.1.2. Einflüsse des Zeiteffekts auf die periphere Insulinsensitivität und pankreatische

Insulinresponse im peripartalen Zeitraum

Es ist nachgewiesen, dass die Insulin- und Glukosekonzentrationen im Blut mit Beginn der Laktation bei gesunden Milchkühen drastisch sinken. Zahlreiche Autoren sind aus diesem Grund zu der Schlussfolgerung gekommen, dass Milchkühe in der Frühlaktation eine Insulinresistenz zeigen (MCDOWELL et al. 1987; ROSE et al. 1997; MIELENZ et al. 2012). Allerdings ist eine Insulinresistenz nicht durch die reduzierten Insulin- und Glukosekonzentrationen, sondern durch eine verminderte Insulinsensitivität des peripheren Gewebe gekennzeichnet (DE KOSTER und OPSOMER 2013; KAHN 1978). Insofern ist die Senkung der Plasma-Insulin- und Glukosekonzentrationen in der Frühlaktation nicht einer Insulinresistenz zuzuordnen, sondern als eine adaptive Veränderung des Organismus der Mutterkuh zu sehen, um die Energiegewinnung durch Lipolyse zu ermöglichen und dadurch Glukose für das Kalb zu sparen.

Es gibt nur wenige Studien, in der die Insulinsensitivität vor und nach der Kalbung im peripartalen Zeitraum bei Milchkühen verglichen wurden. KRÄFT (2004) stellte anhand der euglykämisch-hyperinsulinämischen Clamp-Technik fest, dass die Milchkühe post partum in der Frühlaktation höhere periphere Insulinsensitivität haben, als in der Trockenstehphase. Die Begründung war eine höhere insulin-stimulierbare Glukoseutilisation in der Steady-State-

Diskussion

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Phase bei den laktierenden Kühen im Vergleich zu den Kühen in der Trockenstehphase. KRÄFT (Jahreszahl) kam so zu der Schlussfolgerung, dass die hohe periphere Insulinsensitivität eine kritische Minderversorgung des peripheren Gewebes verhindert, da die hohe periphere Insulinsensitivität bei niedrigen basalen Insulin- und Glukosekonzentrationen eine hohe Glukoseaufnahme des peripheren Gewebes sichert. Allerdings ist diese Schlussfolgerung bei Milchkühen nicht möglich. Ein Vergleich der peripheren Insulinsensitivität zwischen den Milchkühen in der Trockenstehzeit und Frühlaktation ist praktisch unmöglich, da die Glukose-Clearance aufgrund der hohen Glukoseaufnahme durch die Milchdrüse nicht der Glukoseutilisation des peripheren Gewebes entspricht (BOSSAERT et al. 2008). Die Glukose-Clearence (insulinstimulierte Glukoseverwertung) entspricht hingegen der Summe der Glukoseutilisation des insulinabhängigen (peripheren Gewebes) und insulinunabhängigen (insbesondere mammären Gewebes) Gewebes bei Milchkühen aufgrund der Besonderheiten von Glukosehomöostase der Wiederkäuer. Da ca. 70 bis 80 % der Glukose im Blut in der Frühlaktation bei Milchkühen durch die Milchdrüse aufgenommen wird, ist die Glukose-Clearance in der Frühlaktation automatisch höher. Normalerweise erhöht Insulin die Glukoseaufnahme des insulinabhängigen Gewebes. Eine Insulininfusion führt einerseits zu einer erhöhten Glukoseaufnahme des insulinabhängigen Gewebes und andererseits zu einer Senkung der Glukoseaufnahme durch die Milchdrüse bei laktierenden Milchkühen (GROSS et al. 2014; LAARVELD et al. 2013) und bei laktierenden Ziegen (LEENANURUKSA et al. 1988; LINZELL 1967; HOVE 2008) unter hypoglykämischen Bedingungen ohne zusätzliche Glukoseinfusion. Wird dabei zusätzlich Glukose infundiert wie z.B. bei einem hyperinsulinämischen euglykämischen Clamp führt die Hyperinsulinämie hingegen nicht zu einer reduzierten Glukoseaufnahme durch die Milchdrüse bei laktierenden Milchkühen LAARVELD et al. 2013; GROSS et al. 2014) und laktierenden Ziegen (LINZELL 1967; HOVE 2008). In der vorliegenden Studie deuten die post partum deutlich gesunkenen Parameter von SS-Glukose, SS-Glukose/SS-Insulin und NET-SS-Glukose auf eine gestiegene Glukoseverwertung hin. Jedoch ist aus obengenannten Gründen keine Aussage über einen Unterschied der Insulinsensitivität zwischen den Kühen in der Trockenstehphase und Frühlaktation möglich.

In der vorliegenden Studie deuten die mit Beginn der Laktation deutlich gesunkenen Werte von Clamp-AUC-Insulin und NET-AUC-Insulin auf eine reduzierte pankreatische Insulinresponse hin. Die pankreatische Insulinresponse wird unabhängig von der Glukoseverwertung gemacht und ist deshalb sehr zuverlässig beim Rind. Es lässt sich schlussfolgern, dass primipare Milchkühe in der Frühlaktation eine deutlich verminderte pankreatische Insulinresponse haben. Eine verminderte pankreatische Insulinreponse in der Frühlaktation bei Milchkühen wurde ebenfalls in anderen Studien beobachtet (BOSSAERT et al. 2008; LOMAX et al. 1978; KERESTES et al. 2009; SANO et al. 1993; SARTIN et al. 1984; CHELIKANI et al. 2003).

Diskussion

61

5.2.2. Insulinsensitivitätindizes

5.2.2.1. Einflüsse der CLA-Supplementierung auf die Insulinsensitivitätsindizes

Die CLA-Supplementierung zeigte in der vorliegenden Studie keinen Einfluss auf die periphere Insulinsensitivität, die anhand der Insulinsensivitätsindizes bestimmt wurde. Bei multiparen Milchkühen jedoch führte eine CLA-Supplementierung in der Spätlaktation zu einer Reduzierung der RQUICKI-Werte bei multiparen Milchkühen (SAREMI et al. 2014; HAARSTRICH et al. 2011).

5.2.2.2. Einflüsse des Zeiteffekts auf die Insulinsensitivitätsindizes im peripartalen

Zeitraum

Es gab einen signifikanten Zeiteffekt auf RQUICKI und RQUICKI-BHB in der vorliegenden Studie. Am Tag 1 und 7 post partum lagen die RQUICKI- und RQUICKI-BHB-Werte am niedrigsten (nicht signifikant) bei primiparen Milchkühe in der vorliegenden Studie. Es gibt eine Diskrepanz über den peripartalen Zeiteffekt auf RQUICKI bei Milchkühen. Die intensive metabolische Adaptation, Lipomobilisation und die hohe Milchleistung könnte der Grund einer solchen Diskrepanz sein. Deshalb ist die Aussagekraft des Zeiteffekts auf die Insulinsensitivitätsindizes bei Milchkühen im peripartalen Zeitraum fraglich (KERESTES et al. 2009; SCHÖNBERG und OVERTON 2011).

5.2.3. Basalwerte von Insulin, Glukose, BHB und NEFA

5.2.3.1. Einflüsse einer CLA-Supplementierung auf die Basalwerte von Insulin,

Glukose, BHB und NEFA

CLA-Supplementierung zeigte keinen Einfluss auf die Basalwerte von Insulin, Glukose, BHB und NEFA bei primiparen Milchkühen in der vorliegenden Studie. Weitere Studien bestätigten dies (SIGL et al. 2010; PAPPRITZ et al. 2011; HAARSTRICH et al 2011; BERNAL-SANTOS et al. 2002; VETH et al. 2006). In der Arbeit von HOETGER (2013) wurden höhere Glukosekonzentrationen im Blut bei den CLA-gefütterten Milchkühen im Vergleich zu den Kontrolltieren beobachtet. Allerdings können die erhöhten Glukosekonzentrationen nicht als Energieüberschuss gesehen werden, da sie durch unterschiedliche Hormone reguliert werden (STAUFENBIEL et al. 1999). Die signifikanten Effekte von CLA auf die Milchfettsynthese in der Milchdrüse scheinen keinen Einfluss auf

Diskussion

62

den Lipidstoffwechsel des extramammären Gewebes zu haben (SIGL et al. 2010). In weiteren Studien zeigte eine CLA-Supplementierung unterschiedliche Einflüsse auf die Plasma-NEFA- und BHB-Konzentrationen bei multiparen Milchkühen (ODENS et al. 2007; SELBERG et al. 2004)

5.2.3.2. Einfluss des Zeiteffekts auf die Basalwerte von Insulin, Glukose, BHB und

NEFA im peripartalen Zeitraum

In Übereinstimmung mit den vorliegenden Ergebnissen zeigte sich, dass die Plasma-Glukose- und Insulinkonzentrationen bei den Milchkühen bei gleichzeitigem Anstieg der Plasma-NEFA-Konzentrationen deutlich sinken. Diese Veränderungen beruhen auf einer adaptiven Umstellung der Milchkühe, die sich zugunsten des Kalbes bewegen (PARK et al. 2011; THORN et al. 2008; BELL 1995; BOSSAERT et al. 2008; VAN KNEGSEL et al. 2007). Die NEFA-Konzentrationen sanken bei allen Färsen und primiparen Kühen während der Glukoseinfusion in der vorliegenden Studie. Dieser Effekt beruht auf den antilipolytischen Eigenschaften des Insulins. Dieser Abfall der NEFA-Konzentrationen während der Glukoseinfusion kam nicht nur aufgrund der Hemmung der Lipolyse zustande, da die Plasma-NEFA-Konzentration der Summe der NEFAs im Plasma, die im Rahmen der Anflutung (aufgrund der Lipolyse) und der Utilisation entstehen oder verbraucht werden, entspricht. Die Utilisation ist wiederum insulinabhängig, da Insulin die Aktivität der LPL erhöht (HERZOG 2001).

Die BHB-Konzentrationen blieben im peripartalen Zeitraum bei primiparen Milchkühen in der vorliegenden Studie unverändert. Die Erhöhung der BHB-Konzentrationen sind meistens ab Tag 7 post partum bei Milchkühen zu sehen. Je nach Ketose-Type sind hohe BHB-Konzentrationen entweder in den ersten zwei Wochen post partum oder später in dem Zeitraum der maximalen Milchleistung zu beobachten (OETZEL 2003).

5.2.4. Leistungsparameter

5.2.4.1. Einfluss einer CLA-Supplementierung auf die Leistungsparameter

Die in zahlreichen Studien nachgewiesenen Effekte einer CLA-Supplementation (Senkung des Milchfettgehalts und Erhöhung der Milchleistung) konnten in der vorliegenden Studie bestätigt werden. Ebenfalls scheint die Trockenmasseaufnahme durch CLA-Supplementation oder abomasale Infusion von CLA unbeeinflusst zu sein (PAPPRITZ et al. 2011; MAXIN et al. 2011; MEDEIROS et al. 2010; SHINGFELD et al. 2009; SELBERG et al. 2004;

Diskussion

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CASTANEDA-GUIERREZ et al. 2007; HAARSTRICH et al. 2011; PERFIELD et al. 2002; BENAL-SANTOS et al. 2003; MOORE et al. 2004). Insgesamt scheint die CLA-Supplementation keinen Einfluss auf den extramammären Stoffwechsel zu haben (MEDEIROS et al. 2010).

5.2.4.2. Einfluss des Zeiteffekts auf die Leistungsparameter im peripartalen Zeitraum

Die Fütterung und die Milchleistung haben einen erheblichen Einfluss auf die Leistungsparameter im peripartalen Zeitraum. Eine negative Energiebilanz, die bereits mehrere Wochen ante partum beginnt, führt zur Lipomobilisation. Dies führt insbesondere mit Beginn der Laktation zum Sinken der BCS und RFD (SCHRÖDER und STAUFENBIEL (Jahreszahl)). Die einseitige und langfristige Zuchtselektion auf die Milchleistung begünstigt einen exzessiven Körperfettabbau und kann deshalb zu Stoffwechselstörungen in der Transitperiode führen (JAAKSON et al. 2000; HAMMON et al. 2007; SONCLAIR 2010; BEERA et al. 2007).

Diskussion

64

5.2.5. Schlussfolgerungen

1. Die CLA-Supplementierung (100 g pro Tier und Tag) zeigte keinen Einfluss auf die

periphere Insulinsensitivität bei primiparen Milchkühen. Die erste Arbeitshypothese war, dass CLA-Supplementation die periphere Insulinsensitivität bei primiparen Milchkühen möglicherweise reduziert. Diese Arbeitshypothese konnte nicht bestätigt werden.

2. Die CLA-Supplementierung (100 g pro Tier und Tag) zeigte keinen Einfluss auf die pankreatische Insulinresponse bei primiparen Milchkühen. Die zweite Arbeitshypothese war, dass CLA-Supplementation die pankreatische Insulinresponse bei primiparen Milchkühen möglicherweise reduziert. Diese Arbeitshypothese konnte ebenfalls nicht bestätigt werden.

3. Die CLA-Supplementation (100 g pro Tier und Tag) zeigte keinen Einfluss auf die Energiebilanz bei primiparen Milchkühen. Die dritte Arbeitshypothese war, dass CLA-Supplementation keinen Einfluss auf die Energiebilanz bei primiparen Milchkühen zeigt. Diese Arbeitshypothese konnte in der vorliegenden Studie bestätigt werden.

4. Die Parameter des Energiestoffwechsels und die pankreatische Insulinresponse ändern sich mit Beginn der Laktation drastisch. Die vierte Arbeitshypothese, das es erwartet wird, dass sowohl der Energiestoffwechsel als auch die pankreatische Insulinresponse sich vor und nach der Kalbung stark unterscheiden. Diese Arbeitshypothese konnte in der vorliegenden Studie bestätigt werden.

Zusammenfassung

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6.Zusammenfassung

Cagri Binici (2015): Auswirkungen einer postpartalen CLA-Supplementation auf die periphere Insulinsensitivität und pankreatische Insulinresponse bei Primipara der Rasse Deutsche Schwarzbunt-Holstein

Konjugierte Linolsäuren (CLA) werden als Futterergänzungsmittel für Hochleistungsmilchkühe eingesetzt. Es ist nachgewiesen, dass CLA bei Milchkühen den Milchfettgehalt reduziert und die Milchleistung erhöht. Es wird von CLA-Herstellern erklärt, dass CLA dadurch die Energiebilanz verbessert, dass der Organismus durch die Senkung des Milchfettgehalts Energie sparen kann. Die aktuellen Studien haben jedoch gezeigt, dass die Energie, die durch die Senkung des Milchfettgehalts gespart wird, nur für die Milchleistung verbraucht wird und somit keinen Einfluss auf die Energiebilanz des Körpers hat. Außerdem löste eine CLA-Supplementierung in der Spätlaktation eine reduzierte Insulinsensitivität bei multiparen Milchkühen aus. Die Auswirkungen von einer CLA-Supplementierung auf die Insulinsensitivität und periphere Insulinresponse ist bei primiparen Milchkühen bisher nicht untersucht. Ziel der vorliegenden Studie ist es, die Auswirkungen einer postpartalen CLA-Supplementierung (100 g pro Tag und Tier) auf die periphere Insulinsensitivität und pankreatische Insulinresponse bei primiparen Milchkühen zu untersuchen.

16 klinisch gesunde, hochtragende Deutsche Holstein Rinder wurden ante partum mit einer PMR, die auf 60 % Grassilage, 40 % Maissilage und 2 kg/Tag Konzentrat basiert, gefüttert. Nach dem Kalben wurden die Erstkalbinnen in zwei Fütterungsgruppen eingeteilt: Kontrollgruppe (n = 8) und CLA-Gruppe (n = 8). Beide Fütterungsgruppen erhielten eine PMR, die auf 38 % Grassilage, 25 % Maissilage, 37 % Konzentrat (auf DM-Basis) basiert und zusätzlich 3,5 kg Konzentrat (auf DM-Basis), die entweder 100 g CLA-Mischung für die CLA-Gruppe oder 100 g Stearinsäure für die Kontrollgruppe enthielt. CLA Gemisch bestand aus etwa 10 % jeweils von cis-9, trans-11 CLA und trans-10, cis-12 CLA. Die hyperglykämischen Clamps mit konstanter Infusionsrate (11 µmol Glucose kg/min 30 % w/v) wurden am Tag 21 a.p. und Tag 1, Tag 21 und Tag 80 p.p. durchgeführt. Die pankreatische Insulinresponse wurde mittels der Trapezregel als Fläche unter der Kurve (AUC) in drei Formen wie folgt ausgedrückt: basale Fläche (basal AUC), gesamte Fläche (total AUC) und Netto-Inkrement-Fläche (net AUC). Die periphere Insulinsensitivität wurde anhand der Plasma steady-state Konzentrationen (Glukose, Insulin, NEFA), steady-state Glukose:Insulin-Ratio und Insulinsensitivitätsindizes (HOMA, 1/HOMA, QUICKI, RQUICKI, RQUICKI-BHB) bestimmt. Der Leberfettgehalt und die Plasmakonzentrationen von Insulin, Glukose, NEFA und BHB wurden an mehreren Zeitpunkten im peripartalen Zeitraum gemessen. Milchleistung, tägliche Futteraufnahme und Körpergewicht wurden automatisch wöchentlich registriert und die Rückenfettdicke wurde sonographisch bestimmt. Die Varianzanalyse (ANOVA) der Daten erfolgte mit Hilfe der Prozedur MIXED (SAS-Softwarepaket).

Eine postpartale CLA-Supplementierung (100 g pro Tag und Tier) hatte keinen Einfluss auf die periphere Insulinsensitivität und pankreatische Insulinresponse bei den primiparen Milchkühen. Die pankreatische Insulinresponse sank mit Beginn der Laktation drastisch.

Summary

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7.Summary

Cagri Binici (2015): Effects of a postpartum CLA supplementation on peripheral insulin sensitivity and glucose-mediated insulin response in primipara German Holstein cows

Conjugated linoleic acids (CLA) are used as nutritional supplements in high yielding dairy cows. CLA supplementation decreases milk fat yield and increases milk yield significantly whereas energy balance remains almost unchanged. Furthermore, CLA supplementation appears to reduce the peripheral insulin sensitivity in late lactation in multiparous cows. Aim of the present study was to investigate the effects of postpartal CLA (100 g/d) supplements on the peripheral insulin sensitivity and glucose-mediated insulin response in primiparous cows.

From day 21 prepartum 16 clinically healthy German Holstein heifers in late pregnancy were fed a PMR based on 60% grass silage, 40% corn silage and 2 kg/d concentrate ante partum. After calving heifers were divided into a control (n=8) and CLA-treated group (n=8). Both groups were fed a PMR based on 38 % grass silage, 25 % corn silage, 37 % concentrate and additionally 3,5 kg concentrate (on DM basis), which contained either a CLA-mixture (100 g/d) for the CLA group or stearic acid (100 g/d) for the control group. The CLA mixture was composed of proximately 10 % each of cis-9, trans-11 CLA and trans-10, cis-12 CLA. Hyperglycemic clamps with constant infusion rate (11 µmol glucose kg/min 30% w/v) were performed on d21 ante partum and d1, d21 and d80 post partum. Blood samples were taken in 10 minutes intervals during the clamps lasting 240 minutes and were used for insulin, glucose, NEFA and BHB analysis. For evaluation from time concentration curves the area under the curve (AUC), baseline area (basal AUC), and net incremental area (net AUC) using the trapezoidal rule were assessed. Additionally, from baseline values surrogate insulin sensitivity indices (HOMA, 1/HOMA, QUICKI, R-QUICKI and RQUICKI-BHB) were calculated. The total lipid content of the liver and the concentrations of plasma samples (insulin, glucose, NEFA and BHB) were obtained several times peripartum. Milk yield, daily matter intake and body weight were recorded automatically and backfat thickness was determined sonographically. Results were analysed by ANOVA (Proc GLM) of the SAS statistical package.

The postpartum CLA-supplementation had no significant effects on studied parameters indicating no or only very minor effects on the peripheral insulin sensitivity and glucose-mediated insulin response in primiparous cows. The postpartum glucose-mediated-insulin response was significantly reduced compared to prepartum results.

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Tierärztliche Hochschule Hannover · Umstellung ist, dass die Insulin- und Glukosekonzentrationen post partum drastisch sinken, wodurch die energetische Versorgung des peripheren