Tierärztliche Hochschule Hannover · Zytostatika und dabei anfallenden Abfallprodukten veröffentlicht. Diesen Protokollen liegen humanmedizinische Richtlinien, unter anderem des

Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchungen zu Zytostatikarückständen in Serum und Urin bei Hunden mit Tumorerkrankungen

während und nach Chemotherapie

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

-Doctor medicinae veterinariae-

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Anna Katharina Felicitas Knobloch

Brilon

Hannover 2010

Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. med. vet. Ingo Nolte Klinik für Kleintiere Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. med. vet. Ingo Nolte

2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. med. vet. Manfred Kietzmann

Tag der mündlichen Prüfung: 19.05.2010

Das Projekt, in dessen Rahmen diese Arbeit entstanden ist, wurde gefördert von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG SI 1412/1-1, HA 3343/2-1).

MEINEN LIEBEN ELTERN

Diese Dissertation basiert auf zwei Veröffentlichungen in international anerkannten wissenschaftlichen Zeitschriften mit Gutachtersystem (peer review).

INHALT:

I. Einleitung ....................................................................................................... 1

II. Zusammenfassung der Ergebnisse beider Studien .................................... 4

III. Übergreifende Diskussion ............................................................................ 7

IV. Publikationen ............................................................................................... 16

1. Drug residues in serum of dogs receiving anti-cancer chemotherapy

2. Cytotoxic drug residues in urine of dogs receiving anti-cancer

chemotherapy

V. Zusammenfassung (englisch) ..................................................................... 17

VI. Zusammenfassung (deutsch)...................................................................... 19

VII. Schrifttumsverzeichnis ................................................................................ 21

VIII. Abkürzungsverzeichnis ............................................................................... 32

IX. Verlagsbestätigungen ................................................................................. 33

X. Weitere Publikationen im Rahmen dieser Arbeit ....................................... 34

XI. Danksagung .................................................................................................. 35

1

I. Einleitung

Chemotherapien werden zur Behandlung chemosensitiver Tumorerkrankungen, als

adjuvante Therapie bei mikroskopischer Tumorerkrankung und als Sensitizer in der

Radiotherapie eingesetzt (CHUN et al. 2001). Auf Grund dieser vielfältigen

Einsatzgebiete werden Chemotherapien auch in der Veterinärmedizin zunehmend

häufiger zur Behandlung einer Vielzahl von Neoplasien eingesetzt (ALBRECHT

1992, HAHN u. RICHARDSON 1995). Die Verteilung der Zytostatika im Organismus,

ihr Metabolismus und schließlich ihre Ausscheidung unterscheiden sich in

Abhängigkeit von der Art des Chemotherapeutikums (MOORE u. ERLICHMAN

1998).

In der Humanmedizin haben verschiedene Studien gezeigt, dass

Krankenhauspersonal auf onkologischen Stationen zytotoxischen Substanzen

ausgesetzt sein kann (SESSINK et al. 1992, 1994; ENSSLIN et al. 1994, 1997;

BURGAZ et al. 1999; PETHRAN et al. 2003; FRANSMAN et al. 2004, 2005, 2007).

Der Kontakt kann sowohl teratogene (SELEVAN et al. 1985; STÜCKER et al. 1990)

als auch mutagene (WAKSVIK et al. 1981; POHLOVÀ et al. 1986; MILKOVIC-

KRAUS u. HORVAT 1991; SARDAS et al. 1991; GOLONI-BERTOLLO et al. 1992;

SESSINK et al. 1994) Effekte hervorrufen. Die zunehmend häufigere Durchführung

von Chemotherapien in der Kleintiermedizin wirft die Frage auf, inwieweit

Zytostatikarückstände in Se- und Exkreten entsprechend behandelter Patienten

potentielle Gesundheitsrisiken für den Menschen und Umweltgefahren darstellen.

In Ermangelung veterinärmedizinischer Studien über Rückstände dieser Substanzen

basieren Richtlinien für den Umgang mit Chemotherapien in der Veterinärmedizin

derzeit auf Empfehlungen für die Humanmedizin. In einem ersten Dokument für die

Veterinärmedizin hat das European College of Veterinary Internal Medicine of

Companion Animals (ECVIM-CA) entsprechende Protokolle für den Umgang mit

Zytostatika und dabei anfallenden Abfallprodukten veröffentlicht. Diesen Protokollen

liegen humanmedizinische Richtlinien, unter anderem des NIOSH (National Institute

for Occupational Safety on Health) und des MARC (Management and Awareness of

Risks of Cytotoxic Handling) zugrunde (ECVIM-CA 2007).

2

Wegen der guten Wirksamkeit von Chemotherapien beim malignen Lymphom und

bei metastasierten Mastzelltumoren des Hundes stellen diese Tumorerkrankungen

häufige Indikationen für die Anwendung von Zytostatika in der Veterinärmedizin dar.

Das Lymphom ist eine der häufigsten Neoplasien des Hundes (DORN et al. 1968;

DORN et al. 1970). Diverse Chemotherapieprotokolle zur Behandlung dieser

neoplastischen Erkrankung wurden bis heute veröffentlicht (ZEMANN et al. 1998;

CHUN et al. 2000; BOYCE u. KITCHELL 2000; MOORE et al. 2001; GARRETT et al.

2002; SIMON et. al. 2006, SIMON et al. 2008). Viele dieser

Kombinationschemotherapieprotokolle enthalten unter anderem die Zytostatika

Asparaginase, Cyclophosphamid, Vincristin und Doxorubicin.

Mastzelltumoren repräsentieren den zweithäufigsten Tumor beim Hund und den

häufigsten Hauttumor des Hundes (DORN et al. 1968; PRIESTER 1973; VAIL 1996).

Da bis zu 40% dieser Tumoren high-grade oder undifferenziert sind (HOTTENDORF

u. NIELSEN 1967; BOSTOCK 1973; PATNAIK et al. 1984), und für undifferenzierte

Mastzelltumoren eine Metastasierungsrate bis zu 96% (BOSTOCK 1973; VAIL 1996)

beschrieben ist, haben diverse Studien den Einsatz von Chemotherapien zur

Behandlung von Mastzelltumoren untersucht (THAMM et al. 1999; DAVIES et al.

2004; THAMM et al. 2006; CAMPS-PALAU et al. 2007; MARCONATO et al. 2008;

RASSNICK et al. 2008). Auch wenn zu erwarten ist, dass die Entwicklung von

Tyrosin-Kinase-Inhibitoren als alternative Behandlungsmethode von high-grade

Mastzelltumoren die Einsatzhäufigkeit reduzieren wird, werden sich

Patientenbesitzer, oftmals aus finanziellen Gründen, auch weiterhin für eine

Chemotherapie entscheiden (HAHN et al. 2008).

Die meisten Chemotherapieprotokolle, sowohl zur Behandlung von Lymphomen, als

auch in der Therapie von Mastzelltumoren, sehen vor, dass die Patienten eine

Woche nach der Chemotherapie zur Laborkontrolle vorgestellt werden. Das

Vorkommen von Zytostatikarückständen im Serum chemotherapeutisch behandelter

Hunde würde für Tierärzte und Laborpersonal durch den Umgang mit den Blutproben

eine potentielle Kontaminationsgefahr und infolgedessen das Risiko einer

Gesundheitsgefährdung bedeuten. Um derartige Risiken in Zukunft besser erfassen

3

und beurteilen zu können, verfolgt die erste Studie das Ziel, durch eine quantitative

Analyse das Vorkommen von Zytostatikarückständen im Serum von Hunden sieben

Tage nach der Chemotherapie zu untersuchen.

Da die Patienten die Klinik in der Regel nach der Behandlung mit ihren Besitzern

verlassen, könnte weiterhin das Vorkommen von Zytostatikarückständen im Urin der

Tiere eine Gefährdung für Beitzer und andere Personen mit Kontakt zu derart

behandelten Hunden darstellen. Daher befasst sich die zweite Studie, die in diese

Arbeit einfließt, mit der Untersuchung von Zytostatikarückständen im Urin zu

unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Chemotherapie.

Die Ergebnisse der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen sollen

zur Charakterisierung möglicher Gesundheitsrisiken im Zusammenhang mit dem

Einsatz von Chemotherapien in der Veterinärmedizin beitragen.

4

II. Zusammenfassung der Ergebnisse beider Studien

Serum

Es wurden 33 Serumproben, die wenige Minuten nach der Chemotherapie

gewonnen wurden, analysiert. Diese dienten als Vergleichsmessungen für die

Proben, die sieben Tage nach erfolgter Behandlung entnommen wurden. Die

gemessenen Zytostatikakonzentrationen variierten in Abhängigkeit der jeweiligen

Substanz. Die medianen Serumkonzentrationen lagen nach Vincristin bei 37,0 µg/L

(range: 11,0-87,0 µg/L), nach Vinblastin bei 13,0 µg/L (range: 13,0-35,0 µg/L), nach

Cyclophosphamid bei 2484,0 µg/L (range: 1209,0-2778,0 µg/L) und nach

Doxorubicin bei 404,0 µg/L (range: 234,0-528,0 µg/L).

Insgesamt wurden 81 Serumproben analysiert, die entweder sieben Tage nach der

Applikation von Vincristin, Doxorubicin oder Cyclophosphamid (Lymphompatienten),

oder sieben Tage nach der intravenösen Applikation von Vinblastin und gleichzeitig

ein bis zwei Tage nach der oralen Gabe von Cyclophosphamid

(Mastzelltumorpatienten) gewonnen wurden. Von diesen Proben konnten in einer

Probe Vinblastinrückstände in einer Konzentration von 7,0 µg/L und in zwei Proben

Cyclophosphamidrückstände in den Konzentrationen 7,0 µg/L und 8,0 µg/L

nachgewiesen werden. In allen anderen Proben lagen die

Rückstandskonzentrationen unter der Nachweisgrenze.

Urin

Insgesamt wurden 666 quantitative Analysen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach

der Applikation der Substanzen Vincristin, Vinblastin, Doxorubicin und

Cyclophosphamid durchgeführt.

Cyclophosphamid: 203 Proben wurden auf Rückstände von Cyclophosphamid

untersucht. 174 Proben waren von Hunden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach

der intravenösen Injektion von 200 mg/m2 Cyclophosphamid gewonnen worden. 29

Proben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach oraler Cyclophosphamidgabe

(50 mg/m2) entnommen. Die mediane Cyclophosphamidkonzentration wenige

5

Minuten nach intravenöser Injektion betrug 398,2 µg/L (range: 1,2-2582,7 µg/L).

Schon an den Tagen 1, 2 und 3 nach der Chemotherapie lagen die medianen

Urinkonzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze. Die medianen Konzentrationen

von Cyclophosphamidrückständen 1-2 Tage nach oraler Applikation lagen ebenfalls

unter der Nachweisgrenze.

Vincristin: Es wurden 235 Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der

intravenösen Injektion von 0,7 mg/m2 Vincristin untersucht. Die mediane

Vincristinkonzentration im Urin lag wenige Minuten nach der Chemotherapie bei 53,8

µg/L (range: 3,9-149,2 µg/L). An den Tagen 1, 2 und 3 lagen die medianen

Konzentrationen der gemessenen Vincristinrückstände bei 20,2 µg/L (range: 1,2-63,2

µg/L), 11,4 µg/L (range: 1,0-36.3 µg/L) und 6,6 µg/L (0,5-25,5 µg/L). An den Tagen 7,

10, 14 und 21 nach der Chemotherapie befanden sich die medianen

Vincristinurinkonzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze.

Vinblastin: Insgesamt wurden 33 Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der

intravenösen Injektion von Vinblastin in einer Dosierung von 2 mg/m2 auf

Vinblastinrückstände untersucht. Die mediane Vinblastinurinkonzentration direkt

nach der Chemotherapie betrug 144,9 µg/L (range: 77,9-305,3 µg/L). An den Tagen

1, 2 und 3 nach der Vinblastinapplikation konnten mediane Vinblastinkonzentrationen

von 70,8 µg/L (range: 36,6-111,3 µg/L), 35,6 µg/L (range: 25,2-115,3 µg/L) und 18,7

µg/L (range: 13,2-34,4 µg/L) im Urin gemessen werden. Sieben Tage nach der

Chemotherapie mit Vinblastin betrug die mediane Urinkonzentration der gemessenen

Vinblastinrückstände 3,7 µg/L (range: 0,5-8,3 µg/L). Eine einzelne Probe, die 14

Tage nach der Vinblastinapplikation gewonnen worden war, enthielt

Vinblastinrückstände in Höhe von 0,5 µg/L.

Doxorubicin: 195 Urinproben nach intravenöser Injektion von 30 mg/m2 Doxorubicin

standen zur Untersuchung auf Doxorubicinrückstände zur Verfügung. Wenige

Minuten nach der Infusion von Doxorubicin lag die mediane

Doxorubicinkonzentration bei 354,0 µg/L (range: 102,5-3630,7 µg/L). An den Tagen

1, 2 und 3 nach der Doxorubicininfusion betrugen die medianen

Rückstandskonzentrationen 165,6 µg/L (range: 61,4-762,0 µg/L), 156,9 µg/L (range:

53,4-475,1 µg/L) und 158,2 µg/L (range: 13,8-469,8 µg/L). An Tag 7 konnten im

6

Median Doxorubicinkonzentrationen von 26,9 µg/L (range: 0-106,1 µg/L) und an den

Tagen 10, 14 und 21 Konzentrationen von 16,2 µg/L (range: 2,5-73,5 µg/L), 2,5 µg/L

(range: 0-40,5 µg/L) und 2,5 µg/L (range: 0-2,5 µg/L) nachgewiesen werden. Alle

Urinproben, die an den Tagen 22-28 nach der Chemotherapie mit Doxorubicin

gewonnen worden waren enthielten keine nachweisbaren Doxorubicinrückstände.

7

III. Übergreifende Diskussion

Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung von Zytostatikarückständen im Serum

und im Urin von Hunden in Zusammenhang mit der Durchführung von

Chemotherapien in der Veterinärmedizin. Chemotherapien werden in der

Veterinärmedizin zumeist ambulant durchgeführt, so dass entsprechend behandelte

Patienten nach der Chemotherapie die Klinik oder Praxis mit ihren Besitzern

verlassen. Daher könnten Zytostatikarückstände im Urin in erster Linie ein

potentielles Gesundheitsrisiko für Besitzer und andere Personen mit Kontakt zu

derart behandelten Hunden bedeuten. Es war zu erwarten, dass Urin von

chemotherapeutisch behandelten Hunden, ebenso wie es für Urin von

chemotherapeutisch behandelten Menschen gezeigt werden konnte (FRANSMAN et

al. 2004), Rückstände der eingesetzten Substanzen enthalten würde. Dennoch sind

bis heute keine systematischen klinischen Studien veröffentlicht worden, in denen

Rückstände von Chemotherapeutika in Se- und Exkreten von veterinärmedizinischen

Patienten untersucht wurden.

Das Vorkommen von Zytostatikarückständen im Serum chemotherapeutisch

behandelter Hunde wurde in dieser Studie vor allem im Hinblick auf ein potentielles

Kontaminationsrisiko für Tierärzte und Laborpersonal untersucht, welches durch den

Umgang mit Blutproben dieser Hunde bestehen könnte.

In der Humanmedizin beschreiben diverse Studien, über welche Wege Klinikpersonal

in Kontakt mit zytotoxischen Substanzen kommen kann. Sowohl über die Haut

während der Vorbereitung und Durchführung von Chemotherapien (KROMHOUT et

al. 2000, FRANSMAN et al. 2004, 2005), als auch via Inhalation (DE WERK et al.

1983, MC DEVITT et al. 1993, KROMHOUT et al. 2000, KIFFMEYER et al. 2002)

können entsprechende Substanzen von betroffenen Personen inkorporiert werden.

Außerdem bestätigen FRANSMAN et al. (2004, 2005) in zwei Studien das Vorliegen

eines Expositionsrisikos beim Umgang mit Urin von chemotherapeutisch

behandelten Patienten. Ebenso kann Personal beim Waschen entsprechender

Patienten und bei der Bettenreinigung auf onkologischen Stationen

Zytostatikarückständen ausgesetzt sein (FRANSMAN et al. 2004, 2005).

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In der Humanmedizin wird häufig Cyclophosphamid als exemplarische Substanz

gewählt, um die Exposition gegenüber antineoplastischen Substanzen zu messen

(SESSINK et al. 1992; McDEVITT et al. 1993; ENSSLIN et al. 1994; SESSINK et al.

1994; BURGAZ et al. 1999; KROMHOUT et al. 2000; KIFFMEYER et al. 2002;

FRANSMAN et al. 2004, 2005, 2007). Cyclophosphamid wird häufig eingesetzt, und

es stehen sensitive Analysemethoden zur Konzentrationsbestimmung von

entsprechenden Rückständen zur Verfügung (FRANSMANN et al. 2007). Im

Gegensatz zu diesen Studien erlaubt die in der aktuellen Studie angewandte

LC/MS/MS-Methode die simultane Messung der vier Zytostatika Vincristin,

Vinblastin, Cyclophosphamid und Doxorubicin im µg/L-Bereich (HAMSCHER et al.

2010). Diese Substanzen sind Bestandteil vieler Kombinationschemotherapie-

protokolle in der Veterinärmedizin (ZEMANN et al. 1998; THAMM et al. 1999; CHUN

et al. 2000; BOYCE u. KITCHELL 2000; MOORE et al. 2001; GARRETT et al. 2002;

DAVIES et al. 2004; SIMON et. al. 2006, THAMM et al. 2006; CAMPS-PALAU et al.

2007; RASSNICK et al. 2008; SIMON et al. 2008), so dass der Analyse ihrer

Residuen wegen der häufigen Anwendung besondere Bedeutung zukommt. Durch

die zeitgleiche Analyse von Rückständen der vier genannten Zytostatika können zu

jedem Messzeitpunkt innerhalb einer Kombinationschemotherapie Rückstände aller

vier Substanzen nachgewiesen werden.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zur Rückstandsanalyse von Zytostatika im

Serum zeigen, dass Zytostatikarückstände im Serum chemotherapeutisch

behandelter Hunde direkt im Anschluss an die Behandlung nachgewiesen werden

können. Diese messbaren Konzentrationen in Serumproben wenige Minuten nach

der Chemotherapie variierten, wie erwartet, je nach applizierter Substanz.

Blutproben, die zu diesem Zeitpunkt gewonnen werden, stellen daher ein

Kontaminationsrisiko dar. Variationen in den Messwerten lassen sich zum Teil durch

geringe Schwankungen in den Zeitintervallen vom Ende der Applikation der

Zytostatika bis zur anschließenden Entnahme der Blutprobe erklären. Diese

Schwankungen sind abhängig von der individuellen Verteilung und vom jeweiligen

Metabolismus im Patienten und von der Arbeitsweise des behandelnden Tierarztes.

Auch wenn es sich hierbei nur um Schwankungen von wenigen Minuten handelt,

9

könnten gewisse Variabilitäten in den Serumkonzentrationen zu diesem Zeitpunkt

von diesem Faktor beeinflusst worden sein. Dennoch stimmen die Ergebnisse dieser

Studie mit früheren pharmakokinetischen Studien überein. Eine jüngere Studie über

die Pharmakokinetik von Doxorubicin berichtet zum Beispiel über vergleichbare

Serumkonzentrationen kurz nach der Doxorubicininfusion (SELTING et al. 2006).

Da eine Blutentnahme direkt nach der Chemotherapie und an den folgenden ein bis

drei Tagen jedoch nur in Ausnahmefällen notwendig sein dürfte, ist der Kontakt von

Tierärzten und Laborpersonal mit Blutproben zu diesen Zeitpunkten seltener.

Laborkontrollen finden in vielen Chemotherapieprotokollen üblicherweise sieben

Tage nach der Behandlung statt (MacEWEN et al. 1981; MYERS et al. 1997;

ZEMANN et al. 1998; SIMON et al. 2006). Daher wurde in dieser Studie der

Interessenschwerpunkt auf diesen Zeitpunkt gelegt, und in der überwiegenden

Mehrzahl der Proben lagen die Rückstandskonzentrationen zu diesem Zeitpunkt

unterhalb der Nachweisgrenzen. In einer einzelnen Probe konnten niedrige

Vinblastinkonzentrationen nachgewiesen werden. Gründe für diese Ausnahme

bleiben unklar. Eine Kontamination während der Probengewinnung oder individuelle

Unterschiede im Metabolismus sind mögliche Erklärungen hierfür. Hieraus ergibt

sich, dass der Umgang mit Blutproben zu diesem Zeitpunkt als sicher angesehen

werden kann.

Es muss jedoch erwähnt werden, dass in zwei von zwölf Serumproben, die ein bis

zwei Tage nach der oralen Gabe von Cyclophosphamid entnommen worden waren,

Cyclophosphamidrückstände nachgewiesen wurden. Obwohl die gemessenen

Serumkonzentrationen zu diesem Zeitpunkt, verglichen mit Konzentrationen direkt

nach der Behandlung, sehr gering waren und nur in einzelnen Proben nachgewiesen

wurden, muss die Möglichkeit des Vorkommens von Rückständen im Serum kurze

Zeit nach oraler Chemotherapie beachtet werden. Dieser Aspekt ist vor allem in

Hinblick auf Chemotherapieprotokolle, die die kontinuierliche orale

Zytostatikaverabreichung vorsehen, wie beispielsweise zur Behandlung der

chronischen lymphatischen Leukämie (LEIFER u. MATUS 1986) oder des multiplen

Myeloms (McEWEN u. HURVITZ 1977), interessant und sollte in zukünftigen Studien

untersucht werden.

10

Die Ergebnisse der Untersuchungen von Zytostatikarückständen im Urin bestätigen,

dass im Urin von Hunden Rückstände aller vier untersuchten Zytostatika (Vincristin,

Vinblastin, Doxorubicin und Cyclophosphamid) nachweisbar sind. Die gemessenen

Konzentrationen variierten in Abhängigkeit vom Untersuchungszeitpunkt nach der

Chemotherapie. Die höchsten Konzentrationen wurden ein bis zwei Stunden nach

der Behandlung gemessen. Cyclophosphamid zeigte die kürzeste Dauer

nachweisbarer Rückstände im Urin. Residuen dieser Substanz waren nur wenige

Minuten nach der intravenösen Verabreichung messbar. An den Tagen eins bis drei

nach der Behandlung lagen die medianen Cyclophosphamidkonzentrationen

unterhalb der Nachweisgrenze. In einzelnen Urinproben konnten lediglich sehr

niedrige Konzentrationen gemessen werden. Vermutlich sind diese Ergebnisse mit

der Pharmakokinetik von Cyclophosphamid zu erklären. Diese Substanz wird in der

Leber sehr schnell zu aktiven Metaboliten metabolisiert (GLUE u. CLEMENT 1999).

Da die Urinproben in der vorliegenden Arbeit nicht auf das Vorkommen dieser

Metaboliten untersucht wurden, müsste dieser Aspekt in weiterführenden Studien

geklärt werden.

Zusätzlich wurden in der aktuellen Studie Urinrückstände nach oraler Verabreichung

von Cyclophosphamid untersucht. Die Anzahl entsprechender Proben war zwar

gering, die Ergebnisse zeigen aber, dass die medianen

Cyclophosphamidkonzentrationen im Urin ein bis zwei Tage nach der Gabe

unterhalb der Nachweisgrenze lagen. In einer Probe konnten niedrige

Konzentrationen nachgewiesen werden. Die genauere Datenrecherche ergab, dass

der Besitzer das Cyclophosphamid in diesem Fall am Abend eingegeben hatte und

die Urinprobe am folgenden Morgen gewonnen worden war, so dass zwischen

Verabreichung des Zytostatikums und Probengewinnung ein Zeitintervall von 12 statt

24 Stunden wie in den übrigen Fällen, lag. Diese Ergebnisse zeigen, dass detaillierte

Untersuchungen von Zytostatikarückständen im Urin von Hunden mit kontinuierlicher

täglicher oraler Zytostatikagabe durchgeführt werden sollten.

Im Gegensatz zu Cyclophosphamid waren Vincristin- und Vinblastinrückstände im

Urin über einen Zeitraum von drei Tagen nach der Behandlung nachweisbar.

Zusätzlich lag die mediane Vinblastinurinkonzentration sieben Tage nach der

11

Injektion im messbaren Bereich. Da die Anzahl von Urinproben nach der Behandlung

mit Vinblastin, mangels zur Verfügung stehender Patienten, in dieser Studie gering

war, müssten zusätzliche Untersuchungen weiterer Proben, auch zu späteren

Zeitpunkten, die dargestellten Ergebnisse verifizieren und vervollständigen.

Die längste Ausscheidungsdauer von Rückständen im Urin zeigte sich nach der

Behandlung mit Doxorubicin. Doxorubicinrückstände konnten bis zu 21 Tage nach

der Doxorubicininfusion im Urin nachgewiesen werden. Die gemessenen

Konzentrationen waren mit unter 10% der initialen Doxorubicinurinkonzentration eine

Woche nach der Chemotherapie und 1-2% nach zwei Wochen jedoch relativ niedrig.

Die lange Ausscheidungsdauer von Doxorubicin im Urin kann vermutlich durch seine

pharmakokinetischen Eigenschaften erklärt werden. Es wird an Plasmaproteine und

an Gewebe gebunden (ROBERT u. GIANNI 1993). Diese Bindung führt zu einer

raschen Elimination aus dem Serum, gefolgt von einer zweiten Phase des

Metabolismus in der Leber und anschließend einer letzten metabolischen Phase, in

der die Gewebebindung gelöst wird (ROBERT u. GIANNI 1993).

Die Höhe der in der aktuellen Arbeit gemessenen Doxorubicinrückstände und die

Ausscheidungsdauer unterscheiden sich von Ergebnissen einer vorangegangenen

Studie (HAHN et al. 1994). In dieser früheren Studie konnten Doxorubicinrückstände

im Urin von Hunden mit Lymphomen nur für einen Zeitraum von fünf Tagen nach der

Chemotherapie nachgewiesen werden. Weiterhin waren die gemessenen

Doxorubicinkonzentrationen an den Tagen eins bis vier nach der Chemotherapie in

dieser Studie vier- bis neunfach geringer, als die in der aktuellen Studie

nachgewiesenen Konzentrationen. Die Gründe für diese Unterschiede sind nicht

ganz klar, könnten jedoch in Zusammenhang mit der hohen Selektivität der in der

aktuellen Arbeit eingesetzten LC-ESI-MS-MS-Methode stehen. Anders als in der

Studie von HAHN et al. (1994), in der fünf Hunde in metabolischen Käfigen gehalten

wurden, um den gesamten Urin in diesem Zeitraum sammeln zu können und auf

Doxorubicinrückstände und dessen Metabolite zu untersuchen, wurden in der

vorliegenden Arbeit keine metabolischen Käfige eingesetzt. Deshalb erlauben die

Ergebnisse dieser Arbeit keine differenzierten Aussagen über die Pharmakokinetik

und den Metabolismus der untersuchten Zytostatika. Dadurch kann weder die

12

prozentuale Gesamtzytostatikamenge, die mit dem Urin ausgeschieden wird

angegeben werden, noch können Verteilungskurven erstellt werden. Jedoch sollten

in dieser Arbeit Residuen unter realen Bedingungen der Chemotherapieapplikation

und nachfolgender Entlassung der Patienten untersucht werden, welche keine

Haltung der Patienten in metabolischen Käfigen notwendig macht.

In diesem Kontext stellt sich zusätzlich die Frage, inwiefern die Ausscheidungsdauer

mit dem Körperfettanteil der Hunde korreliert. Dieser interessante Aspekt sollte in

zukünftigen Studien untersucht werden, besonders, wenn es sich um Substanzen

handelt, die wie beispielsweise Doxorubicin eine hohe Gewebebindung aufweisen.

Die Konzentrationen von Rückständen im Urin scheinen hingegen nicht wesentlich

von der Länge der Lagerung der Proben im Kühlschrank beeinflusst zu werden. Im

Stabilitätsversuch wurden Proben initial analysiert, anschließend bei -80°C drei Jahre

aufbewahrt und nach diesem Zeitraum erneut untersucht. Die Cyclophosphamid- und

Doxorubicinkonzentrationen stimmten gut überein. Die Vincristin- genau wie die

Vinblastinkonzentrationen waren über diesen Zeitraum nur sehr geringfügig niedriger

geworden.

Wie bereits eingangs erwähnt, sind Richtlinien für den Umgang mit

Chemotherapeutika und dabei anfallenden Abfallprodukten für die Veterinärmedizin

zusammengestellt worden (ECVIM-CA 2007). In diesen Richtlinien werden auch

Zeiträume definiert, in denen nach der Chemotherapie eine Kontamination durch

Zytostatikarückstände im Urin entsprechend behandelter Patienten zu erwarten ist.

Die Festlegung dieser Zeiträume basiert jedoch auf Erfahrungen in der

Humanmedizin. Für die Zytostatika Cyclophosphamid, die Vincaalkaloide und für

Doxorubicin werden beispielsweise vier, drei bzw. sieben Tage angegeben, an

denen in Folge einer Behandlung mit diesen Substanzen mit entsprechenden

Rückständen im Urin gerechnet werden muss (ECVIM-CA 2007). Die Ergebnisse der

vorliegenden Arbeit zeigen aber, dass die Dauer der zu erwartenden

Ausscheidungen von Rückständen mit dem Urin für Vinblastin und Doxorubicin

angepasst werden müsste. Rückstände dieser Substanzen waren im Urin über

längere Zeiträume als angegeben messbar. Im Gegensatz dazu zeigte

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Cyclophosphamid eine kürzere Ausscheidungsdauer von Rückständen der

Reinsubstanz. Allerdings sollte im Hinblick auf das Vorkommen potentieller

zytotoxischer Metaboliten von Cyclophosphamid im Urin, das in dieser Arbeit nicht

untersucht wurde, der Urin mit entsprechender Vorsicht auch über einen Tag nach

der Chemotherapie hinaus behandelt werden.

Bis heute beschreiben zwei frühere Veröffentlichungen das Expositionsrisiko

gegenüber Zytostatika in der Veterinärmedizin (ERJAVEC et al. 2001, MEIJSTER et

al. 2006). In einer Studie untersuchten die Autoren die Exposition von Personen bei

der Zubereitung und Verabreichung von Zytostatika in veterinärmedizinischen

Kliniken. Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Werte nachweisbarer

Zytostatikarückstände auf der Oberfläche von Handschuhen 15-mal höher lagen als

gemessene Werte während der Verabreichung von Zytostatika in

Humankrankenhäusern (MEIJSTRER et al. 2006). Rückstände in Se- und Exkreten

klinischer Patienten wurden in dieser Studie jedoch nicht untersucht. Ein weiterer

Fallbericht beschreibt den Haarverlust bei zwei Haustieren, die durch mit Paclitaxel

kontaminierten Speichel ihrer Besitzerin, die wegen eines Ovarialzellkarzinoms

chemotherapeutisch behandelt wurde, Paclitaxel aufgenommen hatten (ERJAVEC et

al. 2001). Der Speichel der Besitzerin war auf einen Hund und eine Katze übertragen

worden, weil sie von der Besitzerin vorgekautes Essen gefüttert bekamen. Dieser

Fall zeigt, dass Speichel eine zusätzliche potentielle Kontaminationsquelle darstellen

könnte. Der Aspekt sollte daher ebenfalls in weiterführenden Studien untersucht

werden.

In einer jüngeren Studie berichten FRANSMAN et al. (2007) von der sinkenden

Expositionsrate von Krankenschwestern onkologischer Stationen gegenüber

Zytostatika zwischen 1997 und 2000 in den Niederlanden. Unter anderem hat die

Erstellung detaillierter Richtlinien zu dieser Senkung beigetragen. Das Ergebnis

dieser Studie betont die Bedeutung der Charakterisierung von Berufsrisiken und

Umweltgefahren in Verbindung mit der Durchführung von Chemotherapien in der

14

veterinärmedizinischen Onkologie und die Verbesserung der Risikosituation durch

Anpassung von Sicherheitsstandards.

Die Nachweisgrenzen der in den vorliegenden beiden Studien angewandten

Methode für die vier untersuchten Substanzen stellen einen limitierenden Faktor der

Studien dar. Die hier untersuchten Zytostatika werden teilweise von der International

Association of Research on Cancer (IARC) als karzinogen und mutagen und alle als

teratogen klassifiziert (IARC 1975, 1976, 1981, 1987). Demnach müsste jede

nachweisbare Menge dieser Substanzen als potentiell gesundheitsgefährlich

angesehen werden. Unter Beachtung, dass Patienten in der Veterinärmedizin in der

Regel geringere Mengen der Chemotherapeutika erhalten als Patienten in der

Humanmedizin (RUSLANDER 2005), weil niedrigere Dosierungen eingesetzt werden

und die Körpergewichte der Tiere geringer sind, können niedrigere

Rückstandskonzentrationen erwartet werden als in der Humanmedizin. Es bleibt

unklar, ob in der vorliegenden Arbeit die Proben mit Messergebnissen unterhalb der

festgesetzten Nachweisgrenzen wirklich frei von Rückständen der entsprechenden

Zytostatika sind. Verbesserte Messmethoden mit geringeren Nachweis- und

Bestimmungsgrenzen würden diesen Faktor präzisieren. Auf der anderen Seite ist

unklar, inwiefern die gemessenen Rückstandskonzentrationen überhaupt hoch

genug sind, um ein Gesundheitsrisiko für den Menschen darzustellen. Dieser Aspekt

kann in der vorliegenden Arbeit nicht letztendlich geklärt werden. Daher müssen

weiterführende Studien Mutagenitätsprüfungen mit Zytostatikadosierungen in Höhe

der nachgewiesenen Konzentrationen beinhalten. Erst dadurch wird es möglich sein,

potentielle Gefahren ausgehend von Zytostatikarückständen im Serum und im Urin

näher zu definieren. So lange entsprechende Daten noch nicht zur Verfügung

stehen, sollte Urin und Serum von Hunden, die mit den zytotoxischen Substanzen

Vincristin, Vinblastin, Cyclophosphamid und Doxorubicin behandelt werden,

innerhalb der Zeiträume, in denen in dieser aktuellen Studie Zytostatikarückstände

nachgewiesen werden konnten, mit entsprechender Vorsicht und entsprechend den

Richtlinien für den Umgang mit Chemotherapien in der Veterinärmedizin behandelt

werden.

15

Diese Arbeit stellt einen ersten wichtigen Schritt zur Charakterisierung von

Zytostatikarückständen in Se- und Exkreten von Hunden während und nach der

Chemotherapie dar. Die Ergebnisse tragen dazu bei, bestehende Richtlinien für die

Veterinärmedizin anzupassen und damit das Expositionsrisiko für den Menschen zu

reduzieren, um so zu einem sichereren Umgang mit Chemotherapien in der

Veterinärmedizin zu führen.

16

IV. Publikationen

Der selbstständige Anteil an diesen Publikationen umfasst die Probenakquise, die Auswertung der Ergebnisse und Literaturrecherche und die Verfassung beider Publikationen als Hauptautorin.

1. KNOBLOCH, A., S. A. I. MOHRING, N. EBERLE, I. NOLTE, G. HAMSCHER, D. SIMON (2010):

Drug residues in serum of dogs receiving anticancer chemotherapy.

J.Vet.Intern.Med. 24, 379-383

2. KNOBLOCH, A., S. A. I. MOHRING, N. EBERLE, I. NOLTE, G. HAMSCHER, D. SIMON (2010):

Cytotoxic drug residues in urine of dogs receiving anticancer chemotherapy.


17

V. Zusammenfassung (englisch)

Anna Katharina Felicitas Knobloch (2010): Evaluation of drug residues in serum and urine of dogs receiving anti-cancer

chemotherapy

The presence of drug residues in serum and urine of chemotherapeutically treated

dogs may represent an occupational hazard. However, studies on cytotoxic drug

residues in serum and urine of clinical patients are lacking in veterinary oncology.

Therefore, the objective of the two studies was the quantitative analysis of cytotoxic

drug residues in serum of dogs seven days after treatment and in urine at different

timepoints following treatment, in order to evaluate possible occupational hazards

associated with chemotherapy in veterinary medicine.

Client-owned canine cancer patients treated for lymphoma or mast cell tumors with

the chemotherapeutic agents vincristine, vinblastine, cyclophosphamide, or

doxorubicin were eligible for these studies.

Measurement of vincristine, vinblastine, cyclophosphamide and doxorubicin residues

in serum and urine was performed by liquid chromatography tandem mass

spectrometry (LC/MS/MS).

In the first study evaluating drug residues in serum the mean serum concentrations of

33 samples collected directly after treatment were: vincristine: 37.0 µg/L, vinblastine:

13.0 µg/L, cyclophosphamide: 2484.0 µg/L, doxorubicin: 404.0 µg/L. In 81 serum

samples collected seven days following treatment, the majority of samples conained

no measurable residues. The analysis only revealed low vinblastine residues

(7.0 µg/L) in one sample collected seven days following treatment and low

concentrations of cyclophosphamide (7.4 µg/L and 8.6 µg/L) in two samples collected

one to two days following oral administration.

The second study evaluating drug residues in urine showed a median

cyclophosphamide residue concentration of 398.2 µg/L directly following treatment

(d0) and below the level of detection on days 1-3 (d1, d2, d3). Median vincristine

residue concentration was 53.8 µg/L directly after treatment and 20.2, 11.4, and

6.6µg/L on days 1, 2, and 3. Median vinblastine residues amounted to 144.9 (d0),

18

70.8 (d1), 35.6 (d2), and 18.7 µg/L (d3) with low concentrations detectable for seven

days after treatment. Median urine doxorubicin concentrations were 354.0 (d0), 165.6

(d1), 156.9 (d2), and 158.2 µg/L (d3). Low concentrations of doxorubicin residues

were measurable up to 21 days after administration.

The conclusion of the two studies is that in this population of dogs, measurement of

serum from canine chemotherapy patients seven days following treatment with

vincristine, vinblastine, cyclophosphamide and doxorubicin revealed no detectable

chemotherapy residues in the majority of cases. Therefore, handling of blood

samples at this time point may be considered safe. In urine samples variable

concentrations of cytostatics were measured, depending on sampling time point and

substance. Findings may serve to improve present chemoprotection guidelines and

help minimize exposure risks.

19

VI. Zusammenfassung (deutsch)

Anna Katharina Felicitas Knobloch (2010):

Untersuchungen zu Zytostatikarückständen in Serum und Urin bei Hunden mit

Tumorerkrankungen während und nach Chemotherapie

Obwohl Zytostatika in Abhängigkeit von der Substanz als kanzerogen, mutagen und

teratogen einzustufen sind und somit eine potentielle Gesundheitsgefährdung für

Kontaktpersonen darstellen, gab es bis heute keine systematischen Studien, die

Rückstände dieser Substanzen nach chemotherapeutischer Behandlung von Hunden

in der Veterinärmedizin untersucht haben. Die vermehrte Anwendung von

Chemotherapeutika in der Veterinärmedizin wirft jedoch die Frage nach möglichen

Gesundheitsrisiken für Kontaktpersonen, so wie Umweltrisiken durch Rückstände in

Se- und Exkreten und entsprechenden Ausscheidungen chemotherapeutisch

behandelter Tiere auf.

Daher war das Ziel der zwei Studien die quantitative Analyse von

Zytostatikarückständen im Serum von Hunden sieben Tage nach der Chemotherapie

und im Urin zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Chemotherapie, um mögliche

Gesundheitsrisiken im Zusammenhang mit Chemotherapien in der Veterinärmedizin

zu definieren.

Eingegangen in die Studien waren Hunde, die wegen eines Lymphoms oder eines

Mastzelltumors mit den Chemotherapeutika Vincristin, Vinblastin, Cyclophosphamid

oder Doxorubicin behandelt worden waren.

Die Konzentrationen von Vincristin, Vinblastin, Cyclophosphamid und Doxorubicin im

Serum und im Urin wurden mittels einer quantitativen LC/MS/MS-Methode bestimmt.

In der ersten Studie, in der Zytostatikarückstände im Serum untersucht wurden,

betrugen die medianen Serumkonzentrationen in 33 Serumproben, die wenige

Minuten nach der Behandlung gewonnen worden waren: Vincristin: 37,0 µg/L,

Vinblastin: 13,0 µg/L, Cyclophosphamid: 2484,0 µg/L, Doxorubicin: 404,0 µg/L.

In 81 Serumproben, die entweder sieben Tage nach der Applikation von Vincristin,

Doxorubicin oder Cyclophosphamid (Lymphompatienten), oder sieben Tage nach der

intravenösen Applikation von Vinblastin und ein bis zwei Tage nach der oralen Gabe

20

von Cyclophosphamid (Mastzelltumorpatienten) gewonnen worden waren, konnten in

der Mehrzahl der Proben keine Rückstände nachgewiesen werden. Lediglich in einer

Probe wurden Vinblastinrückstände in einer Konzentration von 7,0 µg/L und in zwei

Proben Cyclophosphamidrückstände in den Konzentrationen 7,4 µg/L und 8,6 µg/L

gemessen.

Die zweite Studie, in der Zytostatikarückstände im Urin untersucht wurden, ergab

eine mediane Konzentration von Cyclophosphamidrückständen im Urin von 398,2

µg/L am Tag der Behandlung (d0). An den Tagen 1-3 (d1, d2, d3) nach der

Behandlung lagen die Cyclophosphamidrückstände unterhalb der Nachweisgrenze.

Die mediane Vincristinrückstandskonzentration lag bei 53,8 µg/L am Tag der

Behandlung und bei 20,2 µg/L, 11,4 µg/L, und 6,6 µg/L an den Tagen 1, 2, und 3. Die

medianen Vinblastinrückstände wurden in den Konzentrationen 144,9 µg/L (d0), 70,8

µg/L (d1), 35,6 µg/L (d2), und 18,7 µg/L (d3) gemessen. Niedrige

Vinblastinkonzetrationen waren im Urin bis sieben Tage nach der Behandlung

messbar. Mediane Doxorubicinkonzentrationen lagen bei 354,0 µg/L (d0), 165,6 µg/L

(d1), 156,9 µg/L (d2), und 158,2 µg/L (d3). Niedrige Konzentrationen von

Doxorubicinrückständen waren im Urin bis zu 21 Tage nach der Doxorubicininfusion

messbar.

Auf der Grundlage der Ergebnisse dieser Arbeit scheint es, dass in Blutproben

chemotherapeutisch behandelter Hunde sieben Tage nach der Chemotherapie mit

Vincristin, Vinblastin, Cyclophosphamid und Doxorubicin keine

Zytostatikarückständen zu erwarten sind und der Umgang mit den Blutproben zu

diesem Zeitpunkt als sicher angesehen werden kann. Im Urin dagegen sind in

Abhängigkeit vom Zeitpunkt nach der Behandlung und der applizierten Substanz

unterschiedlich hohe Konzentrationen von Zytostatikarückständen zu erwarten. Die

Ergebnisse dieser Arbeit sollen dazu beitragen Richtlinien für den Umgang mit

Chemotherapien in der Veterinärmedizin und zur Vermeidung von

Gesundheitsgefahren im Zusammenhang mit dem Einsatz von Zytostatika bei Tieren

zu entwickeln.

21

VII. Schrifttumsverzeichnis

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(1998):

A combination chemotherapy protocol (VELCAP-L) for dogs with lymphoma.


32

VIII. Abkürzungsverzeichnis

µg Mikrogramm

L Liter

mg Milligramm

m2 Quadratmeter

d day

IU international units

SC subcutanenous

IV intravenous

PO per os

°C degree celsius

min minutes

mL millilitre

M mol

mM millimol

pH pondus hydrogenii

g gravitational acceleration

et al. et alii

33

IX. Verlagsbestätigungen

1.

30-Nov-2009

Dear Dr. Simon:

It is a pleasure to accept your manuscript entitled "Drug residues in serum of dogs receiving anti-

cancer chemotherapy" in its current form for publication in the Journal of Veterinary Internal

Medicine.

Thank you for choosing the Journal of Veterinary Internal Medicine for publication of your work.

Sincerely,

Prof. Kenneth Hinchcliff

Editor in Chief, Journal of Veterinary Internal Medicine

[email protected]

2.

10-Nov-2009

Dear Dr. Simon:

It is a pleasure to accept your manuscript entitled "Cytotoxic drug residues in urine of dogs receiving

anti-cancer chemotherapy" in its current form for publication in the Journal of Veterinary Internal

Medicine.

Thank you for choosing the Journal of Veterinary Internal Medicine for publication of your work.

Sincerely,

Dr. Stephen DiBartola

Editor in Chief, Journal of Veterinary Internal Medicine

[email protected]

34

X. Weitere Publikationen im Rahmen dieser Arbeit

Publikationen: 1. G Hamscher, SAI Mohring, A Knobloch, N Eberle, H Nau, I Nolte, D Simon (2010) Determination of drug residues in urine of dogs receiving anti-cancer

chemotherapy: is there an environmental or occupational risk?

J.Anal.Toxicol. accepted for publication November 15th, 2009

Vorträge:

1. A Knobloch, SAI Mohring, N Eberle, I Nolte, G Hamscher, D Simon (2008):

Analysis of drug residues in serum of dogs receiving anti-cancer chemotherapy 18th ECVIM-CA Congress in Ghent (4-6th September 2008)

2. A Knobloch, SAI Mohring, N Eberle, I Nolte, G Hamscher, D Simon (2009):

Untersuchungen von Zytostatikarückständen im Serum von Hunden nach Chemotherapie InnLab-Tagung in Berlin (31. Januar-1. Februar 2009)

3. A. Knobloch, SAI Mohring, N Eberle, I Nolte, G Hamscher, D Simon (2010): Belastung von Patient und Umwelt durch Chemotherapeutika Leipziger Tierärztekongress (21. Januar-23. Januar 2010)

35

X. Danksagung

Zunächst möchte ich Herrn Prof. Dr. Ingo Nolte dafür danken, dass ich meine

Dissertation in der Klinik für Kleintiere anfertigen durfte. Ich bedanke mich für die

freundliche, wissenschaftliche Betreuung.

Ein ganz herzliches Dankeschön gilt Frau Dr. Daniela Simon für die Überlassung des

interessanten Themas. Ich bedanke mich für die unerschöpfliche Geduld bei dem

Erstellen der unzähligen Graphiken und den immer wieder notwendigen Korrekturen.

Ich danke dir für jegliche Unterstützung bei dieser Arbeit und darüberhinaus für die

unschätzbar wertvolle Starthilfe in mein Berufsleben.

Mein ganz besonderer Dank gilt Frau Dr. Nina Eberle, die mir in den zweieinhalb

Jahren meiner Promotion immer zur Seite gestanden hat. Bei Problemstellungen

jeglicher Art war sie mir zu jeder Zeit eine große Hilfe und ihrem unermüdlichen

Engagement verdanke ich eine exzellente klinische Ausbildung. Ich habe

wissenschaftlich und menschlich viel von ihr gelernt. Vielen Dank für die sehr schöne

und fröhliche Zeit unserer Zusammenarbeit, in der wir viel Spaß hatten und in der du

mir eine gute Freundin geworden bist.

Weiterhin möchte ich mich bei Frau Alexa Jötzke und Frau Caroline Berg für die gute

Zusammenarbeit und die Mithilfe bei der Probensammlung bedanken. Alexa hat mir

darüberhinaus stets ihre Unterstützung bei Computerfragen gewährt. Vielen Dank

dafür. Auch über alltägliche Kuriositäten habe ich viel von dir gelernt.

Hervorheben möchte ich auch die freundliche Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Dr.

Gerd Hamscher und Frau Siegrun Mohring, für die ich mich ebenfalls bedanke.

Ich danke von ganzem Herzen meinen Eltern für die Hilfe bei der Verwirklichung

meines Kindheitstraumes. Erst durch ihre uneingeschränkte moralische und

finanzielle Unterstützung waren mein Studium und die Anfertigung dieser Arbeit

möglich. Danke, dass ihr immer für mich da seid. Weiterhin möchte ich mich bei

meinen Geschwistern Julien und Rebecca dafür bedanken, dass sie mir immer

wichtige und anteilnehmende Gesprächspartner und über das geschwisterliche

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Verhältnis hinaus gute Freunde sind. Meinem Bruder Tobias danke ich für den

Ansporn, der mir die Fertigstellung seiner eigenen Dissertation war.

Abschließend möchte ich mich bei meinem Freund Nicolas für das kritische

Korrekturlesen und die vielen anregenden Diskussionen bedanken. Ich danke dir von

ganzem Herzen für deine wertvolle und stets liebevolle Unterstützung, dein

Verständnis und deine unendliche Geduld. Schön, dass es dich gibt!

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Tierärztliche Hochschule Hannover · Zytostatika und dabei anfallenden Abfallprodukten veröffentlicht. Diesen Protokollen liegen humanmedizinische Richtlinien, unter anderem des