Tipps und Tricks zur Methodenentwicklung U/HPLC · pH 9 – das Molekül liegt im Verhältnis von 1:1 protoniert und deprotoniert vor Resultat: Peakform kann schlecht sein. pH 10

Page1

Tipps und Tricks zur

Methodenentwicklung U/HPLC

Selektivität

stationäre und mobile Phase

Gradientenoptimierung

Thomas Bienert

Agilent Technologies

Page 2

Chromatographische Grundgleichung

Auflösung für HPLC und UHPLC

N = Bodenzahl - Säulenlänge und Partikelgröße

a = Selektivität – stationäre und mobile Phase

k = Kapazitätsfaktor – isokratische Elution

k = Retentionsfaktor – Gradienten-Elution

( - 1)

[ ] Rs = N k-Faktor

Page 3

Methodenentwicklung

Einfluss der Selektivität, Trenneffizienz und Retention

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Re

so

luti

on

Increase N

Increase Alpha

Increase k'

Selektivität beinflusst die Auflösung am

stärksten

• Stationäre und mobile Phase

• Temperatur

• N stark beeinflussbar durch a

Rs = N½/4 ( -1)/ k’/(k’+1)

Böden: 5000 10000 15000 20000 25000

Alpha: 1.10 1.35 1.60 1.85 2.1

k’: 2.0 4.5 7.0 9.5 12.0

Page 4

Welche ZORBAX Phase für welche Analytik?

StableBond C18 … Eclipse XDB C18… Bonus RP Extend-C18

Empfohlener Bereich:

pH: 0.8-8.0 pH: 2.0-9.0 pH: 2.0-9.0 pH: 2.0 -11.5

T: bis 90/100ºC T: bis 60ºC T: bis 60ºC T: bis 40/60ºC

NEU! Eclipse Plus ... für Basen/Säuren NEU! SB Aq, Phenyl, CN

Page 5

Säulen: RRHT 4.6 x 50 mm 1.8um Mobile Phase A: pH 5 0.05 M Na Acetat, B: ACN (70:30) Flussrate: 1 mL/min

Inj. Vol: 2 ul Detektion: UV 219 nm

RRHT SB-CN,

1.8um

min 0 2 4 6 8

RRHT Eclipse XDB-C18,

1.8um

min 0 2 4 6 8

min 0 2 4 6 8

RRHT SB-C18,

1.8um Indol Pindolol

Optimale Selektivität: Methodenentwicklung

Optimal!

Page 6

Optimale Selektivität für ultra-schnelle Trennungen

min

RRHT SB-Phenyl: schnellste Selektivität!

Elutionsordnung: Peaks 3,4 & 5

Probe:

1. Tolmetin

2. Naproxen

3. Diflunisal

4. Ibuprofen

5. Diclofenac

für SB-Phenyl

SB-Phenyl 1.8um

SB-C8 1.8um

SB-C18 1.8um

SB-CN 1.8um

0 1 2 3 4 5

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Optimal!

doppelte Zeit

Tailing

sek. Wechselwirkungen

Co-Elution

Page 7

min 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

mAU

0

10

20

min 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

mAU

0

10

20

min 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

mAU

0

10

20

Phenol

Methylparaben Ethylparaben

N,N-Diethyl-m-

toluamid

Propylparaben Butylparaben

Toluen

Heptylparaben

Eclipse Plus C18

Eclipse Plus

PhenylHexyl

Bonus RP

Säulen – Scouting zur Methodenentwicklung

Flussrrate: 0.5ml/min; Gradient::25 to 80%ACN in 3min, at 4min 90%ACN,at 4.5min 25%ACN, bei 6min25%ACN

Run time: 6min; Injektionsvol.: 3µl mit needle wash (Wasser/Methanol=50/50) für 6 s; T: 30°C (storage/run)

DAD: 254nm bw 10, ref. 360/100nm, 4nm slit, peak width 0.01min

Page 9

Selektivität - mobile Phase

Auswahl der Elutionsbedingungen

Wässriger Anteil – pH Wert

Organischer Anteil – Typ des organischen Lösungsmittels

Page 10

Puffer pKa Pufferbereich Puffer pKa Pufferbereich

Phosphat Formiat 3,8 2,8 - 4,8

pK1 2,1 1,1 - 3,1 Acetat 4,8 3,8 - 5,8

pK2 7,2 6,2 - 8,2 Tris(hydroxymethyl) 8,1 7,1 - 9,1

pK3 12,3 11,3 - 13,3 Aminomethan 8,3 7,3 - 9,3

Ammonium 9,2 8,2 - 10,2

Citrat Borat 9,2 8,2 - 10,2

pk1 3,1 2,1 - 4,1 1-Methyl-Piperidin 10,3 9,3 - 11,3

pK2 4,7 3,7 - 5,7 Pyrrolidin 10,5 9,5 - 11,5

pK3 5,4 4,4 - 6,4 Triethylamin 10,7 9,7 - 11,7

pH Stabilisatoren für pH-Werte < 2,5

Phosphorsäure, 0,1% TFA

Puffer für die HPLC

Page 11

Einfluss des pH-Wertes auf verschiedene

Substanzklassen

unpolar polar ionisierbar

Naphthalin Benzylalkohol Benzoesäure

Acenaphthen Nitrobenzol Benzanilid

pH 3

pH 7

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Time (min) Time (min) Time (min)

Page 12

pH, pKa (Säurestärke) und schwache Basen

pH 9 – das Molekül liegt im Verhältnis von 1:1 protoniert und deprotoniert vor

Resultat: Peakform kann schlecht sein.

pH 10 – 91% der Moleküle liegen unprotoniert vor – keine Ladung – höhere

Retardierung zu erwarten

pH 8 – 91% der Moleküle leigen protoniert vor – eindeutige Ladung verschiebt die

Retention zu kleinen k’-Werten

Ka = [R3N][H+]

[R3NH+]

Ka = 1 x 10-9

pKa = 9 CHOCH CH N

2 2

CH3

CH3

+

HCH

3

CH3

CHOCH CH N2 2

R3NH+ R3N + H+

+ H+

Diphenhydramin

Page 13

pH-Einfluss auf die Retention von Säuren, Basen

und Neutralsubstanzen

Säule: Bondapak-C18

3.9 x 300 mm

Mobile Phase: 60% 25 mM phosphate buffer

40% Methanol

Flussrate: 2.0 mL/min

Temperatur: RT

Probe: pKa

1. Salicylsäure 3.0

2. Phenobarbital 7.4

3. Phenacetin 2.2

4. Nicotin 7.9

5. Methamphetamin 10.1

J.Chromatogr., 111(1975) 149

Retention und Selektivität zeigen starke Abhängigkeit vom pH-Änderungen

5

SCD

+

+

2 +

1

1.5

1.0

0.5

0.0

-0.5

log

k«

3 4 5 6 7 8 pH

A B C

2

4

5

3

3 5 7 9

ELUENT pH

40

30

20

10

10

Ret

entio

n

+++

3

17,12 - OC

UDC

SOC4

6

C12-OC

Page 14

pH-Änderungen ändern Selektivität und Auflösung

1. Procainamid

2. Buspiron

3. Pioglitazon

4. Eletriptan

5. Dipyridamol

6. Diltiazem

7. Furosemid (4-Chlor-2-

[(2-furylmethyl)amino]-5-

sulfamoylbenzoesäure;

4-Chlor-N-furfuryl-5-

Sulfamoylanthranilsäure;

min 0 2 4 6 8

1

2

3

4

5

6

7 pH 2.7: 0.1% Ameisensäure/ACN

min 0 2 4 6 8

1

7 4

2 6

5 3

pH 4.8: NH4Acetat/ACN

0 2 4 6 8

1

2

3

4 5

6 7 pH 7: NaPO4/ACN

Säulen: Eclipse Plus C18, 4.6

x 100mm, 5um

Gradient: 10 – 90% in 10 min.

Detektion: UV 254 nm

Page 15

(Vorstufe Antidepressiva)

Page 16

Page 17

Eluentvergleich: verschiedene pH-Werte

Säule konstant: Extend C18

H5931A © Agilent Technologies 2011

0 5

1

2,3

4

5

Zeit (min)

7

6

pH 7

30% 20 mM Na2HPO4

70% MeOH

Säule: 4.6 x 150 mm, 5 m

Mobile Phase: wie beschrieben

Flussrate: 1.0 mL/min

Temperatur: RT

Detektion: UV 254 nm

Probe: 1. Maleate

2. Pseudoephedrin

3. Scopolamin

4. Doxylamin

5. Chlorpheniramin

6. Triprolidin

7. Diphenhydramin

Zorbax Extend C18

pH 11

30% 20 mM TEA-Puffer

70% MeOH

0 5 10

1

2

3

4

Zeit (min)

6

5

7

Bessere Auflösung Trennung basischer

Antihistamine überhalb ihres pka-Wertes

Page 19

Organischer Anteil

Page 20

Optimierung der RPC-Trennung

Methanol

Tetrahydorfuran Acetonitril

J.L. Glajch, J.J. Kirkland, K.M. Squire, and

J.M. Minor, J. Chromatogr., 199 (1980) 57.

Änderung der Elutionsmittelstärke

Elutionsmittelstärke-Nomogramm für RPC-Trennungen

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0 20 40 60 80 100

0 20 10 40 30 50 60 70 80 90 100

ACN/WASSER

MEOH/WASSER

THF/WASSER

Page 21

Isoelutropische Stärke

% MeOH in H2O % ACN in H2O Relativer k’-Wert

0 0 100

10 6 40

20 14 16

30 22 6

40 32 2.5

50 40 1

60 50 0.4

70 60 0.2

80 73 0.06

90 86 0.03

100 100 0.01

http://www.sanderkok.com/techniques/hplc/eluotropic.html

http://www.sanderkok.com/techniques/hplc/eluotropic.html

Page 22

Acetonitril/MeOH - Elutionsmittelstärke/Selektivität

50% MeOH

30% ACN

Säule: ZORBAX RRHT Eclipse Plus C18, 4.6 x 50 mm, 1.8 m Mobile Phase: A: 25 mM NaH2PO4 , pH 3.0 B: Organik;

Flussrate: 2.0 mL/min Temperatur: 30°C Detektion: UV 240 nm

Sample: Cardiac Drugs 1.Pindolol 2. Disopyridamide 3.Propranolol 4.Diltiazem 5. Dipyridamole

1 2

mAU

-20

0

20

40

60

80

100

120

140 1

2

3 4 5

1 2 3

mAU

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

2

3 4 5

1

Auflösung der Peakpaare

(2,3), (3,4), (4,5)

ist besser in MeOH

Peak 5 Selektivitätsänderung

Auflösung des Peakpaares

(1,2), ist besser in ACN

kürzere Analysenzeit

höhere Trenneffizienz

Page 23

Selektivitätsoption für aromatische und konjugierte

Systeme

hoch konjugtierte, aromatische Systeme wenig konjugtierte Systeme

Page 24

Steroide – Phenyl-Phasen und ACN

ACN fördert eher die Trennung nach Hydrophobizität

Page 25

Steroide – Phenyl-Phasen und MeOH

MeOH fördert eher die Trennung nach Aromatizität/pi-Elektronen

Page 27

Säulenkits für systematische Methodenentwicklung (400, 600, 1200 bar Systeme)

Kit Bestellnummer Säulen

RRHT Selektivitätskit

2.1*50 mm, 1.8 um

5190-1431 Eclispe Plus C18

Eclipse Plus PhenylHexyl

Bonus RP

RRHT pH-Kit

2.1*50 mm, 1.8 um


StableBond C18

Extend C18


4.6*50 mm, 1.8 um



Bonus RP

RRHT pH-Kit

4.6*50 mm, 1.8 um


StableBond C18

Extend C18


4.6*100 mm, 3.5 um



Bonus RP

RRHT pH-Kit

4.6*100 mm, 3.5 um


StableBond C18

Extend C18

“The lazy man’s system”

DAD

Binäre

Pumpe

ALS

Solvent

selection

valve

Puffer 1-12

Organisch 1,2

(Degasser siehe nächste Folie)

x

bypass (oder 8te Säule)

Waste (oder 7te Säule

TCC cluster (2-3 TCCs)

“The lazy man’s system” – Anwendungen

Page 29

Vollautomatische Methodenoptimierung

• AutoChrom for ChemStation

• ChromSword for ChemStation

Vollautomatische Methodenentwicklung und Optimierung!

Partner-

lösungen!

30

Optimierung einer

(U)HPLC Methode

bezüglich Auflösung und

Geschwindigkeit

Übersicht

31

• Einleitung

• Anforderungen an die Anwendung

• Van Deemter Kurven

• Voraussetzungen für den Methodentransfer

• Optimierung einer (U)HPLC Methode bezüglich Geschwindigkeit

• Reduktion der Säulenlänge

• Anpassung der Gradientenzeit

• Beispiele

• Optimierung einer (U)HPLC Methode bezüglich Auflösung

• Beispiele

• Thema: Selektivität

• Zusammenfassung

32

Anforderungen an die Anwendung

Kürzere Laufzeit (bei gleicher Auflösung)

Mehr

Empfindlichkeit Applikation

Mehr Auflösung (bei gleicher Laufzeit)

Mehr Auflösung

bei kürzerer Laufzeit

33

Van Deemter Kurven für verschiedene

Partikelgrößen

0.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

0.0025

0.0030

0.0035

0.0040

0.0045

0.0 0.5 1.0 1.5

Reduzie

rte T

rennstu

fenhöhe

Fluss

5.0 m

3.5 m

1.8 m

1. Kleine Partikel ergeben niedrigere Trenn-

stufenhöhen und damit höhere Trenneffizienz

2. Für kleine Partikel leidet die Trenneffizienz

weniger wenn man die Flussrate erhöht

Page 34

Chromatographische Grundgleichung

Auflösung für HPLC und UHPLC

N = Bodenzahl - Säulenlänge und Partikelgröße

a = Selektivität – stationäre und mobile Phase

k = Kapazitätsfaktor – isokratische Elution

k = Retentionsfaktor – Gradienten-Elution

( - 1)

[ ] Rs = N k-Faktor

35

Voraussetzungen

Keine Änderung der Selektivität (stationäre und mobile Phase)

Stationäre Phase in versch. Partikelgrößen und

Säulenlängen verfügbar

Keine Änderung der Gradientenspanne (Methode)

Immer z.B. von 20 – 100 % B

k

kNRs

1

1

41

Effizienz Selektivität Kapazität

36

Voraussetzungen

Systemvolumina stehen in passendem Verhältnis zu den

Säulendurchmessern und Flussraten.

2.1 mm 3 mm 4.6 mm

1100 / Standard 1200

1200 RRLC (standard delay vol.)

1200 RRLC (low delay vol.)

1290 Infinity LC

Keine Änderung des Säulendurchmessers beim Methodentransfer!

37

Säulenlänge und Partikelgröße Optimierung der Analyse bezüglich Laufzeit


Applikation

Page 38

Kürzere Laufzeit – Reduktion der

Säulenlänge

Lc1

Säule 1: 2.1 mm x 150 mm, 5.0 µm

Lc2

Säule 2: 2.1 mm x 50 mm, 5.0 µm

(Kapillare)

Reduziert! (für FIA = 0)

N = Lc / H

(H = HETP)

Was passiert mit der Bodenzahl?

39

Reduktion der Säulenlänge Tabelle

Säulenlänge (mm) Bodenzahl N

5 μm Partikel

Bodenzahl N

3.5 μm Partikel

Bodenzahl N

1.8 μm Partikel

150 13050 18650 36250

100 8700 12400 24150

50 4350 6200 12100

2

2

1

1~p

c

p

c

d

L

d

LN

Page 40

Reduktion der Säulenlänge unter Erhalt der

Bodenzahl

Reduktion der Säulenlänge

Säule 1: 2.1 mm x 150 mm, 5.0 µm Säule 2: 2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm

Reduktion der Partikelgröße

Daumenregel

41

5 μm 3.5 μm ⅔

5 μm 1.8 μm ⅓

3.5 μm 1.8 μm ½

Page 42

Reduktion der Laufzeit

= Reduktion auf 1/3

Laufzeit = Reduziert um Längenfaktor

Gradientenzeiten = Reduziert um Längenfaktor

z.B. 15 min 5 min

35 - 60 % in 15 min 35 - 60 % in 5 min

150 mm 50 mm

43

Gradientensteigung Laufzeit

Ft

VSb

G

m

b: Gradientensteigung

S: Konstante

ΔΦ: Änderung in % org. Phase

Vm: Systemvolumen

tG: Gradientenzeit

F: Flussrate

Hält man b konstant ändert sich das Elutionsprofil nicht!

Ft

Vb

G

c~Vc: Säulenvolumen

Vm ≈ Vc war Voraussetzung

Lc: Länge Säule Ft

L

G

c~

Beispiel 1

44

min 0 2 4 6 8

mAU

0

10

20

30

40

Ura

cil

Phenol

Meth

yl para

ben

Eth

yl para

ben

Pro

pyl para

ben

N,N

-die

thyl-m

-Tolu

am

ide

Buty

l para

ben

Tolu

ene

Hepty

l para

ben

Säule: ZORBAX Eclipse Plus C18 2.1 x 150 mm, 5 µm

Beispiel 1

45

Säule: ZORBAX Eclipse Plus C18 2.1 x 150 mm, 5 µm

Mobile Phase: A = Wasser, B = Acetonitril

Gradient: 0 min 20 % B

9 min 100 % B

10 min 100 % B

Fluss: 0.3 mL/min

Stopzeit: 10 min

Postzeit: 5 min

Inj.vol.: 3 μL

Säulentemp.: 40 C

DAD: 254 nm / 4 (360 nm / 100)

46

Beispiel 1


5 μm Partikel

Bodenzahl N

3.5 μm Partikel

Bodenzahl N

1.8 μm Partikel

150 13050 18650 36250

100 8700 12400 24150

50 4350 6200 12100

2

2

1

1~p

c

p

c

d

L

d

LN

Beispiel 1

47

Säule: ZORBAX Eclipse Plus C18 2.1 x 100 mm, 3.5 µm



6.0 min 100 % B (9 min)

6.7 min 100 % B (10 min)

Fluss: 0.3 mL/min

Stopzeit: 6.7 min (10 min)

Postzeit: 3.4 min

Inj.vol.: 3 μL

Säulentemp.: 40 C

DAD: 254 nm / 4 (360 nm / 100)

Beispiel 1

48

min 0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

20

40

60

80

min 0 2 4 6 8

mAU

0

10

20

30

40

150 mm, 5 μm 100 mm, 3.5 μm

Beispiel 2

49


5 μm Partikel

Bodenzahl N

3.5 μm Partikel

Bodenzahl N

1.8 μm Partikel

150 13050 18650 36250

100 8700 12400 24150

50 4350 6200 12100

Die Laufzeit soll weiter verkürzt werden.

Beispiel 2

50




3.0 min 100 % B (6 min)

3.4 min 100 % B (6.7 min)

Fluss: 0.3 mL/min

Stopzeit: 3.4 min (6.7 min)

Postzeit: 1.7 min

Inj.vol.: 3 μL

Säulentemp.: 40 C

DAD: 254 nm / 4 (360 nm / 100)

Beispiel 2

51

min 0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

20

40

60

80

min 0 2 4 6 8

mAU

0

10

20

30

40

150 mm

5 μm

100 mm

3.5 μm

min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140 50 mm

1.8 μm

52

Säulenlänge und Partikelgröße Optimierung der Analyse bezüglich Laufzeit


Applikation

.~ konstFt

Lb

G

c

p

c

d

LN ~

Kürzen der Säulenlänge

unter Beibehalt der

Bodenzahl

Verkleinern der

Partikel

53

Säulenlänge und Partikelgröße

Optimierung der Analyse bezüglich Auflösung

Applikation

Mehr Auflösung (bei gleicher Laufzeit) p

cS

d

LNR ~~

.~ konstFt

Lb

G

c

Verlängern der Säule

54

Werkzeuge Tabelle


5 μm Partikel

Bodenzahl N

3.5 μm Partikel

Bodenzahl N

1.8 μm Partikel

150 13050 18650 36250

100 8700 12400 24150

50 4350 6200 12100

55

Säulenlänge und Partikelgröße

Optimierung der Analyse bezüglich Auflösung

Applikation

Mehr Auflösung (bei gleicher Laufzeit) p

cS

d

LNR ~~

Verkleinern der Partikel

56

Werkzeuge Tabelle


5 μm Partikel

Bodenzahl N

3.5 μm Partikel

Bodenzahl N

1.8 μm Partikel

150 13050 18650 36250

100 8700 12400 24150

50 4350 6200 12100

Beispiel 3

57

min 0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

20

40

60

80

min 0 2 4 6 8

mAU

0

10

20

30

40

150 mm, 5 μm 100 mm, 3.5 μm

Beispiel 3

58




6.0 min 100 % B

6.7 min 100 % B

Fluss: 0.3 mL/min

Stopzeit: 6.7 min

Postzeit: 4 min

Inj.vol.: 3 μL

Säulentemp.: 40 C

DAD: 254 nm / 4 (360 nm / 100)

Beispiel 2

59

min 0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

20

40

60

80

min 0 2 4 6 8

mAU

0

10

20

30

40

150 mm, 5 μm 100 mm, 3.5 μm

min 0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

20

40

60

80

100 100 mm, 1.8 μm

Beispiel 3

60


5 μm Partikel

Bodenzahl N

3.5 μm Partikel

Bodenzahl N

1.8 μm Partikel

150 13050 18650 36250

100 8700 12400 24150

50 4350 6200 12100

Ausgehend von einer 150 mm Säule mit 5 µm Partikeln soll

sowohl die Laufzeit verkürzt als auch die Auflösung verbessert

werden.

Beispiel 4

61


5 μm Partikel

Bodenzahl N

3.5 μm Partikel

Bodenzahl N

1.8 μm Partikel

150 13050 18650 36250

100 8700 12400 24150

50 4350 6200 12100

Eine 150 mm Säule mit 3.5 µm Partikeln soll durch eine Säule

mit 1.8 µm Partikel ersetzt werden, d.h. die Säulenlänge kann

halbiert werden. Eine 75 mm Säule ist aber nicht verfügbar.

Soll eine 50 oder eine 100 mm lange Säule verwendet

werden?

Method Translator

62

Agilent 1290 Infinity LC DVD

Pub.# 5990-4930EN

../../My Documents/01 Resourcen/04 Tools/AgilentMethodTranslator.exe

63

Zusammenfassung

Der Methodentransfer funktioniert immer dann gut, wenn:

• Die stationäre Phase mit identischer Selektivität in

verschiedenen Partikelgößen verfügbar ist.

• Die Systemvolumina in passendem Verhältnis zum

Säulendurchmesser (Flussraten) stehen.

• Die Gradientenspanne nicht verändert wird.

• Der Säulendurchmesser nicht verändert wird.

64

Fragen?

65

Erhöhen der Flussrate

Verkürzen der Analysenzeit

67

Anforderungen an die Anwendung


Mehr

Empfindlichkeit Applikation

Mehr Auflösung (bei gleicher Laufzeit)

Mehr Auflösung

bei kürzerer Laufzeit

Rückblick Teil 1 Optimierung der Analyse bezüglich Laufzeit

68


5 μm Partikel

Bodenzahl N

3.5 μm Partikel

Bodenzahl N

1.8 μm Partikel

150 13050 18650 36250

100 8700 12400 24150

50 4350 6200 12100

Reduktion der Säulenlänge Reduktion der Partikelgröße

Laufzeit = Reduziert um Längenfaktor

Gradientenzeiten = Reduziert um Längenfaktor

Rückblick Teil 1

69

min 0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

20

40

60

80

min 0 2 4 6 8

mAU

0

10

20

30

40

150 mm

5 μm

100 mm

3.5 μm

min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140 50 mm

1.8 μm

70

Rückblick Teil 1 Optimierung der Analyse bezüglich Laufzeit


Applikation

.~ konstFt

Lb

G

c

p

c

d

LN ~

Kürzen der Säulenlänge

unter Beibehalt der

Bodenzahl

Verkleinern der

Partikel

71

Van Deemter Kurven für verschiedene

Partikelgrößen

0.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

0.0025

0.0030

0.0035

0.0040

0.0045

0.0 0.5 1.0 1.5

Reduzie

rte T

rennstu

fenhöhe

Fluss

5.0 m

3.5 m

1.8 m

1. Kleine Partikel ergeben niedrigere Trenn-

stufenhöhen und damit höhere Trenneffizienz

2. Für kleine Partikel leidet die Trenneffizienz

weniger wenn man die Flussrate erhöht

72

Verkürzung der Analysenzeit Erhöhung der Flussrate

Im „Teil1“ wurde zum Ausgleich der

Verkürzung der Gradientenzeit die

Säulenlänge reduziert. .konst

Ft

Lb

G

c

Ausgleich kann aber auch durch die

Erhöhung der Flussrate erzielt

werden. .konst

Ft

Lb

G

c

Beispiel 1

73

min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140


Beispiel 1

74




3.0 min 100 % B

3.4 min 100 % B

Fluss: 0.3 mL/min

Stopzeit: 3.4 min

Postzeit: 3 min

Inj.vol.: 3 μL

Säulentemp.: 40 C

DAD: 254 nm / 4 (360 nm / 100)

Peakwidth: > 0.003 min (80 Hz)

Beispiel 1

75




1.5 min 100 % B (3 min)

1.7 min 100 % B (3.4 min)

Fluss: 0.6 mL/min


Postzeit: 2 min

Inj.vol.: 3 μL

Säulentemp.: 40 C

DAD: 254 nm / 4 (360 nm / 100)


Druck: ca. 440 bar

76

Beispiel 1

min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

min 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

0.3 mL/min 0.6 mL/min

Beispiel 2

77




0.75 min 100 % B (1.5 min)

0.9 min 100 % B (1.7 min)

Fluss: 1.2 mL/min


Postzeit: 1.0 min

Inj.vol.: 3 μL

Säulentemp.: 40 C

DAD: 254 nm / 4 (360 nm / 100)


Druck: ca. 770 bar

78

Beispiel 2

min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

min 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140


min 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

mAU

0

20

40

60

80

100

120 1.2 mL/min

Beispiel 3

79




0.38 min 100 % B

0.45 min 100 % B

Fluss: 2.4 mL/min

Stopzeit: 0.45 min

Postzeit: 0.5 min

Inj.vol.: 3 μL

Säulentemp.: 40 C

DAD: 254 nm / 4 (360 nm / 100)


Druck: > 1200 bar

80

Erhöhung der Temperatur Veringerung Viskosität, Rückdruck

22

41000

pc

c

dd

LFp

~pT

1~ln

η: Viskosität der mobilen Phase

Rückdruck hängt u.a. ab von

der Viskosität der mobilen

Phase.

Viskosität der mobilen Phase

hängt ab von der Temperatur.

81

Thema: Einfluss der Temperatur auf die

Chromatographie

Die Temperatur hat Einfluss auf:

• Viskosität der mobilen Phase (Rückdruck, Analysenzeit)

• Massentransfer (Peakbreite, Auflösung)

• Selektivität

• Stabilität der Analyten

82

Temperatur und Rückdruck

High Temperature LC-MS/MS (HTLC-MS/MS) for High Throughput Bioanalysis

Daniel Tang, PhD, PDM, Michigan Laboratories, PGRD, Pfizer Pharmaceuticals

Flussrate 0.2 mL/min, ZORBAX SB-C18 2.1 x 50 mm, 1.8 µm

83

Analysenzeit

Säule: SB-C18

4.6 x 30 mm, 1.8 µm

Mobile Phase: Wasser/Methanol 40:60

Flussrate: 1 mL/min

Temperatur: siehe Abb.

Probe: 1. Triamcinolon

2. Hydrocortison

84

Bodenzahl (Trennleistung)



• Kurve wird flacher Unempfindlicher gegen Flussratenerhöhung

• Minimale Bodenhöhe bei 80 °C

85

Selektivität

Säule: ZORBAX SB-C18 4.6 x 50 mm, 1.8 µm

Eluent: A: Wasser + 0.1% Ameisensäure B: Acetonitril + 0.1% Ameisensäure (85:15),

Flussrate: 1 mL/min

86

Stabilität der Analyten

Fluss: 0.25 mL/min Fluss: 0.4 mL/min



Unter hohem Druck und bei kurzer Verweilzeit auf der

Säule sind viele Analyten stabil.

Beispiel 3

87




0.38 min 100 % B (0.75 min)

0.45 min 100 % B (0.9 min)

Fluss: 2.4 mL/min


Postzeit: 0.5 min

Inj.vol.: 3 μL

Säulentemp.: 60 C

DAD: 254 nm / 4 (360 nm / 100)


Druck: ca. 1130 bar

88

Beispiel 3

min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

min 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140


min 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

mAU

0

20

40

60

80

100

120 1.2 mL/min

min 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4

mAU

0

20

40

60

80

100 2.4 mL/min

Page 89

Reduzierter

Diffusionspfad

Gross, total

poröser Partikel Klein, total

poröser Partikel

300 Poroshell 5 µm

fester Kern, poröse Schicht

0.25 µm 2.5 µm

Die Diffusionsgeschw. grosser

Biomoleküle ist Faktor 10 kleiner

verglichen zu kleinen Molekülen

5 µm 1.8 µm

Reduzierter

Diffusionspfad

Poroshell 120 2.7um

fester Kern, poröse Schicht

0.5 µm

Partikeltyp – Bodenzahl

Reduzierter

Diffusionspfad

Poroshell 120 Säulen für HPLC und UHPLC:

• 80-90% der Trenneffizienz von “sub 2um”

• bei ~40-50% geringerem Rückdruck

• Partikelgrösse: 2.7um

• Fritte: 2um Porengrösse für minimiertes

Verstopfungspotential

• Druckgrenze: 600 bar

• Der superficial Partikel hat einen festen

Kern (1.7um) und eine poröse

Aussenschicht von nur 0.5 um

February 10, 2012

Confidentiality Label

90

Beschreibung: Poroshell 120

91

Thema: Datenrate Detektor

min 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4

mAU

0

20

40

60

80

100

Zur zuverlässigen Bestimmung

der Peakfläche braucht man

mindestens 10 Datenpunkte über

den Peak!

Peakbreite 0.2 s

10 Datenpunkte in 0.2 s

= 50 Datenpunkte in 1 s

= 50 Hz Datenrate

Beispiel 4

93




0.38 min 100 % B

0.45 min 100 % B

Fluss: 2.4 mL/min

Stopzeit: 0.45 min

Postzeit: 0.75 min

Inj.vol.: 3 μL

Säulentemp.: 60 C

DAD: 254 nm / 4 (360 nm / 100)


94

Beispiel 4

min 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4

mAU

0

20

40

60

80

100 80 Hz

10 Hz

min 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4

mAU

0

10

20

30

40

50

60

95

Zusammenfassung

Beim Verkürzen der Analysenzeit durch Erhöhung der

Flussrate ist folgendes zu beachten:

• Nur bei stationären Phasen mit sub-2-micron Partikel

ist die van Deemter Kurve so flach ansteigend, dass

man nur wenig an Bodenzahl verliert.

• Die van Deemter Kurve ist jedoch nicht komplett

horizontal, d.h. auch bei den sub-2-micron Partikel

verliert man an Bodenzahl.

• Die Temperatur kann als Parameter zur Reduzierung

des Rückdrucks verwendet werden, allerdings hat sie

vielfältigen Einfluss auf die Chromatographie.

96

UV Empfindlichkeit

97

Übersicht

Einleitung • Was bedeutet Empfindlichkeit?

• Welche Parameter haben Einfluss auf die Empfindlichkeit?

Noise (System) • Qualität der mobilen Phasen und Modifier

Noise (Detektor) • Datenrate

• Optischer Spalt

Signal (System) • Säule (Durchmesser, Partikelgröße, Flussrate)

Signal (Detektor) • Datenrate

Zusammenfassung

98

Empfindlichkeit in der UV Detektion

Für das Limit of Detection (LOD), d.h. die Substanzmenge bei der

ein Peak noch vom Rauschen der Basislinie unterschieden

werden kann, gilt üblicherweise:

D.h. ein Peak kann dann noch identifiziert werden, wenn er

doppelt so hoch ist wie das Rauschen in der Basislinie.

Eine Analyse ist umso empfindlicher je höher das Signal und

je niedriger das Rauschen ist.

hSignal = 2 x hNoise

99

„How to enhance S/N“

Aus:

John W. Dolan, LC/GC Europe, March 2010,

Volume 23 Number 3, S. 136 - 140

Increasing the signal:

• Better wavelength

• Better detector

• Modify the analyte

• Inject more sample

• Reduce peak width

Smaller k-value

Smaller column

Higher plate number

Decreasing the noise:

• Increase detector time constant

• Increase signal bunching

• Better temperature control

• Better reagent purity

• Better mixing

• Reduce pump pulsations

100


Detektorparameter

Parameter restliches System



• Better detector




Smaller k-value

Smaller column

Higher plate number






• Better mixing


101




• Better detector




Smaller k-value

Smaller column

Higher plate number






• Better mixing


UHPLC spezifisch

Allgemein

102

Empfindlichkeit in der UV Detektion

System Detektor System Detektor

Noise Signal

Signal/Noise

103

Basislinienrauschen – System


Noise Signal

Signal/Noise

104

Basislinienrauschen – System

Performance der Pumpe

• Pressure Ripple

• Mischung der mobilen Phasen

Mobile Phase

• Absorption der mobilen Phasen und Modifier (TFA)

• Qualität der mobilen Phasen und Modifier

Instrument

• Sauberkeit

• Maintenance

105

Basislinienrauschen – System Mobile Phase – Qualität mobile Phasen und Modifier

Acetonitril 1

Impurity

Acetonitril 2

106

Basislinienrauschen – Detektor


Noise Signal

Signal/Noise

107

Basislinienrauschen – Detektor

Design der optischen Einheit, DAD/VWD

Typ und Geometrie der Flusszelle

Datenrate

Optischer Spalt

108

Basislinienrauschen – Detektor Datenrate

min 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4

mAU

0

20

40

60

80

100




den Peak!

Peakbreite 0.2 s



= 50 Hz Datenrate

109

Basislinienrauschen – Detektor Optische Einheit – Datenrate

min 0 0.5 1 1.5

mAU

0

2

4

6

8

min 0 0.5 1 1.5

mAU

0

2

4

6

8

Noise(PtoP, 0.5 – 1.5 min) = 1.48x10-2 Noise(PtoP, 0.5 – 1.5 min) = 5.43x10-2

Filegröße(DAD1A.ch) = 9 KB Filegröße(DAD1A.ch) = 45 KB

Datenrate = 10 Hz Datenrate = 160 Hz

110

Basislinienrauschen – Detektor Optische Einheit – Datenrate

Wasser/Acetontril 65:35, Laufzeit 2 min, Noise (Peak to Peak) zwischen 0.5 und 1.5 min

Slit 4 nm, Zelle 10 mm Pfadlänge

111

Basislinienrauschen – Detektor Optische Einheit – Programmierbarer Spalt

nm 230 240 250 260 270 280

Absorbance

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

(mAU)

1 nm

2 nm

4 nm

8 nm

Noise

Programmierbarer Spalt zur Optimierung von

Empfindlichkeit und spektraler Auflösung

112

Basislinienrauschen – Detektor Optische Einheit – Programmierbarer Spalt

Wasser/Acetontril 65:35, Laufzeit 2 min, Noise (Peak to Peak) zwischen 0.5 und 1.5 min

Datenrate 40 Hz, Zelle 10 mm Pfadlänge

113

Signal – System


Noise Signal

Signal/Noise

114

Signalhöhe – System

Säule

• Durchmesser

• Partikelgröße

• Flussrate

Systemvolumina

• Totvolumen

• Dispersionsvolumen

115

Signalhöhe

dcI

IA

0

1log

Lambert-Beersches Gesetz

A: Absorption

α: Extinktionskoeffizient

c: Konzentration

d: Pfadlänge

dcA maxmax

Amax

cmax

Signalhöhe – System Säule – Säulendurchmesser

117

Kleinere Säulendurchmesser erhöhen die Empfindlichkeit?

Idee:

Die gleiche Substanzmenge auf einer Säule mit kleinerem

Durchmesser erhöht die Empfindlichkeit.

Hd

VcA

C

ii

2max ~ Gilt nur bei ciVi = konst.


118

Wichtig wenn nur eine limitierte Probenmenge zur Verfügung steht.

• DMPK von Mäusen

• Proteomics

Weniger wichtig wenn genügend Probe zur Verfügung steht.

• Qualitätskontrolle

Hd

VcA

C

ii

2max ~


119

Gilt nur wenn gleiche Substanzmenge auf Säule mit kleinerem

Innendurchmesse aufgegeben werden kann!

4.6 mm Säule Injektionsvol. 5 μL DMSO OK!

2.1 mm Säule Injektionsvol. 5 μL DMSO OK???

Signalhöhe – System Säule – Partikelgröße

120

Kleinere Partikel erhöhen die Empfindlichkeit!

Hd

VcA

C

ii

2max ~Säulen mit kleineren Partikeln

verringern die Bodenhöhe und führen

zu schmaleren und damit höheren

Peaks .

40 mAU 150 mm, 5 µm

Tolu

ene

120 mAU 50 mm, 1.8 µm

Tolu

ene

Signalhöhe – System Säule – Flussrate

121

Amax

cmax

Theorie:

Flussrate beeinflusst nur die

Peakbreite und damit die

Peakfläche aber nicht die

Peakhöhe!

Signalhöhe – System Säule – Flussrate

122

Hd

VcA

C

ii

2max ~ Trennstufenhöhe steigt

mit steigender Flussrate!

123

Signal – Detektor


Noise Signal

Signal/Noise

124

Signalhöhe – Detektor

Datenrate

Pfadlänge

125

Signalhöhe – Detektor Datenrate

min 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4

mAU

0

20

40

60

80

100




den Peak!

Peakbreite 0.2 s



= 50 Hz Datenrate

126


min 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4

mAU

0

20

40

60

80

100 Datenrate 80 Hz

Datenrate 10 Hz min 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4

mAU

0

10

20

30

40

50

60 52 mAU

115 mAU

127


Wasser/Acetontril 20 % B nach 100 % B in 0.5 min, 100 % B für 1 min

Flussrate 1.8 mL/min, Säule 2.1 x 50 mm 1.8 µm

128

Datenrate als Optimierungsparameter

in der UHPLC

129

Datenrate als Optimierungsparameter

in der UHPLC

Optimale Datenrate

für höchste

Empfindlichkeit 40 Hz

Zusammenfassung

• Empfindlichkeit hängt ab von der Signalhöhe und vom

Rauschen (Noise).

• Sowohl der Detektor als auch die weiteren Module des (U)HPLC

System haben Einfluss sowohl auf die Signalhöhe als auch auf

das Rauschen.

• Säulen mit kleinen Partikeln ergeben höhere Signale und

damit mehr Empfindlichkeit.

• Höhere Flussraten reduzieren die Signalhöhe.

• Die Datenrate des Detektors hat sowohl Einfluss auf das

Rauschen als auch auf die Signalhöhe. Sie ist damit ein

Methodenoptimierungsparameter in der (U)HPLC Analyse.

131

Fragen?