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Enzymatische ReaktionenU. Albrecht BC1

1. Chemische Kinetik

2. Enzymatische Kinetik

3. Inhibition

4. pH Effekte

5. Bisubstrat Reaktionen

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Kinetik ist das Studium der Raten bei welchen Chemische Reaktionen ablaufen.

U. Albrecht BC1

1. Chemische Kinetik

A. Elementarreaktionen

A -> P

Kann über Zwischenprodukte ablaufen

A -> I1 -> I2 -> P

A = Ausgansmoleküle, I = Intermediate, P= Produkte

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U. Albrecht BC1

Geschwindigkeitsgleichungen

Konstante Temperatur -> Geschwindigkeit einer Reaktion abhängigvon Konzentration

aA + bB + …….+ zZ -> P

Geschwindigkeitsgleichung:

v = k [A]a [B]b ……. [Z]z

k = GeschwindigkeitskonstanteOrdnung der Reaktion = a + b + ……+ z

A -> P Reaktion erster Ordnung2A -> P Reaktionen zweiter Ordnung

A+B -> P

Reaktionen dritter Ordnung selten, da Wahrscheinlichkeit, dass 3Moleküle zusammentreffen gering ist.

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U. Albrecht BC1B. Reaktionsgeschwindigkeiten

1. Ordnung A -> P

[A] und [P] als Funktion der Zeit:

d [A] d [P]v = dt = dt = k [A]

2. Ordnung 2A -> P

d [A] d [P]v = dt = dt = k [A]2

A + B -> P

d [A] d [B]v = dt = dt = k [A] [B]

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U. Albrecht BC1

Geschwindigkeitsgleichungen erster Ordnung

d [A]v = dt = k [A]

d [A][A] = - k dt

[A]0S[A]d ln [A] = - k 0S t

dt

ln [A] = ln [A]0 - k t

[A] = [A]0 e - k t

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Plot of ln[A] versus time for a first-order reaction.

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U. Albrecht BC1

ln [A] = ln [A]0 - k t

Halbwertszeit:

t 1/2

[A]0/2ln [A]0 = -k t 1/2

t 1/2 = ln2 / k

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Comparison of the progress curves for first- and second-order reactions that have the same value of t1/2.

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U. Albrecht BC1

d [A][A]0S[A]

[A]2 = k 0S tdt

1 1[A] = [A]0 + k t

-> lineare graph. Darstellung

Geschwindigkeitsgleichung für Reaktanten zweiter Ordnung

t 1/2 = 1 / k [A]0-> abh. von Ausgangskonz.

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Potential energy of the colinear H + H2 system as a function of its internuclear distances, RAB and RBC. (a) A perspective drawing.

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U. Albrecht BC1C. Theorie des Übergangszustandes

a = Reaktanden, b = Reaktanden dissoziert, c = Sattelpunkt, d = ProdukteRote linie = Reaktionsverlauf

Reaktion: A + B-C -> A-B + C

z.B. H + H2 -> H2 + H

Übergangszustand

Bei verschiedenartigen MolekülenTäler a und d auf verschiedenen Ebenen.

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Transition state diagrams. (a) For the H + H2 reaction. This is a section taken along the a—c—d line of previous figure.

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U. Albrecht BC1

Übergangszustandsdiagramm

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U. Albrecht BC1

Thermodynamik des Übergangszustandes

A + B <----> X* ----> P + QK* k‘

X* = aktivierter Komplex

d [P]dt = k [A] [B] = k‘ [X*]

k = Geschwindigkeitskonst. der Gesamtreaktionk ‘= Geschwindigkeitskonst. Zerfall von X*

X* im schnellen Gleichgewicht mit A und B[X*]

K* = [A][B]

K* = Gleichgewichtskonstante -> Thermodynamik anwendbar

-RT ln K* = ∆G* ∆G*= Differenz der freien Enthalpieaktivierter Komplex zu Reaktanten

d [P]dt = k‘ e -∆G*/RT [A] [B]

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Transition state diagrams. (b) For a spontaneous reaction, that is, one in which the free energy decreases.

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U. Albrecht BC1

A + B <----> X* ----> P + QK* k‘

Aktivierungsschwelle

k‘ = χ ν ν = Schwingfrequenz der Bindungχ = Transmissionskoeffizient ->

Wahrscheinlichkeit mit der KomplexX* zerfällt.bei H+H2 ist er 0.5, sonst meist 1

Plank‘sches Gesetz ν = ε / h ε = Durchsnittl. Energie d. Schwingung diezum Zerfall von X* führt

h = Planck Konstante

ε = kB T kB = Boltzmann-Konstante -> kB T verfüg-bare thermische Energie

χ kB Tk‘ = h

d [P]dt = k‘ e -∆G*/RT [A] [B]

d [P]dt = k [A] [B]

χ kB Tk = k‘ e -∆G*/RT = h e -∆G*/RT

Meistens = 1

k

Aktivierungsenthalpie

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Transition state diagram for the two-step overall reaction A → I → P.

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U. Albrecht BC1Mehrstufige Reaktionen haben einen GeschwindigkeitsbestimmendenSchritt

Bildung von P bestimmt durch die langsamste Reaktion

A ---> I ----> Pk1 k2

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The effect of a catalyst on the transition state diagram of a reaction.

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U. Albrecht BC1Katalyse führt zur Absenkung der Aktivierungsenergie

Reaktionsgeschwindigkeit wird um e ∆∆G*cat/RT erhöht

Beschleunigung um Faktor 10 ∆∆G*cat= 5.7 kJ/molIst weniger als Hälfte von H2Bindung

1Mio fach ∆∆G*cat= 34 kJ/molEntspricht nur einem Teil derEnergie der meisten kovalenten Bindungen

Katalysator beschleunigt hin-und Rückreaktion gleich stark-> Gleichgewichtskonstante istunverändert.

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U. Albrecht BC1

2. Enzymkinetik

Enzyme = hochspezifische Katalysatorennicht passive Katalysatoren sondern komplexe molekulare Maschinen

Kinetische Messungen -> Aufklären von Katalysemechanismen von Enzymen

A. Michaelis-Menten Gleichung

Fructofuranosidase: Saccharose + Wasser -> Glucose + Fructose

wenn genügend hohe Konz. Saccharose -> Geschwindigkeit unabhängig von Sacc. Konz.

E + S <---> ES ----> P + Ek2k1

k-1

ES = Enzym-Substrat Komplex

Wenn S genug hoch -> 2. Reaktionschritt geschwindigkeitsbestimmend

d [P]v = dt = k2 [ES]

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E + S <---> ES ----> P + Ek2k1

k-1

d [ES]dt = k1 [E][S] - k-1 [ES] - k2 [ES]

Diese Gleichung lässt sich nicht ohne Vereinfachung integrieren

1. Annahme: Es gibt ein präexistierendes Gleichgewicht zwischen Enzymund Substrat.

-> k-1 >> k2

k-1 [E][S]Ks = k1 = [ES]

Diese Annahme ist nicht immer korrekt. ES wird als Michelis-Menten Komplexbezeichent.

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k1 [E][S] = k-1 [ES] + k2 [ES] k1 ([E]T - [ES]) [S] = (k-1 + k2 )[ES] [ES] (k-1 + k2 + k1 [S])= k1 [E]T[S] Division durch k1 aufgelöst nach [ES]

[E]T[S][ES] = KM + [S]

KM= (k-1 + k2 )/ k1 Michaelis-MentenKonstante

Progress curves for the components of a simple Michaelis–Menten reaction.

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478

U. Albrecht BC1

2. Annahme: Es existiert ein Fliessgleichgewicht

d [ES]dt = 0

Dies ist gültig im grauen BereichUnd wenn [ S0 ] >> [ E ]T

[ E ]T = [ E ] + [ ES ]

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U. Albrecht BC1

Anfangsgeschwindigkeit

d [P] k2 [E]T[S]vo = dt = k2 [ES] = KM + [S]

t=0

Bei hoher Substratkonzentration -> Enzym vollständig gesättigt -> Maximalgeschwindigkeit vmax, Enzym liegt vollständig in ES komplex vor.

vmax = k2 [E]T

vmax [S]vo = KM + [S]

Michaelis-Menten Gleichung(Grundgliechung der Enzymkinetik)Nota bene: 2 Annahmen !!!!

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Plot of the initial velocity vo of a simple Michaelis–Menten reaction versus the substrate concentration [S].

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U. Albrecht BC1Die Bedeutung der Michaelis-Konstanten KM

Bei einer Substratkonzentration von [S] = KM ist die Reaktionsgeschwindigkeit die Hälfte des Maximalwertes. Ein Enzym mit kleinem KM erreicht die Maximale katakytische Wirksamkeit bei niedriger Substratkonzentrtion.

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Values of KM for Some Enzymes and Substrates.

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U. Albrecht BC1

KM hängt von der Art des Enzyms und des Substrates ab. Er ist ausserdem Temperatur und pH Abhängig.

KM =k-1

k1 Ks +k2

k1+ =

k2

k1KS = Gleichgew. Dissozationskonst.

-> steigender KS -> fallendeAffinität des Enzyms zu seinem Substrat, wenn k2 < k-1

klein

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U. Albrecht BC1

B. Analyse kinetischer Daten

Aus vo gegen Substrat Plot vmax nur sehr ungenau zu bestimmen. Auch bei Substratkonzentration von 10 KM nur etwa 91% des wahren vmax Wertes ablesbar.-> Lineweaver-Burk Plot = reziproke Formel

A double reciprocal (Lineweaver–Burk) plot.

1 KM 1 1 vo = vmax [S] + vmax

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U. Albrecht BC1kkat / KM ist ein Mass für die katalytische Wirksamkeit

Katalytische Konstante kkat = Wechselzahl (turnover number)

kkat =vmax

[E]TIn Michaelis-Menten Modell istkkat = k2

Wenn [S] << KM wird wenig ES gebildet --> [E] etwa = [E]T ist. Es wird deshalb

d [P] k2 [E]T[S]vo = dt = k2 [ES] = KM + [S]

t=0

k2 kkat

vo KM [E]T [S] KM [E][S]

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Cross section through the active site of human superoxide dismutase (SOD).

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U. Albrecht BC1

SOD perfektes Enzym -> jede Substratkontakt resultiert in Reaktion

Elektrostatisches Feld lenktSauerstoffradikale in dieBindungsstelle für die Reaktion

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U. Albrecht BC1

3. InhibitionInhibitoren sind der Struktur des Substrates ähnlich und interferieren mit dem EnzymEnzyminhibitoren -> Chemotherapeutika siehe z.B. Methotrexat.

Essentieller Cofaktor für die Synthesevon Thymidylsäure -> nötig für DNASynthese

Methotrexat -> blockieren der DNA Synthese -> häufig teilende Zellen davonbetroffen -> Krebszellen

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U. Albrecht BC1

A. Kompetitive Hemmung

E + S ES ----> P + Ek2k1

k-1

+I

EI + S keine Reaktion

KI

KI =[E][I][EI]

Ein kompetitiver Inhibitor erniedrigt die Konzentration des freien Enzyms

Berücksichtigen von Inhibitor ergibt für die Michaelis Menten Gleuchung:

vmax [S]vo = α KM + [S] α =

[I] KI

1 +

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vmax [S]vo = α KM + [S]

Für [S] gegen unendlich bleibt vmax gleich, d.h. der Inhibitor beeinflusst nicht dieWechselzahl.

α KM

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U. Albrecht BC1

vmax unabhängig vonkompetitivem Inhibitor

1 αKM 1 1 vo = vmax [S] + vmax

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U. Albrecht BC1

B. Unkompetitive Hemmung

E + S ES ----> P + Ek2k1

k-1+I

ESI keine Reaktion

K‘I

Bei unkompetitiver Inhibition bindet der Inhibitor and den Enzym-Substrat Komplexaber nicht an das freie Enzym

[ES] [I][ESI]K‘I =

Bindung des nicht kompetitiven Inhibitors (braucht Substrat nicht ähnlich zu sein) ->Konformationsänderung im aktiven Zentrum des Enzyms -> Aktivität reduziert

nicht kompetitiven Inhibitors an freies Enzym -> kein Einfluss auf Substrataffinität ->

vmax [S]vo = KM + α‘ [S]

Michaelis-Menten Gleichung für unkompetitiveHemmung

α‘ = [I] K‘I

1 +

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Lineweaver–Burk plot of a simple Michaelis–Menten enzyme in the presence of uncompetitive inhibitor.

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1 KM 1 α‘ vo = vmax [S] + vmax

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C. Gemischte Hemmung

E + S ES ----> P + Ek2k1

k-1+I

EI

KI

+I

ESI keine Reaktion

K‘I

Gemischte Inhibitoren binden am Enzym an Stellen die sowohl an der Substratbindung als auch an der Katalyse beteiligt sind.

1 αKM 1 α‘ vo = vmax [S] + vmax

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Lineweaver–Burk plot of a simple Michaelis-Menten enzyme in the presence of a mixed inhibitor.

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1 αKM 1 α‘ vo = vmax [S] + vmax

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nc.4. Einfluss des pH-Wertes

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EH + S ESH P + EH

E - ES -

EH2+ ESH2

+

H+

H+

H+

H+

KE1

KE2

KES1

KES2

k1 k2

k-1

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Effect of pH on the initial rate of the reaction catalyzed by the enzyme fumarase.

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The pH dependence of (a) log V ′max and(b) log (V ′max/K ′M).

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Some bisubstrate reactions. (a) The peptide hydrolysis reaction catalyzed bytrypsin. (b) The alcohol dehydrogenase reaction.

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5. Bisubstrat-ReaktionenIn vorherigen Kapiteln Enzyme mit einem Substrat. Transferase- und Redoxreationenbrauchen aber 2 Substrate:

A + B P + QE

P-X + B P + B-XE

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U. Albrecht BC1

Bi-Bi-Reaktionstypen:

2 Substrate(A, B)

2 Produkte(P,Q)

1. Sequentielle oder Kettenreaktion (Einzel-Verdrängungsreaktionen)

Reaktionen, bei denen sich alle Substrate mit dem Enzym verbinden müssen, bevor eine Reaktion ablaufen kann und Produkte freigesetzt werden können.(z. B. NAD+ und NADP+ bedürftige Dehydrogenasen mit Coenzym).

2. Ping-Pong-Reaktionen (Doppel-Verdrängugnsreaktionen)

Eines oder mehrere Produkte werden schon freigesetzt, bevor alle Substrategebunden haben.Die beiden Substrate sind nie gleichzeitig auf der Enzymoberfläche.z. B. Chymotrypsin, Transaminasen und einige Flavoenzyme.

A B P Q

A BP Q

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Double-reciprocal plots for an enzymatic reaction with a Ping Pong Bi Bi mechanism.

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U. Albrecht BC1Unterscheidung von Bisubstratmechanismen

Parallelenschar für verschiedene Substratkonzentrationen deutetAuf Ping-Pong Mechanismus hin.

A and B like uncompetitiveinhibitors

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Double-reciprocal plots of an enzymatic reaction with a Sequential Bi Bi mechanism. (a) Plots of 1/vo versus 1/[A] or 1/[B] at various constant concentrations of B or A.

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U. Albrecht BC1

A and B like competitive inhibitors

Sequentieller Mechanismus