Uber Objekttreue von Phasenkontrastbildern handelsiiblicher Phasenkon frastmikroskope

Von Uwe S c h m i d t

hfit 14 Abbildungen

Inhaltsii bersich t Im folgenden werden die Abbildungseigcnschaften der handelsiiblichen

Phasenkontrasteinrichtungen experimentell und theoretisch fur Objekte von rechteckigem Querschnitt quantitativ untersucht.

Die Arbeit schlieRt sich den Untersuchungen Wol te rs an, die fur ein Phasenkontrastverfahren mit vereinfachter Beleuchtung und linearem Ze r - ni ke -Streifen zeigten2), wie die Objekttreue der Abbildung mit zunehmender Objektbreite abnimmt. Bei sehr breiten Objekten ist praktisch nur noch deer Rand kontrastiert, wahrend die Intensitat an den ubrigen Stellen des Bildes um die ,,Fernabintensitat“, die Intensitat des leeren Gesichtsfeldes, in flachen Bogen pendelt. Uber den Grad der Abbildungstreue entscheidet in erster Linie der Parameter 0 = __ ( b = Objektbreite, 2 = TVellenlange des

Lichtes, 6 = Breite des Zernike -Streifens, f = Objektivbrennweite). Die Aufgabe der vorliegenden Arbeit sol1 es sein, die bei Wol te r gemachten

vereinfachenden Annahmen so abzuandern, daS sie den Verhaltnissen bei den handelsiiblichen Phasenkontrasteinrichtungen - Aperturblende und Ze r - ni ke -Phasenplattchen ringformig - moglichst genau entsprechen.

Als Objekte schienen zunachst scheibenformige fur die Losung dieser Auf- gabe am geeignetsten zu sein, weil diese sich der Symmetrie des gesamten optischen Systems am besten anpassen. Die theoretischc Behandlung fuhrte jedoch auf einen Integralausdruck fur die Lichtamglitude in der Bildebene des Objektivs, der sich allgemein nicht bequem in geschlossener Form in tegrieren lie13 und der im wesentlichen folgendes Aussehen hat :

b . 6 f - i ,

J1 = 1. Besselfunktion, b =; Objektdurchniesser.

I) Auszug aus der Diplomarbeit gleichen Titers vom 30. 6. 1954. Teilweise vorgetragen auf der Tagung der Nordwestdeutschen Physikalischen Gesehchaft in Goslar am 26. April 1954.

2) H. Wolter, Ann. Physik 7, 33, 147 (1950), man vgl.: E. Menzel, Optik 5, 386 (1949); H. Wolter, Naturwiss. 37, 272-276 (1950); K. Schuster, Jenaer Jahrbuch 1951, S. 22.

- -

U . Schmidt: Uber Objekttreue vow Phasenkontraatbildern 69

Die Variabeln in diesem Ausdruck sind Polarkoordinaten und in ihrer Bedeutung aus der nebenstehenden Skizze (Abb. 1) zu entnehmen. Eine Weiterfuhrung der Rechnung durch Reihenentwicklung lieB kein befriedi- gendes Ziel erreichen, da die bekannten Reihen der Besselfunktionen fur diesen Zweck zu schlecht konvergieren. In Betracht gezogene andere Nahe- rungsverfahren schienen fur eine quantitative Unter- vordereKon- suehung nicht ausreichend zu sein.

Da sich aus diesen Grunden die Verwendung kreisformiger Objekte als unzweckmailjig erwies, wur- den sodann streifenformige Objekte auf ihre Eignung Abb. 1. Koordinatenbezeichnungen bei Berechnung untersucht. Bei ihnen yon Kreisscheibenobjekten. y’, y = Apertur durch

Wellenliinge; x, x’ = Reine Aperturgroflen. fuhrte die Theorie auf Aus- drucke, die sich mit er- traglichem Aufwand auswerten liefien. Doch ist auch hier die Rechnung noch sehr umfangreich. Sie wurde daher nur fur einen kleinen Teil der von W o l t e r betrachteten o-Werte3) durchgefiihrt. EB wurden aus dem Bereich, der in der Praxis am meisten interessiert, drei Werte herausgegriffen: (T = 0,32; (T = 0,45; u = 0,67, was bei dem hier benutaten Objektiv4) Objekt- breiten von 7, 10 und 14 p entspricht.

Fur das Experiment hat die Wahl rechteckiger Streifen noch den Vorteil, dal3 sich diese Objekte praziser als alle anderen Formen herstellen lassen. Wenn auch genau rechteckige Strukturen insbesondere in der biologischen Praxis selten vorkommen, so lailjt doch deren Untersuchung die Abbildungs- eigenschaften des Phasenkontrastverfahrens besonders deutlich hervor- treten.

Fur die Ausfuhrung des Experiments gab es zwei Moglichkeiten: Her- stellung mikroskopischer Objekte und Beobachtung mit dem handels- iiblichen Phasenkontrastmikroskop oder Verwendung eines Modellmikroskops bei entsprechend vergroaerten Objekten. Wegen des geringeren Aufwandes wurde der erste Weg beschritten. Die hierfur erforderlichen Mikroobjekte liel3en sich nicht auf dem gewohnlichen Wege mit Hilfe einer Teilmaschine herstellen, sondern es erwies sich, daB eine besondere Technik notig wurde. Diese sol1 im nachsten Abschnitt beschrieben werden.

densorbrenn- Objekt- hintere Objek- ebene ebene tivbrennebene Bildebene

E xperimen teller Teil 1. Herstellung von Mikrophasenobjekten

Die Herstellung der Objekte geschah folgendermailjen : Gewohnliche Ob- jekttrager wurden nach einem von Wol ter6) angegebenen Reaept mit einer ganz gleichmailjig dicken Zaponlackschicht uberzogen, deren optische Weg-

3) Bedeutung yon u s. S. 68. 4, Angabcn S. 71. 5) 1. c., s. 52.

70 Anmlen der Physdk. 6 . Folge. Band 16. 1955

lBnge sich mit dem von Zernike6) entwickelten Dreistrahlverfahren messen lieB. Gewohnliche Objekttrager, wie sie in der Mikroskopie Verwendung finden, sind im optischen Sinn nicht plan und machen daher eine direkte Messung der optischen WeglBnge der Lackschicht unmoglich. Diese Schwierig- keit wurde durch eine Differenzmessung umgangen, indem dcr Objekttrager einmal mit und einmal ohne Lackschicht vor den Dreifachspalt gesetzt wurde und beide dabei entstehenden Interferenzbilder zur Auswertung herangezogen wurden. Die Genauigkeit dieser MeBweise hangt - abgesehen von der grund- sdtzlichen Leistungsgrenze des Dreistrahlverfahrens - im wesentlichen davon ab, da13 die Stellung des Objekttragers vor dem Dreifachspalt bei allen Mes- sungen dieselbe ist. Es zeigte sich, daB die Reproduzierbarkeit der Objekt- tragerstellung fur den verlangten Zweck vollstandig ausreichte.

Die durch die Zaponlackschicht bewirkte Phasenverschiebung ist in Bogen- einheiten angegeben und liegt bei den Messungen zwischen E = -0,l l und E = -0,85 entsprechend M -1 und M L (Na-D-Linien). Die MeBgenauig- keit betragt etwa low3 L entsprechend 9 bis 0,5%.

Die Objekte wurden direkt unter dem Mikroskop aus der Zaponlackschicht mit einem Rasierklingensplitter herausgeschnitten. Der Schnitt wurde durch

Bewegen des Kreuztisches, auf Zeichenebene senkre cht zur Bewegungsrichtung dem der Objekttrager lag, be-

Scttmeide wirkt. Zur Xrzielung verschie- dener Schnittformen konnte der Rasierklingensplitter in seiner Stellung zum Objekttrager ver-

/ l l I l , l l , , l l andert werden. Die entstehende ~ ” “ ~ “ K r ~ u z t i s c b Schnittkante bildete einen ver-

Abb. 2. Schema des Schneidvorganges hiiltnismal3ig flachen Winkel zur Objekttrageroberflache

(Abb. 2). Man konnte daher vermuten, dal3 die so hergestellten Objekte eine ungeniigende Randscharfe besail3en. Hiergegen ist jedoch zu bedenken, dal3 auch bei den schmalsten Objekten das Verhaltnis von Querschnittshohe zu -breite etwa 1 :30 ist. also selbst bei sehr flach stehender Schneide der Rand noch als geniigend scharf bezeichnet werden kann.

Storend wirkte sich dagegen die Mikrostruktur der Schneidenkante Bus, die manchmal die Rmdform d& Objektes etwas deformierte (Abb. 10).

1 1 60

obj&ttragp& ; :

2. Die Herstellung von Phasenkontrastaufnahmen und ihre Ausmertung Zur Auswertung gelangten Objekte mit den Phasenverschiebungen

E = -0 , l l ; E = -0,27 ; E = -0,69; E = -0,84.

Bei der Herstellung von Phasenkontrastaufnahmen dieser Objekte wurde eine Phasenkontrasteinrichtung von Zeil3-Win kel verwendet. Ihre Daten sind :

6) F. Zernike, J. Opt. SOC. Amer. 40, 326 (1950).

U. Schmidt: ober Objekttreue von Phasenkontrastbildern 71

Apertur des Phako-Objektivs . . . . . . . . . . . . 0,250 Apertur des Zerni ke -Phasenringes (4,” . . . . . . . 0,025 Aper tur des aul3eren Ringdur chmessers . . . . . . . . 0,125 Absorption des Zernike-Phasenringes (Amplitude) . . 0,7.

Der Absorptionswert A des Phako-Ringes wurde experimentell ermittelt : Das von hinten beleuchtete Phako-Objektiv projizierte den Ring in die Ekrokamera. Die Aus- wertunn dreier auf diese Weise hergestkter Aufnahmen zeigt Abb. 3. Aus ihr 15t sich un- mittelbar ablesen: A2 = 0,6. Die Maximaldifferenz der drei Werte Aa betriigt M 8%.

Die Phasenkontrastauf - nahmen wurden mit dern Schnellphotometer I1 von ZeiB-Jens susgewertet. Die Schwarzungen lagen bei allen Negativen zwischen 1, l und 0,3. Es war daher moglich, in allen Fiillen den Intensitatsverlauf eines jeden Bildes aus nur einer Aufnahme zu ermitteln. Die Schwarsungskurven wurden aus der Photo- graphie einer rotierenden Stufenscheibe ermittelt. Dauer der Mikroaufnah-

r I I x I Messong I 0 2. ”

2 1 /9x -

7 2 3 4 5 6

Abb. 3. Messung der Absorption A2 des Phako-Ringes. Awgezogene Kurve: Schwarzungskurve. Die abge- grenzten horizontalen Geraden geben die Abszissen - differenz je zweier zusammengehoriger Mel3punkte an. I = BelichtungsintensitBt; J = Photometerintensitat.

Phasenverschiebung 6 , 3 O

-----l

16,3”

3 9 . 9 O

48,1°

Abb. 4. Phasenobjekte unter dem Phasenkontrastmikroskop (Auswahl). Vergroaerung : 200fach. Gleichbreite Objekte untereinander. Die hier gezeigten Objekte sind in der Liinge urn das 15- his 20fache verkiirzt. Die Strukturen zwischen den Objekten sind

durch das Zusammensetzen der photographischen Positive verursacht,

52 u2 (Vgl. b . 6

7, Im theoretischen Teil entspricht dem 0 = 7 der Ausdruck n . f .7d Abb. 5 und Abb. 7.)

72 Annalen der Physik. 6. Folge. Band 16. 1955

men : 80 bis 90 Sekunden. Filmmaterial : Agfa-L-Agepe. Die Ergebnisse sind in Abb. 10 dargestellt und werden zusammen mit den nun zu behandelnden t heoretischen Kur ven des Intensitatsverlaufs eines Phasenkon tras t bildes dis - kutiert werden.

Theoretischer Teil Die Berechnung des Bildes geht vom Four i e r -1ntegraltheorem aus. In

der hinteren Brennebene des Objektivs erzeugt das Objekt ein F r a u n h o f e r - sches Beugungsspektrum. Mit den Bezeichnungen der Abb. 5 lautet die Fraunhofer-Kirchhoffsche Formel, wenn wir zunachst nur einen Punkt P(a , #I) als Lichtquelle aus der Kondensorringblende herausgreifen :

P12, #/2 sind die Begrenzungen des Objektfeldes. Dabei ist O ( x , y) die komplexe Objektfunktion, die also die komplexe

Amplitude (Phase und reelle Amplitude) des Lichtes nach dem Durchtritt durch die Objektebene an-

vordere Kon- gibt. densorbrenn- Objekt- hintere Objek- Zum analytiuchen Aus-

druck fur den Verlauf der Amplitude in der Bildebene des Objektivs gelangt man folgendermaoen (ahnlich Zernike*)) : Werden von der Objektivlinse alle

Abb. 6 . Koordinatenbezeichnungen bei Berechnung Strahlen erfa13t, die von Streifenobjekten. a , /3, y , [ = Apertur duroh einemdurchparallelesLicht

Wellednge. X, y, z', y' = Reine AperturgroDen beleuchteten Punkt der Objektebene ausgehen, so

erhalt der geometrisch optisch definierte Bildpunkt genau die vorn Ausgangs- punkt ausgestrahlte Eriergie ; denn die optische Weglange ist fur alle Xtrahlen die gleiche, und eine Ausloschung durch Interferenz findet zwischen ihnen im Bildpunkt nicht statt. Ein Objekt wird also nur dann getreu abgebildet, wenn in der hinteren Brennebene des Objektivs alle Spektren zur Ausbildung gelangen konnen und sich in der Bildebene zum Bild iiberlagern. Mathematisch bedeutet d iem, daB die F o u r i e r transformierte xu E (y , 5) der gesuchte analytische Ausdruck ist :

ebene ebene ti3-brennebene Bildobene

+M

Uenn bei Integration iiber das gesamte Spektrum ist B, nach dem F o u r i e r - Theorem im Manstab der ObjektivvergroBerung

Fourier-Zerlegung eineindeutig ist.

gleich O ( x , y). X

Ein anderer mathematischer Ausdruck kommt nicht in Frage, da die

l?. Zernike, Physica 9, 687 (1942).

U. Schmidt: Ober Objekttreue van Phasenkinatrastbildern 7 3

Wird E ( y , c ) durch einen Eingriff Q ( y , C) in der hinteren Brennebene zu Q . E abgeandert, so damit auch B, zu :

+W

Dieser Ausdruck wird von y' unabhangig, wenn man die Objektfeldbegren- xung als unendlich groB annimnit und auBerdem verlangt, daB die Objekt- streifen unendlich lang sind :

B :. - bj2 B = e ie

O ( x , y) = const 0 ( x , y) = B - b/2 < x . + b / 2 , /1 1 + bj2 < 2 b = Objektbreite.

fur x = const fur y = const

0 (2, y) ist also eine eindimensionale Funktion : 0 (x, y) = 0 (x). Entsprechend sirid dann auch E und B, eindimensional. Analytisch lafit sich das folgender- maBen einsehen :

Die Integration uber y in (1) liefert bei Beruoksichtigung der besonderen Form von O( x, y) :

und weiter

hintere Objektivbrennebene r

Abb. 6. Integrationsgrenzen in der C-Richtungs)

9, Snmerkung bei der Korrektur: Alle GroDen y und [ sind in Abb. 6 und Bbb. 7 mit einem * zu versehen.

Ann. Physik. 6. Folge, Bd. 16 51,

74 Annalen der Phy&k. 6. Folge. Band 16. 1955

und nach Substitution a-y = y * ; p-[ = [*: +m

~,(x’, y’) = JJ ~ ( y * ) e 8 n i y l ’ .E(<*) ezn i r r ’ .&(y* ,5* )dy*d5* . -00

Urn dieses Integral auswerten zu konnen, teilen wir die Abszisse in fiinf Ab- schnitte ein, wie sie in Ahb. 6 cingeeeichnet sind. Wir integrieren a. €3. im fiinften Abschriitt an der Stelle y t zuriachst awischen -(:’ und +C‘ und erhalten mit der Substitution z F [* = t und bei Beachtung von

2 c;, lim J E ( [ * ) e2nig’c*Q(y:, i*) dc* = ~ ( y z , ~ ) .

P + m -$b,

Dieser Wert ergibt sich unabhangig von der Lage des Punktes yz in Ab- schnitt 5 . Ebenso liefern die Integrale in Abschnitt 1 bis 4 zwischen den Grenzen -[T,f2,3,4 und +(1+:2,3,4 den Wcrt QC.j:,2,,,,,,4, O ) , wahrend die Integrale

hintere Objektivbrennebene r b C

Abb. 7. Integrationsgrenzon in der y-Richtung. Fur die Integrale in (4) mit der Variable11 nG y = s ist in der Zeichnung Si fur ui zu setzenQ)

zwischen & (r und [:’I sowie & [t’’ und & t-crschwinden. Ebenso liefert dic Integration auI3erhalb der Aperturblende keinen Beitrag.

Das bedeutet, da13 bei der nachfolgenden Integration iiher y* &(y* , (*) =z

Daraus folgt fur (2 a) : Q(y* ,O) ist.

+m ~ ~ ( x ‘ , y’) = J ~ ( y * ) e 2 n i * ’ Y * ~ ( y * , 0 ) dy* = ~ ~ ( x ’ ) . (3 )

-Go

Die Berechnung von B,( 2’) verlauft nun entsprechend :

+m

U . Schmidt: Uber Objekttreue von PhasenkontrastbiEdern 75

Dabei ist iA im Phasenring,

1 im Restgebiet. 0 auI3erhalb der Aperturbegrenzung,

Einsetzen von E(y*) ergibt mit den Substitutionen z by* = u, z G y* = s , 2 2 ‘ - 2 2‘ - - v und - = w, sowie den in Abb. 7 beseichneten Grenzen : b G

+ u’r

,/” B, (e , m) = L 7 % ! e i W 8 d s + ( B - 1)- eivu du n n

- 8’ - U‘

T TT --

I

- 8.

I11

+ (i A - 1)- n

- 6.

11

- u. I? ( 4)

+ 26, sinu . + ( B - 1) (i L4 - 1)- 1’ ~ e e v u d u .

n . - U.

~

- v Zur Ahkiirzung so11 gesetzt werden :

v-I

!l!

sin t i t

1 2n 17 ( U { , v) = -- (S i (Ui (v + 1)) - si (?hi (v - 1))) ; si (.) = - ~ dt,

0

dt 1 ” 1 - COB t T(Ui, v) = - (Ci (Ui (v + 1)) - 6i (Ui (v - 1))); bi (2) = {-,-- 2 n 0” Mit diesen Abkurzungen liefern die einzelnen Integrale in (4) :

1 = 1 im limG --f 00,

I1 = f ( B - 1) (Z (u”, 8 ) - z (-u’, v))

IV = 4 ( B - 1) ( i A - 1) (Z ( -U3, v) - z (-?La, v))

VI =t(B-l)(iA-l)(~(u,,v)-,z(-UZ,v)).

I11 = 0 im lim G -+ 00

V = ( i A - l ) im lim G -+ 00

Weiter gilt: n (ui, v) = - n (-uj, v) ; r (Ui, v) = + r(-ue, o).

76

Mit den weiteren Abkiirzungen

Annalen der Physik. 6 . Folgge. Band 16. 1955

R = 1 7 ( u , , v ) + 1 7 ( u , , v ) - - ( u , , v ) + 1 7 ( u , , v ) , U = 1 1 1 ( u " , v ) + I 7 ( u ' , v ) T = lT(~,, V ) - I'(u~, V) + I'(u3, V) - I'(u4, V ) L = I'(u'', V ) - F(u', V )

erhalt man dann fur B,(v) durch Summation der Einzelintegrale I bis VI:

( 5 ) lim B, (v, w) = B, (v) = i A + 4 ( B - 1) (V + i L )

G-tcr , + f (I? - 1) (i A - 1) ( R + i T). Treniiung nach Real- und Imaginiirteil :

Bz = - 4 {b R + a T - (cos E - 1) f/' + sin E 1,) + ~ i { ( n R - b b + + A + t i n sU + ( e o s & - 1 ) L } ,

(n = A (cos F - 1) - sin E , b = (cos E - 1) + A sin E .

Um das Bild in seiner endgiiltigen Gestalt au bekommen, ist nun noch zu be- riicksichtigen, da13 sich die als Lichtquelle wirlrende Kondensorringblende aus einzelnen Lichtquellpunkten P, zusammensetzt. Die von diesen ausgehenden Lichtbiindel schwingen inkoharent zueinander. Es iiberlagern sich also nicht die Bildamplituden B,, sondern die Intensitiiten I = IB,/2, und man erhalt in der Bildebene des Objektes die Intensitatsverteilung :

Ringblende

J = /J ~Bzi'ddad/3. (6) Der Ausdruck (5) fur B, macht eine allgemeinr: Integration iiber a, j3 in (6) unmoglich. Diese sol1 daher naherungsweise clnrch eine Sumniation ersetzt werden. Physikalisch bedeutet dieses, daB die Kondensorringblende durch eine endliche Zahl van einzelnen Lichtquellpunkten P, ersetzt wird und dali iiber die von den einaelnen P, bewirkten Bilder in der Bildebene des Objektivs gemittelt wird.

Die Unterschiede gegeniiber der strengen Rechnung gehen in der Strieh- dicke der gezeichneten Kurven (Abb. 11) unter. Das geht daraus hervor, dal3 eine Erhohung der Zahl der Quellpunkte P, keine wesentliche Hnderung des Bildes mehr bewirkte. Die Annahme, daB das Objektfeld unendliche Aus- ciehnung hat, diente zunachst nur zur Vereinfachung der Rechnung, ist aber auch in der Praxis mit vollig ausreichender Genauigkeit, realisiert.

hintere Objektivbrennebene Phosenring K/&-% '.

/

4x 10 Punlrte 4 x 12 l'unlrte

Abb. 8. Verteilung der Lichtquellpunkte P,. (Es sind nur die Spektrm 0. Ordnung durch die Punkte angedeutet)

4 x 14 Punk* Verteilung fur: 7 p 10 i'c 14 P

U. Schmidt: Uber Objekttreue von Phasenkontrastbildern 77

Bei der Wahl von Lage und Zahl der Lichtpunkte P, wurde so vorgegangen, dal3 sich die von ihnen hervorgerufenen Bilder I BZl2 geniigend wenig vonein- ander unterschieden und alle wesentlichen Bildtypen wiedergaben. Wie die Abb. 8 deutlich machen 9011, ist dieser Unterschied durch die jeweilige Lage des Phasenringes zu den einzelnen Spektren bedingt. Sus Synimetriegrunden braucht dabei nur ein Viertelringgebiet betrachtet zu werden.

+I 0 +I 0 * I 0 *1 0 +r o + I 106 '' ' Relative Bildkoordinote v-

0 +I 0 41 0 * I 0 *I 0 +I 0 * I 0 *I

Abb. 9. Amplitudenverlauf der Einzelkurven B, fur b = 14 p : e = -0,ll. Die Kurven sind jeweils nur von der Bildmittc bis zum rechtcn Bildrand gezeichnet. J" = Fern-

10-6 ' Relative Bildkoordinofe l3-

abamplitude

Urn einrn Wberblick ubcr die Verteilung der Intensitatswerte der Einzel- kurven iB,I2 zu geben, sind in Abb. 9 deren Amplituden fur b = 1 4 p und t' = -0,l l dargestellt. Sie verteilen sich annahernd gleichmafiig uber den ganzen in Frage kommenden Intensitatsbereich. Bei einer Objektbreite von 10 ,u und 14 u ist die Ausdehnung der Spektren in der hinteren Brennebene des Objektes kleiner als bei b = 7 p. Daher muO hier die Anzahl der Lichtquell- punkte P, vergroaert werden, um die Unterschiede der einzelnen Bildkurven geniigend klein zu halten. Die P, sind unregelmafiig verteilt, vertreten daher auch versehieden grol3e Teile der Kondensorringflache. Bei der Summation der Einzelkurven war daher jede von ihnen mi t einem der prozentualen GroBe diescr Teilgebiete entsprechenden Gewichtsfaktor zu versehen.

Ergebnisse und k'olgerungen Das Ergebnis der Rechnung ist neben dem des Experiments auf Abb. 11

dargestellt. Mit ,,l" ist jeweils die Intensitat bezeichnet, die das Gesichtsfeld ohne Anwesenheit eines Objektes zeigt.

Fur die theoretischen Kurven wurden genau die Phasenverschiebungen angemtat, die an den Objekten mit dem Dreistrahlverfahren gemessen worden waren und daher auch tatsachlich den experinlentellen Kurven zugrunde lagen. Die Objektbreiten wurden der Einfachheit halber fur die theoretischen Kurven bei allen vier Phasenverschiebungen in gleicher Weise angesetzt, wahrend bei

78 Annalen der Physik. 6. li'olge. Band 16. 1955

: * f h

W

I h

zo ... ' . . . . .

I5 . . .

20

b 42,u

-1 0 .! Uelntive Bildhoodinate u -

Abb. 10. Experimentelle Kurven. Abszisse : v-Richtung der Bildebenen des Mikroskop- objektivs (v = y); Ordinate: Intensitiit (Einheit = ,,Fernabintensitiit"). Pbsen-

versohiebung im BogenmaB, entsprechend --6 ,3O; - 1 5 , l O ; -39,9"; - 4 8 , l O

l.1. Schmidt: ober Objekttreue von Phaaenkontrastbikk-rn 79

.85 044p

-2 -1 a +r 4 2 Relotive Bildhwrdinofe u -

I P i; 3 &

h \

I I I

I

I I

-2 -I a * I +2 Relohe Bildhoordinofe u -

b = !4g -2 -1 a * I +2

Relotie fildkoordinote v -

I0 -----

I I

b - l4p

-2 - I 4 * I -2 ReIo!w B,ldhoard,nate u -

Abb. 11. Theoretische Kurven. Abszisse und Ordinate wie in ,4bb. 10. Strichelung: ,,Strengcs Xernike-I'erfahren". Beim Vergleich mit den Bildern der Abb. 10 ist zu

beachten, daB die Objektbreiten meist nicht genau iibereinstimmen.

80 Annalen der Physik. 6. Folge. Band 1G. 1955

der Herstellung der Objekte dieses Ziel nicht genau erreicht werden konnte. Die Intensitatsmaxima liegen durchweg bei denselben Werten und an der richti- gen Gtelle. Die vorhandenen Abweichungeii haben ihre Ursache naturgemaI3 z. T. im Experiment, z. T. aber auch in der Rechnung : Bei jedem Bild wurden 2 x 16 Punkte berechnet. Es ist klar, daJ3 mit ihnen nicht immer die genane Hohe der vor albm bei E = -0,69 und E = -0,84 sehr schmalen Maxima er- fa& werden konnte. Doch iut diese Unsicherheit nicht groRer als 0,05 Einheiten oder m&3y0. Die Punkte selbst wurden auf etwa 0,5yo der Fernabintensitiit genau berechnet.

Ein prinaipieller Unterschied awischen Theorie und Experiment ist nur bei dem Objekt Z, = 7 ,u, E = -0,84 xu erkennen, bei dem die theoretische Kurve in der Bildmitte einen leichten Schlenker aufweist, der im experimen- tellen Bilde praktisch nicht vorhanden ist. Die Ursache hierfur diirfte darin liegen, daB bei der Berechnung monochromatisches Licht ([ = 0,55 ,u) voraus- gesetat wurde, wahrend im Experiment eine Niedervoltlampe ohne Filter Verwendung fand. Die Benutsung polychromat'ischen Lichtes hat natiirlich noch eine weitere Glattung der Kurven aur Folge, so daB auch die letzten von der Theorie geforderten Einzelheiten verschwinden.

Die Strichelung stellt die Bildformen bei dem idealisierten, ,,strengen Zernike-Verfahren" dar. Der a. T. erhebliche Unterschied geht bei den breiten Objekten fast vollkommen auf Rechnung des ,,Nicht-strengen-Zer - n ike -Verfahrens" - also Benutaung eines Zerni kc -Phasenringes endlicher Breite -, bei den schmaler werdenden Objekten auch wachsend auf Rech- nung der Apertur.

Fiir drei weiterc mogliche Fehlerquellen sol1 gezeigt werden, da13 sie in die Auswertung nicht eingingen:

1. Bei den Phasenobjektcn mit grolleren Werten von E treten in der Bildebene des Objektivs relativ groae Intensitatsschwankungen auf, die beim Photograpbieren und der nachfolgenden Entwicklung des Filmes umter Umstiinden einen Eberhard-Effekt verursachen kBnnten. DaB dieser unsere Messungen nicht beeinflu&, wurde durch Photographieren einer Intensitatsstufc bckannter Differenz auf den fur die Mikroaui- nahmen mrwandten Film bewiesen. Tn Abb. 12 ist eine solche Stufe dargestellt. Sie wurde nach Art der Fettfleckphotometrie gewonnen, indem eine von vorn und hinten gleichmilWig bclcuchtete Schirmkante in die Kumera projiziert wurde. Aus dieser Photo- meterkurve kann mit ausreichender Sicherheit die Nichtexistenz des Eberhard-Effektes bei den vorlicgenden Versucheii abgelesen werden. Bei der Ordinate wurde der MaBstab so gewahlt, daB die Einheit etwa, der Fernabintensitiit dcr Phasenkontrastaufnahmen entspricht .

2. Die Rechnung nimmt eine gleichmaBig ausgeleuchtete Aperturblende an. In der Praxis ist das natiirlich nic x,ollstandig dcr Fall. Urn den EinfluIj e imr solchen fehler- haften Justierung zu studieren, wurde eine zusatzliche Aufnahme bei relativ Ausleuchtung der Blende gemaeht. Sie ergab jedocli keine wesentlichen Abw Die Symmetrie der Blende maeht diese Erscheinung verstandlich: Wird die eine Ring- halft,e uberbeleuchtet uncl die andere entsprechend unterbeleuchtet, so gleicht sich diese Unsymmetrie deswegen aus, weil einander gegeniiber liegende Lichtquellpunkte die gleichen Bildfehler erzeugen.

3. Demgegenuber ist die Sdiarfeinstellung des Objektivs sehr sorgfaltig vorzunehmen. Bei der benutzten Optik geriugte eine Dejusticrung des Objektes um weniger als 0,Ol mm, um eine im Okular nicht sichtbare Unscharfc bei der Photomctrie deutlich hervortreten zu lassen. Sic LuBert sich vor allem in einer Aufspaltung der Maxima (Abb. 13). Uiese Fehlerquelle kann jedoch leicht durch Probeaufnahmen vermieden werden.

Vergleicht man nun die hier gefundenen Kurven mit den von Wol te r berechneten, so zeigt sich, daI3 auch hier im wesentlichen wieder der Para-

U . Schmidt: nber Objekttreue v m Phasenkontrastbildern 81

b - b . meter (r = -- uber die Abbildungstreue cntscheidet. Drei kleinere Unter- schiede sind allerdings vorhanden : Erstens sind die Objektkanten nicht mehr senkrecht sondern abgeschriigt. Der Grund hierfiir ist die Mitberiicksichtigung der Apertur in der vorliegenden Rechnung. Diese sorgt dafiir, daO die Maxima sich nicht mehr genau an der Objektkante befinden, sondern rnchr oder meniger

a . t

weit nach aul3en verschoben sind. Zueitens wachsen die Maxima bei (r = 0,5 nicht merli- lich an. Ursache hierfiir ist die oben besprochene &lit telung (S. 76). SchlieBlich lafit sich noch aus den Kurven fur cr = 1,5 (33p) und CT = 2,5 (56p) (Abb. 14) entnehrnen, daB die Intensitat im Bild- inneren nicht iiher die Fernab- intensitat hinausgeht. DaIl bei Wol t e r eine andere Absorption des Zerni ke -Phasenpl&ttchens angenommen wurde, spielt in diesem Zusammenhange keine Rolle lo).

Zurammenfassend lBBt sich also sagen, daB zwischeri den vori rnir gefundenen Kurven und denen der eben erwahnten Arbeit nur geringe Unterschiedc bestehen. D e handelsiiblichen Phasen kon tras teinrichtungen

geben allerdings wohl ein klein wenig objckttreuere Abbildun- gen als die einfache Theorie er- warten lieB. Doch ist auchhei dem hier untersuchten Phasen-

........................... 10-

20-.

Ortskoordinale auf d unfersuchten film - Abb. 12. hlodellaulnahme elner inmis i t i t t aa tu te zur Prufung des Eberhard-Effelrtes. Ordinaten- manstab wis Abb. 10 und 11. Punktabstand in Abszissenrichtung wie in Abb. 10 entsprechend 0,29 ,u Objektbreite. Die pesamte Abszissenlange

entspricht l m m anf dem Film

kontrastwrfahren eine quantitative Beurteilung von Aufnahmen nur unter besofideren Umstanden moglich. Man wiirde dazu Modellaufnahmen (oder -berechnungen) der wiehtlgsten Objekt'formen benot,igen.

Einc AbbildungsverbcsseruIig ist nur durch Verkleinerung der Ringbreite mijglich. Freilich mird das Bild dann dunkler. Doch zeigten Versuche i m Kieler Institut, daB man bei Benutzung wirklich starker Lichtquellen (z. B.

10) In eincr kiirzlichim Jenaer Jahrbuch 1953 erschicnenen Arbcit wird von B e y e r als Grenze einer exaktan Abbildung u _< 0,3 (S. 187) und einer annahernd exakten Ab- bildung u < 1 ( 5 . 208) angegeben, wobei fur die Objekte eine Phasenverschiebung von E = --0,42 angenornmen wird. Dahei ist in dcr Praxis jedoch zu beachten, dal3 sich gerade bci sehr kleinen Objektm die Abbildung durch die begrenzte Apertur des Mikroskops wieder verschlechtert. Ein Vergleich zwischen Beyers und meinen Kurven ist nicht ohne Vorbehalt moglich, da er bci der Berechnung scheibenformiger Objckte statt das Z e r - n i k e -Phasenringes ein Phasenplattchen von annahernd Kreisgestalt voraussctzt urid im Experiment qualitativ arbeitet.

Ann. Phy6ik. 6. Folge, Bd. 16 6

82 Annalen der PILysik. 6. Folge. Band 16. 1955

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Hg-Hochdrucklampen; Elektronenblitz) noch durchaus auf den drit,ten Teil der Ringbreite gehen kann, gegenuber den zur Zeit handelsublichen Ein- richtungeii.

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Abb. 14. Photometeikurven breiter Objekte: Hreitc b = 33 p und 56 p. PhasenTer- schiebung E = -0,27 (-15"). Bedeutung von Abszisse und Ordinate wie in Ahb. 10 u. 11

Relative Biidkoodinafe 21-

Zusammenfassung Die Bildverfalschungen handelsiiblicher Phasenkontrastmikroskope niit

Ringapertur endlicher Breite (0,025) wurden fur verschieden breite kiinstlich hergestellte und genau vermessene streifenformige Phasenobjekte gemessen

U . Schmidt: Uber Objekttreue von Phasenkontrastbildern 83

(Phasmverschiebung 6 ,3"; 15,3"; 39,9"; 48:l"; ermittelt nach dem Drei- strahlverfahren von Zernike). Die Photometerkurven stimmen mit dem aus der Theorie berechneten Intensitatsverlauf uberein. Mogliche Fehlerquellen, insbesondere E berhardeffekt, nurden untersucht und ausgeuchaltet. Der Zern ike -Phasewing hatte eine Absorption von 50% und eine Phasenver- schiebung von 90". Die Bildverfalschungen ahneln sehr den von Wol t e r in Ann. Physik 7 , 33 (1950) fur Punktbeleuchtung mitgeteilten. Wie dort ent- scheidet auch hier im wesentlichen der Parameter 0 = -- ( b = Objekt- breite. A = Wellenlange, b = Breite des Ringes, f = Objektivbrennweite) uber die Abbildungsgute. Leichte Abweichungen zeigen sich darin, daI3 fur (T = 0,5 die Hohe der Intensitatsmaxima fast konstant ist und die Intensitat im Bildinnern bei brciten Objekten nicht uber die ,,Fernabintensitat" hinaus- geht.

Abbildungsverbesserung erfordert Verminderung der Ringbreite, die bei Verwendung starker Lichtquellen ( a . B. Hg-Hochstdrucklampe, Elektronen- blitz) auf mindestens ein Drittel gegeniiber den zur Zeit gebrauchlichen Phasen- kontrasteinrichtungen verringert werden kann.

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Dem Institutsdirektor Herrn Prof. Dr. Loch te -Hol tg reven m0cht.e ich an dieser Stelle fur sein frcundliches Interesse und die Unterstutzung der Arbeit danken. Herrn Dozent Dr. W o l t e r , der die Arbeit anregte, danke ich fur fordernde Diskussionen und seine stete Hilfsbereitschaft.

K ie l , Inst,itut fur Experimentalphysik der Universitiit.

Bei der Redalrtion eingcgangen am 26. Dezember 1954.