Übungen zu Ökologischen Fragen in der Lebensmittelproduktion mit

mikrobiellen GemeinschaftenHaslberger, Handschur

Übungsablauf

• MO: Vortrag Methoden, DNA-Extraktion u. DNA-Reinigung

• DI: 1st PCR, nested PCR, Agarosegel, Vorbereitung des DGGE-Gels, DNA-

Fällung• MI: DGGE, Interprätation der Ergebnisse• DO: Extraktion bakterieller DNA aus Blut mittels

neuer Extraktionsmethode, DNA-Messung mit UV, PCR (Hanusch Spital)

Inhalt

• Culture dependent vs. Culture independent Methods

• PCR• RT-PCR• DGGE, TGGE• SSCP, MSSCP• RFLP, TRFLP• RISA, ARISA• Cloning, Sequencing

2 ways for identification: +/- cultivation

Sample

Identification of MicroorganismsDNA/RNA

Culture- independent Methods

Culture Culture- dependent Methods

Only 1-5% of bacteria can be identified in ecosystems using methods including cultivation

Habitat Cultivability (%)

Freshwater 0,25

Brackish water 0,1-3

Sedimente 0,25

Soil 0,3

Food general 0,5-10

Culturable

• Wachstumsbedingungen bekannt– Temperatur, Nährstoffe, aerob/anaerob

• Keim lebend

• Verschiebung der Flora

• 99% aller Bakterien unbekannt

Culture independent

Culture independent

Spezies Sequenz

S. aureus CGAA CGG ACG AGA AGC TTG CTT CTC T GAT

S. epidermidis CGAA CAG ACG AGG AGC TTG CTC CTC T GAC

S. capitis CGAA CAG ACG AGG AGC TTG CTC CTC T GAC

S. warneri CGAA CAG ATA AGG AGC TTG CTC CTT T GAC

S. haemolyticus CGAA CAG ATA AGG AGC TTG CTC CTT T GAC

Polymerase Chain Reaction

Realtime-PCR

RT-PCR

100.000

1.000

10.000

4520 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44

Flu

ore

scen

ce (

F1)

Cycle Number

106 cop105 cop

104 cop

103 cop

RT-PCR

Denaturant Gradient Gel Electrophoresis

Denaturant Gradient Gel Electrophoresis

Temperature Gradient Gel Electrophoresis

• Prinzip wie DGGE

• Keine DNA- denaturierende Substanzen

• Temperatur Gradient

Singlestrand Conformatiom Polymorphism

• DNA denaturierende Substanzen der Probe zugesetzt ssDNA

• Unterschiedliche Konformation der ssDNA beeinflusst Laufgeschwindigkeit im Gel

SSCP

Multitemperature Singlestrand Comformation Polymorphism

• ssDNA

• Denaturants added to PCR- product

• Different bands because of different conformation of ssDNA

• Temperature is changing during the electrophoresis

• Using high voltage

MSSCP

Temperatur changing during run

Temp.

34°C

22°C

10°C

5´

2´

Zeit

MSSCPSSCP bei untersch. Temp. SSCP m. wechselnder Temp.= MSSCP

MSSCP

(Terminal) Restriction Fragment Length Polymorphism

Cutting enzymes

• HIND III A/AGCTT

• BAM HITGG/CCA

• Eco RI GT/AATTC

• 1) -AGTTGG CCAAGCTTTGCTTAGGC

• 2) -AGGTCCTGATGA AGCTTGGTTAT

• 3 ) -TTTGG CCATTA AGCTT AGT AATTC

1) 2) 3) 1) + 2) + 3)

(Automated) Ribosomal Intergenic Spacer Analysis

• dsDNA between 16 S and 23 S rRNA-Gene (Intergenic Spacer)

• Fluorescently primers

• Different bands because of different length of PCR- product

Sensitivity

• DGGE: 95 - 100% 100-700 bp

• SSCP: 80 - 85 % 100-500 bp

• MSSCP: 85 - 95% 100-500 bp

• [T]RFLP: 90 – 100% 100-10000 bp

• [A]RISA: 95 - 100% 200-1200 bp

Membran Hybridisierungsverfahren

Target DNA

Northern Blot: Mit DNA-/RNA-Sonden wird RNA nachgewiesen

Southern Blot: Mit DNA-/RNA-Sonden wird DNA nachgewiesen

YWestern Blot: Mit markiertem Antibody wird Protein nachgewiesen

Methode

DNA extraction PCR DGGE

Food samples

Comparison of bandpatterns

Monitoring Community fingerprints

Clone libraries

Screenig for different clones and sequencing

Identification of microorganisms

PCR

1. Runde PCR (lange Fragmente)

600 –1300 bp

Nested PCR

Einer der Primer trägt am 5‘-Ende eine GC-clamp.

200 – 500 bp

Amplifikation der 16S rDNA

Klonierung

DGGE

Agarosegel

DGGE

Cloning

BHI-Agar + Tet+ Amp + IPTG+ X-Gal

~ 700 bp

Extrahierte DNA

PCR Amplifikation der langen Fragmente

Ligation

Cloning

Lac ZLactose --> Galactose + GlcX-Gal --> blau (Kolonien blau)

klonierte DNA

LactoseX-Gal (Kolonien weiß)

ß-Galactosidase

Blue/white screening

Clone screening

Sequenzierung

Sequenzierung

FASTA run• Alignment DB:ID Source Length Identity% Ungapped%

EM_PRO:AB012212 Enterococcus faecalis gene 1517 99.719 100.000 356 8e-57 10 EM_PRO:AB036835 Enterococcus faecalis gene 1518 100.000 100.000 356 1.2e-57 45 EM_PRO:AB092693 Enterococcus faecalis gene 1455 100.000 100.000 329 9.6e-53 18 EM_PRO:AB098122 Enterococcus faecalis gene 1466 99.719 100.000 356 2e-57 30 EM_PRO:AB100597 Enterococcus faecalis gene 394 100.000 100.000 356 2.9e-57

• .......

• EM_PRO:AB101658 Streptococcus epidermidis g 197 69.854 70.1000 245 2e-48 31

http://www.ebi.ac.uk/fasta33/nucleotide.html

98% Similarity Speziesgrenze96% Similarity Genusgrenze

Tendogramm

http://rdp8.cme.msu.edu/html/index.html

Clone

Fragestellung

Verursachen alle (kultivierbare/nicht-kultivierbare) MOs im Blut klinische Probleme?

Welche nicht-kultivierbaren MOs sind im Blut neutropenischer/septitischer Patienten?

Woher kommen diese MOs/Wie gelangen sie ins Blut des Patienten?

Was kann man dagegen tun?KLINISCHE BEDEUTUNG

Wozu molekulare Analyse ?

Blutkultur oft negativ Gewisse Menge an Keimen muss vorhanden sein Keime müssen kultivierbar sein Zeit Probenmenge 99% der Bakterien weltweit sind unbekannt NUR 1% ALLER BEKANNTEN BAKTERIEN

WACHSEN UNTER LABORBEDINGUNGEN

Probleme bei der Extraktion bakterieller DNA aus Vollblut

Gelelektrophorese

Probleme bei der Extraktion bakterieller DNA aus Vollblut

Gelelektrophorese

Staphylococcus specific PrimersEnterobacteriaceae/Pseudomonadaceae

specific Primers

Probleme bei der Extraktion bakterieller DNA aus Vollblut

DGGE

Lokalisierung der Bakterien im Blut: Fluorescents Insitu Hybridisation

unspiked spiked m. E.coli u. S.flexneri

Shigella- Sonde E.coli- Sonde

Spezielle DNA- Extraktionsmethode

Selektive Lyse der Blutzellen Verdau der Blut- DNA Inaktivierung der DNase Lyse der Bakterienzellen Reinigung der bakteriellen DNA

Extraction Protocol in cooperation with Fa. MOLZYM

Spezielle DNA- ExtraktionsmethodeGelelektrophorese

Spezielle DNA- Extraktionsmethode

Spezielle DNA- ExtraktionsmethodeDGGE

Abwesenheit v. Blut-DNA

Sensitivität