Universitt BielefeldSFB 613M. Nack1, K. Ataka1, J. Heberle1, T. Niehrster2, S. Doose2, und M. Sauer2

1 Biophysikalische Chemie, Fakultt fr Chemie2 Angewandte Laserphysik und Laserspektroskopie, Fakultt fr PhysikUntersuchung der Funktionsdynamik integraler Membranproteine mit oberflchenverstrkter FTIR-Spektroskopie und Einzelmoleklfluores-zenzmikroskopieK8Publikationen [1]X. Jiang, E. Zaitseva, M. Schmidt, F. Siebert, M. Engelhardt, R. Schlesinger, K. Ataka, R. Vogel, J. Heberle, Resolving Voltage-Dependent Structural Changes of a Membrane Photoreceptor by Surface-Enhanced IR Difference Spectroscopy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 25, 1234-1239 (2008).[2]K. Ataka, J. Heberle, Bioenergetics at the Gold Surface, Biochem. Soc. Trans. 36, in press.Ziele Dieses Projekt soll die funktionelle Dynamik von integralen Membranproteinen mittels zeitauf-gelster und oberflchenverstrkter FTIR-Spektroskopie sowie Einzelmoleklfluoreszenz kombiniert mit Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer aufklren. Durch die Entwicklung dieser komplementren Spektroskopieverfahren soll derVorhaben

Schlussfolgerung Die oberflchenverstrkte FTIR-Spektroskopie und die Einzelmoleklfluoreszenzmikroskopie stellen zueinander komplementre Methoden dar, die eine zeitlich sowie spektral hochaufgelste Analyse der Funktionsdynamik von integralen Membranproteinen ermglichen.molekulare Reaktionsmechanismus von Proteinen wie der F0F1-ATPase und Bakteriorhodopsin, beide verantwortlich fr die Sicherstellung des zellulren Energiehaushalts, mit hoher zeitlicher Auflsung verfolgt werden.Abb. 1: Membranproteine und ihre FunktionenArbeitsplan

Orientierte Immobilisierung der Membranproteine Bacteriorhodopsin und F1F0-ATP-Synthase und Rekonstitution in eine Lipiddoppelschicht

SEIDA-Spektroskopie unter Variation der Transmembranspannung

Etablierung der frequenzmodulierten SEIDAS

Zeitaufgelste SEIDAS an Membranproteinen

Selektive Fluoreszenzmarkierung der Membranproteine

FRET-Experimente mit alternierender Laseranregung mit und ohne Stimulation

Beantragte Mittel

2 Doktorandenstellen

Kleingert (Inkubationsschttler): 9.500 Abb. 2:Komplementaritt der eingesetzten Methoden SEIRAS und Einzelmoleklmikroskopie/SICM.Oberflchenverstrkte FTIR-Spektroskopie (SEIRAS)

In-situ-Beobachtung der spezifischen Bindung von Proteinen an Festkrperoberflchen Verstrkung der IR-Banden durch Au-Nanopartikel.dichte Proteinbelegung mit anschlieender Rekonstitution in Lipiddoppelschicht.Stimulation der Proteinfunktion durch Licht, Strom oder Spannung.Erstmalige Aufnahme reaktions-induzierter Differenzspektren (SEIDAS) einer Proteinmonoschicht [1].Entwicklung der AC-modulierten SEIDAS fr erhhte Sensitivitt und fr zeitaufgelste Experimente.Zeitauflsung im s-Bereich.Komplementr zur oberflchen-verstrkten Raman-Spektroskopie

Einzelmoleklfluoreszenz-mikroskopie / SICM

Selektive Markierung von Membranproteinen mit einem Donor (Cy3B, ATTO 590, ATTO 620) und Akzeptorfarbstoff (ATTO 647 N, ATTO 680) mit einem R0-Wert von ca. 5 nmImmobilisierung auf transparenten leitenden Oberflchen (Gold, ITO) in geeigneter Dichte, eingebettet in eine MembranAlternierende Laseranregung im Weitfeld und Totalreflektion (TIRF-Mikroskopie) und spektral separierte Detektion des Donor- und Akzeptorsignals auf zwei Bereichen einer EMCCD-Kamera FRET-Experimente unter gleichzeitiger Anlegung einer Membranspannung mit einer Zeitauflsung im Millisekundenbereich / Rotationsexperimente mit ATP-SynthasenKonfokale Fluoreszenzmikroskopie gekoppelt mit der Ionenleitfhigkeits-mikroskopie (Scanning Ion Conductance Microscopy, SICM) zum Studium der Konformations-dynamik mit s-Zeitauflsung. Adressierung einzelner Membranproteine durch Spannungs-nderung oder Ionengabe ber die Mikrokapillare Vernetzung im SFB A2 (Schmid): Simulationen von MembranenA5 (Seidel, Sauer, Dietz): V-ATPaseA6 (Godt, Glzhuser): Ni-NTA-SAM auf Goldoberflchen, AFMK5 (Mattay, Anselmetti): zeitaufgelste SEIDAS an oberflchengebundenen CalixarenenD7 (Staiger, Sauer): Imaging und Einzelmolekl-fluoreszenz, zirkadiane RhythmikD11 (Niemann, Heberle): Expression und Reinigung von MembranproteinenZ2 (Heinzmann, Htten): Charakterisierung der oberflchengebundenen Proteine durch Elektronenmikroskopie.

K8Zusatzinformation Universitt BielefeldSFB 613 [3]P. Tinnefeld, M. Sauer, Branching-out of single-molecule fluorescence spectroscopy: Challenges for chemistry and influence on biology, Angew. Chem. Int. Ed. 44, 2642-2671 (2008).[4]S. Doose, M. Sauer, Fluoreszenz bringt Licht ins Dunkel, Physik Journal 6, 55-60 (2007).[5]H. Neuweiler, M. Sauer, Exploring life by single-molecule fluorescence spectroscopy, Anal. Chem. 77, 179A-185A (2005).1 .. 10 kHz10 .. 100 nmPiezo- AktuatorMikroelektrodenverstrkerAbstandsteuerungund RasterungKontrolle + DatenanalyseZ (X,Y,t)XYZ-PiezotischAppendix B Einzelmoleklfluoreszenzmikroskopie / Scanning Ion Conductance Microscopy Bei der Ionenleitfhigkeitsmikroskopie (SICM, Scanning Ion Conductance Microscopy) wird der Ionenstrom durch eine Mikrokapillare mit einem ffnungsdurchmesser von ca. 50-100 nm im pA-Bereich gemessen. Der gemessene Ionenstrom wird durch den Abstand der Kapillare von der Oberflche kontrolliert. Die Kapillare wird hierbei in z-Richtung moduliert und die Antwort mittels Lock-in Technik bestimmt. Hierdurch erreichen wir axial eine topographische Auflsung von ca. 5 nm. In lateraler Richtung wird die Auflsung durch den ffnungsdurchmesser der Mikrokapillare bestimmt.Die funktionelle Dynamik einzelner integrierter Membranproteine soll durch alternierende Laseranregung und FRET-Mikroskopie sowohl mittels Weitfeld- als auch mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie unter Anlegen einer Membranspannung mit s bis ms-Zeitauflsung studiert werden.FRET-Mikroskopie und Konformationsdynamik: Donor/Akzeptor-markierte DNA-Hairpins in PBS immobilisiert auf einer Glasoberflche via Biotin/ Streptavidin-Bindung. Anregung des Donors (hier Cy3B) resultiert in Abhngigkeit von der Konformation des Hairpins (offen oder geschlossen) in einem effizienten Energietransfer zum Akzeptor (hier Cy5).Abb. 6:Fluoreszenzbild und topographisches Bild (SICM) einzelner farbstoffmarkierter Glutamattransporter auf einer Glasoberflche.Abb. 7:Kombination von SICM und TIRF-Mikroskopie.Appendix A Oberflchenverstrkte FTIR-Spektroskopie (SEIRAS) Abb 5: Potentialmodulierte SEIDA-Spektren einer Monoschicht eines Thiol-terminierten Methyl-viologens (MV-SAM) auf Gold. Das Potential wurde zwischen -0.5 und -0.1 V (vs. Ag/AgCl) mit einer Frequenz von (a) 33 Hz, (b) 47 Hz, and (c) 73 Hz moduliert. (d) Stationres redox-induziertes Differenzspektrum der MV-SAM. Abb. 3:Lichtinduzierte SEIDA-Spektren einer Einzelschicht von SRII unter verschiedenen TransmembranspannungenAbb. 4:Experimenteller Aufbau der frequenz-modulierten SEIDA-SpektroskopieGerichtete Bindung von Proteinen an funktionalisierte Goldoberflchen ber endstndige Thiole (Cys) oder Affinittsmarker (Ni-NTA oder strep-tag).

In situ Rekonstitution in eine Lipiddoppelschicht zur Funktionalittssicherung der Proteine.

Lichtinduzierte IR-Differenz-Spektroskopie an einer Monoschicht des archaebakteriellen Membranproteins sensory rhodopsin II [1].

Spannungsabhngige Unterschiede der licht-induzierten SEIDA-Spektren von SR II (Abb. 3) weisen den Einfluss des Membranpotentials auf die Funktionalitt von Membranproteinen auf molekularer Ebene nach.

Mit Hilfe der Anschubfinanzierung durch den SFB 613 konnte die frequenzmodulierte SEIDAS entwickelt werden (Abb. 4).

Erste SEIDA-Messungen unter Einsatz der Modulationstechnik besttigen die Anwendbarkeit auf Untersuchungen oberflchengebundener Molekle (Abb. 5)