Aus der Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde und Kopf- und Halschirurgie

St. Elisabeth-Hospital –Universitätsklinik- der Ruhr-Universität Bochum

Direktor: Professor Dr. med. H. Hildmann

Untersuchung der Expression Osteoklasten-stimulierender und Osteoklasten-differenzierender

Faktoren im Cholesteatom

Inaugural-Dissertation zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer

Hohen Medizinschen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von Michael Sand aus Bochum

2003

Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr

Referent: Priv.-Doz. Dr. med. H. Sudhoff

Koreferent: Prof. Dr. med. Jürgen Krämer

Tag der mündlichen Prüfung: 09.12.2003

Ich widme die vorliegende Arbeit meinen Eltern und meinem Bruder.

Abkürzungen

AP = alkaline phosphatase = Alkalische Phosphatase

bp = Basenpaare

cDNA = complementary desoxyribonucleic acid

DAB =3,3`-Diaminobenzidin

DEPC = Diethylpyrocarbonat

DNA = desoxyribonucleic acid

DNS = Desoxyribonucleinsäure

dNTP-Mix = Desoxy-Nucleosid-Triphosphat-Mix

DTT = Dithiothreitol

g = Erdbeschleunigung = 9,81 N/kg

Il = Interleukin

HRP = horse raddish peroxidase = Meerrettichperoxidase

JNK = c-jun N-terminal kinase

kDa= kilo Dalton

LAB-SA = labeled-streptavidin-biotin

LAMP = lysosomal-associated membrane proteins

LGPs = lysosomal glycosylated proteins

M-CSF = macrophage colony-stimulating-factor

MHC = major histocompatibility complex = Haupthistokompatibilitätskomplex

min= Minute

nm= Nanometer = ( 910

− m)

OD= optische Dichte

OPG = Osteoprotegerin (OCIF/TR1/RANK)

OPGL = Osteoprotegerin Ligand (ODF/TRANCE/RANKL)

PBS = phosphat-gepufferte Natriumchlorid-Lösung

RANK = receptor activator of NF-κB

RNA = ribonucleic acid

RNS = Ribonukleinsäure

RT-PCR = reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

sec= Sekunde

TBE = Tris-Borat EDTA

TBS = Tris-gepufferte Natriumchlorid-Lösung

TNF = Tumor-Nekrose-Faktor

TRAFs = tumor necrosis factor receptor-associated factors

TRAP = Tatrat resistente alkalische Phosphatase

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungen

1. Einleitung ______________________________________________________ 6

1.1 Das Cholesteatom __________________________________________________6

1.2 Osteoklasten im Rahmen des Knochenabbaus beim Cholesteatom_____7

1.2.1 Osteoprotegerin-Ligand (OPGL)____________________________________8

1.2.2 Osteoprotegerin (OPG) ____________________________________________9

1.2.3 CD4 _____________________________________________________________10

1.2.4 CD68 ____________________________________________________________10

1.3 Fragestellung der Arbeit____________________________________________11

2. Material und Methoden _________________________________________ 12

2.1 Experimenteller Teil Molekularbiologie______________________________12

2.1.1 RNA–Isolierung __________________________________________________12

2.1.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung der totalen RNA_______14

2.1.3 Reverse Transkription – Reaktion (RT-Reaktion) ___________________15

2.1.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) _________________________________18

2.1.5 Agarosegelelektrophorese________________________________________22

2.2. Immunhistochemie ________________________________________________24

2.2.1 Präparate________________________________________________________25

2.2.2 Einfachfärbung von CD 4, CD 68, OPG und OPGL __________________25

2.2.3 Doppelfärbung von CD 4 und OPGL _______________________________31

3. Ergebnisse ____________________________________________________ 33

3.1 Molekularbiologischer Nachweis von OPGL und OPG ________________33

3.2 Immunhistochemie CD 4, CD 68, OPG und OPGL sowie_______________43

Doppelfärbung von CD 4 und OPGL ____________________________________43

4. Diskussion ____________________________________________________ 58

5. Zusammenfassung_____________________________________________ 65

6.Anhang ________________________________________________________ 67

7. Literatur_______________________________________________________ 70

8. Danksagung ___________________________________________________ 76

9. Lebenslauf ____________________________________________________ 77

Einleitung 6

1. Einleitung

1.1 Das Cholesteatom

Unter dem Krankheitsbild des Cholesteatoms versteht man einen entzündlichen

Prozess im Mittelohr, der in ein kongenitales und ein erworbenes Cholesteatom

eingeteilt werden kann. Bei der kongenitalen Form ist das Trommelfell

charakteristischerweise intakt und man vermutet, dass sich das Cholesteatom aus

epithelialen Resten eines defekten Neuralrohrschlusses zwischen der dritten und

fünften Schwangerschaftwoche bildet (10). Persistierende epitheliale Reste nach

der 33. Schwangerschaftswoche wurden bereits 1857 von Remak beschrieben und

1986 von Michaels bestätigt (32,40). Nach dieser Theorie ist die Persistenz der

epithelialen Reste, die sich während der Entwicklung des Mittelohres zwischen der

10. und 33. Schwangerschaftswoche bilden, für die mögliche Entstehung eines

kongenitalen Cholesteatoms verantwortlich. Ein eindeutiger Nachweis für diese

Theorie steht jedoch noch aus. Das wesentlich häufigere sekundäre Cholesteatom

ist meist Folge einer chronischen Otitis media, einer Ventilationsstörung der Tuba

eustachii oder einer serösen Otitis media. Im Gegensatz zum kongenitalen

Cholesteatom zeigt sich am Trommelfell meist ein randständiger Defekt. Ursächlich

wurden für das Cholesteatom in der Vergangenheit neben einer infektiösen Genese

auch ein neoplastisches Geschehen diskutiert, da sich im Cholesteatom ein Anstieg

sowohl des im neoplastischen Gewebe erhöhten Tumorsuppressorgens p53 als

auch von MIB(Ki-67) und Proliferationsmarkern (PCNA, AgNOR) im Vergleich zu

gesundem Gewebe beobachten ließ (1,46). Nach neueren Veröffentlichungen ist

jedoch die so genannte Retraktionstheorie für das primär und sekundär erworbene

Cholesteatom weitläufig akzeptiert. Dabei nimmt man an, dass es durch eine

Retraktion der Pars flaccida des Trommelfells (Shrapnell`sche Membran) zur

Ausbildung einer Retraktiontasche kommt. Durch einen gestörten

Selbstreinigungsmechanismus des Gehörgangshautepithels oder Epithels des

Trommelfells in die Retraktionstasche kommt es zu einer Akkumulation von Epithel-

und Keratinmassen. Diese Epithel- und Keratinansammlung bildet den Debris, der

-unter anderem bedingt durch den überforderten Selbstreinigungsmechanismus- zu

einer Entzündungsreaktion führt (50). Auslöser einer derartigen Retraktion des

Trommelfells können eine chronische Otitis media oder ein Tubenverschluss sein.

Einleitung 7

Nach Luftresorption durch die Mittelohrschleimhaut kommt es im Mittelohr durch den

Verschluss der Tuba eustachii zu keinem Druckausgleich.

Es bildet sich ein relativer Unterdruck, womit die Ausbildung einer Retraktionstasche

des Trommelfells begünstigt wird. Hierbei ist oft die Pars flaccida des Trommelfells

betroffen, da hier im Unterschied zur Pars tensa nur wenig organisiertes Kollagen

sowie praktisch keine elastischen Fasern vorhanden sind (5).

Die Entzündung beginnt in der Retraktionstasche des Trommelfells und resultiert in

einem vorranschreitenden Knochenabbau der knöchernen Mittelohrstrukturen sowie

der Gehörknöchelchen. Als Folge kann sich, klinisch eine Schalleitungsstörung und

eine damit verbundene Beeinträchtigung des Hörvermögens bis hin zur Taubheit

entwickeln. Bedingt durch den stark proliferativen und migrativen Charakter des

Cholesteatoms sowie der knochendestruierenden Potenz kann es zu

schwerwiegenden z.T. auch lebensbedrohlichen Komplikationen wie Hirnabzess,

Meningitis, Sinusvenenthrombose, Mastoiditis oder Labyrinthitis kommen. Bei

ausgedehnten Cholesteatomen kann sich zusätzlich eine entzündungsbedingte

Fazialisparese entwickeln. Die Therapie des Cholesteatoms beschränkt sich auf

eine operative Entfernung des Cholesteatoms. Die medikamentöse Inhibition des

Knochenabbaus durch Bisphosphonate (Zoledronat) ist Bestandteil aktueller

Forschung und ein möglicher Ansatz für eine medikamentöse Therapie (57).

1.2 Osteoklasten im Rahmen des Knochenabbaus beim Cholesteatom

Osteoklasten sind spezialisierte Zellen der Monozyten-Makrophagen Zelllinie mit der

Funktion des Knochenabbaus. Ein Knochenabbau beim Cholesteatom wurde

bereits 1864 von Virchow (10) beschrieben. Zu dieser Zeit wurden dem

Knochenabbau jedoch noch keine Osteoklasten zugeordnet. Man macht heute den

entzündlichen Prozess des Cholesteatoms, dessen Grundlage die Epithelinvasion

bildet, für den beim Cholesteatom zu beobachtenden Osteoklasten vermittelten

Knochenabbau verantwortlich. Es kommt bei der verstärkten Aktivierung von

Osteoklasten im Rahmen des Cholesteatoms häufig zum Abbau der

Gehörknöchelchen, insbesondere des langen Fortsatzes des Incus (56) sowie

anderen knöchernen Bestandteilen des Mittelohres. Eine Erklärung für die

beobachtete Knochendestruktion wurde in dem Anstieg des Druckes im Mittelohr

gesucht.

Einleitung 8

Der durch das Cholesteatom ansteigende Druck im Mittelohr wurde zunächst für

den beobachteten Knochenabbau verantwortlich gemacht. Nachdem jedoch die

Aufklärung des Stoffwechsels der Osteoklasten in den vergangenen Jahren

erhebliche Fortschritte erfahren hat, wird ein neues Konzept zum Knochenabbau

des Cholesteatoms entwickelt, welches die Rolle des Osteoklasten und der

entzündungsvermittelten Osteoklasten-Aktivierung stärker hervorhebt und mit

einbezieht:

Durch das Cholesteatom kommt es bedingt durch den entzündlichen Prozess im

Mittelohr lokal zu einem Anstieg von T-Helfer Zellen, Monozyten und Makrophagen

sowie einer erhöhten Freisetzung von entzündungstypischen Cytokinen (Il-1, Il-1l,

Il-6, TNF-α, TNF-β, Interferon-γ). Diese Cytokine führen wie die physiologischen

Regulatoren des Knochenstoffwechsels (Vitamin D3, Parathormon, Prostaglandine)

durch eine direkte Aktivierung von Osteoblasten zu einer erhöhten Expression von

essentiellen Schlüsselfaktoren des Osteoklasten-Stoffwechsels (23). Zu diesen

Faktoren zählt man neben Macrophage-Colony-Stimulating-Factor (M-CSF), das

Osteoprotegerin (OPG) sowie den Osteoprotegerin-Ligand (OPGL). Die

Oberflächenproteine CD4 und CD68 sind charakteristisch für Makrophagen, die als

Vorläuferzellen von Osteoklasten bezeichnet werden können. Im Folgenden sollen

die Funktionen von OPGL, OPG, CD4 und CD68 erläutert werden.

1.2.1 Osteoprotegerin-Ligand (OPGL)

OPGL ist ein membranständiges, 316 Aminosäuren langes (38kDa) von

Osteoblasten und aktivierten T-Zellen exprimiertes Molekül, das einen sehr starken

stimulierenden Effekt sowohl auf die Osteoklastogenese als auch auf die

Knochenresorptionsaktivität von Osteoklasten besitzt. Die Expression von OPGL

wird durch eine Reihe von Faktoren erhöht, welche für eine verstärkte

Knochenresorption verantwortlich zu sein scheinen. Zu diesen Faktoren zählt man

neben Glucokortikoiden auch das 1,25-Hydroxyvitamin D3, Interleukin-1, Interleukin-

6, Interleukin-1l, Interleukin-17, TNF-α (Tumor Nekrose Faktor α), Prostaglandin E2

und das Parathormon (24). OPGL - ein Mitglied der Tumor Nekrose Faktor-Familie

(TNF) - bindet an seinen auf der Osteoklasten- und Osteoblasten-Vorläuferzellen-

Oberfläche exprimierten Rezeptor RANK (receptor activator of NF-κB) (12).

Einleitung 9

Durch die Bindung von OPGL an seinen Rezeptor RANK - einem Mitglied der

Tumor Nekrose Faktor Rezeptor Familie (TNF-R) - führt der durch OPGL aktivierte

Rezeptor zusammen mit verschiedenen TRAFs (tumor necrosis factor receptor-

associated factors) zur Aktivierung einer Reihe von Stoffwechselwegen, die im

Osteoklasten bzw. in seinen Vorläuferzellen zu einer verstärkten Aktivierung und

Differenzierung führen. Zu diesen Stoffwechselwegen zählt die Aktivierung der c-jun

N-terminal Kinase (JNK) sowie des nuclear factor-κB (16). Am Ende der Aktivierung

der Stoffwechselwege von JNK und NF-κB durch den OPGL aktivierten Rezeptor

RANK und den TRAFs steht im Rahmen des Cholesteatoms der Knochenabbau von

Gehörknöchelchen und knöchernen Bestandteilen des Mittelohres.

1.2.2 Osteoprotegerin (OPG)

OPG ist ein nicht membranständiges, 401 Aminosäuren langes Molekül (45), das

zur Familie der TNF-Rezeptoren gehört. OPG bindet sich an das OPGL auf den

Osteoblasten und verhindert damit die Aktivierung oder Differenzierung eines

Osteoklasten bzw. Osteoklastenvorläufers. Es kann zu keiner Aktivierung des RANK

Rezeptors im Osteoklasten und seinen Vorstufen kommen. OPG fungiert damit als

physiologischer Inhibitor der Knochenresorption. Zusätzlich besitzt es eine im

Osteoklasten Apoptose induzierende Potenz. Es kann deswegen als Gegenspieler

von OPGL bezeichnet werden.

Abb. 1 OPG und OPGL (modifiziert nach Greenfield)

Einleitung 10

Wie oben bereits dargestellt, haben der von Osteoblasten und aktivierten T-Zellen

produzierte Osteoklasten-Inhibierungs-Faktor OPG und der auf Osteoblasten

exprimierte Osteoklasten-Differenzierungs-Faktor OPGL eine sehr bedeutende

Position im Rahmen der Osteoklastendifferenzierung und des

Osteoklastenstoffwechsels.

1.2.3 CD4

CD4 ist ein 55 kDa schweres, membranassoziiertes, heterodimeres Glycoprotein,

das vier extrazelluläre dem Immunglobulin ähnliche Domänen enthält (2,4,30). Für

eine effiziente Signalverarbeitung durch den T-Zell-Rezeptor, der sowohl auf

zytotoxischen T-Zellen als auch auf T-Helferzellen exprimiert wird, sind CD3 Ketten

und CD4 oder CD8 nötig (19). Die zytotoxischen T-Zellen exprimieren CD8,

während T-Helfer Zellen das CD4 Protein exprimieren (20). Der T-Zellrezeptor ist

mit CD4 in der Lage, MHC-Klasse-II-Moleküle zu binden, die von Antigen

präsentierenden Zellen präsentiert werden (7,54). Das CD4 Protein erhöht hier die

Bindungsneigung zwischen dem T-Zellrezeptor und dem Antigen-/MHC-Klasse-II-

Molekül Komplex (54). CD4 wird ebenfalls in dendritischen Zellen, Mikroglia-Zellen,

kortikalen Zellen und ausgereiften medullären Thymozyten exprimiert (15).

1.2.4 CD68

CD68 ist ein 110 kDa schweres, glykosyliertes, transmembranes Glykoprotein. Es

gehört zur Gruppe der glykosylierten lysosomalen Glykoproteine (LGPs), zu denen

man auch LAMP-1 und LAMP-2 zählt (17,38). LGPs sind Hauptbestandteile

lysosomaler Membranen. Ihnen wird eine protektive Funktion gegenüber

Hydrolasen zugesprochen (11). CD68 wird vornehmlich in cytoplasmatischen

Vesikeln und auf der Oberfläche von Makrophagen, Monozyten und Lymphozyten

exprimiert (36,39,43).

Einleitung 11

1.3 Fragestellung der Arbeit

Die chronische Entzündung des Mittelohres geht mit einer erhöhten Konzentration

von entzündungsspezifischen Cytokinen einher. Cytokine, wie z.B. das von T-

Helferzellen produzierte Il-1, führen zu einer Aktivierung der Produktion von

Schlüsselfaktoren der Osteoklasten-Aktivierung und -Differenzierung (41,45). Dies

geschieht über die direkte Aktivierung von Osteoblasten, die für die Produktion der

Faktoren des Osteoklastenstoffwechsels verantwortlich sind. Zu diesen

Schlüsselfaktoren gehört neben OPG auch sein Ligand OPGL. Um ihre Rolle im

Cholesteatom induzierten Knochenabbau näher beschreiben zu können, werden im

Rahmen des DFG-geförderten Projekts „Knochenabbau durch das Cholesteatom“

(DFG Su 226/2-1) im ersten experimentellen Teil mit Hilfe der reversen

Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) die Expression von OPG und

OPGL in Cholesteatomen im Vergleich zu Gehörgangshäuten untersucht.

Aus dieser Untersuchung sollen Erkenntnisse über eine eventuelle Beteiligung von

OPG und OPGL am destruktiven Knochenabbau des Cholesteatoms gewonnen

werden. Anschließend an den molekularbiologischen Nachweis werden im zweiten

experimentellen Teil die mit Makrophagen assoziierten Antigene CD4 und CD68,

sowie OPG und OPGL, jeweils in Cholesteatomen und in Gehörgangshäuten

immunhistochemisch untersucht. Durch einen Vergleich zwischen

Cholesteatomgewebe und Gehörgangshaut sollen Rückschlüsse auf Verteilung und

die mögliche Expression der Osteoklastenstoffwechsel regulierenden Faktoren OPG

und OPGL, sowie über Vorhandensein und Verteilung von Vorläuferzellen der

Osteoklasten aus der Granulozyten-Makrophagen-Linie im Cholesteatom gezogen

werden. Dies schafft eine Grundlage für weitere Untersuchungen, welche die

Beteiligung der Osteoklasten am Knochenabbau im Cholesteatom untersuchen.

Abschließend wurden in einer Doppelfärbung CD4 und OPGL in einer Präparatserie

(15 Cholesteatome im Vergleich zu fünf Gehörgangshäute und zwei Negativ-

Kontrollen) immunhistochemisch gefärbt, um eine eventuelle Korrelation der

Lokalisation dieser Antigene zu untersuchen.

Material und Methoden 12

2. Material und Methoden

Die vorliegende Arbeit besteht aus zwei experimentellen Teilen:

1. Es wird mit Hilfe der RT-PCR die Expression des Osteoklasten-

Differenzierungsfaktor OPGL und Osteoklasten-Inhibierungsfaktor OPG jeweils im

Cholesteatom und in der Gehörgangshaut untersucht.

2. Es werden Paraffinschnitte von 15 Cholesteatomen und fünf Gehörgangshäuten

immunhistochemisch auf die Existenz und Lokalisation von OPG, OPGL, und der

Makrophagen-assoziierten Antigene CD4 und CD68 hin untersucht. Eine

abschließende immunhistochemische Doppelfärbung untersucht die Expression und

Lokalisation von CD4 und OPGL in einer Präparatserie.

2.1 Experimenteller Teil Molekularbiologie

Ausgangsmaterial der RT-PCR ist totale RNA, dessen Gewinnung im nächsten

Punkt erläutert wird. Das Versuchsprotokoll für Cholesteatomgewebe und

Gehörgangshaut ist identisch. Zum Schutz vor DNAsen, RNAsen und zur

Vermeidung von möglichen Kontaminationen werden bei allen folgenden Versuchen

Einmalhandschuhe, autoklavierte Glas- und Eppendorfgefäße sowie sterile

Einmalpipettenspitzen benutzt.

2.1.1 RNA–Isolierung

Das gewünschte Gewebe (Cholesteatom bzw. Gehörgangshaut) stammt aus OP-

Eingriffen der HNO-Klinik der Ruhr-Universität-Bochum, St. Elisabeth-Hospital. Die

Einwilligung der Ethik-Komission der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universitat

Bochum liegt vor (Registrierungs Nr. 1356). Die totale RNA wird mit Hilfe des

RNeasy Midi Kits (Qiagen, Hilden) anhand den Angaben des Herstellers isoliert.

Das Gewebe wird nach der operativen Entfernung unmittelbar in flüssigem Stickstoff

tiefgefroren, um die Aktivierung von RNA digestiven RNAsen zu verhindern. Das

tiefgefrorene Gewebe wird entweder direkt

Material und Methoden 13

weiterbearbeitet oder bei –80 °C zwischengelagert. Zum Isolieren wird das Gewebe

zuerst gewogen und mit Hilfe eines mit flüssigem Stickstoff vorgekühlten Mörsers

zerkleinert.

Das pulverisierte Gewebe (75-250 mg) wird mit 4 ml RLT-Puffer supplementiert mit

40 µl β-Mercaptoethanol lysiert. Danach wird das Lysat mit Hilfe einer Spritze (20G,

Durchmesser 0,9 mm) homogenisiert und 10 min bei 3.000-5.000xg (8.000 U/min)

zentrifugiert. Der Überstand wird in ein neues 10 ml Röhrchen gegeben, mit einem

Volumen 70%igem Ethanol versetzt und vorsichtig gemixt. Das Ethanol/Lysat-

Gemisch wird dann auf eine Silicasäule (RNeasy Spin midi column,Qiagen,

Hilden) aufgetragen und 5 min bei 3.000-5.000xg abzentrifugiert. Der Durchfluss

wird verworfen. Die Waschschritte, die zum Eluieren der totalen RNA führen,

beginnen mit dem nächsten Schritt.

Hierzu wird 2 ml des RW1-Puffers auf die Silicasäule aufgetragen, 5 min bei 3.000-

5.000xg zentrifugiert und das Zentrifugat verworfen. Um eine eventuelle

Kontamination der Probe mit Fremd-DNA zu vermeiden, wird eine DNase-

Behandlung mit dem RNase-free DNase-Set (Qiagen) anhand den Angaben des

Herstellers durchgeführt. Es wird 140 µl des RDD-Puffers zu 20 µl der DNase I-

Stammlösung gegeben und sehr vorsichtig gemischt, da die DNase I sehr

empfindlich physikalischer Einwirkung gegenüber ist. Die so fertige DNase-I Lösung

(160 µl) wird in die Mitte der Silicasäule pipettiert und 15 min bei Raumtemperatur

inkubiert. Danach wird 2 ml des RW 1-Puffers dazu gegeben und 5 min bei

Raumtemperatur inkubiert. Es folgt eine 5 minütige Zentrifugation bei 3.000-

5.000xg, wobei der Durchfluss verworfen wird. Beim nächsten Waschschritt wird 2,5

ml des RPE-Puffers auf die Säule gegeben und 2 min bei 3.000-5.000xg

zentrifugiert. Es folgt eine erneute Zugabe von 2,5 ml RPE-Puffer und eine

anschliessende Zentrifugation für 5 min bei 3.000-5.000xg. Nach behutsamen

Verwerfen des Durchflusses wird die Säule auf ein neues 15 ml Collection-Tube

gegeben. Zur Eluation werden 150 µl RNase freies Wasser in die Mitte der Säule

gegeben und für 1 min stehen gelassen. Es folgt dann eine Zentrifugation für 3 min

mit 3.000-5.000xg. Um eine höhere RNA Konzentration zu erhalten und das

Ergebnis der Eluation zu optimieren, wird das Eluat nochmals auf die Säule

gegeben und wiederum 3 min bei 3.000-5.000xg abzentrifugiert. Es folgt die

photometrische Konzentrationsbestimmung der totalen RNA.

Material und Methoden 14

2.1.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung der totalen RNA

Die optische Dichte wird mit Hilfe eines Photometers (Ultrospec 2000, Pharmacia

Biotech) jeweils bei 260 nm und 280 nm bestimmt. 1000 µl RNase freies Wasser

dient dabei als Referenz. Zur Konzentrationsbestimmung mit Hilfe der gewonnenen

optischen Dichten bei 260/280 nm wird folgende Formel verwendet:

( )

=

l

gVerdünnungnmODC RNA

µ

µ

1000

*40*)260(

Hinweise:

OD= optische Dichte

Verdünnung= 1:500

40= Es ist allgemein bekannt, dass eine RNA-Lösung mit einer optischen Dichte

von 1 eine Konzentration von 40 l

g

µ

µ in einer Zelle mit einer Schichtdicke von 10

mm besitzt.

Für eine rasche Qualitätsermittlung der isolierten RNA wird zusätzlich das

Absorptionsverhältnis A260nm/A280nm (Ratio) bestimmt.

*)280(

)260(

RnmOD

nmODRatio

−=

*R = Referenz = Absorption von Probe (280nm) – Absorption von Wasser (280nm)

Das Optimum liegt bei reiner RNA zwischen 1,8-2,0.

Material und Methoden 15

2.1.3 Reverse Transkription – Reaktion (RT-Reaktion)

Aus der in 2.1.1 gewonnenen totalen RNA muß zunächst in der RT-Reaktion cDNA

gewonnen werden, um an Ausgangsmaterial für eine PCR zu gelangen. Die

reverse-Transkription-Reaktion wird mit Hilfe des SuperScript First-Strand Synthesis

System (GIBCO BRL) durchgeführt. Dabei wird mit Hilfe einer reversen

Transkriptase die komplementäre DNA aus einzelsträngiger RNA nach folgendem

Prinzip synthetisiert:

Die aus Retroviren gewonnene reverse Transkriptase ist eine RNA-abhängige DNA-

Polymerase. In dieser Arbeit wurde als Primer Random Hexamer verwendet, der

sich an das 3´-Ende des Poly(A)-Schwanz der Ausgangs-RNA bindet. Von diesem

Primer aus startet die reverse Transkriptase die Kettenverlängerung, bei der die

Desoxyribonucleosidtriphosphate (dNTP) als Substrate dienen. Die durch die

Ribonuclease-H-Domäne der reversen Transkriptase normalerweise vorhandene

RNase H Aktivität dient der Hydrolysierung des RNA Teils des entstehenden RNA-

DNA-Hybridanteils (44). Diese wurde vom Hersteller inaktiviert, um eine optimale

cDNA Ausbeute zu erhalten. Am Ende der Reaktion wird durch die Zugabe von

RNase H das RNA-DNA-Hybrid abgebaut.

Material und Methoden 16

Abb. 2 RT-Reaktion (modifiziert nach Stryer)

In dieser Arbeit wurde als Ausgangsmaterial zur Synthese der cDNA 1µg totale RNA

eingesetzt. Das Pipettierschema für die RT-Reaktion ist in Tabelle 1

wiedergegeben, wobei +RT1 und +RT2 positive Ansätze mit Zugabe der reversen

Transkriptase und analog –RT1 und –RT2 negative Kontrollen ohne Zugabe des für

die Reaktion benötigten Enzyms, darstellen.

Material und Methoden 17

Tab. 1 Pipettierschema 1 für RT-Reaktion (alle Angaben in µl)

Probe

+RT1

Probe

+RT2

Probe

–RT1

Probe

-RT2

Kontroll

RNA

1µg RNA X X X X ----------

Kontroll RNA

50 l

ng

µ

----------

----------

----------

----------

1

RandomHexam

er 50 l

ng

µ

1 1 1 1 1

10 mM

dNTP-Mix

1 1 1 1 1

DEPC- H2O (10-X) (10-X) (10-X) (10-X) 7

Um die RNA zu denaturieren, werden die RT-Ansätze für 5 min in einem 65° C

warmen Wasserbad inkubiert. Anschließend werden die Reaktionsansätze sofort

auf Eis gelegt und die Komponenten, die in der Tabelle 2 aufgelistet sind,

hinzugegeben:

Tab. 2: Pipettierschema 2 für RT-Reaktion (alle Angaben in µl)

Probe

+RT1

Probe

+RT2

Probe

–RT1

Probe

–RT2

Kontroll

RNA

10x RT-Puffer 2 2 2 2 2

25mM MgCl2 4 4 4 4 4

RNaseOUT

Recombinant Ribonuclease Inhibitor

1 1

1 1 1

0,1 M DTT 2 2 2 2 2

Material und Methoden 18

Die Ansätze werden 2 min bei 25° C in einem Thermostat äquilibriert. Danach wird

jeweils 1 µl Super Script II RT (reverse Transkriptase) bzw. DEPC-H2O zu den

Ansätzen dazugegeben.

Tab. 3 Pipettierschema 3 für RT-Reaktion (alle Angaben in µl)

Probe

+RT1

Probe

+RT2

Probe

–RT1

Probe

–RT2

Kontroll

RNA

SuperScript II RT

(reverse

Transkiptase)

1 1 --------- ---------- 1

DEPC- H2O ---------- ---------- 1 1 -----------

Die Ansätze werden zuerst 10 min bei 25° C und danach 50 min bei 42° C im

Thermostat inkubiert. Um die RT-Reaktion zum Stoppen zu bringen, werden die

Ansätze aus dem Thermostat genommen und 15 min bei 70° C in einem Wasserbad

erhitzt. Anschließend werden die Proben auf Eis gestellt, jeweils 1 µl RNase-H zu

jeder Probe gegeben und 20 min bei 37° C inkubiert. Dabei wird der RNA-Strang

spezifisch abgebaut, was zur Erhöhung der Sensitivität der nachfolgenden PCR-

Reaktion führt. Die synthetisierte cDNA wird entweder in einer nachfolgenden PCR

weiterverwendet oder alternativ bei –20° C zwischengelagert.

2.1.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Um einen molekularen Nachweis der Faktoren OPGL und OPG mit Hilfe der

Gelelektrophorese führen zu können, müssen die codierenden DNA-Abschnitte mit

Hilfe der PCR vervielfältigt werden. Die Molekularbiologie stellt hierfür mit der

Polymerase -Kettenreaktion eine geeignete Methode zur Verfügung. Dabei wird aus

einer geringen Menge Ausgangs-DNA (template), die in der RT-Reaktion (2.1.3) aus

Material und Methoden 19

totaler RNA synthetisiert wurde, eine in vitro-Vermehrung durchgeführt, die in einer

großen Menge amplifizierter DNA resultiert. Die folgenden Schritte sind dafür nötig:

Zunächst kommt es durch Wärme zu einer Denaturierung der DNA-Doppelhelix.

Nach dieser Strangtrennung bei 94 °C wird die Temperatur auf 72 °C gesenkt. Da

jetzt Einzelstränge vorliegen, können sich die spezifischen Primer im

Hybridisierungsschritt an die beiden komplementären Sequenzen auf der DNA

binden. Ein Primer bindet sich an den einen Einzelstrang, während sich der andere

Primer an den komplementären Einzelstrang in einer bestimmten Entfernung bindet.

Nach diesem Hybridisierungschritt, der auch Annealing genannt wird, kommt es

unter Zugabe einer DNA-Polymerase und Substraten dNTPs

(Desoxynucleosidtriphosphate) ausgehend von den Primern zu einer

Kettenverlängerung. Die hierfür verwendete DNA-Polymerase ist ein hitzestabiles,

aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus gewonnenes Enzym. Diese

Taq-DNA-Polymerase (Taq) bindet sich an einen Primer und synthetisiert einen

komplementären DNA-Strang des zu vervielfältigenden Abschnittes. Wiederholt

man diese Reaktionen mehrfach, so hat man im Endprodukt der PCR-Reaktion eine

große Menge der nachzuweisenden DNA-Sequenz synthetisiert (53). Die in dieser

Arbeit verwendeten spezifischen Primerpaare wurden analog zu schon bekannten

mRNA-Sequenzen konzipiert (Quelle: National Center for Biotechnology Information

- Datenbank) und bei der Firma MWG-Biotech (Ebersberg) hergestellt. Die

Primersequenzen sind im Anhang dargestellt.

Material und Methoden 20

Abb. 3 Polymerase-Kettenreaktion (modifiziert und vereinfacht nach Stryer)

Material und Methoden 21

Tab. 4 Pipettierschema für PCR-Ansätze (alle Angaben in µl)

+RT1

OPG

+RT2

OPGL

-RT1

OPG

-RT2

OPGL

K +RT1 Actin

+RT2 Actin

-RT1

Actin

-RT2

Actin

Nuklease

freies

H2

0

31,5 31,5 31,5 31,5 33,5 37,5 37,5

37,5 37,5

10x-Puffer 5 5 5 5 5 5 5 5 5

dNTP-Mix 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Sense

OPG

2 ------ 2 ------ ----- ------ ------ ------ ------

Antisense

OPG

2 ------ 2 ------ ----- ------ ------ ------ ------

Sense

OPGL

------ 2 ------ 2 ----- ------ ------ ------ ------

Antisense

OPGL

------ 2 ------ 2 ----- ------ ------ ------ ------

Sense

Actin

------ ------ ------ ------ ----- 2 2 2 2

Antisense

Actin

------ ------ ------ ------ ----- 2 2 2 2

Primer A ------ ------ ------ ------ 1 ------ ------ ------ ------

Primer B ------ ------ ------ ------ 1 ------ ------ ------ ------

cDNA

(template)

8 8 8 8 8 2 2 2 2

rTaq 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Die Ansätze haben ein Gesamtvolumen von 50 µl. Sie werden in einem auf 94 °C

vorgeheizten Thermocycler (Biometra) gegeben, der für die Faktoren OPGL und

OPG mit den folgenden PCR-Programmen schon vorher programmiert ist (Tab. 5

und Tab. 6). Die beiden Ansätze +RT1 Actin und +RT2 Actin dienen als positive

Kontrolle.

Material und Methoden 22

Tab. 5 Thermocyclerprogramm für OPG

Temperatur Zeit Anzahl der

Zyklen

94 °C 5 min 1 x

94 °C

55,8 °C

72 °C

30 sec.

30 sec.

30 sec.

33 x

72 °C 7 min 1 x

4°C 0 min ENDE

Tab. 6 Thermocylerprogramm für OPGL

Temperatur Zeit Anzahl

der Zyklen

94 °C 2 min 1 x

94 °C

56 °C

72 °C

1 min

30 sec

45 sec

35 x

72 °C 15 min 1 x

4 °C 0 min ENDE

Nachdem die Reaktion beendet ist, können die Proben bei – 20° C gelagert oder

direkt elektrophoretisch analysiert werden.

2.1.5 Agarosegelelektrophorese

Um den qualitativen Nachweis der Faktoren OPGL und OPG führen zu können,

müssen die zuvor im Rahmen der PCR spezifisch amplifizierten DNA-Fragmente mit

Hilfe der Gelelektrophorese getrennt werden. Hierzu wird eine

Agarosegelelektrophorese der gesuchten Fragmente durchgeführt. Sie beruht auf

Material und Methoden 23

dem Prinzip, dass Moleküle bedingt durch ihre Eigenladung und Größe in einem

elektrischen Feld unterschiedlich weit wandern. Als Trägermedium kann ein

Polyacrylamidgel oder, wie in dieser Arbeit, ein Agarosegel verwendet werden.

Die Proben werden in einem Agarosegel nach Ihrem Molekulargewicht

elektrophoretisch getrennt und die Fragmentlängen der Proben anhand eines DNA-

Standard bestimmt. Zur Herstellung eines 2%igen Agarosegels werden 1,6 g

Agarose (amresco, Solon/USA) und 80 ml 1 x TBE-Puffer (Merck, Darmstadt) in

einem 250 ml Glasbecher gemischt und 3-4 min in einer Mikrowelle erhitzt.

Nachdem die Agarosekristalle sich vollständig aufgelöst haben, wird der

Flüssigkeitsverlust mit destilliertem Wasser ausgeglichen. Nach wiederholtem

Mischen wird nun 1 µl Ethidiumbromid (10 mg/ml, amresco, Solon/USA) dazu

pipettiert und gemischt. Das Ethidiumbromid, hat die Eigenschaft sich zwischen

einzelne Basenpaare eines doppelsträngigen DNA-Moleküls einzulagern, die dann

unter UV-Licht fluoreszieren, und dient damit der Markierung der DNA (44). Die

Agaroselösung wird möglichst blasenfrei in einem Gelträger mit Kamm

ausgegossen und ist nach dem Abkühlen fertig zum Gebrauch.

Die Proben müssen vor der Elektrophorese mit Probenpuffer (Zentralapotheke der

St. Elisabeth-Stiftung) vorbereitet werden. Dazu werden jeweils 10 µl der zuvor bei

der PCR amplifizierten DNA mit 1,7 µl 6 x Probenpuffer versetzt, gemixt und

herunterzentrifugiert. Um eine Aussage über die Größe der DNA-Fragmente

machen zu können, ist es erforderlich einen DNA-Standard bei jeder

elektrophoretischen Trennung mitlaufen zu lassen. In dieser Arbeit wurde der 50 bp

DNA-Standard (Gibco BRL, Invitrogen life technologies, Carlsbad/USA) eingesetzt.

Das fertige Gel wird in eine mit 1 x TBE-Laufpuffer gefüllte horizontale Gelkammer

(Biometra, Göttingen) gegeben. Hierbei ist darauf zu achten, dass das Gel mit

ausreichend Laufpuffer bedeckt ist. Von den vorbereiteten Proben und dem DNA-

Standard werden jeweils 11 µl in eine Geltasche pipettiert. Bei einer Spannung von

60 V lässt man die Proben für etwa 90 min laufen. Nach 90 min ist die Auftrennung

beendet und das Gel kann zur Dokumentation der DNA-Fragmente mit Hilfe einer

computergesteuerten Digitalkamera unter UV-Licht (Herolab Gel-

Dokumentationssystem, Wiesloch) analysiert und anschließend fotodokumentiert

werden.

Material und Methoden 24

2.2. Immunhistochemie

Die immunhistochemischen Untersuchungen werden an in Formalin fixierten und in

Paraffin eigebetteten histologischen Schnitten von Cholesteatomen und

Gehörgangshäuten durchgeführt. Dabei wird die LSAB-Methode (labeled

streptavidin-biotin) angewendet, welche zu den indirekten immunhistologischen

Techniken gezählt wird. Im Gegensatz zu den direkten immunhistologischen

Techniken sind hierbei die Primärantikörper unmarkiert.

Die LSAB-Methode basiert auf dem folgenden Prinzip: Das anzufärbende Antigen

wird mit einem spezifischen Primärantikörper markiert. Ein biotinylierter

Sekundärantikörper bindet an den Primärantikörper und fungiert als Brücke

zwischen dem Streptavidin-Peroxidase Konjugat (im Falle von CD4 Streptavidin-

alkalische Phosphatase Konjugat), was an den Biotinrest des Sekundärantikörpers

(Brückenantikörper) bindet. Die an das Streptavidin gekoppelte Peroxidase (bzw.

alkalische-Phosphatase) wird durch Zugabe eines Chromogens infolge einer

enzymatischen Spaltungreaktion sichtbar gemacht.

Abb. 4 Testprinzip der LSAB-Methode (modifizierte Abb. Zymed Laboratories Inc.)

Material und Methoden 25

Die Antigene CD4 und CD68, sowie der Osteoklasten-Differenzierungsfaktor OPGL

und der Osteoklasten-Inhibierungsfaktor OPG werden jeweils pro Antigen auf einer

Präparat-Serie einfach gefärbt. Für die Färbung von CD68 wird das Histostain-Plus

Kit (Zymed Laboratories Inc. 85-9643) benutzt. Bei allen anderen angefärbten

Antigenen werden die angegebenen Reagenzien verwendet. In einer Präparat-Serie

wird zusätzlich eine Doppelfärbung von CD4 und OPGL durchgeführt.

2.2.1 Präparate

Eine Präparat-Serie besteht aus 15 verschiedenen Cholesteatomschnitten, fünf

verschiedenen Gehörgangshautschnitten und zwei Negativ-Kontrollen jeweils

unterschiedlicher Patienten.

Die Präparate stammen aus der Hals-Nasen-Ohren-Klinik der Ruhr-Universität-

Bochum, St. Elisabeth-Hospital. Nach der direkten Fixierung in Formalin und

anschließenden Einbettung in Paraffin werden die Präparate mit Hilfe eines

Mikrotoms geschnitten und auf Objektträger aufgezogen. Anschließend werden sie

über Nacht bei 37 °C getrocknet und dann im Kühlschrank bei 6 – 8 °C gelagert.

2.2.2 Einfachfärbung von CD 4, CD 68, OPG und OPGL

Die immunhistologische Einfachfärbung läßt sich in die folgenden sechs Schritte

gliedern:

2.2.2.1 Entparaffinierung und Rehydrierung

2.2.2.2 Demaskierung der Antigene

2.2.2.3 Behandlung mit einem Primärantikörper gegen das nachzuweisende

Antigen

2.2.2.4 Behandlung mit einem Sekundärantikörper gegen den Primärantikörper

2.2.2.5 Behandlung mit einem Enzymkonjugat

2.2.2.6 Sichtbar machen des Primär-/Sekundär-Antikörper Komplexes mit einem

Chromogen

Material und Methoden 26

Zu 2.2.2.1 Entparaffinierung und Rehydrierung

Die Paraffinschnitte werden auf einer Wärmeplatte bei 57-59°C für 10-15 min

getrocknet. Alle nachfolgenden Reagenzien müssen für ein optimales Ergebnis bei

Raumtemperatur verwendet werden. Zur Entparaffinierung werden die

Paraffinschnitte zweimal für 10 min mit Xylol behandelt. Es folgt eine absteigende

Alkoholreihe, die der Rehydrierung des Gewebes dient. Hierzu werden die

Paraffinschnitte

10 Minuten mit 100 Vol% Ethanol,

10 Minuten mit 96 Vol% Ethanol,

5 Minuten mit 70 Vol% Ethanol,

5 Minuten mit 50 Vol% Ethanol und

5 Minuten mit Aqua dest.

behandelt.

Zu 2.2.2.2 Demaskierung der Antigene

Durch die Formalinfixierung kommt es zu einer Eiweißvernetzung im Gewebe. Dies

führt zu einer Maskierung der Antigene, wobei es passieren kann, dass ein

Antikörper ein Antigen nicht erkennt. Daher werden die Präparate zur Demaskierung

der Antigene abhängig vom anzufärbenden Antigen vorbehandelt, um die bei der

Formalinfixierung entstandenen Methylenbrücken, welche durch Quervernetzungen

zu Strukturveränderungen von Proteinen führen können, aufzubrechen (Krull). Bei

CD4, CD68 und OPGL wird die Vorbehandlung der Präparate mit einem

Schnellkochtopf durchgeführt. Bei der Färbung von OPG wird eine proteolytische

Vorbehandlung mit Trypsin vorgenommen.

Vorbehandlung mit Trypsin (für OPG)

Es werden 500 mg des bovinen Trypsins der Firma DAKO, Carpinteria/USA (Code

No. S 20 12 Lot 109) mit 25 ml 0,1%iger Calcium Chlorid (CaCl2) Lösung versetzt.

Danach wird die so gewonnene Lösung in 0,1 ml Portionen alliquotiert und bei

Material und Methoden 27

–20°C gelagert. Zum Herstellen der Gebrauchslösung wird die im Schritt zuvor

gewonnene 0,1 ml Trypsin Stammlösung mit 1,9 ml Calcium Chlorid (0,1%) versetzt.

Diese Lösung ist unmittelbar danach gebrauchsfertig und kann 5 Tage bei 2-8°C

gelagert werden.

Zur proteolytischen Demaskierung der Antigene wird das in der Alkoholreihe

rehydrierte Cholesteatom- / Gehörgangshautpräparat bei 37 °C für 30 min mit 150 µl

Trypsin-Lösung versetzt. Dabei werden Peptidbindungen, die von den

Carboxylgruppen von Arginin und Lysin gebildet werden, hydrolysiert und

ermöglichen somit dem Primärantikörper eine optimale Bindung an das

nachzuweisende Antigen.

Vorbehandlung mit Hitze (für CD4, CD68 und OPGL)

In einem Schnellkochtopf werden 2 l 0,01M Citratpuffer (pH 6) angesetzt. Dazu

werden in 1,9 l Aqua dest. 4,2 g Citronensäuremonohydrat (Merck, Darmstadt

1.00244) aufgelöst. Der pH-Wert wird mit Hilfe von pH-Indikatorstäbchen (Merck

1.09535) und 5 %iger NaOH auf einen pH-Wert von 6 eingestellt. Es wird dann mit

Aqua dest. auf 2 l aufgefüllt. Der so hergestellte Puffer wird bei mittlerer Stufe in

einem Schnellkochtopf erwärmt. Die Paraffinschnitte werden in den Schnellkochtopf

gegeben und 5 min erhitzt.

Zu 2.2.2.3 Behandlung mit einem Primärantikörper

Nach der Hitzebehandlung bzw. der Vorbehandlung mit Trypsin, werden die

Präparate 10 min in TBS Puffer gegeben. Es folgt eine 10 minütige Behandlung mit

3 %iger H2O

2-Lösung, die der Inaktivierung endogener Peroxidasen dient. Danach

wird für 10 min mit TBS Puffer behandelt. Eine lichtundurchlässige

Inkubationskammer aus Plastik wird mit 10 ml TBS Puffer befeuchtet. Die Präparate

werden aus dem TBS genommen und die vorhandene Pufferflüssigkeit auf dem

Objektträger durch seitliches Abklopfen auf Zellstofftüchern entfernt. Mit einem

Fettstift (PAP Pen, Cedarlane, Ontario/Canada) werden die Präparate eingekreist,

um den Reagenzienverbrauch zu reduzieren und eine optimale Inkubationssituation

zu schaffen. Für OPG, OPGL und CD4 werden 100 µl oder 2 Tropfen 10% Normal

Material und Methoden 28

Rabbit Serum (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco/USA), für CD68

Blocking Solution A (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco/USA) 10 min

auf das Präparat gegeben. Die Blocking Solution bzw. das Normalserum dienen der

Neutralisierung von Ladungen auf der Präparatoberfläche, um unspezifische

Hintergrundfärbung zu vermeiden. Man bereitet die benötigte Menge Primär-

Antikörper vor. Die verwendeten Antikörper und Verdünnungen können aus Tab. 7

entnommen werden.

Tab. 7

Die Blocking Solution wird durch seitliches Abklopfen auf Zellstoffpapier entfernt.

Mit Ausnahme der Negativ-Kontrolle werden auf jedes Präparat 100 µl des mit TBS-

Puffer verdünnten Primär-Antikörpers pipettiert und dann im Kühlschrank bei 4-6 °C

über Nacht inkubiert.

Zu 2.2.2.4 Behandlung mit einem Sekundärantikörper

Am darauffolgenden Tag wird die Inkubationskammer mit den Präparaten bei

Raumtemperatur 10 min aufgewärmt und danach werden die Präparate drei mal

zwei Minuten in TBS-Puffer gewaschen. Die Präparate werden dann seitlich auf

Zellstoffpapier abgeklopft, um den restlichen Puffer zu entfernen. Es werden 2

Tropfen oder 100µl des Biotin-gekoppelten Sekundärantikörpers auf das Präparat

gegeben. Der verwendete Sekundärantikörper ist abhängig vom Primärantikörper,

da der Primärantikörper für den Sekundärantikörper das zu bindende Antigen ist.

Primär-Antikörper Verdünnung mit TBS-Puffer Hersteller des Primär Antikörpers

CD4

CD68

OPG (RANK)

OPGL (RANKL)

1: 50

1: 50

1: 50

1: 50

Santa Cruz Biotech, sc1140

goat polyclonal

DAKO, Code No. M0814

mouse monoclonal

Santa Cruz, sc7625

goat polyclonal

Santa Cruz, sc7627

goat polyclonal

Material und Methoden 29

Der Sekundärantikörper fungiert als Brückenantikörper. Aus Tab. 8 lassen sich die

verwendeten Sekundärantikörper entnehmen.

Tab. 8

Primär-Antikörper Sekundär-Antikörper Hersteller

CD 4

CD 68

OPG (RANK)

OPGL (RANKL)

Rabbit Anti-Goat IgG Biotin 81-

1640

Biotinylated Second Antibody

Rabbit Anti-Goat IgG Biotin 81-

1640

Rabbit Anti-Goat IgG Biotin 81-

1640

Zymed Laboratories Inc.

Zymed Laboratories Inc.

Zymed Laboratories Inc.

Zymed Laboratories Inc.

Das Präparat wird 10 min mit dem jeweiligen Sekundärantikörper inkubiert. Es folgt

ein Waschschritt mit drei mal zwei Minuten in TBS-Puffer Lösung.

Zu 2.2.2.5 Behandlung mit einem Enzym Konjugat

Nach seitlichem Abklopfen auf Zellstoffpapier wird das Präparat mit 100 µl oder 2

Tropfen Enzym-Konjugat inkubiert. Das verwendete Enzym-Konjugat hängt vom

Sekundärantikörper und vom Chromogen ab. Tab. 9 zeigt die verwendeten Enzym-

Konjugate.

Tab. 9

Primär-Antikörper Enzymkonjugat Hersteller

CD4

CD68

OPG (RANK)

OPGL (RANKL)

AP-Streptavidin, 43-4322

HRP-Streptavidin, 43-4323

HRP-Streptavidin, 43-4323

HRP-Streptavidin, 43-4323

Zymed Laboratories Inc.

Zymed Laboratories Inc.

Zymed Laboratories Inc.

Zymed Laboratories Inc.

Material und Methoden 30

Nachdem das Präparat 10 min mit dem Enzymkonjugat behandelt wurde, folgt

wieder ein Waschschritt mit drei mal zwei Minuten in TBS-Puffer.

Zu 2.2.2.6 Sichtbar machen des Primär-/Sekundär-Antikörper Komplexes mit

einem Chromogen

Nach seitlichem Abklopfen auf Zellstoff wird das Präparat mit einem Chromogen

behandelt (Tab.10), das den Primär-/ Sekundärantikörper-Komplex sichtbar macht.

Tab. 10 Die verwendeten Chromogene.

Primär-Antikörper Chromogen Hersteller

CD4

CD68

OPG (RANK)

OPGL (RANKL)

Fast Red

DAB

DAB

DAB

Boehringer Mannheim

Zymed Laboratories Inc.

Zymed Laboratories Inc.

Zymed Laboratories Inc.

DAB ist ein lichtempfindliches Chromogen und muß daher in einem lichtgeschützten

Reagenzglas hergestellt und gelagert werden. Nach Herstellung ist es maximal eine

Stunde verwendbar.

Das Chromogen Fast Red (Boehringer, Ingelheim) liegt in Tablettenform vor und

muss in TRIS-HCl Lösung gelöst werden. Je 100 µl der frisch angesetzten

Chromogenlösung werden 3-10 min auf die Präparate gegeben. Danach werden die

Präparate mit TBS gewaschen. Nach seitlichem Abklopfen auf Zellstoff werden zur

Gegenfärbung einige Tropfen Mayer`s Hämalaun-Lösung auf das Präparat

gegeben. Nach einer Minute wird das Präparat mit Aqua dest. gespült. Nach 10 min

in Aqua dest. wird das Präparat eingedeckt. Es werden drei Tropfen des

Eindeckmittels Aquatex (Merck, Darmstadt, 1.08562) auf den Objektträger gegeben

und mit einem Deckglas eingedeckt. Die Farbentwicklung sollte im Mikroskop

kontrolliert werden.

Material und Methoden 31

2.2.3 Doppelfärbung von CD 4 und OPGL

Die Doppelfärbung von CD 4 und OPGL an einer Präparatserie lässt sich ähnlich

wie die immunhistochemische Einfachfärbung (2.2.2) in folgende Punkte gliedern:

2.2.3.1 Demaskierung der Antigene

2.2.3.2 Behandlung mit

- einem Primärantikörper gegen OPGL

- einem Sekundärantikörper gegen den Primärantikörper

- einem Enzymkonjugat

- einem Chromogen

- Double-Staining-Enhancer (Zymed)

2.2.3.3 Behandlung mit

- einem zweiten Primärantikörper gegen CD 4

- einem zweiten Sekundärantikörper gegen den zweiten Primärantikörper

- einem zweiten Enzymkonjugat

- einem Chromogen zum Sichtbarmachen des Primär-/Sekundär-Antikörper

Komplexes

2.2.3.4 Eindecken

2.2.3.1

identisch mit 2.2.2.1

2.2.3.2

Nach der Demaskierung der Antigene durch die Vorbehandlung mit Hitze werden

die Präparate 10 min mit der Blocking Solution (10% Normal Rabbit Serum, Zymed

Laboratories Inc., South San Francisco/USA) behandelt. Es folgt die Inkubation mit

dem Primärantikörper gegen OPGL (Santa Cruz, Heidelberg, sc7627, goat

polyclonal) in einer Verdünnung von 1: 50. Nachdem der erste Primärantikörper

gegen OPGL bei einer Temperatur von ca. 4°C im Kühlschrank über Nacht in einer

Material und Methoden 32

mit TBS befeuchteten, lichtundurchlässigen Inkubationskammer mit dem Gewebe

reagieren konnte, wird der Überschuß mit Hilfe eines 3 x 2 minütigen

Waschvorganges in TBS von dem Gewebe entfernt. Es werden dann im nächsten

Schritt 100 µl Sekundärantikörper (Rabbit Anti-Goat IgG Biotin 81-1640, Zymed

Laboratories Inc., South San Francisco/USA) auf die Präparate gegeben und 15 min

abgedeckt inkubiert. Nach einem anschließenden Waschschritt (3x2 min TBS)

werden 100 µl Enzymkonjugat (HRP-Streptavidin, 43-4323, Zymed Laboratories

Inc., Verdünnung 1:150, South San Francisco/USA) auf das Präparat pipettiert. Das

Enzymkonjugat bindet an das Biotin des Sekundärantikörpers, und die daran

gekoppelte Peroxidase führt durch eine Reaktion mit dem Chromogen zur

Farbentwicklung. Nach dem Waschschritt (3 x 2 min TBS) werden als Chromogen

100 µl DAB, 3 min auf das Präparat gegeben. Nach erfolgter Farbentwicklung wird

das DAB mit TBS abgespült. Es folgt eine 30 minütige Inkubation mit einem Double-

Staining-Enhacer der Firma Zymed Laboratories Inc.

2.2.3.3

Der Double-Staining-Enhancer wird mit Aqua dest. abgespült und das Präparat

3x2 min in TBS gewaschen. Nach der 10 minütigen Behandlung mit Blocking

Solution wird im nächsten Schritt 100 µl des zweiten Primärantikörpers gegen CD 4

(Santa Cruz Biotech, Heidelberg, sc1440, goat polyclonal) in einer Verdünnung von

1:50 auf das Präparat gegeben und über Nacht bei 4°C im Kühlschrank inkubiert.

Am nächsten Tag erfolgt nach dem Waschschritt (3x2 min TBS) die Zugabe von 100

µl des Sekundärantikörpers Rabbit Anti-Goat IgG Biotin 81-1640 der Firma Zymed

Laboratories Inc., South San Francisco/USA. Das Präparat wird nach 15 min

Inkubation mit dem Sekundärantikörper und einem Waschschritt (3x2 min TBS) für

15 min mit 100µl des Enzymkonjugates (AP-Streptavidin, 43-4322, Zymed

Laboratories Inc., South San Francisco/USA) inkubiert. Es folgt ein Waschschritt

(3x2 min) und die Behandlung mit 100µl des Chromogens Fast Red (Anleitung

identisch mit 2.2.2.5).

2.2.3.4 siehe 2.2.2.5

Die Beschreibung der computergestützten, lichtmikroskopisch gewonnen

Ergebnisse des immunhistochemischen Teils der Arbeit erfolgt unter 3.2.

Ergebnisse 33

3. Ergebnisse

3.1 Molekularbiologischer Nachweis von OPGL und OPG Um mit Hilfe der PCR die Expression von Osteoprotegerin und dessen Ligand im

Cholesteatom nachweisen zu können, werden Primer verwendet, die zu einem

spezifischen PCR-Produkt bestimmter Basenlänge führen. Die Größe der bei der

PCR erzeugten Produkte und die Position der Primer innerhalb der spezifischen

mRNA-Sequenzen läßt sich anhand von Tabelle 11 entnehmen:

Tab. 11: Fragmentlängen der PCR-Produkte

Zur Positiv-Kontrolle der PCR wird ebenfalls β-Aktin amplifiziert. Sieht man in der

Gelelektrophorese eine fluoreszierende Bande bei 323 bp für OPG bzw. bei 556 bp

für OPGL, ist das Ergebnis positiv. Das bedeutet, dass anhand der cDNA, die aus

totaler RNA der Gehörgangshaut bzw. des Cholesteatoms synthetisiert wurde, die

Expression von OPG und OPGL nachzuweisen ist.

Primer Sequenz (5`-3`) Position Produktgröße

Sense-OPG

gctaacctcaccttcgag

Antisense-OPG tgattggacctggttacc

955-1279 324 bp

Sense-OPGL ctatttcagagcgcagatggat

Antisense-OPGL tatgagaacttgggattttgatgc

387-944 557 bp

Sense-β-Aktin

gcaagagaggcatcctcacc

Antisense-β-Aktin

gcacagcctggatagcaacg

219-459 240 bp

Ergebnisse 34

OPG-Nachweis im Cholesteatom

Die molekularbiologische Untersuchung zeigte bei allen acht untersuchten

Cholesteatomen verschiedener Patienten eine spezifische Bande bei 324

Basenpaaren. Damit wurde der codierende DNA-Abschnitt für OPG in allen acht

untersuchten Cholesteatomen nachgewiesen. Die Negativkontrollen waren

ausnahmslos negativ. Im folgenden sind die relevanten Gelabschnitte aus den

dokumentierten Bildern dargestellt:

Abb. 5 Cholesteatom 1 OPG Abb. 6 Cholesteatom 2 OPG

Banden: Banden: siehe links

1= DNA-Standard

2= β-Aktin

3= 324bp Produkt (OPG-Nachweis)

Ergebnisse 35

Abb. 7 Cholesteatom 3 OPG Abb. 8 Cholesteatom 4 OPG

Banden: Banden: siehe links

1= DNA-Standard

2= 324bp Produkt

Abb. 9 Cholesteatom 5 OPG Abb. 10 Cholesteatom 6 OPG

Banden: Banden: siehe links

1= DNA-Standard

2= 324bp Produkt

Ergebnisse 36

Abb. 11 Cholesteatom 7 OPG Abb. 12 Cholesteatom 8 OPG

Banden: Abb. 9 Banden: siehe Abb. 9

Ergebnisse 37

OPG Nachweis in Gehörgangshaut

In den fünf untersuchten Gehörgangshäuten ließ sich eine Bande bei ca. 324 bp

nachweisen. Damit wurde auch hier in allen untersuchten Proben ein Nachweis für

die Expression von OPG erbracht. In drei Fällen erscheinen die Banden relativ

schwach, sind aber dennoch als positiv zu werten. Die Negativkontrollen waren alle

negativ.

Abb. 13 Gehörgangshaut OPG

Banden:

1= DNA-Standard

2= 324bp Produkt

OPGL Nachweis im Cholesteatom

Das spezifische Amplikon, das für OPGL codiert, wurde in allen acht

Cholesteatomen nachgewiesen. Die folgenden Gelabschnitte zeigen in Tasche Nr. 1

den DNA-Standard und in Tasche Nr. 2 das 557bp lange PCR-Produkt für den

OPGL Nachweis.

Ergebnisse 38

Abb. 14 Cholesteatom 1 OPGL Abb. 15 Cholesteatom 2 OPGL

Banden: Banden: siehe Abb. 14

1= DNA-Standard

2= 557bp Produkt

Abb. 16 Cholesteatom 3 OPGL Abb. 17 Cholesteatom 4 OPGL

Banden: siehe Abb. 14 Banden: siehe Abb. 14

Ergebnisse 39

Abb. 18 Cholesteatom 5 OPGL Abb. 19 Cholesteatom 6 OPGL

Banden: Banden: siehe Abb. 18

1= DNA-Standard

2= 557bp Produkt

Abb. 20 Cholesteatom 7 OPGL Abb. 21 Cholesteatom 8 OPGL

Banden: siehe Abb. 18 Banden: siehe Abb. 18

Ergebnisse 40

OPGL Nachweis in Gehörgangshaut

In der Gehörgangshaut konnte in einem Fall eine stark positive Bande

(Gehörgangshaut 2), und in einem anderen Fall eine sehr schwach positive Bande

(Gehörgangshaut 3) detektiert werden. In drei weiteren Fällen war der Nachweis für

OPGL negativ. Auch hier zeigt die erste Tasche wie zuvor den DNA-Standard und

die zweite Tasche eine zu erwartende Bande bei 557bp. Bei negativen Proben ist in

der zweiten Tasche kein spezifisches PCR-Produkt nachzuweisen.

Abb. 22 Gehörgangshaut 1 OPGL Abb. 23 Gehörgangshaut 2

OPGL

Nachweis negativ Banden:

1= DNA-Standard

2= 557bp Produkt

Ergebnisse 41

Abb. 24 Gehörgangshaut 3 OPGL Abb. 25 Gehörgangshaut 4 OPGL

Banden: Nachweis negativ

1= DNA-Standard

2= 557bp Produkt

Abb. 26 Gehörgangshaut 5 OPGL

Nachweis negativ

Ergebnisse 42

Zusammenfassung der Ergebnisse

Die Abbildungen 27 und 28 zeigen einen Überblick über die Ergebnisse des

molekularbiologischen Teils:

0

1

2

3

4

5

6

7

8

positive

Proben

1 2

OPGL OPG

Abb. 27 Expression von OPGL (1) und OPG (2) im Cholesteatom (n=8)

0

1

2

3

4

5

positive

Proben

1 2

OPGL OPG

Abb. 28 Expression von OPGL (1) und OPG (2) in Gehörgangshaut (n=5)

Ergebnisse 43

3.2 Immunhistochemie CD 4, CD 68, OPG und OPGL sowie Doppelfärbung von CD 4 und OPGL

Die Ergebnisse der Immunhistochemie sind in Tabelle 12 zusammengefasst. Dabei

zeigt sich für alle angefärbten Antigene, mit der Ausnahme von OPG, eine stärkere

positive Reaktion in den Cholesteatomen als in den Gehörgangshautpräparaten:

Tab. 12 Ergebnisse der Immunhistochemie (Einzelfärbungen)

Epithel OPG OPGL CD4 CD68

Matrix + ++ ++ ++/+++

Perimatrix + ++ ++ ++/+++

Gehörgangshaut + + + +

+++ = stark positive Reaktion (> 75 % der Zellen positiv )

++ = positive Reaktion (zwischen 5 % - 75 % der Zellen positiv)

+ = schwach positive Reaktion (< 5 % der Zellen positiv)

0 = keine Reaktion

Die immunhistochemische Doppelfärbung zeigt eine Korrelation von OPGL und

CD4. Beide Antigene waren, wie in der Einzelfärbung zuvor auch, sowohl im

Cholesteatom als auch in der Gehörgangshaut nachweisbar. Im folgenden sollen

Teile der gewonnen Bilder gezeigt und erläutert werden.

Ergebnisse 44

Abb.29 Übersichtsaufnahme einer Hämtoxylin – Eosin Färbung (HE-Färbung) des

Cholesteatoms (Vergrößerung 100x)

Die Kerne in der Übersichtsaufnahme (Abb.29) sind blauschwarz bis violett,

cytoplasmatische Bestandteile rosa bis rot. Die Matrix des Cholesteatoms besteht

charakteristischer Weise aus Keratinozyten und abgeschilferten Bestandteilen der

Epidermis, sowohl der Gehörgangshaut als auch des Trommelfells. Die Perimatrix

besteht aus dem subepithelialen Bindegewebe mit meist entzündlichem Infiltrat. Sie

ist der Ort der Osteoklastendifferenzierung und des Knochenabbaus.

Ergebnisse 45

Abb.30 zeigt eine Färbung mit Antikörper gegen OPG in der Perimatrix des

Cholesteatoms (Vergrößerung 200x)

Es zeigen sich in der Abb.30 vereinzelt positive Reaktionen. Im oberen Teil des

Bildes zeigt sich eine stärkere cytoplasmatische Färbung als im unteren Teil.

Ergebnisse 46

Abb. 31 zeigt eine Färbung mit Antikörper gegen OPG in der Perimatrix des

Cholesteatoms (Vergrößerung 200x)

Im oberen rechten Abschnitt der Abb.31 sind Teile der Mittelohrmukosa zu sehen.

Eingebettet im entzündlichen Infiltrat aus Lymphozyten zeigt sich eine deutlich

positive Reaktion (siehe Pfeil) gegen OPG.

Abb. 32 zeigt die Negativkontrolle einer Färbung des Cholesteatoms mit Antikörper

gegen OPG. Markierung (1) zeigt die Matrix, Markierung (2) die Perimatrix

(Vergrößerung 100x)

Ergebnisse 47

Abb. 33 zeigt Färbung eines Gehörgangshautpräparates mit Antikörper gegen

OPG Markierung (1) Stratum corneum, (3) Stratum papillare, (4) Stratum reticulare,

(5) subepitheliale Kapillargefäße (Vergrößerung 100x)

In der Abb.33 ist die vitale Epidermis (2) als deutlich positiv zu werten. Die

Kollagenbündel im Korium sind unspezifisch angefärbt.

Ergebnisse 48

Abb. 34 zeigt die Färbung eines Gehörgangshautpräparates mit Antikörper gegen

OPG (Vergrößerung 100x)

Die vitale Epidermis und das Stratum corneum mit den Keratinozyten der Abb. 34

sind positiv (1+2). Das Stratum basale (3) ist etwas schwächer angefärbt. Im

Stratum papillare (4) zeigen sich neben den Lymphozyten und Makrophagen

positive Reaktionen.

Ergebnisse 49

Abb. 35 zeigt die Färbung eines Cholesteatompräparates mit Antikörper gegen

OPGL (Vergrößerung 200x)

In der Matrix (obere Pfeile) und im darunter liegenden epithelialen Gewebe (1) der

Abb. zeigen sich cytoplasmatische positive Reaktionen. In der Perimatrix (2) des

Cholesteatoms sind positive Reaktionen (untere Pfeile) zu beobachten.

Ergebnisse 50

Abb. 36 zeigt die Färbung eines Cholesteatompräparates mit Antikörper gegen

OPGL (Vergrößerung 200x)

In diesem Ausschnitt (Abb.36) aus der Perimatrix des Cholesteatoms zeigt sich ein

starkes entzündliches Infiltrat mit zahlreichen Makrophagen. Es sind deutlich

positive Reaktionen (braun) zu erkennen.

Abb. 37 zeigt die Negativkontrolle einer Färbung des Cholesteatoms mit Antikörper

gegen OPGL; Markierung (1) zeigt die Matrix, Markierung (2) die Perimatrix

(Vergrößerung 200x)

Ergebnisse 51

Abb. 38 zeigt die Färbung eines Cholesteatompräparates mit Antikörper gegen

CD4 (Vergrößerung 200x)

Die Färbung der Matrix in der Abb. 38 ist als unspezifisch zu werten. Das Epithel (2)

und das subepitheliale Bindegewebe (3) bilden die Perimatrix des Cholesteatom in

der zahlreiche CD4 positive Zellen beobachtet werden können.

Ergebnisse 52

Abb. 39 zeigt die Färbung eines Cholesteatompräparates mit Antikörper gegen

CD4; in diesem Ausschnitt aus der Perimatrix sind deutlich positive Reaktionen

gegen CD4 zu erkennen (Vergrößerung 400x)

.

Abb. 40 zeigt die Negativkontrolle einer Färbung des Cholesteatoms mit Antikörper

gegen CD4; Markierung (1) zeigt die Matrix, Markierung (2) die Perimatrix

(Vergrößerung 100x)

Ergebnisse 53

Abb. 41 zeigt die Färbung eines Gehörgangshautpräparates mit Antikörper gegen

CD4 (Vergrößerung 100x)

Das Stratum corneum (1) in der Abb. 41 zeigt eine unspezifische Färbung. Die vitale

Epidermis (2), das Stratum basale (3) sowie das Stratum papillare (4) zeigen

positive Reaktionen (Pfeile).

Abb. 42 zeigt die Färbung eines Cholesteatompräparates mit Antikörper gegen

CD68 (Vergrößerung 200x)

Die Matrix (1) in der Abb.42 ist negativ. Die Perimatrix (2) zeigt ein starkes

entzündliches Rundzellinfiltrat. Viele der beobachtbaren Makropahgen sind CD68

positiv (Pfeile).

Ergebnisse 54

Abb. 43 zeigt die Färbung eines Cholesteatompräparates mit Antikörper gegen

CD68 (Vergrößerung 400x)

Die Perimatrix (1) des Cholesteatoms (Abb.43) zeigt eine eventuell unspezifische,

cytoplasmatische Anfärbung. Der subepitheliale Bereich hingegen zeigt deutlich

positive, dunkelbraune Reaktionen (Pfeile).

Abb. 44 zeigt die Negativkontrolle einer Färbung des Cholesteatoms mit Antikörper

gegen CD68; Markierung (1) zeigt die Matrix, Markierung (2) die Perimatrix

(Vergrößerung 400x)

Ergebnisse 55

Abb. 45 zeigt die Färbung eines Gehörgangshautpräparates mit Antikörper gegen

CD68. Das Stratum corneum (1) zeigt eine unspezifische Färbung. Positive

Reaktionen sind im Stratum basale der vitalen Epidermis (2) sowie im Stratum

papillare (3) zu beobachten. (Vergrößerung 200x)

Ergebnisse 56

Abb. 46 zeigt die Doppelfärbung eines Cholesteatompräparates mit Antikörper

gegen CD4 und OPGL (Vergrößerung 400x)

Der vorliegende Ausschnitt aus der Perimatrix des Cholesteatoms (Abb.46) zeigt ein

starkes entzündliches Infiltrat. Es lassen sich Zellen nachweisen die nur eine

positive Reaktion gegen OPGL (1) oder nur gegen CD4 (2) zeigen. Ein grosser Teil

der Makrophagen zeigt jedoch eine doppelt positive Reaktion sowohl gegen OPGL

als auch gegen CD4 (3).

Ergebnisse 57

Abb. 47 zeigt die Negativkontrolle der Doppelfärbung des Cholesteatoms mit

Antikörper gegen CD4 und OPGL (Vergrößerung 200x)

Abb. 48 zeigt die Doppelfärbung eines Gehörgangshautpräparates mit Antikörper

gegen CD4 und OPGL (Vergrößerung 100x)

Die vitale Epidermis (1) in der Abb. 48 zeigt CD4 positive Reaktionen. Das Stratum

papillare ist nur vereinzelt positiv für CD4 bzw. OPGL. Eine Co-Expression wie in

der Perimatrix des Cholesteatoms lässt sich nicht beobachten.

Diskussion 58

4. Diskussion

Die Pathogenese des Cholesteatoms ist seit mehreren Jahren Gegenstand

kontroverser Diskussionen und kann zur Zeit noch nicht als eindeutig aufgeklärt

bezeichnet werden. In Anbetracht der Tatsache, dass ein großer Teil der

chronischen Mittelohrentzündungen Cholesteatome sind oder sich zu solchen

enwickeln, ist es von epidemiologischer Bedeutung durch das Entschlüsseln der

Pathogenese des Cholesteatoms, einschliesslich seiner Komplikationen, mögliche,

die Operation unterstützende Therapieformen zu entwickeln.

Als eine der bekannten Hauptkomplikationen des voranschreitenden Cholesteatoms

kann es zu einer knöchernen Destruktion des Mittel- und Innenohres mit potentiell

lebensbedrohlichen, intracraniellen Komplikationen kommen. Dabei stellt sich die

Frage, wie das Cholesteatom zu einem Knochenabbau führen kann. Der direkte

Mechanismus und seine Steuerung sind ebenfalls Bestandteil aktueller Diskussion.

Hierzu einige Vorbemerkungen:

Knochen Auf-, Ab- und Umbau sind Prozesse, die je nach Ausprägung sowohl

physiologischen als auch pathologischen Charakter annehmen können. Ein

physiologischer Knochen Auf- und Umbau beinhaltet die Synthese der

Knochenmatrix sowohl durch Osteoblasten als auch die Resorption von Knochen

durch Osteoklasten. Kommt es zu einem pathologischen Knochenabbau, ist das

Verhältnis von Synthese der Knochenmatrix durch Osteoblasten zur Resorption des

Knochens durch Osteoklasten zugunsten der Resorptionsvorgänge verschoben. Im

Rahmen des Cholesteatoms lässt sich dann eine knöcherne Destruktion

morphologisch beschreiben, welche die Gehörknöchelchenkette und andere

knöcherner Bestandteile des Mittel- und Innenohres betreffen kann.

Fest steht, dass als direkte nachgewiesene Ursache für die knöchernen

Destruktionen nur eine einzige Zelle im menschlichen Körper verantwortlich

gemacht werden kann: der Osteoklast. Sein genauer Aktivierungs- und

Kontrollmechanismus ist im Rahmen des Cholesteatoms jedoch auch noch nicht

eindeutig geklärt. Neben einer cytokinbedingten Aktivierung von Osteoklasten

wurden in der Vergangenheit mehrere verschiedene Faktoren als Auslöser für die

Aktivierung von Osteoklasten und dem damit verbundenen Knochenabbau diskutiert

(35,47), die im folgenden in groben Zügen dargestellt werden sollen.

Diskussion 59

Bedingt durch den Verlust der Kontaktinhibierung der Keratinozyten des

Trommelfells und des Gehörgangsepithels kommt es zu einer fortschreitenden

Akkumulation von Keratinozyten in eine Retraktionstasche des Trommelfells. Diese

progrediente Ansammlung von Keratinozyten führt zu einer lokalen Expansion des

Cholesteatoms und damit verbunden zu einer Druckerhöhung. Dies führte zu der

Annahme, dass der erhöhte Druck als Auslöser für die Osteoklastenaktivierung

verantwortlich zu machen sei (21,55). Orisek und Chole zeigten, dass der durch das

Cholesteatom bedingte Druckanstieg zwischen 1.3 und 11,9 mm Hg und damit unter

dem kapillären Perfusionsdruck von 25mm Hg liegt (35). Damit stellte sich die

druckbedingte Aktivierung von Osteoklasten als unwahrscheinlich heraus. Durch

eine sekundäre Infektion des Cholesteatoms und des umliegenden Gewebes kann

es zu einer Produktion sowohl bakterieller Endotoxine als auch zu einer Erhöhung

von Enzymen wie z.B. Kollagenasen und sauren Hydrolasen durch das umliegende

entzündliche Gewebe kommen (33). Zelluläre Faktoren wie Cytokine und

Wachstumsfaktoren sind demnach nicht als einziger Auslöser der

Osteoklastenaktivierung zu sehen, scheinen jedoch eine der wichtigsten Rollen zu

übernehmen. Dabei ist der folgende grundsätzliche Ansatz weitläufig akzeptiert:

Durch die Migration von Keratinozyten in eine Retraktionstasche des Trommelfells

kommt es zu einer, das Cholesteatom begleitenden, entzündlichen Reaktion des

subepithelialen Bindegewebes. In der sich bildenden Perimatrix führt dies zu einer

erhöhten Konzentration von Cytokinen, welche die Osteoklasten-Aktivierung und -

Differenzierung entscheidend beeinflussen.

Dies ist insofern von herausragender Bedeutung, da Osteoklasten die einzigen

Zellen im menschlichen Körper sind, welche die Fähigkeit besitzen, Knochen

abzubauen, und es sich hierbei um eine direkten Aktivierungsmechanismus gerade

dieser Zellen handelt. Sie werden direkt für den Knochenabbau im Rahmen des

Cholesteatoms verantwortlich gemacht und stellen ein morphologisches Substrat

dar, dass den beobachteten Knochendestruktionen zugeordnet werden kann.

Es wurde in dieser Arbeit daher ein Augenmerk auf das Vorhandensein der

Osteoklasten- Vorläuferzellen, die aus der Monozytenmakrophagenzelllinie

stammen, sowie auf den Aktivierungsprozeß adulter Osteoklasten gelegt. Beides

sind essentielle Vorraussetzungen bzw. Bestandteile der

Osteoklastendifferenzierung und -steuerung. Hierzu wurden zur genaueren

Beschreibung des Vorhandenseins und der Verteilung von Osteoklasten-

Diskussion 60

Vorläuferzellen, die mit Makrophagen assoziierten Antigene CD4 und CD68

immunhistochemisch untersucht. Es zeigte sich dabei, dass sich beim Cholesteatom

in den untersuchten 15 Präparaten CD4 positive Reaktionen nachweisen ließen

(5% - 75% der Zellen positiv). Die Gehörgangshäute wiesen im Vergleich nur eine

schwach positive Reaktion (unter 5% der Zellen positiv) auf.

Bei dem immunhistochemischen Nachweis von CD68 war der Unterschied zwischen

den Cholesteatom- und den Gehörgangshautpräparaten noch eindeutiger. Im

Vergleich zur Gehörgangshaut ließen sich hier Cholesteatom-Präparate mit stark

positiven Reaktionen (über 75% positive Zellen) beobachten (siehe Abb.42). Damit

konnte das Vorhandensein von Osteoklastenvorläuferzellen eindeutig

nachgewiesen werden. Das Epithel zeigt zwar vereinzelt positive Reaktionen, in der

Mehrheit sind diese jedoch im subepithelialen Bindegewebe zu beobachten (siehe

Abb.43). Dieses Ergebnis war zu erwarten, da das subepitheliale Bindegewebe Ort

des entzündlichen Geschehens ist.

In den untersuchten immunhistochemischen Cholesteatomschnitten ist das

subepitheliale Bindegewebe also der Ort mit dem stärksten entzündlichen Infiltrat.

Dies deckt sich mit den Beobachtungen von Negri et al., die eine verstärkte

Konzentration von aktivierten Makrophagen und T- Zellen im Cholesteatom

beschrieben haben (34).

Makrophagen und aktivierte T-Zellen spielen bekanntlich eine bedeutende Rolle im

Immunsystem des Menschen. Neben der eigenen Körperabwehr nehmen sie auch

eine Schlüsselposition in Entzündungsprozessen ein. Makrophagen haben dabei

vielfältige Funktionen, wie z.B. einen großen Teil der immunologischen Antwort auf

fremde Substanzen, die Produktion von Cytokinen im Rahmen der Entzündung,

sowie die Phagozytose und die anschließende Präsentation von Antigenen.

Dadurch werden sie zu zentralen Zellen der immunologischen Antwort auf

eingewanderte Keratinozyten im Mittelohr (52).

Die immunhistochemische Untersuchung zeigt, dass es sich aufgrund der stärkeren

Anfärbung der makrophagenassoziierten Antigene CD4 und CD68 beim

Cholesteatom um einen Entzündungsprozess mit einer eindrucksvollen Erhöhung

der Makrophagendichte handelt. Da Makrophagen die Osteoklasten-Vorläuferzellen

darstellen, lässt sich aufgrund der Ergebnisse im Cholesteatom eine erhöhte Anzahl

von Osteoklasten erwarten. Darüber lässt sich jedoch, bedingt durch die

Diskussion 61

verwendeten Antikörper, keine Aussage treffen, da CD4 und CD68 keine

spezifischen Osteoklasten-Marker sind.

Sowohl unter physiologischen, als auch unter pathologischen Bedingungen, sind für

die Osteoklastogenese einige wichtige Voraussetzungen zu erfüllen. Eine dieser

wichtigen Voraussetzungen ist die Zell-Zell-Interaktion zwischen den

Bindegewebszellen beziehungsweise Osteoblasten und den Osteoklasten-

Vorläuferzellen, die zu der sogenannten parakrinen Stimulation führt (12). Die Liste

der Osteoklasten-steuernden Faktoren ist lang. Man zählt neben Prostaglandinen,

Glucokortikoiden, Parathormon, Vitamin D, Endothelinen, Il-1, Il-6, Hepatocyte

Growth Factor (HGF), Tumor Nekrose Faktor (TNF), Transformig Growth Factor β

(TGFβ) auch das in dieser Arbeit untersuchte Osteoprotegerinligand (OPGL) und

sein Rezeptor Osteoprotegerin (OPG) dazu (12).

Osteoblasten und T-Zellen antworten auf die entzündungsspezifischen Zytokine (Il-

1, Il-1l, Il-6, TNF-α, TNF-β, Interferon-γ) mit einer verstärkten Expression von

Osteoprotegerinligand (OPGL), eines membranständigen Proteins aus der Tumor-

Nekrose- Faktor-Familie (TNF), dass im Rahmen des Stoffwechsels von

Osteoklasten zu den Faktoren mit dem stärksten aktivierenden Potential zählt und

als essentiell für die Osteoklastogenese einzustufen ist (24). OPGL ist sowohl ein

Schlüsselmolekül im Rahmen der Differenzierung von Osteoklasten-Vorläuferzellen

(Makrophagen) zu Osteoklasten, als auch in der Aktivierung von adulten

Osteoklasten. Um den Aktivierungsprozeß adulter Osteoklasten zu untersuchen,

wurde hierzu der immunhistochemische Nachweis dieses Schlüsselmoleküls der

Osteoklastogenese erbracht.

Es ließ sich im Cholesteatom eine stark positive Reaktion von OPGL sowohl in der

Matrix, als auch in der entzündlichen Perimatrix beobachten. In der Gehörgangshaut

zeigte sich hingegen nur eine schwach positive Reaktion. Diese Ergebnisse der

Immunhistochemie decken sich mit den molekularbiologischen Nachweisen von

OPGL. Der molekularbiologische Nachweis der Expression von OPGL wurde

ebenfalls sowohl im Cholesteatom, als auch in der Gehörgangshaut vorgenommen.

In allen acht untersuchten Cholesteatomen konnte dabei ein eindeutiger Nachweis

der Expression von OPGL geführt werden. In Anbetracht der Tatsache, dass es sich

beim Cholesteatom um ein stark entzündliches Gewebe handelt, wurde dieses

Ergebnis aufgrund der damit verbundenen erhöhten T-Zell Konzentration auch

erwartet.

Diskussion 62

Anders hingegen sieht es in den untersuchten Proben der Gehörgangshaut aus.

Hier konnte nur bei einer von fünf untersuchten Gehörgangshäuten eine eindeutig

positive (Gehörgangshaut 2) bzw. in einer weiteren Probe nur ein schwach positives

Ergebnis (Gehörgangshaut 3) des Nachweises der Expression von OPGL erzielt

werden.

Der sich immunhistochemisch als schwach und molekularbiologisch als schwierig

herausgestellte Nachweis von OPGL in der Gehörgangshaut ist mit dem Fehlen

einer entzündungsbedingten Aktivierung der Expression von OPGL in Osteoblasten

und in aktivierten T-Zellen zu erklären. Unter regelrechten physiologischen

Bedingungen kommt es daher nur zur einer geringen Freisetzung von OPGL in der

Gehörgangshaut.

Die Ergebnisse der Doppelfärbung von CD4 und OPGL bestätigen, dass OPGL von

den CD4 positiven T-Helfer Zellen in der Perimatrix des Cholesteatoms produziert

wird. Damit sind in der Perimatrix des Cholesteatoms gute Vorraussetzungen für die

entzündungsbedingte verstärkte Aktivierung von adulten Osteoklasten bzw. für die

Differenzierung von Makrophagen zu multinukleären Osteoklasten gegeben. Hiermit

ist ein direkter Zusammenhang zwischen entzündungsbedingter Aktivierung und

potentieller Knochendestruktion durch Osteoklasten gegeben. Es wurde damit

erstmalig eine Co-Expression von CD4 und OPGL in der Perimatrix des

Cholesteatoms beschrieben. Es ist aufgrund dieser Beobachtungen nachgewiesen,

dass es im Cholesteatom zu einer verstärkten OPGL Expression durch aktivierte T-

Zellen kommt. Das Konzept einer tumor- oder entzündungsbedingten Aktivierung

von adulten Osteoklasten bzw. Differenzierung von Makrophagen zu Osteoklasten

wurde bereits für andere Erkrankungen, die zu Knochenabbau führen können,

entwickelt und ist hiermit in Einklang zu bringen (37). Zusammenfassend lässt sich

zu OPGL sagen, dass das Vorhandensein im Cholesteatom einen wichtigen

Hinweis für die Osteoklasten-Aktivierung und der damit einhergehenden

knochendestruierenden Potenz des Cholesteatoms liefert. Dies kann ein wichtiger

Ansatzpunkt weiterer Untersuchungen zum Knochenabbau im Cholesteatom sein.

Osteoprotegerin (OPG) ist ein löslicher TNF-Rezeptor und physiologischer Inhibitor

der Knochenresoprtion und wird auch als „osteoclastogenesis inhibitory factor„

(OCIF) bezeichnet.

Diskussion 63

Die Untersuchungen des Osteoprotegerin (OPG), dem Gegenspieler von

Osteoprotegerinligand (OPGL), kommen zu folgenden Ergebnissen:

Der Nachweis der Expression von OPG mit Hilfe der RT-PCR war in allen

untersuchten Cholesteatomen und Gehörgangshäuten positiv.

Diese gewonnenen Ergebnisse decken sich mit den Ergebnissen der

immmunhistochemischen Untersuchung. OPG kann sowohl im Cholesteatom als

auch in der Gehörgangshaut eindeutig nachgewiesen werden. OPG lässt sich

immunhistochemisch in der Gehörgangshaut jedoch stärker anfärben als im

Cholesteatom. Das Osteoklasten aktivierende OPGL hingegen zeigte sich im

Cholesteatom stärker positiv als in den untersuchten Gehörgangshäuten. Dies

untersützt die These, dass das entzündliche Infiltrat in der Perimatrix des

Cholesteatoms zu einer verstärkten Produktion von OPGL führt, und es gleichzeitig

zu einer verringerten Expression von OPG kommt.

Durch das Verwenden einer hochsensitiven und spezifischen Methode, der

Polymerase-Ketten-Reaktion, kann den Ergebnissen der Untersuchung der

Expression von OPG und OPGL eine hohe Validität zugesprochen werden. Ein

falsch positives Ergebnis durch eine Kontamination mit Fremd-DNA ist prinzipiell

möglich, aber als sehr unwahrscheinlich einzuschätzen. Dieselbe Aussage gilt auch

für falsch negative Ergebnisse, da es mit Hilfe der PCR möglich ist, bereits aus einer

sehr geringen Menge Ausgangs-DNA eine Aussage über die Expression eines

Faktors zu machen. Nach den erfolgten qualitativen Nachweisen sowohl im

Cholesteatom als auch in der Gehörgangshaut kann man in einem quantitativen

Verfahren z.B. durch eine quantitative PCR oder Northern-Blot-Experiment die

Stärke der Expression von OPG und OPGL vergleichen.

Letztendlich ist das progressive Wachstumsverhalten des Cholesteatoms mit den

beschriebenen Knochenarrosionen sicherlich ein multifaktorielles Geschehen und

nicht einzig und allein mit dem Vorhandensein der beobachteten erhöhten

Makrophagen-Dichte oder Osteoklasten-differenzierender Zytokine zu erklären.

Dennoch zeigen sich hier wichtige Hinweise auf ein von Kong enwickeltes Konzept

der Knochendestruktion, dass uns von der entzündlichen Polyarthritis bekannt ist

(23) :

Diskussion 64

Eine das Cholesteatom begleitende, entzündliche Reaktion führt zu einer

verstärkten Produktion von OPGL durch entzündungsbedingt aktivierte T-Zellen.

Diese Reaktion ist mitverantwortlich für eine verstärkte Osteoklastogenese und

einem Knochenabbau durch Osteoklasten. Kong et al. haben weiterhin gezeigt,

dass Mäuse mit einem ausgeschalteten OPGL-Gen eine starke Osteopetrose sowie

Störungen der Odontogenese zeigen. Daher kann eine weitere Erforschung des

Osteoklasten aktivierenden Systems zur Entwicklung einer unterstützenden

medikamentösen Therapie in Form von Osteoklasten hemmenden Substanzen z.B.

in Form eines OPGL Antagonisten führen. Neben der Operation würde dies zu einer

ergänzenden möglichen Therapieform führen, welche eventuell zu einer Hemmung

der Osteoklastenproliferation und damit des Knochenabbaus im Rahmen des

Cholesteatoms führt.

Zusammenfassung 65

5. Zusammenfassung

Das Cholesteatom ist ein chronisch entzündlicher Prozeß im Mittelohr. Eine

begleitende, entzündungsbedingte Aktivierung von Osteoklasten kann zu einer

Resorption von Gehörknöchelchen und knöchernen Bestandteilen des Mittelohres

mit zum Teil lebensbedrohlichen Komplikationen führen. Der Prozess der

Knochenresorption ist noch nicht eindeutig geklärt. Ein Hauptdifferenzierungs- und

Aktivierungsfaktor der Osteoklasten, die für den Knochenabbau verantwortlich sind,

ist das Osteprotegerin-Ligand (OPGL). OPGL ist ein von aktivierten T-Zellen und

Osteoblasten exprimiertes, membranständiges Molekül, was sowohl eine

stimulierende Wirkung auf die Osteoklastogenese als auch auf die

Knochenresorptionsaktivität von Osteoklasten besitzt. Sein Gegenspieler ist das

Osteoprotegerin (OPG), ein nicht membranständiges, ebenfalls von Osteoblasten

und aktivierten T-Zellen produziertes Molekül. Es bindet sich an OPGL und hemmt

damit die Aktivierung der Osteoklasten. Sowohl OPG als auch OPGL konnten in der

Gehörgangshaut und im Cholesteatomgewebe mit Hilfe einer RT-PCR

nachgewiesen werden. Damit ist nach dem erfolgten qualitativen Nachweis dieser

beiden wichtigen Faktoren die Grundlage für weitere quantitative

Nachweisverfahren gegeben.

In den immunhistochemischen Untersuchungen zeigte sich in der Perimatrix des

Cholesteatoms eine erhöhte Anfärbbarkeit sowohl für OPGL als auch für die

makrophagenassoziierten Antigene CD4 und CD68. Die Makrophagendichte im

Cholesteatom ist im Vergleich zur Gehörgangshaut deutlich erhöht. OPG hingegen

war im Cholesteatom schwächer anfärbbar als in der Gehörgangshaut.

In einer immunhistochemischen Doppelfärbung zeigt sich sowohl in der Matrix als

auch in der Perimatrix der Cholesteatomproben ein Vorhandensein von gleichzeitig

CD4 und OPGL positiven Zellen. Dies deutet auf eine Co-Expression von CD4 und

OPGL hin. Verantwortlich dafür sind durch die Entzündung aktivierte T-Zellen, die

mit einer verstärkten Produktion von OPGL auf die Entzündung reagieren. Eine

erhöhte OPGL-Konzentration kann dann in einer ausgeprägten Aktivierung von

Osteoklasten resultieren, was einen verstärkten Knochenabbau zur Folge haben

kann. Die Ergebnisse der Arbeit unterstützen ein Konzept, dass bereits für die

entzündliche Arthritis formuliert wurde:

Zusammenfassung 66

Die das Cholesteatom begleitende Entzündung führt zu einer erhöhten Freisetzung

von OPGL durch aktivierte T-Zellen. Dies ist ein wichtiger Faktor in der Aktivierung

und Differenzierung von Osteoklasten. Daher könnte neben der Operation die

medikamentöse Inhibierung von OPGL zu einer möglichen begleitenden

Therapieform führen.

Anhang 67

6.Anhang Im folgenden sind die mRNA-Sequenzen von humanem OPGL und OPG

dargestellt. Die für die PCR verwendeten Primersequenzen sind markiert.

Quelle : National Center for Biotechnology Information (NCBI)

humanes Osteoprotegerin Ligand (OPGL):

-Anfang-

1 aagcttggta ccgagctcgg atccactact cgacccacgc gtccgcgcgc cccaggagcc

61 aaagccgggc tccaagtcgg cgccccacgt cgaggctccg ccgcagcctc cggagttggc

121 cgcagacaag aaggggaggg agcgggagag ggaggagagc tccgaagcga gagggccgag

181 cgccatgcgc cgcgccagca gagactacac caagtacctg cgtggctcgg aggagatggg

241 cggcggcccc ggagccccgc acgagggccc cctgcacgcc ccgccgccgc ctgcgccgca

301 ccagcccccc gccgcctccc gctccatgtt cgtggccctc ctggggctgg ggctgggcca

361 ggttgtctgc agcgtcgccc tgttcttcta tttcagagcg cagatggatc ctaatagaat

421 atcagaagat ggcactcact gcatttatag aattttgaga ctccatgaaa atgcagattt

481 tcaagacaca actctggaga gtcaagatac aaaattaata cctgattcat gtaggagaat

541 taaacaggcc tttcaaggag ctgtgcaaaa ggaattacaa catatcgttg gatcacagca

601 catcagagca gagaaagcga tggtggatgg ctcatggtta gatctggcca agaggagcaa

661 gcttgaagct cagccttttg ctcatctcac tattaatgcc accgacatcc catctggttc

721 ccataaagtg agtctgtcct cttggtacca tgatcggggt tgggccaaga tctccaacat

781 gacttttagc aatggaaaac taatagttaa tcaggatggc ttttattacc tgtatgccaa

841 catttgcttt cgacatcatg aaacttcagg agacctagct acagagtatc ttcaactaat

901 ggtgtacgtc actaaaacca gcatcaaaat cccaagttct cataccctga tgaaaggagg

961 aagcaccaag tattggtcag ggaattctga attccatttt tattccataa acgttggtgg

1021 attttttaag ttacggtctg gagaggaaat cagcatcgag gtctccaacc cctccttact

1081 ggatccggat caggatgcaa catactttgg ggcttttaaa gttcgagata tagattgagc

1141 cccagttttt ggagtgttat gtatttcctg gatgtttgga aacatttttt aaaacaagcc

1201 aagaaagatg tatataggtg tgtgagacta ctaagaggca tggccccaac ggtacacgac

1261 tcagtatcca tgctcttgac cttgtagaga acacgcgtat ttacagccag tgggagatgt

1321 tagactcatg gtgtgttaca caatggtttt taaattttgt aatgaattcc tagaattaaa

1381 ccagattgga gcaattacgg gttgacctta tgagaaactg catgtgggct atgggagggg

1441 ttggtccctg gtcatgtgcc ccttcgcagc tgaagtggag agggtgtcat ctagcgcaat

1501 tgaaggatca tctgaagggg caaattcttt tgaattgtta catcatgctg gaacctgcaa

1561 aaaatacttt ttctaatgag gagagaaaat atatgtattt ttatataata tctaaagtta

Anhang 68

1621 tatttcagat gtaatgtttt ctttgcaaag tattgtaaat tatatttgtg ctatagtatt

1681 tgattcaaaa tatttaaaaa tgtcttgctg ttgacatatt taatgtttta aatgtacaga

1741 catatttaac tggtgcactt tgtaaattcc ctggggaaaa cttgcagcta aggaggggaa

1801 aaaaatgttg tttcctaata tcaaatgcag tatatttctt cgttcttttt aagttaatag

1861 attttttcag acttgtcaag cctgtgcaaa aaaattaaaa tggatgcctt gaataataag

1921 caggatgttg gccaccaggt gcctttcaaa tttagaaact aattgacttt agaaagctga

1981 cattgccaaa aaggatacat aatgggccac tgaaatctgt caagagtagt tatataattg

2041 ttgaacaggt gtttttccac aagtgccgca aattgtacct tttttttttt ttcaaaatag

2101 aaaagttatt agtggtttat cagcaaaaaa gtccaatttt aatttagtaa atgttatctt

2161 atactgtaca ataaaaacat tgcctttgaa tgttaatttt ttggtacaaa aataaattta

2221 tatgaaaaaa aaaaaaaaag ggcggccgct ctagagggcc ctattctata g

-Ende-

humanes Osteoprotegerin (OPG) :

-Anfang-

1 gtatatataa cgtgatgagc gtacgggtgc ggagacgcac cggagcgctc gcccagccgc

61 cgyctccaag cccctgaggt ttccggggac cacaatgaac aagttgctgt gctgcgcgct

121 cgtgtttctg gacatctcca ttaagtggac cacccaggaa acgtttcctc caaagtacct

181 tcattatgac gaagaaacct ctcatcagct gttgtgtgac aaatgtcctc ctggtaccta

241 cctaaaacaa cactgtacag caaagtggaa gaccgtgtgc gccccttgcc ctgaccacta

301 ctacacagac agctggcaca ccagtgacga gtgtctatac tgcagccccg tgtgcaagga

361 gctgcagtac gtcaagcagg agtgcaatcg cacccacaac cgcgtgtgcg aatgcaagga

421 agggcgctac cttgagatag agttctgctt gaaacatagg agctgccctc ctggatttgg

481 agtggtgcaa gctggaaccc cagagcgaaa tacagtttgc aaaagatgtc cagatgggtt

541 cttctcaaat gagacgtcat ctaaagcacc ctgtagaaaa cacacaaatt gcagtgtctt

601 tggtctcctg ctaactcaga aaggaaatgc aacacacgac aacatatgtt ccggaaacag

661 tgaatcaact caaaaatgtg gaatagatgt taccctgtgt gaggaggcat tcttcaggtt

721 tgctgttcct acaaagttta cgcctaactg gcttagtgtc ttggtagaca atttgcctgg

781 caccaaagta aacgcagaga gtgtagagag gataaaacgg caacacagct cacaagaaca

841 gactttccag ctgctgaagt tatggaaaca tcaaaacaaa gcccaagata tagtcaagaa

901 gatcatccaa gatattgacc tctgtgaaaa cagcgtgcag cggcacattg gacatgctaa

961 cctcaccttc gagcagcttc gtagcttgat ggaaagctta ccgggaaaga aagtgggagc

1021 agaagacatt gaaaaaacaa taaaggcatg caaacccagt gaccagatcc tgaagctgct

1081 cagtttgtgg cgaataaaaa atggcgacca agacaccttg aagggcctaa tgcacgcact

Anhang 69

1141 aaagcactca aagacgtacc actttcccaa aactgtcact cagagtctaa agaagaccat

1201 caggttcctt cacagcttca caatgtacaa attgtatcag aagttatttt tagaaatgat

1261 aggtaaccag gtccaatcag taaaaataag ctgcttataa ctggaaatgg ccattgagct

1321 gtttcctcac aattggcgag atcccatgga tgataa -Ende-

Literatur 70

7. Literatur 1) Albino, AP, Kimmelman CP, Parisier SC. Cholesteatoma: a molecular and cellular puzzle. Am J Otol 1998, 19(1), 7-19. 2) Allison, JP, Havran WL. The immunbiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Ann Rev Immunol 1991, 9, 679-705. 3) Amling, M, Delling G. Osteoklastenbiologie Bedeutung im Rahmen von Knochenmetastasen. Orthopäde 1998, 27, 214-223. 4) Arthos, J, Deen KC, Chaikin MA, Fornwald JA, Sathe G, Sattentau QJ, Clapham PR, Weiss RA, McDougal JS, Pietropaolo C. Identification of the residues in human CD4 critical for the binding of HIV. Cell 1989, 57, 469-481. 5) Canalis, RF, Lambert PR. The Ear Comprehensive Otology. Philadelphia, Lippincott Wiliams & Wilkins, 1999. 6) Chambers, TJ. Regulation of the differentiation and function of osteoclasts. J Pathol 2000, 192(1), 4-13. 7) Ehrich, EW, Devaux B, Rock EP, Jorgensen JL, Davis MN, Chien YH. T cell receptor interaction with peptide/major histocompatibility complex (MHC) and superantigen/MHC ligands is dominated by antigen. J Exp Med 1993, 178, 713-722. 8) Fixe, P, Praloran V. M-CSF: haematopoietic growth factor or inflammatory cytokine? Cytokin 1998, 10(1), 32-7. 9) Flanagan, AM, Lader CS. Update on the biologic effects of macrophage colony-stimulating factor. Curr Opin Hematol 1998, 5(3), 181-185. 10) Friedmann, I, Arnold W. Pathology of the Ear. London, Churchill & Livingstone, 1993. 11) Fukuda, M. Lysosomal membrane glycoproteins. Structure, biosynthesis, and intracellular trafficking. J Biol Chem 1991, 266, 21327-21330.

Literatur 71

12) Greenfield, EM, Bi Y, Miyauchi A. Regulation of osteoclast activity. Life sci 1999, 65(11), 1087-1102. 13) Hall, TJ, Chambers TJ. Molecular aspects of osteoclast function. Inflamm Res 1996, 45(1), 1-9. 14) Hayashi, S, Yamane T, Miyamoto A, Hemmi H, Tagaya H, Tanio Y, Kanda H, Yamazaki H, Kunisada T. Commitment and differentiation of stem cells to the osteoclast lineage. Biochem Cell Biol 1998, 76(6), 911-22. 15) Healy, D, Dianda L, Moore JP, McDougal JS, Moore MJ, Estess P, Buck D, Kwong PD, Beverley PC, Sattentau QJ. Novel anti-CD4 monoclonal antibodies separate human immunodeficiency virus infection and fusion of CD4+ cells from virus binding. J Exp Med 1990, 172, 1233-1242. 16) Hofbauer, LC, Heufelder AE. Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology. J Mol Med 2001, 79(5/6), 243-253. 17) Holness, CL, Simmons DL. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood 1993, 81, 1607-1613. 18) Ingalls, RR, Heine H, Lien E, Yoshimura A, Golenbock D. Lipopolysaccharide Recognition, CD14, and lipopolysaccharide receptors. Infect Dis Clin North Am 1999, 13(2), 341-53. 19) Janeway, CA. The T cell receptor as a multicomponent signaling machine: CD4/CD8 coreceptors and CD45 in T cell activation. Ann Rev Immunol 1992, 10, 645-674. 20) Julius, M, Maroun CR, Haughn L. Distinct roles for CD4 and CD68 as co-receptors in antigen receptor signaling. Immunol Today 1993, 14, 177-183. 21) Kirchner The pathology in cholesteatoma. Proc R Soc Med 1930, 2, 332. 22) Kojima, H, Miyazaki H, Shiwa M, Tanaka Y, Moriyama H. Molecular biological diagnosis of congenital and acquired cholesteatoma on the basis of differences in telomere length. Laryngoscope 2001, 111(5), 867-73.

Literatur 72

23) Kong, YY, Penninger JM. Molecular control of bone remodeling and osteoporosis. Exp Gerontol 2000, 35(8), 947-56. 24) Kong, YY, Yoshida H, Sarosi I, Tan HL, Timms E, Capparelli C, Morony S, Oliveira-dos-Santos AJ, Van G, Itie A, Khoo W, Wakeham A, Dunstan CR, Lacey DL, Mak TW, Boyle WJ, Penninger JM. OPGL is a key regulator of osteoclastogenesis, lymphocyte development and lymph-node organogenesis. Nature 1999, 397(6717), 315-23. 25) Kostenuik, PJ, Shalhoub V. Osteoprotegerin: a physiological and pharmacological inhibitor of bone resorption Curr Pharm Des 2001, 7(8), 613-35. 26) Krull, G. Vorbehandlung von Paraffinschnitten in der Immunhistologie. Gerhard-Domagk-Institut für Pathologie, Domagkstr. 17, 41849 Münster. 27) Lacey, DL, Timms E, Tan HL, Kelley MJ, Dunstan CR, Burgess T, Elliott R, Colombero A, Elliott G, Scully S, Hsu H, Sullivan J, Hawkins N, Davy E, Capparelli C, Eli A, Qian YX, Kaufman S, Sarosi I, Shalhoub V, Senaldi G, Guo J, Delaney J, Boyle WJ. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell 1998, 93(2), 165-76. 28) Lees, RL, Heersche JN. Macrophage colony stimulating factor increases bone resorption in dispersed osteoclast cultures by increasing osteoclast size. J Bone Miner Res 1999, 14(6), 937-45. 29) Lerner, UH. Osteoclast formation and resorption. Matrix Biol 2000, 19(2), 107-20. 30) Maddon, PJ, Molineaux SM, Maddon DE, Zimmermann KA, Godfrey M, Alt FW, Chess L, Axel R. Structure and expression of human and mouse T4 genes. Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84, 9155-9159 31) Martinez-Pomares, L, Platt N, McKnight AJ, da Silva RP, Gordon S. Macrophage membrane molecules: markers of tissue differentiation and heterogenity. Immunobiology 1996, 195(4-5), 407-16. 32) Michaels, L. An epidermoid formation in the developing middle ear: possible source of cholesteatoma. J Otolaryngolog 1986, 15, 169-74.

Literatur 73

33) Moriyama, H. Bone resorption in choilesteatoma: epithelial mesenchymal cell interaction and collagenase production. Laryngoscope 1987, 97, 854. 34) Negri, B, Schilling V, Bujia J, Schulz P, Kastenbauer E. Immunotype findings in macrophages and aural cholesteatomas. Eur Arch Otorhinolaryngol 1992, 249, 87-90. 35) Orisek, B, Chole RA. Pressures exerted by experimental cholesteatomas. Arch Otolaryngol 1987, 113, 386. 36) Pulford, KA, Sipos A, Cordell JL, Stross WP, Mason DY. Distribution of the CD68 macrophage/myeloid associated antigen. Int Immunol 1990, 2, 973-980. 37) Quinn, J, McGee J, Athanasou N. Human tumour-associated macrophages differentiate into osteoclastic bone-resorbing cells. J Pathol 1998, 184, 31-36. 38) Ramprasad, MP, Fischer W, Witztum JL, Sambrano GR, Quehenberger O, Steinberg D. The 94- to 97-kDa mouse macrophage membrane protein that recognizes oxidized low density lipoprotein and phosphatidylserine-rich liposomes is identical to macrosialin, the mouse homologue of human CD68. Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92, 9580-9584. 39) Ramprasad, MP, Terpstra V, Kondratenko N, Quehenberger O, Steinberg D. Cell surface expression of mouse macrosialin and human CD68 and their role as macrophage receptors for oxidized low density lipoprotein. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93, 14833-14838. 40) Remak, R. Ein Beitrag zur Entwicklungsgeschichte der Krebshaften Geschwülste. Dtsch Klin 1854, 6, 170-4. 41) Roodman, GD. Cell biology of the osteoclast. Exp Hematol 1999, 27(8), 1229-41. 42) Stanley, ER, Berg KL, Einstein DB, Lee PS, Pixley FJ, Wang Y, Yeung YG. Biology and action of colony--stimulating factor-1. Mol Reprod Dev 1997, 46(1), 4-10. 43) Strobl, H, Scheinecker C, Csmarits B, Majdic O, Knapp W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Brit J Haematol 1995, 90, 774-782.

Literatur 74

44) Stryer, L. Biochemie, 4.Aufl., Heidelberg, Spektrum Akademischer Verlag, 1996. 45) Suda, T, Takahashi N, Udagawa N, Jimi E, Gillespie MT, Martin TJ. Modulation of osteoclast differentiation and function by the new members of the tumor necrosis factor receptor and ligand families. Endocr Rev 1999, 20(3), 345-57. 46) Sudhoff, H, Bujia J, Fisseler-Eckhoff A. Expression of a cell-cycle associated nuclear antigen (MIB1) in cholesteatoma and auditory meatal skin. Laryngoscope 1995, 105,1227-1231. 47) Sudhoff, H, Hildmann H, Michaels L. Pathogenesis in Cholesteatoma.The Hague, The Netherlands, Kugler Publications, 1999. 48) Takahashi, N, Udagawa N, Suda T. A new member of tumor necrosis factor ligand family, ODF/OPGL/TRANCE/RANKL, regulates osteoclast differentiation and function. Biochem Biophys Res Commun 1999; 256(3), 449-55. 49) Teitelbaum, SL. Bone resorption by osteoclasts. Science 2000, 289(5484), 1504-8. 50) Tos, M. A new pathogenesis of mesotympanic (congenital) cholesteatoma. Laryngoscope 2000, 110(11), 1890-7. 51) Vaananen, HK, Zhao H, Mulari M, Halleen JM. The cell biology of osteoclast function. J Cell Sci 2000 Feb, 113(Pt 3), 377-81. 52) van Dijk, CM, Visser CE, Veldmann JE. Spatial distribution of Langerhans` cells and T-lymphocyte subpopulations in human tympanic membrane and aural cholesteatoma. Virchows Arch B 1986, 52, 143-152. 53) Varsányi, M. Biochemisch-Molekularbiologisches Praktikum für Mediziner. Bochum, Universitätsverlag Brockmeyer, 1996. 54) Vignali, DA. The interaction between CD4 and MHC class II molecules and its effect on T cell function. Behring Institute Mitteilungen 1994, 133-147. 55) Walsh, TE, Covell WP, Ogura JH. The effect of cholesteatosis on bone. Ann Otol Rhinol Laryngol 1951, 60, 1100.

Literatur 75

56) Wetmore, RF, Muntz HR, McGill TJ. Pediatric Otolaryngology: Principles And Practic Pathways. New York, Thieme Medical Publishers Inc., 2000. 57) Yoon, TH, Lee SH, Park MH, Chang HJ, Chung JW, Kim HJ. Inhibition of Cholesteatomatous Bone Resorption with Pamidronate Disodium. Acta Otolaryngol 2001, 121, 178-181.

Danksagung 76

8. Danksagung Das Zustandekommen dieser Arbeit wurde durch viele Personen unterstützt. Ich möchte mich an erster Stelle bei dem Direktor der Universitätsklinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Kopf- und Halschirurgie der Ruhr-Universität Bochum Herrn Professor Dr. med. H. Hildmann für die Überlassung der Arbeit bedanken. Bei Herrn Priv.-Doz. Dr. med. H. Sudhoff bedanke ich mich für die hervorragende Betreuung während der gesamten Arbeit. Seine kompetenten Ratschläge haben einen wesentlichen Beitrag zur Vollendung dieser Arbeit geleistet. Frau Dipl.-Biol. M. Hagnia, Frau Dipl.-Biol. A. Antonopoulos und Frau S. Kanabey danke ich für die exzellente Betreuung und Durchsicht des experimentellen Teils. Neben der Deutschen-Forschungs-Gemeinschaft die das Projekt „Knochenabbau durch das Cholesteatom“ (DFG Su 226/2-1) gefördert und das Zustandekommen dieser Arbeit ermöglicht hat, bedanke ich mich bei Professor Dr. S. Merchant, Massachusetts Eye and Ear Infirmary, Harvard Medical School, Boston für den Zugang zur Felsenbeinsammlung und hilfreiche Diskussionen zur Pathogenese des Cholesteatoms. Für die Durchsicht der Arbeit möchte ich mich bei Frau cand. med. C. Temp, Recklinghausen sowie Herrn Dr. rer. nat. K. Uludag, San Diego bedanken. Meinen Gymnasiallehrern Dr. phil. A. Vogt und Dr. rer. nat. W. Rücker bin ich ebenfalls zu großem Dank verpflichtet, da sie in mir frühzeitig das Interesse an der Komplexität der Perzeption und den damit verbundenen Organen geweckt haben. Meiner Familie und meinen Freunden sei für Ihre großzügige Unterstützung gedankt.