Untersuchung der Wechselwirkungen von · Mit Hilfe der Konduktometrie werden charakteristische Struktureigenschaften wie die Stöchiometrie zwischen den Metallionen und den Untereinheiten

Untersuchung der Wechselwirkungen von ökologisch relevanten bi- und trivalenten

Metallionen mit bakteriellen EPS

Vom Fachbereich Chemie der Universität Duisburg-Essen

(Campus Essen) zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation

von

Guido Furth

aus

Heinsberg

Essen 2006

Die vorliegende Arbeit wurde im Fachgebiet

Physikalische Chemie

der Universität Duisburg-Essen in der Zeit von Februar´04 bis September´06 angefertigt.

Berichterstatter: Prof. Dr. Christian Mayer

Prof. Dr. Karl Molt Tag der mündlichen Prüfung: 14. Feb. 2007

Danksagung

Herrn Prof. C. Mayer möchte ich für die Überlassung des fachübergreifenden Themas und für die fortwährende Unterstützung im Verlauf dieser Arbeit danken. Bei Herrn Prof. K. Molt bedanke ich mich für die Übernahme des Korereferates. Mein besonderer Dank gilt den Mitgliedern der Forschergruppe „Physikalische Chemie von Biofilmen“ für ihre unerschöpfliche Diskussionsbereitschaft, der Übermittlung vieler mikrobiologischer Aspekte und ihren hilfreichen Anregungen zur Durchführung dieser Arbeit. Frau Dr. Annegret Therheiden danke ich für ihre konstruktiven Verbesserungs-vorschläge an meiner Arbeit. Bei Herrn Manfred Zähres möchte ich mich für die stete Unterstützung bei den Aufnahmen der NMR-Spektren bedanken. Besonders bedanken möchte ich mich auch bei Herrn Robert Knieriem, der mir durch die Einweisung in die chiroptischen Methoden und seiner moralischen Unterstützung sehr geholfen hat. Allen Mitarbeitern der PC und der Mikrobiologie, die nicht namentlich erwähnt wurden, möchte ich für die hilfreichen Diskussionen und die freundliche Atmosphäre danken. Besonderer Dank geht an die DFG für die finanzielle Unterstützung. Meiner Familie gilt mein ganz besonderer Dank. Ich weiß, dass es für alle nicht immer einfach war. Ohne ihr Verständnis, ihre Ermutigungen und den Rückhalt den mir im besonderen meine Frau Claudia und meine beiden Kinder Laura und Annabell gaben, wäre diese Arbeit überhaupt nicht zustande gekommen.

Das Bekannte ist endlich, das Unbekannte unendlich. Geistig stehen wir auf einem Inselchen inmitten eines grenzenlosen Ozean von Unerklärlichem. Unsere Aufgabe ist es, von Generation zu Generation ein klein wenig mehr Land trockenzulegen.

Thomas Huxley

Inhaltsverzeichnis

i

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ............................................................................................................ 1

2 Theoretische Grundlagen ............................................................................................... 3

2.1 Biofilme und Extrazelluläre Polymere Substanzen (EPS) ............................................... 3

2.1.1 Lebensraum Biofilm................................................................................................ 3

2.1.2 EPS von Biofilmen.................................................................................................. 4

2.2 Polysaccharidexprämierende Bakterien ........................................................................... 7

2.2.1 Leuconostoc mesenteroides..................................................................................... 7

2.2.2 Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus .............................................................. 8

2.2.3 Xanthomonas campestris......................................................................................... 9

2.3 Polysaccharide.................................................................................................................. 11

2.3.1 Struktur und Eigenschaften ..................................................................................... 11

2.3.2 Polysaccharide als Polyelektrolyte.......................................................................... 13

2.3.3 Polysaccharide bakteriellen Ursprungs ................................................................... 18

2.3.3.1 Dextran ........................................................................................................ 18

2.3.3.2 Hyaluronsäure ............................................................................................. 19

2.3.3.3 Xanthan ....................................................................................................... 20

2.4 Schwermetalle in der Umwelt .......................................................................................... 22

2.5 Methoden zur Charakterisierung von EPS ....................................................................... 25

2.5.1 Größenausschlusschromatographie (SEC).............................................................. 25

2.5.2 Konduktometrie....................................................................................................... 27

2.5.3 CD-Spektroskopie ................................................................................................... 30

2.5.4 Rotationsviskosimetrie ............................................................................................ 34

2.5.4.1 Koaxial-Zylinder-Rotationsviskosimeter .................................................... 36

2.5.4.2 Kegel-Platte-Rotationsviskosimeter............................................................ 38

2.5.4.3 Platte-Platte-Rotationsviskosimeter ............................................................ 39

2.5.5 NMR-Spektroskopie als physikalische Methode zur Strukturaufklärung............... 40

Inhaltsverzeichnis

ii

3 Material ................................................................................................................................. 43

3.1 Polysaccharide.................................................................................................................. 43

3.2 Chemikalien ..................................................................................................................... 43

3.3 Geräte ............................................................................................................................... 45

3.3.1 Computer Software ................................................................................................. 46

4 Methoden .............................................................................................................................. 47

4.1 Reinigung und Abbau von kommerziellen EPS............................................................... 47 4.2 Bestimmung der Molmasse von Polyelektrolyten mit SEC............................................. 47

4.3 Konduktometrische Titration ........................................................................................... 48

4.4 Viskosimetrie von EPS..................................................................................................... 50

4.4.1 Rotationsviskosimetrische Titration........................................................................ 51

4.4.2 Bestimmung von newtonschem und nichtnewtonschem Verhalten........................ 52

4.5 Circulardichroismus ......................................................................................................... 52

4.6 NMR-Spektroskopie......................................................................................................... 53

5 Ergebnisse............................................................................................................................. 54

5.1 Charakterisierung der EPS-Proben................................................................................... 54

5.1.1 Molmassenbestimmung der Proben ........................................................................ 54

5.1.2 Viskosität der Proben in wässriger Lösung............................................................. 58

5.2 Konduktometrische Titration mit Kationen ..................................................................... 59

5.2.1 Leitfähigkeitsmessungen von Dextran .................................................................... 59

5.2.2 Leitfähigkeitsmessungen von Hyaluronat............................................................... 61

5.2.3 Leitfähigkeitsmessungen von Xanthan......................................................... 65

5.3 Rotationsviskosimetrische Untersuchung in Ab- bzw. Anwesenheit von mehr-

wertigen Kationen .................................................................................................................. 70

5.3.1 Viskositätsmessungen in Abhängigkeit von der Kationenkonzentration................ 70

5.3.1.1 Viskositätsänderungen von Dextranlösung................................................. 71

5.3.1.2 Viskositätsänderungen von Hyaluronatlösung............................................ 72

5.3.1.3 Viskositätsänderungen von Xanthanlösung ................................................ 74

5.3.2 Viskositätsmessungen in Abhängigkeit von der Schergeschwindigkeit ................. 75

5.3.2.1 Viskositätsänderungen von Dextranlösung................................................. 76

5.3.2.2 Viskositätsänderungen von Hyaluronatlösung............................................ 77

5.3.2.3 Viskositätsänderungen von Xanthanlösung ................................................ 78

Inhaltsverzeichnis

iii

5.4 Einfluss zweiwertiger Kationen auf die optische Aktivität von Polysacchariden ........... 79

5.4.1 Circulardichroismus von Hyaluronat ...................................................................... 79

5.4.2 Circulardichroismus von Xanthan........................................................................... 81

5.5 Charakterisierung von Polysacchariden durch NMR-Spektroskopie............................... 83

5.5.1 1H-NMR-spektroskopische Untersuchung der Wechselwirkung von bakteriellen

EPS mit zweiwertigen Kationen ...................................................................................... 84

5.5.1.1 Dextran .............................................................................................. 85

5.5.1.2 Hyaluronat ......................................................................................... 86

5.5.1.3 Xanthan.............................................................................................. 87

5.5.2 13C-NMR-spektroskopische Untersuchung der Wechselwirkung von bakteriellen

EPS mit zweiwertigen Kationen ...................................................................................... 89

5.5.2.1 Dextran .............................................................................................. 89

5.5.2.2 Hyaluronat ......................................................................................... 90

5.5.2.3 Xanthan.............................................................................................. 92

5.5.3 HSQC-spektroskopische Charakterisierung von Hyaluronat ....................... 95

6 Diskussion............................................................................................................ 96

6.1 Verhalten von Polysacchariden in Abwesenheit von mehrwertigen Kationen ................ 96

6.1.1 Dextran .................................................................................................................... 98

6.1.2 Hyaluronat............................................................................................................... 99

6.1.3 Xanthan ................................................................................................................... 104

6.2 Wechselwirkung der Polysaccharide mit mehrwertigen Kationen .................................. 108

6.2.1 Dextran .................................................................................................................... 110

6.2.2 Hyaluronat............................................................................................................... 112

6.2.3 Xanthan ................................................................................................................... 118

7 Zusammenfassung.............................................................................................. 126 8 Literatur .............................................................................................................. 128 9 Anhang ................................................................................................................ 137

Anhang A – Abbildungsanhang ....................................................................... 137

Anhang B – Abbildungsverzeichnis ................................................................. 152

Anhang C – Tabellenverzeichnis...................................................................... 158

1 Einleitung

1

1 Einleitung Der größte Teil der auf der Erde lebenden Mikroorganismen kommt in so genannten

Biofilmen vor [1]. Mit dem Begriff des Biofilms werden verschiedene mikrobielle

Lebensgemeinschaften wie Mikrokolonien, Flocken und Schlämme bezeichnet. Biofilme

entstehen, wenn Mikroorganismen sich an Grenzflächen anlagern und dort wachsen. Alle

Organismen, so auch biofilmbildende Bakterien, benötigen neben Stickstoff- und

Kohlenstoffquellen (Makronährstoffe) Spuren- oder Mikronährstoffe für ihre Entwicklung.

Zu den Spurenelementen gehören eine Reihe von Metallen, die aufgrund ihrer Dichte von ca.

5 g/cm³ und höher zu den Schwermetallen gezählt werden [2]. Die meisten Schwermetalle

sind Übergangsmetalle mit unvollständig aufgefüllten d-Orbitalen. Diese d-Orbitale sind die

Ursache, dass Schwermetall-Ionen eine Reihe von Komplexen bilden können, die teilweise

redoxaktive Fähigkeiten besitzen [3]. Die Schwermetalle mit der größten Bedeutung für die

meisten Organismen im Stoffwechsel sind Eisen, Kupfer, Mangan und Zink [4]. Zink spielt

neben der Funktion als Cofaktor in über 300 Enzymen (z. B. Alkoholdehydrogenase, RNA-

und DNA-Polymerasen) vor allem als Strukturelement in Proteinen wie z. B.

Zinkfingerproteinen eine entscheidende Rolle [4, 5, 6]. Die Quellen der

Schwermetallemission sind teils natürlichen (Vulkane, Verwitterung), teils anthropogenen

Ursprungs (Rauchgase, Fabrikabwässer, Bergbau, Sondermüll, Autoabgase). Das

nichtessentielle Element Cadmium findet in der Elektroindustrie und Galvanik sowie als

Farbpigment in Farben und in Batterien eine weite Anwendung und tritt als Beiprodukt der

Zink- und Eisengewinnung auf [7]. Wie auch Zink zählt Cadmium nicht zu den redoxaktiven

Metallen. Neben der Funktion als Biokatalysatoren wirken sowohl essentielle als auch

nichtessentielle Schwermetalle in Abhängigkeit von ihrer Konzentration als Zellgifte. So kann

ein Überschuss an Eisen oder Kupfer die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies über die

Fenton-Reaktion verursachen, die dazu führen, dass biologische Makromoleküle wie DNA,

Proteine oder Lipide durch Oxidationen zerstört werden [5, 7]. Weiterhin können Metalle wie

Cadmium oder Blei an wichtige Domänen innerhalb der Enzyme binden, deren Funktion

inhibieren und infolge dessen den gesamten Stoffwechsel beeinflussen. Diese Inaktivierung

wird häufig durch die hohe Affinität zu Amino- und Carboxylgruppen verursacht. Um dem

entgegen zu wirken, haben Mikroorganismen in Biofilmen eine Reihe von Mechanismen

entwickelt, um sich vor einer Schwermetalltoxizität zu schützen. Die Metallbindung an

extrazellulären Präzipitaten stellen erste Schutzmechanismen nach außen hin dar. Diese so

genannten extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) die überwiegend aus

Polysacchariden, Proteinen und Nukleinsäuren bestehen, machen bis zu 95% der

1 Einleitung

2

Trockenmasse eines Biofilms aus [8]. Um die Wechselwirkung von Biofilmen mit der

Umgebung, die Struktur von Biofilmen und die damit verbundene Änderung der

physikalischen Eigenschaften insbesondere durch die Wechselwirkung mit zweiwertigen

Metallionen besser zu verstehen, werden von Bakterien exprämierte Polysaccharide wie

Alginat, Xanthan, Hyaluronsäure und Dextran intensiv untersucht.

Im Focus der vorliegenden Arbeit steht die Wechselwirkung von zwei- und dreiwertigen

Schwermetall–Kationen mit zunehmend verzweigten Polysacchariden.

Mit Hilfe der Konduktometrie werden charakteristische Struktureigenschaften wie die

Stöchiometrie zwischen den Metallionen und den Untereinheiten der Polymere sowie die

Stabilität der Komplexe (∆κ*-Wert) bestimmt. Die Methode der Rotationsviskosimetrie zeigt

die Tertiärstruktur der Polysaccharide in Lösung. Die 1D- bzw. 2D-NMR-Spektroskopie ist

ein probates Mittel zur Untersuchung von langkettigen Kohlenhydraten. So ist es möglich,

durch den Einsatz spezieller Sonden während einer NMR-Messung die unmittelbare

Umgebung eines komplexierten bivalenten Kations zu ergründen. Die Einflüsse eines

zweiwertigen Kations auf die Chiralitätszentren der Polymere lassen sich durch

spektroskopische Methoden wie der CD-Spektroskopie ermitteln.

2 Theoretische Grundlagen


2.1 Biofilme und Extrazelluläre Polymere Substanzen (EPS)

2.1.1 Lebensraum Biofilme Etwa 99% der auf der Erde lebenden Mikroorganismen kommen in so genannten Biofilmen

vor [9]. Mit dem Begriff des Biofilms werden verschiedene mikrobielle

Lebensgemeinschaften an Grenzflächen wie Mikrokolonien, Flocken und Schlämme

bezeichnet. Allen Biofilmen ist gemein, dass die Mikroorganismen für einen relativ langen

Zeitraum in einer großen räumlichen Nähe zueinander in einer stark hydratisierten Matrix,

den extrazellulären polymeren Substanzen (EPS), eingebettet sind [10]. Eine

Modellvorstellung von einem aquatischen Biofilm ist in Abbildung 2.1 dargestellt.

Abbildung 2.1: Modell eines Biofilms in wässriger Umgebung. Es sind diskrete Mikrokolonien, in denen die Zellen in eine dichte EPS-Matrix eingebettet sind, erkennbar. Die Pfeile symbolisieren den konvektiven Fluss durch offene Wasserkanäle in der Matrix [10].

Biofilme weisen häufig eine große Artenvielfalt an Mikroorganismen auf und stellen nicht nur

einen Lebensraum für Bakterien, sondern auch für Pilze, Algen und Protozoen dar [10].

Durch den relativ langen Zeitraum in dem die Mikroorganismen in unmittelbarer Nähe

angesiedelt sind, kann es zu zahlreichen Wechselwirkungen kommen, welche letztendlich zur

Bildung einer synergetischen Gemeinschaft führen kann. Diese Mikrokonsortien sind dann in

der Lage komplexe Verbindungen abzubauen [11]. Die hohe Zelldichte in einem Biofilm

3


4

ermöglicht den Austausch von Informationen in Form von Genen oder niedermolekularen

Signalmolekülen. Diese membranpermeablen Signalmoleküle werden von den

Mikroorganismen selbst produziert und durch Diffusion in die Umgebung freigesetzt.

Zusammenfassend kann man sagen, dass das Leben der Mikroorganismen im Biofilm eine

Reihe von Vorteilen bietet. Neben optimal angepassten Lebensbedingungen in der jeweiligen

Mikronische sind die Organismen durch die umgebende EPS-Matrix gegen verschiedene

Umwelteinflüsse geschützt [11], da beispielsweise Biozide kaum die Zellen erreichen. Die

Gelmatrix kann bis zu 98 % Wasser speichern [12] und bietet daher Schutz gegen

Austrocknung.

2.1.2 EPS von Biofilmen

Der Begriff „EPS“ steht für eine Reihe von Biopolymeren. Je nach Definition versteht man

hierunter „extrazelluläre Polysaccharide“, „Exopolysaccharide“ [13] oder „extrazelluläre

polymere Substanzen biologischen Ursprungs, die an der Bildung mikrobieller Aggregate

beteiligt sind“ [14]. In dieser Arbeit wird die Abkürzung für „außerhalb der Zelle liegende

organische Makromoleküle in mikrobiellen Aggregaten“ verwendet, welche letztlich 1999 in

dieser Form von Wingender et al. [15] definiert wurde.

Den größten Anteil der EPS machen häufig die Polysaccharide aus. Aber auch Proteine,

Lipide und Nukleinsäuren können in beträchtlichen Anteilen vorkommen. Die Polysaccharide

sind von den genannten Komponenten mit Abstand am besten untersucht [16]. Es sind

Homopolysaccharide als Bestandteil der EPS gefunden worden, die nur aus einem einzelnen

Monosaccharid-Typus bestehen. Dazu gehören z. B. Mutan, Curdlan, Dextran, Levan und

Cellulose, die nur aus neutralen Bausteinen (Glucose, Fructose) bestehen, oder andere, die nur

aus anionischen Bausteinen, den Uronsäuren aufgebaut sind [10,16]. Ebenso sind

Heteropolysacccharide bekannt, die aus verschiedenen neutralen oder geladenen Bausteinen

bestehen, welche aus Wiederholungseinheiten von 2-8 Zuckern zusammengesetzt sind, z.B.

Xanthan oder Hyaluronat. Die Polysaccharide können linear und verzweigt auftreten, wobei

das Rückgrat meist aus 1,3- oder 1,4- glykosidisch verbundenen Monosaccharid-Bausteinen

mit α- oder β-Konfiguration der Zucker besteht [16].


5

Tabelle 2.1: Allgemeine Zusammensetzung bakterieller EPS [11] EPS Komponenten

(Untereinheiten, Vorstufen)

Hauptbindungstypen Struktur des Polymerrückgrats

Substituenten (Beispiele)

Polysaccharide Monosaccharide Uronsäuren

glycosidische Bindungen

lineare, verzweigte Seitenketten

organisch: O-Acetyl. N-Acetyl.Succinyl. Pyrovyl.

anorganisch : Sulfat. Phosphat

Proteine (Polypeptide)

Aminosäuren Peptidbindungen linear Oligosaccharide (Glycoproteine) Fettsäuren (Lipoproteine)

Nukleinsäuren Nukleotide Phosphodiester- bindungen

linear

Phospholipide Fettsäuren Glycerin Phosphat Ethanolamin Serin Cholin Zucker

Esterbindungen Seitenketten

Huminstoffe phenolische Verbindungen einfache Zucker Aminosäuren

Etherbindungen C-C Bindungen Peptidbindungen

Quervernetzungen

Die EPS halten den Biofilm zusammen und verleihen ihm seine Form sowie einen großen

Teil seiner physikalisch-chemischen Eigenschaften. Überdies sind die EPS bei der

Primäradhäsion der Mikroorganismen an Oberflächen von großer Bedeutung. Sie bilden

sozusagen den Klebstoff, der den Biofilm an der Oberfläche hält. Der quantitative Anteil der

EPS in Biofilmen und deren Zusammensetzung sind in Abhängigkeit von

Umgebungsbedingungen teilweise starken Schwankungen unterworfen. Die EPS können

dabei einen Anteil von 50% bis 90% der gesamten organischen Substanz im Biofilm

einnehmen [11].

Durch so genannte schwache Wechselwirkungen sowie durch Verschlaufung und Verknotung

fädiger Makromoleküle bilden die EPS ein dreidimensionales Netzwerk. Die schwachen

Wechselwirkungen können durch Ausbildung von London–Kräften, elektrostatischen

Wechselwirkungen und Wasserstoffbrücken-Bindungen zustande kommen. Die resultierende

Kraft, die dieses Netzwerk zusammenhält, ist keineswegs gering, da sie sich aus der Summe

aller Typen von Wechselwirkungen zusammensetzt [17]. Die geladenen Gruppen der

Polysaccharide (z. B. Carboxylgruppen an Uronsäuren) sowie Substituenten (z. B.

Acetamidogruppen in Polysacchariden) haben dabei einen entscheidenden Einfluss auf die

physikalisch-chemischen Eigenschaften des Biofilms, zu denen die Festigkeit, die Viskosität,


6

die Wasserbindungskapazität, die Bindungsfähigkeit und die Selektivität, mit der

anorganische Ionen gebunden werden, zählen [18].


2.2 Polysaccharidexprämierende Bakterien

2.2.1 Leuconostoc mesenteroides

Abbildung 2.2: Rasterelektronische (SEM) Aufnahme von Leuconostoc mesenteroides

Die Spezies Leuconostoc mesenteroides ist ein epiphytisches Bakterium, welches in der Natur

weit verbreitet ist. Diesem Gram-positiven, nicht pathogenen und heteotrophen Bakterium ist

es möglich, unter anaeroben Konditionen zu bestehen [19]. Das Erscheinungsbild entspricht

in den meisten Flüssigkulturen den Kokken. Die Bakterien liegen entweder isoliert, als Paare

oder kettenförmig vor, wobei ihre Struktur stark mit den Wachstumsbedingungen korreliert

ist. Zellen, deren Nahrungsgrundlage die Glucose war oder welche auf festem Untergrund

inkubierten, haben häufig eine gestreckte oder stäbchenförmige Morphologie [20]. Ferner

wurde für Leuconostoc mesenteroides eine gute Eignung für Fermentationsprozesse bestätigt,

so dass es in der Industrie insbesondere bei der Lebensmittelherstellung zum Einsatz

kommt [21]. Bei den industriell herbeigeführten Stoffwechselprodukten handelt es sich

überwiegend um Lactate, Ethanol und Kohlendioxid.

Oft haben die von Leuconostoc mesenteroides exprämierten EPS eine hohe Viskosität, welche

überwiegend auf die hohe Konzentration an Polysacchariden zurückgeführt wird [22]. Dabei

handelt es sich in der Regel um Dextran und Levan, welche, wenn sie unerwünscht vorliegen,

zu erheblichen Problemen bei der industriellen Fermentation führen [23].

7


2.2.2 Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus

Abbildung 2.3: Rasterelektronische (SEM) Aufnahme von Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus

In den vergangenen Jahren wurden immer wieder Veränderungen an der Taxonomie der

Streptokokken vorgenommen. Eine Möglichkeit der Einteilung berücksichtigt die kulturellen,

biochemischen und serologischen Eigenschaften [24]. Dabei werden die Keime in vier

Gruppen unterteilt: die Pyogen-Streptokokken, die Viridans-Streptokokken, die Laktis-

Streptokokken und die Enterokokken.

Die tatsächlichen phylogenetischen Beziehungen der Streptokokken der dritten Gruppe

konnten erst in den letzten Jahren durch Anwendung von DNA-DNA- und DNA-RNA-

Hybridisierungen sowie durch Sequenzierungstechniken und chemotaxonomische

Zellwandanalysen eingehender untersucht werden. In diesem Zusammenhang konnte durch

Hybridisierungsstudien eine Ähnlichkeit zwischen Streptococcus zooepidemicus und

Streptococcus equi festgestellt werden [25]. Aus diesem Grund wurde die Umbenennung von

Streptococcus zooepidemicus in Streptococcus equi subsp. zooepidemicus vorgeschlagen

[25].

Streptococcus equi subsp. zooepidemicus ist ein kokkenförmiges, Gram-positives, fakultativ

anaerobes aber aerotolerantes Bakterium, welches sich bevorzugt in Ketten anordnet. Die

Aerotoleranz vieler Streptocokken ist durch die Anwesenheit der Superoxid-Dismutase

bedingt, welche den Einfluss der Superoxid-Radikale minimiert [26, 27]. Der Organismus

schützt sich darüber hinaus mit Hilfe von NADH-Oxidase (NOX) vor einer irreversiblen

Oxidation durch elementaren Sauerstoff. Dabei reduziert das Enzym den molekularen

Sauerstoff zu Wasser.

8


Streptococcus equi subsp. zooepidemicus ist durchaus pathogen und verursacht oft enzootisch

auftretende Erkrankungen wie Septikämien, eitrige Wundinfektionen, Endometritiden,

Arthritiden und Mastitiden. Tiere können latente Träger dieser Bakterienspezies sein. Von

Heim- und Haustieren ist das Pferd am häufigsten von Infektionen mit Streptococcus equi

subsp. zooepidemicus betroffen [28].

In letzter Zeit weckte dieses Bakterium zunehmendes Interesse bei der Industrie, da es mit

Hilfe von Fermentationspraktiken zur Herstellung von Polysacchariden insbesondere der

Hyaluronsäure und dessen Salz dem Hyaluronat im industriellen Maßstab genutzt werden

kann [29].

2.2.3 Xanthomonas campestris

Abbildung 2.4: Rasterelektronische (SEM) Aufnahme von Xanthomonas campestris

Xanthomonas campestris gehört zur Gattung von Bakterien, zu der gelbpigmentierte

Pseudomonaden zusammengefasst werden. Wie alle dieser Gruppe angehörenden Bakterien

sind sie Gram-negativ, besitzen eine stäbchenförmige Morphologie und sind monotrich, polar

begeißelt. Dieses pflanzenpathogene aber für Menschen ungefährliche Bakterium wächst

aerob und bildet keine Sporen [30]. Die gelbe Pigmentierung der Xanthomonaden findet ihre

Ursache in einer bromhaltigen Polyenverbindung.

Verschiedene Pathovare dieses Bakteriums sind wirtschaftlich bedeutende

Pflanzenkrankheitsereger. So verursacht es zum Beispiel die Adernschwärze bei allen

Kulturformen der Brassica-Arten aber auch bei Wildformen der Kreuzblütengewächse. Hier

konnte der saatgutübertragbare Erreger nachgewiesen werden [31].

9


10

Wie viele andere Bakterien auch, exprämiert Xanthomonas campestris vielerlei polymere

Substanzen (EPS). Dazu zählt unter anderem das Polysaccharid Xanthan, welches industriell

erzeugt und wässrigen Lösungen zur Viskositätserhöhung zugesetzt wird (z.B. Pudding,

Diätsuppen, Druckerschwärze) [32].

http://xanthan.lexikona.de/art/Xanthan.html


2.3 Polysaccharide

2.3.1 Struktur und Eigenschaften Polysaccharide ist der Sammelbegriff für makromolekulare Kohlenhydrate, deren Moleküle in

vielen Fällen aus einem einfachen Baustein der allgemeinen Formel Cn(H2O)n aufgebaut sind

[33]. Ein Großteil der Trockenmasse der EPS besteht wie schon beschrieben aus

Polysacchariden. Um ihre Funktion in Biofilmen zu verstehen, ist es nötig, grundlegende

Wesensmerkmale darzulegen. In der Abbildung 2.5 sind einige typische Monomerbausteine

dargestellt.

Pentosen

O H

OH

OH

H

H

OHH

OH

O H

OHOH

H

H

OH

H

OH

O H

OHH

OHH

OHH

OHOH

α-D-Glucofuranose α-D-Xylofuranose α-D-Arabinofuranose

Hexosen

O

H

HH

OH

H

O H

H O H

O H

O H

O

H

OHH

H

OHOH

H H

OH

OH

O

OHH

HH

OHOH

H OH

H

OH

β-D-Galactopyranose β-D-Mannopyranose α-D-Glucopyranose

Uronsäuren

O

H

HH

OH

H

O H

H O H

O H

O HO

O

H

OHH

H

OHO H

H H

O H

OHO

O

H

HH

H

OHO H

H O H

O H

O HO

β-D-Galacturonsäure α-D-Glucuronsäure β-D-Mannuronsäure

Abbildung 2.5: Häufige Monosaccharideinheiten in Biopolymeren

11

Je nach Zusammensetzung eines Polysaccharids unterscheidet man Homopolysaccharide wie

Dextran, Cellulose oder Stärke, die nur aus einem Saccharidbaustein bestehen, von den vor

allem in Pflanzengummen und Bindegewebe vorkommenden Heteropolysacchariden, wie

Pektine, Mannane und Xylane, die sich aus mehreren unterschiedlichen Bausteinen


12

zusammensetzen. Neben der Zusammensetzung werden die Polysaccharide aufgrund ihrer

Funktion in Reserve- (Stärke, Glykogen) und Gerüstpolysaccharide (Celluose, Chitin)

unterteilt. Die Reservepolysaccharide dienen als Energielieferanten. So ist z. B. die Stärke die

Glucosespeicherform der meisten höheren Pflanzen und wird in Form kleiner

wasserunlöslicher Körner (Granula) in den Chloroplasten abgelagert. Gerüstpolysaccharide,

wie die Cellulose, sorgen für die Stabilität von Pflanzen. Durch die Zusammenlagerung der

Cellulosemoleküle zu Elementar- und Mikrofibrillen entsteht ein stabiles Polysaccharidgerüst

[34] .

Die wichtigsten Polysaccharide stellen die Cellulose und Stärke dar. Das ß-1,4-glykosidisch

verknüpfte Cellulosemolekül ist sowohl hinsichtlich der Menge als auch der Verarbeitung das

bedeutendste Biomolekül. Durchschnittlich bildet ein Baum täglich circa 14 g Cellulose, was

aneinandergereiht der 175-fachen Strecke zwischen Erde und Sonne (2,6·1010 km) entspricht

[33]. Das als Zellstoff bezeichnete technische Produkt enthält noch viele andere Bestandteile,

die durch verschiedene Aufschlussverfahren wie „Steam Explosion“ abgetrennt wird [34].

Das zweite wichtige Polysaccharid, die Stärke, besteht zu 20 – 30% aus Amylose (α-1,4-

verknüpfte Glucose) und zu 70 – 80% aus Amylopektin (α-1,4 mit α-1,6-verzweigte

Glucose). Je nach Quelle kommt es in sehr unterschiedlichem Gehalt in Kartoffeln, Mais,

Reis und anderen Pflanzen vor. Mengenmäßig betrachtet ist die Stärke das wichtigste

Nahrungsmittel des Menschen. Der Kohlenhydratbedarf eines Erwachsenen (Schätzungsweise

500 g/Tag) wird zum Großteil durch Stärke abgedeckt [33]. Von besonderer Bedeutung für

die Struktur der Polysaccharide ist die Art der glykosidischen Bindung zwischen den

Monomerbausteinen. Dabei spielt nicht nur die Position der Verknüpfung (1,3-, 1,4- oder 1,6-

Bindung), sondern auch das diastereomere C1-Atom eine Rolle. Dieses kann eine

Verknüpfung in α- oder β-Form eingehen und damit die Vielfalt der Strukturen vergrößern.

Eine Auswahl wichtiger Polysaccharide ist in Tabelle 2.1 zusammengestellt.

Tabelle 2.2: Zusammenstellung wichtiger Polysaccharide [34]

Polysaccharid Verknüpfung Struktur Molmasse Vorkommen Amylopektin α–1,4; α–1,6 verzweigt 3⋅105 – 1⋅109 Stärkebestandteil

Amylose α–1,4 linear 5⋅104 – 1⋅106 Stärkebestandteil Cellulose β–1,4 linear 3⋅104 – 1,5⋅106 Pflanzenzellwand

Chitin β–1,4 linear ~ 4⋅105 Insekten Dextran α–1,6 verzweigt 1,5⋅104 – 5⋅107 Bakterien

Glykogen α–1,4; α–1,6 verzweigt bis 1,6⋅106 Leber Hyaluronsäure β–1,3; β–1,4 linear > 5⋅104 Bindegewebe


Tabelle 2.2 (Fortsetzung): Zusammenstellung wichtiger Polysaccharide [34]

Polysaccharid Verknüpfung Struktur Molmasse Vorkommen Pektin α–1,4 linear 1⋅104 – 5⋅105 Pflanzen

Pullulan α–1,4; α–1,6 linear 1⋅104 – 5⋅106 Pilz Xanthan β–1,4 linear 2 – 1,5⋅107 Bakterien

Aufgrund der Vielzahl an Polysacchariden ergibt sich ein großer Bereich von technischen

Anwendungen. Derivatisierungsreaktionen der nativen Polymere ermöglichen eine

Anpassung, Optimierung und Erweiterung der möglichen Einsatzgebiete. Bei der

wasserunlöslichen Cellulose resultiert aus der Derivatisierung beispielsweise ein Aufbrechen

der intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen. Die so erhaltenen Celluloseether und -

ester sind je nach Grad und Ort der Substitution, sowie Art der eingeführten Gruppe(n) bereits

kaltwasserlöslich und finden vielfältige technische Anwendungen.

2.3.2 Polysaccharide als Polyelektrolyte Eine Vielzahl der bekannten Polysaccharide ist geladen und gehört damit auch zu den

Polyelektrolyten. Unter diesem Begriff versteht man Makromoleküle, die eine große Anzahl

ionisch dissoziierbarer Gruppen tragen. Wird ein Polyelektrolyt in einem geeigneten polaren

Lösungsmittel, meist Wasser, gelöst, so dissoziiert dieser in ein hochgeladenes Polyion und

eine der Ladung entsprechenden Anzahl entgegengesetzt geladener Gegenionen [35, 36].

Dabei unterscheidet man zwischen anionischen und kationischen Polyelektrolyten. Beispiele

für einen anionischen und einen kationischen Polyelektrolyten sind in Abbildung 2.6

dargestellt.

*

*

SO3- Na+

N+

*

Cl-

Abbildung 2.6: Anionischer Polyelektrolyt Natrium-Polystyrolsulfonat (links) und kationischer Polyelektrolyt Polydiallyldimethyl-ammoniumchlorid (rechts)

13


Aufgrund der Kombination, der für die Polyelektrolyten typischen Eigenschaften, spielen

diese sowohl in der Natur als auch in technischen Prozessen eine gewichtige Rolle. So

übernehmen sie als Proteine wichtige Funktionen in Stoffwechselprozessen. Als

Nukleinsäuren (DNA, RNA) fungieren sie als Träger der Erbinformationen. In der Technik

werden natürliche und synthetische Polyelektrolyte vielseitig eingesetzt, z. B. als

Flockungsmittel in der Wasseraufarbeitung [35-38]. Der großen Bedeutung von

Polyelektrolyten steht jedoch trotz intensiver Forschung über viele Jahre hinweg ein noch

immer lückenhaftes Verständnis der mannigfaltigen Eigenschaften gegenüber [39,40].

Die Lösungseigenschaften der geladenen Polymere, wie z. B. hydrodynamische und

kolligative Eigenschaften, werden im Gegensatz zu den ungeladenen Polymeren maßgeblich

von langreichweitigen elektrostatischen Wechselwirkungen der auf der Kette lokalisierten

Ladungen bestimmt. Sie unterscheiden sich aus diesem Grund gravierend von den

Lösungseigenschaften neutraler Polymere. Für ein Verständnis der beschriebenen

Eigenschaften müssen sowohl intra- und intermolekulare Coulomb-Wechselwirkungen als

auch osmotische und konformative Effekte berücksichtigt werden. Die Stärke der Coulomb-

Wechselwirkung wird z. B. von der Dichte der Ladung auf dem Polymer bestimmt. Für das

von einer lokalen Ladungsdichte erzeugte lokale elektrische Potential liefert die „Poisson

Gleichung“ die Lösung ( ist der Nablaoperator). ∇

( ) ( )r

rrεε

ρφ0

2 −=∇ mit r

qrr

i

επεφ

04)( = (2.1)

Hierbei bezeichnet qi eine Punktladung (qi = zi⋅e, mit zi gleich Ladungszahl und e gleich

Elementarladung), ε0 die Dielektrizitätskonstante des Vakuums und εr die relative

Dielektrizitätskonstante des umgebendem Mediums. Wird ein System mit verschiedenen

ionischen Spezies betrachtet, besteht zwischen der lokalen Ladungsdichte ρ(r) und der

lokalen Ionenkonzentration ni(r) (Anzahl pro Einheitsvolumen) die Beziehung:

∑=i

ii rnzer )()(ρ (2.2)

Aufgrund der Elektroneutralitätsbedingung gilt mit der Gesamtteilchenkonzentration (Anzahl

pro Einheitsvolumen) der Spezies ni0:

14


∑ =i

iinz 00 (2.3)

Nimmt man eine Boltzmann-Verteilung für die relative Verteilung der Ionen am Ort des

Potentials bezogen auf die Gesamtlösung an und führt den zeitlichen Mittelwert des

elektrischen Potentials (<φ(r)>) ein, ergibt sich für die lokale Teilchenkonzentration:

⎥⎦⎤

⎢⎣⎡ ⟩⟨−=

kTrznrn i

ii)(exp)( 0 φ (2.4)

Die „Poisson-Boltzmann“ (PB) Gleichung wird durch Substitution von Gleichung (2.2) und

(2.4) in Gleichung (2.1) erhalten.

∑ ⎥⎦⎤

⎢⎣⎡ ⟩⟨−−=

kTrezn

rern i

ii)(exp)( 0

0

φεε

(2.5)

Die PB Gleichung ist von fundamentaler Wichtigkeit, wenn theoretische Betrachtungen über

das Verhalten von niedermolekularen oder polymeren Elektrolyten angestellt werden. Da die Stärke und die Reichweite der elektrostatischen Kräfte sehr stark von der Ionenstärke

der Lösung abhängig ist, kann eine Variation der Ionenstärke zu einer Änderung der

Eigenschaften einer Polyelektrolytlösung führen: In Polyelektrolytlösungen geringer

Ionenstärke stoßen sich die Polyionen über große Distanzen aufgrund der Coulomb-

Wechselwirkungen der geladenen Hauptketten ab. Im Falle flexibler Polyelektrolyte führen

zusätzlich intramolekulare elektrostatische Kräfte zu einer Abstoßung der Kettensegmente

und somit zu einer Aufweitung des Polymerknäuels bis hin zu weitgehend gestreckten

Konformationen bei sehr geringer Ionenstärke und gleichzeitig hoher Ladungsdichte [41].

Eine Erhöhung der Ionenstärke ist gleichbedeutend mit einer zunehmenden Abschirmung der

Ladungen und führt so zu einer schwächeren inter- und intramolekularen Coulomb-

Wechselwirkung. Daher verhalten sich Polyelektrolyte bei sehr hoher Ionenstärke fast wie

ungeladene Polymere. Beim Austausch der Gegenionen durch mehrwertige Ionen wurden

intensive Wechselwirkungen zwischen diesen und den Polymeren beobachtet. Häufig ändert

sich die Konformation in der Gegenionenumgebung, so dass die Struktur einem beladenen

Eierkarton (engl. Eggbox) ähnelt. Ein solches Wechselwirkungsbeispiel ist in Abbildung 2.7

schematisiert für Algenalginat in Anwesenheit von Ca2+-Ionen dargestellt.

15


Abbildung 2.7: Das „Eggbox“-Modell für Calcium-Alginat; hellblaue Kettensegmente: Polymannuronatblöcke; dunkelblaue Kettensegmente: Polyguluronatblöcke; rechts: Detailansicht der Koordination eines Calciumions innerhalb einer „Eggbox“ [42] Viele Arbeitsgruppen haben in der Vergangenheit den Knäuel-Stäbchen-Übergang von

flexiblen Polyelektrolyten, hervorgerufen durch eine Erhöhung der Ladungsdichte oder eine

Erniedrigung der Ionenstärke, theoretisch untersucht [43-47]. Hierbei wurden mit Hilfe von

molekulardynamischen sowie Monte-Carlo-Simulationen Knäuelstrukturen (a), gestreckte

Konformationen (b) und „Perlenketten-Strukturen“ (c) vorhergesagt (Abb. 2.8). Eine Ursache

für die ebenfalls experimentell bestätigte Vielfalt der Kettenkonformationen

(Sekundärstruktur) liegt darin, dass Wasser in den meisten Fällen ein schlechtes

Lösungsmittel für das Polymer-Rückgrat ist [48-50]. Die Sekundärstruktur wird somit durch

ein Zusammenspiel aus elektrostatischen Kräften und den Polymer-Solvens-

Wechselwirkungen bestimmt [51].

16


))

AbbildunKonforma

In der V

quantitati

standen

Leitfähigk

Aktivitäts

Das durc

Wechselw

Gegenion

potentiom

Bisher e

ermittelte

umfassen

für diesen

sowohl

Wechselw

für flexibl

a

)

g 2.8: Computersimulation eines statisttion (b) und einer Perlenketten Struktur (c) [

ergangenheit wurde mit Hilfe diverser ex

ves Verständnis des Lösungsverhaltens von P

neben Lichtstreuung, Röntgenstreu

eitsmessungen insbesondere solche Me

bestimmung der mobilen Gegenionen erlaub

h die hohe Ladungsdichte bedingte elek

irkung zwischen den hochgeladenen Polyion

en. Diese Korrelation hat eine Reduktion der

etrischen Messungen mittels ionenselektiv

rwies sich jedoch eine grundlegende In

r Daten von schwachen Polyelektrolyten

de theoretische Beschreibung dieser Substan

Sachverhalt liegt in der Abhängigkeit der e

von der Konformation des Polyions a

irkungen der Polyanionen untereinander. E

e Polyelektrolyte nicht möglich.

b

c

ischen Knäuels (a), der gestreckten 52]

perimenteller Methoden versucht, ein

olysacchariden zu entwickeln. Hierbei

ung, Viskositätsmessungen und

thoden im Vordergrund, die eine

en [53-56].

trostatische Feld bewirkt eine starke

en und den entgegengesetzt geladenen

Gegenionenaktivität zur Folge, was bei

er Elektroden ersichtlich wird [36].

terpretation sämtlicher experimentell

als sehr schwierig und damit eine

zklasse als nicht möglich. Der Grund

xperimentell zugänglichen Observablen

ls auch von den elektrostatischen

ine Separation der beiden Beiträge ist

17


Bei konformativ starren Polyelektrolyten hingegen sind Konformationsänderungen strukturell

ausgeschlossen und alle beobachteten Effekte sind ausschließlich auf zwischenmolekulare

Coulomb-Wechselwirkungen zurückzuführen. Dies sollte die genaue Interpretation der

Messdaten und damit verbunden eine theoretische Beschreibung vereinfachen.

2.3.3 Polysaccharide bakteriellen Ursprungs

2.3.3.1 Dextran

O

HH

H

OHOH

H OH

H

CH2

O

n Abbildung 2.9: Abbildung einer Monomereinheit des Dextrans (Monosaccharidbaustein)

Dextran ist ein schleimartiges, hochmolekulares, neutrales Biopolysaccharid dessen

Grundgerüst aus verzweigten Glucose-Monomeren (s. Abb. 2.9) besteht. Seine Molmasse

liegt zwischen 5 · 103 − 6 · 106 g/mol. Die Glucoseeinheiten sind über 1,2-, 1,3-, aber auch

über 1,4-glykosidische Bindungen miteinander verknüpft [57].

Wegen der physiologisch guten Verträglichkeit weckt Dextran zunehmend die

Aufmerksamkeit der Humanmedizin. So wird es zum Beispiel als 6%ige Lösung in

Blutplasmaersatzmitteln eingesetzt und kommt als Verdickungsmittel wegen seiner guten

Wasserbindungsfähigkeit in einigen Hautcremes zum Einsatz.

In der Lebensmittelindustrie wird Dextran ebenfalls als Verdickungsmittel eingesetzt und

findet sich dort als Nahrungsmittelzusatz in Suppen, Soßen und anderen Speisen wieder [21].

Die Quellungseigenschaften und das Fehlen elektrischer Ladungen prädestinieren Dextran als

Säulenmaterial für die Gel-Permeations-Chromatographie (GPC), wo es modifiziert zur

Analyse wässriger Lösungen von großen Biomolekülen zum Einsatz kommt [33].

Dextran wird extrazellulär von Bakterien der Gattung Leuconostoc durch enzymatische

Umsetzung von Saccharose gebildet und ist so auch über Fermentationsprozesse industriell

zugänglich. In der Regel dauert dieser mikrobiologische Prozess 24 Stunden und benötigt

unter optimalen Bedingungen eine Temperatur von 25°C [58].

18


2.3.3.2 Hyaluronsäure

O

H

HH

H

OH

H OH

COOH

O

O

H

HH

H

OHH

NH

OH

CH3O

n

O

O

Abbildung 2.10: Abbildung einer Grundeinheit der Hyaluronsäure (Disaccharidbaustein)

Die Hyaluronsäure ist eine makromolekulare Kette aus Disaccharideinheiten, die wiederum

aus je zwei Glukosederivaten bestehen: D-Glucuronsäure (s. Abb. 2.10, links) und N-Acetyl-

D-glucosamid (s. Abb. 2.10, rechts). Beide unterscheiden sich von der β-D-Glucose nur durch

eine Substitution am C-6- bzw. am C-2-Kohlenstoff. Im Disaccharid wird die Glucuronsäure

glykosidisch β-1,3 an das N-Acetylglucosamid geknüpft, das wiederum mit der nächsten

Glucuronsäure in der polymeren Kette β-1,4 verbunden ist. In neutraler wässriger Lösung

bilden sich Wasserstoffbrückenbindungen hauptsächlich mit den Carboxyl- und den

N-Acetylgruppen und es entsteht ein Zufallsknäuel mit einem Durchmesser von 500 nm. Bei

Konzentrationen kleiner 1 g/L entfaltet sich das Polymer spontan [59].

Im Vergleich zu den restlichen Glycosaminoglycanen (GAGs) nimmt die Hyaluronsäure eine

Sonderstellung ein. Im Gegensatz zu den GAGs ist dieses Polysaccharid kein Proteoglykan

und besitzt mit einigen Millionen g/mol eine außerordentliche Molekülgröße, welche bei

vielen Untersuchungsmethoden störend wirkt. Des Weiteren fehlen gegenüber den GAGs die

Sulfatreste und eine Kernregion wurde nie gefunden. Eine ausreichende Klärung der

Biosynthese steht ebenfalls noch aus, im Besonderen fehlen fundierte Kenntnisse bezüglich

der Initialschritte.

Ein in der Literatur beschriebener Mechanismus der Biosynthese von Hyaluronsäure bedingt

einen alternierenden Einschub von UDPGlcNAc und UDPGlcNA vom reduzierenden Ende

der wachsenden Kette. Dieser Aufbaumechanismus ist eher typisch für die Bildung

bakterieller Polysaccharide, wobei immer der letzte eingefügte UDP-Rest das Ende der Kette

bildet [60].

Hyaluronsäure ist Hauptbestandteil der Synovia (Gelenkflüssigkeit) und wirkt als

Schmiermittel bei allen Gelenkbewegungen. Sie zeichnet sich hier zusätzlich durch thixotrope

Eigenschaften aus. Ihre Viskosität verändert sich mit einwirkenden mechanischen Kräften,

d. h. die Viskosität nimmt ab, je stärker die Scherkräfte werden [61].

19


Aus diesem Grund werden seit etwa 1990 Hyaluronsäurepräparate für die industrielle

Vermarktung konzipiert, welche in kranke Gelenke gespritzt werden. Die Wirksamkeit ist

recht unterschiedlich. Bei vielen Patienten wirkt es funktionsverbessernd, eine deutliche

Besserung wird für 6 bis 12 Monate prognostiziert. Die beobachteten allergischen Reaktionen

waren anfangs durch die Tatsache bedingt, dass die Hyaluronsäure-Produkte früher aus

Hahnenkämmen hergestellt wurden und daher Spuren von Hühnerprotein enthielten. Seit die

Hyaluronsäure-Produkte über Fermentationsprozesse mit Streptocokken hergestellt werden,

sind allergische Reaktionen äußerst selten geworden [62].

2.3.3.3 Xanthan

O

OOH

HH

OOH

H H

H O

OH

HH

OH

H OH

H

COOH

O

HH

H

OO

H OH

HCH 2OH

O

HH

H

OOH

H OH

H

CH 2OH

O

CH 2OAcH

HH

OH

H OH

HO

HOOC

CH3

n

Abbildung 2.11: Abbildung einer Grundeinheit des Xanthans (Pentasaccharidbaustein)

Xanthan stellt ein von Xanthomonas campestris, Pseudomonas aeruginosa oder Azobacter

vinelandii unter aeroben Bedingungen gebildetes, verzweigtes, anionisches

Heteropolysaccharid dar. Die Hauptkette besteht aus β-1,4 glykosidisch verknüpften Glucose-

Molekülen, welche mit der Cellulose identisch sind. Ketalartig ist die Benztraubensäure an

eine Seitenkette jedes zweiten Glucosemoleküls gebunden [63]. Die Seitenketten bestehen

dabei aus β-D-Mannose, aus β-1,4-D-Glucuronsäure und aus α-1,2-D-Mannose. Ähnlich wie

Cellulose ist auch Xanthan über den ganzen pH-Bereich stabil. Bei hohen Temperaturen wird

das Xanthan von starken Oxidationsmitteln wie z.B. Hypochlorit oder Persulfat abgebaut.

Man geht davon aus, dass die Konformation des natürlichen Xanthans in rechtgängigen

Einzel- und Doppelhelices mit einer Windungshöhe von 47Å vorliegt. Das Molekulargewicht

von Xanthan liegt bei 106 – 107 Dalton [64].

20


21

Industriell wird Xanthan im Chargen-Verfahren durch submerse Gärung unter starker

Belüftung hergestellt. Außerdem kann es mit der zweitägigen Batch-Fermentation gewonnen

werden. Dabei liegt die Ausbeute bei 25 – 30 g/L. Die gesamte Weltproduktion liegt bei

10.000 t [65].

Strukturviskose Xanthanlösungen werden als Verdickungsmittel und Stabilisatoren für

Emulsionen in Nahrungsmitteln (wie z. B. Marmeladen, Mayonnaisen, Saucen, Speiseeis),

Kosmetika, Farben und in der Erdölindustrie als Hilfsmittel beim Bohren eingesetzt [66].


2.4 Schwermetalle in der Umwelt

Der Eintrag von Schwermetallen in die Oberflächengewässer stellt eine Beeinträchtigung

aquatischer Lebensgemeinschaften dar. Hier beobachtet man im Besonderen eine

Anreicherung der toxischen Metalle in Biofilmen, welche als Schwebstoffe, Oberflächenfilme

oder Sedimentbiofilme vorliegen. Diese starke Affinität zu den EPS führt zu mannigfaltigen

Problemen. So gelangen beispielsweise durch die Aufnahme von kontaminiertem Biomaterial

durch Mikrorganismen die Schwermetalle in die Nahrungskette [67]. Um eine Abnahme der

Schwermetallemission zu erwirken, bedarf es gezielter Maßnahmen [68]. Durch Verschärfung

der Auflagen im Bereich Umweltschutz für deutsche Unternehmen wurde zwischen 1985 und

2000 ein starker Rückgang der Schwermetallemissionen in die Oberflächengewässer erwirkt

(Abb 2.12). Außer für Arsen und Nickel, bei denen der nicht beeinflussbare geogene Anteil

recht hoch ist, wurden die geforderten Reduktionsvorgaben der Internationalen

Meeresschutzabkommen in der Größenordnung von 50% (Cr, Cu, Ni, Zn sowie das Metalloid

As), beziehungsweise 70% (Cd, Hg, Pb) für die genannten Schwermetalle erreicht oder

überschritten. Sie liegen zwischen 36% bei Nickel und 85% bei Quecksilber und sind vor

allem auf die drastische Reduzierung der industriellen Direkteinträge zurückzuführen. Einen

entscheidenden Beitrag zu dieser Umweltentlastung haben neben den Maßnahmen im Bereich

der Industrie auf Grund verschärfter gesetzlicher Anforderungen auch der seit 1990

eingetretene Rückgang industrieller Aktivitäten in den neuen Bundesländern geleistet. Im Jahr

2000 spielten industrielle Direkteinleitungen nur noch eine untergeordnete Rolle. Die

Bedeutung der Einleitungen aus kommunalen Kläranlagen war zwar nach wie vor hoch,

jedoch wurden im Jahre 2000 die Gewässerbelastungen durch diffuse Quellen dominiert [69].

5

CEmission Tonnen pro Jahr

100%

80%

60%

40%

20%

0%

Schwermetallemission 198

d Cu Zn Pb Cr

63 1263 7172 913 947

22



Cd Cu Zn Pb Cr Emission Tonnen pro Jahr 15 697 3505 373 316

100%

80%

60%

40%

20%

0%

Cd Cu Zn Pb Cr Emission Tonnen pro Jahr 12 683 3187 296 283

100%

80%

60%

40%

20%

0%


Dränwasser Erosion Hofabläufe und Abdrift Bergbaualtlasten Kommunale Kläranlagen

Grundwasser Abschwemmung Urbane Flächen Atmosphärische Deposition Industrielle Direkteinleitung

Abbildung 2.12: Schwermetallemissionen aus Punkt- und diffusen Quellen in die Oberflächengewässer Deutschlands im Jahr 1985, 1995 und 2000 [69]

Die diffusen Quellen haben gegenwärtig einen Anteil von etwa 76% bei Cadmium und

Kupfer, 84% bei Blei und Chrom und 80% bei Zink. Als maßgebliche Eintragspfade wurden

Kanalisationen und nicht angeschlossene Einwohner, die Erosion und der Grundwasserzufluss

identifiziert. Mischwasserentlastungen und Niederschlagsabflüsse aus Trennsystemen

verursachen 10 - 40% der gesamten Schwermetallemissionen. Dabei werden besonders hohe

Anteile bei Zink, Blei und Kupfer erreicht. Da in den Mischsystemen ein nicht unbedeutender

Anteil des Niederschlagsabflusses zur Kläranlage weitergeleitet wird, ergibt sich bezogen auf

Schwermetalle eine geringere Gewässerbelastung als beim Trennsystem. Durch Erosion

werden insbesondere die Metalle Chrom und Blei in die Gewässer eingetragen. Bei Arsen

(57%) und Nickel (45%) überwiegen die geogenen Emissionen (Grundwasserpfad) [70].

23


24

Auch wenn die Emissionen abgenommen haben, ist der Eintrag derzeit immer noch

unvertretbar hoch, so dass vorrangig die Reinigung der städtischen Regenabwässer auf Dauer

verbessert werden muss.


2.5 Methoden zur Charakterisierung von EPS

2.5.1 Größenausschlusschromatographie (SEC)

Die Größenausschlusschromatographie (engl. Size Exclusion Chromatography, SEC) ist eine

chromatographische Methode, die im Idealfall die Fraktionierung der Probe ausschließlich

nach den hydrodynamischen Radien der einzelnen Moleküle ermöglicht. Die Grundlagen

dieser Methode stammen aus den Arbeiten von Porath und Flodin [71]. Sie erzeugten

quervernetzte Dextran-Gele, mit denen die Trennung wässriger Proteinlösungen möglich war.

Moore erweiterte die Methode auf organische Lösungsmittel, indem er vernetzte Polystyrole

zur Fraktionierung synthetischer Polymere einsetzte [72]. Der ursprüngliche Begriff

Gelpermeationschromatographie (GPC) geht auf die Verwendung von Gelen als

Trennmaterial zurück. Heutzutage werden, je nach Lösungsmittel, für die

Größenausschlußchromatographie verschiedene Begriffe wie Gelfiltration und

Ausschlußchromatographie verwendet. Eine schematische Darstellung des

Trennmechanismus der SEC findet sich in Abbildung 2.13.

A) B)

Abbildung 2.13: Darstellung des porösen Säulenfüllmaterials (A) und des Trenn-mechanismus der SEC (B)

Abbildung 2.10 zeigt drei Polymere (A bis C) unterschiedlicher Größe. Je nach

hydrodynamischem Radius können kleinere Polymere (z. B. Teilchen C) tiefer in die Poren

eindringen und damit zeitlich erst nach den größeren Probenbestandteilen (Teilchen A)

eluieren. Dieses Verhalten ist im rechten Teil der Abbildung 2.10 anhand des

Elutionsdiagramms sichtbar. Das effektiv wirksame Volumen eines Teilchens setzt sich dabei

aus dem Volumen des Makromoleküls und der Solvathülle zusammen. Die zur Trennung

25


eingesetzten porösen Säulenfüllmaterialien wurden seit den Anfängen der SEC ständig

verbessert. So verringerte sich beispielsweise deren Partikelgröße von anfangs 30 µm auf

heute bis 3 – 5 µm [73]. Kleinere Partikel ermöglichen eine bessere Auflösung, d. h. eine

bessere Trennung der Substanzgemische. Diesen Vorteilen steht aber ein Druckanstieg durch

die größere Packungsdichte gegenüber, was zu einer höheren Belastung des Trennmaterials

und anderer Systemkomponenten (z. B. Pumpen) führt. Die Größen der Partikelporen liegen

im Bereich von 0,003 – 0,4 µm. Je nach Lösungsmittel und Trennaufgabe (analytisch oder

präparativ) kann das Säulenfüllmaterial variiert werden.

Allgemein unterscheidet man folgende Gruppen:

1. Halbstarre Materialien:

- hochverzweigtes, quervernetztes Polystyrol für organische Löungsmittel

- hydrophile Gele für wässrige Lösungsmittel (z. B. Polyglycerylmethacrylat,

Polyacrylamid-Gel, etc.)

2. Silicabasierende Materialien:

- höhere mechanische Stabilität und größerer Löungsmittel-Anwendungsbereich

- Probleme mit Absorption

- geringere Auswahl an Porositäten

3. Soft Polymer Gele:

- kein Einsatz in der Analytik (nicht druckstabil)

- präparative Säulen, z. B. Sephadex (Dextran etc.)

Treten keine Wechselwirkungen zwischen Probe und Säulenmatrix auf, so kann das

Retentionsvolumen VR eines Teilchens mit Hilfe des Verteilungskoeffizienten KSEC und den

Säulenvolumina V0 (Zwischenkornvolumen) und VPore (Porenvolumen) über die folgende

Gleichung beschrieben werden [74]:

PoreSECR VKVV ⋅+= 0 (2.6)

Der Verteilungskoeffizient KSEC, der das Verhältnis der mittleren Konzentration innerhalb und

außerhalb der Poren beschreibt, hängt nur von Diffusionsprozessen und nicht von

enthalpischen Effekten ab.

26


In der Praxis ist die Trennung mittels Größenausschlußchromatographie wesentlich

komplexer. Abweichungen vom idealen Verhalten können durch Wechselwirkungen der

Probe mit dem Säulenfüllmaterial (Adsorption, Ionenausschluß und Degradation) oder

Störungen, die auf die Proben selbst zurückzuführen sind (Aggregat- und Assoziatanteile),

auftreten [75]. Durch diese zusätzlichen Wechselwirkungen kann die Elutionsreihenfolge

gestört werden. Im schlimmsten Fall verbleibt die Probe auf den Säulen, wodurch diese

irreversibel beschädigt werden.

2.5.2 Konduktometrie Wie schon beschrieben können Elektrolyte entweder als einfache Kation-Anion-Paare oder

aber auch polymer (s. Polyelektrolyte Kap. 2.3.2) vorliegen. Erfolgt ein Stromtransport erst

im gelösten Zustand spricht man von „potentiellen Elektrolyten“, wobei Elektrolyte im

ungelösten Zustand „echte Elektrolyte“ genannt werden [76]. Beschreiben wir einen

Elektrolyten als einen Stoff aus Kation K+ und Anion A- so ergibt sich für die Dissoziation mit

Kc als Dissoziationskonstante, folgendes Gleichgewicht [77]:

[ ][ ]KA

AKKc

−+

= (2.7)

Die Leitfähigkeit einer Elektrolytlösung ergibt sich aus dem Widerstand R der Zelle und der

Geometrie des Elektrolyten. Er wird in Ω gemessen und gehorcht dem Ohmschen Gesetz.

IUR = (2.8)

U: Potentialdifferenz in V; I: elektrischer Strom in A

Berücksichtigt man die Gestalt des Leiters, d. h. seinen Querschnitt A und seine Länge l erhält

man den spezifischen Widerstand ρ gemessen in Ω cm.

lRA ⋅

=ρ (2.9)

Die spezifische Leitfähigkeit κ ist als Kehrwert des spezifischen Widerstandes definiert.

27


ρκ 1

= (2.10)

Zur Berücksichtigung der Konzentrationsabhängigkeit der Leitfähigkeit eines Elektrolyten

wird die molare Leitfähigkeit λm sowie die Äquivalenzleitfähigkeit λ in Ω-1 cm2 mol-1

definiert.

cmκλ = ;

evcκλ = (2.11)

Die Äquivalentkonzentration cev hängt von der Ladungszahl des Kations z+ oder Anions z-

und von den stöchiometrischen Koeffizienten ν+ bzw. ν- ab.

czcev ++= ν (2.12)

Die molare Leitfähigkeit und die Äquivalentleitfähigkeit sind keine konstanten Größen,

sondern hängen von der Beweglichkeit der Ionen ab. Je nach Ladung und Größe bewegen

sich die Ionen in einem elektrischen Feld mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. Des

Weiteren beruht die Leitfähigkeit auf dem Stromtransport durch die Ionen und hängt darüber

hinaus vom Dissoziationsgrad des Elektrolyten ab. Aus diesem Grund erwartet man für die

Abhängigkeit der Leitfähigkeit von der Konzentration für starke und schwache Elektrolyte

unterschiedliche Gesetzmäßigkeiten [78].

Im Gegensatz zu schwachen Elektrolyten liegen starke Elektrolyte selbst bei sehr hohen

Konzentrationen vollständig dissoziiert vor. Die Leitfähigkeit nimmt daher direkt proportional

zur Konzentration des Elektrolyten zu. Allerdings beobachtet man auf Grund von

interionischen Wechselwirkungen, dass die Leitfähigkeit langsamer ansteigt als theoretisch

erwartet. Bei sehr hohen Konzentrationen nimmt sie wieder ab. Dies ist bei starken

Elektrolyten auf Ionenassoziation zurückzuführen. Die Äquivalentleitfähigkeit sinkt ebenfalls

mit zunehmender Konzentration, da Wechselwirkungen zwischen den Ionen in Form

coulombscher Kräfte zunehmen und damit die Ionenbeweglichkeit eingeschränkt wird.

Teilweise kommt es zur Bildung von Ionenpaaren, die neutral sind und den Strom nicht leiten.

Diese Abhängigkeit der Äquivalentleitfähigkeit für Konzentrationen kleiner 10-2 mol/L kann

mit Hilfe des „Kohlrauschschen Quadratwurzelgesetzes“ angepasst werden [79].

28


ck−= ∞λλ (2.13)

Hierbei bedeutet λ∞ die Ionenleitfähigkeit bei unendlicher Verdünnung und k der

Proportionalitätsfaktor. Schwache Elektrolyte sind in stark verdünnten Lösungen vollständig

dissoziiert. Allerdings nimmt der Dissoziationsgrad mit steigender Konzentration ab. Für

Lösungen, in denen interionische Wechselwirkungen vernachlässigt werden können, lässt sich

der Dissoziationsgrad α aus dem Verhältnis der Äquivalentleitfähigkeit und der

Äquivalentleitfähigkeit bei unendlicher Verdünnung berechnen.

∞

=λλα (2.14)

Wobei hier α das Verhältnis der Konzentration des Kations bzw. des Anions zur

Gesamtkonzentration des Elektrolyten ausdrückt.

[ ]c

K +

=α bzw. [ ]c

A−

=α (2.15)

Bestimmt man die Leitfähigkeit von Elektrolyten im Rahmen einer konduktometrischen

Titration, wird der elektrische Widerstand in einer Leitfähigkeitsmesszelle ermittelt. Die

schematische Anordnung einer solchen Präzisionsleitfähigkeitsmesszelle ist in Abbildung

2.14 A gegeben.

A) ∼ B)

Abbildung 2.14: A) Skonduktometrische Unte

chematische Darstellung einer Präzisionsleitfähigkeitsmesszelle für rsuchungen. B) Wheatstone Brückenschaltung [80]

29


Die Zelle wird in eine Widerstandsbrückenschaltung (Wheatstone-Brücke) so eingebaut, dass

beim Abgleich der Brücke der unbekannte Zellwiderstand im Verhältnis zu den bekannten

Widerständen gemessen werden kann (s. Abb. 2.14 B) [80]. Aus dem Zellwiderstand R ergibt

sich gemäß Gleichung (2.9) und (2.10) die elektrische Leitfähigkeit.

Al

R⋅=

1κ bzw. CG ⋅=κ (2.16)

G: Leitwert des Elektrolyten R1 gemessen in Simens, S= Ω-1

Die Zellkonstante C wird über Kalibrierung der Messzelle bestimmt. Gewöhnlich werden

hierzu KCl-Lösungen eingesetzt, für welche die spezifische Leitfähigkeiten bekannt sind.

Zur Vermeidung von Polarisationserscheinungen sowie von elektrolytischen Vorgängen

werden die Messungen bei Wechselstrom durchgeführt. Die abzugleichenden Widerstände

sind damit Blindwiderstände, für die neben dem Ohmschen Anteil auch kapazitive und

induktive Widerstände berücksichtigt werden müssen.

2.5.3 CD-Spektroskopie

Ist die Konfiguration einer Verbindung bekannt, so muss dies nicht zwangsläufig bedeuten,

dass die Sekundärstruktur und damit die Konformation dieser eindeutig geklärt ist. Als

Beispiel dient die D-Glucose, bei der alle Substituenten die aus sterischen Gründen

begünstigten äquatorialen Positionen des Pyranringes besetzen. Aus diesem Grund beobachtet

man bei den Oligomeren der Glucose, der Stärke und Cellulose ausschließlich diese

Konformation. Anders ist dies in flexiblen Verbindungen dieses Zuckerrings, in denen die

Moleküle in verschiedenen Konformationen vorliegen oder je nach experimentellen

Bedingungen unterschiedliche Konformationen einnehmen können. Keine Methode – mit

Ausnahme der kernmagnetischen Resonanz – reagiert auf Änderungen der Molekülgestalt so

empfindlich wie der Circulardichroismus (CD).

Aus diesem Grund eignet sich die CD-Spektroskopie ausgezeichnet zur Strukturaufklärung

von optisch aktiven Verbindungen. Durch die Einstrahlung von linear polarisierten Licht in

eine Lösung mit optisch aktiver Substanz, wird im Bereich der Absorptionsbande des

Analyten beim Austritt elliptisch polarisiertes Licht beobachtet [81]. Das linear polarisierte

30


Licht kann als Überlagerung einer links- und einer rechtspolarisierten Teilwelle gleicher

Amplitude angesehen werden.

A) B)

Abbildung 2.15: A) Zirkular polarisiertes Licht; Erzeugung aus zwei linear polarisierten Wellen, die 90 ° phasenverschoben sind. B) Links polarisiertes Licht

Läuft die Teilwelle E2 der Teilwelle E1 voraus, erhält man, wie in Abbildung 2.15 B zu sehen,

links polarisiertes Licht. Läuft allerdings die Teilwelle E1 der Teilwelle E2 voraus, folgt

daraus rechts polarisiertes Licht.

Für eine optisch aktive Verbindung besitzen die Absorptionskoeffizienten εL und εR

unterschiedliche Werte, so dass die beiden Teilwellen von der Probe unterschiedlich stark

absorbiert werden. Die Folge einer Abweichung dieser beiden Parameter ist, dass das

austretende Licht dann nicht mehr linear, sondern elliptisch polarisiert, da die beiden

zirkularen Anteile nicht mehr die gleiche Amplitude besitzen.

Abbildung 2.16: Durch unterschiedliche Absorption des links- bzw. rechtspolarisierten Lichts einer optisch aktiven Verbindung (εL ≠ εR) resultiert ein CD-Signal [82].

Circulardichroismus ist somit die ungleiche Absorption von links- und rechtspolarisiertem

Licht (∆ε = εL-εR) [83].

31


Die CD-Spektroskopie bietet wertvolle Hilfe bei der Konfigurations- und

Konformationsanalyse komplizierter organischer Verbindungen, vor allem von Naturstoffen.

Abbildung 2.17: UV-Spektrum und zugehöriges Circulardichrogramm im Bereich der Absorption; Charakteristisch für einen positiven Cotton-Effekt. Befinden sich zwei oder mehr Chromophore in räumlicher Nähe zueinander, resultiert in der

Regel aus ihrer Wechselwirkung eine Kopplung, exciton coupling oder split CE genannt,

anhand derer man die Konfiguration des Moleküls bestimmen kann. Abbildung 2.17 zeigt den

typischen S-förmigen Kurvenverlauf eines solchen split CE [84]. Wie dort abgebildet, können

CD-Banden positiv oder negativ sein und treten nur in einem Wellenlängenbereich auf, für

den auch "normale" Absorptionsbanden existieren.

Es hat sich eingebürgert, den Circulardichroismus und die damit verbundene anomale

Rotationsdispersion als Cotton-Effekt (CE) zusammenzufassen [81]. Definitionsgemäß

spricht man von einem positiven Cotton-Effekt, wenn das Maximum der Kurve bei größerer

Wellenlänge liegt als das Minimum.

Allgemein werden CD-Bestimmungen bei Naturstoffen vor allem verwendet, um

den Gehalt an Sekundärstrukturelementen (α-Helix, β-Faltblatt und

Schleifenbereichen) abzuschätzen,

Konformationsänderungen zu beobachten, z. B.

bei der Bindung eines Liganden,

bei Protein-Protein-Wechselwirkungen,

bei der Rückfaltung denaturierter Naturstoffe,

32


bei Faltungsvorgängen und

zur Bestimmung der Stabilität einer Verbindung in bestimmten Puffern oder

unter bestimmten Bedingungen, sowie um

Umweltisolate aus verschiedenen Quellen zu vergleichen.

CD-Signale von z. B. Proteinen treten in zwei Spektralbereichen auf. Signale im

kurzwelligen UV-Bereich von 170 bis 250 nm (der so genannten Amid-Region) sind vor

allem auf die Peptidbindung zurückzuführen, während die Signale im langwelligen UV-

Bereich von 250 bis 300 nm von den aromatischen Aminosäuren stammen. Zudem geben

Disulfid-Brücken Signale bei 250 nm.

Die gebräuchlichen CD-Spektrometer sind aus historischen Gründen in Einheiten der

Elliptizität einer Lösung geeicht. Daher wird bei Spektren häufig auch die Elliptizität Θ nach

Lambert-Beer angegeben [83].

( )cdRL εεπ

−=Θo18010ln

41 (2.17)

Eine schematische Darstellung eines solchen Spektrometers ist in Abbildung 2.18 gezeigt.

Hierbei handelt es sich um ein „Yobin Yvon Dichrograph Mark III“.

33

Abbildung 2.18: Schematische Darstellung eines Strahlengangs in einem CD-Spektrometer (Yobin Yvon Dichrograph Mark III)

Die Vorteile der CD-Spektroskopie gegenüber anderen Methoden liegen in der geringen

Stoffmenge, die für eine Messung benötigt wird und der vergleichsweise kurzen Messzeit.


2.5.4 Rotationsviskosimetrie Wird ein Stoff (gasförmig, flüssig oder fest) verformt, so setzt er der Formänderung einen

Widerstand entgegen, den man allgemein als seine Viskosität bezeichnet. Bewegt sich eine

Flüssigkeitsschicht mit konstanter Geschwindigkeit v in x-Richtung parallel zu einer zweiten

Schicht, dann wirkt zwischen den beiden Schichten eine Reibungskraft FR. Die

Bewegungsenergie wird durch die Reibung in Wärme umgewandelt. Die Viskosität eines

Stoffes ist daher ein Maß für die innere Reibung [76].

Zur Erklärung dieser Stoffeigenschaft betrachtet man folgendes Modell, das einen

Flüssigkeitsfilm zwischen einer starren Fläche und einer beweglichen Fläche darstellt, die

sich mit der Geschwindigkeit v bewegt (Abb. 1). Auf die der bewegten Platte benachbarten

Flüssigkeitsschicht wird infolge der wirkenden Adhäsionskräfte die gleiche Geschwindigkeit

übertragen. Diese Schicht überträgt dann über die (im Verhältnis zu den Adhäsionkräften

schwächeren) Kohäsionskräfte einen Teil des Impulses auf die nächste Flüssigkeitsschicht,

diese wieder auf die nächste usw.. Dadurch bildet sich ein Geschwindigkeitsgradient aus.

Dieser Strömungstyp, bei dem die benachbarten Flüssigkeitsschichten übereinander

hinweggleiten, ohne sich zu vermischen, wird laminare Strömung genannt. Im Gegensatz

dazu werden Strömungen, in denen Flüssigkeitswirbel entstehen, als turbulente Strömungen

bezeichnet [85].

Abbildung 2.19: Laminares Strömungsdiagram

Die Reibungskraft FR zwischen den benachbarten Schichten einer laminaren Strömung ist für

viele Flüssigkeiten proportional zur Schichtfläche A und zum Geschwindigkeitsgefälle

senkrecht zur Bewegungsrichtung x.

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⋅=

dydvAFR η (2.18)

34


Dies ist das Newtonsche Gesetz für viskoses Fließen. Der Proportionalitätsfaktor η wird als

dynamische Viskosität bezeichnet und besitzt die Einheit Pa⋅s. Er gibt die auf eine

Flüssigkeitsschicht bei einem bestimmten Geschwinigkeitsgefälle wirkende Reibungskraft an.

Die Reibungskraft ist für Newtonsche Flüssigkeiten (viele niedermolekulare Flüssigkeiten

oder auch hochverdünnte Polymerlösungen) eine Stoffkonstante, die nur von Temperatur und

Druck, nicht aber vom Geschwindigkeitsgefälle G abhängt. Mit anderen Worten, für

Newtonsche Flüssigkeiten ist der Quotient aus Schubspannung τ und Geschwindigkeits-

gradient G konstant.

.constG =⋅= τη mit A

FR=τ ; dydvG = (2.19)

Die dynamische Viskosität ist für viele Stoffe bei konstanter Temperaur und konstanter

chemischer Struktur nicht konstant, sondern abhängig von den Spannungen und

Verformungen, denen die Stoffe unterworfen werden. Verdoppelt man z. B. die

Schergeschwindigkeit, so führt ein Nicht-Newtonsches Verhalten nicht zu einer

Verdoppelung der Schubspannung, wie das für eine Newtonsche Flüssigkeit nach obiger

Gleichung der Fall wäre [86]. Die wichtigsten Erscheinungen des nicht-Newtonschen

Fließverhaltens in Abhängigkeit von der Schergeschwindigkeit zeigt die folgende

Abbildung 2.20.

dilatant

η / P

a⋅s

newtonsch

pseudoplastisch

s-1

Abbildung 2.20: Schematische Darstellung des Fließverhaltens nicht-Newtonscher Fluide

Bei der Dilatanz nimmt die Scherviskosität mit steigender Schergeschwindigkeit zu. Dies

führt dazu, dass das Fluid beim Fließen dickflüssiger wird. Bei einem plastischem Fluid

35


36

beginnt das Fließen erst oberhalb einer Mindestschubspannung. Unterhalb dieser Grenze

verhält sich die Substanz wie ein Feststoff [85]. Ein Beispiel hierfür sind disperse Systeme

mit hohen Einwaage-Konzentrationen (Farben, Lacke, Mayonnaise, Zahnpasta, Vaseline). Die

Pseudoplastizität (Strukturviskosität) ist charakteristisch für Polymerlösungen oder

–schmelzen. Bei kleinen Schergeschwindigkeiten (sog. 1. Newtonscher Bereich) ist die

Scherviskosität unabhängig von der Schergeschwindigkeit, d. h., die Kettenmoleküle bzw.

–segmente relaxieren schnell genug (sie kehren nach der Störung durch die Scherung so

schnell in ihre Ausgangslage zurück, dass sich die Struktur der Lösung nicht verändert).

Oberhalb einer kritischen Schergeschwindigkeit nimmt die Scherviskosität ab. Als mögliche

Erklärung für dieses Phänomen wird eine Streckung der Polymerketten mit zunehmender

Schergeschwindigkeit angenommen, bis ein Maximalwert erreicht ist. Beispiele: Lacke,

Thermoplaste, Mehrbereichsöle, Klebstoffe [87].

In der Polymerphysik findet die Viskosimetrie breite Anwendung. Anhand der Abhängigkeit

der dynamischen Viskosität der Polymerlösung von der Molmasse der Polymere lässt sich die

Form der Polymere (z.B. in Abhängigkeit von Lösungsmittel) ermitteln [88]. Andererseits

kann aus Kalibrierkurven, die mit Hilfe von Polymeren bekannter Molmassen aufgestellt

wurden, die Molmasse eines gleichen Polymers unbekannten Polymerisationsgrades bestimmt

werden [89].

Für die Messung der Viskosität stehen zahlreiche Verfahren wie z. B. die Kapillar- und

Rotationsviskosimetrie zur Verfügung. Bei der Rotationsviskosimetrie bestehen die

Messanlagen entweder aus zylindrischen oder t-spindelförmigen Kegel-Platte oder Platte-

Platte Messkörpern. Erstere eignen sich für niedrig bis mittel viskose, letztere für mittel bis

hochviskose Systeme.

2.5.4.1 Koaxial-Zylinder-Rotationsviskosimeter Im Koaxial-Zylinder-Rotationsviskosimeter befindet sich die Messflüssigkeit im Ringspalt

zwischen dem inneren und dem äußeren Zylinder. Wenn der innere Zylinder rotiert, spricht

man vom Searle-System. Im umgekehrten Fall handelt es sich um das Couette-System [86].

Dabei bildet sich ein Geschwindigkeitsgefälle zwischen dem inneren und dem äußeren

Zylinder aus (Couette-Strömung), d. h. es wird eine Scherung mit vorgegebenem

Geschwindigkeitsgradienten verursacht. Das Drehmoment, das durch das Gefälle auf den

inneren bzw. äußeren Zylinder übertragen wird, ist der dynamischen Viskosität direkt


proportional [76]. Die Auslenkung wird von einer Torsionsfeder kompensiert und die

Gleichgewichtslage elektrisch abgegriffen.

Abbildung 2.21: Schematische Darstellung eines Koaxial-Zylinder-Rotationsviskosi- meters [86]

Das Schergefälle DS ergibt sich dabei aus der Rotationsgeschwindigkeit ω und der Breite des

Messspaltes,

22

22

iaS rr

rD⋅⋅⋅

=ω , [s-1] (2.20)

Die Schubspannung τ ergibt sich aus der am Zylindermantel des Messkörpers angreifenden

Kraft F bezogen auf die Zylinderoberfläche.

hrF

i ⋅⋅⋅=

πτ

2, [Pa] (2.21)

Scherkräfte, die auf den Zylinderunter-(ober)-teil wirken, werden mittels Korrekturfaktoren

(von Gerätehersteller bestimmt). Um eine hohe Messgenauigkeit zu erreichen, sollte zudem

ra-ri<<ri sein, damit τ zwischen Messkörper und Messbecher konstant ist, d. h. keine

Wandeffekte entstehen. Wandeffekte bewirken, dass bei hoch viskosen Zubereitungen die

Fliessgrenze in unmittelbarer Nähe des rotierenden Zylinders überschritten wird, in der Nähe

des stationären Messbechers noch unterschritten ist. Damit verläuft die Scherung nicht

graduell über die ganze Spaltbreite, sondern in einer enger definierten Zwischenschicht.

37


2.5.4.2 Kegel-Platte-Rotationsviskosimeter Das Kegel-Platte-Viskosimeter wird auch als Kegel-Platte-Rheometer bezeichnet, da neben

der Viskosität auch andere Fließeigenschaften bestimmt werden können.

Das Kegel-Platte-Rheometer besteht aus einer ebenen Platte mit dem Radius r und einem sehr

stumpfen Kegel, die koaxial zueinander angeordnet sind. Die Kegelspitze liegt im Zentrum

der Kreisplatte. Der Spalt zwischen Platte und Kegel ist der Scherspalt mit dem Winkel α, in

dem die zu untersuchende Substanz eingebracht wird [90]. Wenn die Kegeloberfläche und die

Fläche der Platte ungefähr gleich groß sind (bei kleinem α), sind die Schubspannungen an der

Platte und am Kegel ungefähr gleich groß und damit stimmen die Schergeschwindigkeiten an

Platten- und Kegeloberfläche überein.

Abbildung 2.22: Schematische Darstellung eines Kegel-Platte- Rotationsviskosimeters [86]

Der Öffnungswinkel α zwischen Platte und Kegel beträgt ca. 0.2-5°, wobei kleinere Winkel

bevorzugt werden. Das Drehmoment D ergibt sich aus:

αω

=D , [s-1] (2.22)

und die Schubspannung aus:

223

rF⋅⋅

⋅=

πτ , [Pa] (2.23)

Aufgrund des sehr schmalen Kegelspaltes und der eindeutig definierten Scherfläche treten

keine Rand- und Wandeffekte auf. Weitere Vorteile liegen im sehr geringen Materialbedarf

für die Messung und dem minimalen Zeitaufwand für das Einfüllen und Reinigen.

38


2.5.4.3 Platte-Platte-Rotationsviskosimeter Als Alternative zum Kegel-Platte-Prinzip bietet sich das Platte-Platte-Prinzip an. Das Platte-

Platte-Viskosimeter besteht aus zwei parallelen ebenen Platten mit den Radien r. Antrieb und

Messeinrichtung können an derselben Platte angebracht, aber auch voneinander getrennt sein.

Abbildung 2.23: Schematische Darstellung eines Platte-Platte-Viskosimeters [86]

Die Scherung entspricht der Torsion eines zylindrischen Stabes [90]. Die Strömung im Spalt

zwischen den beiden Platten ist komplizierter als beim Kegel-Platte-Viskosimeter. Das

Drehmoment berechnet sich nach:

dydvd

dydv

dydv

dydv

rDdydv

R

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⋅⋅⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

⋅= ∫

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

τπ

03

32 (2.24)

Hierin bedeuten τ die Schubspannung, r den Radius, D das Drehmoment und dν/dy die

Schergeschwindigkeit. Die Platte-Platte-Einrichtung ist insbesondere für grobkörnige

Dispersionen und Suspensionen vorteilhaft, da der Platte-Platte-Spalt ausreichend variabel

eingestellt werden kann.

39


40

2.5.5 NMR-Spektroskopie als physikalische Methode zur Strukturaufklärung Die Methode der kernmagnetischen Resonanz, abgekürzt NMR (engl. Nuclear Magnetic

Resonance), ist eine der wichtigsten Methoden für die Strukturaufklärung von Biomolekülen,

insbesondere der von Polysacchariden. Zu diesem Thema gibt es bereits mannigfaltige

Veröffentlichungen [91], so dass hier nur oberflächlich auf die Grundlagen der NMR-

unterstützten Charakterisierung von Polysacchariden eingegangen wird. Im Rahmen dieser

Arbeit wird der 13C-NMR-Spektroskopie besondere Aufmerksamkeit geschenkt.

Im Gegensatz zur optischen Spektroskopie wird bei der NMR-Spektroskopie die Absorption

als eine Funktion der Strahlungsfrequenz grafisch dargestellt. Die Aufklärung von

strukturchemischer Fragestellungen in der Biochemie ist eine der wichtigsten Anwendungen

der 1H-NMR-Spektroskopie. Zur Aufklärung einer Struktur können alle Informationen aus

einem NMR-Spektrum herangezogen werden [92].

Dazu gehören:

• Die Anzahl chemisch nicht-äquivalenter Protonenkerne.

• Die Lage der Signale zur Ermittlung der chemischen Verschiebung und von

Abschirmungseffekten.

• Die Multiplizität der Peakgruppen.

• Die Ermittlung der Kopplungskonstanten.

• Die Peakflächen als Maß für die Anzahl von Kernen in einer Peakgruppe.

Zusätzliche Informationen zur Molekülstruktur lassen sich aus den Relaxationszeiten

gewinnen, soweit diese experimentell bestimmt wurden.

Die natürliche Häufigkeit des 13C-Isotops von nur 1,1% und das im Vergleich kleinere

gyromagnetische Verhältnis bedingen eine etwa 6000mal geringere Empfindlichkeit der 13C-

NMR-Spektroskopie gegenüber der 1H-Resonanz [93]. Dennoch kann, durch geeignete Wahl

der Experimente, die chemische Verschiebung in den 13C-Spektren zur Strukturaufklärung

organischer oder biochemischer Moleküle wie in der Protonen-NMR genutzt werden.

Einflüsse der chemischen Umgebung des Kerns können vergleichbar wie in der 1H-

Spektroskopie zur Strukturaufklärung herangezogen werden. Die Wechselwirkungen sind hier

nicht auf das unmittelbare Nachbaratom beschränkt. So lassen sich Substituenteneinflüsse

selbst über fünf Kohlenstoffatome hinweg noch in Verschiebungseffekten nachweisen.


Die besondere Bedeutung d gt in der Möglichkeit,

Informationen zum Kohlenstoff- nen-NMR zur Wasserstoff-

Peripherie des Moleküls zu er hen Verschiebung ist mit

200 ppm deutlich breiter Zur Erleichterung der

Spektreninterpretation werden häufig Doppel-Resonanz-

Techniken eingesetzt. Beispiel tkopplung die Spin-Spin-

Kopplung von 13C-Kernen m ng der Probe mit einer

breitbandigen Radiofrequenz, d nen-Resonanzbereich liegt,

entkoppelt (Abb. 2.24). Im -NMR-Spektrum ist das

entkoppelte Spektrum wesentlic Entkopplungsmethode liegt

darin, dass alle Informationen üb

Abbildung 2.24: Impulsfolge be

Mit Hilfe anderer Methoden i

Wasserstoffkerne am 13C-Kern z

Distortionless Enhancement by

Wasserstoffatome keine Signal

Experimenten einen wesentliche

Abbildung 2.25: Angeregter Kmit Hilfe des 90°-Pulses auf 13Cτ-Periode differenzieren sich diegebundenen Wasserstoffatome [

er 13C-NMR-Spektroskopie lie

Gerüst und nicht wie in der Proto

halten. Der Bereich der chemisc

als für Protonen-Resonanzen.

in der 13C-NMR-Spektroskopie

sweise wird bei der Breitbanden

it 1H-Kernen durch Bestrahlu

ie im gesamten anregbaren Proto

Vergleich zum gekoppelten 13C

h vereinfacht. Der Nachteil dieser 13 1
er C, H-Kopp
i der Breitbande

st es jedoch m

u bestimmen. Be

Polarization Tra

e, so dass diese

n Beitrag zur qua

ern ist 1H. Nach in einen Multiqu Operatortherme

95].

lu

n

ö

i

n

l

da

ngen verloren gehen [92].

tkopplung [92]

glich, die Anzahl der direkt gebundenen

einer DEPT-Messung beispielsweise (engl.

sfer) [94] ergeben Kohlenstoffkerne ohne

Information in Kombination mit anderen

itativen Analyse bietet.

er Zeit τ entsteht ein Antiphasentherm, der ntentherm überführt wird. In der folgenden in Abhängigkeit von der Anzahl der direkt

41


Ein weiterer Vorteil der DEPT-Methode besteht darin, dass die Empfindlichkeit gegenüber

einem normalen Entkopplungsexperiment für die 13C-Kerne bis auf das achtfache gesteigert

werden kann. Die obige Abbildung 2.25 zeigt die Impulsfolge für ein solches Experiment.

Die bisher erläuterten Methoden gehören zum Bereich der 1D-NMR-Spektroskopie. Für

kompliziertere Systeme werden allerdings häufig Experimente der 2D-heteronuklear

korrelierten NMR-Spektroskopie benötigt. Die Aufnahme des unempfindlichen

Kohlenstoffkerns ist jedoch äußerst langwierig, so dass eine normale 2D-NMR-Messung mit

z. B. der C, H-COSY-Methode (engl. Correlated Spectroscopy) häufig durch ein inverses

Verfahren wie der HSQC-Methode (engl. Heteronuclear Single Quantum Coherence) ersetzt

wird. Der Einsatz dieses Verfahrens führt zu einer Verkürzung der Messzeit, wobei auf dem

Kanal des unempfindlichen Kerns Kohärenzen erzeugt werden, welche sich auf den

empfindlichen 1H-Kern übertragen. Die resultierenden Resonanzen des 1H-Kerns werden

gemessen und führen zu einem Spektrum in dem die Heterokerne über die Ordinaten vereint

(1H=X-Achse; 13C=Y-Achse) werden. Auf diese Weise ist eine genaue Signalzuordnung

möglich, da nur Signale von direkt gebundenen C- und H-Atomen erscheinen [96]. Die

Impulsfolge für ein solches Experiment ist, wie in Abbildung 2.26 zu sehen, sehr komplex

und besteht sowohl im 13C-Kanal als auch im Protonen-Kanal aus einer Vielzahl von 90°- und

180°-Impulsen, die durch die Zeiten τ und t1 getrennt sind.

Abbildung 2.26: Angeregter Kern ist 1H. In der Zeit τ wird die Polarisation von 1H auf 13C übertragen. In t1 entwickelt sich diese 13C-Verschiebung ohne 1H-Kopplungen. Während der Zeit δ dephasiert ein Gradient (Echo/Antiecho) die Magnetisierung. Nach einem Polarisationstransfer rephasiert der letzte Gradient (G2) τ die gewünschte Magnetisierung. Detektiert wird 1H unter 13C-Entkopplung [96].

42

3 Material

43

3 Material

3.1 Polysaccharide Für diese Arbeit wurden unterschiedliche Polysaccharide verwendet. Als Modelsubstanz für

die Gattung der ungeladenen Polysaccharide wurde das Dextran, ein verzweigtes

Polysaccharid, dass von Leuconostoc mesenteroides exprämiert wird, genutzt. Darüber hinaus

wurden Experimente mit geladenen Polysacchariden durchgeführt, wobei zwei

unterschiedlich stark verzweigte Polyelektrolyte eingesetzt wurden. Zum einen die

Hyaluronsäure bzw. deren Natriumsalz das Hyaluronat. Hierbei handelt es sich um ein

geladenes, unverzweigtes Polysaccharid, dass durch industrielle Fermentation mit

Streptococcus equi subspecies zooepidemicus gewonnen wird. Zum anderen wurde das

Natriumsalz des Xanthans, ein geladenes, verzweigtes Polysaccharid mit einem

Glucoserückgrad, welches ebenfalls durch Fermentation (Xanthomonas campestris) erhalten

wird, verwendet. In der unten aufgeführten Tabelle 3.1 sind unter anderem die Hersteller der

genutzten Polysaccharide aufgeführt.

Tabelle 3.1: Verwendete Polysaccharide

Substanzname Hersteller Herkunft Best.-Nr. CAS-Nr.

Dextran Sigma Leuconostoc mesenteroides

D4876-50G 9004-54-0

Hyaluronsäure (Natriumsalz) Fluka Streptococcus equi sp. Zooepidemicus

53747

9067-32-7

Xanthan (Natriumsalz) Sigma Xanthomonas campestris

G12553-100G

11138-66-2

3.2 Chemikalien Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente wurden zwei- bzw. dreiwertige

Salze genutzt. Zudem wurden Chemikalien zur spezifischen Kationenentfernung, sowie als

NMR-Lösemittel oder zur Kalibrierung der Messapparaturen benötigt. Die wichtigsten dieser

Substanzen sind in Tabelle 3.2 zusammengestellt.

3 Material

44

Tabelle 3.2: Verwendete Chemikalien

Substanzname Formel Hersteller Best.-Nr. Mol.-Gew.

Aceton C3H6O Riedel de Haën

32201

58.08

Bleiacetat-Dihydrat C4H6O4Pb • 2 H2O

Fluka 15319 379,33

Cadmiumacetat-Dihydrat C4H6O4Cd • 2 H2O

Fluka 20901 266.52

Calciumchlorid-Hexahydrat CaCl2 • 6 H2O

Riedel de Haën

12074 219.08

Deuteriumoxid D2O Merck 103428 20.03

Eisen-(II)-chlorid-Tetrahydrat

FeCl2 • 4 H2O

Aldrich

22,029-9

270.32

Eisen-(III)-chlorid-Hexahydrat

FeCl3 • 6 H2O

Riedel de Haën

103943

270.32

Ethanol, absolut C2H6O

Merck 100983 46.07

Ethylendiamintetraessigsäure-di-Natriumsalz-Dihydrat (Titriplex III), (Na2-EDTA)

C10H14N2Na2O8 • 2 H2O

Merck

108418

372.24

Kupfer-(II)-chlorid-Dihydrat

CuCl2 • 2 H2O

Riedel de Haën

31286

Magnesiumchlorid-Hexahydrat MgCl2 • 6 H2O Merck

105833

203.30

Manganchlorid-Tetrahydrat MnCl2 • 4 H2O Fluka

63544

125.84

Natriumacetat C2H3NaO2

Merck

106268

82.03

Natriumchlorid NaCl

Baker

0278

58.44

Natriumhydroxid Plätzchen

NaOH Merck 106498 40.00

Schwefelsäure, 95-97%,

H2SO4

Riedel de Haën

30743

98.08

Zinkacetat-Dihydrat C4H6O4Zn • 2 H2O

Fluka 96459 219.50

3 Material

45

3.3 Geräte Im Rahmen der Promotionsarbeit wurden diverse Apparaturen und Messinstrumente benötigt.

Diese für die vorliegende Arbeit relevanten Gerätschaften sind in Tabelle 3.3 angegeben.

Tabelle 3.3: Verwendete Geräte

Gerät Hersteller und Bezeichnung

Analysenwaage Sartorius, BP 210 S

Analyzer f. LS 30 Contraves

Analyzer f. LS 40 Contraves

CD-Spektrometer AVIV CD Spektropolarimeter (Model 62 ADS)

Dialyseschlauch Fa. Serva, Visking

Elektrode Tetracon 96 WTW

GPC-Entgaser Viskotek, Degasser VE 7510

GPC-Dualdetektor Viskotek, Model 270

GPC-Pumpe Viskotek, Solvent Pump VE 1122

GPC-RI-Detektor Viskotek, VE 3580

Konduktometer LF 537/537-A WTW

Kryostat Mgw/Lauda Klein-Kryomat C6CT

Laborzentrifuge Hettich Universal 2S

Lyophilisationsanlage Crist, ALPHA 1-2

Magnetrührer IKA-Combimag RCT

Pipette Eppendorf Reference 50-250 µL

Reagenzglasschüttler Vortex Genie 2, Fa. Scientific Industries

Rotationsviskosimeter Low shear 30 und Low shear 40; Contraves

Steuereinheit f. LS 40 Contraves

Thermometer mgw Lauda R 40/2 Digital Thermometer

Thermostat Reotherm 115 contraves 3

Transferpette Brand (100 µL – 1000 µL)

Ultraschallfinger Branson – Digital Sonifier W-250D

Die hier nicht erwähnten Geräte gehören zur Laborgrundausstattung.

3 Material

46

3.3.1 Computer Software Zur Auswertung der GPC-Ergebnisse und der NMR-Spektren wurden spezielle Computer-

programme benötigt, welche in untenstehender Tabelle aufgeführt sind.

Tabelle 3.4: Verwendete Computer-Software

Hersteller Programm Version

Viskotek OmniSEC 4.2

Departamento de Quimica Organica, Universidade de

Santiago de Compostela

MestRe-C (1D) 2.3

Departamento de Quimica Organica, Universidade de

Santiago de Compostela

MestRe-C (2D) 4.9

4 Methoden

47

4 Methoden

4.1 Reinigung und Abbau von kommerziellen EPS Die kommerzielle EPS (Dextran, Hyaluronat und Xanthan) wird in einer 0,1 molaren

Natriumchlorid-Lösung mit einer Konzentration von 1,2 g/L gelöst. Für den Abbau des

hochpolymeren Moleküls wird die Lösung über 3 h auf 50°C erhitzt und über diese

Zeitspanne hinweg mit einem Ultraschallgerät der Firma Branson mit einer Intensität von 60

Watt beschallt. Das Xanthan wurde darüber hinaus zum weiteren Abbau über 5 h, 10 h und 15

h beschallt. Die trübe Lösung wird filtriert und 2h bei 4000 rpm zentrifugiert. Für die

Abtrennung niedermolekularer Fremdkörper und für den Ionenaustausch kommen

Dialyseschläuche (Visking, Serva Heidelberg, Deutschland) mit einer Ausschlussgrenze von

12.000-14.000 g/mol zum Einsatz. Der bei der Zentrifugation erhaltene Überstand wird über

einen Zeitraum von ca. 16 h dialysiert, wobei der Wasserwechsel zu Beginn der Dialyse alle

15 min (4x) und alle 30 min (6x) vollzogen wird. Dies entspricht einer ausgetauschten

Wassermenge von 50 L. Die über Nacht weiter dialysierte Lösung wird eingefroren und über

zwei Tage lyophilisiert.

Um eine möglichst sterile Präparation zu gewährleisten, wurden die verwendeten Glasgeräte

mit konz. Schwefelsäure gespült und die Metallspatel, Rührkerne, sowie die Pinzetten vor

dem Gebrauch mit Ethanol abgeflammt. Die Lyophilisate wurden bis zu ihrer weiteren

Verwendung kühl (-18°C) gelagert.

4.2 Bestimmung der Molmasse von Polyelektrolyten mit SEC Zur Bestimmung der Molmasse der kommerziellen Polysaccharide bzw. deren abgebauten

Varianten, wurden Lösungen dieser in einer SEC-Malls-Anlage untersucht. Für die

Messungen kamen drei Säulen, welche in Reihe geschaltet wurden, zum Einsatz. Eine

Vorsäule (ViscoGEL PWXL, 6.0 × 40 mm) mit einer Partikelgröße von 12 µm wurde als

Schutz für die nachfolgenden Trennsäulen vorgeschaltet. Bei den SEC-Säulen handelt es sich

um zwei „ViscoGEL PWXL“-Säulen mit den Abmessungen von 6.0 × 300 mm und einer

Porengröße von 6-13 µm. Bei der genutzten Apparatur kommt die Methode der so genannten

„Tripledetektion“ zum Einsatz. Hierunter versteht man die Kombination dreier Detektoren zur

Bestimmung der Molmasse. Neben der Detektion des Refraktionsindex, mit einem VE 3580-

4 Methoden

Detektor der Firma Viskotek wird hierbei mit einem Dualdetektor (270, Viskotek), welcher

eine Streulichteinheit, sowie ein Viskosimeter beinhaltet, gemessen.

Mit dem Programm „OmniSEC 4.2“ der Firma Viskotek wurde die GPC-Anlage gesteuert.

Des Weiteren wurden die erhaltenen Messdaten mit diesem Programm ausgewertet und die

Molmasse berechnet.

Für die Messung wurde das Lyophilisat (2 mg/mL) in tridestilliertem Wasser gelöst und die

Apparatur mit entgastem tridestilliertem Wasser gespült. Nach einer Betriebsdauer des Lasers

von 20 min wurde die sterilfiltrierte (Sterilfilter; 0,2 µm) Probe im Überschuss zugegeben, um

eine vollständige Füllung der Probenschleife (100 µL) des Injektors zu gewährleisten. Um die

Reproduzierbarkeit zu überprüfen, wurden die Messungen mindestens dreimal wiederholt.

4.3 Konduktometrische Titration Es wurden unterschiedlich konzentrierte, wässrige Lösungen (100 mL) der über drei Stunden

abgebauten bzw. nichtabgebauten Lyophilisate (0,5 mg/mL bis 3,0 mg/mL) angesetzt und

über 1 h durch Rühren homogenisiert. Die Apparatur besteht aus einem Konduktometer,

sowie einer Tetracon-Elektrode der Firma WTW. Die Messungen wurden bei 25°C (± 0,1°C)

durchgeführt wobei die Temperatur mit Hilfe eines Kryostaten der Firma Lauda konstant

gehalten wurde. Titriert wurde mit einer 0,05 molaren Salzlösung in 100 µL-Schritten.

Die dadurch erhaltenen Leitwerte (κ) wurden gegen die Kationenkonzentration (c)

aufgetragen und durch den resultierenden Graphen Ausgleichskurven gelegt. So ist es

möglich, eine wechselwirkungsbedingte Diskontinuität nachzuweisen und den

Äquivalenzpunkt zu bestimmen. Des Weiteren erhält man den Äquivalenzpunkt durch

Ableitung der Leitfähigkeitsfunktion, wobei diese oberhalb der Äquivalenzkonzentration

annähernd konstant wird ( .constddc

=κ

).

Ist die Stoffmenge nM der Polysacchariduntereinheit bekannt, so kann das stöchiometrische

Verhältnis zwischen Kation und Monomereinheit am Äquivalenzpunkt berechnet werden. Die

Stoffmenge wird wie folgt bestimmt (Gl. 4.1).

M

PolyM M

Vcn

⋅= (4.1)

48

4 Methoden

Wobei cPoly die Konzentration des Polysaccharids in der Lösung ist, V das Messvolumen und

MM der Molmasse einer Monomereinheit entspricht. Dividiert man die Stoffmenge des Salzes

am Äquivalenzpunkt nÄ durch die Stoffmenge des Polysaccharidmonomers nM im

Messvolumen, erhält man als Quotient das stöchiometrische Verhältnis zwischen Kation und

Polysacchariduntereinheit QÄ (Gl. 4.2).

M

ÄÄ n

nQ = (4.2)

Eine weitere für die Stabilität der sich einstellenden Komplexe charakteristische Größe wird

durch die Methode der Konduktometrischen Titration erhalten. Die Differenz zwischen der

Leitfähigkeit am Äquivalenzpunkt der Polysaccharidlösung (κÄ) und der entsprechenden

Leitfähigkeit einer reinen Salzlösung (κSalz) bei identischer Konzentration ergibt

∆κ* (s.Abb. 4.1).

( ) 0* kÄSalz +−=∆ κκκ (4.3)

Um den Startwert der reinen Elektrolytlösung bezüglich der Polymerlösung anzupassen wird

die Konstante k0, welche dem Startwert der Polymerlösung entspricht, hinzuaddiert.

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

0,22

0,24

0,26

0,28

0,3

-0,01 0,01 0,03 0,05 0,07 0,09 0,11 0,13 0,15c (mol/L)

κ (m

S/cm

)

∆κ∗

Äquivalenzpunkt

b

a

k 0

Abbildung 4.1: Exemplarische Abbildung der Leitfähigkeitsfunktion einer Titration einer reinen Salzlösung in bidestilliertes Wasser (a) und einer Salzlösung in eine wässrige Polyelektrolytlösung (b). 49

4 Methoden

4.4 Viskosimetrie von EPS

Die für diese Arbeit genutzten Rotationsviskosimeter (LS30 u. LS40) der Firma Contraves

wurden nach einer Aufwärmphase von mindestens einer halben Stunde kalibriert. Der

Nullpunktsabgleich musste vor jeder Messung durchgeführt werden, um Massenträgheits-

effekte des Messkörpers auszuschließen und einen elektronischen Nullpunkt zu erhalten. Der

Abstand zwischen Messbecher und Messkörper beträgt 3 mm und der Messkörper ist

21,5 mm hoch. Mit einer Referenzprobe wird die Funktionstüchtigkeit der Apparatur

kontrolliert, bevor die eigentlichen Messungen gestartet werden. Bei den Messungen ist

darauf zu achten, dass die Oberfläche des Messkörpers glatt, grat- und fettfrei ist. Darüber

hinaus muss der Abstand zwischen Messkörper und Messbecher bei der Durchführung der

Experimente überall gleich sein (s. Abb. 2.17, Kap. 2.5). Um eine konstante Temperatur von

25°C (±0,1°C) über den Messverlauf zu gewährleisten, wird ein Reotherm 115 Kryostat der

Firma Contraves verwendet.

Um Rückschlüsse auf die vorliegende Knäuelstruktur der Polysaccharide in wässriger Lösung

ziehen zu können, wurde mit Hilfe der ermittelten Molmassen (vgl. Kap. 4.2) unter

Einbeziehung der Viskositäten der Staudinger-Index ([η]) bestimmt.

[ ]cLs

Ls 1⋅

−=

ηηη

η (4.4)

η: Viskosität der Lösung; ηLs: Viskosität des Lösemittels; c: Konzentration des gelösten Polymers

Mit dem Staudinger-Index ist die Berechnung des Exponenten der „Mark-Houwink-

Gleichung“ (α) möglich, welcher ein Indiz für die Kompaktheit der Molekülstruktur in

Lösung ist.

[ ] αη MK ⋅= (4.5)

K: empirisch ermittelte Konstante; M: Molmasse

50

4 Methoden

4.4.1 Rotationsviskosimetrische Titration Um eine optimale Solvatisierung der gefriergetrockneten und über drei Stunden abgebauten

bzw. nichtabgebauten Polysaccharide (1,5 mg/mL) in wässriger Lösung zu gewährleisten,

wurden diese durch einstündiges Rühren homogenisiert und über Nacht im Kühlschrank

gelagert. Die Proben (50 mL) wurden in ein am Thermostatkreislauf angeschlossenes Gefäß

gegeben und eine halbe Stunde gerührt. Da der Messbecher nur 4 mL Lösung aufnehmen

kann, wurde die Titration im thermostatisierten Gefäß durchgeführt und nach Einstellung des

Gleichgewichts (ca. 5 min) sofort in den Messbecher des Viskosimeters überführt. Um eine

Reproduzierbarkeit der Messung sicherzustellen wurden die Messungen fünfmal wiederholt.

Die Anwesenheit von Luftblasen in der Lösung führen zu Messungenauigkeiten, da eine

heterogene Scherung die Folge ist. Aus diesem Grund wurde durch die Reduktion der

Rührgeschwindigkeit auf ein Mindestmaß und durch die Vermeidung von Turbulenzen bei

der Überführung der Probe versucht, eine Luftblasenbildung zu verhindern. Gemessen wurde

20 s bei einer Schergeschwindigkeit von 2,0 s-1 und titriert wurde mit einer 0,05 molaren

Salzlösung in 50 µL-Schritten.

Die dadurch erhaltenen Viskositäten wurden gegen die Salzkonzentration aufgetragen und

durch den resultierenden Graphen wurde eine Ausgleichsgerade gelegt (s. Abb. 4.2).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014

Konzentration Me2+ (mmol/L)

η (m

Pa*s

)

Äquivalenzpunkt

Abbildung 4.2: Exemplarische Abbildung der Viskositätsfunktion einer Titration einer Salzlösung in eine wässrige Polyelektrolytlösung

51

4 Methoden

52

So ist es möglich, den Äquivalenzpunkt über die rotationsviskosimetrische Titration zu

bestimmen und damit wie im Abschnitt 4.3 beschrieben, das stöchiometrische Verhältnis von

Kationen zur Polymeruntereinheiten zu berechnen.

4.4.2 Bestimmung von newtonschem und nichtnewtonschem Verhalten Wie unter 4.4.1 beschrieben wurde eine wässrige Polysaccharidlösung (1,5 mg/mL) der

abgebauten und der unbehandelten Lyophilisate angesetzt und über Nacht bei 8°C quellen

gelassen. Nach der Kalibration (s. Kap. 4.4) der Messanlage, wurden die Lösungen in den

Messzylinder gegeben und eine halbe Stunde auf 25°C temperiert. Gemessen wurde 1.5 min

bei variabler Schergeschwindigkeit (0,5 s-1 bis 8,0 s-1). Um eine Reproduzierbarkeit der

Messungen zu gewährleisten wurden diese fünfmal wiederholt.

4.5 Circulardichroismus Mit Hilfe der CD-Spektroskopie wird für die Polysaccharide die Änderung des

Circulardichroismus in Abhängigkeit von der zugesetzten Salzkonzentration bestimmt.

Gemessen wird mit einem CD-Spektropolarimeter der Firma AVIV (Model 62 ADS). Hierbei

ist es möglich die Proben zu temperieren, so dass bei einer konstanten Temperatur von 25°C

die circulardichroitische Änderung der Probe detektiert werden kann. Die verwendete

Quarzküvette besitzt einen optischen Durchgang von 1 mm und ein Volumen von 200 µL. Es

ist darauf zu achten, dass die Küvettenoberfläche absolut rein (kein Schmutz oder Kratzer) ist

und die zu vermessende Lösung keine optisch wirksamen Verunreinigungen, wie z. B. Blasen

oder Staubpartikel, enthält. Zu diesem Zweck wurden die Polysaccharid-Lösungen

sterilfiltriert (Sterilfilter; 0,2 µm). Der Wellenlängenbereich lag während der Messungen bei

150-300 nm und das Messintervall betrug 20 nm/min. Für die Messungen wurden

ausschließlich abgebaute Polysaccharide verwendet (7 mg/mL), da aufgrund der hohen

Viskosität der unbehandelten Lösungen eine Präparation nicht möglich war.

Die zu vermessenden Lösungen mit einer jeweils gegebenen Salzkonzentration wurden im

Vorfeld angesetzt, da eine Titration apparaturbedingt ausgeschlossen war. Hierbei wurde

jeweils 1 mL Lösung mit entsprechender Salzkonzentration am Vortag angesetzt und über

Nacht bei 8°C quellen gelassen.

4 Methoden

53

4.6 NMR-Spektroskopie Die Lyophilisate wurden in D2O (Merck) bei pD 7,0 resuspendiert. Die Deuteriumresonanz

wurde als ,,field-frequency-lock" verwendet und die NMR-Spektren wurden mit einem DRX-

500-, sowie mit einem DRX-300-NMR-Spektrometer der Firma Bruker aufgenommen. Die

aus der Messung resultierenden 1D-Spektren wurden mit dem Programm MestRe-C 2.3 und

die 2D-Spektren mit dem Programm MestRe-C 4.9 (Departamento de Quimica Organica,

Universidade de Santiago de Compostela) ausgewertet. Die Temperatur im Messkopf betrug

während der Messungen 60°C.

Die 1H-NMR-Spektren wurden mit 64K x 512 Datenpunkten sowie einer spektralen Weite

von 9980 Hz aufgenommen. Die Eingestrahlten Pulse hatten einen Winkel von 15° und die

Wartezeit zwischen den Pulsen betrug 8,5 Sekunden.

Die 13C-NMR-Spektren wurden mit 64K x 1024 Datenpunkten und einer spektralen Weite

von 32680 Hz aufgenommen. Die Proben wurden mit einem 90° Puls angeregt, wobei die

Wartezeit zwischen den Pulsen 2,5 Sekunden betrug. Während der Messung wurden 5000 bis

6000 Scans durchgeführt. Es wurde mit der „Reversed-Gated-Decoubling-Methode“

gemessen, denn diese Methode ermöglicht eine Aufnahme der Spektren ohne den Kern-

Overhauser-Effekt. Dies hat zur Folge, dass neben der chemischen Verschiebung bei der

Analyse des Spektrums auch noch das Intensitätsverhältnis berücksichtigt werden kann.

Die 2D-NMR-Spektren wurden mit 64K x 512 Datenpunkten und einer spektralen Weite für

den 13C-Kanal von 7360 Hz und für den 1H-Kanal von 2650 Hz aufgenommen. Es wurde mit

der „HSQC-Methode“ gemessen. Dabei handelt es sich um eine inverse 1H-13C-Korrelation.

Diese ermöglicht es, eine heteronukleare Resonanzuntersuchung in relativ kurzer Zeit

durchzuführen.

Als Grundlage der Signalzuordnung wurden die veröffentlichten Daten verschiedener

Arbeitsgruppen genutzt [97-102]. Für die Experimente mit bivalenten Kationen erfolgte die

Zuordnung der Signale über Referenzen zu Spektraldaten, die für reine Polysaccharid-

Lösungen in Abhängigkeit von der Polysaccharidkonzentration und dem Abbauverfahren

erhalten wurden.

5 Ergebnisse

54

5 Ergebnisse

5.1 Charakterisierung der EPS-Proben

Eine wichtige Größe, um die Eigenschaften von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS)

zu ergründen, ist ihre molare Masse. Aus diesem Grund wurden die für diese Arbeit

verwendeten EPS und die abgebauten Varianten mittels GPC charakterisiert. Des Weiteren ist

die Viskosität einer wässrigen EPS-Lösung stark von der Art und der Konformation des

gelösten Biopolymers abhängig, so dass diese charakteristische Größe mit Hilfe eines

Rotations-viskosimeters bestimmt wurde.

Bei den in dieser Arbeit untersuchten EPS handelt es sich um Dextran von Leuconostoc

mesenteroides, um das Natriumsalz der Hyaluronsäure von Streptococcus equi subspecies

zooepidemicus und um das Natriumsalz des Xanthans von Xanthomonas campestris.

In diesem Kapitel sind die Ergebnisse der GPC, sowie der Viskosimetrie der wässrigen EPS-

Lösungen zusammengefasst.

5.1.1 Molmassenbestimmung der Proben Für die Messungen wurden die Polysaccharide wie in Kapitel 4.2 beschrieben in

tridestilliertem Wasser gelöst und mit der SEC-Malls analysiert. Die erhaltenen Molmassen

sind in Tabelle 5.1 aufgeführt.

Tabelle 5.1: Mittlere molare Massen der verwendeten EPS

extrazelluläre polymere Substanz mittl. Molmasse

Dextran 2.0 ⋅ 105 g/mol

Hyaluronat 1.7 ⋅ 106 g/mol

Hyaluronat, 3 Stunden durch Ultraschall-

einwirkung abgebaut

4.0 ⋅ 105 g/mol

Xanthan 2.90 ⋅ 106 g/mol

Xanthan, 3 Stunden durch Ultraschall-

einwirkung abgebaut

1.70 ⋅ 106 g/mol


einwirkung abgebaut

1.04 ⋅ 106 g/mol

5 Ergebnisse

Tabelle 5.1 (Fortsetzung): Mittlere molare Massen der verwendeten EPS

extrazelluläre polymere Substanz mittl. Molmasse


einwirkung abgebaut

6.8 ⋅ 105 g/mol


einwirkung abgebaut

1.4 ⋅ 105 g/mol

In Abbildung 5.1 sind die Signale einer Messung des Viskositätsdetektors (links) und des

Differentialrefraktometers (rechts) exemplarisch für Hyaluronsäure aufgeführt.

-17.98

289.90

597.77

905.64

1213.51

1521.38

1829.25

Vis

com

eter

DP

(mV

)

Retention Volume (mL)0.00 2.81 5.63 8.44 11.25 14.06 16.88 19.69 22.50

-503.34

-502.20

-501.06

-499.92

-498.77

-497.63

-496.49R

efra

ctiv

e In

dex

(mV

)


Abbildung 5.1: Exemplarische Abbildung der Elutionskurve für Hyaluronat, detektiert mit dem Viskositätsdetektor (links) und dem Differentialrefraktometer (rechts)

Da der Umgang mit den nicht abgebauten Polysacchariden, insbesondere dem Xanthan,

wegen der hohen Viskosität der wässrigen Lösungen nicht unproblematisch war, wurde eine

mechanische Degradation der Molmasse erwogen. Dieser Ultraschallabbau wurde durch den

Vergleich der Molmassen der einzelnen Fraktionen kontrolliert (Tab. 5.1). Betrachtet man das

Elutionsvolumen für die jeweiligen Fraktionen, so fällt auf, dass das Maximum für längere

Abbauzeiten zu höheren Retentionsvolumen hin verschoben ist. Dies wird in der Abbildung

5.2 für die 5 h abgebaute, die 10 h abgebaute und die 15 h abgebaute Xanthanfraktion

deutlich.

55

5 Ergebnisse

56

Abbildung 5.2: SEC-Malls für den Ultraschallabbau von Xanthan (0 h, 5 h, 10 h, 15 h mit einer Intensität von 60 Watt)

Wie die Elutionskurven in obiger Abbildung zeigen, nimmt die Verschiebung der Peaks mit

zunehmender Abbauzeit ab. Dieser Effekt ist am ausgeprägtesten zwischen der 10 h Fraktion

und der 15 h Fraktion zu beobachten. Diese Ergebnisse zeigen somit, dass der Abbau

offensichtlich in keinem linearen Zusammenhang mit der Degradationszeit steht. Eine

Auftragung der mittleren Molmasse in Abhängigkeit von der Abbauzeit liefert einen nicht

linearen Zusammenhang (Abb. 5.3) dargestellt.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 5 10Degradationszeit [h]

Mitt

lere

Mol

mas

se [1

06 g/m

ol]

15

Abbildung 5.3: Auftragung der mittleren Molmassen der abgebauten Fraktionen gegen die Degradationszeit

-533.23

-533.02

-532.81

-532.61

-532.40

-532.19

-531.98

Ref

ract

ive

Inde

x (m

V)


-

kein Ultraschallabbau kein Ultraschallabbau

522.84

-521.06

-519.27

-517.49

-515.71

-513.92

-512.14

Ref

ract

ive

Inde

x (m

V)


-549.68

-528.04

-506.39

-484.75

-463.11

-441.47

-419.83

Ref

ract

ive

Inde

x (m

V)


-549.32

-508.56

-467.81

-427.05

-386.29

-345.54

-304.78

Ref

ract

ive

Inde

x (m

V)


α-D-Glucofuranose α-D-Glucofuranose

5 Ergebnisse

57

5.1.2 Viskosität der Proben in wässriger Lösung Für die Messungen wurden die Polysaccharide, wie im Abschnitt 4.4.1 des Methodenteils

beschrieben, in destilliertem Wasser gelöst und mit einem Rotationsviskosimeter analysiert.

Die Messungen wurden bei einer Schergeschwindigkeit von 2 s-1, einer Temperatur von

25°C und einer Dauer von 20 s durchgeführt. Die erhaltenen Viskositäten, sowie die

berechneten Exponenten der „Mark-Houwink-Gleichung“ (α) sind in Tabelle 5.2 aufgeführt.

Tabelle 5.2: Viskosität der verwendeten EPS mit einer Konzentration von 1,5 mg/mL extrazelluläre polymere Substanz Viskosität α

Dextran 0.97 mPa⋅s 0,11

Hyaluronat 58 mPa⋅s 0,78

Hyaluronat 3 Stunden durch Ultraschall-

einwirkung abgebaut

2.8 mPa⋅s 0,49

Xanthan 224 mPa⋅s 0,88

Xanthan 3 Stunden durch Ultraschall-

einwirkung abgebaut

3.1 mPa⋅s 0,55


einwirkung abgebaut

2.0 mPa⋅s 0,48


einwirkung abgebaut

1.6 mPa⋅s 0,43


einwirkung abgebaut

1.5 mPa⋅s 0,34

Die Viskosität der Lösung des verzweigten und ungeladenen Dextrans ist am niedrigsten. Bei

dem geladenen und unverzweigten Makromolekül Hyaluronat ist die Viskosität höher. Das

Xanthan als verzweigtes und geladenes Polymer besitzt die höchste Lösungs–Viskosität.

Das Verhalten der viskosen wässrigen Lösungen und damit die Struktur der gelösten

Polysaccharide wird durch den Ultraschallabbau beeinflusst. Bei zunehmender

Beschallungszeit nimmt nicht nur die Molmasse sondern auch die Viskosität der Lösung ab.

Darüber hinaus führt die Ultraschallbehandlung zu einer kompakteren Knäuelstruktur.

Während die unbehandelten Polyelektrolyte in wässriger Lösung einem vollständig

durchspülten Knäuel entsprechen (α≈ 1,0), beobachtet man für das Hyaluronat nach einer

dreistündigen Ultraschallbehandlung, dass sich die Dichte des gelösten Makromoleküls

erhöht. Ein Exponent (α) von 0,51 entspricht einem nur teilweise durchspülten Knäuel. Dies

5 Ergebnisse

58

wird ebenfalls für die über 3 h, 5 h, 10 h und 15 h abgebauten Xanthanfraktionen beobachtet

[89].

Wie stark der Einfluss der Degradation auf die Viskosität ist, kann man beim Xanthan

deutlich beobachten. Die Viskosität wird nach einem dreistündigem Ultraschallabbau um das

75-fache verringert. Betrachtet man allerdings den Abbau über größere Zeiträume, so fällt auf,

dass eine weitere Verringerung der Viskosität, wie in Tabelle 5.2 zu sehen, für Abbauzeiten

>3 h vergleichsweise gering ausfällt. Aus diesem Grund wurden für die weiteren

Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit überwiegend die über 3 h abgebauten Fraktionen

verwendet.

5 Ergebnisse

5.2 Konduktometrische Titration mit Kationen Um einen Einblick in die Wechselwirkungscharakteristik von Metallionen mit EPS zu

erhalten, bedarf es der Bestimmung des Äquivalenzpunktes. Dabei handelt es sich um einen

wichtigen Aspekt der quantitativen Analyse bezüglich der Wechselwirkungspositionen. Ein

probates Mittel zur Bestimmung des Äquivalenzpunktes ist die konduktometrische Titration

mit Kationen. Diese wurde wie in Kapitel 4.3 beschrieben durchgeführt. Bei den Titranden

handelt es sich um Lösungen der zwei bzw. dreiwertigen Metall- und Schwermetallionen der

Salze Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, Manganchlorid, Eisen(II)chlorid, Eisen(III)chlorid,

Kupferchlorid, Zinkacetat, Cadmiumacetat und Bleiacetat.

5.2.1 Leitfähigkeitsmessungen von Dextran Gemessen wurden Lösungen des Dextrans von 0,5 bis 3,0 mg/mL bei einer Temperatur von

25°C. Die Leitfähigkeitsfunktion zeigt keine Diskontinuität, so dass für Titrationen mit den

oben genannten Salzlösungen keine Äquivalenzpunkte bestimmt werden können (s. Abb. 5.4).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005

Konzentration Me2+ [mol/L]

Lei

tfäh

igke

it [m

S/cm

]

Abbildung 5.4: Exemplarische Abbildung für eine Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Ca2+-Lösung (0,05 mol/L)

In Abbildung 5.4 ist die Leitfähigkeit einer Dextran-Lösung gegen die Kationenkonzentration

aufgetragen. In diesem Fall handelt es sich um Ca2+-Ionen, die zur Polysaccharidlösung

titriert wurden. Die Titrationskurve weist bei allen Messungen lediglich eine unterschiedliche

59

5 Ergebnisse

Steigung auf. Ansonsten wurden weder bei Variation des Salzes noch bei der

Konzentrationsänderung der Dextranlösung auffällige Abweichungen vom kontinuierlichen

Verlauf beobachtet. Die leichte Krümmung bei höheren Konzentrationen ist auf den Einfluss

des Kohlrauschschen Quadratwurzelgesetzes zurückzuführen. Die Vergleichsabbildungen für

weitere Dextrankonzenrationen sowie der unterschiedlichen Salze sind im Anhang (s. Abb.

A.1 bis A.8) zufinden.

5.2.2 Leitfähigkeitsmessungen von Hyaluronat Wie in Abschnitt 5.2 beschrieben, wurden für das Hyaluronat konduktometrische Titrationen

mit wässrigen Lösungen verschiedener Metallkationen durchgeführt. Hierbei wurden

verschieden konzentrierte wässrige Lösungen des Hyaluronats von 0,5 bis 3,0 mg/mL bei

einer Temperatur von 25°C gemessen. Aufgrund der resultierenden Wechselwirkungen

zwischen dem geladenen Polysaccharid und den hinzutitrierten Kationen gibt es einen

diskontinuierlichen Verlauf der Leitfähigkeitsfunktion. Ein exemplarischer Verlauf einer

typischen Leitfähigkeitsmessung, bei der die Leitfähigkeit gegen die Kationenkonzentration

aufgetragen wird, ist in der Abbildung 5.5 zu sehen.

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0,55

0,6

0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005


Lei

tfäh

igke

it [m

S/cm

]

α-D-Glucofuranose

Abbildung 5.5: Exemplarische Abbildung für eine Titration einer Lösung (100 mL) des über 3 h abgebauten Hyaluronats (1,5 mg/mL) mit einer Pb2+-Lösung (0,05 mol/L)

60

5 Ergebnisse

Zu Beginn der Leitfähigkeitstitration nimmt die Leitfähigkeit im Vergleich zum restlichen

Funktionsverlauf nur langsam zu. Wird allerdings die Äquivalenzkonzentration des Kations

(s. Abb. 5.5) überschritten, so verläuft diese kontinuierlich und mit einer größeren Steigung

als im Anfangsbereich. Auch hier gilt wie beim Dextran, dass die Abweichung bei höheren

Elektrolytkonzentrationen durch das Kohlrausche Quadratwurzel-Gesetz bedingt wird. Wie in

Kapitel 4.3 erläutert, ist es möglich durch graphische Extrapolation den Äquivalenzpunkt zu

bestimmen. Trägt man zusätzlich das erste Differenzial der Leitfähigkeitsfunktion auf (s. Abb.

5.6), so kann mit Hilfe der Bedingung, dass diese ab dem Äquivalenzpunkt annähernd

konstant wird (s. Kap. 4.3) die Äquivalenzkonzentration genauer verifiziert werden.

0

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005


∆κ

[mS/

cm]

Abbildung 5.6: Exemplarische Darstellung der ersten Ableitung einer Leitfähigkeitsfunktion von Hyaluronat (1,0 mg/mL; 100 mL) mit dem Kation „Pb2+“

α-D-Glucofuranose

Vergleicht man die im Anhang (s. Abb. A.9 bis A.15) abgebildeten Leitfähigkeitsgraphen, so

fällt auf, dass es Variationen im Zusammenhang mit den jeweiligen Kationen gibt. Oberhalb

der Äquivalenzkonzentration beobachtet man unterschiedliche Steigungen der Graphen,

welche von der molaren Leitfähigkeit des Kations geprägt sind. Darüber hinaus tritt eine mehr

oder weniger ausgeprägte Diskontinuität in den einzelnen Abbildungen auf. Die

Diskontinuität im Bereich der Äquivalenzkonzentration ist ein charakteristisches Merkmal für

die Stabilität des sich einstellenden Komplexes zwischen EPS und Metallion und ist um so

ausgeprägter, je intensiver die Wechselwirkungen sind. Als Maß für die Intensität der

Wechselwirkung wird, wie in Kapitel 4.3 beschrieben, die Differenz der Leitfähigkeit

zwischen reinem Elektrolyt und dem wechselwirkenden Elektrolyt ∆κ * bestimmt. 61

5 Ergebnisse

62

Die erhaltenen Äquivalenzkonzentrationen und die berechneten ∆κ*-Werte für die jeweiligen

Kationen sind in den folgenden Tabellen zusammengestellt.

Tabelle 5.3: Äquivalenzkonzentration Tabelle 5.4: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Calcium und ∆κ*-Werte von Magnesium

Hyaluronat

[mg/mL]

Ca2+

[mol/L]

∆κ*

[mS/cm]

Hyaluronat

[mg/mL]

Mg2+

[mol/L]

∆κ*

[mS/cm]

0,5 2,5⋅10-5 0,018 0,5 3,0⋅10-5 0,015

1,0 5,5⋅10-5 0,031 1,0 5,5⋅10-5 0,023

1,5 8,0⋅10-5 0,074 1,5 7,0⋅10-5 0,040

2,0 10,5⋅10-5 0,076 2,0 10,0⋅10-5 0,045

2,5 12,5⋅10-5 0,080 2,5 12,5⋅10-5 0,053

3,0 15,0⋅10-5 0,087 3,0 15,0⋅10-5 0,056

Tabelle 5.5: Äquivalenzkonzentration Tabelle 5.6: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Mangan und ∆κ*-Werte von Kupfer

Hyaluronat

[mg/mL]

Mn2+

[mol/L]

∆κ*

[mS/cm]

Hyaluronat

[mg/mL]

Cu2+

[mol/L]

∆κ*

[mS/cm]

0,5 2,8⋅10-5 0,029 0,5 2,5⋅10-5 0,027

1,0 5,5⋅10-5 0,025 1,0 5,0⋅10-5 0,053

1,5 7,5⋅10-5 0,039 1,5 7,5⋅10-5 0,075

2,0 10,0⋅10-5 0,072 2,0 10,0⋅10-5 0,096

2,5 12,5⋅10-5 0,059 2,5 12,5⋅10-5 0,122

3,0 15,0⋅10-5 0,063 3,0 15,0⋅10-5 0,139

Tabelle 5.7: Äquivalenzkonzentration Tabelle 5.8: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Eisen(II) und ∆κ*-Werte von Zink

Hyaluronat

[mg/mL]

Fe2+

[mol/L]

∆κ*

[mS/cm]

Hyaluronat

[mg/mL]

Zn2+

[mol/L]

∆κ*

[mS/cm]

0,5 4,0⋅10-5 0,030 0,5 3,0⋅10-5 0,032

1,0 3,5⋅10-5 0,043 1,0 6,5⋅10-5 0,069

1,5 8,0⋅10-5 0,064 1,5 7,3⋅10-5 0,075

2,0 10,0⋅10-5 0,075

2,5 12,0⋅10-5 0,090

3,0 15,0⋅10-5 0,114

5 Ergebnisse

63

Tabelle 5.9: Äquivalenzkonzentration Tabelle 5.10: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Cadmium und ∆κ*-Werte von Blei

Hyaluronat

[mg/mL]

Cd2+

[mol/L]

∆κ*

[mS/cm]

Hyaluronat

[mg/mL]

Pb2+

[mol/L]

∆κ*

[mS/cm]

0,5 3,0⋅10-5 0,016 0,5 2,5⋅10-5 0,010

1,0 5,3⋅10-5 0,056 1,0 6,0⋅10-5 0,064

1,5 8,0⋅10-5 0,084 1,5 7,5⋅10-5 0,102

Die entsprechenden Werte für die Äquivalenzkonzentration sowie für ∆κ* konnten für die

Titration mit Eisen(III) nicht ermittelt werden. Bei einer Konzentration von 0,9 mmol/L

wurde immer wieder das Löslichkeitsprodukt der wässrigen Lösung überschritten, so dass die

gebildeten Komplexe in Form von Flocken ausfielen. Aus diesem Grund war es auch nicht

möglich das stöchiometrische Verhältnis von Kation zu Polysacchariduntereinheit zu

bestimmen.

Diese charakteristische Größe, welche untrennbar mit der Konformation des Komplexes

verknüpft ist, wurde für alle im Rahmen dieser Arbeit verwendeten bivalenten Salze

errechnet. Das berechnete Verhältnis wird für Hyaluronat mit den Konzentrationen von 0,5

bis 2,0 mg/mL in der Tabelle 5.11 aufgeführt.

Tabelle 5.11: Stöchiometrisches Verhältnis zwischen den komplementären Kationen und der Polymeruntereinheit von Hyaluronat

Hyaluronatkonzentration [g/L]

0,5 1,0 1,5 2,0

Calciumchlorid 1:5,26 1:4,78 1:4,94 1:5,01

Magnesiumchlorid 1:4,38 1:4,78 1:5,64 1:5,54

Manganchlorid 1:4,79 1:4,78 1:5,26 1:5,26

Eisen(II)chlorid 1:3,29 1:5,26 1:4,93 1:5,26

Kupferchlorid 1:5,26 1:5,26 1:5,26 1:5,26

Zinkacetat 1:4,38 1:4,05 1:5,45

Cadmiumacetat 1:4,38 1:5,01 1:4,94

Biv

alen

te S

alze

Bleiacetat 1:5,26 1:4,39 1:5,26

Bei den Schwermetallionen Zink, Cadmium und Blei war die Berechnung des Verhältnisses

oberhalb einer Konzentration von 1,5 mg/mL des Hyaluronats nicht möglich, da sich bei der

5 Ergebnisse

Titration ein Feststoff bildete. Folglich scheidet die Bestimmung eines Äquivalenzpunktes als

Grundlage für die Berechnung aus (s. Tab. 5.11).

Wird der Mittelwert für die aufgeführten Ergebnisse gebildet, so kommen auf ein Kation fünf

Monomereinheiten.

5.2.3 Leitfähigkeitsmessungen von Xanthan Für wässrige Lösungen des Xanthans in Konzentrationen von 0,5 bis 3,0 mg/mL wird

entsprechend Kapitel 4.3 die Leitfähigkeit in Abhängigkeit der zugesetzten

Kationenkonzentration bei einer Temperatur von 25°C gemessen. Ebenso wie beim

Hyaluronat gibt es auch beim Xanthan, wegen der resultierenden Wechselwirkungen

zwischen dem geladenen Polysaccharid und den hinzutitrierten Kationen, einen

diskontinuierlichen Verlauf der Leitfähigkeitsfunktion. Ein exemplarischer Verlauf einer

typischen Leitfähigkeitsmessung, bei der die Leitfähigkeit gegen die Kationenkonzentration

aufgetragen wird, ist in der Abbildung 5.7 zu sehen.

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005


Lei

tfäh

igke

it [m

S/cm

]

Äquivalenzpunkt

Abbildung 5.7: Exemplarische Abbildung einer Leitfähigkeitskurve für die Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung (100 mL) der Konzentration 1,0 mg/mL mit einer Zn2+-Lösung der Konzentration 0,05 mol/L

64

5 Ergebnisse

Der grundsätzliche Verlauf der Leitfähigkeitsfunktion ähnelt der des Hyaluronats (vgl.

Abb. 5.5). Bis zum Äquivalenzpunkt hin nimmt die Leitfähigkeit nur wenig zu, die Funktion

verläuft sehr flach. Wird die Äquivalenzkonzentration des Kations (s. Abb. 5.7) überschritten,

so verläuft der Funktionsgraph mit einer größeren Steigung. Die Abweichung bei höheren

Elektrolytkonzentrationen resultiert aus dem Kohlrauschschen Quadratwurzel-Gesetz. Wie in

Kapitel 4.3 erläutert, ist es möglich, durch eine graphische Auswertung der

Leitfähigkeitsfunktion und deren erste Ableitung (s. Abb. 5.8) den Äquivalenzpunkt zu

bestimmen. Hierbei wird der Äquivalenzpunkt entsprechend den Abbildung 5.7 und 5.8

abgelesen.

0

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005Konzentration Me2+ [mol/L]

∆κ

[mS/

cm]

Äquivalenzpunkt

Abbildung 5.8: Exemplarische Darstellung der ersten Ableitung einer Leitfähigkeitsfunktion von Xanthan (1,5 mg/mL; 100 mL) in Abhängigkeit von der Zn2+-Ionenkonzentration

Wie die Abbildungen im Anhang (s.Abb. A.16 bis A.22) zeigen, treten für Xanthan im

Leitfähigkeitsgraphen kationenspezifische Varianzen auf. Am auffälligsten ist hierbei, neben

den unterschiedlichen Steigungen oberhalb der Äquivalenzkonzentration, welche von der

molaren Leitfähigkeit des Kations abhängen, die mehr oder weniger ausgeprägte

Diskontinuität in den einzelnen Abbildungen. Dieser Knick im Bereich der

Äquivalenzkonzentration ist ein charakteristisches Merkmal für die Stärke des sich

einstellenden Komplexes und ist um so ausgeprägter, je intensiver die Wechselwirkungen

sind. Als Maß für die Intensität der Wechselwirkung, wird die Differenz der Leitfähigkeit

zwischen reinem Elektrolyt und dem wechselwirkenden Elektrolyt ∆κ* bestimmt.

65

5 Ergebnisse

66

Die erhaltenen Äquivalenzkonzentrationen sowie die berechneten ∆κ*-Werte für die

jeweiligen Kationen sind in den folgenden Tabellen zusammengestellt.

Tabelle 5.12: Äquivalenzkonzentration Tabelle 5.13: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Calcium und ∆κ*-Werte von Magnesium

Xanthan

[mg/mL]

Ca2+

[mol/L]

∆κ*

[mS/cm]

Xanthan

[mg/mL]

Mg2+

[mol/L]

∆κ*

[mS/cm]

0,5 2,7⋅10-5 0,003 0,5 2,5⋅10-5 0,012

1,0 5,0⋅10-5 0,05 1,0 5,5⋅10-5 0,019

1,5 8,0⋅10-5 0,078 1,5 7,5⋅10-5 0,045

2,0 10,0⋅10-5 0,081 2,0 9,5⋅10-5 0,070

Tabelle 5.14: Äquivalenzkonzentration Tabelle 5.15: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Mangan und ∆κ*-Werte von Kupfer

Xanthan

[mg/mL]

Mn2+

[mol/L]

∆κ*

[mS/cm]

Xanthan

[mg/mL]

Cu2+

[mol/L]

∆κ*

[mS/cm]

0,5 3,3⋅10-5 0,002 0,5 3,0⋅10-5 0,025

1,0 6,0⋅10-5 0,028 1,0 5,5⋅10-5 0,043

1,5 9,0⋅10-5 0,032 1,5 7,0⋅10-5 0,059

2,0 9,5⋅10-5 0,063 2,0 9,5⋅10-5 0,083

Tabelle 5.16: Äquivalenzkonzentration Tabelle 5.17: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Eisen(II) und ∆κ*-Werte von Zink

Xanthan

[mg/mL]

Fe2+

[mol/L]

∆κ*

[mS/cm]

Xanthan

[mg/mL]

Zn2+

[mol/L]

∆κ*

[mS/cm]

0,5 3,0⋅10-5 0,021 0,5 3,0⋅10-5 0,009

1,0 5,5⋅10-5 0,034 1,0 5,5⋅10-5 0,045

1,5 7,5⋅10-5 0,058 1,5 6,5⋅10-5 0,082

2,0 9,0⋅10-5 0,064 2,0 9,5⋅10-5 0,088

5 Ergebnisse

Tabelle 5.18: Äquivalenzkonzentration Tabelle 5.19: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Cadmium und ∆κ*-Werte von Blei

Xanthan

[mg/mL]

Cd2+

[mol/L]

∆κ*

[mS/cm]

Xanthan

[mg/mL]

Pb2+

[mol/L]

∆κ*

[mS/cm]

0,5 3,5⋅10-5 0,034 0,5 3,0⋅10-5 0,037

1,0 5,5⋅10-5 0,049 1,0 5,5⋅10-5 0,070

1,5 10,0⋅10-5 0,093 1,5 10,0⋅10-5 0,130

Die entsprechenden Werte für die Äquivalenzkonzentration und für ∆κ* konnten für die

Titration mit Eisen(III) nicht ermittelt werden. Ab einer Konzentration von 0,65 mmol/L

wurde immer wieder das Löslichkeitsprodukt der wässrigen Lösung überschritten, so dass die

gebildeten Komplexe in Form von Flocken ausfielen.

Darüber hinaus wurden die Werte für höhere Konzentrationen als 2,0 mg/mL in den obigen

Tabellen nicht berücksichtigt, da wegen der im Vergleich mit dem Hyaluronat offensichtlich

stärkeren Wechselwirkung der bivalenten Kationen ein außerordentlich ungleichmäßiger

Kurvenverlauf die Folge war. Ein Ausschnitt der Leitfähigkeitskurve für die Titration einer

Xanthan-Lösung ist in Abbildung 5.9 dargestellt.

0,7

0,71

0,72

0,73

0,74

0,75

0,76

0,77

0,78

0,79

0,8

0 0,00025 0,0005 0,00075 0,001 0,00125


Lei

tfäh

igke

it [m

S/cm

]

Abbildung 5.9: Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung der Konzentration 2,5 mg/mL mit einer Lösung von Cd2+-Ionen mit einer Konzentration von 0,05 mol/L

67

5 Ergebnisse

68

Durch die nicht eindeutige Zuordnung des Äquivalenzpunktes fehlte jegliche Grundlage zur

Bestimmung der Äquivalenzkonzentration und zur Berechnung von ∆κ*, sowie des

stöchiometrischen Quotienten QÄ.

Die charakteristische Größe des stöchiometrischen Verhältnisses von Kation zur

Polymeruntereinheit, welche untrennbar mit der Konformation des Komplexes verknüpft ist,

wurde für das Xanthan mit den Konzentration von 0,5 bis 2,0 mg/mL berechnet (s. Tab. 5.20).

Tabelle 5.20: Stöchiometrisches Verhältnis zwischen den komplementären Kationen und der Polymeruntereinheit von Xanthan

Xanthankonzentration [g/L]

0,5 1,0 1,5 2,0

Calciumchlorid 1:1,97 1:2,13 1:2,0 1:2,14

Magnesiumchlorid 1:2,14 1:1,94 1:2,14 1:2,25

Manganchlorid 1:1,62 1:1,78 1:1,78 1:2,25

Eisen(II)chlorid 1:1,78 1:1,94 1:2,13 1:2,37

Kupferchlorid 1:1,78 1:1,94 1:2,29 1:2,29

Zinkacetat 1:1,78 1 :1,94 1:2,46 1:2,25

Cadmiumacetat 1:1,53 1:1,94 1:1,97

Biv

alen

te S

alze

Bleiacetat 1:1,78 1:1,94 1:1,97

Bei den Schwermetallionen Cadmium und Blei wurde das Verhältnis oberhalb einer

Xanthankonzentration von 1,5 mg/mL nicht berücksichtigt, da sich bei der Titration ein

Feststoff bildete. Folglich scheidet die Bestimmung eines Äquivalenzpunktes und damit der

Äquivalenzkonzentration zur Berechnung von ∆κ*, sowie des stöchiometrischen

Verhältnisses aus.

Wird der Mittelwert für die aufgeführten Ergebnisse gebildet, so kommen auf ein Kation zwei

Monomereinheiten.

5 Ergebnisse

5.3 Rotationsviskosimetrische Untersuchung in Ab- bzw. Anwesenheit von mehrwertigen Kationen In Abschnitt 5.1.2 wurde bereits die Viskositätsänderung durch eine mechanische

Degradation der Molmasse beschrieben. Im Kapitel 5.2 wurden die Ergebnisse der

Wechselwirkung von bi- und trivalenten Kationen während einer Leitfähigkeitsmessung

geschildert. Zur weiteren Charakterisierung wird in diesem Kapitel anhand der bei der

Rotationsviskosimetrie erhaltenen Ergebnisse sowohl der Einfluss von bi- bzw. trivalenten

Kationen auf die Viskosität einer EPS-Lösung, als auch der Einfluss variierender

Schergeschwindigkeiten auf die EPS-Lösungen gezeigt.

5.3.1 Viskositätsmessungen in Abhängigkeit von der Kationenkonzentration Mit Hilfe der Rotationsviskosimetrie wurde der Einfluss von Kationen auf die Viskosität von

EPS-Lösungen untersucht, wobei die Vorgehensweise weitestgehend der der

konduktometrischen Titration entsprach (s. Absch. 4.4.1). Bei den verwendeten Kationen

handelt es sich um zwei bzw. dreiwertige Metall- und Schwermetallionen der Salze

Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, Manganchlorid, Eisen(II)chlorid, Eisen(III)chlorid,

Kupferchlorid, Zinkacetat, Cadmiumacetat und Bleiacetat.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 0,0001 0,0002 0,0003 0,0004 0,0005 0,0006 0,0007 0,0008 0,0009


η [m

Pa*s

]

Abbildung 5.10: Beispielabbildung für die Viskositätsmessung einer Fe3+-Titration. Es wurde in 50 µL-Schritten eine Eisen(III)-Lösung (0,05 mol/L) in eine Hyaluronatlösung (1,5 mg/mL; 50 mL) gegeben

69

5 Ergebnisse

Bei dem Versuch EPS-Lösungen mit dem trivalenten Kation Fe3+ zu titrieren, wurde ab einer

Konzentration von 0,9 mmol/L, immer das Löslichkeitsprodukt der wässrigen Lösung

überschritten und es fiel ein Feststoff aus. Des Weiteren sind die bis zu dieser Konzentration

ermittelten Messwerte wenig repräsentativ, da die Messungen nicht reproduzierbare

Ergebnisse liefern. In obiger Abbildung 5.10 werden die Messwertschwankungen im Verlauf

einer solchen Messung aufgezeigt.

Es kommt also, wie in dieser Abbildung dargestellt, während der Messungen zu erheblichen

Viskositätssprüngen, welche unabhängig vom untersuchten Polyelektrolyt und seiner

Konzentration beobachtet wurden.

5.3.1.1 Viskositätsänderungen von Dextranlösung Die Messungen wurden entsprechend Abschnitt 4.4.1 des Methodenteils durchgeführt. Das

Dextran (1,5 mg/mL) wurde in destilliertem Wasser gelöst (50 mL) und bei einer Temperatur

von 25°C vermessen. Die erhaltenen Viskositäten wurden gegen die Kationenkonzentration

aufgetragen. Eine exemplarische Abbildung für ein solches Diagram liefert die

Abbildung 5.11.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014


η [m

Pa*s

]

Abbildung 5.11: Exemplarische Abbildung für eine rotationsviskosimetrische Titration an Dextranlösung. Es wurde in 50 µL-Schritten eine Ca2+-Lösung (0,05 mol/L) in eine Dextranlösung (1,5 mg/mL; 50 mL) gegeben

70

5 Ergebnisse

Im Fall des abgebildeten Titrationsverlaufs handelt es sich um Ca2+-Ionen, die zur

Polysaccharidlösung titriert wurden. Die Titrationskurve weist jedoch für alle anderen

Kationen (auch Eisen(III)chlorid) stets einen linearen Verlauf auf. Die leichten Varianzen der

Messpunkte liegen alle im Rahmen der versuchsbedingten Toleranz. Betrachtet man die im

Anhang abgebildeten Graphen der rotationviskosimetrischen Titrationen des Dextrans, so fällt

auf, dass ein Einfluss auf die Viskosität durch Zugabe von bi- bzw. trivalenten Kationen

ausbleibt. Die Viskosität der Dextranlösungen bleibt also grundsätzlich für alle

durchgeführten Versuche konstant.

5.3.1.2 Viskositätsänderungen von Hyaluronatlösung Wie schon im Abschnitt 5.3.1 beschrieben wurde auch für das Hyaluronat eine

rotationsviskosimetrische Titration mit Kationen durchgeführt. Hierbei wurden wässrige

Lösungen des Hyaluronats (1,5 mg/mL) bei einer Temperatur von 25°C gemessen. Aufgrund

der resultierenden Wechselwirkungen zwischen dem geladenen Polysaccharid und den

hinzutitrierten Kationen, weicht der Verlauf der Viskositätsfunktion von einer Geraden ab.

Ein exemplarischer Verlauf einer typischen Viskositätsmessung, bei der die Viskosität gegen

die Kationenkonzentration aufgetragen wird, ist in der Abbildung 5.12 zu sehen.

0

10

20

30

40

50

60

0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014

Konzentration Me2+ [mmol/L]

η [m

Pa*s

]

Äquivalenzpunkt

Abbildung 5.12: Exemplarischer Verlauf für eine typische Viskositätsmessung des Hyaluronats (nicht abgebaut). Es wurde in 50 µL-Schritten eine Ca2+-Lösung (0,05 molar) in eine Hyaluronatlösung (1,5 mg/mL; 50 mL) titriert

71

5 Ergebnisse

72

Wie in obiger Abbildung zu erkennen, nimmt die Viskosität während der Titration bis zum

Erreichen eines nahezu konstanten Wertes, in diesem Fall ca. 18 mPa⋅s, ab. Allerdings ist der

Funktionsgraph dabei keineswegs linear, er folgt vielmehr einem kontinuierlich abnehmenden

Verlauf der sich asymptotisch einer konstanten Viskosität nähert. Eine solche

Viskositätsabnahme ist typisch für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten bivalenten

Kationen und wurde bei allen Messdurchläufen beobachtet.

Wie im Abschnitt 4.4.1 des Methodenteils erläutert, ist es möglich, durch graphische

Extrapolation den Äquivalenzpunkt zu bestimmen. Diese ist gemeinsam mit den berechneten

stöchiometrischen Verhältnissen zwischen Kation und Polymeruntereinheit in Tabelle 5.21

aufgeführt.

Tabelle 5.21: Äquivalenzkonzentration und stöchiometrisches Verhältnis zwischen den kompleme tären Kationen und der Polymeruntereinheit von Hyaluronat (1,5 mg/mL) n

Äquivalenz-

konzentration[mol/L]

Kation-Monomer-

Verhältniss

Calciumchlorid 9,0⋅10-5 1:4,4

Magnesiumchlorid 8,0⋅10-5 1:5,0

Manganchlorid 8,0⋅10-5 1:5,0

Eisen(II)chlorid 9,0⋅10-5 1:4,4

Kupferchlorid 8,0⋅10-5 1:5,0

Zinkacetat 8,0⋅10-5 1:5,0

Cadmiumacetat 8,5⋅10-5 1:4,7

Biv

alen

te S

alze

Bleiacetat 8,0⋅10-5 1:5,0

Wird der Mittelwert für die aufgeführten Verhältnisse gebildet, so kommen auf ein Kation ca.

fünf Polymeruntereinheiten. Vergleicht man die erhaltenen Äquivalenzkonzentrationen der

Viskosimetrie mit denen der Konduktometrie, so fällt auf, dass diese im Mittel um 7,5%

voneinander abweichen.

5 Ergebnisse

5.3.1.3 Viskositätsänderungen von Xanthanlösung Für Xanthan wurden wässrige Lösungen mit einer Polysaccharidkonzentration von

1,5 mg/mL bei einer Temperatur von 25°C gemessen. Ebenso wie beim Hyaluronat ergeben

sich auch beim Xanthan, wegen der resultierenden Wechselwirkungen zwischen dem

geladenen Polysaccharid und den hinzutitrierten Kationen in Abhängigkeit von der

Konzentration, unterschiedliche Viskositäten. Dies führt zu einer Abweichung vom linearen

Verhalten während der Titration. Ein exemplarischer Verlauf einer typischen

Viskositätsmessung, bei der die Viskosität gegen die Kationenkonzentration aufgetragen

wird, ist in der Abbildung 5.13 zu sehen.

Das Diagram ähnelt bei gleicher Konzentration stark dem des Hyaluronats. Der

Funktionsgraph ist ebenfalls nichtlinear und folgt einem kontinuierlich abnehmenden Verlauf,

der sich asymptotisch einer konstanten Viskosität nähert. Im Vergleich zum Hyaluronat ist

jedoch die asymptotische Annäherung zu niedrigeren Konzentrationen hin verschoben, so

dass der Äquivalenzpunkt von dem des Hyaluronats abweicht.

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014

Konzentration von Me2+ [mol/L]

η [m

Pa*s

] Äquivalenzpunkt

Abbildung 5.13: Exemplarische Abbildung der Viskositätsänderung einer Xanthan-Lösung (1,5 mg/mL; 3h abgebaut) durch Titration mit einer CaCl2-Lösung (0,05 mol/L)

Die hier, wie auch beim Hyaluronat, detektierte Viskositätsabnahme ist typisch für die im

Rahmen dieser Arbeit untersuchten bivalenten Kationen und wurde bei allen Messdurchläufen

beobachtet.

Durch graphische Extrapolation, wie im Abschnitt 4.4.1 des Methodenteils beschrieben,

wurden die Äquivalenzpunkte und somit die Äquivalenzkonzentrationen bestimmt. Diese sind

73

5 Ergebnisse

gemeinsam mit den berechneten stöchiometrischen Verhältnissen in Tabelle 5.22 für eine

Xanthankonzentration von 1,5 mg/mL aufgeführt.

Tabelle 5.22: Äquivalenzkonzentration und stöchiometrisches Verhältnis zwischen den komplementären Kationen und der Polymeruntereinheit von Xanthan (1,5 mg/mL)

Äquivalenz-

konzentration[mol/L]

Kation-Monomer-

Verhältniss

Calciumchlorid 8,5⋅10-5 1:1,9

Magnesiumchlorid 8,0⋅10-5 1:2,0

Manganchlorid 8,0⋅10-5 1:2,0

Eisen(II)chlorid 8,5⋅10-5 1:1,9

Kupferchlorid 9,0⋅10-5 1:1,8

Zinkacetat 8,0⋅10-5 1:2,0

Cadmiumacetat 8,5⋅10-5 1:1,9

Bleiacetat 8,0⋅10-5 1:2,0

Biv

alen

te S

alze

Wird der Mittelwert für die aufgeführten Verhältnisse gebildet, so kommen auf ein Kation ca.

zwei Polymeruntereinheiten. Vergleicht man die erhaltenen Äquivalenzkonzentrationen mit

denen der Konduktometrie, so fällt eine durchschnittliche Abweichung von 7% auf.

5.3.2 Viskositätsmessungen in Abhängigkeit von der Schergeschwindigkeit Die Viskosität einer wässrigen EPS-Lösung ist stark von der Tertiärstruktur des gelösten

Biopolymers abhängig, so dass diese charakteristische Größe mit Hilfe eines

Rotationsviskosimeters bestimmt werden kann. Um das Fließverhalten und damit die

Abhängigkeit einer solch viskosen Lösung von der Schergeschwindigkeit zu ergründen,

wurden unter Variation der Rotationsfrequenz die Viskositäten ermittelt. Dabei wurden

wässrige Proben von Dextran, Hyaluronat und Xanthan mit und ohne Salzzusatz untersucht.

In diesem Abschnitt ist das newtonsche und nichtnewtonsche Verhalten von EPS-Lösungen

unter interionischen Wechselwirkungen mit einem bi- bzw. trivalenten Kation sowie ohne

Fremdioneneinwirkung dokumentiert.

74

5 Ergebnisse

5.3.2.1 Viskositätsänderungen von Dextranlösung Wie im Abschnitt 4.4.2 des Methodenteils näher erläutert, wurde das Dextran in destilliertem

Wasser aufgenommen und bei 25°C für 1,5 min vermessen. Bei den zuvor durchgeführten

viskosimetrischen Untersuchungen des Dextrans in Anwesenheit von bi- bzw. trivalenten

Kationen wurde während einer Messung keine Varianz der Impulsübertragung beobachtet (s.

Absch. 5.3.1.1). Dieser Sachverhalt wurde hier im Rahmen der durchgeführten

Viskositätsmessungen sowohl bei den Lösungen mit Salzzusatz als auch ohne bestätigt. Ein

Einfluss auf die Viskosität blieb aus, wie in Abbildung 5.14 für eine Dextranlösung mit einer

Konzentration von 1,5 mg/mL zu sehen ist.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 1 2 3 4 5

Schergeschwindigkeit [s-1]

η [m

Pa*s

]

Abbildung 5.14: Abbildung einer Viskositätsmessung von Dextran (1,5 mg/mL) bei unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten

Die Viskosität der Dextranlösung bleibt bei den eingesetzten Schergeschwindigkeiten von 0,5

bis 5,0 s-1 konstant, so dass eine Gerade resultiert. Darüber hinaus zeigen Messungen bis zu

einer Schergeschwindigkeit von 8,0 s-1 keinerlei Einfluss auf die untersuchten Proben, so dass

es sich bei den untersuchten Dextranlösungen in guter näherung um newtonsche Flüssigkeiten

handelt.

75

5 Ergebnisse

5.3.2.2 Viskositätsänderungen von Hyaluronatlösung Als Grundlage für die Messungen wurden die unter Abschnitt 4.4.2 aufgeführten

Versuchsbedingungen berücksichtigt. Die wässrige Hyaluronatlösung wurde bei 25°C

vermessen und die Viskositäten bei unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten

aufgezeichnet. Ein solches Diagram, bei dem die Schergeschwindigkeit (dreier

unterschiedlicher Messungen) gegen die Viskosität aufgetragen wird, ist in Abbildung 5.15

dargestellt. Bei den gezeigten Ergebnissen handelt es sich um einen Viskositätsverlauf von

Hyaluronat ohne Salzzusatz und um zwei Viskositätsverläufe mit Salzzusatz. In diesem Fall

wurde Ca2+ als Kation für die Messungen der unteren beiden Verläufe eingesetzt. Es kann ein

deutlicher Unterschied gegenüber dem salzfreien Verlauf beobachtet werden.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 1 2 3 4 5


η [m

Pa*s

]

ohne Zusätzemit 0,08 mM CaCl2mit CaCl2 gesättigt

Abbildung 5.15: Abbildung einer Viskositätsmessung von Hyaluronat (1,5 mg/mL) bei unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten und Salzkonzentrationen (CaCl2)

Betrachtet man den oberen Graphen des Diagramms, bei dem kein Salz hinzugegeben wurde,

so sieht man eine Abnahme der Viskosität, während die Schergeschwindigkeit zunimmt. Dies

entspricht einer Abweichung vom klassischen Verhalten einer newtonschen Flüssigkeit (s.

Kap. 2.5.4). Für den Funktionsgraphen einer Lösung mit Äquivalenzkonzentration (s. Tab. 5.3

u. 5.21), sowie für den im Diagram abgebildeten Verlauf einer gesättigten Lösung, gilt dies

nicht. Bei diesen bleibt die Viskosität unabhängig von der Schergeschwindigkeit konstant und

entspricht somit dem Verhalten einer newtonschen Flüssigkeit.

76

5 Ergebnisse

5.3.2.3 Viskositätsänderungen von Xanthanlösung Beim Xanthan, wie auch beim Dextran und dem Hyaluronat, wurde darauf geachtet, eine

homogene wässrige Lösung zu erhalten. Die Viskositäten wurden bei unterschiedlichen

Schergeschwindigkeiten und einer Temperatur von 25°C bestimmt. Die Ergebnisse einer

solchen Messung wurden in ein Diagram übernommen und die Viskosität gegen die

Schergeschwindigkeit aufgetragen. Ein exemplarisches Diagram ist in Abbildung 5.16 für

drei Messungen unterschiedlicher Salzkonzentrationen dargestellt. In diesem Fall wurde

CaCl2 für die Messungen verwendet.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5


η [m

Pa*s

]

ohne Zusätzemit 0,08 mM CaCl2gesättigt mit CaCl2

Abbildung 5.16: Abbildung einer Viskositätsmessung von Xanthan (1,5 mg/mL) bei unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten und Salzkonzentrationen (CaCl2)

Ganz ähnlich den Beobachtungen beim Hyaluronat erkennt man für die Probe ohne

Salzzusatz, dass eine nahezu lineare Abnahme der Viskosität über den Verlauf einer

Schergeschwindigkeitszunahme die Folge ist (nichtnewtonsches Verhalten). Für eine EPS-

Lösung mit Ca2+-Ionen in der Äquivalenzkonzentration (s. Tab. 5.12 u. 5.22) sowie eine Ca2+-

Ionen gesättigte Lösung, gilt dies nicht. Bei diesen beiden bleibt die Viskosität unabhängig

von der Schergeschwindigkeit konstant, welches einem newtonschen Verhalten der viskosen

Lösung entspricht.

77

5 Ergebnisse

5.4 Einfluss zweiwertiger Kationen auf die optische Aktivität von

Polysacchariden

Um den Einfluss von bivalenten Kationen auf extrazelluläre polymere Substanzen bezüglich

ihrer optischen Aktivität zu untersuchen, wurden circulardichroitische Messungen

überwiegend im Wellenlängenbereich des fernen UVs (150 nm – 300 nm) durchgeführt. Die

in diesem Bereich optisch aktiven chiralen Zentren geben Aufschluss über mögliche

konformative Wechselwirkungen zwischen Kation und Biopolymer. Hierbei wurden

unterschiedlich konzentrierte Polysaccharidlösungen im Rahmen von Titrationsversuchen

untersucht. Es handelt sich dabei um Relativmessungen des Hyaluronats und dem Xanthan.

In diesem Abschnitt sind die Ergebnisse verschiedener Titrationsversuche der beiden

geladenen Polysaccharide aufgeführt.

5.4.1 Circulardichroismus von Hyaluronat Die Messungen wurden, wie im Methodenteil (s. Absch. 4.5) beschrieben, durchgeführt. Zu

diesem Zweck lagen Lösungen der Konzentration 7 mg/mL des über 3 h abgebauten

Hyaluronats (s. Absch. 4.1) mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen vor, welche nach der

Filtration mit zirkular polarisiertem Licht bestrahlt wurden.

-250

-200

-150

-100

-50

0200 205 210 215 220 225 230 235 240 245 250

λ (nm)

mD

eg

Abbildung 5.17: CD-Kurven von über 3 h abgebautem Hyaluronat (a) und von Hyaluronat-Lösungen mit einer Ca2+-Konzentration von 0,0025 mol/L (b), 0,005 mol/L (c) und 0,0075 mol/L (d)

d

c b a

78

5 Ergebnisse

Die Messergebnisse werden zur graphischen Auswertung in ein Diagram übertragen, bei

welchem der Circulardichroismus gegen die Wellenlänge aufgetragen wird. Wie in obiger

Abbildung 5.17 zu sehen, besitzt das Polysaccharid bei 210 nm eine negative Bande mit einer

Intensität von –220 mDeg. Eine Wellenlängenverschiebung des Minimums für

unterschiedliche Salzkonzentrationen wurde nicht beobachtet, jedoch wurde eine Änderung

bezüglich der Intensitäten gegenüber der salzfreien Fraktion festgestellt. Bei einer

Salzkonzentration von 2,5 mmol/L nimmt der Intensitätsbetrag der Absorptionsbande auf

198 mDeg ab und sinkt für steigende Ca2+-Konzentrationen bis auf einen Wert von 135 mDeg

für eine Konzentration von 7,5 mmol/L Ca2+-Ionen.

Im Diagram der Abbildung 5.18, wird die Abhängigkeit des Circulardichroismus einer

wässrigen Hyaluronatlösung (7 mg/mL; 3 h abgebaut) mit zunehmender Konzentration von

Blei-Ionen unter obigen Konditionen dargestellt. Die detektierte negative Bande für salzfreies

Hyaluronat besitzt eine Intensität von –210 mDeg. Abweichend von den Messungen in

Anwesenheit von Ca2+-Ionen, wurde eine Wellenlängenverschiebung der Absorptionsbande

für unterschiedliche Salzkonzentrationen beobachtet.

-250

-200

-150

-100

-50

0200 205 210 215 220 225 230 235 240 245 250

λ (nm)

mD

eg

Abbildung 5.18: CD-Kurven von über 3 h abgebautem Hyaluronat (a) und von Hyaluronat-Lösungen mit einer Pb2+-Konzentration von 0,002 mol/L (b), 0,005 mol/L (c) und 0,0075 mol/L (d)

d

c

b

a

Über den Titrationsverlauf hinweg, wird eine Verschiebung zu höheren Wellenlängen

beobachtet. Bei einer Salzkonzentration von 2 mmol/L verschiebt sich das Minimum nach

212 nm und der Intensitätsbetrag der Bande nimmt dabei auf 171 mDeg ab. Das Signal-

79

5 Ergebnisse

Rausch-Verhältnis wird mit steigender Pb2+-Konzentration zunehmend schlechter, so dass die

Ergebnisse für Konzentrationen oberhalb von 5 mmol/L nicht reproduzierbar sind.

Des Weiteren zeigt sich im Rahmen der spektroskopischen Untersuchungen ein

Zusammenhang zwischen der Intensität für die Absorptionsbande bei 210 nm und der

Konzentration des Hyaluronats. Die Absorptionsbande ist um so ausgeprägter, je höher die

Konzentration des Polysaccharids in der Lösung ist.

5.4.2 Circulardichroismus von Xanthan Für Xanthan wurden entsprechend CD-Spektren von Xanthan-Lösungen (7 mg/mL; 3 h

abgebaut) unterschiedlicher Calciumchlorid-Konzentration aufgezeichnet. Bei dem hier

verwendeten Verfahren wird die eingestrahlte Wellenlänge sukzessive reduziert und der

Circulardichroismus in den Spektren gegen diese aufgetragen.

-13.000

-11.000

-9.000

-7.000

-5.000

-3.000

-1.000210 220 230 240 250 260 270 280

λ (nm)

mD

eg

Abbildung 5.19: Vergrößerung von CD-Kurven aufgenommen im Bereich von 210 bis 280 nm von über 3 h abgebautem Xanthan und von Xanthan-Lösungen mit einer Ca2+-Konzentration von 0,002 mol/L, 0,005 mol/L und 0,0075 mol/L

2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0- 1 2

- 1 0

- 8

- 6

- 4

- 2

0

2

4

6

8 x a c 0 2 .a c d x a c 0 3 .a c d x a c 0 4 .a c d

m D e g

W e l le n lä n g e ( λ n m )

In Abbildung 5.19 wird die Abhängigkeit des Circulardichroismus einer wässrigen

Xanthanlösung mit zunehmender Konzentration von Calcium-Ionen bei pH 6,0 in einem

Spektralbereich von >200 nm gezeigt. Das Polysaccharid besitzt bei 220 nm eine negative

Bande mit einer Intensität von –12.500 mDeg. Eine Wellenlängenverschiebung des

Minimums für unterschiedliche Salzkonzentrationen, sowie eine Änderung der Intensität

80

5 Ergebnisse

81

wurde nicht beobachtet. Allerdings fällt ein vergleichsweise niedriges Signal-Rausch-

Verhältnis (s. Abb. 5.18) bei gleichzeitig hoher CD-Aktivität auf.

Darüber hinaus wurde im Rahmen der spektroskopischen Untersuchungen ähnlich wie beim

Hyaluronat eine Beziehung zwischen der Intensität für die negative Absorptionsbande bei

220 nm bzw. der positiven bei 203 nm (s. Abb. 5.18) und der Konzentration des Xanthans

festgestellt. Die Absorptionsbanden sind um so ausgeprägter, je höher die Konzentration des

Polysaccharids ist.

5 Ergebnisse

5.5 Charakterisierung von Polysacchariden durch NMR-Spektroskopie

Im Rahmen dieser Arbeit wurden neben den schon beschriebenen physikalischen Methoden

zur Charakterisierung der EPS auch kernmagnetische Resonanzuntersuchungen durchgeführt.

Dabei handelt es sich um die Verfahren der 1H-NMR-Spektroskopie, der 13C-NMR-

Spektroskopie, sowie einer Kombination der beiden Verfahren im Rahmen der HSQC-

Methode (engl. Heteronuclear Single Quantum Coherence).

Die aufgeführten Ergebnisse veranschaulichen überwiegend die Wechselwirkung von

bivalenten Kationen, insbesondere der paramagnetischen Metallionen Mangan(II) und

Kupfer(II), welche als Sonden für die zu erwartenden Wechselwirkungen mit den

Polysacchariden eingesetzt wurden. Darüber hinaus wurden NMR-Spektren der EPS-

Lösungen in Abhängigkeit von der Ultraschallbehandlung detektiert, um zu untersuchen,

inwieweit über eine derartige Nachbehandlung die spektrale Auflösung gesteigert werden

kann.

In Abbildung 5.20 ist für Xanthan eine Steigerung der spektralen Auflösung (13C-NMR) als

folge des Ultraschallabbaus zu sehen. Durch die Degradation wurde wie die Ergebnisse in

Abschnitt 5.1.2 zeigen, die Viskosität der Lösung reduziert. Dies ermöglicht eine schnellere

Bewegung der Moleküle bei gleichzeitiger Konzentrationserhöhung des Xanthans.

Abbauzeit Konzentration

0 h 16 mg/mL

0255075100125150175200 (ppm)

3 h 20 mg/mL

10 h 51 mg/mL

15 h 125 mg/mL

Abbildung 5.20: Einfluss der Abbauzeit bzw. der Konzentration auf die spektrale Auflösung und das Signal-Rausch-Verhältnis einer 13C-NMR-Untersuchung von Xanthan bei 60°C

Als Folge wird eine Steigerung des Signal-Rausch-Verhältnisses beobachtet.

82

5 Ergebnisse

Derselbe Effekt wurde beim Hyaluronat beobachtet, wobei eine ungleich stärkere Zunahme

des Signal-Rausch-Verhältnisses erzielt wurde. Ein Vergleich des unabgebauten Hyaluronats

mit dem über 3 h abgebauten ist in Abbildung 5.21 dargestellt.

a)

0255075100125150175200

b)

(ppm)

Abbildung 5.21: Einfluss der Abbauzeit bzw. der Konzentration auf die spektrale Auflösung einer 13C-NMR-Untersuchung von Hyaluronat bei 60°C; 0 h abgebaut und 16 mg/mL (a); 3 h abgebaut und 75 mg/mL (b)

Die beiden Spektren wurden ebenfalls bei 60°C aufgenommen. Die Konzentration des

Hyaluronats im oberen Spektrum betrug 16 mg/mL, welches der maximal zu lösenden Menge

des nicht abgebauten Hyaluronats entsprach. Das Spektrum für eine Konzentration von

75 mg/mL des abgebauten Hyaluronats weist ganz offensichtlich sowohl eine verbesserte

spektrale Auflösung als auch ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis auf.

5.5.1 1H-NMR-spektroskopische Untersuchung der Wechselwirkung von bakteriellen

EPS mit zweiwertigen Kationen

Neben den in diesem Kapitel bereits beschriebenen konduktometrischen, rheologischen und

chiroptischen Methoden wurden im Rahmen dieser Arbeit zur weiteren Charakterisierung der

Wechselwirkungen von bivalenten Kationen mit geladenen EPS die 1H-Kernresonanzen der

EPS in Anwesenheit von Mangan(II) und Kupfer(II) untersucht. Hierzu wurden Messungen

83

5 Ergebnisse

ohne Salzzusatz mit denen in Gegenwart von paramagnetischen Ionen verglichen. Diese

Ergebnisse sind in den folgenden Abschnitten aufgeführt.

5.5.1.1 Dextran Auf der Grundlage, dass ein Erkenntnisgewinn für eine Kernresonanzuntersuchung mit 1H-Kernen ausbleibt, wird an dieser Stelle auf die Präsentation der Spektren von Dextran in

Anwesenheit von bivalenten Kationen verzichtet. Abgesehen von einer Linienverbreiterung

aller Signale bei steigender Konzentration der paramagnetischen Kationen (≤ 1,2 mmol/L),

wurden keinerlei Einflüsse beobachtet. Insbesondere blieben spezifische Wechselwirkungen

aus. Aus diesem Grund wird in diesem Abschnitt ausschließlich eine Signalzuordnung für das 1H-NMR-Spektrum einer elektrolytfreien Dextranlösung (s. Abb. 5.22) vorgenommen.

0 .51 .01 .52 .02 .53 .03 .54 .04 .55 .05 .5

3 .9 04 .0 04 .1 04 .2 04 .3 04 .4 04 .5 0

H-5 H-6 H-4

H-3 H-2

H-1

(ppm)

Abbildung 5.22: Exemplarische Abbildung eines 1H-NMR-Spektrums einer Dextran-Lösung der Konzentration 75 mg/mL, gemessen bei 60°C

Die Messung wurde entsprechend den Anweisungen des Abschnitts 2.5.5 durchgeführt. Die

Dextran-Lösung mit einer Konzentration von 75 mg/mL wurde in D2O aufgenommen und bei

einer Temperatur von 60°C untersucht.

84

5 Ergebnisse

5.5.1.2 Hyaluronat In Abbildung 5.23 sind die 1H-NMR-Spektren von über 3 h abgebauten Hyaluronat mit einer

Konzentration von 75 mg/mL sowohl ohne Salzzusatz als auch in Gegenwart von 1,2 mmol/L

Mn2+- bzw. Cu2+-Ionen gezeigt. Die Linienbreite der Signale nimmt vom oberen Spektrum

zum untersten zu. Bei dem Spektrum mit der höchsten Auflösung handelt es sich um die

Messung einer Hyaluronat-Lösung ohne Salzzusatz (a). Das mittlere Spektrum (b) resultiert

aus der Messung einer Hyaluronat-Lösung in Gegenwart von Manganchlorid und wurde, wie

die anderen auch, bei 60°C aufgenommen.

0 . 51 . 01 . 52 . 02 . 53 . 03 . 54 . 04 . 55 . 05 . 5

a)

[CH3C(O)N]

[H-2]

[H-3, H-5] H-4, H-5

[H-6], H-6H-3

H-2

[H-4]H-1

[H-1]

0 . 50 . 51 . 01 . 01 . 51 . 52 . 02 . 02 . 52 . 53 . 03 . 03 . 53 . 54 . 04 . 04 . 54 . 55 . 05 . 05 . 55 . 5

b)

0 . 50 . 51 . 01 . 01 . 51 . 52 . 02 . 02 . 52 . 53 . 03 . 03 . 53 . 54 . 04 . 04 . 54 . 55 . 05 . 05 . 55 . 56 . 06 . 0

c)

Abbildung 5.23: Gegenüberstellung dreier 1H-NMR-Spektren von Hyaluronat in Gegenwart von 1,2 mmol/L Mn2+-Inonen (b), 1,2 mmol/L Cu2+-Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a). Die Signale, die zum N-Acetyl-D-glucosamid gehören, sind durch eckige Klammern gekennzeichnet ([...])

(ppm)

85

5 Ergebnisse

86

Bei dem letztgenannten Spektrum wird eine Überlappung der H-1 Signale beobachtet. Die

Resonanzen für H-3 bis H-5 überlappen ebenfalls in den Bereichen von 3,86 bis 4,08 ppm

und 4,10 bis 4,30 ppm, so dass eine Zuordnung der Signale schwierig wird. Es wird eine

Zunahme der relativen Linienbreite gegenüber dem Spektrum a für das H-2 Signal des

N-Acetyl-D-glucosamids von 20 Hz und für das H-2 Signal des D-Glucuronans von 12 Hz

ermittelt. Die Linienbreite des Acetamido-Signals nimmt um 60 Hz zu. In Anwesenheit von

Kupferchlorid wurde das unterste der in Abbildung 5.23 dargestellten Spektren (c)

aufgezeichnet. Hierbei ist die Linienbreite so weit vorangeschritten, dass abgesehen von der

Acetamido-Gruppe bei 2,3 ppm mit einer Linienbreite von 353 Hz, keine Zuordnung der

Resonanzen möglich ist. Im Vergleich mit dem Spektrum a (Abb. 5.23) nimmt die relative

Linienbreite der Acetamido-Resonanz um 350 Hz zu.

5.5.1.3 Xanthan Die Messungen wurden konform der in Abschnitt 4.6 beschriebenen Methode durchgeführt.

Dabei wurde eine Xanthan-Lösung der Konzentration 125 mg/mL in D2O angesetzt und bei

60°C in An- bzw. Abwesenheit von mehrwertigen Metallionen NMR-spektroskopisch

untersucht. In Abbildung 5.24 werden drei 1H-NMR-Spektren von Xanthan in Gegenwart von

Mn2+-Inonen (b), Cu2+-Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a) einander gegenübergestellt. Ähnlich

wie beim Hyaluronat wird eine Linienverbreiterung bei Zugabe der paramagnetischen Ionen

in einer Konzentration von 1,2 mmol/L beobachtet. Diese ist aber im Gegensatz zu den

Untersuchungen des Hyaluronats regiospezifisch. Damit ist gemeint, dass sich der Einfluss

der Linienbreite nicht über das gesamte Spektrum erstreckt, sondern auf zwei Signale

beschränkt ist. Hierbei handelt es sich zum einen um die Resonanz für das CH3-Signal der

Pyruvatgruppe bei 1,87 ppm und zum anderen um die Resonanz bei 4,13 ppm. Dabei besitzt

das Kupfer(II) offensichtlich den größeren Einfluss von den Beiden paramagnetischen

Kationen wie in Abbildung 5.24 durch den Vergleich der relativen Linienbreiten ersichtlich.

Hierbei wird eine Zunahme der relativen Linienbreiten für das Xanthanspektrum in

Gegenwart von Mangan gegenüber dem Spektrum a für das CH3-Signal der Pyruvatgruppe

um 44 Hz und für die Resonanz bei 4,13 ppm um 11 Hz beobachtet.

5 Ergebnisse

0 . 50 . 51 . 01 . 01 . 51 . 52 . 02 . 02 . 52 . 53 . 03 . 03 . 53 . 54 . 04 . 04 . 54 . 55 . 05 . 05 . 55 . 56 . 06 . 06 . 56 . 5

a)

CH3 Acetat CH3 Pyruvat

(ppm)

87

0 . 50 . 51 . 01 . 01 . 51 . 52 . 02 . 02 . 52 . 53 . 03 . 03 . 53 . 54 . 04 . 04 . 54 . 55 . 05 . 05 . 55 . 56 . 06 . 06 . 56 . 5

b)

(ppm)

0 . 50 . 51 . 01 . 01 . 51 . 52 . 02 . 02 . 52 . 53 . 03 . 03 . 53 . 54 . 04 . 04 . 54 . 55 . 05 . 05 . 55 . 56 . 06 . 06 . 56 . 5

c)

(ppm)

Abbildung 5.24: Gegenüberstellung dreier 1H-NMR-Spektren von Xanthan aufgezeichnet in Gegenwart von 1,2 mmol/L Mn2+-Inonen (b), 1,2 mmol/L Cu2+-Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a).

Beim Vergleich der Spektren a und c wird eine signifikante Linienverbreiterung des CH3-

Signals der Pyruvatgruppe um 159 Hz beobachtet. Die Zunahme der relativen Linienbreite

der Resonanz bei 4,13 ppm ist unsicher, da eine eindeutig Zuordnung durch den Einfluss des

paramagnetischen Kattions nicht möglich ist.

5 Ergebnisse

5.5.2 13C-NMR-spektroskopische Untersuchung der Wechselwirkung von bakteriellen

EPS mit zweiwertigen Kationen

Im Rahmen der kernspezifischen Resonanzuntersuchungen wurde neben dem bereits

beschriebenen Einfluss von bivalenten Kationen auf die 1H-Kerne (s.o.) auch der Einfluss auf

die 13C-Isotope der EPS untersucht. Die besondere Bedeutung der 13C-NMR-Spektroskopie

liegt in der Möglichkeit, zusätzlich Informationen zum Kohlenstoff-Gerüst neben der

Wasserstoff-Peripherie des Moleküls zu erhalten. Der Bereich der chemischen Verschiebung

ist hierbei mit 200 ppm deutlich breiter als für die Protonen-Resonanzen.

Analog zur 1H-NMR-Spektroskopie handelt es sich bei den verwendeten paramagnetischen

Kationen um Mangan(II) und Kupfer(II).

5.5.2.1 Dextran Es wird an dieser Stelle wie in Abschnitt 5.5.1.1 auch auf die Präsentation der Dextran-

Spektren in Anwesenheit von bivalenten Kationen verzichtet, da keine signifikanten

Aussagen getroffen werden können. Abgesehen von einer Linienverbreiterung aller Signale

bei steigender Konzentration der paramagnetischen Kationen wurden keinerlei Einflüsse

beobachtet. Insbesondere blieben spezifische Wechselwirkungen aus. Aus diesem Grund wird

in diesem Abschnitt ausschließlich eine Signalzuordnung für das 13C-NMR-Spektrum einer

elektrolytfreien Dextran-Lösung (s. Abb. 5.25) durchgeführt.

01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 0 01 1 01 2 0

6 66 76 86 97 07 17 27 37 47 57 67 7

C-4 C-6

C-5 C-2 C-3

C-1

(ppm)

Abbildung 5.25: Exemplarische Abbildung eines 13C-NMR-Spektrums einer Dextranlösung (75 mg/mL), gemessen bei 60°C

88

5 Ergebnisse

Die Messung wurde wie im Abschnitt 2.5.5 beschrieben durchgeführt. Das Dextran

(75 mg/mL) wurde in D2O gelöst und das 13C-NMR-Spektrum bei einer Temperatur von

60°C aufgenommen.

5.5.2.2 Hyaluronat Zur Untersuchung des Hyaluronats wurde dieses nach Abschnitt 4.1 gereinigt und über 3 h

abgebaut. Das Lyophilisat wurde in D2O resuspendiert (75 mg/mL) und die Spektren bei 60°C

aufgenommen. Die 13C-NMR-Spektren für die Messungen von Hyaluronat in Anwesenheit

von Kupfer(II) und Mangan(II) mit den Konzentrationen von 0,3 mmol/L und 1,2 mmol/L

zeigen grundsätzlich die gleichen Eigenschaften, so dass auf eine Darstellung der Kupfer-

Spektren in diesem Kapitel verzichtet wurde und auf den Anhang (s. Abb. A.23) verwiesen

werden muss. In Abbildung 5.26 ist die Auswirkung einer Manganzugabe auf das gesamte

Spektrum exemplarisch für die untersuchten paramagnetischen Kationen gezeigt.

102030405060708090100110120130140150160170180190200

a)

C2, C3, C5,[C5],[C4] C4 [C7]

C1 [C3] [C8] [C1] C6 [C2]

[C6]

b)

c)

(ppm) Abbildung 5.26: Exemplarische Gegenüberstellung dreier 13C-NMR-Spektren von Hyaluronat in Gegenwart von 0,3 mmol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a). Die Signale die zum N-Acetyl-D-glucosamid gehören sind durch eckige Klammern gekennzeichnet ([...])

89

5 Ergebnisse

Im Gegensatz zu den Ergebnissen der 1H-NMR-Spektroskopie (s. Abschnitt 5.5.1.2) wird bei

steigender Kationenkonzentration eine regiospezifische Wechselwirkung deutlich. Der

Einfluss beschränkt sich auf die Signale bei 25,5 ppm, 79,5 ppm, 176,8 ppm und 178,5 ppm.

Zur besseren Übersicht wurden hier die betroffenen Bereiche in den Abbildungen 5.27 und

5.28 vergrößert dargestellt.

a) C5

70717273747576777879

[C5] C3 C2 [C4]

b)

c)

Abbildung 5.27: Vergrößerung des Bereichs zwischen 70 und 80 ppm für 13C-NMR-Spektren von Hyaluronat in Gegenwart von 0,3 mmol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a). Die Signale, die zum N-Acetyl-D-glucosamid gehören sind durch eckige Klammern gekennzeichnet ([...])

(ppm)

212223242526272829176177178179180181182183184

c)

b)

a) [C7]

C6

[C8]

(ppm)

Abbildung 5.28: Vergrößerung des Bereichs zwischen 175 und 185 ppm (linke Abb.) bzw. von 20 bis 30 ppm (rechts) für 13C-NMR-Spektren von Hyaluronat in Gegenwart von 0,3 mmol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a). Die Signale, die zum N-Acetyl-D-glucosamid gehören sind durch eckige Klammern gekennzeichnet ([...]) 90

5 Ergebnisse

91

Wie in Abbildung 5.28 zu sehen, nimmt die relative Linienbreite für das Signal des

Carboxylat-Kohlenstoffs sowie für das C-6-Signal der Hydroxymethyl-Gruppe des

Acetylglucosamids stark zu. Hierbei ist aufgrund der außerordentlichen Zunahme der

Linienbreite die letztgenannte Resonanz genau wie das C-5-Signal der Glucuronsäure

(79,5 ppm) schon bei einer Konzentration von 0,3 mmol/L Mangan(II) nicht mehr

nachweisbar. Bei einer Konzentration von 1,2 mmol/L fällt auf, dass eine Zunahme der

Linienbreite für das gesamte Spektrum resultiert. Hervorzuheben wäre allerdings das Methyl-

Signal der Acetamido-Gruppe bei 25,5 ppm, bei dem man eine signifikante Zunahme der

Linienbreite von 45 Hz auf 160 Hz beobachtet (s. Abb. 5.28). Darüber hinaus erfahren das

C-4-Signal des Acetylglucosamids, sowie die C-3-Resonanz der Glucuronsäure eine

Verschiebung zu höheren Frequenzen hin. Dabei beträgt die Differenz der chemischen

Verschiebung für das C-4-Signal 0,65 ppm und für die C-3-Resonanz 0,82 ppm.

Als Grundlage für die Auswertung wurden die von Siciňska et al. veröffentlichten Ergebnisse

genutzt [98]. Die Zuordnung der Resonanzen für das C-3- bzw. C-5-Signal wurde durch die

Ergebnisse der inversen 1H-13C-Korelation (HSQC), welche weiter unten im Abschnitt 5.5.2.4

gezeigt werden, möglich.

5.5.2.3 Xanthan

Die Messungen wurden, wie im Methodenteil (s. Absch. 4.6) beschrieben durchgeführt. Zu

diesem Zweck lagen Lösungen (125 mg/mL) des über 15 h abgebauten Xanthans

(s. Absch. 4.1) mit unterschiedlicher Salzkonzentration vor, welche 13C-NMR-

spektroskopisch untersucht wurden. Die 13C-NMR-Spektren für die Messungen von Xanthan

in Anwesenheit von Kupfer(II) und Mangan(II) mit den Konzentrationen von 0,3 mmol/L und

1,2 mmol/L weisen wie beim Hyaluronat keinerlei Unterschiede auf, so dass ebenfalls auf

eine Darstellung der Kupfer-Spektren verzichtet wurde.

In Abbildung 5.29 ist die Auswirkung einer Manganzugabe auf das gesamte Spektrum

gezeigt. Wie schon die im Abschnitt 5.5.1.3 erhaltenen Ergebnisse der 1H-NMR-

Spektroskopie zeigen, wird bei steigender Kationenkonzentration eine regiospezifische

Wechselwirkung deutlich. Es wird hier ebenso eine Beschränkung der Wechselwirkungen auf

wenige Signale beobachtet. Dabei handelt es sich um die Signale bei 27,8 ppm, 105,1 ppm

und 178,2 ppm.

5 Ergebnisse

255075100125150175200

a) Glc, GlcĆ-2

Man, Man´, Pyr C-4

Pyr CH C-2, C-3, C-4, C-5

Ac CH Ac, Carb C=O

92

Abbildung 5.29: Exemplarische Gegenüberstellung dreier 13C-NMR-Spektren von Xanthan in Gegenwart von 0,3 mmol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a)

9698100102104106108110112114116 Abbildung 5.30: Vergrößerung des Bereichs zwischen 96 und 116 ppm für 13C-NMR-Spektren von Xanthan in Gegenwart von 0,3 mmol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a)

GlcA, Glc, Glc´ C-1

Pyr C-2 Man C-1 ManĆ-1 Man, ManĆ-6

Pyr C=O

b)

c)

(ppm)

a) Pyr C-2 Man C-1, ManĆ-1

GlcA, Glc, Glc´ C-1

b)

c)

(ppm)

5 Ergebnisse

Zur besseren Übersicht wurden hier die betroffenen Bereiche in den Abbildungen 5.30 und

5.31 vergrößert dargestellt.

16182022242628303234 (ppm)

Ac CH Pyr CH

168170172174176178180182184186188

c)

b)

a) Ac, Carb C=O

Pyr C=O

Abbildung 5.31: Vergrößerung des Bereichs zwischen 168 und 188 ppm (linke Abb.) bzw. von 15 bis 35 ppm (rechts) für 13C-NMR-Spektren von Xanthan in Gegenwart von 0,3 mmol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a)

Wie in Abbildung 5.31 zu sehen wird eine extreme Linienverbreiterung für das Signal des

Carboxylat-Kohlenstoffs sowie für das CH3-Signal der Pyruvat-Gruppe detektiert. Hierbei ist

der Nachweis der erstgenannten Resonanz schon bei einer Konzentration von 0,3 mmol/L

Mangan(II) nicht mehr möglich und die Linienbreite für das CH3-Signal der Pyruvat-Gruppe

nimmt von 60 Hz auf 297 Hz zu. Darüber hinaus wird bei einer Konzentration von

1,2 mmol/L eine Zunahme der Linienbreite für das C-2- Signal der Pyruvat-Gruppe sowie

dem gesamten C-1-Signal (105,1 ppm) aller Zuckerringe beobachtet. Dies führt wie in

Abbildung 5.30 dargestellt zu einer Abnahme der Signalauflösung, so dass die Resonanzen

nur wenig differenziert detektiert werden konnten. Die 13C-NMR-Spektren für Xanthan in

Gegenwart von Kupfer(II)ionen sind wie für das Hyaluronat im Anhang abgebildet

(s. Abb. A.24).

93

5 Ergebnisse

5.5.3 HSQC-spektroskopische Untersuchung von Hyaluronat Zur weiteren Charakterisierung des Hyaluronats wurden 2D-NMR-Untersuchungen

durchgeführt. Hierbei wurde der Polyelektrolyt nach Abschnitt 4.1 gereinigt und über 3 h

abgebaut. Das Lyophilisat wurde mit einer Konzentration von 75 mg/mL in D2O

resuspendiert und die Spektren mit einem DRX-300-NMR-Spektrometer der Firma Bruker

aufgenommen.

Bei der Auswertung der 13C-NMR-Spektren des Hyaluronats ergaben sich im Bereich von

80 ppm bis 90 ppm Diskrepanzen bezüglich der Ergebnisse von Siciňska et al., welche als

Grundlage für die Auswertung der 1D-13C-NMR-Spektren genutzt wurden. Insbesondere die

Zuordnung des C-3 Signals erwies sich als schwierig. Die von Siciňska et al. durchgeführten

Untersuchungen erfolgten bei einer Temperatur von <37°C. Um einen eventuellen

Temperatureffekt bei den erhaltenen Messergebnissen als Ursache für die Differenzen zu

berücksichtigen, wurden inverse 1H-13C-Korelationsmessungen bei einer Temperatur von

60°C durchgeführt. Ein exemplarisches 2D-Spektrum für diese Messung ist in

Abbildung 5.32 dargestellt.

ppm

2.53.03.54.04.55.05.5 ppm

30

40

50

60

70

80

90

100

C-4, C-5

C-3

Abbildung 5.32: Exemplarisches 2D-Spektrum einer inversen 1H-13C-Korelation (HSQC) von Hyalronat (75 mg/mL) bei 60°C. Aufgetragen sind ein 1H-NMR-Spektrum (X-Achse) und das 13C-NMR-Spektrum eines DEPT-Experiments (Y-Achse) 94

5 Ergebnisse

95

Auf der X-Achse ist das 1H-NMR-Spektrum aufgetragen und auf der Y-Achse befindet sich

das 13C-NMR-Spektrum eines DEPT-Experiments. Aus diesem Grund fehlen das

Carboxylat- sowie das Carbonyl-Signal beim 13C-NMR-Spektrum (ca. 175 ppm). Die

Zuordnung des CH3-Signals für die Acetamido-Gruppe ist unzweifelhaft. Diese ist beim 13C-NMR-Spektrum bei 25,5 ppm und beim 1H-NMR-Spektrum bei 2,3 ppm zu finden. Eine

temperaturbedingte Verschiebung des Signals ausgelöst durch die Temperaturdifferenz im 1H-NMR-Spektrum sowie im 13C-NMR-Spektrum wurde nicht beobachtet.

Anders sieht dies für das angesprochene C-3-Signal der Glucuronsäure aus. Dieses verschiebt

sich beim 13C-NMR-Spektrum unter dem Einfluss der höheren Temperatur um nahezu 3 ppm

zu höheren Werten hin, so dass es die Position mit dem C-5-Signal tauscht. Dies entspricht

den beobachteten Wechselwirkungseffekten aus Abschnitt 5.5.2.2, wobei das C-5-Signal

durch den paramagnetischen Einfluss eine so extreme Linienverbreiterung erfährt, dass eine

Detektion nicht mehr möglich ist.

Eine Auflistung der 13C-Resonanzen, die durch die HSQC-Methode bei 60°C für die

Monomere des Hyaluronats ermittelt wurden, erfolgt in unten aufgeführter Tabelle 5.23.

Tabelle 5.23: Chemische Verschiebung der Signale für die Monomere des Hyaluronats (Glucuronsäure und Glucosamid) bei 13C-NMR-Spektren angegeben in der Einheit ppm. 13C-Resonanzen C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 CH3C(O)NH CH3C(O)NHGlucuronsäure 106,1 75,6 76,8 83,0 79,1 177,8 Glucosamid 103,5 57,4 85,9 71,7 78,5 63,8 176,4 25,5

6 Diskussion

96

6 Diskussion

Bei Untersuchungen von Wingender et al. wurde als ein wesentlicher Bestandteil des

Biofilms von Pseudomonas aeruginosa, das Alginat mit 95% der Trockenmasse ausgemacht

[103]. Das Alginat besitzt eine außerordentlich hohe Affinität zu mehrwertigen Metallionen,

insbesondere zum Calcium(II) mit dem es über die Carboxylatgruppen der Glucuronate

komplexiert [104]. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen rückte die Frage, in welcher Form die

Ladung bzw. der Verzweigungsgrad der EPS eine Rolle bei den Wechselwirkungen zwischen

Kation und Biopolymer spielt, immer weiter in den Focus. Darüber hinaus ist die Prägnanz

von Schwermetallen in aquatischen Systemen bekannt (s. Kap. 2.4), so dass das Interesse, den

Einfluss ökologisch relevanter Metallionen im Speziellen auf Biofilme zu untersuchen,

wuchs.

Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Wechselwirkungen von mehrwertigen Metallionen mit

extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) und die resultierende Struktur der sich bildenden

Komplexe näher untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden drei Modellpolysaccharide

exemplarisch für die von Bakterien exprämierten EPS in Anwesenheit und in Abwesenheit

von mehrwertigen Kationen untersucht und die Ergebnisse miteinander verglichen. Bei den

Polysacchariden handelt es sich um das verzweigte, ungeladene Dextran, das unverzweigte,

geladene Hyaluronat und das verzweigte und geladene Xanthan.

6.1 Verhalten von Polysacchariden in Abwesenheit von mehrwertigen Kationen Wie bereits erwähnt wurde mit Hilfe diverser physikalischer Methoden die EPS weitergehend

charakterisiert. Um mit diesen reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, mussten die

Polysaccharide allerdings entsprechend präpariert werden. Eines der größten Hindernisse für

die Untersuchungen war die hohe Viskosität der Polymerlösungen, welche sich beim Lösen

der unbehandelten Biopolymere einstellte. Des Weiteren musste eine gleichbleibende Qualität

der zu untersuchenden Proben sichergestellt werden. Zu diesem Zweck wurde die

Aufarbeitung der kommerziellen EPS wie im Abschnitt 4.1 beschrieben erarbeitet.

Zur Ermittlung einer geeigneten Prozedur für den Molmassenabbau wurden die Proben

systematisch auf die Verträglichkeit unterschiedlicher Degradationsmethoden untersucht. Um

einen Vergleich der Substanzen und damit eine Reproduzierbarkeit der Ergebnisse

6 Diskussion

97

sicherzustellen, ist es wesentlich, dass die Reinigungsprozedur keinerlei unerwünschte

Effekte auf die Seitenketten bzw. die funktionellen Gruppen der Polysaccharide ausübt. Aus

diesem Grund schied die „milde saure Hydrolyse“, wie sie von Mayer et al. zum Abbau von

Alginaten verwendet wurde, für die hier untersuchten Polysaccharide aus [104]. Bei

Anwendung dieser Methode wurde beobachtet, dass neben den glycosidischen Bindungen

ebenso die Acetamido-Gruppen des Hyaluronats gespalten wurden. Dies führt zu einer

Verfälschung der Untersuchungsergebnisse, da diese funktionelle Gruppe die physikalischen

Eigenschaften des Hyaluronats signifikant beeinflusst. Eine weitere Möglichkeit der

selektiven Spaltung von glycosidischen Bindungen ist die verbreitete Methode der

enzymatischen Degradation. Hierbei greifen die eingesetzten Enzyme im Idealfall wie eine

Schere zwischen die Zuckerringe und trennen diese voneinander. Für die Spaltung des

Hyaluronats zeigt diese Methode gute Ergebnisse. Sie scheitert allerdings beim Xanthan an

einer nicht ausreichenden Selektivität, so dass zusätzlich eine Spaltung der Zuckerbindungen

an den Seitenketten beobachtet wird. Aus diesem Grund wurde diese Art des Abbaus

ebenfalls verworfen. Für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten EPS erscheint die

Methode des Ultraschallabbaus bei Anpassung der Amplitude, der Temperatur und der

Zeitdauer am geeignetsten. Wie die mit SEC-Malls erhaltenen Ergebnisse in Tabelle 5.1

bestätigen, wurde durch Anwendung des Ultraschalls ein Abbau der Polyelektrolyte erzielt.

Des Weiteren wurde die gewünschte Abnahme der Lösungs-Viskosität durch die

Molmassenreduktion herbeigeführt (s. Tab. 5.2).

Wie im Abschnitt 5.1.1 beschrieben, wurde ein nicht linearer Zusammenhang zwischen der

Abbauzeit und der resultierenden Molmasse beobachtet. Dieser Sachverhalt, der in Abbildung

5.3 zum Ausdruck gebracht wird, resultiert aus dem Zusammenspiel der Intensität

(Amplitude) und der Frequenz des Ultraschalls. Diese konstantgehaltenen Parameter führen

wahrscheinlich zu einer mit diesem Wertepaar verbundenen Molmasse, an welche sich der

Verlauf der Zeitfunktion asymptotisch annähert.

Neben dem Molmassenabbau ist die Reinigung und damit die Entfernung von Fremdstoffen,

die bei der Fermentation oder beim Abbau in die Proben eingebracht wurden, essentiell. Die

Abtrennung geschieht durch Filtration der Suspensionen und anschließender Zentrifugation.

Die Beseitigung von Fremdsalzen und Fragmenten, die leichter sind als 12.000 bis 14.000

g/mol geschieht durch Dialyse.

6 Diskussion

98

6.1.1 Dextran Grundsätzlich ist für das Dextran anzumerken, dass diesen eine Sonderstellung im Rahmen

dieser Promotionsarbeit zukommt. Als Vertreter der ungeladenen Polysaccharide dient es als

Vergleichssubstanz bezüglich der geladenen Polysaccharide. Es bietet durch seine verzweigte

Struktur darüber hinaus die Möglichkeit, den Einfluss der Seitenketten auf die physikalischen

Eigenschaften zu untersuchen.

Die Molmasse des kommerziellen Dextrans wurde mittels SEC-Malls bestimmt

(s. Absch. 5.1). Es ist mit einer Molmasse von 2,0 ⋅ 105 g/mol das Kleinste der untersuchten

Polysaccharide und besitzt, trotz seines hohen Verzweigungsgrades in wässrigen Lösungen,

eine niedrige Viskosität (s. Absch. 5.1.2). Dies liegt wahrscheinlich an der neutralen Ladung

des Polysaccharids, welche zu geringen intermolekularen Wechselwirkungen führt. Eine

Vernetzung ist ebenfalls auszuschließen, da sich die ermittelte Viskosität nur unwesentlich

von der des Wassers abhebt. Die über das Polymer verteilten Hydroxylgruppen führen

darüber hinaus zu einer guten Löslichkeit in der wässrigen Phase, wobei allerdings die

Bildung von kompakten Knäueln vermutet wird. Dafür sprechen die Ergebnisse der

Rotationsviskosimetrie (Absch. 5.3.2.1), sowie der berechnete Exponent α der Mark-

Houwink-Gleichung. Dieser beträgt α= 0,11 und wurde mit Hilfe der spezifischen Viskosität

des Dextrans in wässriger Lösung ermittelt. Die Geometrie liegt damit zwischen der einer

Kugel (α= 0,0) und der einer Gauß-Kette (α= 0,50) [76]. Des Weiteren zeigt sich, dass die

Viskosität unabhängig von der Schergeschwindigkeit konstant bleibt (s. Absch. 5.3.2). Dies

entspricht der klassischen Vorstellung einer newtonschen Flüssigkeit.

Bei höheren Konzentrationen (s. Kap. 5) ist allerdings eine Quellung des Dextrans als Folge

des Kontakts zwischen den hydrodynamischen Äquivalenzsphären und damit eine starke

Zunahme der Viskosität bekannt [105]. Aufgrund der niedrigen Viskosität der Dextranlösung

ist es offensichtlich, dass die kritische Konzentration des Dextrans im Rahmen der

durchgeführten Messungen nicht erreicht wurde und somit eine Polymer-Polymer-Verhakung

(engl. Entanglements) ausblieb.

6 Diskussion

99

6.1.2 Hyaluronat Beim bifunktionellen Copolymer Hyaluronat handelt es sich um das Natriumsalz der

Hyaluronsäure, welches sich aus alternierenden β-1,3 und β-1,4 verknüpften

Monomereinheiten zusammensetzt. Das Glucuronat sowie das Glucosamin aus denen das

Hyaluronat besteht, beeinflussen die physikalischen Eigenschaften des Polyelektrolyten

wegen ihrer funktionellen Gruppen stark. Aus diesem Grund ist das Wissen um ihr

quantitatives Erscheinungsbild in einem solchen Molekül essentiell. Die Molmasse des

kommerziellen Hyaluronats wurde mittels SEC-Malls bestimmt (s. Absch. 5.1) und beträgt

1,7 ⋅ 106 g/mol. Damit ist diese ca. 10 mal größer als die des Dextrans, welches im Rahmen

dieser Arbeit untersucht wurde.

Für den Metabolismus der meisten Organismen ist die Präsenz von externen Wasser

unabdingbar. Ohne dieses wird der Stoffwechsel entscheidend gestört und führt über kurz

oder lang zu einer Austrocknung der Lebensform. Wie in der Literatur beschrieben, besitzt die

Hyaluronsäure eine außerordentlich starke Wasserbindefähigkeit [62]. Dies ist für einen

Biofilm von großer Bedeutung und wurde bei den hier durchgeführten Studien ebenfalls für

das Natriumsalz beobachtet. Die äußerst kompakte sowie stabile Form im festen Zustand wird

durch die starken intramolekularen bzw. intermolekularen Wechselwirkungen bedingt.

Hierbei spielen Wasserstoffbrücken eine wesentliche Rolle. Wie Mitra et al. durch

Röntgenbeugungs-experimente herausfanden, kann das Hyaluronat als Einfach-, Doppel- und

Dreifachhelix vorliegen. Hierbei ist das Natriumion oktaedrisch koordiniert und führt zu einer

zusätzlichen intra- bzw. intermolekularen Verknüpfung der Hyaluronatfasern [106].

In wässriger Lösung führen Solvatisierungsvorgänge zu einer Aufweitung der

Molekülstruktur, so dass sich die Reibungseigenschaften der Lösung verändern und damit

auch deren Viskosität. Wird das hydrodynamische Volumen der Polymerteilchen betrachtet,

so gibt es eine Beziehung zwischen diesem und der Molmasse, welche durch den Staudinger-

Index ausgedrückt wird. Hierbei handelt es sich um das Verhältnis von hydrodynamischem

Volumen zur Molmasse. Eine charakteristische Eigenschaft von statistischen Knäueln ist,

dass ihre Dichte mit steigender Molmasse abnimmt. Dies wurde analog bei den

durchgeführten Viskositätsmessungen beobachtet. Mit Hilfe des Staudinger-Indexes und dem

daraus abgeleiteten Exponenten α (s. Mark-Houwink-Gl. Absch. 4.4), wurde eine

strukturbezogene Interpretation der gelösten Teilchen möglich (s. Absch. 5.1.2). Das

unabgebaute Molekül liegt demnach in aufgeweiteter Form als vollständig durchspültes

Knäuel vor. Dies entspricht im Idealfall einem Exponenten von α = 1,0. Wird das abgebaute

6 Diskussion

100

Hyaluronatmolekül in wässriger Lösung betrachtet, so fällt eine Abnahme der Viskosität,

bedingt durch eine Oberflächenreduktion der Knäuelstruktur, auf. Die Molmassenreduktion

führt wie schon beschrieben zu einer Dichtezunahme des Knäuels, welche mit den

Ergebnissen aus Abschnitt 5.1.2 belegt werden kann. Der Exponent nimmt für das über eine

Dauer von 3 h mit Ultraschall abgebaute Hyaluronat um 37,5% ab, so dass ein Hinweis auf

ein nur teilweise durchspültes Knäuel mit eindeutig höherer Dichte vorliegt. Allerdings nimmt

die Dichte weniger stark zu als bei einem neutralen Polymer wie dem Dextran (s. α -Werte,

Absch. 5.1.2). Dies liegt wahrscheinlich an den negativen Ladungen der Carboxylatgruppen,

welche sich gegenseitig abstoßen. Dieser Effekt führt zu einer zusätzlichen Aufweitung und

bleibt beim ungeladenen Dextran aus. Des Weiteren bedarf die Verdrängung der gebundenen

Wassermoleküle einer größeren Energie als beim Dextran, da diese stärker an das Glucuronat

gebunden sind. Die intensive Wasserstoffbrückenbindung wird durch die Ladung der

Carboxylatgruppe bedingt und führt beim Polyelektrolyten zu einer ausgedehnteren

Hydratschicht als beim Dextran. Diese mehrlagige Schicht verhindert zusätzlich eine weitere

Komprimierung des Hyaluronatknäuels. Einen weiteren Beweis für die Struktur eines

Polyelektrolyten wie dem Hyaluronat sowie für die resultierenden Wechselwirkungen

erbringt die Viskosität einer wässrigen Lösung in Abhängigkeit von der

Schergeschwindigkeit. Während beim Dextran keinerlei Einfluss der Schergeschwindigkeit

auf die Viskosität beobachtet wird, zeigen die Ergebnisse in Kapitel 5.3.2.2 für das

Hyaluronat eine Abnahme der Viskosität mit zunehmender Schergeschwindigkeit. Dies

geschieht aufgrund einer Ausrichtung der Polymerfasern entlang der Strömungsrichtung,

welche einem für Polymere typischen pseudoplastischen Verhalten entspricht (s. Absch.

2.5.3). Wie die berechneten Ergebnisse der Tabelle 5.2 im Ergebnisteil zeigen, müsste das

über 3 h abgebaute Hyaluronat nahezu als Gauß-Kette vorliegen. Damit würde dieses von der

idealisierten Kugelform abweichen, die als Grundlage zur Beschreibung der Viskosität einer

newtonschen Flüssigkeit dient. Wie experimentell bewiesen, verringert sich die Viskosität

durch eine Steigerung der Schergeschwindigkeit, so dass eine Abweichung vom newtonschen

Verhalten beobachtet wird. Dies spricht klar für die Richtigkeit der berechneten Struktur des

Polyelektrolyten in wässriger Lösung.

Des Weiteren zeigen theoretische Betrachtungen bezüglich der Konformation, dass das

Hyaluronat, ähnlich wie im festen Zustand, in wässriger Lösung eine helikale Struktur besitzt.

Die von Haxaire et al. durchgeführten Rechnungen zeigen, dass es einen weiten, energetisch

stabilen Bereich für Hyaluronat mit diversen helikalen Moden entlang der Hyaluronatfaser

gibt [107]. Hierbei reicht das Erscheinungsbild der Struktur über eine linkshändig vierfach

6 Diskussion

gefaltete bis hin zu einer rechtshändig fünffach gefalteten Symmetrie. Die Struktur ist dabei

sowohl vom pH-Wert der Lösung, als auch von der Art der Gegenionen abhängig.

Energieminimierte Strukturen des Hyaluronats sind einmal parallel und einmal orthogonal in

Abbildung 6.1 dargestellt.

Abbildung 6.1: Exemplarische Darstellung von Hyaluronat in wässriger Lösung nach Rechnungen von Haxaire et al. [107]

Entgegen der Annahme, die Struktur der Hyaluronsäure bestehe in wässriger Lösung im

wesentlichen aus einem statistischen Knäuel [108], wurde im Rahmen chiroptischer sowie in

NMR-Untersuchungen eine lokale Ordnung bestätigt [109, 110].

Wie die Ergebnisse im Kapitel 5.4.1 zeigen, konnte die Lage der CD-Bande für die

Glucosamineinheit des Hyaluronats konform den Literaturangaben bei 210 nm reproduziert

werden [111]. Buffington et al. beschreiben in ihrer Arbeit zur CD-Spektroskopie von

Hyaluronat in wässriger Lösung, dass die Ordnung wesentlich vom pH-Wert der Lösung

abhängig ist [112]. Bei einer Abnahme des pH-Wertes wird eine Intensitätsänderung der

Bande für den π–π*-Übergang des Acetylgucosamids bei 210 nm beschrieben.

Die durch 13C-NMR-Studien erhaltenen Ergebnisse von Hyaluronatfragmenten niedriger

Molmasse legen den Schluss nahe, dass Wasserstoffbrücken zwischen den Monomereinheiten

zu einer Stabilisierung entlang der Polymerfaser führen [113]. Allerdings, so wird weiter von

Scott et al. postuliert, werden die direkten intramolekularen Wasserstoffbrücken, wie sie z. B.

in Dimethylsulfoxid vorliegen, in wässrigen Lösungen durch Wassermoleküle und die von

ihnen ausgehenden Wasserstoffbrücken substituiert. Dies erklärt die starke Wasserbindungs-

fähigkeit des Hyaluronats bei dem sich intensive Wasserstoff-brücken mit den

Wassermolekülen bilden. Wird neben der großen Zahl an potentiellen Anbindungspunkten

eine zusätzliche Bildung von Wassereinschlüssen berücksichtigt, so erscheint die hohe

101

6 Diskussion

Wasserabsorption durchaus plausibel. In Abbildung 6.2 wird eine mögliche Konfiguration

einer Tetrasaccharideinheit in wässriger Lösung gezeigt.

O OO

O

C

O O

HOHO

OOH

HOH2C

NHC

O

CH3

O

HO

OHO

HO

C

OO

HOH2C

NH

CO CH3

HO

H HO

H

HO

HH

OH

Abbildung 6.2: Ausschnitt von Hyaluronat (Tetrasaccharideinheit) in wässriger Lösung

Die zwei sich wiederholenden Disaccharide sollen für ein besseres Verständnis einer zweifach

gefalteten Helix führen, wie sie auch in Abbildung 6.3 schematisch dargestellt ist.

Abbildung 6.3: Schematische Darstellung eines Hyaluronatauschnittes (Tetrasaccharid-einheit) in einem unpolaren Lösemittel (z. B. DMSO).

Bei der obigen Abbildung 6.3 ist die Wechselwirkung zwischen der Carboxylatgruppe und

der Acetamidogruppe schematisch dargestellt. Diese führen zu einer Faltung des Moleküls,

wobei in wässriger Lösung wahrscheinlich eine Aufweitung der Faltung durch eindringenden

Wassermoleküle die Folge ist. Die Wassermoleküle setzen sich zwischen die Carboxylat- und

die Acetamidogruppe, welche daraufhin über Wasserstoffbrückenbindungen miteinander

verknüpft werden.

102

6 Diskussion

103

Die NMR-Messungen wurden bei einer erhöhten Temperatur von 60°C durchgeführt um über

die damit verbundene Verringerung der Viskosität der wässrigen Lösungen eine Verbesserung

des Signal-Rauschverhältnisses zu erzielen. Diese Methode führte bereits bei Emmerichs et

al. zu guten Resultaten [114]. Die Temperaturerhöhung bewirkt eine bessere Beweglichkeit

der Moleküle, so dass eine Abnahme der Viskosität und damit eine Steigerung der spektralen

Auflösung resultiert. Wie sich allerdings durch den Vergleich mit den Ergebnissen von

Siciňska et al. sowie von Mary et al. herausstellte, wurde die Signalzuordnung bei einer

Temperatur über 37°C problematisch, da sich die Lage der 13C-Resonanzen im NMR-

Spektrum von den Literaturwerten unterscheidet [98, 99]. Die Annahme, dass der

Temperaturunterschied diesen Verschiebungseffekt auslöst, wurde durch die Ergebnisse von

Siciňska et al. erhärtet, da diese im Rahmen ihrer Arbeit einen Temperatureinfluss auf die

chemische Verschiebung detektierten. Die dort beschriebenen NMR-Messungen wurden

zwischen 4°C und 37°C durchgeführt. Um den Einfluss der Temperatur genauer zu

verifizieren und eine Signalzuordnung bei einer Temperatur von 60°C zu ermöglichen, wurde

eine inverse 1H-13C-Korrelationsmessung (HSQC) mit einem DRX-300-NMR-Spektrometer

der Firma Bruker durchgeführt (s. Absch. 5.5.2). Das aufgetragene Spektrum des DEPT-

Experimentes (Y-Achse) liefert dabei eine verbesserte Auflösung der Resonanzen gegenüber

einem NMR-Experiment mit einer ausschließlichen 13C-Anregung. Die Vermutung, dass es

sich bei der Signalverschiebung um einen Temperatureffekt handeln könnte, wurde bestätigt.

Die Änderung der chemischen Verschiebung bei höherer Temperatur wird auf eine erhöhte

Beweglichkeit der Makromoleküle zurückgeführt. Ein Indiz für diese These liefert die Arbeit

von Toffanin et al., welche ebenfalls eine Abweichung zu den NMR-Ergebnissen von

Siciňska et al. beschreibt [115]. Bei ihren NMR-Untersuchungen wurden aus nur wenigen

Saccharidbausteinen bestehende Hyaluronatfragmente eingesetzt, welche aufgrund ihrer

niedrigen Molmasse in wässriger Lösung zu einer geringen Viskosität führen. Damit

verbunden besitzen die kleineren hydrodynamischen Sphären eine höhere Beweglichkeit, so

dass eine Steigerung der spektralen Auflösung sowie eine Abweichung gegenüber den

Ergebnissen von Siciňska et al. bezüglich der C-3-Position beim 13C-NMR-Spektrum

resultiert (s. Kap. 5.5.4.2). Die Vorrausetzungen von Toffanin et al. sind vergleichbar mit

denen dieser Arbeit, da hier genauso durch die Steigerung der Temperatur eine Abnahme der

Viskosität und damit einhergehend eine Zunahme der Beweglichkeit der Moleküle bewirkt

wird. Aus diesem Grund ist es plausibel, dass sich die erhaltenen Positionen der 13C-

Resonanzen mit denen von Toffanin et al. nahezu decken.

6 Diskussion

104

6.1.3 Xanthan Das Heteropolymer Xanthan (Natriumsalz) besitzt ebenso wie das Hyaluronat bzw. das

Dextran auch ein aus Saccharideinheiten aufgebautes Rückgrad. Dies besteht wie beim

Dextran aus Glucose-Molekülen, welche über eine β-1,4 glycosidische Bindung miteinander

verknüpft sind. Abweichend vom Dextran, welches nur aus ungeladenen Glucose-

untereinheiten aufgebaut ist, wird an jedem zweiten Glucosering die Brenztraubensäure einer

Seitenkette ketalartig gebunden. Die Seitenketten bestehen dabei aus β-D-Mannose, aus β-

1,4-D-Glucuronsäure, aus α-1,2-D-Mannose und einer endständigen Pyruvatgruppe. Eben

diese Pyruvatgruppe beeinflusst die physikalischen Eigenschaften des Xanthans

charakteristisch. Es wurde z. B. ein Zusammenhang zwischen der Pyruvatkonzentration und

der Viskosität einer wässrigen Xanthan-Lösung ermittelt. Wie von Candia et al. beschrieben

nimmt die Viskosität mit steigender Konzentration der Pyruvatgruppen zu [116]. Das

Gegenion Natrium(I) führt wahrscheinlich zu einer Kompensation der sich abstoßenden

negativen Pyruvatladung und darüber hinaus zur Bildung von „schwachen“ intermolekularen

Wechselwirkungen. Diese könnten ähnlich wie beim Calcium(II)alginat zu einer Entstehung

von Verknüpfungspunkten beitragen, welche durch die Pyruvatgruppen komplexiert

werden [104]. Durch die Neutralisation der negativen Ladungen mit dem Na+-Ion können bei

Überschreitung der kritischen Konzentration die Moleküle ausreichend nah zusammen

rücken, so dass eine Polymer-Polymer-Verhakung (Entanglements) resultiert. Dies erklärt

vielleicht auch das niedrigere Löslichkeitsprodukt des Xanthans verglichen mit dem des

Hyaluronats und dem des Dextrans. Bei Konzentrationen über 20 mg/mL des unabgebauten

Xanthans wurde häufig die Bildung eines Niederschlags beobachtet. Die

Ausfällungskonzentration muss hierbei nicht so groß sein wie beim Dextran oder dem

Hyaluronat, da die Aktivität der Pyruvatgruppen zu einer stärkeren Wechselwirkung der

Polymere untereinander und damit zu einer Agglomeration führt. Die Molekülgröße des

verwendeten unabgebauten kommerziellen Xanthans wurde mittels SEC-Malls bestimmt und

besitzt mit 2,9 ⋅ 106 g/mol mit Abstand die größte Molmasse der untersuchten Polysaccharide.

Wie schon an anderer Stelle angemerkt (s. Absch. 2.1 u. 6.1.2) ist es für biofilmbildende

Organismen wichtig, dass ein Teil der exprämierten polymeren Substanzen eine gute

Wasserbindungsfähigkeit besitzt. Dies gilt auch für das Xanthan als Bestandteil der EPS des

Xanthomonas campestris, welches über eine außerordentliche Wasserbindekapazität verfügt.

Die ebenfalls äußerst kompakte sowie stabile Form im festen Zustand wird durch die starken

intramolekularen bzw. intermolekularen Wechselwirkungen bedingt. Hierbei spielen wie auch

beim Hyaluronat Wasserstoffbrücken eine wesentliche Rolle. Da Moorhouse et al. in ihrer

6 Diskussion

105

Arbeit über die Struktur von Xanthan im festen Zustand, die Kristallisation dieses Polymers

als äußerst schwierig einstufen, ist die Methode der Röntgenbeugung nur bedingt zur

Strukturaufklärung geeignet [117]. Allerdings beschreiben diese Autoren in Kombination mit

energetischen Betrachtungen eine mehrfache, rechtshändige Helixstruktur des Xanthans im

festen Zustand.

Genau wie die Struktur von Xanthan im festen Zustand ist die des Moleküls in wässriger

Lösung bisher nicht eindeutig geklärt. Es wurde jedoch ein Zusammenhang zwischen der

Ordnung des Moleküls und der Temperatur aufgezeigt [118, 119]. Hierbei wird eine

Stabilisierung sowohl der Einfach-Helix sowie der Doppel-Helix durch niedrige

Temperaturen vermutet. Weiterhin postulieren Liu et al., dass bei einer Temperaturerhöhung

der Übergang von einem geordneten Zustand der Doppel-Helix in eine aufgeweitete dimere

Knäuelstruktur mit teilweise geordneten Regionen erfolgt. Diese geordneten Regionen

werden wahrscheinlich durch Wechselwirkungen zwischen den Seitenketten sowie dem

Rückgrad des Xanthans bedingt [120]. Ebenso wie beim Hyaluronat führen in wässriger

Lösung Solvatisierungsvorgänge zu einer Aufweitung der Molekülstruktur, so dass sich die

Reibungseigenschaften der Lösung verändern und damit auch deren Viskosität. Wird das

hydrodynamische Volumen der Polymerteilchen betrachtet, so gibt es eine Beziehung

zwischen diesem und der Molmasse. Die Ergebnisse aus Kapitel 5.1 zeigen die Abhängigkeit

der Viskosität der Polymerlösungen von ihrer Molmasse auf. Mit Hilfe des Staudinger-

Indexes und dem daraus abgeleiteten Exponenten α (s. Mark-Houwink-Gl., Absch. 4.4) ist

eine Interpretation der Knäuelstruktur der gelösten Teilchen möglich (s. Absch. 5.1.2). Das

unabgebaute Molekül liegt demnach mit einem Exponenten von α = 0,88 in aufgeweiteter

Form als vollständig durchspültes Knäuel vor. Werden die abgebauten Xanthanfraktionen in

wässriger Lösung betrachtet, so fällt eine Abnahme der Viskosität mit abnehmender

Molmasse auf. Die Molmassenreduktion führt zu einer Dichtezunahme des Knäuels, welche

mit den Ergebnissen aus Abschnitt 5.1.2 belegt werden kann. Der Exponent nimmt für das

über 3 h mit Ultraschall abgebaute Xanthan nicht ganz so stark wie beim Hyaluronat um 33%

ab, so dass ein Hinweis auf eine nur teilweise durchspültes Knäuel mit eindeutig höherer

Dichte vorliegt. Hierbei weicht der Exponent genau wie beim 5 h abgebauten Xanthan nur

unwesentlich vom Idealwert einer Gauß-Kette mit α = 0,50 ab. Für das über 10 h und 15 h

abgebaute Xanthan verdichtet sich das Knäuel weiter, so dass sich die Struktur des gelösten

Moleküls einer Kugelsymmetrie annähert. Allerdings nimmt die Dichte bei vergleichbarer

Molmasse weniger stark zu als bei einem neutralen Polymer wie dem Dextran (s. α -Werte,

Absch. 5.1.2). Dies liegt wahrscheinlich an den negativen Ladungen der Pyruvatgruppen

6 Diskussion

sowie der Carboxylatgruppen des Natriumsalzes, welche sich gegenseitig abstoßen. Dieser

Effekt führt zu einer zusätzlichen Aufweitung und bleibt beim ungeladenen Dextran aus.

Einen weiteren Beweis für die postulierte makroskopische Struktur sowie für die

resultierenden Wechselwirkungen erbringt das Verhalten der wässrigen Lösung bei

variierender Schergeschwindigkeit. Während beim Dextran keinerlei Einfluss auf die

Viskosität beobachtet wird, zeigt sich beim Xanthan eine Abnahme der Viskosität mit

zunehmender Schergeschwindigkeit. Dies geschieht aufgrund einer Ausrichtung der

Polymerfasern entlang der Strömungsrichtung, welche einem für Polymere typischen

pseudoplastischen Verhalten entspricht (s. Absch. 2.5.3). Entsprechend müsste das über 3 h

abgebaute Xanthan nahezu als Gauß-Kette vorliegen. Damit würde dieses von der

idealisierten Kugelform abweichen, die als Grundlage zur Beschreibung der Viskosität einer

newtonschen Flüssigkeit dient. Wie experimentell bewiesen, verringert sich allerdings die

Viskosität durch eine Steigerung der Schergeschwindigkeit, so dass eine Abweichung vom

newtonschen Verhalten beobachtet wird. Dies spricht klar für die Richtigkeit der berechneten

Struktur des Polyelektrolyten in wässriger Lösung.

OO

O

O

O

O

O

O

O

*

O

H2CO

O

O

O

CH2OHCH2OH

AcOCH2

O

ONa+

Na+

HO

OH

OH

OH

OH

OH

HO

HO

OH

OO

O

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O

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Na+

HO

OH

OH

OH

OH

OH

HO

HO

OH

n

Abbildung 6.4: Ausschnitt von Xanthan (Trisaccharideinheit)

Die durch circulardichroitische Untersuchungen erhaltenen Ergebnisse des nativen Xanthans

spiegeln die optische Aktivität der funktionellen Gruppen wider. Diese Chromophoren

befinden sich in den Seitenketten des Polysaccharids. Dabei handelt es sich um die

Acetylgruppe der D-Mannose und die Carboxylatgruppen der D-Glucuronsäure bzw. der

Pyruvatgruppe. Angeregt durch UV-Licht im Bereich von 210 nm erfolgt ein n–π*-Übergang

für die Chromophoren. Wie in der Literatur aufgezeigt, besitzen die CD-Spektren eines

statistischen Knäuels zwei für Xanthan charakteristische Banden [121, 122]. Eine positive bei

200 nm und eine negative bei 220 nm. Wie die Ergebnisse im Kapitel 5.4.2 zeigen, wurde die

106

6 Diskussion

107

Lage der Banden des nativen Xanthans bei den hier durchgeführten Messungen reproduziert.

Also liegt das Xanthan in wässriger Lösung mit der verwendeten Konzentration von 7 mg/mL

als statistisches Knäuel vor.

Die NMR-Messungen wurden wie beim Hyaluronat bei einer Temperatur von 60°C

durchgeführt, um hinsichtlich der hohen Viskosität der wässrigen Lösungen eine

Verbesserung des Signal-Rauschverhältnisses zu erzielen. Wie die 13C-NMR-Ergebnisse

(s. Absch. 5.5) allerdings zeigen, reicht für Xanthan eine Konzentration von 16 mg/mL bei

einer Temperatur von 60°C nicht aus, um aussagekräftige 13C-NMR-Spektren zu erhalten.

Damit aber ein Anstieg der Viskosität bei zunehmender Xanthankonzentration sowie eine

Abnahme der Mobilität der Polymerketten ausbleibt, wurden die Makromoleküle mittels

Ultraschall partiell depolymerisiert. Dies bewirkt eine gute Löslichkeit der Xanthanfragmente

und entsprechend eine verbesserte Beweglichkeit der Moleküle in Lösung. Durch diese

Maßnahme wurde das Signal/Rauschverhältnis sowie die spektrale Auflösung der 13C-NMR-

Spektren entscheidend verbessert. Wie die erhaltenen Spektren ebenfalls zeigen, ist die

verwendete Degradationsmethode ausreichend selektiv bezüglich der glykosiydischen

Trennung, so dass nur Bindungen zwischen den Glucoseeinheiten des Rückgrades gespalten

wurden.

6 Diskussion

108

6.2 Wechselwirkung der Polysaccharide mit mehrwertigen Kationen

Die Ergebnisse von Schürks et al. zeigen, dass das Alginat als ein wesentlicher Bestandteil

des Biofilms von Pseudomonas aeruginosa eine außerordentliche Affinität zu mehrwertigen

Metallionen besitzt [104]. Um diese Ergebnisse in die Diskussion bezüglich der hier

eingesetzten Modellpolysaccharide einfließen zu lassen, wurden die Wechselwirkungen von

Calcium(II), Magnesium(II) und Mangan(II) auf Dextran, Hyaluronat sowie Xanthan

betrachtet. Darüber hinaus ist der Einfluss von Schwermetallionen auf aquatische Systeme

von großem Interesse, da durch die starke Anbindung eine Aufkonzentrierung ökologisch

bedenklichen Materials und damit verbunden ein erhöhtes Gefahrenpotenzial induziert wird.

Aus diesem Grund wurden weitergehend die Wechselwirkungen von Schwermetallionen wie

Eisen(II), Eisen(III), Kupfer(II), Zink(II), Cadmium(II) und Blei(II) mit den

Modelpolysacchariden untersucht.

Ein Ziel dieser Untersuchungen war es, den Bindungsmechanismus zwischen den

Polyscchariden und den mehrwertigen Kationen näher zu beschreiben. Hierfür wurden unter

anderem hochauflösende 13C-NMR-Spektren der Polysaccharide in Gegenwart

unterschiedlicher Kationenkonzentrationen aufgezeichnet. Es wurde vermutet, dass sich das

Spektrum bei einer koordinativen Bindung der Kationen zu einzelnen Monomerbausteinen

bzw. zu funktionellen Gruppen der einzelnen Bausteine verändert. Da die Kohlenstoffatome

keine direkte Bindung mit den Kationen eingehen, erwartete man zwei Änderungen des

Spektrums. Die erste Möglichkeit ist eine Verschiebung der Signale aufgrund der neuen

chemischen Umgebung. Die zweite mögliche Änderung ist eine Verbreiterung der betroffenen

Signale aufgrund der eingeschränkten Beweglichkeit koordinativ gebundener funktioneller

Gruppen. Eine Verstärkung dieses Effekts verspricht man sich durch den Einsatz

paramagnetischer Sonden in Form von paramagnetischen, bivalenten Kationen. Solche Ionen

spielen in der NMR-Spektroskopie eine wichtige Rolle. Bei 13C-NMR-Messungen wird

normalerweise darauf geachtet, paramagnetische Verunreinigungen zu vermeiden, da sie die

Relaxationszeiten verkürzen und damit die Linien verbreitern. Die Gegenwart von

paramagnetischen Ionen kann zusätzlich eine Verschiebung der Signale bewirken. Da aber

nicht alle Signale eines Moleküls gleichmäßig beeinflusst werden, lässt sich der Effekt gezielt

bei der Spektrenanalyse einsetzen. Hierbei muss man zwei Arten der Wechselwirkung

unterscheiden, die beide zu Signalverschiebungen führen. Zum einen die

Kontaktwechselwirkung und zum anderen die Pseudokontaktwechselwirkung. Beide setzen

eine Komplexbildung zwischen dem Substrat und dem paramagnetischen Metallion voraus,

6 Diskussion

109

wobei sich in Lösung ein Gleichgewicht zwischen freien Komponenten und Komplexen

einstellt. Durch die Kontaktwechselwirkung wird im Komplex Spindichte des ungepaarten

Elektrons auf das Substratmolekül übertragen. Da die Spindichteverteilung am Ort der

beobachteten Kerne sehr unterschiedlich ist, wird auch der Verschiebungseffekt nicht überall

im Molekül gleich groß sein. Die Pseudokontaktwechselwirkung ist eine dipolare

Wechselwirkung zwischen dem magnetischen Dipolfeld des ungepaarten Elektrons und dem

des beobachteten Kerns. Das Mangan(II) sowie das Kupfer(II) besitzen ein ungepaartes

Elektron. Ionen in denen ungepaarte Elektronen auftreten, besitzen ein permanentes

magnetisches Moment. Ohne äußeres Feld sind die magnetischen Momente statistisch verteilt

und heben sich gegenseitig auf. Legt man ein äußeres magnetisches Feld an, so richten sich

die magnetischen Momente in Feldrichtung aus, es entsteht eine Magnetisierung, die dem

äußeren Feld gleichgerichtet ist. Die paramagnetische Suszeptibilität ist unabhängig von der

Feldstärke, aber temperaturabhängig, da eine Temperaturzunahme der Ausrichtung der

permanenten Magnete im äußeren Feld entgegenwirkt [33].

Mit Hilfe von Titrationsversuchen ist es möglich, über den Bindungsmechanismus hinaus die

Struktur der sich einstellenden Komplexe zu untersuchen. Es wurde vermutet, dass sich die

Struktur der gelösten Polysaccharide durch die sukzessive Zugabe von mehrwertigen

Metallionen verändert. Entsteht eine koordinative Bindung der Polymeren mit den Kationen,

so geschieht dies nicht ohne makroskopische Auswirkungen. Es wurde angenommen, dass

durch die Wechselwirkung der Polysaccharide mit den Kationen in wässriger Lösung eine

Änderung der Viskosität einhergeht. Wie Emmerichs et al. beobachteten, kann dies durch eine

Vernetzung der Polymeren mit den Kationen durch die Bildung von Netzwerkpunkten

ausgelöst werden [114]. Dies würde zu einer Viskositätszunahme führen. Eine weitere

Möglichkeit besteht darin, dass sich die Teilchendichte durch eine stärkere Faltung des

Polymers und einer intensiveren intramolekularen Wechselwirkung in Anwesenheit von

Metallkationen vergrößert. Dies würde einer Viskositätsabnahme entsprechen. Verändert sich

die unmittelbare Umgebung einer funktionellen Gruppe durch die Wechselwirkung mit einem

mehrwertigen Metallion, ist ein Einfluss auf die chiroptischen Eigenschaften der Polymer-

Lösung wahrscheinlich. Ausgelöst würde dies durch die Änderung der chemischen

Umgebung der Chromophoren, so dass der Circulardichroismus bei einer solchen Probe ein

anderer wäre als bei einer kationenfreien Lösung. Es wurde weitergehend vermutet, dass die

Wechselwirkungen der Kationen mit den Biopolymeren einen diskontinuierlichen Verlauf

einer Leitfähigkeitstitration bedingen. Diese nicht kontinuierliche Zunahme der Leitfähigkeit

wird wahrscheinlich neben der kohlrauschschen Komponente durch koordinative Bindungen

6 Diskussion

110

zwischen den Polysacchariden und den mehrwertigen Metallionen verursacht. Tritt eine

Komplexierung auf, so sind die Ladungsträger in einem elektrischen Feld gehemmt bis sich

ein Gleichgewicht zwischen den freien Komponenten und den Komplexen während der

Titration einstellt. Dies würde bis zur Gleichgewichtsbildung zu einer niedrigeren

Leitfähigkeitszunahme gegenüber einer polysaccharidfreien Lösung führen.

6.2.1 Dextran Um den Einfluss von mehrwertigen Kationen auf ungeladene EPS zu untersuchen, wurde das

Dextran als Modellpolysaccharid eingesetzt. Dabei liegt der Schwerpunkt der

Untersuchungen darauf, eine Änderung der physikalischen Eigenschaften in Anwesenheit von

bi- bzw. trivalenten Kationen nachzuweisen. Das Rückgrad des Dextrans besteht aus über

glycosidische Bindungen verknüpften Glucose-Einheiten. Die Hydroxylgruppen der

Glucosemonomere besitzen am Sauerstoff lokalisierte freie Elektronenpaare, sind also

Lewisbasen. Werden diese partiell negativen Ladungen einer Lewissäure in Form eines

Kations ausgesetzt, resultiert aufgrund coulombscher Kräfte eine Anziehung. Diese auf

theoretischen Überlegungen fußende Annahme wird in der Literatur für dreiwertige

Metallionen bestätigt [123]. Die chiroptischen Untersuchungen von Crescenzi et al. zeigen,

dass ein Einfluss auf das Dextran durch die untersuchten Lanthanoide vorliegt [124]. Die

Ergebnisse von de Soares et al. sprechen dafür, dass die Hydroxylgruppen, welche am C-2-

bzw. C-3-Atom der Monomereinheiten gebunden sind, mit den untersuchten Lanthanoiden

komplexieren [125]. Dabei nimmt die Stabilität des Komplexes von La3+ über Ce3+ zu Nd3+

ab. Der von Mazi et al. beschriebene Einfluss auf die Viskosität zeigt, dass im

Konzentrationsbereich bis 0,08 mol/L die Viskosität der 20%igen Dextran-Lösung abnimmt

um dann anschließend bis zu einer Konzentration von 0,16 mol/L wieder zuzunehmen. Mit

Hilfe des ermittelten Minimums ist es möglich, nach den Ergebnissen von Hirashima et al.

ein stöchiometrisches Verhältnis zu berechnen. Für das Polymer/Kation-System beträgt das

Verhältnis 1:1 [126]. Dieser eindeutig belegte Einfluss der Lanthanoide auf Dextran in

wässriger Lösung konnte mit den hier untersuchten Kationen Ca2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Fe3+,

Cu2+, Zn2+, Cd2+ und Pb2+ nicht reproduziert werden. Wie in Kapitel 5.3.1.1 zu sehen, erfolgt

in Anwesenheit von bivalenten sowie von trivalenten Kationen im Konzentrationsbereich von

0,2 bis 1,6 mmol/L keine Änderung der Viskosität einer Dextran-Lösung mit der

Konzentration von 1,5 g/L. Eine Leitfähigkeitsänderung einer wässrigen Dextran-Lösung, wie

6 Diskussion

111

sie in Abhängigkeit der Kationenkonzentration für Lanthanoide beschrieben wurde, konnte

mit den hier untersuchten Kationen nicht nachvollzogen werden [123]. Der in Abbildung 5.4

des Kapitels 5.2.1 dargestellte Leitfähigkeitsgraph zeigt exemplarisch für die hier

untersuchten Kationen einen linearen Verlauf für die Titration einer Calcium(II)-Lösung in

eine Dextran-Lösung und beweist damit, dass keine vergleichbaren Wechselwirkungen mit

den bivalenten Kationen vorliegen. Darüber hinaus wurde eine spezifische Wechselwirkung

von bivalenten Kationen mit Dextran mit Hilfe der paramagnetischen Kationen Mangan(II)

und Kupfer(II) ausgeschlossen. Die NMR-Untersuchungen zeigen keinen Unterschied bei der

chemischen Verschiebung der Resonanzen von Dextran-Lösungen in Anwesenheit von

bivalenten Kationen zu denen ohne Kationen auf. Es wurde allerdings in Gegenwart der

paramagnetischen Ionen, wie erwartet durch die Induktion eines lokalen Magnetfeldes

innerhalb der Probe ein Einfluss auf die Relaxationzeit beobachtet, so dass eine

Linienverbreiterung für das gesamte Spektrum resultiert.

Grundsätzlich zeigt der Vergleich der Literaturergebnisse mit denen dieser Arbeit, dass die

Wertigkeit der positiven Ionen ein wesentliches Merkmal für die Interaktion zwischen Kation

und dem neutralen Polysaccharid darstellt. Die für diese Arbeit genutzten Kationen sind

entsprechend weniger starke Lewissäuren als die trivalenten Lanthanoide. Dies bedeutet, dass

die Wechselwirkungen mit den freien Elektronenpaaren des Makromoleküls so gering

ausfallen, dass sie mit den verwendeten Methoden nicht nachgewiesen werden können und

somit keinen signifikanten Einfluss auf die physikalischen Eigenschaften des Dextrans haben.

Dementsprechend wird es durch Biofilme mit Dextran als wesentlichen Bestandteil der EPS

zu keiner bedeutsamen Akkumulation von bivalenten Schwermetallionen kommen.

Neben der Ladung des Kations müssen für die Wechselwirkung von Dextran mit einem

solchen weitere Faktoren eine Rolle spielen, da das trivalente Eisen(III)ion ebenfalls keine

charakteristische Änderung der physikalischen Eigenschaften verursacht. Werden die

Kationen miteinander verglichen, erkennt man einen signifikanten Unterschied in den

Ionenradien. Diese sind im Gegensatz zu den Lanthanoiden für die hier untersuchten Ionen

abgesehen von Pb2+ mit 1,19 Å alle kleiner bzw. gleich 1,00 Å. Das Eisen(III)ion nimmt mit

einem Radius von nur 0,55 Å nicht einmal halb so viel Raum ein wie die dreiwertigen

Lanthanoide mit einem Ionenradius von ≥ 1,14 Å. Daraus kann eine Größenabhängigkeit der

Wechselwirkungsaktivität der Ionen abgeleitet werden. Dafür spricht auch die von Mazi et al.

beobachtete Stabilitätsreihe der Lanthanoidenkomplexe (s.o) [123]. Durch die Zuordnung der

entsprechenden Ionenradien für die geschilderten Metalle ist es möglich, analog zu den hier

6 Diskussion

112

diskutierten Beobachtungen eine Zunahme der Komplexstabilität mit steigendem Ionenradius

zu postulieren.

Zusammenfassend bedeutet dies Folgendes: je größer die Ladung ist und je mehr Oberfläche

eine Kationensäure besitzt, um so ausgeprägter sind die Wechselwirkungen mit dem Dextran.

6.2.2 Hyaluronat Die von Emmerichs et al. erhaltenen Ergebnisse bezüglich der Wechselwirkungen der

bivalenten Kationen Calcium(II), Magnesium(II) und Mangan(II) mit dem Algen- sowie dem

Bakterienalginat konnten mit dem Polysaccharid Dextran wie in Kapitel 6.2.2 beschrieben

nicht reproduziert werden [114]. Die geringe Lewisbasizität der Hydroxylgruppen scheint für

eine signifikante Wechselwirkung nicht ausreichend stark zu sein. Aus diesem Grund wurde

eine Untersuchung etwaiger Wechselwirkungen von mehrwertigen Metallionen mit einem

geladenen Biopolymer wie dem Hyaluronat angestrebt. Dieses Copolymer besitzt ähnlich wie

das Alginat eine Glucuronatuntereinheit. Dabei war davon auszugehen, dass eine

Wechselwirkung der Metallionen mit den in dissoziierter Form negativ geladenen

Carboxylgruppen sehr wahrscheinlich ist. Bei dem zweiten Monomer, aus welchem sich das

Hyaluronat zusammensetzt, handelt es sich um ein Glucosamid. Da zu diesem Thema noch

keine Ergebnisse veröffentlicht wurden, waren hierbei die Wechselwirkungen mit den

untersuchten Kationen völlig unklar, so dass nur eine eventuelle Wechselwirkung mit der

Amidgruppe vermutet wurde.

Zu einer Charakterisierung der Wechselwirkungen der Metallionen mit dem Hyaluronat in

wässriger Lösung wurden Leitfähigkeitstitrationen (s. Absch. 4.3) durchgeführt. An dieser

Stelle erfolgte ein Vergleich der Wechselwirkungen von Calcium(II), Magnesium(II),

Mangan(II), Eisen(II), Eisen(III), Kupfer(II), Zink(II), Cadmium(II) und Blei(II). Der

jeweilige Leitwert wurde in mS/cm notiert. Der Verlauf einer solchen Titration ist in

Abbildung 5.5 am Beispiel des über 3 h abgebauten Hyaluronats mit Blei(II) dargestellt. Die

anderen Titrationsverläufe sind im Anhang unter A.9 bis A.15 aufgeführt. Aus den

eingesetzten Hyaluronatkonzentrationen von 0,5 mg/mL bis 2,0 mg/mL konnten

Stoffmengenkonzentrationen (s. Tab. 5.3 bis 5.10) bezogen auf die jeweiligen

Polymeruntereinheiten berechnet werden. Die ermittelten Äquivalenzpunkte liegen zwischen

den Werten 0,025 und 0,11 mmol/L für die untersuchten Kationen und einer

Hyaluronatkonzentration von 1,5 mg/mL. Dies bedeutet, dass die Anbindung der Ionen in

6 Diskussion

einem Verhältnis von einem Kation zu fünf Polymeruntereinheiten erfolgt. Aufgrund dieses

Ergebnisses kann man sagen, dass die Kationen mit dem Hyaluronat wechselwirken, da eine

Hemmung der Beweglichkeit der Ladungsträger in dem angelegten elektrischen Feld

resultiert. Dies wird in Abbildung 5.5 deutlich, wo bis zum Erreichen des Äquivalenzpunktes

eine Abweichung zum polysaccharidfreien Verlauf beobachtet wird. Hierbei ist die

Abweichung der Leitfähigkeitskurve in Form der Diskontinuität für jedes untersuchte Kation

unterschiedlich stark ausgeprägt. Ein solches Verhalten spricht für die Bildung

unterschiedlich starker Komplexe. Denn je stärker ein Komplex, um so intensiver sind auch

die Wechselwirkungen zwischen Kationen und den Monomeren des Hyaluronats. Als

Indikator für die Stabilität des Komplexes bzw. für die Wechselwirkungsintensität wurde die

Differenz ∆κ* (s. Tab. 5.3 bis 5.10) der Leitfähigkeitskurven in Anwesenheit von Hyaluronat

und in Abwesenheit des Polysaccharids wie in Kapitel 4.3 beschrieben berechnet.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Ionenradius [Å]∆κ∗ [mS/cm × 10-

1

Pb2+ Ca2+ Cd2+ Zn2+ Cu2+ Mg2+ Mn2+

Abbildung 6.5: Balkendiagramm für den Ionenradius bivalenter Kationen mit der durch Leitfähigkeitstitrationen ermittelten Abnahme der spezifischen Leitfähigkeit κ*.

Durch den Vergleich der Ergebnisse wird eine tendenzielle Steigerung der Wechselwirkungen

einhergehend mit der Zunahme der Ionenradien beobachtet, da die ∆κ*-Werte wie in

Abbildung 6.6 dargestellt mit steigendem Ionenradius ebenfalls zunehmen. Diese

Beobachtung entspricht der Schlussfolgerung für die Wechselwirkung des Dextrans mit

dreiwertigen Lanthanoiden, bei der ebenfalls ein Zusammenhang zwischen Komplexstabilität

und Ionenradius festgestellt wurde (s. Absch. 6.2.2).

Die Bildung von solchen Komplexen bewirkt wahrscheinlich eine Änderung der

Molekülstruktur, so dass sich die Reibungseigenschaften der Lösung verändern und damit

113

6 Diskussion

114

auch deren Viskosität. Um dieser Frage nachzugehen, wurden rotationsviskosimetrische

Titrationen durchgeführt. Der Verlauf einer solchen Titration ist in Abbildung 5.12 am

Beispiel des Hyaluronats mit Calcium(II) dargestellt. Alle weiteren Titrationsverläufe sind im

Anhang aufgeführt. Hierbei wurde abweichend zu den Ergebnissen von Emmerichs et al. eine

Abnahme der Viskosität bei gleichzeitiger Konzentrationszunahme der mehrwertigen

Kationen in einer wässrigen Hyaluronatlösung beobachtet [114]. Es wird davon ausgegangen,

dass eine Vernetzung wie sie beim Alginat mit bivalenten Kationen beobachtet wurde,

ausbleibt und stattdessen eine Zunahme der intramolekularen Wechselwirkungen resultiert.

Wie die Abbildungen 6.2 und 6.3 in Kapitel 6.1.2 veranschaulichen, werden die solvatisierten

Hyaluronatketten in wässriger Lösung über Wasserstoffbrücken stabilisiert und liegen als

statistische Knäuel vor. Es wird vermutet, dass die positiven Ladungsträger durch

coulombsche Wechselwirkungen getrieben in diese Knäuelstruktur diffundieren und so zu

einer Faltung des Polyelektrolyten beitragen. Ausgelöst wird dies durch eine intensive

intramolekulare Verknüpfung über die Kationen mit den funktionellen Gruppen. Des

Weiteren werden die negativen Ladungen entlang der Hyaluronatkette durch die

mehrwertigen Metallionen kompensiert, so dass sich diese nicht weiter abstoßen. Dies führt

zu einer Dichtezunahme des Knäuels und entsprechend zu einer Abnahme der Reibung der

Polymerketten untereinander. Die resultierende, kontinuierliche Abnahme der Viskosität wie

sie in Abbildung 5.12 zu sehen ist, schreitet solange voran, bis sich ein Gleichgewicht

zwischen den freien Komponenten und den Komplexen während der Titration einstellt.

Oberhalb dieser Äquivalenzkonzentration beobachtet man eine konstante Viskosität. Mit

Hilfe dieser Äquivalenzkonzentration und der eingesetzten Hyaluronatkonzentration von 1,5

mg/mL konnten Stoffmengenkonzentrationen bezogen auf die jeweiligen Polymerunter-

einheiten, die mit den Kationen wechselwirken, berechnet werden. Die in Tabelle 5.21

zusammengefassten Ergebnisse entsprechen im Wesentlichen denen der konduktometrischen

Titration wobei auf ein Kation annähernd fünf Polymeruntereinheiten kommen.

Dass eine Kontraktion der Hyaluronatmoleküle in Gegenwart von mehrwertigen Kationen

sehr wahrscheinlich ist, zeigen auch die Ergebnisse der Viskositätsuntersuchung von

Hyaluronat-Lösungen in Kapitel 5.3.2.2. Hierbei wurde der Einfluss auf die Viskosität in

Abhängigkeit der Schergeschwindigkeit untersucht. Während in Abwesenheit von

mehrwertigen Kationen eine Abnahme der Viskosität einer Hyaluronat-Lösung mit

zunehmender Schergeschwindigkeit beobachtet wurde, bleibt für eine Hyaluronat-Lösung in

Anwesenheit von mehrwertigen Kationen eine Viskositätsänderung aus (s. Abb. 5.15). Eine

charakteristische Eigenschaft von Polymeren sowie von Polyelektrolyten ist, dass diese in

6 Diskussion

115

Lösung vom klassischen newtonschen Verhalten abweichen. Dies geschieht normalerweise

durch die Bildung eines vollständig durchspülten Knäuels. Die gelösten Polymere werden

durch die Zunahme der Scherkräfte zunehmend gestreckt, so dass eine Ausrichtung parallel

zur Strömungsrichtung resultiert. Dies führt zu schergeschwindigkeitsabhängigen

Viskositäten, wobei diese Strukturänderung in der Regel reversibel ist. Da sich die Viskosität

der Hyaluronat-Lösung in Gegenwart der mehrwertigen Kationen nicht verändert, wird eine

Komprimierung der Knäuelstruktur vermutet. Diese wird wahrscheinlich durch intensive

intramolekulare Wechselwirkungen bedingt und verhindert so eine Streckung des Moleküls

während einer Scherung.

Um diese Wechselwirkungen weitergehend zu charakterisieren, wurden im Rahmen dieser

Arbeit NMR-Untersuchungen durchgeführt. Man vermutet für die Kationen Mangan(II) und

Kupfer(II) einen ähnlichen Anlagerungsmechanismus wie bei den Kationen Calcium(II),

Magnesium(II), Eisen(II), Eisen(III), Zink(II), Cadmium(II) und Blei(II). Aufgrund des

Effektes der paramagnetischen Ionen Mangan(II) und Kupfer(II) wurde eine Veränderung der

NMR-Spektren von gelöstem Hyaluronat erwartet. Die Beeinflussung der Resonanzsignale

des Hyaluronats sollte Informationen über den Komplex Mangan- bzw. Kupfer-Hyaluronat

liefern und somit indirekt auch Informationen über die Hyaluronatkomplexe der übrigen

mehrwertigen Kationen. Hierfür wurden Konzentrationsreihen mit gleichen

Hyaluronatanteilen (der über 3 h abgebauten Fraktionen), aber unterschiedlichen Mangan-

bzw. Kupferkonzentrationen angesetzt. Von diesen Lösungen wurden hochauflösende 13C-

NMR-Spektren nach der „reversed gated decoupling“ Methode (s. Kap. 4.6) aufgezeichnet.

Die Spektren wurden verglichen und zeigten signifikante Linienverbreiterungen an

bestimmten Kohlenstoffatomen der Zuckerringe. Diese Spektren sind in Abbildung 5.26 für

Hyaluronat-Lösungen in Anwesenheit von Mangan(II) exemplarisch für die untersuchten

paramagnetischen Kationen dargestellt.

Man sieht hier sehr deutlich, dass beim Glucuronat nur zwei Signale verbreitert werden, siehe

dazu auch Abbildung 5.28. Aus der vergrößerten Darstellung lässt sich entnehmen, dass die

stärkste Beeinflussung an der C-6 Position gefunden wird. Das C-6 ist der Kohlenstoff der in

dissoziierter Form negativ geladenen Carboxylgruppe. Die zweite Verbreiterung findet sich

am Kohlenstoff der Position 5, also am direkt benachbarten Kohlenstoff (s. Abb. 5.27). Man

kann also von einer Wechselwirkung der Manganionen mit der negativ geladenen

Carboxylgruppe ausgehen. Das Manganion befindet sich in direkter Nähe zum C-6

Kohlenstoff und verursacht aufgrund des zusätzlichen Magnetfeldes eine starke Verbreiterung

des Signals. Dieses Magnetfeld strahlt auch auf das C-5-Atom aus und verbreitert somit auch

6 Diskussion

116

sein Signal. Diese Linienverbreiterungen sprechen für eine Wechselwirkung der

Manganionen mit der Carboxylatgruppe des Glucuronats. Bei den Resonanzen des

Glucosamids werden ebenfalls zwei Linien verbreitert (s. Abb. 5.27 und 5.28). Aus der

Abbildung 5.28 lässt sich entnehmen, dass die stärkste Beeinflussung an der C-7 Position

gefunden wird. Dabei handelt es sich um den Carbonylkohlenstoff der Amid-Gruppe. Des

Weiteren wird für die benachbarte C-8 Position der Methylgruppe eine Linienverbreiterung

detektiert. Eine Verbreiterung des Signals der Methylprotonen wird ebenfalls im 1H-NMR-

Spektrum einer Hyaluronat-Lösung in Anwesenheit von Mangan(II) beobachtet (s. Abb.

5.23). Es wird vermutet, dass sich das Manganion in der unmittelbaren Umgebung zum C-7

Kohlenstoff befindet und dort durch das zusätzliche Magnetfeld eine starke Verbreiterung des

Signals verursacht. Dieses Magnetfeld strahlt auch auf das C-8-Atom sowie auf die Protonen

der Methylgruppe aus und verbreitert somit auch diese Signale.

Die NMR-Ergebnisse sprechen für eine Wechselwirkung der Manganionen mit der

Carbonylgruppe des Glucosamids. Eine indirekte Bestätigung dieser Annahme wird durch die

chiroptischen Ergebnisse der CD-Spektroskopie geliefert. Die CD-Spektren der Abbildung

5.17 zeigen exemplarisch den Einfluss von Calcium(II) auf Hyaluronat in wässriger Lösung.

Es wird vermutet, dass diese Änderung des Circulardichroismus in Anwesenheit von

Calcium(II) durch einen ähnlichen Anlagerungsmechanismus wie bei den Kationen

Magnesium(II), Mangan(II), Eisen(II), Eisen(III), Kupfer(II), Zink(II), Cadmium(II) und

Blei(II) ausgelöst wird. Die Amidgruppe wird durch die unmittelbare Nähe des

Calcium(II)ions in ihrer räumlichen Anordnung verändert. Dieser Einfluss auf die

Ausrichtung des Chromophors bewirkt eine Intensitätsabnahme des Circulardichroismus wie

in Abbildung 5.17 gezeigt. Berücksichtigt man die bisher diskutierten Ergebnisse, so ist eine

Komplexstruktur wie in Abbildung 6.6 dargestellt sehr wahrscheinlich. In dieser Struktur ist

eine Drehung der Amidgruppe um die Stickstoffbindung zum Zuckerring angedeutet, welche

für den sich ändernden Circuladichroismus verantwortlich gemacht werden kann. Des

Weiteren befindet sich das Metallion in unmittelbarer Nähe der Carboxylat- sowie der

Carbonylgruppe. Dies passt sehr gut zu den erhaltenen NMR-Ergebnissen. Werden die bereits

für Wechselwirkungen mit einwertigen Kationen veröffentlichten Strukturen des Hyaluronats

in fester Form als auch in wässriger Lösung berücksichtigt, sprechen die im Rahmen dieser

Promotionsarbeit erhaltenen Ergebnisse für einen oktaedrischen Komplex, so wie er in

Abbildung 6.6 schematisch dargestellt ist [106].

6 Diskussion

Abbildung 6.6: Postulierte Struktur eines oktaedrischen Metall-Hyaluronatkomplexes zweier Tetrasaccharideinheiten. Der Entwurf geht konform mit den im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Ergebnissen.

Die weiteren Befunde sprechen dafür, dass dieses Model eines oktaedrischen Komplexes auf

alle im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Metallionen in wässriger Lösung gleichermaßen

angewendet werden kann.

117

Berücksichtigt man die gesammelten Fakten, so kann eine Affinität der ökologisch relevanten

Kationen zum Hyaluronat vorausgesetzt werden. Dies bedeutet für aquatische Biofilme mit

Hyaluronat als wesentlichen Bestandteil der EPS, dass eine Akkumulation von mehrwertigen

Kationen in deren Matrix wahrscheinlich ist. Diese Anreicherung von teilweise toxischem

Material ist keinesfalls unproblematisch, da es auf diese Weise in die Nahrungskette gelangen

kann. Die Aufnahme von planktonischen Partikeln mit erhöhter Schwermetallkonzentration

durch höhere Organismen kann zu einem unkalkulierbaren Risiko für diese und allen der

Nahrungskette angehörenden Spezies führen. Die mannigfaltigen Auswirkungen, wie

beispielsweise die Schwächung des Immunsystems oder die Bildung von Allergien, können

durch den Verzehr von z. B. Fisch und anderen marinen Lebensformen bis zum Menschen

vordringen. Die Wechselwirkungen mit den Schwermetallen, wie sie im Rahmen dieser

Arbeit für das Hyaluronat diskutiert wurden, können möglicherweise auch positiven Nutzen

bringen. Es ist denkbar, dass die Affinität der Schwermetallionen zum Hyaluronat zu einer

Verbesserung der Wasserqualität eingesetzt werden kann. Würde man stationäre Hyaluronat-

gele in Klärwerken als Filtersystem einsetzen oder das Hyaluronat den Klärschlämmen

beimengen, so könnten die Schwermetallionen möglicherweise aus dem Wasser entfernt

werden. Ein anschließendes Recycling durch eine chemische Behandlung würde ein solches

Verfahren, neben der endgültigen Entsorgung der Klärschlämme, schließlich abrunden.

6 Diskussion

118

6.2.3 Xanthan

Eine Wechselwirkung von mehrwertigen Metallionen mit geladenen EPS wurde bereits im

Rahmen dieser Arbeit durch die Untersuchung von Hyaluronat sowie den Untersuchungen

von Emmerichs et al bezüglich dem Alginat bestätigt [114]. Bei diesen Polyelektrolyten

handelt es sich allerdings um lineare, unverzweigte Copolymere. Der strukturelle Einfluss von

EPS mit geladenen Seitenketten wurde bei den bisher veröffentlichten Untersuchungen nicht

berücksichtigt. Eine Charakterisierung solcher Wechselwirkungen ist mit Hilfe des Xanthans

gebildet von Xanthomonas campestris möglich. Das hetero Polymer Xanthan (Natriumsalz)

besitzt ebenso wie das Hyaluronat bzw. das Dextran ein aus Saccharideinheiten aufgebautes

Rückgrad. Dies besteht wie beim Dextran aus Glucose-Molekülen, welche über eine β-1,4

glycosidische Bindung miteinander verknüpft sind. Abweichend vom Dextran, welches nur

aus ungeladenen Glucoseuntereinheiten aufgebaut ist, wird an jedem zweiten Glucosering die

Brenztraubensäure einer Seitenkette ketalartig gebunden. Die Seitenketten bestehen dabei aus

β-D-Mannose, aus β-1,4-D-Glucuronat, aus α-1,2-D-Mannose und einer endständigen

Pyruvatgruppe. Es war davon auszugehen, dass eine Wechselwirkung der Metallionen mit

den in dissoziierter Form negativ geladenen Carboxylatgruppen des Glucuronats sowie der

Pyruvatgruppe sehr wahrscheinlich ist.

Um diese Wechselwirkungen der Kationen mit dem Xanthan in wässriger Lösung

weitergehend zu charakterisieren, wurden Leitfähigkeitstitrationen (s. Absch. 4.3)

durchgeführt. An dieser Stelle erfolgte ein Vergleich der Wechselwirkungen von Calcium(II),

Magnesium(II), Mangan(II), Eisen(II), Eisen(III), Kupfer(II), Zink(II), Cadmium(II) und

Blei(II). Der jeweilige Leitwert wurde in mS/cm notiert. Der Verlauf einer solchen Titration

ist in Abbildung 5.7 am Beispiel des über 3 h abgebauten Xanthans mit Zink(II) dargestellt.

Die anderen Titrationsverläufe sind im Anhang unter A.15 bis A.22 aufgeführt. Aus den

eingesetzten Xanthankonzentrationen von 0,5 mg/mL bis 2,0 mg/mL konnten

Stoffmengenkonzentrationen (s. Tab. 5.12 bis 5.19) bezogen auf die jeweiligen

Polymeruntereinheiten berechnet werden. Die ermittelten Äquivalenzpunkte liegen zwischen

den Werten 0,022 und 0,07 mmol/L für die untersuchten Kationen und einer

Xanthankonzentration von 1,5 mg/mL. Dies bedeutet, dass eine Anbindung der Ionen in

einem Verhältnis von einem Kation zu zwei Polymeruntereinheiten erfolgt. Aufgrund der

erhaltenen Ergebnisse kann man sagen, dass die Kationen mit dem Xanthan wechselwirken,

da eine Hemmung der Beweglichkeit der Ladungsträger in dem angelegten elektrischen Feld

die Folge ist. Dies wird in Abbildung 5.7 deutlich, wo bis zum Erreichen des

6 Diskussion

Äquivalenzpunktes eine Abweichung zum polysaccharidfreien Verlauf beobachtet wird.

Hierbei wurde für jedes untersuchte Kation ein charakteristischer Verlauf der Diskontinuität

beobachtet. Dieser ist wie beim Xanthan auch von der Wechselwirkungsaktivität zwischen

den Kationen und dem Polysaccharid abhängig. Die Komplexstabilität kann in Form der

Differenz ∆κ* (s. Tab. 5.3 bis 5.10) der Leitfähigkeitskurven in Anwesenheit von Hyaluronat

und in Abwesenheit des Polysaccharids, wie in Kapitel 4.3 beschrieben, bestimmt werden.

Wie die Ergebnisse in Kapitel 5.2.3 zeigen, wird beim Xanthan ebenso wie beim Hyaluronat

und dem Dextran mit Zunahme der Ionenradien ein Anstieg der Wechselwirkungen

beobachtet.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Ionenradius [Å]∆κ∗ [mS/cm × 10-

1

Pb2+ Ca2+ Cd2+ Zn2+ Cu2+ Mg2+ Mn2+

Abbildung 6.7: Balkendiagramm für den Ionenradius bivalenter Kationen mit der durch Leitfähigkeitstitrationen ermittelten Abnahme der spezifischen Leitfähigkeit κ*.

Dieser Zusammenhang zwischen Ionenradius und den ∆κ*-Werten wird im Balkendiagramm

der Abbildung 6.7 verdeutlicht.

Es wurde vermutet, dass die Bildung von solchen Komplexen ebenso wie beim Hyaluronat (s.

Kap. 6.2.2) wahrscheinlich eine Änderung der Molekülstruktur bewirkt, so dass sich die

Reibungseigenschaften der Lösung verändern und damit auch deren Viskosität. Diese

Annahme wurde im Zusammenhang mit dreiwertigen Metallionen bereits in der Literatur

diskutiert. Rodd et al. haben im Rahmen ihrer Untersuchungen eine Zunahme der Viskosität

nach Zugabe von Aluminium(III) beobachtet [127]. Beim Überschreiten der kritischen

Konzentration, so wird von Shu et al. berichtet, bildete sich ein Gel [128]. Der Mechanismus,

welcher der Gelbildung zugrunde liegt, ist allerdings noch unklar. Um den Verlauf der

Gelbildung weitergehend zu ergründen, wurden kinetische Untersuchungen in Gegenwart von

119

6 Diskussion

Chrom(III)ionen mit Xanthan-Lösungen durchgeführt [129]. Bei den 1H-NMR-Studien von

Hansen et al. wurde in Anwesenheit des paramagnetischen Kations ein Einfluss auf die Spin-

Gitter-Relaxation beobachtet. Dies wird auf eine Zunahme der Viskosität durch die

Wechselwirkung von Xanthan mit dem dreiwertigen Metallion zurückgeführt, wobei das

Kation eine intermolekulare Vernetzung begünstigt. Eine solche Vernetzung wird auch für

das Alginat in wässriger Lösung und in Anwesenheit von bivalenten Kationen postuliert

[114]. Hierbei wird angenommen, dass die Metallionen Netzwerkpunkte ausbilden, über

welche eine intermolekulare Verbrückung möglich wird. Um einer Änderung der Viskosität

von Xanthan-Lösungen in Gegenwart von mehrwertigen Kationen nachzugehen, wurden im

Rahmen der Promotionsarbeit rotationsviskosimetrische Titrationen durchgeführt. Der

Verlauf einer solchen Titration ist in Abb. 5.12 am Beispiel des Xanthans mit Calcium(II)

dargestellt. Alle weiteren Titrationsverläufe sind im Anhang den Kationen entsprechend

aufgeführt. Die Untersuchungsergebnisse (s. Absch. 5.3.1.3) zeigen, analog zur Literatur, für

die Titration von Eisen(III) in eine Xanthan-Lösung eine Gelbildung. Für die Titration von

bivalenten Kationen wurde allerdings abweichend zu den Ergebnissen von Emmerichs et al.

eine Abnahme der Viskosität bei gleichzeitiger Konzentrationszunahme der zweiwertigen

Kationen in einer wässrigen Xanthan-Lösung beobachtet [114]. Es wird davon ausgegangen,

dass eine Vernetzung wie sie beim Alginat mit bivalenten Kationen beobachtet wurde,

ausbleibt und stattdessen eine Zunahme der intramolekularen Wechselwirkungen resultiert.

OO

OO

OO

OH2C

O

OO

O

CH2OHCH2OH

AcOCH2

HO

OH

HOHOHOOH

OH

O

O

O O

OH

HO

O

OO

OO

OO

O

CH2

O

O

O O

CH2OHCH2OH

AcOCH2

HO

OH

HOHOHOOH

OH

O

O

O O

OH

HO

H3CO

**

Na+

n

n

Na+

CH3

Abbildung 6.8: Schematische Darstellung einer möglichen Struktur der intermolekularen Wasserstoffbrückenbindung von Xanthan (Natriumsalz) in wässriger Lösung [130].

120

6 Diskussion

121

Wie die von Tako et al. postulierte Struktur zweier Pentasaccharideinheiten von Xanthan in

wässriger Lösung veranschaulicht (s. Abb. 6.8), werden die solvatisierten Doppelhelices in

wässriger Lösung über Wasserstoffbrücken stabilisiert und liegen als statistisches Knäuel vor

[130]. Es wird vermutet, dass die bivalenten, positiven Ladungsträger durch coulombsche

Wechselwirkungen getrieben in diese Knäuelstruktur diffundieren und die einwertigen

Natriumionen verdrängen. Durch das Eindringen der zweiwertigen Kationen würde eine

Faltung des Polyelektrolyten begünstigt. Ausgelöst würde diese Faltung durch eine intensive

Wechswelwirkung der Kationen mit den Carboxylatgruppen der Seitenkette. Des Weiteren

werden die negativen Ladungen entlang der Xanthankette durch die Metallionen kompensiert,

so dass sich die negativen Gruppen nicht weiter abstoßen. Dies führt zu einer Dichtezunahme

des Knäuels und entsprechend zu einer Abnahme der Reibung der Polymerketten

untereinander. Die resultierende, kontinuierliche Abnahme der Viskosität wie sie in

Abbildung 5.13 zu sehen ist, schreitet solange voran, bis sich ein Gleichgewicht zwischen den

freien Komponenten und den Komplexen während der Titration einstellt. Oberhalb dieser

Äquivalenzkonzentration beobachtet man eine konstante Viskosität. Mit Hilfe dieser

Äquivalenzkonzentration und der eingesetzten Xanthankonzentration von 1,5 mg/mL konnten

Stoffmengenkonzentrationen bezogen auf die jeweiligen Polymeruntereinheiten, die mit den

Kationen wechselwirken, berechnet werden. Die in Tabelle 5.22 zusammengefassten

Ergebnisse entsprechen im Wesentlichen denen der konduktometrischen Titration, wobei auf

ein Kation annähernd zwei Polymeruntereinheiten kommen.

Dass eine Kontraktion der Xanthanmoleküle in Gegenwart von bivalenten Kationen sehr

wahrscheinlich ist, zeigen auch die Ergebnisse der Viskositätsuntersuchung von Xanthan-

Lösungen in Kapitel 5.3.2.3. Hierbei wurde der Einfluss auf die Viskosität in Abhängigkeit

der Schergeschwindigkeit untersucht. Analog zu den Ergebnissen des Hyaluronats in

wässriger Lösung wurde in Abwesenheit von mehrwertigen Kationen eine Abnahme der

Viskosität einer Xanthan-Lösung mit zunehmender Schergeschwindigkeit beobachtet. Ebenso

wie beim Hyaluronat bleibt eine Viskositätsänderung der Xanthan-Lösung in Anwesenheit

von zweiwertigen Kationen jedoch aus (s. Abb. 5.16). Eine charakteristische Eigenschaft von

Polymeren sowie von Polyelektrolyten ist, dass diese in Lösung vom klassischen

newtonschem Verhalten abweichen. Dies geschieht normalerweise durch die Bildung eines

vollständig durchspülten Knäuels. Die gelösten Polymere werden durch die Zunahme der

Scherkräfte zunehmend gestreckt, so dass eine Ausrichtung parallel zur Strömungsrichtung

resultiert. Dies führt zu schergeschwindigkeitsabhängigen Viskositäten, wobei diese

Strukturänderung in der Regel reversibel ist. Ein solches Verhalten wird auch für die

6 Diskussion

122

Polelektrolyten Xanthan und Hyaluronat in wässriger Lösung angenommen. Da sich die

Viskosität der Xanthan-Lösung in Gegenwart der bivalenten Kationen ebenso wie beim

Hyaluronat nicht verändert, wird für die beiden Polymere in Lösung ein ähnlicher

Wechselwirkungsmechanismus vermutet. In beiden Fällen führt dieser zu einer

Komprimierung der Knäuelstruktur, welche wahrscheinlich durch intensive intramolekulare

Wechselwirkungen bedingt wird. Auf diese Weise wird eine signifikante Streckung des

Moleküls während einer Scherung verhindert.

Um diese Wechselwirkungen weitergehend zu charakterisieren, wurden analog zum

Hyaluronat (s. Kap. 6.2.2) NMR-Untersuchungen durchgeführt. Man vermutet für die

Kationen Mangan(II) und Kupfer(II) einen ähnlichen Anlagerungsmechanismus wie bei den

Kationen Calcium(II), Magnesium(II), Eisen(II), Eisen(III), Zink(II), Cadmium(II) und

Blei(II). Aufgrund des Effektes der paramagnetischen Ionen Mangan(II) und Kupfer(II)

wurde eine Veränderung der NMR-Spektren von gelöstem Xanthan erwartet. Die

Beeinflussung der Resonanzsignale des Xanthans sollte Informationen über den Komplex

Mangan- bzw. Kupfer-Xanthan liefern und somit indirekt auch Informationen über die

Xanthankomplexe der übrigen mehrwertigen Kationen. Hierfür wurden Konzentrationsreihen

mit gleichen Xanthananteilen der über 3 h abgebauten Fraktionen, aber unterschiedlichen

Mangan- bzw. Kupferkonzentrationen angesetzt. Von diesen Lösungen wurden

hochauflösende 13C-NMR-Spektren nach der reversed gated decoupling Methode (s. Kap.

4.6) aufgezeichnet. Die Spektren wurden verglichen und zeigten signifikante

Linienverbreiterungen an bestimmten Kohlenstoffatomen der Seitenketten. Diese Spektren

sind in Abbildung 5.29 für Xanthan-Lösungen in Anwesenheit von Mangan(II) exemplarisch

für die untersuchten paramagnetischen Kationen dargestellt.

Die Annahme, dass eine Wechselwirkung des bivalenten Kations mit dem Glucuronat der

Xanthanseitenkette erfolgt, konnte an dieser Stelle nicht bestätigt werden. Ein Einfluss auf die

Signalbreite oder auf die Signalintensität der Carboxylatresonanzen des Glucuronats wurden

nicht detektiert (s. Abb. 5.29). Werden die Vergrößerungen in den Abbildungen 5.30 bzw.

5.31 betrachtet, wird die Vermutung, dass die Carboxylgruppe der Pyruvatgruppe in eine

Wechselwirkung mit den mehrwertigen Kationen involviert ist, bestätigt. Es wurde für drei

Resonanzen der Pyruvylgruppe eine Linienverbreiterung detektiert. Wie in Abbildung 5.30

(links) zu sehen, ist das C-1-Signal des Kohlenstoffs der in dissoziierter Form negativ

geladenen Carboxylgruppe von diesem Effekt am stärksten betroffen. Die zweite

Verbreiterung findet sich am direkt benachbarten Kohlenstoff der Position 2 (s. Abb. 5.30).

Die dritte Verbreiterung wurde für den Kohlenstoff der Methylgruppe detektiert, welche

6 Diskussion

123

ebenfalls an den C-2-Kohlenstoff der Pyruvylgruppe kovalent gebunden ist (s. Abb. 5.31).

Man kann also von einer Wechselwirkung der Manganionen mit der negativ geladenen

Carboxylgruppe der Pyruvatgruppe ausgehen. Das Manganion befindet sich in direkter Nähe

zum Carboxylkohlenstoff und verursacht aufgrund des zusätzlichen Magnetfeldes eine starke

Verbreiterung des Signals. Dieses Magnetfeld strahlt auch auf das C-2-Atom sowie auf den

Kohlenstoff der Methylgruppe aus und verbreitert somit auch diese Signale. Eine

Verbreiterung des Signals der Methylprotonen wird ebenfalls im 1H-NMR-Spektrum einer

Xanthan-Lösung in Anwesenheit von Mangan(II) beobachtet (s. Abb. 5.24). Es wird

vermutet, dass sich das Manganion in der unmittelbaren Umgebung zum Methylkohlenstoff

befindet und dort durch das zusätzliche Magnetfeld eine starke Verbreiterung des Signals

verursacht. Ein weiterer Einfluss auf die Linienbreite bzw. deren Intensität wurde im 13C-

NMR-Spektrum nicht beobachtet.

Die NMR-Ergebnisse sprechen für eine Wechselwirkung der Manganionen mit der

Carboxylgruppe der Pyruvatgruppe. Eine indirekte Bestätigung dieser Annahme wird durch

die chiroptischen Ergebnisse der CD-Spektroskopie geliefert. Die CD-Spektren der

Abbildung 5.19 zeigen exemplarisch Xanthan in wässriger Lösung in Gegenwart von

Calcium(II). Wie dort zu sehen, bleibt eine Änderung des Circulardichroismus in

Anwesenheit von Calcium(II) aus. Ein möglicher Grund hierfür ist, dass eine koordinative

Bindung eines bivalenten Kations mit der Carboxylgruppe der Pyruvatgruppe keine Änderung

der chiroptischen Eigenschaften verursacht. Dieses Verhalten wurde beim Hyaluronat

ebenfalls beobachtet, wo ausschließlich eine Änderung des Circulardichroismus für das

Signal des Glucosamids beobachtet wurde und die koordinative Bindung des Kations mit der

Carboxylgruppe keinen weiteren Einfluss auf das Spektrum zeigte. Führt man die Änderung

des CD-Signals auf eine Drehung der Amidgruppe zurück, so folgt daraus, dass die

Wechselwirkung mit der Carboxylgruppe zu keinerlei weiteren konformativen Änderung der

Struktur führt. Überträgt man dieses Ergebnis auf die CD-Untersuchung des Xanthans, wird

analog ein konformativer Einfluss für die Wechselwirkung der Kationen mit den

Pyruvatgruppen ausgeschlossen.

Fasst man die bisher diskutierten Ergebnisse zusammen, so ist eine Komplexstruktur wie sie

von Tako et al. für einen Calcium(II)-Xanthankomplex vorgeschlagen wurde (Abb. 6.9) nicht

plausibel. In Abbildung 6.9 wird eine Wechselwirkung zwischen den Carboxylatgruppen der

Pyruvatgruppe sowie des Glucuronats schematisch dargestellt. Dies ist aber nach den hier

vorliegenden Erkenntnissen nicht möglich, da die NMR-Ergebnisse eine ausschließliche

6 Diskussion

Wechselwirkung der Carboxylgruppe der Pyruvatgruppe aufzeigen. Des Weiteren würde in

einem solchen Komplex auf jedes Kation eine Polymeruntereinheit kommen.

OO

OO

OO

OH2C

O

O

O O

CH2OHCH2OH

AcOCH2

HO

OH

HOHO

HOOH

OH

O

O

O O

OH

HO

O

OO

OO

OO

O

CH2

O

O

O O

CH2OHCH2OH

AcOCH2

HO

OH

HOHO

HOOH

OH

O

O

O O

OH

HO

O

**

Ca2+ Ca2+

n

n

Abbildung 6.9: Schematische Darstellung einer möglichen Struktur der intermolekularen Calcium(II)-Brückenbindung von Xanthan (Calciumsalz) einschließlich intramolekularer Assoziation in wässriger Lösung vorgeschlagen von Tako et al. [130]. Dies widerspricht aber den Ergebnissen der konduktometrischen Titration sowie der

rotationviskosimetrischen Titration, mit welchen ein Verhältnis von einem Kation zu zwei

Polymeruntereinheiten bestimmt wurde.

Abbildung 6.10: Schematische Darstellung einer möglichen Struktur der intermolekularen Brückenbindung von Xanthan über bivalente Kationen einschließlich intramolekularer Assoziation analog zu den im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse. 124

6 Diskussion

125

Mit der obigen Abbildung 6.10 erhält man eine schematische Darstellung, bei der die hier

erhaltenen Ergebnisse berücksichtigt wurden. Wie dort abgebildet wird eine oktaedrische

Koordination des Natriumions über die Acetylgruppe und zwei Carboxylatgruppen der

Glucuronate aufgezeigt. Diese Glucuronate sind Teile zweier Seitenketten und gehören

jeweils zu einer benachbarten Pentasaccharideinheit. Des Weiteren wird davon ausgegangen,

dass ein tetraedrischer Komplex durch die Wechselwirkung von einem bivalenten Kation mit

zwei Carboxylatgruppen von gegenüberliegenden Pyruvatgruppen gebildet wird. Dieser

Bindungsmechanismus, wie er hier für die Bildung eines tetraedrischen Chelatkomplexes

geschildert wird, gilt wahrscheinlich für alle im Rahmen dieser Arbeit untersuchten

Metallionen gleichermaßen.

Betrachtet man die gesammelten Fakten, dann gilt eine Affinität der ökologisch relevanten

Kationen zum Xanthan, wie sie auch für das Hyaluronat beobachtet wurde, als bewiesen.

Dies bedeutet entsprechend, dass aquatische Biofilme, mit Xanthan als wesentlichen

Bestandteil der EPS, mehrwertige Kationen akkumulieren können. Das unkalkulierbare

Risiko für die Spezies in dessen Nahrungskette die Schwermetalle eindringen gilt an dieser

Stelle genauso wie für das Hyaluronat.

Es ist denkbar, dass die Affinität des Xanthans zu Schwermetallionen ebenso wie beim

Hyaluronat beschrieben durch den Einsatz in Klärwerken zu einer Verbesserung der

Wasserqualität beitragen kann.

7 Zusammenfassung

126

7 Zusammenfassung Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen bezüglich der

Wechselwirkungen von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) und ökologisch

relevanten bi- bzw. trivalenten Kationen in wässriger Lösung durchgeführt. Mittels

physikalischer Methoden wurden die Modellpolysaccharide Dextran, Hyaluronat sowie

Xanthan in Anwesenheit und in Abwesenheit von mehrwertigen Metallionen (Ca2+, Mg2+,

Mn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Cd2+ und Pb2+) charakterisiert. Das ungeladene Dextran wurde

als Vergleichssubstanz für die geladenen Polyelektrolyte Hyaluronat und Xanthan eingesetzt.

Um bei geladenen Molekülen den Einfluss von Seitenketten zu untersuchen, wurde das

Xanthan mit dem Hyaluronat verglichen. Ein partieller Abbau der Polymeren in Lösung

wurde durch eine Ultraschalldegradation erzielt. Dabei wurde die Molmasse für das

Hyaluronat von 1,7 ⋅ 106 g/mol auf 4,0 ⋅ 105 g/mol und für Xanthan von 2,9 ⋅ 106 g/mol auf

1,4 ⋅ 105 g/mol reduziert. Dies führt zu einer Viskositätsabnahme der Polymerlösung und

somit zu einer höheren Beweglichkeit der solvatisierten Moleküle. Das Dextran war mit einer

Molmasse von 2,0 ⋅ 105 g/mol bereits gut löslich und wurde aus diesem Grund nicht weiter

abgebaut. Mit Hilfe von Leitfähigkeits- bzw. rotationsviskosimetrischen Titrationen wurde

das Verhältnis von Kationen zu den Polymeruntereinheiten für Hyaluronat mit 1 zu 5 und für

Xanthan mit 1 zu 2 am Äquivalenzpunkt bestimmt. Die Polyelektrolytlösungen zeigten in

Abwesenheit von mehrwertigen Kationen eine Abweichung vom klassischen newtonschen

Verhalten. Dies wurde durch Untersuchungen der Viskosität in Abhängigkeit zur Scherrate

festgestellt. In Anwesenheit von bi- bzw. trivalenten Metallionen gab es keine Abweichungen

vom newtonschen Verhalten. Es wird vermutet, dass in Gegenwart von Kationen eine starke

intramolekulare Wechselwirkung zu einer Dichtezunahme des Moleküls und damit zu einer

Abnahme der Viskosität der Lösungen führt. Bestätigt wurde dies durch rotations-

viskosimetrische Titrationen, bei denen eine Abnahme der Viskosität der Lösungen bei

gleichzeitiger Erhöhung der Kationenkonzentration beobachtet wurde. Strukturspezifische

Wechselwirkungen wurden für das Hyaluronat sowie für Xanthan mittels CD-Spektroskopie

und 1H- bzw. 13C-NMR-spektroskopischen Untersuchungen nachgewiesen. Hierbei

beobachtete man für das Hyaluronat regiospezifische Wechselwirkungen der untersuchten

Kationen mit den Amidgruppen sowie den Carboxylatgruppen. Für das Xanthan zeigten die

Untersuchungen eine spezifische Wechselwirkung der mehrwertigen Metallionen

ausschließlich mit den Carboxylatgruppen der Pyruvatgruppen auf.

7 Zusammenfassung

Bei Berücksichtigung der gesammelten Fakten wurde eine Affinität der hier untersuchten

ökologisch relevanten Kationen zu den geladenen Vertretern der EPS nachgewiesen. Für das

Hyaluronat bedeutet dies in Gegenwart von mehrwertigen Kationen die Bildung eines

intramolekularen, oktaedrischen Chelatkomplexes, dessen Stabilität mit dem Kationenradius

zunimmt (s. Abb. 7.1).

Abbildung 7.1: Postulierte Struktur eines oktaedrischen Metall-Hyaluronatkomplexes zweier Tetrasaccharideinheiten.

Das Xanthan bildet ebenfalls in Gegenwart von mehrwertigen Kationen einen

intramolekularen Chelatkomplex, bei welchem allerdings eine tetraedrische Koordination des

Kations vermutet wird. Bei diesem Komplex nimmt die Stabilität wie beim Hyaluronat mit

dem Kationenradius zu. Die in der Literatur beschriebene Annahme, dass Xanthan mit den

mehrwertigen Kationen über die Pyruvatgruppen und die Glucuronate wechselwirken, konnte

nicht bestätigt werden [130]. Analog zu den hier erhaltenen Ergebnissen wird vielmehr davon

ausgegangen, dass die koordinativen Bindungen auf die Pyruvatgruppen beschränkt sind (s.

Abb. 7.2).

Abbildung 7.2: Strukturvorschlag für die Wechselwirkung von Xanthan mit mehrwertigen Kationen.

127

8 Literaturverzeichnis

128


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9 Anhang

9 Anhang Anhang A – Abbildungsanhang Konduktometrie

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Abbildung A.1: Exemplarische Abbildung für eine Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Mg2+-Lösung (0,05 mol/L)

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Abbildung A.2: Exemplarische Abbildung für eine Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Mn2+-Lösung (0,05 mol/L)

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9 Anhang

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Abbildung A.3: Exemplarische Abbildung für eine Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Fe2+-Lösung (0,05 mol/L)

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Abbildung A.4: Exemplarische Abbildung für eine Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Fe3+-Lösung (0,05 mol/L) 138

9 Anhang

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Abbildung A.5: Exemplarische Abbildung für eine Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Cu2+-Lösung (0,05 mol/L

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Abbildung A.6: Exemplarische Abbildung für eine Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Zn2+-Lösung (0,05 mol/L 139

9 Anhang

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Abbildung A.7: Exemplarische Abbildung für eine Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Cd2+-Lösung (0,05 mol/L

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Abbildung A.8: Exemplarische Abbildung für eine Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Pb2+-Lösung (0,05 mol/L 140

9 Anhang

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Abbildung A.9: Exemplarische Abbildung für eine Titration einer Lösung (100 mL) des über 3 h abgebauten Hyaluronats (1,5 mg/mL) mit einer Ca2+-Lösung (0,05 mol/L)

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Konzentrat io n M e2+ [mo l/L]

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Abbildung A.10: Exemplarische Abbildung für eine Titration einer Lösung (100 mL) des über 3 h abgebauten Hyaluronats (1,5 mg/mL) mit einer Mg2+-Lösung (0,05 mol/L) 141

9 Anhang

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Abbildung A.11: Exemplarische Abbildung für eine Titration einer Lösung (100 mL) des über 3 h abgebauten Hyaluronats (1,5 mg/mL) mit einer Mn2+-Lösung (0,05 mol/L)

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Abbildung A.12: Exemplarische Abbildung für eine Titration einer Lösung (100 mL) des über 3 h abgebauten Hyaluronats (1,5 mg/mL) mit einer Fe2+-Lösung (0,05 mol/L)

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9 Anhang

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Abbildung A.13: Exemplarische Abbildung für eine Titration einer Lösung (100 mL) des über 3 h abgebauten Hyaluronats (1,5 mg/mL) mit einer Cu2+-Lösung (0,05 mol/L)

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Abbildung A.14: Exemplarische Abbildung für eine Titration einer Lösung (100 mL) des über 3 h abgebauten Hyaluronats (1,5 mg/mL) mit einer Zn2+-Lösung (0,05 mol/L)

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9 Anhang

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Abbildung A.15: Exemplarische Abbildung für eine Titration einer Lösung (100 mL) des über 3 h abgebauten Hyaluronats (1,5 mg/mL) mit einer Cd2+-Lösung (0,05 mol/L)

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Abbildung A.16: Exemplarische Abbildung einer Leitfähigkeitskurve für die Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung (100 mL) der Konzentration 1,5 mg/mL mit einer Ca2+-Lösung der Konzentration 0,05 mol/L

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9 Anhang

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Abbildung A.17: Exemplarische Abbildung einer Leitfähigkeitskurve für die Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung (100 mL) der Konzentration 1,5 mg/mL mit einer Mg2+-Lösung der Konzentration 0,05 mol/L

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Abbildung A.18: Exemplarische Abbildung einer Leitfähigkeitskurve für die Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung (100 mL) der Konzentration 1,5 mg/mL mit einer Mn2+-Lösung der Konzentration 0,05 mol/L 145

9 Anhang

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Abbildung A.19: Exemplarische Abbildung einer Leitfähigkeitskurve für die Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung (100 mL) der Konzentration 1,5 mg/mL mit einer Fe2+-Lösung der Konzentration 0,05 mol/L

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Abbildung A.20: Exemplarische Abbildung einer Leitfähigkeitskurve für die Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung (100 mL) der Konzentration 1,5 mg/mL mit einer Cu2+-Lösung der Konzentration 0,05 mol/L 146

9 Anhang

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0,55

0,6

0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005


Lei

tfäh

igke

it [m

S/cm

]

Abbildung A.21: Exemplarische Abbildung einer Leitfähigkeitskurve für die Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung (100 mL) der Konzentration 1,5 mg/mL mit einer Cd2+-Lösung der Konzentration 0,05 mol/L

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005


Lei

tfäh

igke

it [m

S/cm

]

Abbildung A.22: Exemplarische Abbildung einer Leitfähigkeitskurve für die Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung (100 mL) der Konzentration 1,5 mg/mL mit einer Pb2+-Lösung der Konzentration 0,05 mol/L

147

9 Anhang

Rotationsviskosimetrie

Viskositätsänderung einer Dextranlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer MgCl2-Lsg. (0,05 mol/L)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014

Konzentration von MgCl2 [mol/L]

η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

Viskositätsänderung einer Dextranlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer MnCl2-Lsg. (0,05 mol/L)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014

Konzentration von MnCl2 [mol/L]

η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

Viskositätsänderung einer Dextranlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe

einer FeCl2-Lsg. (0,05 mol/L)

0,5

0,55

0,6

0,65

0,7

0,75

0,8

0,85

0,9

0,95

1

0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,014 0,016 0,018 0,02

Konzentration von FeCl2 [mol/L]

η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

Viskositätsänderung einer Dextranlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer FeCl3-Lsg. (0,05 mol/L)

0,5

0,55

0,6

0,65

0,7

0,75

0,8

0,85

0,9

0,95

1

0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,014 0,016 0,018 0,02


η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

Viskositätsänderung einer Dextranlösung (1,5 mg/mL)

bei Zugabe einer CuCl2-Lsg. (0,05 mol/L)

0,5

0,55

0,6

0,65

0,7

0,75

0,8

0,85

0,9

0,95

1

0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,014 0,016 0,018 0,02

Konzentration von CuCl2 [mol/L]

η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

Viskositätsänderung einer Dextranlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer ZnAc2-Lsg. (0,05 mol/L)

0,5

0,55

0,6

0,65

0,7

0,75

0,8

0,85

0,9

0,95

1

0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,014 0,016 0,018 0,02

Konzentration von ZnAc2 [mol/L]

η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

Viskositätsänderung einer Dextranlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer CdAc2-Lsg. (0,05 mol/L)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014

Konzentration von CdAc2 [mol/L]

η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

Viskositätsänderung einer Dextranlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer PbAc2-Lsg. (0,05 mol/L)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014 0,0016 0,0018 0,002

Konzentration von PbAc2 [mol/L]

η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

148

9 Anhang

Viskositätsänderung einer Hyaluronatlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer MgCl2-Lsg. (0,05 mol/L)

0

10

20

30

40

50

60

70

0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014


η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

Viskositätsänderung einer Hyaluronatlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer MnCl2-Lsg. (0,05 mol/L)

0

10

20

30

40

50

60

0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014


η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

Viskositätsänderung einer Hyaluronatlösung (1,0 mg/mL) bei Zugabe einer FeCl2-Lsg. (0,05 mol/L)

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

2,4

0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,014


η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

Viskositätsänderung einer Hyaluronatlösung (1,0 mg/mL) bei Zugabe einer CuCl2-Lösung (0,05 mol/L)

0,75

0,95

1,15

1,35

1,55

1,75

1,95

2,15

0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014


η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

Viskositätsänderung einer Hyaluronatlösung (1,5 mg/mL) bei

Zugabe einer ZnAc2-Lsg. (0,05 mol/L)

0

10

20

30

40

50

60

0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014


η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

Viskositätsänderung einer Hyaluronatlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer CdAc2-Lsg. (0,05 mol/L)

0

10

20

30

40

50

60

70

0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014


η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

Viskositätsänderung einer Hyaluronatlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer PbAc2-Lsg. (0,05 mol/L)

1,5

1,7

1,9

2,1

2,3

2,5

2,7

2,9

3,1

0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014


η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

Viskositätsänderung einer Xanthanlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer MgCl2-Lsg. (0,05 mol/L)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014


η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

149

9 Anhang

Viskositätsänderung einer Xanthanlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer MnCl2-Lsg. (0,05 mol/L)

1,5

1,7

1,9

2,1

2,3

2,5

2,7

2,9

3,1

3,3

0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014


η (

Visk

ositä

t) [m

Pa*s

]

Viskositätsänderung einer Xanthanlösung (1,0 mg/mL) bei Zugabe einer FeCl2-Lsg. (0,5 mol/L)

1

1,5

2

2,5

3

0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025


η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

Viskositätsänderung einer Xanthanlösung (1,0 mg/mL) bei Zugabe einer CuCl2-Lsg. (0,1 mol/L)

1

1,5

2

2,5

3

0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014


η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

Viskositätsänderung einer Xanthanlösung (1,0 mg/mL) bei Zugabe einer ZnAc2-Lsg. (0,5 mol/L)

1

1,5

2

2,5

3

0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025


η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

Viskositätsänderung einer Xanthanlösung (1,0 mg/mL) bei Zugabe einer

CdAc2-Lsg.(0,2 mol/L)

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025


η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

Viskositätsänderung einer Xanthanlösung (1,0 mg/mL) bei Zugabe einer

PbAc2-Lsg. (0,05 mol/L)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014


η (V

isko

sitä

t) [m

Pa*s

]

150

9 Anhang

151

3C-NMR-Spektroskopie

1

255075100125150175 Abbildung 5.26: Exemplarische Darstellung eines 13C-NMR-Spektrums von Hyaluronat in Gegenwart von 0,3 mmol/L (a) und 1,2 mmol/L (b) Cu2+- Ionen.

102030405060708090100110120130140150160170180190

pektrums von Xanthan in egenwart von 0,3 mmol/L (a) und 1,2 mmol/L (b) Cu2+- Ionen.

a)

b)

Abbildung 5.26: Exemplarische Darstellung eines 13C-NMR-SG

9 Anhang

152

nhang B - Abbildungsverzeichnis

Abbildung 2.1: et

den konvektiven Fluss durch offene Wasserkanäle in der Matrix [10]. 3

bbildung 2.2: Rasterelektronische (SEM) Aufnahme von Leuconostoc mesenteroides 7

ooepidemicus 8

bbildung 2.4: Rasterelektronische (SEM) Aufnahme von Xanthomonas campestris 9

bbildung 2.5: Häufige Monosaccharideinheiten in Biopolymeren 11

Abbildung 2.6: kationischer Polyelektrolyt Polydiallyldimethyl-ammoniumchlorid (rechts) 13

Abbildung 2.7: nte:

r Koordination eines Calciumions innerhalb einer „Eggbox“ [42] 16

Abbildung 2.8: ckten Konformation (b) und einer Perlenketten Struktur (c) [52] 17

Abbildung 2.9: (Monosaccharidbaustein) 18

Abbildung 2.10 einheit der Hyaluronsäure (Disaccharidbaustein) 19

Abbildung 2.11 heit des Xanthans (Pentasaccharidbaustein) 20

Abbildung 2.12 Oberflächengewässer Deutschlands im Jahr 1985, 1995 und 2000 [69] 23

A

Modell eines Biofilms in wässriger Umgebung. Es sind diskrete Mikrokolonien, in denen die Zellen in eine dichte EPS-Matrix eingebettsind, erkennbar. Die Pfeile symbolisieren

A Abbildung 2.3: Rasterelektronische (SEM) Aufnahme von Streptococcus equi subsp. Z A A

Anionischer Polyelektrolyt Natrium-Polystyrolsulfonat (links) und

Das „Eggbox“-Modell für Calcium-Alginat; hellblaue Kettensegmente: Polymannuronatblöcke; dunkelblaue KettensegmePolyguluronatblöcke; rechts: Detailansicht de

Computersimulation eines statistischen Knäuels (a), der gestre

Abbildung einer Monomereinheit des Dextrans

: Abbildung einer Grund

: Abbildung einer Grundein

: Schwermetallemissionen aus Punkt- und diffusen Quellen in die

9 Anhang

153

Abbildung 2.13 ulenfüllmaterials (A) und des Trenn- mechanismus der SEC (B) 25

Abbildung 2.14 konduktometrische Untersuchungen. B) Wheatstone Brückenschaltung [80] 29

Abbildung 2.15 n Wellen, die 90 ° phasenverschoben sind. B) Links polarisiertes Licht 31

Abbildung 2.16 einer optisch aktiven Verbindung (εL ≠ εR) resultiert ein CD-Signal

[82]. 31

Abbildung 2.17 h der Absorption; Charakteristisch für einen positiven Cotton-Effekt. 32

Abbildung 2.18 lengangs in einem CD-Spektrometer (Yobin Yvon Dichrograph Mark III) 33

bbildung 2.19: Laminares Strömungsdiagram 34

bbildung 2.20: Schematische Darstellung des Fließverhaltens nicht-Newtonscher Fluide 35

Abbildung 2.21 e Darstellung eines Koaxial-Zylinder-Rotationsviskosi- meters [86] 37

Abbildung 2.22 e Darstellung eines Kegel-Platte- Rotationsviskosi- meters [86] 38

bbildung 2.23: Schematische Darstellung eines Platte-Platte-Viskosimeters [86] 39

bbildung 2.24: Impulsfolge bei der Breitbandentkopplung [92] 41

Abbildung 2.25ird.

Abhängigkeit von der Anzahl der direkt gebundenen Wasserstoffatome [95] 41

: Darstellung des porösen Sä

: A) Schematische Darstellung einer Präzisionsleitfähigkeitsmesszelle für

: A) Zirkular polarisiertes Licht; Erzeugung aus zwei linear polarisierte

: Durch unterschiedliche Absorption des links- bzw. rechtspolarisierten Lichts

: UV-Spektrum und zugehöriges Circulardichrogramm im Bereic

: Schematische Darstellung eines Strah

A A

: Schematisch

: Schematisch

A A

: Angeregter Kern ist 1H. Nach der Zeit τ entsteht ein Antiphasentherm, der mit Hilfe des 90°-Pulses auf 13C in einen Multiquantentherm überführt w In der folgenden τ-Periode differenzieren sich die Operatortherme in

9 Anhang

154

Abbildung 2.26 uf 13C

ünschte Magnetisierung. Detektiert wird 1H unter 13C-Entkopplung [96] 42

Abbildung 4.1

wässrige Polyelektrolytlösung (b). 49

Abbildung 4.2 einer Titration einer Salzlösung in eine wässrige Polyelektrolytlösung 51

Abbildung 5.1 dem Viskositätsdetektor (links) und dem Differentialrefraktometer (rechts) 55

Abbildung 5.2: abbau von Xanthan (0 h, 5 h, 10 h, 15 h mit einer Intensität von 60 Watt) 56

Abbildung 5.3: Degradationszeit 56

Abbildung 5.4: Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Ca2+-Lösung (0,05 mol/L) 59

Abbildung 5.5: über auten Hyaluronats (1,5 mg/mL) mit einer Pb2+-Lösung (0,05

mol/L) 60

Abbildung 5.6: von Hyaluronat (1,0 mg/mL; 100 mL) mit dem Kation „Pb2+“ 61

Abbildung 5.7: tration 1,0 mg/mL

mit einer Zn2+-Lösung der Konzentration 0,05 mol/L 64

Abbildung 5.8: sfunktion

Ionenkonzentration 65

: Angeregter Kern ist 1H. In der Zeit τ wird die Polarisation von 1H a übertragen. In t1 entwickelt sich diese 13C-Verschiebung ohne 1H- Kopplungen. Während der Zeit δ dephasiert ein Gradient (Echo/Antiecho) die Magnetisierung. Nach einem Polarisationstransfer rephasiert der letzte Gradient (G2) τ die gew

: Exemplarische Abbildung der Leitfähigkeitsfunktion einer Titration einer reinen Salzlösung in bidestilliertes Wasser (a) und einer Salzlösung in eine

: Exemplarische Abbildung der Viskositätsfunktion

: Exemplarische Abbildung der Elutionskurve für Hyaluronat, detektiert mit

SEC-Malls für den Ultraschall

Auftragung der mittleren Molmassen der abgebauten Fraktionen gegen die

Exemplarische Abbildung für eine

Exemplarische Abbildung für eine Titration einer Lösung (100 mL) des3 h abgeb

Exemplarische Darstellung der ersten Ableitung einer Leitfähigkeitsfunktion

Exemplarische Abbildung einer Leitfähigkeitskurve für die Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung (100 mL) der Konzen

Exemplarische Darstellung der ersten Ableitung einer Leitfähigkeitvon Xanthan (1,5 mg/mL; 100 mL) in Abhängigkeit von der Zn2+-

9 Anhang

155

Abbildung 5.9: L mit einer Lösung von Cd2+-Ionen mit einer Konzentration von 0,05 mol/L 67

Abbildung 5.10 n. Es wurde eine

Hyaluronatlösung (1,5 mg/mL; 50 mL) gegeben 69

Abbildung 5.11+-Lösung (0,05 mol/L)

in eine Dextranlösung (1,5 mg/mL; 50 mL) gegeben 70

Abbildung 5.12

Lösung (0,05 molar) in eine Hyaluronatlösung (1,5 mg/mL; 50 mL) titriert 71

Abbildung 5.13 mL; 3h abgebaut) durch Titration mit einer CaCl2-Lösung (0,05

mol/L) 73

Abbildung 5.14 xtran (1,5 mg/mL) bei unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten 75

Abbildung 5.15

(CaCl2) 76

Abbildung 5.16

(CaCl2) 77

Abbildung 5.17onzentration von 0,0025 mol/L (b), 0,005 mol/L

(c) und 0,0075 mol/L (d) 78

Abbildung 5.18onzentration von 0,002 mol/L (b), 0,005 mol/L

(c) und 0,0075 mol/L (d) 79

Abbildung 5.19

Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung der Konzentration 2,5 mg/m

: Beispielabbildung für die Viskositätsmessung einer Fe3+-Titratio in 50 µL-Schritten eine Eisen(III)-Lösung (0,05 mol/L) in

: Exemplarische Abbildung für eine rotationsviskosimetrische Titration an Dextranlösung. Es wurde in 50 µL-Schritten eine Ca2

: Exemplarischer Verlauf für eine typische Viskositätsmessung des Hyaluronats (nicht abgebaut). Es wurde in 50 µL-Schritten eine Ca2+-

: Exemplarische Abbildung der Viskositätsänderung einer Xanthan-Lösung (1,5 mg/

: Abbildung einer Viskositätsmessung von De

: Abbildung einer Viskositätsmessung von Hyaluronat (1,5 mg/mL) bei unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten und Salzkonzentrationen

: Abbildung einer Viskositätsmessung von Xanthan (1,5 mg/mL) bei unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten und Salzkonzentrationen

: CD-Kurven von über 3 h abgebautem Hyaluronat (a) und von Hyaluronat- Lösungen mit einer Ca2+-K

: CD-Kurven von über 3 h abgebautem Hyaluronat (a) und von Hyaluronat- Lösungen mit einer Pb2+-K

: Vergrößerung von CD-Kurven aufgenommen im Bereich von 210 bis 280 nm von über 3 h abgebautem Xanthan und von Xanthan-Lösungen mit

9 Anhang

156

Abbildung 5.20 ung sch-Verhältnis einer 13C-NMR-Untersuchung von

Xanthan bei 60°C 82

Abbildung 5.21 ei 60°C; 0 h abgebaut und

16 mg/mL (a); 3 h abgebaut und 75 mg/mL (b) 83

Abbildung 5.22 ms einer Dextran-Lösung der Konzentration 75 mg/mL, gemessen bei 60°C 84

Abbildung 5.23 rt

-glucosamid gehören, sind durch eckige Klammern gekennzeichnet ([...]) 85

Abbildung 5.24 Mn2+-Inonen (b), 1,2 mmol/L Cu2+-Ionen (c)

und ohne Salzzusatz (a). 87

Abbildung 5.25 rums einer Dextranlösung (75 mg/mL), gemessen bei 60°C 88

Abbildung 5.26

- glucosamid gehören sind durch eckige Klammern gekennzeichnet ([...]) 89

Abbildung 5.27

e, die zum id gehören sind durch eckige Klammern

gekennzeichnet ([...]) 90

Abbildung 5.28 .

-glucosamid

gehören sind durch eckige Klammern gekennzeichnet ([...]) 90

einer Ca2+-Konzentration von 0,002 mol/L, 0,005 mol/L und 0,0075 mol/L 80 : Einfluss der Abbauzeit bzw. der Konzentration auf die spektrale Auflös und das Signal-Rau

: Einfluss der Abbauzeit bzw. der Konzentration auf die spektrale Auflösung einer 13C-NMR-Untersuchung von Hyaluronat b

: Exemplarische Abbildung eines 1H-NMR-Spektru

: Gegenüberstellung dreier 1H-NMR-Spektren von Hyaluronat in Gegenwa von 1,2 mmol/L Mn2+-Inonen (b), 1,2 mmol/L Cu2+-Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a). Die Signale, die zum N-Acetyl-D

: Gegenüberstellung dreier 1H-NMR-Spektren von Xanthan aufgezeichnet in Gegenwart von 1,2 mmol/L

: Exemplarische Abbildung eines 13C-NMR-Spekt

: Exemplarische Gegenüberstellung dreier 13C-NMR-Spektren von Hyaluronat in Gegenwart von 0,3 mmol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a). Die Signale die zum N-Acetyl-D

: Vergrößerung des Bereichs zwischen 70 und 80 ppm für 13C-NMR- Spektren von Hyaluronat in Gegenwart von 0,3 mmol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a). Die Signal N-Acetyl-D-glucosam

: Vergrößerung des Bereichs zwischen 175 und 185 ppm (linke Abb.) bzw von 20 bis 30 ppm (rechts) für 13C-NMR-Spektren von Hyaluronat in Gegenwart von 0,3 mmol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a). Die Signale, die zum N-Acetyl-D

9 Anhang

157

Abbildung 5.29ol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c)

und ohne Salzzusatz (a) 92

Abbildung 5.30l/L Mn2+- Ionen (b), 1,2

mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a) 92

Abbildung 5.31 bzw.

l/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a) 93

Abbildung 5.32 C)

-Achse) und das 13C-NMR-Spektrum eines DEPT-Experiments (Y-Achse) 94

Abbildung 6.1: ronat in wässriger Lösung nach Rechnungen von Haxaire et al. [107] 101

bbildung 6.2: Ausschnitt von Hyaluronat (Tetrasaccharideinheit) in wässriger Lösung 102

Abbildung 6.3: (Tetrasaccharideinheit) in einem unpolaren Lösemittel (z. B. DMSO). 102

bbildung 6.4: Ausschnitt von Xanthan (Trisaccharideinheit) 106

Abbildung 6.5: r durch

Leitfähigkeit κ* 113

Abbildung 6.6: ier rfen konform zu den im Rahmen dieser

Arbeit erhaltenen Ergebnisse. 117

Abbildung 6.7: itstitrationen ermittelten Abnahme der spezifischen

Leitfähigkeit κ* 119

: Exemplarische Gegenüberstellung dreier 13C-NMR-Spektren von Xanthan in Gegenwart von 0,3 mm

: Vergrößerung des Bereichs zwischen 96 und 116 ppm für 13C-NMR- Spektren von Xanthan in Gegenwart von 0,3 mmo

: Vergrößerung des Bereichs zwischen 168 und 188 ppm (linke Abb.) von 15 bis 35 ppm (rechts) für 13C-NMR-Spektren von Xanthan in Gegenwart von 0,3 mmo

: Exemplarisches 2D-Spektrum einer inversen 1H-13C-Korelation (HSQ von Hyalronat (75 mg/mL) bei 60°C. Aufgetragen sind ein 1H-NMR- Spektrum (X

Exemplarische Darstellung von Hyalu

A

Schematische Darstellung eines Hyaluronatauschnittes

A

Balkendiagramm für den Ionenradius bivalenter Kationen mit deLeitfähigkeitstitrationen ermittelten Abnahme der spezifischen

Postulierte Struktur eines oktaerischen Metall-Hyaluronatkomplexes zweTetrasaccharideinheiten. Entwo

Balkendiagramm für den Ionenradius bivalenter Kationen mit der durch Leitfähigke

9 Anhang

158

Abbildung 6.8: ng von Xanthan

(Natriumsalz) in wässriger Lösung [130]. 120

Abbildung 6.9:

arer Assoziation in wässriger Lösung vorgeschlagen von Tako et al. [130]. 124

Abbildung 6.10 ren

tion analog zu den im Rahmen dieser Arbeit rhaltenen Ergebnissen. 124

Schematische Darstellung einer möglichen Struktur der intermolekularen Wasserstoffbrückenbindu

Schematische Darstellung einer möglichen Struktur der intermolekularen Calcium(II)-Brückenbindung von Xanthan (Calciumsalz) einschließlich intramolekul

: Schematische Darstellung einer möglichen Struktur der intermolekulaBrückenbindung von Xanthan über bivalente Kationen einschließlich intramolekularer Assoziae

9 Anhang

159

nhang C - Tabellenverzeichnis

abelle 2.1: Allgemeine Zusammensetzung bakterieller EPS [11] 5

abelle 2.2: Zusammenstellung wichtiger Polysaccharide [34] 12

abelle 3.1: Verwendete Polysaccharide 43

abelle 3.2: Verwendete Chemikalien 44

abelle 3.3: Verwendete Geräte 45

abelle 3.4: Verwendete Computer-Software 46

abelle 5.1: Mittlere molare Massen der verwendeten EPS 54

abelle 5.2: Viskosität der verwendeten EPS mit einer Konzentration von 1,5 mg/mL 57

abelle 5.3: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Calcium 62

abelle 5.4: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Magnesium 62

abelle 5.5: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Mangan 62

abelle 5.6: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Kupfer 62

abelle 5.7: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Eisen(II) 62

abelle 5.8: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Zink 62

abelle 5.9: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Cadmium 63

abelle 5.10: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Blei 63

A T T T T T T T T T T T T T T T T

9 Anhang

160

Tabelle 5.11: den komplementären Kationen und der Polymeruntereinheit von Hyaluronat 63

abelle 5.12: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Calcium 66

abelle 5.13: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Magnesium 66

abelle 5.14: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Mangan 66

abelle 5.15: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Kupfer 66

abelle 5.16: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Eisen(II) 66

abelle 5.17: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Zink 66

abelle 5.18: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Cadmium 67

abelle 5.19: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Blei 67

Tabelle 5.20 hen den komplementären Kationen und der Polymeruntereinheit von Xanthan 68

Tabelle 5.21:

mg/mL) 72

Tabelle 5.22entären Kationen und der Polymeruntereinheit von Xanthan (1,5

mg/mL) 74

Tabelle 5.23: e und Glucosamid) bei 13C-NMR-Spektren angegeben in der

Einheit ppm. 95

Stöchiometrisches Verhältnis zwischen

T T T T T T T T

: Stöchiometrisches Verhältnis zwisc

Äquivalenzkonzentration und stöchiometrisches Verhältnis zwischen den komplementären Kationen und der Polymeruntereinheit von Hyaluronat (1,5

: Äquivalenzkonzentration und stöchiometrisches Verhältnis zwischen den komplem

Chemische Verschiebung der Signale für die Monomere des Hyaluronats (Glucuronsäur

Selbständigkeitserklärung Hiermit erkläre ich, die vorliegende Arbeit selbständig ohne fremde Hilfe verfasst zu haben

und nur die angegebene Literatur und Hilfsmittel verwendet zu haben.

Essen, 14. November 2006

(Guido Furth)

161

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Untersuchung der Wechselwirkungen von · Mit Hilfe der Konduktometrie werden charakteristische Struktureigenschaften wie die Stöchiometrie zwischen den Metallionen und den Untereinheiten