Zbl. Bakt. Hyg. A 258,159-172 (1984)

Untersuchungen zum Stoffwechse1 phosphatlimitierterStreptomycetenkulturenII. Mitteilung: Reinigung und Charakterisierung einer saurenPhosphatase aus Kulturfiltraten des TurimycinbildnersStreptomyces hygroscopicus

Investigations to Metabolism of Phosphate-Limited Cultures of StreptomyceshygroscopicusII. Communication: Purification and Characterization of Acid PhosphataseProduced by Streptomyces hygroscopicus

]ORG-HERMANN OZEGOWSKI und P. ]. MULLER

Akademie der Wissenschaften der DDR, Forschungsbereich Biowissenschaften undMedizin, Zentralinstitut fur Mikrobiolope und experimentelle Therapie Jena

Mit 8 Abbildungen . Emgegangen am 23. Mai 1984· Angenommen am 30. Juli 1984

Summary

Acid phosphatase was purified from culture filtrates of Streptomyces hygroscopicusstrain JA 6599-R 27/158. Method used included as first step either ammonium sulfateprecipitation or adsorption of acid phosphatase on Bentonit and the desorption of enzymefrom Bentonit with alkaline buffers, adsorption to DEAE-cellulose, column chromatogra­phy on Sephadex G 50 and isoelectric focusing in Sephadex gel. The specific activity of theresulting enzyme was 51 IlMol/min/mg at 25 DC and pH of 6.25 with p-nitrophenylphos-

Verzeichnis der im Text verwendeten Abkiirzungen

AMP Adenosin-5' -phosphatcAMP Adenosin-3:5'phosphat, zyklischADP Adenosin-5' -diphosphatATP Adenosin-5' -triphosphatEDTA EthylendiamintetraessigsaureGMP Guanosin-Y -phosphatNADP P-Nicotinamldadenindinucleotidphosphatp-NPP p-NitrophenylphosphatDNS DesoxyribonukleinsaurePi phosphatgebundener Phosphors. Phosphatase saure Phosphatasea. Phosphatase alkalische Phosphatase

160 ].-H.Ozegowski und P.].Miiller

phate as substrate. The pI detected by isoelectric focusing was at pH 7.25. The molecularweight determined by gel chromatography and by SDS electrophoresis was found to be27000.

The pH-dependence of hydrolytic activity of acid phosphatase was substrate specific. Theenzyme was found to hydrolyze essentially at pH 6.2 phosphoenolpyruvate, ATP, ADP,fructose-1,6-diphosphate and tyrosine-O-phosphate. The activity was inhibited by phos­phate, molybdate, arsenate, vanadate, pyrophosphate and tetraborate. In the culture me­dium the acid phosphatase caused the release of phosphate from solid and soluted substra­tes. Therefore the involvement of acid phosphatase in the regulation of secondary metabo­lism was discussed.

Zusammenfassung

Es wird die Reinigung einer sauren Phosphatase aus Kulturlosungen von Streptomyceshygroscopicus Stamm ]A 6599-R 27/158 beschrieben und das Enzym charakterisiert.

Die saure Phosphatase wurde aus den Kulturlosungen entweder durch Ammoniumsulfat­fallung oder Adsorption an Bentonit mit anschlieRender Desorption unter Verwendungalkalischer Puffer angereichert. Die Reinigung erfolgte mittels DEAE-Celluloseadsorption,Gelchromatografie an Sephadex G 50 und praparativer isoelektrischer Fokussierung. Dasgereinigte Enzym hat eine spezifische Aktivitat von 51 !!Mol/min/mg gegeniiber p-Nitrophe­nylphosphat als Substrat bei einer Temperatur von 25 DC und einem pH von 6,25. DasMolekulargewicht wurde mit 27000 bestimmt. Das Maximum der enzymatischen Aktivitatgegeniiber p-Nitrophenylphosphat lag bei pH 6,25, der isoelektrische Punkt bei pH 7,25.Die Anderung der hydrolytischen Aktivitat der sauren Phosphate war substratabhangig. DasEnzym katalysierte bei pH 6,2 vor allem die Hydrolyse von Phosphoenolpyruvat, ATP,ADP, Fruktose-1,6-diphosphat und Tyrosin-O-phosphat. Die Aktivitat der Phosphatasewurde durch Phosphat, Molybdat, Arsenat, Vanadat, Pyrophosphat und Tetraborat inhi­biert. Das Enzym ist an der Freisetzung von Phosphat aus festen und gelosten Nahrbodenbe­standteilen beteiligt und hat deshalb Bedeutung bei der durch Phosphat bewirkten Regula­tion des Sekundarstoffwechsels.

Einleitung

Die Biosynthese von Sekundar-Metaboliten durch Mikroorganismen wird in denmeisten Fallen durch eine zu hohe Phosphatversorgung der Produzenten negativ beein­flugt. Auch bei der in-vivo-Bildung der zu den Sekundar-Metaboliten zu rechnendenToxine durch pathogene Mikroorganismen werden Zusammenhange mit der Phos­phatkonzentration von Korperfliissigkeit diskutiert (29). In Anbetracht des relativ gra­gen Schwankungsbereichs des Plasmaphosphatspiegels im Menschen (28) erscheint einsolcher Zusammenhang moglich zu sein.

In Antibiotikafermentationen mit Streptomyceten als Produzenten wird die Produkt­bildung ebenfalls durch Phosphatmangel initiiert (8, 14,29, 30). Technische Antibioti­kafermentationen stellen damit ein leicht zugangliches und wirtschaftlich interessantesObjekt zur Untersuchung der durch Phosphat bewirkten Regulation des Sekundar­Metabolit-Stoffwechsels dar.

Die Kulturmedien der technischen Fermentationen enthalten in bezug auf dasWachstum suboptimale Phosphatanfangskonzentrationen (14,30). Urn aber die erhal­tenen Zellkonzentrationen der Produzenten zu erklaren, ist es notwendig, Phosphat­freisetzungsprozesse aus den in den komplexen Medienbestandteilen enthaltenen Phos-

Saure Phosphatase aus Streptomyces 161

phatestern in die Bilanzierung einzubeziehen. So betriigt die Anfangskonzentration desgelosten Phosphates in Turimycin-Fermentationen mit etwa 16 mgPJl weniger als 10 %der im Medium vorhandenen Gesamtphosphatkonzentration (6, 16).

Phosphatfreisetzungsprozesse wurden von Asai et al. (1) in Fermentationen des Ma­krolid-Antibiotikums Maridomycin nachgewiesen. Bei Fermentationen des chemischverwandten Turimycins (16, 17), des Aminoglycosids Streptomycin (18) und des Strep­tothricins Nourseothricin (19) werden entsprechende Prozesse diskutiert, die sowohlWachstum als auch andere iiber Phosphat regulierte Stoffwechselleistungen, wie Phos­phatase-, Nuklease- und Proteasebildung beeinflussen. So konnte gezeigt werden, daBeine bestimmte, nicht zu hohe, externe Phosphatzufiihrung die Nourseothricinbildungin spiiteren Phasen der Fermentation nach der durch Phosphatlimitation bewirktenInitiation der Sekundiirmetabolitsynthese positiv beeinfluBt (unveroffentlichte Ergeb­nisse). Andererseits kann durch zu hohe Phosphatfreisetzungsraten wahrend der Fer­mentation die Phosphatlimitation aufgehoben werden. Die mit ihr verbundenen Stoff­wechselleistungen werden dann negativ beeinfluBt. Liegt bei den anderen Substratenkein Mangel vor, konnen weitere Wachstumsphasen (Diauxie) auftreten (16, 17).

Der in Turimycin-Fermentationen sowie in anderen technischen Fermentationen oftals Stickstoffquelle eingesetzte Sojaextraktionsschrot enthalt etwa 8 mg PJg, Kartoffel­starke etwa 0,8 mg PJg und Maisquellwasser (Trockenmasse) 30-35 mg P/g, wovonder weitaus grogte Teil bei der Sterilisation der Medien nicht gelost wird. Der hydroly­tische Aufschlug der als Partikeln vorliegenden oder gelosten phosphathaltigen kom­plexen Substrate mug durch Proteasen, Amylasen und Nukleasen erfolgen. Die eigent­liche Phosphatfreisetzung sollte dabei von Phosphohydrolasen, insbesondere Phospha­tasen, katalysiert werden. Diese Enzyme werden haufig durch Phosphat inhibiert undin ihrer Synthese reprimiert (9).

In der vorliegenden Arbeit wird die in Turimycin-Fermentationen nachgewiesenesaure Phosphatase charakterisiert und die Funktion dieses Enzyms bei der Phosphat­freisetzung aus den komplexen Substraten untersucht. Es war auch zu priifen, ob diebereits beschriebene alkalische Phosphatase aus Kulturfiltraten von Streptomyces hy­groscopicus (22) ebenfalls an der Phosphatfreisetzung beteiligt ist.

Material und Methoden

Stamm: Streptomyces hygroscopicus JA 6599-R 27-158 (11).Fermentation: Der Streptomyces hygroscopicus wurde entsprechend Muller et al. (17) im

200-I-Fermenrer geziichtet.Substrate und Substanzen: p-Nitrophenylphosphat, Dinatriumsalz (zur Labordiagno­

stik), VEB Arzneimittelwerk Dresden. Von der Fa. Serva, Heidelberg wurden folgendeSubstrate verwendet: Phosphoenolpyruvat, Na-Salz, krist., reinst; DL-Glycerin-l-phosphat,Na2-Salz, rein, 98 %ig; a-D-Glucose-1-phosphat-Na2-Salz, krist., p.A.; a-D-Glucose-6­phosphat-NaTSalz; p.A.; D-Fructose-1-phosphat'2CHA-Salz, reinst, max. 88 %; D-Fruc­tose-6-phosphat· Na2-Salz, rein; D-Fructose-1,6-diphosphat· NarSalz, reinst, krist.; Adeno­sin-3'5-phosphat, zyklisch, reinst; Adenosin-5' -triphosphat· NarSalz, krist., reinst; Ade­nosin-5' -diphosphat· NarSalz, reinst., Adenosin-5'-phosphat· Na2-Salz, reinst; ~-Nico­tinamidadenindinucleotidphosphat-Na-Salz, p.A.; Cocarboxylase (Thiaminpyrophosphat­chlorid) reinst; L-Glycerin-3-phosphat· NaTSalz, p.A.; DNS aus Lachssperma, O-Phospho­L-serin, O-Phospho-DL-threonin. Na-aktivierter Bentonit (ca. 70 % Montmorillonit).

Tyrosin-O-phosphat wurde entsprechend Mitchell et al. (15) dargestellt. Ampholyte, LKBBromma.

162 J.-H.Ozegowski und P.J.Mulier

Protease aus Streptomyces hygroscopicus wurde entspreehend Ozegowski et al. (24)dargestellt. Streptodornase wurde von Herrn Dr. D. Gerlach (ZIMET, Jena) zur Yerfiigunggestellt.

Gewinnung und Reinigung der sauren Phosphatase: Naeh einer Fermentationszeit von120 Std. wurde von der Kulturlosung die Hauptmenge des Myzels und der festen Nahrme­dienbestandteile dureh Zentrifugation entfernt und der Oberstand dureh Absaugen uberHyflosupereel (Ferak) von Myzelresten befreit. Zur Anreieherung der sauren Phosphatasewurde das Enzym entweder aus dem Kulturfiltrat dureh 80 %ige Ammoniumsulfatsattigungprazipitiert oder direkt aus dem Kulturfiltrat dureh Adsorption an Bentonit gewonnen. Zurvollstandigen Adsorprion der Phosphatase wurden 15 g Bentonit/l Kulturfiltratlosung einge­ruhrt. Die Desorption der Phosphatase vom Bentonit erfolgte dureh Elution mit 0,1 M Tris­HCI-Puffer pH 9,0 der 20 % Athylenglykol enthielt. Urn aus dem Eluat das Enzym mitAmmoniumsulfat ausfallen zu konnen, muRte die Elutionslosung zur Entfernung des Athy­lenglykols gegen dest. Wasser dialysiert werden. AnschlieBend wurde die e1uierte Phospha­tase mit 80 % Ammoniumsulfat gefallt. Das Prazipitat wurde dureh Zentrifugation abge­trennt, in wenig Wasser gelost und uber Naeht bei 4°C gegen 0,1 M Tris-HCI-Puffer pH7,2 dialysiert. Die erhaltene stark gefarbte Rohenzymlosung wurde mit entspreehend aquili­brierter DEAE-Cellulose (Reanal, Budapest) im bateh-Yerfahren extrahiert, urn die starkgefarbten Bestandteile zu entfernen. Fur 5 I Rohenzymlosung wurden etwa 100 g DEAE­Cellulose benotigt. Nach der Extraktion wurde die Enzymlosung gegen dest. Wasser dialy­siert und Iyophilisiert. Das lyophil getrocknete Rohenzym wurde dureh isoelektrisehe Fo­kussierung analysiert und der Gehalt an Fremdaktivitaten (Protease, DNase, Amylase) gete­stet. Zur weiteren Reinigung der sauren Phosphatase wurden etwa 100 mg Rohenzym in2 ml Wasser gelost und auf eine Sephadex GSa Saule (2,5 x 90 em) aufgetragen. AisElutionspuffer diente ein 0,1 M Tris-HCI-Puffer, pH 7,2, der 0,5 M NaCl enthielt. DiePhosphatase-haltigen Proteinfraktionen wurden gesammelt, vereinigt und mit Ammonium­sulfat gefallt. Das ausfallende Prazipitat wurde durch Zentrifugation abgetrennt, in wenigWasser gelost und tiber eine Sephadex G25-Saule (2,5 x 30 em) entsalzt. Die Phosphataseenthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und 2 % Ampholyt, pH 3-10, sowie 0,8 % Se­phadex G 100 zugesetzt, in ein Gelbett gegossen und bei 580 Y fur 14 Std. unter Wasserkuh-

~"-JI I \ I~:l:

0.61 / \ [~a.:g

O.5j I \ 15:

0,4j§X

0,3 300

0,2 200

0,1 100

00 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 Fraktion

Abb. 1. Gelchromatografie von saurer Phosphatase aus Streptomyces hygroscopicus anSephadex (;50. Aufgetragen wurden 2 ml Rohenzymlosung, die 50 mg Rohenzym/ml ent­hielt. Ais Elutionspuffer diente ein 0,1 M Tris-HCI-Puffer pH 7,2, in dem 0,5 M NaCI gelostwaren. E = !J.Mollmin.

Saure Phosphatase aus Streptomyces 163

'0

Abb. 2. SDS-Elektrophorese von saurer Phosphatase aus Streptomyces hygroscopicus in10 %igem Polyacrylamidgel. Aufgetragen wurden reduzierte und alkylierte Phosphatasepro­ben (0,5 mg/ml). Von links nach rechts wurden aufgetragen: Molekulargewichtsstandard,saure Phosphatase 10 !!l, 20 I-ll, 30 !!l, 40 I-ll und Molekulargewichtsstandard. Der Moleku­largewichtsstandard enthielt Rinderserumalbumin, Eieralbumin, Myoglobin und Cyto­chrom C.

lung fokussiert. Danach wurde die Phosphatasebande identifiziert, ausgeschnitten, die Phos­phatase yom Sephadex eluiert und aus der Lasung mit 80 % Ammoniumsulfat ausgefallt.Von der gereinigtenPhosphatase wurde die spezifische Aktivitat bestimmt, das Enzymdurch isoelektrische Fokussierung und Natriumdodecylsulfatelektrophorese charakterisiertsowie seine Temperatur- und pH-Stabilitat, die Substratspezifiat und der EinflulS von Inhibi­toren auf die Aktivitat untersucht.

Aktivitiitsbestimmungen

Saure Phosphatase: Als Substratlasung diente ein 0,5 M Acetatpuffer pH 6,25, der200 mg p-NPP/lOO ml (5 X 10-3 M) enthielt. Zur Bestimmung wurde 1 ml Substratlasungmit 0,1 ml entsprechend verdi.innter Enzymlasung versetzt und 30 Min. bei 25 DC inkubiert.Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 ml 10 %iger Trichloressigsaure gestopptund nach 5 Min. 1 milO %ige Natronlauge zugesetzt und die Extinktion bei 405 nm in 1 cmKi.ivetten vermessen. Mit einem Extinktionskoeffizienten des gebildeten p-Nitrophenols von18,5 cm2/1-l Mol wurde die Aktivitat (I-lMol/min) der Hydrolyse von p-NPP berechnet.

Alkalische Phosphatase: Die Aktivitiit der alkalischen Phosphatase wurde wie bei Oze­gowski u. Miiller (22) heschrieben bestimmt.

164 ].-H.Ozegowski und P.J.Miiller

Proteinase: Die proteolytische Aktivitat wurde caseinolytisch nach der Methode vonKunitz (12) ermittelt.

Desoxyribonuklease und amylolytische Aktivitiit: Die Desoxyribonuklease- und amyloly­tische Aktivitat wurde durch Radialdifussion entsprechend der Methode von Schill u. Schu­macher (25) bestimmt.

Proteinbestimmung: Der Proteingehalt wurde entsprechend der Methode von Lowry etal. (13) festgestellt. Ais Eichprotein diente Rinderserumalbumin.

Isoelektrische Fokussierung und Natriumdodecylsulfat (SDS)-elektrophorese in Poly­acrylamidgel: Beide Methoden wurden in der von Gerlach u. Kohler (5) beschriebenenWeise ausgefiihrt.

Ergebnisse

In 120stiindigen Turimycinfermentationen von Streptomyces hygroscopicus konn­ten in den Kulturiiberstanden Aktivitaten von saurer Phosphatase bei pH 6,2 von0,8-3 [.IMollmin/ml nachgewiesen werden.

Zur Gewinnung der sauren Phosphatase wurden die vom Myzel befreiten Kulturlo­sungen einerseits direkt mit Ammoniumsulfat zu 80 % gesattigt, andererseits konntedie saure Phosphatase an Bentonit (Montmorillonit) adsorbiert werden, und von die­sem bei alkalischen Bedingungen und in Gegenwart von 20 % Athylenglykol wiederumeluiert werden, wobei aber nur 40-50 % der urspriinglichen Aktivitat wiedergewonnenwerden konnten.

Die gewonnene Rohphosphataselosung war stark gefarbt. Die stark farbenden Be­standteile konnten mittels DEAE-Celluloseextraktion abgetrennt werden. Die erhalte­ne, schwach gefarbte Losung enthielt neben der sauren Phosphatase noch eine Reiheweiterer Proteine, erkennbar daran, daB bei isoelektrischer Auftrennung neben derPhosphatasebande noch 10-12 weitere Proteinbanden auftraten. In der Rohphospha­taselosung wurde neben Protease-, Amylase-, Desoxyribonuklease auch in geringenMengen alkalische Phosphataseaktivitat gefunden.

Zur weiteren Reinigung der sauren Phosphatase wurde die Rohenzymlosung Iyophi­lisiert. Von diesem Rohprodukt wurden 100 mg in 2 ml Wasser gelost und zur Tren­nung auf eine Sephadex GsO-Saule aufgetragen. Dabei konnten drei Proteinpeaks er-

4 pH5678

1 ••• _~~ _

9

- ---.--.

Abb. 3. Isoelektrische Fokussierung von saurer Phosphatase aus Streptomyces hygroscopi­cus in Polyacrylamidgel. Von links nach rechts wurden jeweils 10 [.II Probelosung, die 0,2,0,5, 1; 1,5,2 und nochmals 0,2 mg/ml enthielten, aufgetragen (pH-Gradient 4,0-9,0).

Saure Phosphatase aus Streptomyces 165

halten werden, wobei die Hauptaktivitat an saurer Phosphatase im mittleren Protein­gipfe1 lokalisiert war (Abb. 1). In den Fraktionen des zuerst e1uierten Proteinpeakswurde Protease, Amylase, Desoxyribonuklease und alkalische Phosphatase nachgewie­sen, wogegen im letzten Proteinpeak nur Proteaseaktivitat aufzufinden war. Die nachdiesem Reinigungsschritt erhaltene Phosphatase1asung enthielt bei isoe1ektrischer Auf­trennung neben der Phosphatasebande noch drei weitere Proteinbanden. Diese wurdendurch praparative isoe1ektrische Fokussierung von der sauren Phosphatase abgetrennt,so daB nach diesem letzten Reinigungsschritt eine saure Phosphatase erhalten wurde,die sowohl in der isoe1ektrische'n Fokussierung wie auch in der SDS-Elektrophorese nureine Proteinbande ergab. Fiir diese gereinigte saure Phosphatase wurde eine spezifischeAktivitat gegeniiber p-NPP bei 25°C und pH 6,25 von 51 f-lMollmin/mg bestimmt.Durch Ge1chromatographie an Sephadex G50 und durch SDS-Elektrophorese wurdeein Molekulargewicht von 27000 ermitte1t (Abb. 2). Der isoe1ektrische Punkt lag beipH 7,25 (Abb. 3). Dnter neutralen pH-Bedingungen (Tris-HCl-Puffer pH 7,0) war diePhosphatase bis etwa 45°C stabil, hahere Temperaturen fiihrten zu einer zunehmen­den Inaktivierung (Abb. 4).

~-«100 ~ 0 0 '"

80

60

40

20

30 40 50 60 70 80 Tlo( I

Abb. 4. Temperaturstabilitat von saurer Phosphatase aus Streptomyces hygroscopicus. DieProben wurden ftir 30 Min. in einem 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 7,0 auf die angegebenenTemperaturen erhitzt, anschlie/Send abgektihlt und die Aktivitat bei 25°C und pH 6,25bestimmt. A: relative Aktivitat.

Fiir die pH-Stabilitat wurde ein sehr schmaler pH-Bereich von pH 5,5 bis 7,5 gefun­den, in dem iiber einen Zeitraum von 24 Std. keine Inaktivierung des Enzyms nach­weisbar war (Abb. 5). Mit p-NPP als Substrat wurde ein Aktivitatsmaximum bei pH6,25 (Abb. 6) bestimmt. Mit der gereinigten sauren Phosphatase wie auch mit demlyophil getrocknetem Rohenzym wurde die Phosphatfreisetzung aus dem Kulturme­dium sowie Nahrbodenbestandteilen untersucht.

Als Phosphoesterhydrolasen dienten sowohl die saure wie auch die alkalische Phos­phatase aus Streptomyces hygroscopicus. Diese Enzyme wurden sowohl allein als auchin Verbindung mit anderen Hydrolasen wie Protease aus Streptomyces hygroscopicus,Streptodornase aus Streptococcus equisimilis und Amylase aus Bacillus subtilis einge­setzt. Das Phosphatase-haltige Rohenzym enthie1t proteolytische, amylolytische undnukleolytische Aktivitat. Ais Substrat diente das bei pH 6,8 autoklavierte Submersme­dium sowie eine Suspension von 1°g Sojaextraktionsschrot in einem Liter 0,02 MTris-HCl-Puffer (pH 6,8), die ebenfalls autoklaviert worden war.

166 ].-H.Ozegowski und P.]. Miiller

~':<

100

80

60

40

20

12 11 10 4 1 pH

Abb. 5. pH-Stabilitiit von saurer Phosphatase aus Streptomyces hygroscopicus. Die Probenwurden in 0,01 M Puffern unterschiedlicher pH-Werte bei 4°C 24 Stunden inkubiert. DieAktivitiit der sauren Phosphatase wurde in 0,5 M Acetatpuffer pH 6,25 bei 25°C gemessen.A: relative Aktivitiit.

~...100j

80l60

40

20

~...1001 .,....-;

IIIIII

6,2 6It pH

o I •4 pH

Abb. 6. EinfluB des pH-Wertes auf die Aktivitat von saurer Phosphatase. Die Aktivitatwurde im pH-Bereich von pH 3-7 in 0,5 M Acetat, im pH-Bereich von 7-8 in 0,5 M Tris­HCI-Puffer gemessen. A: relative Aktivitiit.

Die Kinetik der Phosphatfreisetzung aus dem Kulturmedium im neutralen pH-Be­reich ist in Abb. 7 wiedergegeben. Sie zeigt, daiS weder die gereinigte saure noch diealkalische Phosphatase allein in der Lage waren, Phosphat aus dem Kulturmediumfreizusetzen. Erst bei Anwesenheit anderer hydrolytischer Aktivitaten kam es mit dersauren Phosphatase zu einer Phosphatfreisetzung, wogegen die alkalische Phosphataseunter diesen Bedingungen kein Phosphat freisetzte. Das Rohenzym, das die durch­schnittliche Zusammensetzung des Kulturfiltrates bei Fermentationsende nach etwa120 stiindiger Fermentation widerspiegelt, setzte ebenfalls Phosphat aus dem Kultur­medium frei. Wurde statt des kompletten Kulturmediums nur Sojaextraktionsschrotals Substrat eingesetzt, konnte bei Rohenzymzusatz gleichfalls eine Phosphatfreiset­zung beobachtet werden, deren Rate jedoch auch bei weiterem Zusatz von saurerPhosphatase nicht erhoht werden konnte.

Saure Phosphatase aus Streptomyces 167

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40

~-------------30 J

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10

Inkubationszeif [hI4o1-1~~~~-~~~~-~~~--------

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.--.6--6.6.--.6.

Abb. 7. Untersuchungen zur P,-Freisetzung aus Medium durch Phosphatasen aus Streptomy­ces hygroscopicus. 10 ml Medium wurden jeweils mit den folgenden Hydrolasen versetztund die Pj-Konzentrationen wiihrend der lnkubation gemessen.T--T Rohenzym (50 mg) mit folgenden Aktivitiiten/mg: (s. Phosphatase 0,5 I-tMoll

min, a. Phosphatase 1 I-tMollmin, Desoxyribonuklease 20 E, Protease 0,2 E,a-Amylase 18 Esaure Phosphatase (0,5 mg)alkalische Phosphatase (I mg)saure Phosphatase (0,5 mg) + Protease (1) (1 mg) + a-Amylase (2) (1 mg) +Desoxyribonuklease (3) (2400 E)alkalische Phosphatase (1 mg) + Protease (1) (1 mg) + a-Amylase (2) (1 mg)+ Desoxyribonuklease (3) (2400 E)Probe ohne Enzym(1) Protease aus Streptomyces hygroscopicus (spez. Akt. 0,8 E/mg)(2) a-Amylase aus Bacillus subtilis (spez. Akt. 1800 E/mg)(3) Desoxyribonuklease aus Streptococcus equisimilis

Yp/VP.

m.1,0

0,5

o j •6 U 7 ~

Abb. 8. Abhiingigkeit der substratspezifischen Phosphatfreisetzungsrate von p-NPP undGlucose-6-phosphat vom pH-Wert. Die Phosphatfreisetzungsrate von Glucose-6-phosphatbei pH 6,0 wurde gegeniiber p-NPP gleich 100 % gesetzt.Vp-PhosphatfreisetzungsrateVPm-maximale Phosphatfreisetzungsrate aus Glucose-6-phosphate-. p-NPP 0--0 Glucose-6-phosphat

168 ].-H.Ozegowski und P.].Mulier

Die Substratspezifitiit der sauren Phosphatase wurde im Bereich physiologischer pH­Werte bei pH 6,2 (Aktivitiitsmaximum gegeniiber p-NPP) und bei pH 7,2 untersucht(Tab. 1).

Die saure Phosphatase spaltet neben dem synthetischen Substrat p-NPP vor aHemPEP, ATP, ADP, Fructose-l,6-diphosphat und Tyrosin-O-phosphat. Mit der Veriinde­rung des pH-Wertes iindert sich auch die Reihenfolge der Hydrolysegeschwindigkeitender verschiedenen Substrate (Tab. 1). Dieses Verhalten ist auf die unterschiedlicheAbhiingigkeit der Hydrolyserate der einzelnen Substrate yom pH-Wert zuriickzufiih­ren, wie es fUr p-NPP und Glucose-6-phosphat gezeigt werden konnte (Abb. 8).

Von den untersuchten Inhibitoren zeigten vor aHem Vanadat, Molybdat, Pyrophos­phat, Arsenat und Tetraborat stark inhibierende Wirkungen, wogegen Komplexbildnerkeinen EinfluR ausiibten (Tab. 2).

Tabelle 1. Bestimmung der Substratspezifitiit von saurer Phosphatase aus StreptomyceshygroscopicusDie Substratspezifitiit wurde bei 25°C und den pH-Werten pH 7,2 und pH 6,2 bestimmt.Bei beiden pH-Werten diente Tyrosin-O-phosphat als Vergleich. Die Substratkonzentrationim Test betrug 5 mM, die Enzymaktivitiit 5 ~Mol!min. Nach 60 Min. Inkubation wurde1 mll0%ige Trichloressigsiiure zugesetzt und nach Chen et al. (2) die Phosphatkonzentra­tion bestimmt. Die gemessenen Werte wurden fur jedes Substrat mit einer Vergleichsprobeohne Enzym korrigiert. Ansatz: 1 ml gepufferte Substratlosung + 0.1 ml Enzym oderWasser.

Substrat relative Aktivitiit (%)pH 7,2 (0,5 M Tris) pH 6,2 (0,5 M Acetat)

p-NitrophenylphosphatTyrosin-O-phosphatNADPc-AMPGlucose-6-phosphatFructose-I-phosphatFructose-6-phosphatFructose-l,6-diphosphatO-Phospho-D,L-threoninO-Phospho-L-serinATPADPAMPGlucose-I-phosphatThiaminpyrophosphat3-PhosphoglycerinGMPDNSPhosphoenolpyruvat

85100

152

20423340

24

12452

2103230

8

30

89100

o

83

67112

122124

78

130

Diskussion

Die saure Phosphatase aus Streptomyces hygroscopicus liegt wie die alkalische Phos­phatase (22) extrazelluliir in den Kulturlosungen vor. Ihre Aktivitat wird durch Verbin­dungen inhibiert wie sie auch fiir andere Phosphatasen beschrieben werden (4). Daweder EDTA noch andere Komplexbildner einen inhibierenden EinfluR ausiiben,

Saure Phosphatase aus Streptomyces 169

Tabelle 2. EinflufS von Inhibitoren auf die Aktivitat von saurer Phosphatase aus Streptomy­ces hygroscopicus1m Testsystem wurden 0,1 ml Enzymlosung mit einer Aktivitat von 10 f-tMol/min mit 1 ml0,5 M Acetatpuffer pH 6,2, der 10 mM p-NPP und Inhibitor in einer Testkonzentration von5 mM enthielt, gemischt und eine Stunde bei 25°C inkubiert. Danach wurde die Reaktiondurch Zusatz von 1 ml 10%ige Trichloressigsaure gestoppt, anschliefSend 1 ml 10%igeNaOH zugesetzt und die Extinktion bei 405 nm vermessen.

Inhibitor

ohne InhibitorEDTANH4 vanadatNH4 molybdatKH2P04

Na4P20,ZnS04NaFNaN]Na-fluoracetat0-PhenanthrolinCaCl1

Na2HP04Na2B407Na-citratNaHAs04MgS04

relative Aktivitat (%)

10091

4o

34117870739597

1043612

100I

90

scheint es sich bei diesem Enzym nicht urn ein Metallenzym zu handeln. 1m Gegensatzzu den sauren Phosphatasen anderer Mikroorganismen mit Molekulargewichten imBereich von 100000 bis 360000 (21, 26) besitzt die yom Streptomyces hygroscopicusgebildete saure Phosphatase ein vergleichsweise niedriges Molekulargewicht von27000. Die Moglichkeit, daIS es sich bei der vorliegenden sehr niedermolekularensauren Phosphatase urn das aktive Bruchstiick eines grolSeren Molekiils handelt, konn­te nicht bestatigt werden, da auch bei schonender Behandlung mit SDS-Probepuffer(vierundzwanzigstiindige Dialyse mit und ohne Merkaptoathanolzusatz) wie auch inder Gelchromatografie stets das gleiche Molekulargewicht von 27000 gefunden wur­de. Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigten, daB bei pH-Werten zwischen pH 6,2und pH 7,2 die Phosphohydrolaseaktivitat der Kulturfiltrate gegeniiber p-NPP vorwie­gend auf die saure Phosphatase und nicht auf die alkalische Phosphatase, pH-Aktivi­tatsmaximum pH 9,2 (22) zuriickzufiihren ist. Die Phosphatfreisetzung aus festen undgelosten komplexen organischen Phosphatquellen im neutralen pH-Bereich ist nur aufdie Aktivitat dieser sauren Phosphatase zuriickzufiihren. Sie ist jedoch nicht durch diesaure Phosphatase aUein, sondern nur in Verbindung mit proteolytischer, amylolyti­scher und nukleolytischer Aktivitat moglich. Damit konnte gezeigt werden, daB diesaure Phosphatase zwar den letzten Schritt der Phosphatfreisetzung, die Phosphatester­hydrolyse, bewirkt, die Phosphatfreisetzung jedoch ein ProzelS ist, bei dem verschiede­ne Hydrolasen zusammenwirken. Die Phosphatfreisetzungsrate hangt notwendigerwei­se nicht nur von der Hydrolasenzusammensetzung, sondern auch von der Partikelgro-

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Be, dem Quellungsgrad des Substrates, dem pH-Wert und anderen EinfluBgroBen aboDadurch kann nicht einem definierten Enzym eine ratenbestimmende Funktion eindeu­tig zugeordnet werden. Durch Inhibition der sauren Phosphatase mittels spezifischerInhibitoren kann jedoch die Phosphatfreisetzungsrate stark reduziert werden (20).

Die beschriebene saure Phosphatase wird bei Streptomyces hygroscopicus bei Phos­phatmangel exkretiert (17), urn fur das Wachstum notwendiges Phosphat aus den inMediumbestandteilen vorliegenden Phosphatestern, wie z. B. Nukleinsiiuren, Zucker­phosphaten, Phospholipiden und Inosithexaphosphaten, zu erschlieBen. In diesem Zu­sammenhang ist auch die relativ geringe Substratspezifitiit der sauren Phosphatase imVergleich zur alkalischen Phsophatase (22) verstiindlich. Wie die Substratuntersuchun­gen bei verschiedenen pH-Werten zeigten, ist die Aktivitiitsiinderung substratspezi­fisch. Bei Anniiherung des pH-Wertes an das Aktivitiitsmaximum gegenuber p-NPP(pH 6,25) steigt die Phosphatfreisetzung aus dem Niihrmedium an (20) und deutetdamit auf eine allgemeine AktivitiitserhOhung mit sinkendem pH-Wert hin, die erstdurch die zunehmende Inaktivierung der Phosphatase mit abnehmenden pH-Wertenbegrenzt wird. Wie schon fur die alkalische Phosphatase aus Streptomyces hygroscopi­cus gefunden wurde (22), besitzt auch die saure Phosphatase eine hohe hydrolytischeAktivitiit gegenuber Tyrosin-O-phosphat. Dieses Ergebnis unterstutzt die von Swarupet al. (27) sowie von Chernoff u. Li (3) beschriebene Beobachtung, daB p-NPP-phos­phohydrolasen gleichzeitig eine hohe Tyrosin-O-phosphat-spaltende Aktivitiit besit­zen. Diese Eigenschaft ist sehr wahrscheinhch auf den aromatischen Charakter beiderVerbindungen zuruckzufuhren.

Die saure Phosphatase ist sicherlich auch am naturlichen Standort des Streptomyce­ten, im Boden, an der Phosphatfreisetzung beteiligt. Sehr wahrscheinlich liegt sie anTonmineral-Partikeln adsorbiert vor (7), die wie die Adsorptionsexperimente mit Ben­tonit zeigen, eine groBe Adsorptionsaffinitiit fur die saure Phosphatase besitzen. Dasvon Streptomyces hygroscopicus JA 6599 gebildete Macrolid-Antibiotikum Turimycinwird iihnlich anderen Antibiotika (31) gleichfalls durch Bentonit adsorbiert (unverOf­fentlichtes Ergebnis). Die stabilen Antibiotika-Enzym-Tonmineral-Adsorbate stellendann im Boden ein durch das Antibiotikum vor anderen Mikroorganismen geschutztesDepot phosphohydrolytischer Aktivitiit dar. Diese Depot konnte die Phosphatversor­gung auskeimender Streptomycetensporen absichern (23), die selbst keine extrazellulii­ren Hydrolaseaktivitiiten besitzen (10).

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Dr. Jorg-Hermann Ozegowski, Zentralinstitut fur Mikrobiologie und experimentelleTherapie, Beutenbergstr. 11, DDR-6900 Jena