Zbl. Bakt. Hyg. A 258,159-172 (1984)
Untersuchungen zum Stoffwechse1 phosphatlimitierterStreptomycetenkulturenII. Mitteilung: Reinigung und Charakterisierung einer saurenPhosphatase aus Kulturfiltraten des TurimycinbildnersStreptomyces hygroscopicus
Investigations to Metabolism of Phosphate-Limited Cultures of StreptomyceshygroscopicusII. Communication: Purification and Characterization of Acid PhosphataseProduced by Streptomyces hygroscopicus
]ORG-HERMANN OZEGOWSKI und P. ]. MULLER
Akademie der Wissenschaften der DDR, Forschungsbereich Biowissenschaften undMedizin, Zentralinstitut fur Mikrobiolope und experimentelle Therapie Jena
Mit 8 Abbildungen . Emgegangen am 23. Mai 1984· Angenommen am 30. Juli 1984
Summary
Acid phosphatase was purified from culture filtrates of Streptomyces hygroscopicusstrain JA 6599-R 27/158. Method used included as first step either ammonium sulfateprecipitation or adsorption of acid phosphatase on Bentonit and the desorption of enzymefrom Bentonit with alkaline buffers, adsorption to DEAE-cellulose, column chromatography on Sephadex G 50 and isoelectric focusing in Sephadex gel. The specific activity of theresulting enzyme was 51 IlMol/min/mg at 25 DC and pH of 6.25 with p-nitrophenylphos-
Verzeichnis der im Text verwendeten Abkiirzungen
AMP Adenosin-5' -phosphatcAMP Adenosin-3:5'phosphat, zyklischADP Adenosin-5' -diphosphatATP Adenosin-5' -triphosphatEDTA EthylendiamintetraessigsaureGMP Guanosin-Y -phosphatNADP P-Nicotinamldadenindinucleotidphosphatp-NPP p-NitrophenylphosphatDNS DesoxyribonukleinsaurePi phosphatgebundener Phosphors. Phosphatase saure Phosphatasea. Phosphatase alkalische Phosphatase
160 ].-H.Ozegowski und P.].Miiller
phate as substrate. The pI detected by isoelectric focusing was at pH 7.25. The molecularweight determined by gel chromatography and by SDS electrophoresis was found to be27000.
The pH-dependence of hydrolytic activity of acid phosphatase was substrate specific. Theenzyme was found to hydrolyze essentially at pH 6.2 phosphoenolpyruvate, ATP, ADP,fructose-1,6-diphosphate and tyrosine-O-phosphate. The activity was inhibited by phosphate, molybdate, arsenate, vanadate, pyrophosphate and tetraborate. In the culture medium the acid phosphatase caused the release of phosphate from solid and soluted substrates. Therefore the involvement of acid phosphatase in the regulation of secondary metabolism was discussed.
Zusammenfassung
Es wird die Reinigung einer sauren Phosphatase aus Kulturlosungen von Streptomyceshygroscopicus Stamm ]A 6599-R 27/158 beschrieben und das Enzym charakterisiert.
Die saure Phosphatase wurde aus den Kulturlosungen entweder durch Ammoniumsulfatfallung oder Adsorption an Bentonit mit anschlieRender Desorption unter Verwendungalkalischer Puffer angereichert. Die Reinigung erfolgte mittels DEAE-Celluloseadsorption,Gelchromatografie an Sephadex G 50 und praparativer isoelektrischer Fokussierung. Dasgereinigte Enzym hat eine spezifische Aktivitat von 51 !!Mol/min/mg gegeniiber p-Nitrophenylphosphat als Substrat bei einer Temperatur von 25 DC und einem pH von 6,25. DasMolekulargewicht wurde mit 27000 bestimmt. Das Maximum der enzymatischen Aktivitatgegeniiber p-Nitrophenylphosphat lag bei pH 6,25, der isoelektrische Punkt bei pH 7,25.Die Anderung der hydrolytischen Aktivitat der sauren Phosphate war substratabhangig. DasEnzym katalysierte bei pH 6,2 vor allem die Hydrolyse von Phosphoenolpyruvat, ATP,ADP, Fruktose-1,6-diphosphat und Tyrosin-O-phosphat. Die Aktivitat der Phosphatasewurde durch Phosphat, Molybdat, Arsenat, Vanadat, Pyrophosphat und Tetraborat inhibiert. Das Enzym ist an der Freisetzung von Phosphat aus festen und gelosten Nahrbodenbestandteilen beteiligt und hat deshalb Bedeutung bei der durch Phosphat bewirkten Regulation des Sekundarstoffwechsels.
Einleitung
Die Biosynthese von Sekundar-Metaboliten durch Mikroorganismen wird in denmeisten Fallen durch eine zu hohe Phosphatversorgung der Produzenten negativ beeinflugt. Auch bei der in-vivo-Bildung der zu den Sekundar-Metaboliten zu rechnendenToxine durch pathogene Mikroorganismen werden Zusammenhange mit der Phosphatkonzentration von Korperfliissigkeit diskutiert (29). In Anbetracht des relativ gragen Schwankungsbereichs des Plasmaphosphatspiegels im Menschen (28) erscheint einsolcher Zusammenhang moglich zu sein.
In Antibiotikafermentationen mit Streptomyceten als Produzenten wird die Produktbildung ebenfalls durch Phosphatmangel initiiert (8, 14,29, 30). Technische Antibiotikafermentationen stellen damit ein leicht zugangliches und wirtschaftlich interessantesObjekt zur Untersuchung der durch Phosphat bewirkten Regulation des SekundarMetabolit-Stoffwechsels dar.
Die Kulturmedien der technischen Fermentationen enthalten in bezug auf dasWachstum suboptimale Phosphatanfangskonzentrationen (14,30). Urn aber die erhaltenen Zellkonzentrationen der Produzenten zu erklaren, ist es notwendig, Phosphatfreisetzungsprozesse aus den in den komplexen Medienbestandteilen enthaltenen Phos-
Saure Phosphatase aus Streptomyces 161
phatestern in die Bilanzierung einzubeziehen. So betriigt die Anfangskonzentration desgelosten Phosphates in Turimycin-Fermentationen mit etwa 16 mgPJl weniger als 10 %der im Medium vorhandenen Gesamtphosphatkonzentration (6, 16).
Phosphatfreisetzungsprozesse wurden von Asai et al. (1) in Fermentationen des Makrolid-Antibiotikums Maridomycin nachgewiesen. Bei Fermentationen des chemischverwandten Turimycins (16, 17), des Aminoglycosids Streptomycin (18) und des Streptothricins Nourseothricin (19) werden entsprechende Prozesse diskutiert, die sowohlWachstum als auch andere iiber Phosphat regulierte Stoffwechselleistungen, wie Phosphatase-, Nuklease- und Proteasebildung beeinflussen. So konnte gezeigt werden, daBeine bestimmte, nicht zu hohe, externe Phosphatzufiihrung die Nourseothricinbildungin spiiteren Phasen der Fermentation nach der durch Phosphatlimitation bewirktenInitiation der Sekundiirmetabolitsynthese positiv beeinfluBt (unveroffentlichte Ergebnisse). Andererseits kann durch zu hohe Phosphatfreisetzungsraten wahrend der Fermentation die Phosphatlimitation aufgehoben werden. Die mit ihr verbundenen Stoffwechselleistungen werden dann negativ beeinfluBt. Liegt bei den anderen Substratenkein Mangel vor, konnen weitere Wachstumsphasen (Diauxie) auftreten (16, 17).
Der in Turimycin-Fermentationen sowie in anderen technischen Fermentationen oftals Stickstoffquelle eingesetzte Sojaextraktionsschrot enthalt etwa 8 mg PJg, Kartoffelstarke etwa 0,8 mg PJg und Maisquellwasser (Trockenmasse) 30-35 mg P/g, wovonder weitaus grogte Teil bei der Sterilisation der Medien nicht gelost wird. Der hydrolytische Aufschlug der als Partikeln vorliegenden oder gelosten phosphathaltigen komplexen Substrate mug durch Proteasen, Amylasen und Nukleasen erfolgen. Die eigentliche Phosphatfreisetzung sollte dabei von Phosphohydrolasen, insbesondere Phosphatasen, katalysiert werden. Diese Enzyme werden haufig durch Phosphat inhibiert undin ihrer Synthese reprimiert (9).
In der vorliegenden Arbeit wird die in Turimycin-Fermentationen nachgewiesenesaure Phosphatase charakterisiert und die Funktion dieses Enzyms bei der Phosphatfreisetzung aus den komplexen Substraten untersucht. Es war auch zu priifen, ob diebereits beschriebene alkalische Phosphatase aus Kulturfiltraten von Streptomyces hygroscopicus (22) ebenfalls an der Phosphatfreisetzung beteiligt ist.
Material und Methoden
Stamm: Streptomyces hygroscopicus JA 6599-R 27-158 (11).Fermentation: Der Streptomyces hygroscopicus wurde entsprechend Muller et al. (17) im
200-I-Fermenrer geziichtet.Substrate und Substanzen: p-Nitrophenylphosphat, Dinatriumsalz (zur Labordiagno
stik), VEB Arzneimittelwerk Dresden. Von der Fa. Serva, Heidelberg wurden folgendeSubstrate verwendet: Phosphoenolpyruvat, Na-Salz, krist., reinst; DL-Glycerin-l-phosphat,Na2-Salz, rein, 98 %ig; a-D-Glucose-1-phosphat-Na2-Salz, krist., p.A.; a-D-Glucose-6phosphat-NaTSalz; p.A.; D-Fructose-1-phosphat'2CHA-Salz, reinst, max. 88 %; D-Fructose-6-phosphat· Na2-Salz, rein; D-Fructose-1,6-diphosphat· NarSalz, reinst, krist.; Adenosin-3'5-phosphat, zyklisch, reinst; Adenosin-5' -triphosphat· NarSalz, krist., reinst; Adenosin-5' -diphosphat· NarSalz, reinst., Adenosin-5'-phosphat· Na2-Salz, reinst; ~-Nicotinamidadenindinucleotidphosphat-Na-Salz, p.A.; Cocarboxylase (Thiaminpyrophosphatchlorid) reinst; L-Glycerin-3-phosphat· NaTSalz, p.A.; DNS aus Lachssperma, O-PhosphoL-serin, O-Phospho-DL-threonin. Na-aktivierter Bentonit (ca. 70 % Montmorillonit).
Tyrosin-O-phosphat wurde entsprechend Mitchell et al. (15) dargestellt. Ampholyte, LKBBromma.
162 J.-H.Ozegowski und P.J.Mulier
Protease aus Streptomyces hygroscopicus wurde entspreehend Ozegowski et al. (24)dargestellt. Streptodornase wurde von Herrn Dr. D. Gerlach (ZIMET, Jena) zur Yerfiigunggestellt.
Gewinnung und Reinigung der sauren Phosphatase: Naeh einer Fermentationszeit von120 Std. wurde von der Kulturlosung die Hauptmenge des Myzels und der festen Nahrmedienbestandteile dureh Zentrifugation entfernt und der Oberstand dureh Absaugen uberHyflosupereel (Ferak) von Myzelresten befreit. Zur Anreieherung der sauren Phosphatasewurde das Enzym entweder aus dem Kulturfiltrat dureh 80 %ige Ammoniumsulfatsattigungprazipitiert oder direkt aus dem Kulturfiltrat dureh Adsorption an Bentonit gewonnen. Zurvollstandigen Adsorprion der Phosphatase wurden 15 g Bentonit/l Kulturfiltratlosung eingeruhrt. Die Desorption der Phosphatase vom Bentonit erfolgte dureh Elution mit 0,1 M TrisHCI-Puffer pH 9,0 der 20 % Athylenglykol enthielt. Urn aus dem Eluat das Enzym mitAmmoniumsulfat ausfallen zu konnen, muRte die Elutionslosung zur Entfernung des Athylenglykols gegen dest. Wasser dialysiert werden. AnschlieBend wurde die e1uierte Phosphatase mit 80 % Ammoniumsulfat gefallt. Das Prazipitat wurde dureh Zentrifugation abgetrennt, in wenig Wasser gelost und uber Naeht bei 4°C gegen 0,1 M Tris-HCI-Puffer pH7,2 dialysiert. Die erhaltene stark gefarbte Rohenzymlosung wurde mit entspreehend aquilibrierter DEAE-Cellulose (Reanal, Budapest) im bateh-Yerfahren extrahiert, urn die starkgefarbten Bestandteile zu entfernen. Fur 5 I Rohenzymlosung wurden etwa 100 g DEAECellulose benotigt. Nach der Extraktion wurde die Enzymlosung gegen dest. Wasser dialysiert und Iyophilisiert. Das lyophil getrocknete Rohenzym wurde dureh isoelektrisehe Fokussierung analysiert und der Gehalt an Fremdaktivitaten (Protease, DNase, Amylase) getestet. Zur weiteren Reinigung der sauren Phosphatase wurden etwa 100 mg Rohenzym in2 ml Wasser gelost und auf eine Sephadex GSa Saule (2,5 x 90 em) aufgetragen. AisElutionspuffer diente ein 0,1 M Tris-HCI-Puffer, pH 7,2, der 0,5 M NaCl enthielt. DiePhosphatase-haltigen Proteinfraktionen wurden gesammelt, vereinigt und mit Ammoniumsulfat gefallt. Das ausfallende Prazipitat wurde durch Zentrifugation abgetrennt, in wenigWasser gelost und tiber eine Sephadex G25-Saule (2,5 x 30 em) entsalzt. Die Phosphataseenthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und 2 % Ampholyt, pH 3-10, sowie 0,8 % Sephadex G 100 zugesetzt, in ein Gelbett gegossen und bei 580 Y fur 14 Std. unter Wasserkuh-
~"-JI I \ I~:l:
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00 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 Fraktion
Abb. 1. Gelchromatografie von saurer Phosphatase aus Streptomyces hygroscopicus anSephadex (;50. Aufgetragen wurden 2 ml Rohenzymlosung, die 50 mg Rohenzym/ml enthielt. Ais Elutionspuffer diente ein 0,1 M Tris-HCI-Puffer pH 7,2, in dem 0,5 M NaCI gelostwaren. E = !J.Mollmin.
Saure Phosphatase aus Streptomyces 163
'0
Abb. 2. SDS-Elektrophorese von saurer Phosphatase aus Streptomyces hygroscopicus in10 %igem Polyacrylamidgel. Aufgetragen wurden reduzierte und alkylierte Phosphataseproben (0,5 mg/ml). Von links nach rechts wurden aufgetragen: Molekulargewichtsstandard,saure Phosphatase 10 !!l, 20 I-ll, 30 !!l, 40 I-ll und Molekulargewichtsstandard. Der Molekulargewichtsstandard enthielt Rinderserumalbumin, Eieralbumin, Myoglobin und Cytochrom C.
lung fokussiert. Danach wurde die Phosphatasebande identifiziert, ausgeschnitten, die Phosphatase yom Sephadex eluiert und aus der Lasung mit 80 % Ammoniumsulfat ausgefallt.Von der gereinigtenPhosphatase wurde die spezifische Aktivitat bestimmt, das Enzymdurch isoelektrische Fokussierung und Natriumdodecylsulfatelektrophorese charakterisiertsowie seine Temperatur- und pH-Stabilitat, die Substratspezifiat und der EinflulS von Inhibitoren auf die Aktivitat untersucht.
Aktivitiitsbestimmungen
Saure Phosphatase: Als Substratlasung diente ein 0,5 M Acetatpuffer pH 6,25, der200 mg p-NPP/lOO ml (5 X 10-3 M) enthielt. Zur Bestimmung wurde 1 ml Substratlasungmit 0,1 ml entsprechend verdi.innter Enzymlasung versetzt und 30 Min. bei 25 DC inkubiert.Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 ml 10 %iger Trichloressigsaure gestopptund nach 5 Min. 1 milO %ige Natronlauge zugesetzt und die Extinktion bei 405 nm in 1 cmKi.ivetten vermessen. Mit einem Extinktionskoeffizienten des gebildeten p-Nitrophenols von18,5 cm2/1-l Mol wurde die Aktivitat (I-lMol/min) der Hydrolyse von p-NPP berechnet.
Alkalische Phosphatase: Die Aktivitiit der alkalischen Phosphatase wurde wie bei Ozegowski u. Miiller (22) heschrieben bestimmt.
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Proteinase: Die proteolytische Aktivitat wurde caseinolytisch nach der Methode vonKunitz (12) ermittelt.
Desoxyribonuklease und amylolytische Aktivitiit: Die Desoxyribonuklease- und amylolytische Aktivitat wurde durch Radialdifussion entsprechend der Methode von Schill u. Schumacher (25) bestimmt.
Proteinbestimmung: Der Proteingehalt wurde entsprechend der Methode von Lowry etal. (13) festgestellt. Ais Eichprotein diente Rinderserumalbumin.
Isoelektrische Fokussierung und Natriumdodecylsulfat (SDS)-elektrophorese in Polyacrylamidgel: Beide Methoden wurden in der von Gerlach u. Kohler (5) beschriebenenWeise ausgefiihrt.
Ergebnisse
In 120stiindigen Turimycinfermentationen von Streptomyces hygroscopicus konnten in den Kulturiiberstanden Aktivitaten von saurer Phosphatase bei pH 6,2 von0,8-3 [.IMollmin/ml nachgewiesen werden.
Zur Gewinnung der sauren Phosphatase wurden die vom Myzel befreiten Kulturlosungen einerseits direkt mit Ammoniumsulfat zu 80 % gesattigt, andererseits konntedie saure Phosphatase an Bentonit (Montmorillonit) adsorbiert werden, und von diesem bei alkalischen Bedingungen und in Gegenwart von 20 % Athylenglykol wiederumeluiert werden, wobei aber nur 40-50 % der urspriinglichen Aktivitat wiedergewonnenwerden konnten.
Die gewonnene Rohphosphataselosung war stark gefarbt. Die stark farbenden Bestandteile konnten mittels DEAE-Celluloseextraktion abgetrennt werden. Die erhaltene, schwach gefarbte Losung enthielt neben der sauren Phosphatase noch eine Reiheweiterer Proteine, erkennbar daran, daB bei isoelektrischer Auftrennung neben derPhosphatasebande noch 10-12 weitere Proteinbanden auftraten. In der Rohphosphataselosung wurde neben Protease-, Amylase-, Desoxyribonuklease auch in geringenMengen alkalische Phosphataseaktivitat gefunden.
Zur weiteren Reinigung der sauren Phosphatase wurde die Rohenzymlosung Iyophilisiert. Von diesem Rohprodukt wurden 100 mg in 2 ml Wasser gelost und zur Trennung auf eine Sephadex GsO-Saule aufgetragen. Dabei konnten drei Proteinpeaks er-
4 pH5678
1 ••• _~~ _
9
- ---.--.
Abb. 3. Isoelektrische Fokussierung von saurer Phosphatase aus Streptomyces hygroscopicus in Polyacrylamidgel. Von links nach rechts wurden jeweils 10 [.II Probelosung, die 0,2,0,5, 1; 1,5,2 und nochmals 0,2 mg/ml enthielten, aufgetragen (pH-Gradient 4,0-9,0).
Saure Phosphatase aus Streptomyces 165
halten werden, wobei die Hauptaktivitat an saurer Phosphatase im mittleren Proteingipfe1 lokalisiert war (Abb. 1). In den Fraktionen des zuerst e1uierten Proteinpeakswurde Protease, Amylase, Desoxyribonuklease und alkalische Phosphatase nachgewiesen, wogegen im letzten Proteinpeak nur Proteaseaktivitat aufzufinden war. Die nachdiesem Reinigungsschritt erhaltene Phosphatase1asung enthielt bei isoe1ektrischer Auftrennung neben der Phosphatasebande noch drei weitere Proteinbanden. Diese wurdendurch praparative isoe1ektrische Fokussierung von der sauren Phosphatase abgetrennt,so daB nach diesem letzten Reinigungsschritt eine saure Phosphatase erhalten wurde,die sowohl in der isoe1ektrische'n Fokussierung wie auch in der SDS-Elektrophorese nureine Proteinbande ergab. Fiir diese gereinigte saure Phosphatase wurde eine spezifischeAktivitat gegeniiber p-NPP bei 25°C und pH 6,25 von 51 f-lMollmin/mg bestimmt.Durch Ge1chromatographie an Sephadex G50 und durch SDS-Elektrophorese wurdeein Molekulargewicht von 27000 ermitte1t (Abb. 2). Der isoe1ektrische Punkt lag beipH 7,25 (Abb. 3). Dnter neutralen pH-Bedingungen (Tris-HCl-Puffer pH 7,0) war diePhosphatase bis etwa 45°C stabil, hahere Temperaturen fiihrten zu einer zunehmenden Inaktivierung (Abb. 4).
~-«100 ~ 0 0 '"
80
60
40
20
30 40 50 60 70 80 Tlo( I
Abb. 4. Temperaturstabilitat von saurer Phosphatase aus Streptomyces hygroscopicus. DieProben wurden ftir 30 Min. in einem 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 7,0 auf die angegebenenTemperaturen erhitzt, anschlie/Send abgektihlt und die Aktivitat bei 25°C und pH 6,25bestimmt. A: relative Aktivitat.
Fiir die pH-Stabilitat wurde ein sehr schmaler pH-Bereich von pH 5,5 bis 7,5 gefunden, in dem iiber einen Zeitraum von 24 Std. keine Inaktivierung des Enzyms nachweisbar war (Abb. 5). Mit p-NPP als Substrat wurde ein Aktivitatsmaximum bei pH6,25 (Abb. 6) bestimmt. Mit der gereinigten sauren Phosphatase wie auch mit demlyophil getrocknetem Rohenzym wurde die Phosphatfreisetzung aus dem Kulturmedium sowie Nahrbodenbestandteilen untersucht.
Als Phosphoesterhydrolasen dienten sowohl die saure wie auch die alkalische Phosphatase aus Streptomyces hygroscopicus. Diese Enzyme wurden sowohl allein als auchin Verbindung mit anderen Hydrolasen wie Protease aus Streptomyces hygroscopicus,Streptodornase aus Streptococcus equisimilis und Amylase aus Bacillus subtilis eingesetzt. Das Phosphatase-haltige Rohenzym enthie1t proteolytische, amylolytische undnukleolytische Aktivitat. Ais Substrat diente das bei pH 6,8 autoklavierte Submersmedium sowie eine Suspension von 1°g Sojaextraktionsschrot in einem Liter 0,02 MTris-HCl-Puffer (pH 6,8), die ebenfalls autoklaviert worden war.
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~':<
100
80
60
40
20
12 11 10 4 1 pH
Abb. 5. pH-Stabilitiit von saurer Phosphatase aus Streptomyces hygroscopicus. Die Probenwurden in 0,01 M Puffern unterschiedlicher pH-Werte bei 4°C 24 Stunden inkubiert. DieAktivitiit der sauren Phosphatase wurde in 0,5 M Acetatpuffer pH 6,25 bei 25°C gemessen.A: relative Aktivitiit.
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20
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IIIIII
6,2 6It pH
o I •4 pH
Abb. 6. EinfluB des pH-Wertes auf die Aktivitat von saurer Phosphatase. Die Aktivitatwurde im pH-Bereich von pH 3-7 in 0,5 M Acetat, im pH-Bereich von 7-8 in 0,5 M TrisHCI-Puffer gemessen. A: relative Aktivitiit.
Die Kinetik der Phosphatfreisetzung aus dem Kulturmedium im neutralen pH-Bereich ist in Abb. 7 wiedergegeben. Sie zeigt, daiS weder die gereinigte saure noch diealkalische Phosphatase allein in der Lage waren, Phosphat aus dem Kulturmediumfreizusetzen. Erst bei Anwesenheit anderer hydrolytischer Aktivitaten kam es mit dersauren Phosphatase zu einer Phosphatfreisetzung, wogegen die alkalische Phosphataseunter diesen Bedingungen kein Phosphat freisetzte. Das Rohenzym, das die durchschnittliche Zusammensetzung des Kulturfiltrates bei Fermentationsende nach etwa120 stiindiger Fermentation widerspiegelt, setzte ebenfalls Phosphat aus dem Kulturmedium frei. Wurde statt des kompletten Kulturmediums nur Sojaextraktionsschrotals Substrat eingesetzt, konnte bei Rohenzymzusatz gleichfalls eine Phosphatfreisetzung beobachtet werden, deren Rate jedoch auch bei weiterem Zusatz von saurerPhosphatase nicht erhoht werden konnte.
Saure Phosphatase aus Streptomyces 167
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40
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Abb. 7. Untersuchungen zur P,-Freisetzung aus Medium durch Phosphatasen aus Streptomyces hygroscopicus. 10 ml Medium wurden jeweils mit den folgenden Hydrolasen versetztund die Pj-Konzentrationen wiihrend der lnkubation gemessen.T--T Rohenzym (50 mg) mit folgenden Aktivitiiten/mg: (s. Phosphatase 0,5 I-tMoll
min, a. Phosphatase 1 I-tMollmin, Desoxyribonuklease 20 E, Protease 0,2 E,a-Amylase 18 Esaure Phosphatase (0,5 mg)alkalische Phosphatase (I mg)saure Phosphatase (0,5 mg) + Protease (1) (1 mg) + a-Amylase (2) (1 mg) +Desoxyribonuklease (3) (2400 E)alkalische Phosphatase (1 mg) + Protease (1) (1 mg) + a-Amylase (2) (1 mg)+ Desoxyribonuklease (3) (2400 E)Probe ohne Enzym(1) Protease aus Streptomyces hygroscopicus (spez. Akt. 0,8 E/mg)(2) a-Amylase aus Bacillus subtilis (spez. Akt. 1800 E/mg)(3) Desoxyribonuklease aus Streptococcus equisimilis
Yp/VP.
m.1,0
0,5
o j •6 U 7 ~
Abb. 8. Abhiingigkeit der substratspezifischen Phosphatfreisetzungsrate von p-NPP undGlucose-6-phosphat vom pH-Wert. Die Phosphatfreisetzungsrate von Glucose-6-phosphatbei pH 6,0 wurde gegeniiber p-NPP gleich 100 % gesetzt.Vp-PhosphatfreisetzungsrateVPm-maximale Phosphatfreisetzungsrate aus Glucose-6-phosphate-. p-NPP 0--0 Glucose-6-phosphat
168 ].-H.Ozegowski und P.].Mulier
Die Substratspezifitiit der sauren Phosphatase wurde im Bereich physiologischer pHWerte bei pH 6,2 (Aktivitiitsmaximum gegeniiber p-NPP) und bei pH 7,2 untersucht(Tab. 1).
Die saure Phosphatase spaltet neben dem synthetischen Substrat p-NPP vor aHemPEP, ATP, ADP, Fructose-l,6-diphosphat und Tyrosin-O-phosphat. Mit der Veriinderung des pH-Wertes iindert sich auch die Reihenfolge der Hydrolysegeschwindigkeitender verschiedenen Substrate (Tab. 1). Dieses Verhalten ist auf die unterschiedlicheAbhiingigkeit der Hydrolyserate der einzelnen Substrate yom pH-Wert zuriickzufiihren, wie es fUr p-NPP und Glucose-6-phosphat gezeigt werden konnte (Abb. 8).
Von den untersuchten Inhibitoren zeigten vor aHem Vanadat, Molybdat, Pyrophosphat, Arsenat und Tetraborat stark inhibierende Wirkungen, wogegen Komplexbildnerkeinen EinfluR ausiibten (Tab. 2).
Tabelle 1. Bestimmung der Substratspezifitiit von saurer Phosphatase aus StreptomyceshygroscopicusDie Substratspezifitiit wurde bei 25°C und den pH-Werten pH 7,2 und pH 6,2 bestimmt.Bei beiden pH-Werten diente Tyrosin-O-phosphat als Vergleich. Die Substratkonzentrationim Test betrug 5 mM, die Enzymaktivitiit 5 ~Mol!min. Nach 60 Min. Inkubation wurde1 mll0%ige Trichloressigsiiure zugesetzt und nach Chen et al. (2) die Phosphatkonzentration bestimmt. Die gemessenen Werte wurden fur jedes Substrat mit einer Vergleichsprobeohne Enzym korrigiert. Ansatz: 1 ml gepufferte Substratlosung + 0.1 ml Enzym oderWasser.
Substrat relative Aktivitiit (%)pH 7,2 (0,5 M Tris) pH 6,2 (0,5 M Acetat)
p-NitrophenylphosphatTyrosin-O-phosphatNADPc-AMPGlucose-6-phosphatFructose-I-phosphatFructose-6-phosphatFructose-l,6-diphosphatO-Phospho-D,L-threoninO-Phospho-L-serinATPADPAMPGlucose-I-phosphatThiaminpyrophosphat3-PhosphoglycerinGMPDNSPhosphoenolpyruvat
85100
152
20423340
24
12452
2103230
8
30
89100
o
83
67112
122124
78
130
Diskussion
Die saure Phosphatase aus Streptomyces hygroscopicus liegt wie die alkalische Phosphatase (22) extrazelluliir in den Kulturlosungen vor. Ihre Aktivitat wird durch Verbindungen inhibiert wie sie auch fiir andere Phosphatasen beschrieben werden (4). Daweder EDTA noch andere Komplexbildner einen inhibierenden EinfluR ausiiben,
Saure Phosphatase aus Streptomyces 169
Tabelle 2. EinflufS von Inhibitoren auf die Aktivitat von saurer Phosphatase aus Streptomyces hygroscopicus1m Testsystem wurden 0,1 ml Enzymlosung mit einer Aktivitat von 10 f-tMol/min mit 1 ml0,5 M Acetatpuffer pH 6,2, der 10 mM p-NPP und Inhibitor in einer Testkonzentration von5 mM enthielt, gemischt und eine Stunde bei 25°C inkubiert. Danach wurde die Reaktiondurch Zusatz von 1 ml 10%ige Trichloressigsaure gestoppt, anschliefSend 1 ml 10%igeNaOH zugesetzt und die Extinktion bei 405 nm vermessen.
Inhibitor
ohne InhibitorEDTANH4 vanadatNH4 molybdatKH2P04
Na4P20,ZnS04NaFNaN]Na-fluoracetat0-PhenanthrolinCaCl1
Na2HP04Na2B407Na-citratNaHAs04MgS04
relative Aktivitat (%)
10091
4o
34117870739597
1043612
100I
90
scheint es sich bei diesem Enzym nicht urn ein Metallenzym zu handeln. 1m Gegensatzzu den sauren Phosphatasen anderer Mikroorganismen mit Molekulargewichten imBereich von 100000 bis 360000 (21, 26) besitzt die yom Streptomyces hygroscopicusgebildete saure Phosphatase ein vergleichsweise niedriges Molekulargewicht von27000. Die Moglichkeit, daIS es sich bei der vorliegenden sehr niedermolekularensauren Phosphatase urn das aktive Bruchstiick eines grolSeren Molekiils handelt, konnte nicht bestatigt werden, da auch bei schonender Behandlung mit SDS-Probepuffer(vierundzwanzigstiindige Dialyse mit und ohne Merkaptoathanolzusatz) wie auch inder Gelchromatografie stets das gleiche Molekulargewicht von 27000 gefunden wurde. Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigten, daB bei pH-Werten zwischen pH 6,2und pH 7,2 die Phosphohydrolaseaktivitat der Kulturfiltrate gegeniiber p-NPP vorwiegend auf die saure Phosphatase und nicht auf die alkalische Phosphatase, pH-Aktivitatsmaximum pH 9,2 (22) zuriickzufiihren ist. Die Phosphatfreisetzung aus festen undgelosten komplexen organischen Phosphatquellen im neutralen pH-Bereich ist nur aufdie Aktivitat dieser sauren Phosphatase zuriickzufiihren. Sie ist jedoch nicht durch diesaure Phosphatase aUein, sondern nur in Verbindung mit proteolytischer, amylolytischer und nukleolytischer Aktivitat moglich. Damit konnte gezeigt werden, daB diesaure Phosphatase zwar den letzten Schritt der Phosphatfreisetzung, die Phosphatesterhydrolyse, bewirkt, die Phosphatfreisetzung jedoch ein ProzelS ist, bei dem verschiedene Hydrolasen zusammenwirken. Die Phosphatfreisetzungsrate hangt notwendigerweise nicht nur von der Hydrolasenzusammensetzung, sondern auch von der Partikelgro-
170 ]. H. Ozegowski und P.]. Muller
Be, dem Quellungsgrad des Substrates, dem pH-Wert und anderen EinfluBgroBen aboDadurch kann nicht einem definierten Enzym eine ratenbestimmende Funktion eindeutig zugeordnet werden. Durch Inhibition der sauren Phosphatase mittels spezifischerInhibitoren kann jedoch die Phosphatfreisetzungsrate stark reduziert werden (20).
Die beschriebene saure Phosphatase wird bei Streptomyces hygroscopicus bei Phosphatmangel exkretiert (17), urn fur das Wachstum notwendiges Phosphat aus den inMediumbestandteilen vorliegenden Phosphatestern, wie z. B. Nukleinsiiuren, Zuckerphosphaten, Phospholipiden und Inosithexaphosphaten, zu erschlieBen. In diesem Zusammenhang ist auch die relativ geringe Substratspezifitiit der sauren Phosphatase imVergleich zur alkalischen Phsophatase (22) verstiindlich. Wie die Substratuntersuchungen bei verschiedenen pH-Werten zeigten, ist die Aktivitiitsiinderung substratspezifisch. Bei Anniiherung des pH-Wertes an das Aktivitiitsmaximum gegenuber p-NPP(pH 6,25) steigt die Phosphatfreisetzung aus dem Niihrmedium an (20) und deutetdamit auf eine allgemeine AktivitiitserhOhung mit sinkendem pH-Wert hin, die erstdurch die zunehmende Inaktivierung der Phosphatase mit abnehmenden pH-Wertenbegrenzt wird. Wie schon fur die alkalische Phosphatase aus Streptomyces hygroscopicus gefunden wurde (22), besitzt auch die saure Phosphatase eine hohe hydrolytischeAktivitiit gegenuber Tyrosin-O-phosphat. Dieses Ergebnis unterstutzt die von Swarupet al. (27) sowie von Chernoff u. Li (3) beschriebene Beobachtung, daB p-NPP-phosphohydrolasen gleichzeitig eine hohe Tyrosin-O-phosphat-spaltende Aktivitiit besitzen. Diese Eigenschaft ist sehr wahrscheinhch auf den aromatischen Charakter beiderVerbindungen zuruckzufuhren.
Die saure Phosphatase ist sicherlich auch am naturlichen Standort des Streptomyceten, im Boden, an der Phosphatfreisetzung beteiligt. Sehr wahrscheinlich liegt sie anTonmineral-Partikeln adsorbiert vor (7), die wie die Adsorptionsexperimente mit Bentonit zeigen, eine groBe Adsorptionsaffinitiit fur die saure Phosphatase besitzen. Dasvon Streptomyces hygroscopicus JA 6599 gebildete Macrolid-Antibiotikum Turimycinwird iihnlich anderen Antibiotika (31) gleichfalls durch Bentonit adsorbiert (unverOffentlichtes Ergebnis). Die stabilen Antibiotika-Enzym-Tonmineral-Adsorbate stellendann im Boden ein durch das Antibiotikum vor anderen Mikroorganismen geschutztesDepot phosphohydrolytischer Aktivitiit dar. Diese Depot konnte die Phosphatversorgung auskeimender Streptomycetensporen absichern (23), die selbst keine extrazelluliiren Hydrolaseaktivitiiten besitzen (10).
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Dr. Jorg-Hermann Ozegowski, Zentralinstitut fur Mikrobiologie und experimentelleTherapie, Beutenbergstr. 11, DDR-6900 Jena