Untersuchungen zur Rolle von Alb3 und Alb4 bei der ... · 3.7.23 Thylakoidmembran-Bindungstest mit Peptidinhibierung.....59 3.7.24 Expressionsnachweis ... 0II, PsbW, PsaK TD TD Alb3

Untersuchungen zur Rolle von Alb3 und Alb4 bei der Biogenese der Thylakoidmembran

in Arabidopsis thaliana

Dissertation zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie und Biotechnologie

an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften

der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt in der

AG Molekularbiologie pflanzlicher Organellen

vorgelegt von

Thomas Bals aus

Unna

Bochum

Oktober, 2009

Erstgutachterin: Frau Prof. Dr. Danja Schünemann

Zweitgutachter: Herr Prof. Dr. Matthias Rögner

Analyses of Alb3 and Alb4 in thylakoid membrane biogenesis

in Arabidopsis thaliana

Dissertation to obtain the degree

Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.)

at the Faculty of Biology and Biotechnology

Ruhr-University Bochum

International Graduate School of Biosciences Ruhr-University Bochum

Molecular Biology of Plant Organelles

submitted by

Thomas Bals

from

Unna

Bochum

October, 2009

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung...................................................................................................... 1

1.1 Funktion und evolutionärer Ursprung der Chloroplasten.................................1 1.2 Proteintransport kernkodierter Proteine über die chloroplastidären

Hüllmembranen...............................................................................................1 1.3 Proteintransport zu den Thylakoiden ..............................................................2 1.3.1 Proteinimport in das Thylakoidlumen ..............................................................3 1.3.1.1 Der cpSec-Weg...............................................................................................4 1.3.1.2 Der cpTat-Weg................................................................................................4 1.3.2 Proteinintegration in die Thylakoidmembran...................................................5 1.3.2.1 Spontane Insertion ..........................................................................................5 1.3.2.2 Der cpSRP-Weg..............................................................................................5 1.4 Proteininteraktionen der Komponenten des posttranslationalen cpSRP-

Transportwegs ................................................................................................8 1.5 Die Oxa1/YidC/Alb3-Proteinfamilie ...............................................................10 1.5.1 Oxa1..............................................................................................................11 1.5.2 Yid C .............................................................................................................13 1.5.3 Alb3 ...............................................................................................................14

2. Zielsetzung ................................................................................................. 17

3. Material und Methoden .............................................................................. 18

3.1 Chemikalien ..................................................................................................18 3.2 Verbrauchsmaterial .......................................................................................19 3.3 Geräte ...........................................................................................................20 3.4 Biologisches Material ....................................................................................21 3.4.1 Enzyme .........................................................................................................21 3.4.2 Antikörper......................................................................................................21 3.4.3 Verwendete Plasmide ...................................................................................22 3.4.4 Erstellte Plasmide und verwendete Oligonukleotide .....................................23 3.4.5 Mikroorganismen...........................................................................................29 3.4.5.1 Escherichia coli .............................................................................................29 3.4.5.2 Saccharomyces cerevisiae ...........................................................................29 3.4.6 Pflanzenmaterial ...........................................................................................29 3.5 Anzuchtbedingungen ....................................................................................30 3.5.1 Anzucht und Lagerung von Escherichia coli .................................................30 3.5.2 Anzucht und Lagerung von Saccharomyces cerevisiae................................30 3.5.3 Pflanzenanzucht............................................................................................31 3.6 Molekularbiologische Methoden....................................................................31 3.6.1 Polymerase-Kettenreaktion zur Amplifizierung von DNA-Fragmenten .........31 3.6.2 Site-directed Mutagenese PCR.....................................................................32 3.6.3 Overlap PCR .................................................................................................33 3.6.4 DNA-Restriktion ............................................................................................34 3.6.5 Ligation..........................................................................................................35 3.6.6 Herstellung CaCl2-kompetenter Escherichia coli-Zellen................................35 3.6.7 Transformation von Plasmiden in CaCl2-kompetente Escherichia coli-

Zellen ............................................................................................................35 3.6.8 In-Fusion Klonierung .....................................................................................36 3.6.9 Plasmid-Präparation......................................................................................36 3.6.10 DNA-Konzentrationsbestimmung..................................................................37

Inhaltsverzeichnis II

3.6.11 Restriktionsanalyse und Sequenzierung.......................................................37 3.6.12 Agarosegelelektrophorese zur Trennung von DNA.......................................37 3.6.13 Split-Ubiquitin System ...................................................................................38 3.6.13.1 Transformation von Saccharomyces cerevisiae mit Plasmid-DNA ...............39 3.6.13.2 β-Galaktosidase Filtertest .............................................................................39 3.6.14 Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (Split-YFP System) ..................40 3.6.14.1 Isolierung von Arabidopsis thaliana Protoplasten und transiente

Transfektion ..................................................................................................41 3.7 Biochemische Methoden...............................................................................42 3.7.1 Überexpression von Proteinen in Escherichia coli ........................................42 3.7.2 Denaturierende Aufreinigung von Proteinen mit His-tag über Ni-NTA..........42 3.7.3 Native Aufreinigung von Proteinen mit His-tag über Ni-NTA.........................43 3.7.4 Aufreinigung von Proteinen mit GST-tag über Glutathion-Sepharose ..........44 3.7.5 Abspaltung des GST-tags über Thrombinverdau..........................................45 3.7.6 Dialyse von Proteinen ...................................................................................45 3.7.7 BCA-Proteinbestimmung...............................................................................45 3.7.8 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)...................................45 3.7.9 Coomassie-Färbung......................................................................................47 3.7.10 Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf

Nitrocellulosemembranen (Western-Blot) .....................................................47 3.7.11 Proteinfärbung mit Ponceau S ......................................................................47 3.7.12 Immundetektion von Proteinen .....................................................................48 3.7.13 Affinitätsaufreinigung von Antikörpern ..........................................................49 3.7.14 In vitro Transkription......................................................................................50 3.7.15 In vitro Translation.........................................................................................50 3.7.16 In vitro Expression mit RTS 100 Wheat Germ ..............................................51 3.7.17 Pull down Experiment ...................................................................................51 3.7.18 Peptide-Scanning ..........................................................................................52 3.7.18.1 Bindung des rekombinanten Proteins an die PepSpot-Membran .................52 3.7.18.2 Elektrophoretischer Transfer eines rekombinanten Proteins von der

PepSpot-Membran auf eine PVDF-Membran ...............................................53 3.7.18.3 Regeneration der PepSpot-Membran ...........................................................54 3.7.19 Präparation von Thylakoidmembranen aus Arabidopsis thaliana .................55 3.7.19.1 Chlorophyllbestimmung.................................................................................56 3.7.19.2 Salzwaschung der Thylakoidmembranen .....................................................56 3.7.19.3 Solubilisierung der Thylakoidmembranen .....................................................56 3.7.20 Crosslinking der Thylakoidmembranproteine von Arabidopsis thaliana........57 3.7.21 Coimmunpräzipitation ...................................................................................57 3.7.21.1 Kopplung des Antikörpers an Protein-A-Sepharose beads...........................57 3.7.21.2 Präzipitation ..................................................................................................58 3.7.22 Thylakoidmembran-Bindungstest..................................................................58 3.7.23 Thylakoidmembran-Bindungstest mit Peptidinhibierung ...............................59 3.7.24 Expressionsnachweis der YFP-Fusionsproteine in Arabidopsis thaliana

Protoplasten ..................................................................................................59 3.7.25 Trichloressigsäure-Präzipitation....................................................................60 3.8 Biophysikalische Methoden...........................................................................60 3.8.1 Massenspektrometrie....................................................................................60 3.8.2 Gelfiltration ....................................................................................................61 3.8.2.1 Eichung der Gelfiltrationssäule .....................................................................61 3.8.2.2 Gelfiltration der solubilisierten Thylakoidmembranproteine...........................62

Inhaltsverzeichnis III

4. Ergebnisse.................................................................................................. 63

4.1 Herstellung spezifischer Antikörper gegen Alb3 und Alb4 ............................63 4.1.1 Expression der Antigene GST-nAlb3, GST-cAlb3 und cAlb4-his ..................64 4.1.2 Test der Antikörper α-Alb3 und α-Alb4 gegen die Antigene..........................65 4.1.3 Test der Antikörper α-Alb3 und α-Alb4 gegen die in vitro translatierten

Volllängenproteine ........................................................................................67 4.1.4 Test der Antikörper α-Alb3 und α-Alb4 mit Thylakoidmembran-proteinen ....68 4.2 Analyse der Interaktionen von Alb3 und Alb4 mit den Proteinen des

cpSRP-Transportwegs ..................................................................................69 4.2.1 Interaktionen von Alb3 und Alb4 mit den Proteinen des cpSRP-

Transportwegs im Hefe Split-Ubiquitin System.............................................69 4.2.2 Proteininteraktionen von Alb3 und Alb4 mit den Proteinen des cpSRP-

Transportwegs im Split-YFP System ............................................................71 4.2.3 Analyse der Binderegion zwischen Alb3 und cpSRP43 über das Split-

YFP System ..................................................................................................76 4.2.4 Peptide Scanning von Alb3 mit rekombinantem cpSRP43 ...........................80 4.2.5 Bestätigung der mittels Peptide Scanning gezeigten Binderegionen im

Split-YFP System ..........................................................................................82 4.2.6 Verifizierung der Binderegionen im Hefe Split-Ubiquitin System ..................84 4.2.7 Pull down Analysen zur Interaktion von Alb3 und cpSRP43.........................86 4.2.8 Untersuchung der Alb3 Bindestelle im Thylakoidmembran-Bindungstest.....89 4.2.9 Analyse der Bindedomäne des cpSRP43 für das Alb3.................................90 4.3 Analyse der Interaktion von Alb3 und Alb4 mit den Proteinen der

Thylakoidmembran........................................................................................95 4.3.1 Crosslinking der Thylakoidmembranproteine................................................95 4.3.2 Interaktion von Alb4 mit den kernkodierten ATP-Synthase

Untereinheiten im Split-YFP System.............................................................97 4.3.3 Gelfiltrationsanalyse solubilisierter Thylakoidmembranproteine .................100 4.3.4 Coimmunpräzipitation solubilisierter Thylakoidmembranproteine ...............101

5. Diskussion ................................................................................................ 103

5.1 Die cpSRP-Untereinheit cpSRP43 interagiert direkt mit dem integralen Membranprotein Alb3..................................................................................103

5.2 Identifizierung der Alb3-Interaktionsbereiche für das cpSRP43 und Charakterisierung der Alb3-cpSRP43 Interaktion .......................................105

5.3 Das cpSRP43 interagiert mit Alb3 über die Ankyrin repeat Region ............110 5.4 Alb4 interagiert nicht mit den Komponenten des cpSRP-Transportwegs ...115 5.5 Alb4 ist mit der chloroplastidären ATP-Synthase assoziiert und interagiert

nicht mit Alb3 und cpSecY ..........................................................................116

6. Zusammenfassung .................................................................................. 120

7. Summary................................................................................................... 121

8. Literaturverzeichnis ................................................................................. 122

9. Abkürzungsverzeichnis........................................................................... 131

10. Abbildungsverzeichnis............................................................................ 132

11. Tabellenverzeichnis ................................................................................. 134

Inhaltsverzeichnis IV

12. Anhang...................................................................................................... 135

12.1 Publikationen...............................................................................................135 12.2 Lebenslauf...................................................................................................136 12.3 Danksagung ................................................................................................137

1 Einleitung 1

1. Einleitung

1.1 Funktion und evolutionärer Ursprung der Chloroplasten

Die Chloroplasten der photoautotrophen Eukaryoten ermöglichen eine Vielzahl an

biochemischen Funktionen. Dazu gehören die Synthese von Fettsäuren, Aminosäuren

und Porphyrinen sowie die Sulfat- und Stickstoffreduzierung. Die allgemein bekannteste

Funktion der Chloroplasten ist die Fixierung von Kohlenstoff durch die Photosynthese. Bei

der Photosynthese werden Kohlendioxid und Wasser zu Glukose und Sauerstoff

umgesetzt. Mit der Existenz von Chloroplasten können die photoautotrophen Eukaryoten

die absorbierte Strahlungsenergie der Sonne in chemisch nutzbare Energieträger

umwandeln. Die Endosymbiontentheorie beruht darauf, dass die Chloroplasten über

Phagozytose eines photosynthetisch aktiven Prokaryoten durch eine heterotrophe

Wirtszelle entstanden sind (Weeden, 1981; Cavalier-Smith, 2000). Man nimmt an, dass

der phagozytierte Prokaryot den heutigen Cyanobakterien ähnelte (Reyes-Prieto et al.,

2007). Im Laufe der Evolution erfolgte neben einem Verlust auch ein Transfer von

genetischer Information aus dem Genom des Endosymbionten in das Kerngenom der

Wirtszelle (Martin und Herrmann, 1998). Chloroplasten enthalten etwa 3000 Proteine

(Abdallah et al., 2000). Davon sind nur etwa 100 Proteine im Chloroplastengenom selbst

kodiert (Timmis et al., 2004). Die Mehrheit der Proteine (> 95%) ist kernkodiert und wird

posttranslational nach erfolgter Synthese im Cytosol in die Chloroplasten importiert

(Keegstra und Cline, 1999; Leister, 2003). Der Transfer der Gene in das Kerngenom

erforderte die Entstehung einer koordinierten Protein-Import-Maschinerie (Soll und

Schleiff, 2004; Kessler und Schnell, 2006; Jarvis, 2008; Agne und Kessler, 2009; Benz et

al., 2009).

1.2 Proteintransport kernkodierter Proteine über die chloroplastidären Hüllmembranen

Chloroplasten sind komplex strukturierte Organellen, die sich aus drei Membransystemen

(innere und äußere Hüllmembran und Thylakoidmembran) und drei löslichen

Kompartimenten (Intermembranraum der Hüllmembranen, Stroma und Thylakoidlumen)

zusammensetzen. Viele Proteinkomplexe der Chloroplasten bestehen aus Proteinen, die

im Zellkern bzw. auf dem Plastom kodiert sind. Die Assemblierung dieser Komplexe

erfordert einen koordinierten Import der Proteine in das Organell. Für die korrekte

Sortierung und den Import über die chloroplastidären Hüllmembranen tragen fast alle

1 Einleitung 2

Proteine am N-Terminus ein 20-150 Aminosäuren langes Transitpeptid (Bruce, 2000,

2001). Diese Proteine werden als Vorstufenproteine bezeichnet. Cytosolische Faktoren

können den Transport des Vorstufenproteins erleichtern und die Effizienz des

chloroplastidären Imports der Proteine erhöhen. Bei diesen Faktoren handelt es sich um

14-3-3 Proteine sowie das Hsp70 und Hsp90 Chaperon, die zusammen mit dem

Vorstufenprotein einen guidance-Komplex bilden (May und Soll, 2000; Jarvis 2008). Der

Import der Proteine erfolgt über Translokationskomplexe, die in den chloroplastidären

Hüllmembranen lokalisiert sind. Hierbei handelt es sich um das Translokon der äußeren

Hüllmembran der Chloroplasten (TOC-Komplex, translocon of the outer envelope

membrane of chloroplasts) und das der inneren Hüllmembran der Chloroplasten (TIC-

Komplex, translocon of the inner envelope membrane of chloroplasts). Die Translokation

des Proteins vollzieht sich in mehreren Schritten und ist ein aktiver ATP- und GTP-

abhängiger Prozess. Im Stroma des Chloroplasten wird das Transitpeptid proteolytisch

abgespalten (Richter und Lamppa, 1998). Nach Abspaltung des Transitpeptids wird das

Protein durch stromale Chaperone gebunden (Jackson-Constan et al., 2001). Diese

dienen dazu Proteinaggregationen zu vermeiden, die Faltung des funktionsfähigen

Proteins zu unterstützen und die Proteine in einem transportfähigen Zustand für einen

möglichen Transport zur Thylakoidmembran zu halten.

1.3 Proteintransport zu den Thylakoiden

Nach beschriebener Translokation über die Hüllmembranen der Chloroplasten erfolgt die

Sortierung der Proteine innerhalb des Organells an ihren Wirkort. Für den koordinierten

Transport der chloroplastidären Proteine über die Thylakoidmembran und die Integration

der Proteine in die Membran sind bisher vier verschiedene Transportwege bekannt

(Abbildung 1-1). Der cpSec-Weg und der cpTat-Weg ermöglichen den Transport und die

Translokation von lumenalen Proteinen. Der cpSRP-Weg und die spontane Insertion sind

für die Integration von integralen Membranproteinen verantwortlich. An dem Transport der

Proteine innerhalb des cpSec-Wegs, cpTat-Wegs und cpSRP-Wegs sind verschiedene

Protein- und Energiekomponenten beteiligt. Die spontane Insertion der Proteine erfolgt

ohne weiteren Einfluss anderer Faktoren (Schünemann, 2004, 2007; Aldridge et al.,

2009).

1 Einleitung 3

cpSRP

LHCPs

GTPATP stim.

cpFtsY

cpSRP

Thylakoidmembran

Thylakoidlumen

spontan

cpTat-Translokase

cpTat

PMF

Hcf106 TatC Tha4

cpSec

cpSec-Translokase

SecY SecE

TD

ATP cpSecA

Transport zum Lumen Transport zur Membran

z. B. OE23, OE16 z. B. OE33, PC z.B. CF0II, PsbW, PsaKTD

TD

Alb3

Stroma

Abbildung 1-1: Transportwege der Proteine innerhalb des Chloroplasten Dargestellt sind die Transportwege von kernkodierten Proteinen vom Stroma zur

Thylakoidmembran bzw. in das Thylakoidlumen der Chloroplasten. Der Transport der Proteine in

das Thylakoidlumen wird durch den cpTat-Weg und den cpSec-Weg vermittelt. Der cpSRP-Weg

und die spontane Insertion sind für die Integration von integralen Membranproteinen verantwortlich.

(TD = Transitdomäne; PMF = proton motive force) (verändert nach Schünemann, 2007)

1.3.1 Proteinimport in das Thylakoidlumen

Kernkodierte Proteine des Thylakoidlumens werden sowohl über die Hüllmembranen, als

auch über die Thylakoidmembranen transportiert und tragen dafür ein doppeltes

Transitpeptid. Für den zusätzlichen Transport der Proteine über die Thylakoidmembran ist

neben des N-terminalen Transitpeptids ein zweites Transitpeptid erforderlich. Nach

Abspaltung des ersten Transitpeptids durch eine stromale Peptidase wird das

Transportsignal für die Translokation des Proteins über die Thylakoidmembran

zugänglich. Die Transitpeptide besitzen charakteristische Domänen. Die N-Domäne

besteht aus geladenen Aminosäuren, die H-Domäne enthält vorwiegend hydrophobe

Aminosäuren und die polare C-Domäne trägt das Konsensus-Motiv Ala-X-Ala (Jarvis und

Robinson, 2004).

1 Einleitung 4

1.3.1.1 Der cpSec-Weg

Der chloroplastidäre Sec-Weg zeigt Homologien zum bakteriellen Transportmechanismus

von Sec-abhängigen Proteinen (Robson und Collinson, 2006; Driessen und Nouwen,

2008). In Bakterien bindet das cytosolische Chaperon SecB das Vorstufenprotein und

transportiert dieses zur periplasmatischen Membran. Das periphere Membranprotein

SecA bildet als eine ATPase den Translokationsmotor und schleust die Proteine durch

den Translokationskanal. Die Translokationspore wird von den essentiellen

Hauptkomponenten SecY und SecE gebildet (Brundage et al., 1990). Der cotranslationale

Transport erfolgt über das cytosolische SRP.

Der bakterielle und chloroplastidäre Sec-abhängige Proteintransport erfolgt nach

scheinbar ähnlichen Mechanismen. Die Proteine werden ebenfalls im ungefalteten

Zustand transportiert. Es konnten bereits mit der ATPase cpSecA und den Proteinen der

Translokase cpSecY und cpSecE chloroplastidäre Homologe nachgewiesen werden

(Abbildung 1-1) (Yuan et al., 1994; Laidler et al., 1995; Roy und Barkan, 1998;

Schünemann et al., 1999; Sun et al., 2007). Jedoch konnten nicht zu allen bakteriellen

Komponenten homologe Proteine im chloroplastidären cpSec-Transport gefunden

werden. Aufgrund der Assoziation des YidC-Homologs Alb3 (siehe auch Abschnitt 1.5)

und des chloroplastidär kodierten D1 mit cpSecY wird derzeit eine Funktion der cpSec-

Translokase bei der cotranslationalen Insertion von Proteinen in die Thylakoidmembran

diskutiert (Zhang et al., 2001; Klostermann et al., 2002; Pasch et al., 2005).

1.3.1.2 Der cpTat-Weg

Eine weitere Möglichkeit für die Translokation von lumenalen Proteinen bietet der cpTat-

Transportweg (Abbildung 1-1). Die Transitpeptide der Proteine, die über diesen Weg

transportiert werden, tragen ein charakteristisches Twin-arginine-Motiv, welches diesem

Transportweg seinen Namen verleiht (Tat: Twin-arginine translocation) (Chaddock et al.,

1995). Eine Besonderheit des cpTat-Wegs ist, dass bereits gefaltene Proteine über die

Thylakoidmembran translokalisiert werden können (Marques et al., 2004). Für diesen

Transport sind im Gegensatz zur cpSec-Translokase keine löslichen Komponenten

bekannt. Für den Translokationsvorgang sind die integralen Membranproteine Hcf106,

Tha4 und cpTatC essentiell (Cline und Mori, 2001; Mori und Cline, 2002; Dabney-Smith et

al., 2006). Die Untereinheiten Hcf106 und cpTatC bilden einen Rezeptorkomplex,

während das Tha4 Protein durch Oligomerisierung einen Kanal formt. Bei einer Bindung

des Substratproteins kommt es zur Assemblierung der beiden Komplexe zur vollständigen

Translokase.

Der Translokationsvorgang erfordert in vitro einen Protonengradienten (Klösgen et al.,

1 Einleitung 5

1992), während in vivo diese Abhängigkeit nicht bestätigt werden konnte (Finazzi et al.,

2003; Di Cola et al., 2005). Dieses könnte an fehlenden Komponenten in den in vitro

Studien liegen. Anstelle dessen wird eine Bedeutung des Membranpotentials diskutiert

(Theg et al., 2005; Braun et al., 2007).

1.3.2 Proteinintegration in die Thylakoidmembran

1.3.2.1 Spontane Insertion

Die meisten chloroplastidären Proteine werden anhand eines spezifischen Transportwegs

über die Thylakoidmembran translokalisiert bzw. in diese inseriert. Einige Proteine jedoch

werden offenbar ohne Beteiligung von Energiekomponenten, stromalen

Transportproteinen oder einer Translokase in die Thylakoidmembran integriert (Abbildung

1-1) (Michl et al., 1994; Kim et al., 1999; Woolhead et al., 2001). Die Integration dieser

Proteine scheint sich ohne irgendwelche Hilfskomponenten auf spontanem Weg zu

vollziehen. Über die spontane Insertion werden hauptsächlich Proteine mit einer

Transmembrandomäne (CF0II, PsbX, PsbW) in die Membran eingebaut. Bei diesen

Proteinen bedingt eine hydrophobe Region des Transitpeptids die Insertion (Thompson et

al., 1998). Allerdings kann die spontane Insertion auch von Proteinen mit zwei

Transmembrandomänen vollzogen werden (PsaK, PsaG). In diesem Fall ermöglicht eine

positiv geladene stromale loop Region die Insertion der Proteine in die Thylakoidmembran

(Zygadlo et al., 2006).

1.3.2.2 Der cpSRP-Weg

Die SRPs (signal recognition particles) sind aus dem Cytosol von Eukaryoten und

Prokaryoten bekannt, wo sie der cotranslationalen Insertion von Membranproteinen in das

endoplasmatische Retikulum und in die Plasmamembran dienen (Koch et al., 2003; Pool,

2005). Das SRP ist ein Ribonukleoprotein, welches bei Eukaryoten aus einer RNA-

Komponente und sechs Polypeptiden besteht. Die etwa 54 kDa große Untereinheit

SRP54 erkennt das Signalpeptid des zu transportierenden Proteins. Nach Bindung dieses

Komplexes an den SRP-Rezeptor wird das Protein cotranslational durch einen

Translokationskanal in das endoplasmatische Retikulum geschleust.

Der SRP-Weg in E. coli ähnelt dem eukaryotischen SRP-Weg. Der SRP-

Transportmechanismus dient dem cotranslationalen Transport von Proteinen zur

Plasmamembran (de Gier und Luirink, 2001). Das SRP in E. coli stellt mit einer RNA-

1 Einleitung 6

Komponente und dem bakteriellen Homolog des SRP54, Ffh (fiftyfour homolog), ebenfalls

ein Ribonukleoprotein dar. Bei dem FtsY handelt es sich um einen SRP-Rezeptor. Dieser

Rezeptor ist als peripheres Protein der Plasmamembran und als lösliches Protein im

Cytosol zu finden. Das cytosolische FtsY bindet den Komplex aus Ribosom, SRP und

naszierendem Protein und befördert diesen zur Plasmamembran.

Das chloroplastidäre SRP kann im Vergleich zu den anderen SRPs sowohl

cotranslational, als auch posttranslational wirken. Der posttranslationale chloroplastidäre

SRP-Weg (cpSRP-Weg) dient der Integration der Proteine der LHCP-Familie (light-

harvesting chlorophyll a/b-binding protein) in die Thylakoidmembran (Abbildung 1-1)

(Schünemann, 2007). Die LHCPs agieren als periphere Antennen der Photosysteme I und

II und stellen etwa ein Drittel der gesamten Thylakoidmembranproteine (Yamamoto und

Bassi, 1996). Bei den LHCPs handelt es sich um kernkodierte Proteine, die als

Vorstufenproteine im Cytosol synthetisiert werden. Ein N-terminales Transitpeptid sorgt

für den posttranslationalen Transport über das TOC- und TIC-Translokon der

chloroplastidären Hüllmembranen ins Stroma. Nachdem das Transitpeptid abgespalten

wurde, werden die LHCPs durch das chloroplastidäre SRP gebunden (Abbildung 1-2).

Der so geformte Transitkomplex ermöglicht den Transport der hydrophoben LHCPs durch

das Stroma zur Thylakoidmembran und hält das LHCP somit in einem integrationsfähigen

Zustand (Payan und Cline, 1991). Chloroplastidäre SRPs beinhalten keine RNA, besitzen

jedoch neben einem SRP54-Homolog (cpSRP54) noch eine weitere 43 kDa große

Komponente (cpSRP43) (Li et al., 1995; Schünemann et al., 1998; Klimyuk et al., 1999).

Bei dem cpSRP43 handelt es sich um eine neue Komponente der SRP-Untereinheiten,

die bisher nur in Chloroplasten Höherer Pflanzen identifiziert wurde. Allerdings konnte von

unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass es ein Homolog zum cpSRP43 in

Chlamydomonas reinhardtii und Physcomitrella patens gibt (Richter, Träger und

Schünemann, unveröffentlichte Daten). Der chloroplastidäre SRP-Rezeptor cpFtsY ist

sowohl im Stroma lokalisiert, als auch mit der Thylakoidmembran assoziiert (Kogata et al.,

1999; Tu et al., 1999). Analog zum bakteriellen System scheint das cpFtsY als Rezeptor

des Transitkomplexes zu arbeiten, der für den Transport zum Translokon der Membran

verantwortlich ist. Des Weiteren spielen die Nukleotide ATP und GTP eine entscheidende

Rolle in diesem Transportweg (Hoffman und Franklin, 1994; Yuan et al., 2002). Die

Funktion des ATP ist allerdings noch nicht geklärt. Bisher wurden nur GTPasen

identifiziert. Die GTP-Hydrolyse der GTPasen cpSRP54 und cpFtsY ermöglicht einen

effizienten und gerichteten Transport (Jaru-Ampornpan et al., 2007). Es wurde gezeigt,

dass für die in vitro Integration der LHCPs in isolierte Thylakoidmembranen die

Komponenten cpSRP43, cpSRP54, cpFtsY und GTP ausreichend sind (Tu et al., 1999;

Yuan et al., 2002). Die detaillierten Proteininteraktionen der einzelnen Komponenten des

posttranslationalen cpSRP-Transportwegs sind einem folgenden Kapitel zu entnehmen

1 Einleitung 7

(Kapitel 1.4). Mit dem integralen Thylakoidmembranprotein Alb3 wurde die Translokase

des posttranslationalen cpSRP-Wegs entdeckt, die für die Insertion der LHCPs in die

Thylakoidmembran notwendig ist (Sundberg et al., 1997; Moore et al., 2000). Das Alb3

gehört zu der sogenannten Oxa1/YidC/Alb3- Proteinfamilie, dessen Mitglieder in der

Insertion und Assemblierung von Membranproteinen in Mitochondrien, Bakterien und

Chloroplasten beteiligt sind (Yi und Dalbey, 2005; Xie und Dalbey, 2008). Eine

ausführliche Darstellung dieser wichtigen Membranproteine erfolgt in einem gesonderten

Kapitel zur Oxa1/YidC/Alb3- Proteinfamilie (Kapitel 1.5).

4354

cpSRP

Transit-komplex

+ GTP

LHCP

Alb3

TM

4354psbA

Ribosom

D1

cpSec-Translokase

54

54

cpFtsY

cotranslational posttranslational

Abbildung 1-2: Modell des co- und posttranslationalen cpSRP-Transportwegs Das Modell stellt die Beteiligung des cpSRP54 am cotranslationalen SRP-Weg zur Integration von

plastidär kodiertem D1 und am posttranslationalen SRP-Weg zur Integration von kernkodiertem

LHCP dar. Das cpSec-assoziierte Alb3 scheint an der SRP-abhängigen cotranslationalen Insertion

von plastidär kodierten Thylakoidmembranproteinen beteiligt zu sein, während die

posttranslationale Integration von LHCP unabhängig von der cpSec-Translokase verläuft.

(verändert nach Schünemann, 2007)

Das cpSRP54 ist neben dem posttranslationalen Transport im Komplex mit cpSRP43

auch am cotranslationalen Transport chloroplastidär kodiertem D1-Protein involviert

(Abbildung 1-2), wobei cpSRP54 an das naszierende D1 bindet (Nilsson et al., 1999;

1 Einleitung 8

Nilsson und van Wijk, 2002). Eine Interaktion des cpSRP43 mit dem naszierenden D1

konnte bislang nicht gezeigt werden. Dieses weist auf eine spezialisierte Rolle des

cpSRP43 im posttranslationalen Transport und eine Doppelfunktion des cpSRP54 sowohl

im posttranslationalen als auch im cotranslationalen Transport hin. Des Weiteren konnte

eine Assoziation von cpSecY mit Ribosomen und dem D1-Protein gezeigt werden (Zhang

et al., 2001). Die cpSec-Translokase ist somit wahrscheinlich an der cotranslationalen

Insertion des chloroplastidär kodierten D1 beteiligt. Das integrale Membranprotein Alb3

scheint ebenfalls eine Doppelfunktion innerhalb des cpSRP-Wegs zu haben. Neben der

Funktion in der posttranslationalen Insertion der LHCPs in die Thylakoidmembran, scheint

die Assoziation mit der cpSec-Translokase auf eine Rolle von Alb3 innerhalb der

cotranslationalen Insertion von Proteinen zu deuten (Klostermann et al., 2002; Pasch et

al., 2005).

1.4 Proteininteraktionen der Komponenten des posttranslationalen cpSRP-Transportwegs

Im folgenden Abschnitt sollen die Proteininteraktionen innerhalb des cpSRP-Wegs näher

beschrieben werden (Abbildung 1-3). Das cpSRP43 ist aus zwei charakteristischen

Protein-Protein-Interaktionsdomänen aufgebaut, den Ankyrin repeats und den

Chromodomänen. Es besitzt im N-Terminus eine Chromodomäne und vier Ankyrin

repeats sowie im C-terminalen Bereich zwei benachbarte Chromodomänen (Klimyuk et

al., 1999; Jonas-Straube et al., 2001; Goforth et al., 2004). Ankyrin repeats ermöglichen

als charakteristische Bindedomänen verschiedene Proteininteraktionen und sind dadurch

an der Ausbildung von Proteinkomplexen beteiligt (Sedgwick und Smerdon, 1999). Die

Chromodomänen wurden anfänglich in Proteinen des Zellkerns identifiziert, wo sie einen

Einfluss auf die Regulation der Chromatinstruktur zeigen (Brehm et al., 2004).

Chromodomänen sind charakteristisch aus drei antiparallelen β-Faltblättern und einer C-

terminalen α-Helix aufgebaut (Sivaraja et al., 2005). Die Kristallstruktur des cpSRP43

(Chromodomäne1 bis Ankyrin repeat 4) zeigt, dass die Ankyrin repeats 2 und 3 ein

typisches helix-turn-helix Motiv besitzen, während die Ankyrin repeats 1 und 4 verlängerte

Helices aufweisen (Stengel et al., 2008). Die Chromodomäne 1 und Ankyrin repeat 1

gehen durch Fusion ihrer Helices direkt ineinander über. Auch Ankyrin repeat 4 zeigt

durch die verlängerte Helix einen direkten Übergang zur Chromodomäne 2. Das cpSRP54

besteht aus einer N-terminalen G-Domäne, welche für die GTPase Funktion

verantwortlich ist, und einer C-terminalen methioninreichen M-Domäne (Franklin und

Hoffman, 1993). Bei der Heterodimerisierung des cpSRP-Komplexes kommt es zur

Interaktion der Chromodomäne 2 des cpSRP43 mit der M-Domäne des cpSRP54

(Goforth et al., 2004; Hermkes et al., 2006). Es konnte gezeigt werden, dass die

1 Einleitung 9

Chromodomäne 2 des cpSRP43 mit einem 10 Aminosäuren langen Bindemotiv innerhalb

der M-Domäne des cpSRP54 interagiert (Goforth et al., 2004; Funke et al., 2005;

Hermkes et al., 2006; Kathir et al., 2008). Aufgrund der positiven Ladung des Bindemotivs

im cpSRP54 (Funke et al., 2005) und der negativen Oberflächenladung der

Chromodomäne 2 des cpSRP43 (Sivaraja et al., 2005) könnte es sich um eine

elektrostatische Interaktion handeln.

LHCPTMD L-18 Motiv

cpSRP43 A1 A2 A3 A4 CD3

cpSRP54 G-Domäne M-Domäne

Bindemotiv

cpFtsY G-DomäneN-Domäne

CD2CD2CD1

Abbildung 1-3: Proteininteraktionen der Komponenten des cpSRP-Transportwegs Das cpSRP43 besitzt drei Chromodomänen (CD1-3) und vier Ankyrin repeats (A1-4). Das

cpSRP54 besteht aus einer G-Domäne, welche für die GTPase Aktivität zuständig ist, und einer

methioninreichen M-Domäne. Bei der Heterodimerisierung des cpSRP kommt es zur Interaktion

der Chromodomäne 2 mit einem 10 Aminosäuren langen Bindemotiv innerhalb der M-Domäne des

cpSRP54. Das LHCP besitzt drei Transmembrandomänen (TMD). Es interagiert über das L-18

Motiv mit der Ankyrin repeat Region des cpSRP43. Weiterhin interagiert das cpSRP54 mit den

hydrophoben Transmembrandomänen des LHCPs und dem cpSRP-Rezeptor FtsY.

Die LHCPs stellen das Substrat des cpSRP-Transportwegs dar. Diese integralen

Membranproteine besitzen 3 Transmembrandomänen. Bei der Bildung des

Transitkomplexes kommt es zunächst zur Interaktion der Ankyrin repeat Domäne des

1 Einleitung 10

cpSRP43 mit dem sogenannten L18-Motiv des LHCPs, welches sich zwischen der 2. und

3. Transmembrandomäne befindet (DeLille et al., 2000; Tu et al., 2000; Jonas-Straube et

al., 2001; Stengel et al., 2008). Die Bindung zwischen cpSRP54 und LHCP erfolgt über

die hydrophoben Transmembrandomänen des LHCPs (DeLille et al., 2000; Tu et al.,

2000; Groves et al., 2001). Das cpFtsY ist aus einer N-terminalen N-Domäne und einer C-

terminalen G-Domäne, welche für die GTPase Aktivität verantwortlich ist, aufgebaut

(Stengel et al., 2007; Chandrasekar et al., 2008). Die Proteine cpSRP54 und cpFtsY sind

in der Lage in GTP-gebundener Konformation miteinander zu interagieren. Die

Dissoziation beider Proteine erfolgt über GTP-Hydrolyse (Jaru-Ampornpan et al., 2007).

Das Protein Alb3 stellt die Translokase des cpSRP-Wegs dar. Dieses integrale

Membranprotein besitzt 5 Transmembrandomänen. Es konnte gezeigt werden, dass

cpSRP54 und cpFtsY zusammen mit Alb3 einen Komplex an der Thylakoidmembran

bilden können (Moore et al., 2003). Die Proteininteraktionen der löslichen cpSRP-

Komponenten mit Alb3 sind jedoch noch nicht vollständig geklärt und daher ein zentraler

Teil dieser Arbeit.

1.5 Die Oxa1/YidC/Alb3-Proteinfamilie

Die Biogenese von membrangebundenen Proteinkomplexen wie z.B. der Photosysteme,

Atmungskette oder ATP-Synthase ist von entscheidender Bedeutung für die Funktionalität

von Zellen. Für diese Funktionalität der Proteinkomplexe ist nicht nur der Transport der

Proteine an ihren Wirkort, sondern auch ein korrekter Einbau in die Membranen essentiell.

Die Mitglieder der sogenannten Oxa1/YidC/Alb3-Proteinfamilie sind evolutionär

konserviert und ermöglichen die Insertion und Assemblierung von Membranproteinen in

Mitochondrien, Bakterien und Chloroplasten (Kuhn et al., 2003; Kiefer und Kuhn, 2007;

Xie und Dalbey, 2008; Zhang et al., 2009). Diese Proteinfamilie weist im Bereich ihrer

Transmembrandomänen eine hydrophobe Kernregion auf, während die hydrophilen

Bereiche in ihrer Länge und Funktion variieren (Yen et al., 2001). Die konservierten

Bereiche der Proteine ermöglichen die Komplementation der Proteine untereinander in

den verschiedenen Systemen, während die hydrophilen Anteile auf eine spezielle

Funktion der Proteine deuten (Preuss et al., 2005; van Bloois et al., 2005). Das bakterielle

Homolog YidC besitzt 6 Transmembrandomänen, während die Homologen in den

Organellen, Oxa1 und Alb3, jeweils 5 Transmembrandomänen aufweisen (Abbildung 1-4).

Die N- und C-terminalen Bereiche des bakteriellen YidC ragen, aufgrund der

Membrantopologie, beide ins Cytoplasma. Das YidC besitzt zwischen der ersten und

zweiten Transmembrandomäne eine lange periplasmatische Domäne. Erste Arbeiten

1 Einleitung 11

geben näheren Aufschluss auf die Struktur des YidC (Ravaud et al., 2008). Bei dem

mitochondrialen Oxa1 und dem chloroplastidären Alb3 ergibt die Membrantopologie eine

Lokalisation der N- und C-terminalen Enden auf gegenüberliegenden Seiten. Der

N-Terminus von Oxa1 zeigt in den Intermembranraum und der C-Terminus in die Matrix

der Mitochondrien. Das chloroplastidäre Alb3 ragt mit dem N-Terminus in das

Thylakoidlumen und mit dem C-terminalen Ende in das Stroma (Kuhn et al., 2003). In den

folgenden Abschnitten sollen zunächst die charakteristischen Funktionen der

namensgebenden Mitglieder der Oxa1/YidC/Alb3-Proteinfamilie näher beschrieben

werden. Zusätzlich erfolgt eine Beschreibung weiterer Homologe dieser Proteinfamilie.

N

C

N

N CC

YidC Oxa1Alb3

Intermembranraum

MatrixCytoplasma

Thylakoidlumen

Stroma

Periplasma

Abbildung 1-4: Membrantopologie von Alb3, YidC und Oxa1 Das chloroplastidäre Alb3 und das mitochondriale Oxa1 besitzen fünf Transmembrandomänen,

während das bakterielle Homolog YidC aus sechs Transmembrandomänen besteht (Kuhn et al.,

2003). Die N- und C-terminalen Bereichen des Alb3 und Oxa1 befinden sich auf

gegenüberliegenden Seiten der Membran. Der N-Terminus von Alb3 zeigt ins Thylakoidlumen und

der C-Terminus ins Stroma der Chloroplasten. Der N-Terminus des mitochondrialen Oxa1 weist in

den Intermembranraum und der C-Terminus in die Matrix der Mitochondrien. Das bakterielle YidC

zeigt eine Membrantopologie, bei der beide Termini ins Cytoplasma ragen. Das YidC besitzt

zwischen der ersten und zweiten Transmembrandomäne eine lange periplasmatische Domäne.

Oxa1 und Alb3 haben jeweils einen verlängerten hydrophilen C-Terminus.

1.5.1 Oxa1

Oxa1 ist ein 36 kDa großes Protein der inneren Mitochondrienmembran von

Saccharomyces cerevisiae, das die Insertion von kern- und mitochondrialkodierten,

inneren Membranproteinen vermittelt (Hell et al., 1998; Hell et al., 2001) (Abbildung 1-5).

Es wurde durch die Analyse von Proteinen, die an der Assemblierung des Cytochrom-

1 Einleitung 12

Oxidase-Komplexes beteiligt sind, identifiziert (Oxa1 = oxidase assembly 1) (Bauer et al.,

1994; Bonnefoy et al., 1994). Oxa1 ist sowohl an der posttranslationalen, als auch an der

cotranslationalen Proteininsertion beteiligt (Bonnefoy et al., 2009). Im mitochondrialen

Transport sind bislang keine Homologen zu den Untereinheiten der bakteriellen Sec-

Translokase bekannt. Daher scheint das Oxa1 ausschließlich in einem Sec-unabhängigen

Integrationsmechanismus zu agieren (Glick und Von Heijne, 1996). Für die Oxa1-

abhängige Insertion von kernkodierten, mitochondrialen Proteinen werden die Proteine

zunächst vom Cytosol in die mitochondriale Matrix transportiert und anschließend in die

innere Membran integriert. Durch Interaktion der C-terminalen, α-helicalen Domäne des

Oxa1 mit den translatierenden Ribosomen konnte eine unterstützende Wirkung auf die

cotranslationale Proteininsertion nachgewiesen werden (Jia et al., 2003; Szyrach et al.,

2003). Diese C-terminale Domäne scheint jedoch keinen Einfluss auf die

posttranslationale Proteininsertion zu haben. Es konnte gezeigt werden, dass das

bakterielle Homolog YidC mit Hilfe der C-terminalen Ribosomen-Bindestelle des Oxa1 die

Funktion des Oxa1 komplementieren kann (Preuss et al., 2005; van Bloois et al., 2005).

Weiterhin wurde gezeigt, dass Oxa1 wie auch das bakterielle Homolog YidC mit

translatierenden Ribosomen eine Pore bildet (Kohler et al., 2009). Oxa1 Hefemutanten

haben gezeigt, dass von der Deletion des Oxa1 nicht nur die Assemblierung der

Cytochrom-Oxidase, sondern auch die ATP-Synthase betroffen ist (Altamura et al., 1996;

Jia et al., 2007).

In Mitochondrien von Saccharomyces cerevisiae wurde neben dem Oxa1 bereits ein

Homolog identifiziert, welches als Oxa2/Cox18 bezeichnet wurde. Dieses Protein spielt

eine spezifische Rolle in der Biogenese des Cytochrom-Oxidase-Komplexes (Preuss et

al., 2005; Bonnefoy et al., 2009). Komplementationsversuche haben gezeigt, dass YidC

die beiden mitochondrialen Homologe Oxa1 und Oxa2/Cox18 funktionell ersetzen kann

(Preuss et al., 2005). Das Oxa2/Cox18 kann ebenfalls die Sec-unabhängige Funktion von

YidC in E. coli komplementieren (van Bloois et al., 2007). In der Hefe sind Oxa1 und

Oxa2/Cox18 nicht in der Lage sich gegenseitig zu komplementieren, was auf eine

unterschiedliche Funktion der beiden Proteine schließen lässt. Das Oxa2/Cox18 scheint

im Gegensatz zum Oxa1 ausschließlich eine posttranslationale Aufgabe zu haben. Die

posttranslationale Funktion des Oxa2/Cox18 wird durch die unterstützende Wirkung auf

die Translokation der C-terminalen Domäne des Cox2 in den Intermembranraum und eine

mögliche Funktion in der Assemblierung mit den anderen Untereinheiten des Cytochrom-

Oxidase-Komplexes gezeigt (Saracco und Fox, 2002). Das Oxa2 in Neurospora crassa ist

in der Lage die Oxa2-Mutante der Hefe zu komplementieren, was für eine gemeinsame

Funktion der beiden Proteine spricht. Die Deletion dieses Oxa2-Gens verursacht einen

spezifischen Defekt in der Biogenese des Cytochrom-Oxidase-Komplexes (Funes et al.,

2004).

1 Einleitung 13

1.5.2 Yid C

YidC ist ein 60 kDa großes, integrales Membranprotein der Plasmamembran in E. coli und

wurde als neue Komponente der Sec-Translokase nachgewiesen (Saaf et al., 1998; Scotti

et al., 2000). In E. coli werden die meisten Membranproteine über den cotranslationalen

SRP-Weg zur Plasmamembran transportiert und über die Sec-Translokase in die innere

Membran inseriert. Das integrale Membranprotein der Plasmamembran YidC stellt eine

entscheidende Komponente der Sec-Translokase dar und ermöglicht den lateralen

Einbau von Transmembrandomänen integrierter Proteine aus der Sec-Translokase in die

Membran (Beck et al., 2001; Urbanus et al., 2001; van der Laan et al., 2001; Houben et

al., 2004). YidC interagiert dabei mit den Transmembrandomänen der inserierten Proteine

direkt nach deren Freisetzung aus dem Sec-Translokon. Dieses verhindert die

Aggregation der integrierten Proteine. Das YidC scheint somit eine Funktion als

Membranchaperon auszuüben. Des Weiteren wurde gezeigt, dass YidC in E. coli für die

Insertion von Membranproteinen, die unabhängig von der Sec-Translokase integriert

werden, essentiell ist (Samuelson et al., 2000; Chen et al., 2002; Serek et al., 2004; van

der Laan et al., 2004; van Bloois et al., 2005; Facey et al., 2007). Dabei handelt es sich

z. B. um Phagenproteine oder die F0c-Untereinheit der ATP-Synthase. Von den

Phagenproteinen wurde zunächst angenommen, dass sie spontan in die Membran

inserieren. Das YidC ist in der Lage, wie das mitochondriale Homolog Oxa1, mit

translatierenden Ribosomen eine dimere Insertionspore auszubilden (Kohler et al., 2009).

Die bisherigen Daten zeigen, dass YidC sowohl in Kombination mit der Sec-Translokase

als auch unabhängig von dieser bei der Integration von Membranproteinen agieren kann

(Abbildung 1-5).

In grampositiven Bakterien findet man hauptsächlich zwei YidC Homologe (Funes et al.,

2009). Das YidC1 und YidC2 aus Streptococcus mutans sind in der Lage das YidC aus

E.coli in der Sec-abhängigen und Sec-unabhängigen Proteininsertion zu komplemetieren.

YidC2 besitzt, wie das mitochondriale Homolog Oxa1, einen positiv geladenen C-

Terminus und kann mit Ribosomen assoziieren. Es ist in der Lage die Funktion von Oxa1

in der cotranslationalen Proteininsertion von mitochondrialen, inneren Membranproteinen

zu übernehmen. Weiterhin wurde gezeigt, dass YidC2 unabhängig von dem SRP-Weg

cotranslational wirken kann.

1 Einleitung 14

1.5.3 Alb3

Das Alb3 Protein wurde aus der Analyse von Pigment-defizienten Mutanten von

Arabidopsis thaliana identifiziert. Die Mutanten zeigen einen drastischen Albino-Phänotyp

(Albino 3 = Alb3) und sind nicht in der Lage ohne externe Kohlenstoffquelle über das

Keimungsstadium hinaus zu überleben (Sundberg et al., 1997). Der Chlorophyllgehalt

beträgt nur etwa 5 % des Wildtyplevels. Die Chloroplasten zeigen nur wenige

Thylakoidmembranen und keinerlei Granastapelung. Alb3 ist ein 45 kDa großes,

integrales Thylakoidmembranprotein, welches an der posttranslationalen Integration der

LHCPs in die Thylakoidmembran beteiligt ist (Moore et al., 2000; Moore et al., 2003)

(Abbildung 1-5). Es konnte gezeigt werden, dass eine Vorinkubation von

Thylakoidmembranen mit einem Alb3-Antikörper die Integration des Lhcb1 beeinträchtigt,

während dieses keine Auswirkungen auf den Transport von cpSec- und cpTat-

abhängigen Proteinen hatte (Moore et al., 2000). Gleichermaßen wurde die Integration

von zwei weiteren Mitgliedern der LHCP-Familie (Lhcb4.1 und Lhcb5) in die

Thylakoidmembran verhindert (Woolhead et al., 2001). Das Alb3 scheint bei der

Integration von LHCP unabhängig von der cpSec-Translokase zu agieren, da die

Vorinkubation der Thylakoidmembran mit einem Antikörper gegen den C-Terminus von

cpSecY keinen Einfluss auf die Integration von LHCP hat (Mori et al., 1999). Die

posttranslationale Integration der LHCPs ist daher ein cpSRP/Alb3-abhängiger, jedoch

cpSec-unabhängiger Mechanismus (Moore et al., 2003). Andere Arbeiten zeigen

allerdings eine Assoziation des Alb3 mit der cpSec-Translokase (Klostermann et al., 2002;

Pasch et al., 2005). Das cpSec-assoziierte Alb3 scheint an der cpSRP-abhängigen

cotranslationalen Insertion von chloroplastidär kodierten Thylakoidmembranproteinen

beteiligt zu sein (Abbildung 1-5). Zudem konnte gezeigt werden, dass Alb3 in der Lage ist

das YidC in einem YidC-defizienten Bakterienstamm zu komplementieren. Das Alb3

ermöglicht in E.coli die Membraninsertion von Sec-abhängigen und Sec-unabhängigen

Membranproteinen (Jiang et al., 2002).

Neben dem Alb3 konnte mit dem Alb4 ein zweites chloroplastidäres Homolog der

Oxa1/YidC/Alb3-Proteinfamilie in Arabidopsis thaliana identifiziert werden (Gerdes et al.,

2006). Zahlreiche Analysen wie z. B. Importstudien, immunologische Detektion in

chloroplastidären Subfraktionen und GFP-Lokalisationsstudien ergaben, dass Alb4 in der

Thylakoidmembran der Chloroplasten lokalisiert ist. Arabidopsis thaliana Mutanten mit

einem um 90 % reduzierten Alb4 Level zeigten keinen offensichtlichen Phänotyp. Der im

Vergleich zu den alb4-Mutanten drastische Phänotyp der alb3-Mutante zeigt, dass Alb4

nicht in der Lage ist die Funktion von Alb3 zu kompensieren. Die chloroplastidäre

Ultrastruktur der alb4-Mutanten weist vergrößerte Plastiden mit einer im Vergleich zum

Wildtyp aufgelockerten Anordnung der Granathylakoide auf. Das Alb4 scheint somit einen

1 Einleitung 15

Einfluss auf die Biogenese der Chloroplasten zu haben. Die genaue Funktion des Alb4 ist

jedoch noch nicht bekannt.

In Chlamydomonas reinhardtii wurden ebenfalls zwei Alb3-Homologe (Alb3.1 und Alb3.2)

identifiziert (Bellafiore et al., 2002; Göhre et al., 2006). Die Inaktivierung des Alb3.1 in der

ac29-Mutante von Chlamydomonas reinhardtii hat zwei bedeutende Effekte. Die Menge

des LHCI und LHCII im Photosystem I und II ist um mehr als das 10-fache reduziert und

der Chlorophyllgehalt entspricht nur 30% des Wildtyplevels. Zudem ist das Photosystem II

um das 2-fache bzw. 10-fache in den Zellen, die in Licht bzw. bei Dunkelheit angezogen

wurden, vermindert (Bellafiore et al., 2002). Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass

Alb3.1 an der Assemblierung des D1 in das Reaktionszentrum des Photosystems II von

Chlamydomonas reinhardtii involviert ist (Ossenbühl et al., 2004). Interessanterweise

scheint dagegen Alb3.1 für die Integration des D1 in die Thylakoidmembran keine

signifikante Rolle zu spielen (Ossenbühl et al., 2004). Das Alb3.1 hat daher eine Funktion

in der Integration der LHCPs und in der Assemblierung des Photosystem II. Weiterhin ist

bemerkenswert, dass die Inaktivierung des Alb3.1 in Chlamydomonas reinhardtii einen

deutlich milderen Phänotyp zeigt, als der Verlust des Alb3 in Arabidopsis thaliana

(Sundberg et al., 1997; Bellafiore et al., 2002). Mit dem Alb3.2 konnte ein weiteres Alb3-

Homolog in Chlamydomonas reinhardtii identifiziert werden, das den Verlust des Alb3.1 in

der Mutante ac29 möglicherweise teilweise kompensieren kann (Bellafiore et al., 2002).

Eine Reduktion des Alb3.2 in der Chlamydomonas RNAi-Mutante führt zu einer starken

Reduktion der Phtosysteme I und II und langfristig zum Zelltod. Während die Menge an

Lichtsammelkomplexen nicht so stark reduziert ist, wie in der alb3.1-Mutante, zeigt die

alb3.2-Mutante mit einer Vergrößerung der Vakuole einen weiteren Phänotyp, dessen

Ursache allerdings nicht geklärt ist (Göhre et al., 2006).

Im Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC6803 konnte ebenfalls ein Alb3-Homolog

(Slr1471) identifiziert werden. Mutanten zeigten, dass dieses Homolog für die Morphologie

der Thylakoide und die Lebensfähigkeit der Zellen wichtig ist (Spence et al., 2004). Es

konnte gezeigt werden, dass das Slr1471 mit dem D1 Protein interagieren kann und

daher für die Integration des D1 wichtig ist (Ossenbühl et al., 2006). Das Slr1471 ist

hauptsächlich in der Cytoplasmamembran lokalisiert und in der Lage das YidC in einem

YidC-defizienten E.coli Bakterienstamm zu ersetzen (Gathmann et al., 2008). Mit der

Lokalisation des Slr1471 in der Cytoplasmamembran ist eine Funktion in der Biogenese

des Photosystem II in der Cytoplasmamembran verbunden.

1 Einleitung 16

Oxa1

Mitochondrien

Matrix

Sec

YidC

E. coli

Cytoplasma

YidC

cpSec

Alb3Alb3

Chloroplast

Thylakoidlumen

Stroma

TM innere Membran

äußere Membran

innere Membran

äußere Membran

Cytoplasma

Abbildung 1-5: Proteininsertionen durch Alb3, YidC und Oxa1 Das integrale Thylakoidmembranprotein Alb3 ermöglicht in Chloroplasten die posttranslationale

Insertion der LHCPs. Weiterhin ist das Alb3 mit der cpSec-Translokase assoziiert und agiert dort

vermutlich in der cotranslationalen Insertion von chloroplastidär kodierten Thylakoidmembran-

proteinen. Das YidC in E.coli ist sowohl in der Sec-abhängigen, als auch Sec-unabhängigen

Proteininsertion beteiligt. In Mitochondrien vermittelt Oxa1 die posttranslationale und

cotranslationale Insertion von inneren Membranproteinen.

2 Zielsetzung 17

2. Zielsetzung

In der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle von Alb3 und Alb4 bei der Biogenese der

Thylakoidmembran von Arabidopsis thaliana genauer geklärt werden. Alb3 und Alb4 sind

chloroplastidäre Homologe der Oxa1/YidC/Alb3-Proteinfamilie, deren Mitglieder eine

entscheidende Bedeutung bei der Insertion und Assemblierung von Membranproteinen

haben.

In vorangegangenen Arbeiten konnte bereits gezeigt werden, dass Alb3 für die Insertion

von Mitgliedern der LHCPs, die cpSRP-abhängig zur Thylakoidmembran transportiert

werden, essentiell ist. In einem ersten Teilprojekt dieser Arbeit sollte der docking-Prozess

des Komplexes aus LHCP und cpSRP in Kombination mit dem SRP-Rezeptor cpFtsY an

die Thylakoidmembran näher analysiert werden. Als zentrale Frage sollte dabei

untersucht werden, ob dieser Prozess auf einer direkten Interaktion der Proteine des

cpSRP-Wegs mit der Translokase Alb3 beruht.

Da zu Beginn dieser Arbeit die molekulare Funktion des integralen

Thylakoidmembranproteins Alb4 bei der Biogenese der Chloroplasten unbekannt war,

sollte in einem weiteren Teilprojekt die Interaktion von Alb4 mit anderen

Thylakoidmembranproteinen analysiert werden.

Um die homologen Proteine in Arabidopsis thaliana in biochemischen Untersuchungen

getrennt voneinander detektieren zu können, sollten zunächst spezifische Antikörper

gegen das Alb3 und das Alb4 hergestellt werden. Für die Analyse von Protein-Protein-

Interaktionen sollten sowohl in vivo Studien unter Verwendung des Hefe Split-Ubiquitin

Systems und der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation in Arabidopsis Protoplasten

als auch in vitro Interaktionsstudien (z. B. pull down Analysen, chemisches Crosslinking,

Coimmunpräzipitation) durchgeführt werden.

3 Material und Methoden 18

3. Material und Methoden

3.1 Chemikalien

Tabelle 3-1: Chemikalienliste

Chemikalie Hersteller [35S]-Methionin (37 TBq/mmol, 370 MBq/ml) Hartmann Adenin Hemisulfat-Salz SIGMA Affi Gel 15 Biorad Coomassie® Brilliant Blau G-250 SERVA CSM –His –Leu –Trp (Complete Supplement Mixture minus the above) BIO 101 CSM –Leu –Trp (Complete Supplement Mixture minus the above) BIO 101 Cellulase SERVA DOB (ohne AS) BIO 101 Gene RulerTM 1Kb DNA Ladder Fermentas Glutathion Sepharose 4B Amersham Macerozyme SERVA Molekulargewichtsmarker SIGMA Ni-NTA-Agarose Qiagen Page RulerTM Prestained Protein Ladder Fermentas PEG 3350 SIGMA Pepton MERCK

Ponceau S SERVA Protein A Sepharose CL 4B Amersham Proteinaseinhibitor, complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Sulfo-MBS PIERCE Super Signal West Femto Luminol/Enhancer Solution PIERCE Super Signal West Femto Stable Peroxide Buffer PIERCE Super Signal West Pico Luminol/Enhancer Solution PIERCE Super Signal West Pico Stable Peroxide Buffer PIERCE Weizenkeimlysat (Wheat Germ) Promega

Nicht aufgeführte Chemikalien wurden in Laborqualität von der Firma AppliChem

bezogen.


3.2 Verbrauchsmaterial

Tabelle 3-2: Verbrauchsmaterial

Material Hersteller Blotting Paper Schleicher&Schuell Dialyse-Kassetten PIERCE Filterpapier Schleicher&Schuell Hyperfilm ECL High performance chemiluminescence film Amersham Impfösen Greiner Kodak Biomax MR Film Scientific Imaging Film Kodak Kodak Biomax MS Scientific Imaging Film Kodak Kryoröhrchen Brand Membranfilter Millipore Miracloth Calbiochem PCR-Thermo-Strips 0,2 ml PeqLab PCR-Tubes 0,2 ml Brand Petrischalen Greiner Pipettenspitzen Greiner Polyprep Chromatographie Säulen Biorad Porablot NCL Nitrocellulosemembran Macherey-Nagel PS Küvetten halbmikro Brand Reaktionsgefäße 15 ml Greiner Reaktionsgefäße 50 ml Greiner Safelock Tubes 1,5 ml Eppendorf Safelock Tubes 2 ml Eppendorf UV-Küvetten mikro Brand Wizard Mini Columns Promega

Tabelle 3-3: Kits

Kit Hersteller BCATM Protein Assay Kit PIERCE In-FusionTM Dry-Down PCR Cloning Kit Clontech NucleoSpin Extract II Kit Macherey-Nagel NucleoSpin Plasmid Mini Prep Kit Macherey-Nagel Plasmid Maxi Prep Kit Promega QuikChange XL site-directed mutagensis kit Stratagene RTS 100 Wheat Germ CECF Kit Roche


3.3 Geräte

Tabelle 3-4: Geräte

Geräte Hersteller Aekta Explorer 10 GE Healthcare Biowave S2100 Photometer Biochrom Brutschrank Memmert Electrophoresis Power Supply E143 Consort Electrophoresis Power Supply E233 Consort Electrophoresis Power Supply E835 Consort Elektronische Präzisionswaage Kern & Sohn GmbH Gel Dokumentation Herolab Gel Dryer Modell 583 Biorad Gelfiltrationssäule Superose 6 10/300 GL GE Healthcare Heizblock Bio TDB-100 LAB4you Hoefer Mighty Small II (SDS-PAGE) Amersham Hoefer TE 22 tank transfer unit Amersham Hotplate & Stirrer SB162 Bibby Sterilin LSM 510 Meta Zeiss Minishaker MINI-SECOUEUR IKA MS 2 MINISHAKER Minitron HT (Thermoschüttler) Infors PerfectBlueTMHorizontal Mini Electrophoresis System PeqLab pH-Meter MP220 Mettler Toledo Power Pac 200 (Spannungsgeber) Biorad Schüttelwasserbad 1083 GFL Shaker S-4 ELMI Sonifier Cell Disruptor B15 Branson Thermocycler Mastercycler gradient Eppendorf Thermomixer Comfort Eppendorf Mixer Waring Blender Waring Zentrifuge 5415 D Eppendorf Zentrifuge 5417 R Eppendorf Zentrifuge 5412 D Eppendorf Zentrifuge 5424 Eppendorf Zentrifuge 5804 R Eppendorf Zentrifuge AvantiTM J-25 Beckman


3.4 Biologisches Material

3.4.1 Enzyme

KOD HiFi DNA-Polymerase Novagen

Pfu-Turbo-DNA-Polymerase Stratagene

Restriktionsendonukleasen Fermentas

RNase A Fermentas

SP6 Polymerase Fermentas

T4-DNA-Ligase Fermentas

3.4.2 Antikörper

Anti-Kaninchen IgG: Peroxidase-gekoppelter Antikörper zur Detektion von Kaninchen-

Antikörpern (Verdünnung 1:10000; Sigma)

Anti-Ratte IgG: Peroxidase-gekoppelter Antikörper zur Detektion von Ratten-


Anti-Huhn IgG: Peroxidase-gekoppelter Antikörper zur Detektion von Huhn-


Anti-Alb3: polyklonales Antiserum aus Kaninchen (Verdünnung 1:500;

SeqLab)

Anti-Alb4: polyklonales Antiserum aus Kaninchen (Verdünnung 1:500;

aufgereinigt 1:100; SeqLab; Gerdes et al., 2006)

Anti-Alb4: polyklonales Antiserum aus Ratte (Verdünnung 1:500; SeqLab)

Anti-chaos: polyklonales Antiserum aus Huhn (Verdünnung 1:5000;

Schünemann et al. 1998)

Anti-cpSecY: polyklonales Antiserum aus Kaninchen (Verdünnung 1:5000;

Schünemann et al. 1999)

Anti-c-myc: Antikörper zur Detektion eines c-myc-tags (Clontech)

Anti-HA: Antikörper zur Detektion eines HA-tags (Clontech)

Anti-CF1β: Antikörper zur Detektion von CF1β (Agrisera)

Anti-CF0IV: Antikörper zur Detektion von CF0IV (Agrisera)

Anti-CF1α+β, Anti-CF1γ, Anti-CF1δ, Anti-CF1ε, Anti-CF0I, Anti-CF0II, Anti-CF0III

(freundlicherweise zur Verfügung gestellt von PD Dr. Jörg Meurer, Universität München)


3.4.3 Verwendete Plasmide

Im folgenden sind die verwendeten Plasmide aufgelistet und beschrieben.

Tabelle 3-5: Verwendete Plasmide

Plasmid Beschreibung Referenz

pGEX4T3 Expressionsvektor, kodiert für N-terminalen GST-tag, T7-lac-Promotor Pharmacia

Biotech

pET-DUET1 Expressionsvektor, kodiert für N-terminalen Hexahistidin-tag, T7-lac-Promotor Novagen

pET-29b Expressionsvektor, kodiert für C-terminalen Hexahistidin-tag, T7-lac-Promotor Novagen

pSS Vektor zur in vitro Transkription/ Translation, SP6-Promotor Franklin und

Hoffmann, 1993

pIVEX1.3WG in vitro Expressionsvektor für das RTS 100 Wheat Germ System, T7-lac-Promotor Roche

pAMBV4 Vektor für Hefetransformation, kodiert für C-terminales Ubiquitin-Fragment Dualsystems

Biotech AG

pADSL-Nx Vektor für Hefetransformation, kodiert für N-terminales Ubiquitin-Fragment Dualsystems

Biotech AG

pSPYCE Vektor für das Split-YFP System, kodiert für das C-terminale cYFP-Fragment Walter et al.,

2004

pSPYNE Vektor für das Split-YFP System, kodiert für das C-terminale nYFP-Fragment Walter et al.,

2004

pSPYCE-TS(rbcs)

Vektor für das Split-YFP System, kodiert für die Rubisco Transitsequenz und das C-terminale cYFP-Fragment

verändert nach Walter et al., 2004

pSPYNE-TS(rbcs)

Vektor für das Split-YFP System, kodiert für die Rubisco Transitsequenz und das C-terminale nYFP-Fragment

verändert nach Walter et al., 2004


3.4.4 Erstellte Plasmide und verwendete Oligonukleotide

Die für die Amplifikation von DNA-Fragmenten eingesetzten Oligonukleotide wurden von

der Firma Sigma-Genosys bezogen.

Die folgenden Plasmide kodieren für die Antigene von Alb3 und Alb4. Diese wurden

genutzt, um spezifische Antikörper herzustellen.

pGEX4T3-cAlb3: for BamHI CGTGGATCCAAGCGCAGCAAGAAGAAC rev XhoI CTGCTCGAGTTATACAGTGCGTTTCCGCTT pGEX4T3-nAlb3: for BamHI CGTGGATCCTCCAGCTTAAACGAGATT rev XhoI CTGCTCGAGTTACTTCTGCACGGCGGATGA pET29b-cAlb4: (Gerdes et al., 2006)

Nachfolgend aufgeführte Primer wurden für die Klonierung des pETDuet1-cpSRP43-

Konstruktes benötigt, um rekombinantes His-cpSRP43 zu erhalten.

pETDuet1-cpSRP43: for BamHI CAGGATCCGGCCGTACAAAGAAACTAC rev HindIII GTAAGTTTCATTCATTCATTGGTTG

Die im Folgenden aufgelisteten Primer und Plasmide dienten der Herstellung von GST-

cpSRP43 Deletionskonstrukten für den Thylakoidmembran-Bindungstest.

pGEX4T3-cpSRP43(Ank1+CD2): for Ank1 BamHI GCTGGATCCGAGTACGAGACACCCTGG rev Ank1 overlap CD2 TTTCTCTAACCCAATTCTGACGTCTCGGTCCTCCAG for CD2 overlap Ank1 CTGGAGGACCGAGACGTCAGAATTGGGTTAGAGAAA rev CD2 XhoI GATCTCGAGTCACAGCCCATCCTCGTA pGEX4T3-cpSRP43(Ank2+CD2): for Ank2 BamHI GCTGGATCCGACGAAAACGGCCGGACG rev Ank2 overlap CD2 TTTCTCTAACCCAATTCTATCGGCTCCAGCCTCCGC for CD2 overlap Ank2 GCGGAGGCTGGAGCCGATAGAATTGGGTTAGAGAAA rev CD2 XhoI GATCTCGAGTCACAGCCCATCCTCGTA pGEX4T3-cpSRP43(Ank3+CD2): Template pGEX4T3-cpSRP43(ΔAnk4): for Ank3 BamHI GCTGGATCCATGAGGGGAGGCTTGACG rev CD2 XhoI GATCTCGAGTCACAGCCCATCCTCGTA


pGEX4T3-cpSRP43 (ΔAnk1): for BamHI GCT GGA TCC GCC GTA CAA AGA AAC TAC for ΔAnk1 overlap GCAGACGTAGTGTCGGATGCCGTGGACGAA rev ΔAnk1 overlap TTCGTCCACGGCATCCGACACTACGTCTGC rev XhoI GAT CTC GAG TCA TTC ATT CAT TGG TGG pGEX4T3-cpSRP43 (ΔAnk2): for BamHI GCT GGA TCC GCC GTA CAA AGA AAC TAC for ΔAnk2 overlap GACGTCGATGCCGTGCTCGACCACCGAGAC rev ΔAnk2 overlap GTCTCGGTGGTCGAGCACGGCATCGACGTC rev XhoI GAT CTC GAG TCA TTC ATT CAT TGG TGG pGEX4T3-cpSRP43 (ΔAnk3): for BamHI GCT GGA TCC GCC GTA CAA AGA AAC TAC for ΔAnk3 overlap CTCGACCACCGAGACATTGAAGTGGAAGAC rev ΔAnk3 overlap GTCTTCCACTTCAATGTCTCGGTGGTCGAG rev XhoI GAT CTC GAG TCA TTC ATT CAT TGG TGG pGEX4T3-cpSRP43, pGEX4T3-cpSRP43(ΔAnk4), pGEX4T3-cpSRP43(Ank4+CD2), pGEX4T3-cpSRP43(CD2-3): (Laborbestand)

Die folgenden Plasmide dienten der in vitro Transkription und Translation, dessen

Translationsprodukte für pull down Analysen eingesetzt wurden.

pSS-Alb4(328-499): for NcoI GACCCATGGTTTTGAGCACGGCACAGCAA rev SalI GGCGTCGACTTACCTCTTCTCTGTTTCATGAGA pSS-Alb3(299-462): for NcoI GACCCATGGTTATGAAGCCTCCTCAAACT rev SalI GTAGTCGACTTATACAGTGCGTTTCCGCTT pSS-Alb3(320-462): for NcoI GACCCATGGTTCCACTCATGATCGGTTAC rev SalI GTAGTCGACTTATACAGTGCGTTTCCGCTT pSS-Alb3(328-462): for NcoI GACCCATGGTTTTGTCTGTCCCATCAGGA rev SalI GTAGTCGACTTATACAGTGCGTTTCCGCTT pSS-Alb3(336-462): for NcoI GACCCATGGTTATTTACTGGCTCACAAAT rev SalI GTAGTCGACTTATACAGTGCGTTTCCGCTT pSS-Alb3(320-442): for NcoI GACCCATGGTTCCACTCATGATCGGTTAC rev SalI GTAGTCGACTTAGCTTGTTGTGCTCGAAGC pSS-Alb3(299-462 Δ314-317): Template pSPYCE-Alb3(Δ314-317): for NcoI GACCCATGGTTATGAAGCCTCCTCAAACT rev SalI GTAGTCGACTTATACAGTGCGTTTCCGCTT


pSS-Alb3(299-462 Δ389-415): Template pSPYCE-Alb3(Δ389-415): for NcoI GACCCATGGTTATGAAGCCTCCTCAAACT rev SalI GTAGTCGACTTATACAGTGCGTTTCCGCTT pSS-Alb3, pSS-pAlb4: (Laborbestand) pIVEX1.3 WG-Alb3(299-462): for NcoI GACCCATGGTTATGAAGCCTCCTCAAACT rev SalI GTAGTCGACTTATACAGTGCGTTTCCGCTT pIVEX1.3WG-Alb3(299-462 Δ374-388): Template pSPYCE-Alb3(Δ374-388): for NcoI GACCCATGGTTATGAAGCCTCCTCAAACT rev SalI GTAGTCGACTTATACAGTGCGTTTCCGCTT

Folgende Plasmide wurden für die in vivo Interaktionsstudien in Arabidopsis thaliana

Protoplasten eingesetzt.

pSPYNE-atpC1: for BamHI CACTAGTGGATCCATGGCTTGCTCTAATCTA rev SalI TACCCTCGAGGTCGACAACCTGTGCATTAGCTCC pSPYNE-atpC2: for BamHI CACTAGTGGATCCATGACAGGTTCGATCTCG rev SalI TACCCTCGAGGTCGACAGACTCTCGAAGAGCTTC pSPYNE-atpD: for BamHI CACTAGTGGATCCATGGCGTCTCTTCAACAA rev SalI TACCCTCGAGGTCGACAGTAGCTAATTGAATCTC pSPYNE-atpG: for BamHI CACTAGTGGATCCATGGCTGCTAATTCGATA rev SalI TACCCTCGAGGTCGACAGAAGGAAGAACCTTCTT pSPYCE-Alb4(1-142)Alb3(159-462): for BamHI CGCCACTAGTGGATCCATGTCTTCAACAATATCC for overlap GCTACGTTCCCATTGACTAAGCAACAGGTT rev overlap AACCTGTTGCTTAGTCAATGGGAACGTAGC rev SalI TACCCTCGAGGTCGACTACAGTGCGTTTCCGCTT pSPYCE-Alb4(1-210)Alb3(227-462): for BamHI CGCCACTAGTGGATCCATGTCTTCAACAATATCC for overlap CTATATAGAGCCCTCTCTAACGTGGCCAAC rev overlap GTTGGCCACGTTAGAGAGGGCTCTATATAG rev SalI TACCCTCGAGGTCGACTACAGTGCGTTTCCGCTT pSPYCE-Alb4(1-239)Alb3(256-462): for BamHI CGCCACTAGTGGATCCATGTCTTCAACAATATCC for overlap GTTGCTGCAAGACAGAGTGGATCCGGCATT rev overlap AATGCCGGATCCACTCTGTCTTGCAGCAAC rev SalI TACCCTCGAGGTCGACTACAGTGCGTTTCCGCTT


pSPYCE-Alb4(1-255)Alb3(272-462): for BamHI CGCCACTAGTGGATCCATGTCTTCAACAATATCC for overlap ATTGAGGGACACCCACCATTGGGATGGTAT rev overlap ATACCATCCCAATGGTGGGTGTCCCTCAAT rev SalI TACCCTCGAGGTCGACTACAGTGCGTTTCCGCTT pSPYCE-Alb4(1-288)Alb3(296-462): for BamHI CGCCACTAGTGGATCCATGTCTTCAACAATATCC for overlap CAGTCCTCGCAGAGTATGGAAATTATGAAG rev overlap CTTCATAATTTCCATACTCTGCGAGGACTG rev SalI TACCCTCGAGGTCGACTACAGTGCGTTTCCGCTT pSPYCE-Alb4(1-300)Alb3(314-462): for BamHI CGCCACTAGTGGATCCATGTCTTCAACAATATCC for overlap TCACAAGCAGTGACTCTTGTTTTCAAGTTT rev overlap AAACTTGAAAACAAGAGTCACTGCTTGTGA rev SalI TACCCTCGAGGTCGACTACAGTGCGTTTCCGCTT pSPYCE-Alb4(1-319)Alb3(336-462) entspricht pSPYCE-Alb4(1-302)Alb3(319-462): for BamHI CGCCACTAGTGGATCCATGTCTTCAACAATATCC for overlap CCTTCTGGTTTAAGTATTTACTGGCTCACA rev overlap TGTGAGCCAGTAAATACTTAAACCAGAAGG rev SalI TACCCTCGAGGTCGACTACAGTGCGTTTCCGCTT pSPYCE-Alb4(1-326)Alb3(343-462): for BamHI CGCCACTAGTGGATCCATGTCTTCAACAATATCC rev overlap TTGGGCGGTACTAAGTACGTT for overlap TATTGGCTGACCAACAACGTA rev SalI TACCCTCGAGGTCGACTACAGTGCGTTTCCGCTT pSPYCE-Alb3(1-342)Alb4(327-499): for BamHI CGCCACTAGTGGATCCATGGCGAGAGTTCTAGTC rev overlap TGCCGTGCTCAAAATATTATTTGTGAGCCA for overlap TGGCTCACAAATAATATTTTGAGCACGGCA rev SalI TACCCTCGAGGTCGACCCTCTTCTCTGTTTCATGAGA pSPYCE-Alb3(1-359): for BamHI CGCCACTAGTGGATCCATGGCGAGAGTTCTAGTC rev SalI TACCCTCGAGGTCGACCTTTGCACCACCTAGTTT pSPYCE-Alb3(1-366): for BamHI CGCCACTAGTGGATCCATGGCGAGAGTTCTAGTC rev SalI TACCCTCGAGGTCGACTGCGTTTTCATCCATATT pSPYCE-Alb3(1-415): for BamHI CGCCACTAGTGGATCCATGGCGAGAGTTCTAGTC rev SalI TACCCTCGAGGTCGACTTCTTCTACCAATTCAAC pSPYCE-Alb3(1-442): for BamHI CGCCACTAGTGGATCCATGGCGAGAGTTCTAGTC rev SalI TACCCTCGAGGTCGACGCTTGTTGTGCTCGAAGC pSPYCE-Alb3(F316T): for AATACGCTTCTTGTTACCAAGTTTCTTCCACTC rev GAGTGGAAGAAACTTGGTAACAAGAAGCGTATT


pSPYCE-Alb3(L314A): for CAGAAGAATACGCTTGCTGTTTTCAAGTTTCTT rev AAGAAACTTGAAAACAGCAAGCGTATTCTTCTG pSPYCE-Alb3(L313Q,L314A): for GCACAGAAGAATACGCAGGCTGTTTTCAAGTTTCTT rev AAGAAACTTGAAAACAGCCTGCGTATTCTTCTGTGC pSPYCE-Alb3(Δ314,315): for GCACAGAAGAATACGCTTTTCAAGTTTCTTCCACTC rev GAGTGGAAGAAACTTGAAAAGCGTATTCTTCTGTGC pSPYCE-Alb3(Δ314-317): for CAGAAGAATACGCTTTTTCTTCCACTCAT rev CATGAGTGGAAGAAAAAGCGTATTCTTCTG pSPYCE-Alb3(Δ374-388): for BamHI CGCCACTAGTGGATCCATGGCGAGAGTTCTAGTC rev overlap TTTTAATTGTCTAAATCCCGCACTTATTAT for overlap ATAATAAGTGCGGGATTTAGACAATTAAAA rev SalI TACCCTCGAGGTCGACTACAGTGCGTTTCCGCTT pSPYCE-Alb3(Δ389-415): for BamHI CGCCACTAGTGGATCCATGGCGAGAGTTCTAGTC rev overlap TGATTCAGACTGAGATCTTTCGCCAGCATC for overlap GATGCTGGCGAAAGATCTCAGTCTGAATCA rev SalI TACCCTCGAGGTCGACTACAGTGCGTTTCCGCTT pSPYCE-Alb3, pSPYNE-Alb3, pSPYCE-Alb4, pSPYNE-Alb4, pSPYCE-TS(rbcs)-cpSRP43, pSPYNE-TS(rbcs)-cpSRP43, pSPYCE-TS(rbcs)-cpSRP54, pSPYNE-TS(rbcs)-cpSRP54, pSPYCE-TS(rbcs)-cpFtsY, pSPYNE-TS(rbcs)-cpFtsY: (Laborbestand)

Nachfolgend gelistete Plasmide kamen bei den in vivo Interaktionsstudien im Hefe Split-

Ubiquitin System zum Einsatz.

pAMBV4-Alb3(Δ314-317): Template pSPYCE-Alb3(Δ314-317) for XbaI CTATCTAGACAAAAATGAGCTTAAACGAGATTCCTC rev Stu I ATGAGGCCTTTTACAGTGCGTTTCCGCTT pAMBV4-Alb3(Δ374-388): Template pSPYCE-Alb3(Δ374-388) for XbaI CTATCTAGACAAAAATGAGCTTAAACGAGATTCCTC rev Stu I ATGAGGCCTTTTACAGTGCGTTTCCGCTT pAMBV4-Alb3(Δ389-415): Template pSPYCE-Alb3(Δ389-415) for XbaI CTATCTAGACAAAAATGAGCTTAAACGAGATTCCTC rev Stu I ATGAGGCCTTTTACAGTGCGTTTCCGCTT pAMBV4-Alb3, pAMBV4-Alb4, pMBV-Alg5, pAlg5-NubI, pAlg5-NubG, pADSL-cpSRP43, pADSL-cpSRP54, pADSL-cpFtsY: (Laborbestand)


Des weiteren wurden folgende Sequenzierungsprimer verwendet:

pGEX4T3: for GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG rev CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG pETDuet1: for ATGCGTCCGGCGTAGAG rev GATTATGCGGCCGTGTACAA pSS: for GATTTAGGTGACACTATA rev TAATACGACTCACTATAGGG pIVEX1.3WG: for CGAAGTTGTAAAACGACGGCCAGT rev CAGGAAACAGCTATGAC pSPYCE: for AAGTTCATTTCATTTGGAGAG rev CTGCTTGTCAGCGTAATCTGG pSPYNE: for AAGTTCATTTCATTTGGAGAG rev CATAAGATCCTCCTCAGAAAT pAMBV4: for TTTCTGCACAATATTTCAAGC rev GTAAGGTGGACTCCTTCT


3.4.5 Mikroorganismen

3.4.5.1 Escherichia coli

Tabelle 3-6: Escherichia coli-Stämme

Stamm Genotyp Quelle

XL1 blue

recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17, supE44 relA1 lac- [F´ pro AB lacIqZ∆M15 Tn10(tetr) ]

Stratagene, Bullock et al., 1987

BL21 (DE3) F– ompT hsdSB(rB –mB –) gal dcm

(DE3) Novagen

RosettaTM

F– ompT hsdSB(rB– mB–) gal dcm lacY1 (DE3) pRARE (argU, argW, ileX, glyT, leuW, proL) (CmR)

Novagen

3.4.5.2 Saccharomyces cerevisiae

Tabelle 3-7: Saccharomyces cerevisiae-Stamm

Stamm Genotyp Quelle

DSY-1 MATa, his3Δ200, trp1-901, leu2-3,112 Ade2, LYS2::(lexAop)4-HIS3, URA3::(lexAop)8-lacZ GAL4)

Dualsystems Biotech AG

3.4.6 Pflanzenmaterial

Bei dem für diese Arbeit verwendeten Pflanzenmaterial handelte es sich um die

Ackerschmalwand Arabidopsis thaliana (Columbia).


3.5 Anzuchtbedingungen

3.5.1 Anzucht und Lagerung von Escherichia coli

Die Anzucht von Escherichia coli Kulturen erfolgte in LB-Medium, welches zur Selektion

mit den entsprechenden Antibiotika versetzt wurde. Flüssigkulturen wurden bei 37 °C und

220 rpm über Nacht im Schüttler inkubiert. Die Anzucht der Kulturen auf LB-Festmedium

erfolgte bei 37 °C über Nacht im Wärmeschrank. Die kurzfristige Lagerung der Kulturen

geschah bei 4 °C. Um eine langfristige Lagerung zu gewährleisten, wurden Glycerolstocks

angelegt. Dazu wurden 600 μl der Bakterienkultur mit 600 μl 75 %igem Glycerol in

Kryoröhrchen gemischt und unverzüglich bei –80 °C gelagert.

LB-Medium: LB-Festmedium:

10 g Trypton 10 g Trypton

5 g Hefeextrakt 5 g Hefeextrakt

10 g NaCl 10 g NaCl

100 μl NaOH (10 M) 100 μl NaOH (10 M)

ad 1 l Aqua dest. 15 g Agar

ad 1 l Aqua dest.

Konzentrationen der Antibiotika im Medium:

Ampicillin: 50 μg/ml

Kanamycin: 50 μg/ml

Chloramphenicol: 34 μg/ml

3.5.2 Anzucht und Lagerung von Saccharomyces cerevisiae

Die Anzucht des Saccharomyces cerevisiae Stammes DSY-1 erfolgte auf Festagarplatten

über 3 Tage bei 30 °C. Wildtyp-Kulturen wurden auf YPAD-Agarplatten angezogen.

Flüssigmedium-Kulturen wurden von Stammplatten, die bei 4 °C gelagert wurden, mit

Einzelkolonien beimpft und in einem Schüttler bei 30 °C und 200 rpm über Nacht

inkubiert. Die Kultivierung und Selektion Plasmid-tragender Zellen erfolgte auf

entsprechendem drop-out-Medium.


YPAD-Vollmedium: YPAD-Agar:

10 g Hefeextrakt 20 g Agar

20 g Trypton ad 1 l YPAD

10 g Glukose Monohydrat

40 mg Adeninsulfat

ad 1 l Aqua dest.

drop-out-Medien:

-LT-Medium: -LT-Agar:

27 g DOB 20 g Agar

0,65 g CSM-Leu-Trp ad 1 l -LT-Medium

40 mg Adeninsulfat

ad 1 l Aqua dest.

-LTH-Medium: -LTH-Agar:

27 g DOB 20 g Agar

0,65 g CSM-Leu-Trp-His ad 1 l -LTH-Medium

40 mg Adeninsulfat

ad 1 l Aqua dest.

3.5.3 Pflanzenanzucht

Die Pflanzen wurden in einem (8,5 Stunden Licht/ 22 °C und 15,5 Stunden Dunkelheit/

19,5 °C)-Zyklus bei einer Lichtintensität von 100 μE m-2 s-1 und einer relativen

Luftfeuchtigkeit von 65 % in der Phytokammer angezogen.

3.6 Molekularbiologische Methoden

3.6.1 Polymerase-Kettenreaktion zur Amplifizierung von DNA-Fragmenten

Zur gezielten Vervielfältigung ausgewählter DNA-Fragmente wurden spezifische

Oligonukleotide (siehe 3.4.4) in eine Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain

reaction, PCR) unter Verwendung der KOD HiFi DNA-Polymerase (Novagen) eingesetzt.

Die Polymerase-Kettenreaktion ist ein in vitro Verfahren, um selektiv einen definierten

DNA-Abschnitt zu amplifizieren. Die PCR wurde mit Hilfe des Mastercyclers der Firma

Eppendorf durchgeführt.


PCR-Ansatz:

100 ng Template-DNA

10 µl 10x KOD Puffer # 1

10 µl dNTPs (je 2 mM)

4 µl MgCl2 (25 mM)

1 µl Primer forward (100 µM)

1 µl Primer reverse (100 µM)

0,8 µl KOD HiFi DNA-Polymerase

ad 100 µl Aqua dest.

PCR-Programm:

Denaturierung 2 min 98 °C

Denaturierung* 20 sec 98 °C

Annealing* 10 sec 55-60 °C

Elongation* 30 sec 72 °C

Kühlung 4 °C

*Dieser Zyklus wurde 25-mal durchgeführt.

Nach der PCR wurde ein Aliquot der Produkte in einem 1 %igen Agarosegel aufgetrennt

und die Größe mittels eines Größenstandards überprüft. Die Aufreinigung des PCR

Ansatzes erfolgte über das NucleoSpin Extract II Kit.

3.6.2 Site-directed Mutagenese PCR

Mit Hilfe des Mutagenesis-Kit Quik-Change XL wurden gezielte Aminosäureaustausche in

Plasmide eingebracht. Die site-directed Mutagenese PCR erfolgte nach Angaben des

Herstellers.

PCR-Ansatz:

50 ng Matrizen-DNA

4 μl Primer forward (10 μM)

4 μl Primer reverse (10 μM)

1 μl dNTP mix

5 μl 10x PCR-Puffer

3 μl Q-Sol

1 μl Pfu Turbo-DNA-Polymerase

ad 50 μl Aqua dest.


PCR-Programm:

Start 1 min 95 °C

Denaturierung* 50 sec 95 °C

Annealing* 50 sec 60 °C

Elongation* 20 min 68 °C

Finale Elongation 7 min 68 °C

Kühlung 4 °C

*Dieser Zyklus wurde 18-mal durchgeführt.

Im Anschluss an die PCR erfolgte ein Dpn I Verdau zum Abbau des methylierten

Ausgangsplasmids. Dazu wurde der PCR Ansatz mit 1 µl Dpn I versetzt und für

3 Stunden bei 37 °C inkubiert.

3.6.3 Overlap PCR

Mit Hilfe der Overlap PCR konnten in drei aufeinander folgenden PCR Schritten

Fusionskonstrukte aus zwei DNA-Fragmenten hergestellt werden. Zunächst wurden die

beiden DNA-Fragmente in getrennten PCR Ansätzen amplifiziert. Dazu wurden Primer

eingesetzt, deren überlappende Enden komplementär zu der Sequenz des anderen DNA-

Fragments waren (Overlap Primer). Im zweiten PCR Schritt erfolgte die Anlagerung der

beiden DNA-Fragmente anhand der komplementären Überhänge. Die komplementären

Bereiche dienten als Primer, die somit in der zweiten PCR fehlten. Die Amplifizierung des

Fusionskonstruktes erfolgte in einem dritten PCR Schritt durch den Einsatz des for-

Primers und rev-Primers aus der ersten PCR.

1. PCR:

PCR Ansatz DNA-Fragment 1:

100 ng Template-DNA

1 μl Primer for (ohne Überhang)

1 μl Overlap-Primer rev

10 μl dNTPs (je dNTP 2 mM)

4 µl MgCl2 (25 mM)

10 μl 10x KOD-Puffer #1

0,8 μl KOD HiFi DNA-Polymerase



PCR Ansatz DNA-Fragment 2:

100 ng Template-DNA

1 μl Overlap-Primer for

1 μl Primer rev (ohne Überhang)


4 µl MgCl2 (25 mM)




2. PCR (ohne Zugabe von Primern)

Äquivalente Mengen der DNA-Fragmente 1 und 2 aus der ersten PCR


4 µl MgCl2 (25 mM)




3. PCR (Amplifikation des Fusionskonstruktes)

50 µl des PCR-Ansatzes nach der 2. PCR

1 μl Primer for (flankierender Primer von DNA-Fragment 1)

1 μl Primer rev (flankierender Primer von DNA-Fragment 2)


2 µl MgCl2 (25 mM)




Für alle PCR Schritte wurde das Programm für die KOD HiFi DNA-Polymerase (3.6.1)

verwendet.

3.6.4 DNA-Restriktion

Restriktionsendonukleasen erkennen spezifische Sequenzen in doppelsträngiger DNA

und führen an diesen Stellen zu Doppelstrangbrüchen, indem sie Phosphodiester-

bindungen hydrolysieren. Für die Restriktionsanalysen wurden TypII-Restriktions-

endonukleasen mit den Puffern laut Herstellerangaben (Fermentas) eingesetzt.


3.6.5 Ligation

Die Ligationen erfolgten mit der T4-DNA-Ligase von Fermentas. Die Reaktionen wurden

laut Herstellerangaben in einem Reaktionsvolumen von 15 μl angesetzt, wobei die

einzusetzenden DNA-Mengen in einem molaren Verhältnis von 1:3 (Vektor:Insert)

vorlagen. Die Ligationsansätze beinhalteten 1 µl T4-DNA-Ligase sowie 1,5 µl des T4-

DNA-Ligase Puffers und wurden für 2 Stunden bei 22 °C im Thermoblock inkubiert. Nach

einer anschließenden Hitzeinaktivierung der Ligase für 10 min bei 65 °C wurden die

Ansätze für die Transformation in Escherichia coli genutzt.

3.6.6 Herstellung CaCl2-kompetenter Escherichia coli-Zellen

Für die Herstellung von kompetenten Zellen wurde zunächst eine 5 ml LB-Vorkultur des

E. coli Stammes über Nacht bei 37 °C und 220 rpm angezogen. Mit dieser Vorkultur

konnte eine 100 ml LB-Hauptkultur angeimpft werden. Nach einer Inkubationszeit von

1 Stunde bei 37 °C im Schüttler wurden die Zellen sedimentiert (5000 rpm, 10 min). Das

Pellet wurde in 6 ml 100 mM CaCl2-Lösung resuspendiert. Die Zellsuspension wurde

30 min auf Eis inkubiert und anschließend erneut pelletiert (5000 rpm, 10 min). Das

Resuspendieren des Pellets erfolgte in 4 ml 100 mM CaCl2 mit 15 % Glycerin. Daraufhin

wurden 200 μl Aliquots der Zellen in 1,5 ml-Reaktionsgefäßen in flüssigem Stickstoff

eingefroren und bei –80 °C bis zur Verwendung gelagert.

3.6.7 Transformation von Plasmiden in CaCl2-kompetente Escherichia coli-Zellen

Über die Hitzeschock-Transformation wurden die Plasmide in Bakterien überführt. Dazu

wurden 200 µl eingefrorene kompetente Zellen auf Eis aufgetaut, mit der zu

transformierenden DNA (Ligationsansatz bzw. 100 ng Plasmid-DNA) gemischt und 20 min

auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock von 90 sec bei 42 °C wurden die Zellen eine

Minute auf Eis gestellt, mit 600 μl antibiotikafreiem LB-Medium (37 °C) versetzt und im

37 °C-Schüttler für 45 min bei 750 rpm regeneriert. Anschließend wurden die Zellen auf

Antibiotika-haltigen LB-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C zu Kolonien

herangezogen.


3.6.8 In-Fusion Klonierung

Die In-Fusion Klonierung stellt eine Alternative zur herkömmlichen Ligation dar. Mit Hilfe

des In-FusionTM Dry-Down PCR Cloning Kit der Firma Clontech werden DNA-Fragmente

über homologe Rekombination mit der Vektor-DNA verbunden. Zunächst wurde das

entsprechende DNA-Fragment mit speziellen Oligonukleotiden, die neben den

gewünschten Restriktionsschnittstellen einen zusätzlichen 15 bp Überhang der

Vektorsequenz beinhalteten, amplifiziert. Das aufgereinigte PCR-Produkt wurde mit dem

linearisierten Vektor und den im Kit befindlichen Reaktionskomponenten in einem

Volumen von 10 µl für 30 min bei 42 °C inkubiert. Der Ansatz wurde kurz abgekühlt, mit

40 µl TE-Puffer verdünnt und 5 µl der Verdünnung für die Transformation in E. coli (Kit)

eingesetzt. Nach 30 minütiger Inkubation auf Eis erfolgte der Hitzeschock für 45 sec bei

42 °C. Es folgte die Zugabe von 450 µl SOC-Medium (Kit), die Inkubation für eine Stunde

bei 37 °C und 750 rpm, das Ausplattieren der Zellen auf Antibiotika-haltigem LB-

Festmedium und die Anzucht über Nacht bei 37 °C.

TE-Puffer pH 7,5:

1,21 g Tris

0,29 g EDTA

ad 1 l Aqua dest.

3.6.9 Plasmid-Präparation

Zur Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli wurde eine 1,5 ml-Übernachtkultur in

Antibiotika-haltigem LB-Medium bei Raumtemperatur und 13000 rpm für 30 sec pelletiert

und in 100 μl GET-Puffer resuspendiert. Die Zellen wurden durch Zugabe von 200 μl

0,2 M NaOH/1% SDS für maximal 5 min bei Raumtemperatur alkalisch lysiert. Nach der

Neutralisation mit 150 μl 3 M Kaliumacetat (pH 4,8) wurde die DNA mit 200 μl

Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert. Zur Phasentrennung erfolgte eine Zentrifugation für

5 min bei Raumtemperatur und 13000 rpm. Die obere wässrige Phase wurde in ein

frisches Reaktionsgefäß überführt und mit 1 ml Ethanol (-20 °C) für 30 min bei -20 °C

gefällt. Die DNA wurde für 10 min bei 4 °C und 14000 rpm pelletiert. Das Pellet wurde mit

300 µl 70% Ethanol (-20 °C) gewaschen, getrocknet und in 50 μl Aqua dest.

aufgenommen. Die Lagerung erfolgte bei -20 °C. Die nach dieser Methode isolierte

Plasmid-DNA enthielt noch RNA und wurde für RNase-haltige Kontrollrestriktionen

verwendet. Zur Gewinnung von möglichst reiner Plasmid-DNA wurde die Plasmidisolation

mit einem NucleoSpin Plasmid Mini Prep Kit (Macherey & Nagel) durchgeführt. Für große

Mengen an Plasmid-DNA wurde das Plasmid Maxi Prep Kit (Promega) verwendet.


GET-Puffer:

50 mM Glukose

25 mM Tris/HCl pH 8,0

10 mM EDTA pH 8,0

3.6.10 DNA-Konzentrationsbestimmung

Zur photometrischen Bestimmung der DNA-Konzentration wurde die Extinktion einer 1:50

verdünnten DNA-Lösung bei 260 nm in UV-Küvetten gemessen. Die Konzentration der

DNA wurde durch das Photometer berechnet nach der Formel:

LösungDNA

Küvette

VVE

lg

−

××=⎥

⎦

⎤⎢⎣

⎡ 50260

μμ

3.6.11 Restriktionsanalyse und Sequenzierung

Um eine erfolgreiche Ligation überprüfen zu können, wurde die isolierte Plasmid-DNA

restringiert und die DNA-Fragmente über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt. Plasmid-

DNA mit einem korrekten Restriktionsmuster wurde sequenziert. Die Sequenzierungen

wurden bei dem Sequenzierungsservice der Fakultät für Chemie und Biochemie an der

Ruhr-Universität Bochum durchgeführt.

3.6.12 Agarosegelelektrophorese zur Trennung von DNA

Zur Auftrennung und Größenabschätzung von DNA-Fragmenten wurde eine Agarose-

gelelektrophorese in horizontalen Elektrophoreseapparaturen durchgeführt. Die Agarose

wurde in 1x TAE-Puffer durch Aufkochen gelöst, mit 1 μg Ethidiumbromid pro ml

Agarosegel versetzt und in die Apparatur gegossen. Durch den Zusatz des

Ethidiumbromids konnte die DNA unter Ultraviolett-Bestrahlung sichtbar gemacht werden.

Als Laufpuffer für die Elektrophorese wurde ebenfalls 1x TAE-Puffer verwendet. Die DNA-

Proben wurden mit DNA-Ladepuffer versetzt und die Elektrophorese bei einer Spannung

von 100 V durchgeführt. Als Größenstandard wurde der Gene RulerTM 1kb DNA Ladder

eingesetzt.


50x TAE:

242 g Tris

in 500 ml Aqua dest. lösen

100 ml 0,5 M Na2EDTA pH 8,0

51,1 ml Essigsäure

ad 1 l Aqua dest.

5x DNA-Ladepuffer:

3,75 ml 75% Glycerin

500 μl 2,5% Orange G (in Aqua dest.)

100 μl 1x TAE

650 μl Aqua dest.

3.6.13 Split-Ubiquitin System

Das Split-Ubiquitin System basiert auf dem Hefe two-hybrid System und ermöglicht die

Analyse der Interaktionen von Membranproteinen in vivo. Das Ubiquitin markiert in seiner

eigentlichen Funktion abnorme Proteine für deren proteolytischen Abbau. In diesem

System ist das Ubiquitin in zwei Hälften gespalten. Das Nub-Fragment stellt den

N-Terminus und das Cub-Fragment den C-Terminus des Ubiquitins dar. Das Cub-Protein

mit einem angehängten Reporter wird von dem Vektor pAMBV4 und das Nub-Protein

durch den Vektor pADSL-Nx der Firma Dualsystems Biotech AG (DUALmembrane Kit)

kodiert. Um die Interaktion von zwei Membranproteinen zu analysieren, werden die

beiden Proteine so an die Ubiquitin-Fragmente fusioniert, dass die Ubiquitin-Hälften

cytosolisch lokalisiert sind. Ein Reporter, bestehend aus DNA-bindender Domäne (LexA-

Protein) und transkriptions-aktivierender Domäne (Virionenprotein 16), wird an das Cub-

Fragment fusioniert. Im Falle der Rekonstitution des Ubiquitins wird der Reporter

proteolytisch abgespalten und kann im Nukleus die Reportergene aktivieren. Die DNA-

bindende Domäne kann sich an den LexA-Operator anlagern und die aktivierende

Domäne die Transkription der Reportergene starten. Bei den Reportergenen des DSY1-

Hefestamms handelt es sich um das HIS3, welches der Selektion auf Minimalmedium

dient, und den Reporter lacZ, der für die β-Galaktosidase kodiert.


3.6.13.1 Transformation von Saccharomyces cerevisiae mit Plasmid-DNA

Aus einer 5 ml-Übernachtkultur des Hefestamms DSY-1 in YPAD-Medium wurde eine

100 ml Hauptkultur auf eine OD600 von 0,2 angeimpft und bei 200 rpm und 30 °C bis zu

einer OD600 von 0,5 inkubiert. Die Zellen wurden in zwei 50 ml-Reaktionsgefäßen für

5 min bei 2000 rpm abzentrifugiert und die Pellets anschließend mit je 40 ml Aqua dest.

gewaschen. Danach wurden diese in je 1 ml 0,1 M Lithiumacetat (LiAc) aufgenommen

und auf zwei 1,5 ml-Reaktionsgefäße verteilt. Die Zellsuspension wurde für 15 sec bei

14000 rpm sedimentiert und jedes Pellet in 480 μl 0,1 M LiAc resuspendiert. Pro

Transformationsansatz wurden 100 μl Zellsuspension in einem 1,5 ml-Reaktionsgefäß

kurz abzentrifugiert und in 50 μl 0,1 M LiAc aufgenommen. Den kompetenten Hefezellen

wurden 480 μl 50 % PEG, 72 μl 1 M LiAc und je 1 μg Plasmid-DNA (bait- und prey-

Vektor) zugefügt. Die Ansätze wurden mit Aqua dest. auf 720 μl aufgefüllt, 1 min gevortext

und für 30 min bei Raumtemperatur auf einem Drehrad inkubiert. Nach der Inkubation

wurden die Ansätze mit 72 μl Dimethylsulfoxid gemischt. Nach dem Hitzeschock für

15 min bei 42 °C wurden die Zellen für 15 sec bei 6000 rpm sedimentiert. Die Zellpellets

wurden in 300 μl Aqua dest. resuspendiert und je 150 μl auf –LT- und –LTH-Platten

ausgestrichen. Die Inkubation erfolgte für 3 Tage bei 30 °C.

3.6.13.2 β-Galaktosidase Filtertest

Die Aktivität der β-Galaktosidase ist ein Reporter für eine Interaktion zweier Proteine

innerhalb des Split-Ubiquitin Systems und lässt sich über den β-Galaktosidase Filtertest

überprüfen. Dazu wurde auf die Hefekolonien der –LTH-Platten nach 3 Tagen Wachstum

bei 30 °C ein Rundfilter aufgelegt und anschließend die anhaftenden Hefezellen in

flüssigem Stickstoff aufgebrochen. Nach dem Auftauen des Filters wurde dieser auf einen

Stapel aus drei mit X-Gal-Reaktionslösung durchfeuchteten Filterpapieren gelegt, so dass

die Hefekolonien nach oben zeigten. Die Filter wurden abgedeckt und bei 30 °C für

2 Stunden inkubiert. Bei Interaktion der beiden Fusionsproteine sollte eine Blaufärbung

beobachtet werden können, die auf der β-Galaktosidase Aktivität beruht und zur semi-

quantitativen Auswertung dient. Das Enzym ist in der Lage das Galaktose-Analog X-Gal

(5-Bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-Galaktopyranosid) zu einem blauen Farbstoff umzu-

setzen.


Z-Puffer pH 7,0: X-Gal-Reaktionslösung:

10,7 g Na2HPO4 x 2 H2O 30 ml Z-Puffer

5,5 g NaH2PO4 x H2O 81 μl β-Mercaptoethanol

0,75 g KCl 501 μl X-Gal-Lösung

0,24 g MgSO4 x 7 H2O

ad 1 l H2O

X-Gal-Lösung:

20 mg/ml X-Gal in Dimethylformamid

3.6.14 Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (Split-YFP System)

Das auf der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation basierende Split-YFP System

dient der in vivo Analyse der Protein-Protein Interaktionen in intakten Pflanzenzellen. Das

yellow fluorescent protein (YFP) stellt ein Derivat des green fluorescent protein (GFP) dar,

welches in der Zellbiologie für in vivo Lokalisationsstudien verwendet wird. In dem Split-

YFP System ist das YFP in zwei Hälften gespalten. Das nYFP umfasst die N-terminale

Hälfte und das cYFP entspricht dem C-Terminus des YFPs. Das nYFP wird durch den

Vektor pSPYNE (split YFP N-terminal fragment expression) und das cYFP durch den

Vektor pSPYCE (split YFP C-terminal fragment expression) kodiert (Walter et al., 2004).

Für die Interaktionstests werden die zu untersuchenden Proteine so an die YFP-

Fragmente fusioniert, dass die YFP-Hälften auf der Stroma gelegenen Seite lokalisiert

sind. Im Falle einer Interaktion der beiden Fusionsproteine rekonstituieren sich die beiden

nicht-fluoreszierenden YFP-Hälften zu dem fluoreszierenden YFP, dessen Fluoreszenz an

einem Laserscanning Mikroskop (LSM 510 Meta) sichtbar gemacht und dokumentiert

werden kann. Der Transport der Proteine aus dem Cytosol in den Chloroplasten wird über

die jeweilige chloroplastidäre Transitsequenz der Proteine gewährleistet. Fehlt diese

Transitsequenz, wurde die Transitsequenz der kleinen Untereinheit der Rubisco vor das

jeweilige Konstrukt kloniert, um den chloroplastidären Import zu erreichen. Dazu wurden

die beiden Vektoren pSPYNE-TS(rbcs) und pSPYCE-TS(rbcs) eingesetzt. Diese Vektoren

wurden ebenfalls für die Negativkontrollen eingesetzt, da somit der Import der einzelnen

YFP-Hälften allein garantiert ist.


3.6.14.1 Isolierung von Arabidopsis thaliana Protoplasten und transiente Transfektion

Für die in vivo Interaktionsstudien der Proteine im Split-YFP System wurden zunächst

Arabidopsis thaliana Protoplasten isoliert. Dazu wurden 10-15 Blätter von Arabidopsis

thaliana (1-2 cm Blattlänge im Rosettenstadium) in 0,5-1 mm dünne Streifen geschnitten

und zum Abbau der Zellwände in 25 ml Enzymlösung unter Vakuum im Dunkeln inkubiert.

Danach wurden die Protoplasten durch ein Nylonsieb (40-70 µm) filtriert und somit vom

groben Blattmaterial getrennt. Nach erfolgter Zentrifugation (100 g, 2 min, soft start und

soft stop) wurden die Protoplasten mit Lösung D gewaschen und mit Hilfe einer

Thomakammer die Zellzahl bestimmt. Die Zellzahl wurde auf 2x105/ml eingestellt und die

Protoplasten für 30 min auf Eis inkubiert. Nach erfolgter Zentrifugation (100 g, 2 min, soft

start und soft stop) wurden die Protoplasten in Lösung C aufgenommen (2x105/ml) und

standen für die Transfektion zur Verfügung. Für die Transfektion wurden je 40 µg

Plasmid-DNA (pSPYCE- und pSPYNE-Vektor), 500 µl Protoplastensuspension und 550 µl

Lösung B in einem 15 ml Reaktionsgefäß gut vermischt und für 30 min bei

Raumtemperatur inkubiert. Nach der Transfektion wurden die Protoplasten mit 3 ml

Lösung D gewaschen, erneut zentrifugiert (100 g, 2 min, soft start und soft stop) und in

400 µl Lösung D aufgenommen. Die Protoplasten wurden in Petrischalen überführt und in

4 ml Lösung D für 16-18 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Für die Analyse am

Fluoreszenz Mikroskop wurden die Protoplasten zentrifugiert (100 g, 2 min, soft start und

soft stop) und das Pellet in 100 µl Lösung D aufgenommen. Die Auswertung der

Proteininteraktionen über die Rekonstitution der YFP-Fluoreszenz erfolgte mit Hilfe des

Laserscanning Mikroskops (LSM 510 Meta).

Enzymlösung: Lösung B:

1,5 % Cellulase R10 61,5 % PEG 4000

0,4 % Macerozyme R10 0,3 M Mannit

0,4 M Mannit 0,15 M CaCl2

20 mM KCl

20 mM MES pH 5,7

10 min, 55 °C

10 mM CaCl2

0,1 % BSA


Lösung C: Lösung D:

0,4 M Mannit 154 mM NaCl

15 mM MgCl2 125 mM CaCl2

4 mM MES pH 5,7 5 mM KCl

2 mM MES pH 5,7

3.7 Biochemische Methoden

3.7.1 Überexpression von Proteinen in Escherichia coli

Zunächst wurde aus einer Antibiotika-haltigen E.coli Übernachtkultur eine Hauptkultur

angeimpft und diese bei 37 °C und 220 rpm im Schüttler bis zu einer OD600 von 0,5-0,7

herangezogen. Darauf erfolgte die Induktion der Proteinexpression mit einer IPTG-

Endkonzentration von 1 mM. Nach einer Inkubation von 3 Stunden wurden die Zellen

geerntet und das überexprimierte Protein aufgereinigt. Zur Kontrolle wurde ein Aliquot von

500 µl vor der Induktion (t0) bzw. 3 Stunden nach der Induktion (t3) abgenommen und die

Überexpression mittels SDS-PAGE überprüft.

IPTG-Stocklösung (100 mM):

238,3 mg IPTG

ad 1 ml Aqua dest.

3.7.2 Denaturierende Aufreinigung von Proteinen mit His-tag über Ni-NTA

Für die denaturierende Aufreinigung überexprimierter Proteine mit His-tag wurden

zunächst 250 ml Zellkultur geerntet und das Pellet in 4 ml Puffer B (pH 8,0)

aufgenommen. Die Lyse erfolgte durch vorsichtiges Vortexen, um Schaumbildung zu

vermeiden, und Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach einer zehnminütigen

Zentrifugation bei 14000 rpm wurde das Lysat in einem 15 ml Reaktionsgefäß mit 1 ml Ni-

NTA-Slurry über Nacht bei Raumtemperatur invertiert. Die Ni-NTA-Beads wurden dann

bei 5000 rpm für 3 min abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Beads wurden

dreimal mit je 5 ml Puffer C (pH 5,9) gewaschen und beim letzten Waschschritt in eine

Säule (Biorad PolyPrep Column) überführt. Das benutzte Reaktionsgefäß wurde

anschließend mit 5 ml Puffer C nachgespült. Nachdem der Puffer durch die Säule

gelaufen war, wurde diese in ein frisches 1,5 ml-Reaktionsgefäß gestellt und das


gebundene Protein mit 0,5 ml Puffer E (pH 4,5) eluiert. Dieser Elutionsschritt erfolgte

insgesamt dreimal, wobei die Eluate nicht vereinigt wurden. Zur Überprüfung der

Aufreinigung wurden sowohl vom Lysat, als auch vom Überstand nach der Inkubation mit

den Ni-NTA-Beads je 10 µl abgenommen, um diese mit je 10 µl der Eluatfraktionen über

eine SDS-PAGE kontrollieren zu können.

Puffer B (Lysepuffer) pH 8,0: Puffer C (Waschpuffer) pH 5,9:

100 mM NaH2PO4 100 mM NaH2PO4

10 mM Tris-HCl 10 mM Tris-HCl

8 M Harnstoff 8 M Harnstoff

Puffer E (Elutionspuffer) pH 4,5:

100 mM NaH2PO4

10 mM Tris-HCl

8 M Harnstoff

3.7.3 Native Aufreinigung von Proteinen mit His-tag über Ni-NTA

Für die native Aufreinigung überexprimierter Proteine mit His-tag wurden zunächst 400 ml

Zellkultur geerntet und das Pellet in 10 ml Lysepuffer aufgenommen. Der Aufschluss der

Zellen erfolgte durch eine Ultraschallbehandlung (50 W, 50% Pulse, 4 min). Nach der

Zentrifugation für 30 min bei 14000 rpm und 4 °C wurde das Lysat abgenommen und über

Nacht bei 4 °C mit 500 µl Ni-NTA-Slurry auf dem Drehrad inkubiert. Danach wurden die

Beads dreimal mit 10 ml Waschpuffer gewaschen und in eine Säule (Biorad PolyPrep

Column) überführt. Die Säule wurde dreimal mit je 10 ml Waschpuffer gewaschen und

das gebundene Protein anschließend mit 0,5 ml Elutionspuffer eluiert. Dieser

Elutionsschritt erfolgte dreimal, wobei die Eluate nicht vereinigt wurden. Zur Überprüfung

der Aufreinigung wurden sowohl vom Lysat, als auch vom Überstand nach der Inkubation

mit den Beads je 10 µl abgenommen, um diese mit je 10 µl der Eluatfraktionen über eine

SDS-PAGE kontrollieren zu können.

Lysepuffer pH 8,0: Waschpuffer pH 8,0:

50 mM HEPES 50 mM HEPES

300 mM NaCl 300 mM NaCl

1 mM DTT 1 mM DTT

10 mM Imidazol 20 mM Imidazol


Elutionspuffer pH 8,0:

50 mM HEPES

300 mM NaCl

1 mM DTT

250 mM Imidazol

3.7.4 Aufreinigung von Proteinen mit GST-tag über Glutathion-Sepharose

Für die Aufreinigung von Proteinen mit GST-tag wurde zunächst 1 ml Glutathion-

Sepharose-Beads abzentrifugiert (1500 rpm, 5 min, 4 °C), mit 4 ml eiskaltem 1x TBS

gewaschen und in 1,5 ml 1x TBS aufgenommen. Daraufhin wurden 5 x 500 ml Zellkultur

geerntet (4000 g, 10 min, 4 °C) und die Pellets in 20 ml Lysepuffer, dem zuvor ½ Tablette

complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets der Firma Roche zugesetzt wurde,

resuspendiert. Zur Lyse der Zellen erfolgte eine Ultraschallbehandlung (50 W, 50% Pulse,

4 min). Das Lysat wurde abzentrifugiert (30 min, 4 °C, 18000 rpm), zu den vorbereiteten

Glutathion-Sepharose-Beads gegeben und über Nacht bei 4 °C invertiert. Danach wurden

die Beads dreimal mit 15 ml Lysepuffer gewaschen und beim letzten Waschschritt in eine

Chromatographie-Säule (Biorad PolyPrep Column) überführt. Die Säule wurde dreimal mit

je 10 ml Puffer B gewaschen und das gebundene Protein anschließend mit 0,5 ml

Glutathion-Puffer eluiert. Dieser Elutionsschritt erfolgte dreimal, wobei die Eluate nicht

vereinigt wurden. Zur Überprüfung der Aufreinigung wurden sowohl vom Lysat, als auch

vom Überstand nach der Inkubation mit den Beads je 10 µl abgenommen, um diese mit je

10 µl der Eluatfraktionen über eine SDS-PAGE kontrollieren zu können.

Lysepuffer: Puffer B:

50 ml Tris pH 8,0 50 ml Tris pH 8,0

17,53 g NaCl 8,8 g NaCl

0,15 g DTT ad 1 l Aqua dest.

10 ml Triton X-100

0,3 g EDTA

ad 1 l Aqua dest.

Glutathion-Puffer: 10x TBS, pH 7,5:

3,07 g Glutathion (reduziert) 60,5 g Tris

50 ml Tris pH 8,0 87,6 g NaCl

ad 1 l Aqua dest. ad 1 l Aqua dest.


3.7.5 Abspaltung des GST-tags über Thrombinverdau

Über das pGEX4T3-Expressionssystem wurde ein N-terminaler GST-tag an das zu

exprimierende Protein angefügt. Für die Abspaltung des GST-tags wurden 25 μg

aufgereinigtes Protein und 5 Units Thrombin in 200 μl Puffer B+ gegeben. Die Inkubation

erfolgte über Nacht bei 4 °C auf dem Drehrad.

Puffer B+:

50 mM Tris pH 8,0

150 mM NaCl

2,5 mM CaCl2

3.7.6 Dialyse von Proteinen

Um aufgereinigte Proteine in andere Pufferlösungen zu überführen, wurden diese mit Hilfe

von Dialysekassetten der Firma PIERCE gegen den gewünschten Puffer dialysiert. Die

Dialyse erfolgte zunächst unter Rühren für zwei Stunden in 2 l Puffer bei

Raumtemperatur. Danach wurde das Protein in 2 l frischem Puffer über Nacht bei 4 °C

weiter dialysiert.

3.7.7 BCA-Proteinbestimmung

Zur Proteinkonzentrationsbestimmung wurde das BCATM Protein Assay Kit der Firma

PIERCE verwendet. Dazu wurde sowohl eine BSA-Eichreihe (0-30 μg BSA), als auch

verschiedene Mengen der zu untersuchenden Proteinlösung und gleiche Mengen des

Puffers, in dem das Protein gelöst war, mit Aqua dest. auf 50 µl aufgefüllt. Diese Proben

wurden mit 1 ml BCA-Mix, bestehend aus 50 Teilen Reagenz A und einem Teil

Reagenz B, versetzt und 30 min bei 60 °C inkubiert. Nach Zentrifugation der Proben

wurde die optische Dichte bei 562 nm bestimmt und die Proteinkonzentration mit Hilfe der

Eichgeraden ermittelt.

3.7.8 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die SDS-PAGE wurde zur Trennung von Proteingemischen nach dem Molekulargewicht

verwendet und im vertikalen, diskontinuierlichen Gelsystem aus Sammelgel und Trenngel

durchgeführt. Die Acrylamidkonzentration des Trenngels richtete sich nach der Größe der

zu analysierenden Proteine. Die mit Auftragspuffer versetzten Proben wurden bei 98 °C


für 2 min denaturiert, gevortext, abzentrifugiert und in die Geltaschen eingebracht. Die

Elektrophorese erfolgte bei 30 mA pro Gel in 1x Laufpuffer (mit SDS). Proben, die erst

später verwendet werden sollten wurden bei -20 °C gelagert. Vor dem Auftragen wurden

diese erneut auf 98 °C erhitzt. Als Größenstandard diente der Marker Page RulerTM

Prestained Protein Ladder der Firma Fermentas.

Tabelle 3-8: Trenngel pH 8,8 (4 Minigele):

Acrylamidkonzentration 10% 12% 15%

30 % Acrylamid (29:1) 5,3 ml 6,4 ml 8 ml

1,5 M Tris pH 8,8 4 ml 4 ml 4 ml

Aqua dest. 3,3 ml 5,6 ml 4 ml

20 % SDS 0,08 ml 0,08 ml 0,08 ml

TEMED 0,02 ml 0,02 ml 0,02 ml

25 % APS 0,06 ml 0,06 ml 0,06 ml

Sammelgel pH 6,8 (4 Minigele): Sammelgel-Stock pH 6,8:

6 ml Sammelgel-Stock pH 6,8 50 ml 30 % Acrylamid (29:1)

6 μl TEMED 1,5 ml 20 % SDS

48 μl 25 % APS 18,8 ml 1 M Tris pH 6,8

48 μl Bromphenolblau-Lösung ad 300 ml Aqua dest.

4x Auftragspuffer: Bromphenolblau-Lösung:

2 ml 1 M Tris pH 6,8 40 mg Bromphenolblau

4 ml Glycerol ad 10 ml Aqua dest.

4 ml 20 % SDS

800 μl β-Mercaptoethanol

3 mg Bromphenolblau

5x Laufpuffer (ohne SDS) : 1x Laufpuffer (mit SDS):

15 g Tris 200 ml 5x Laufpuffer

72 g Glycin 5 ml 20% SDS



3.7.9 Coomassie-Färbung

Zum Nachweis der Proteine wurden die SDS-Polyacrylamidgele mit Coomassie-

Färbelösung bedeckt und auf dem Schüttler für 15 min gefärbt. Die Färbelösung wurde

gegen Entfärber ausgewechselt und das Gel solange inkubiert, bis die Proteinbanden

deutlich zu erkennen waren und der Hintergrund komplett entfärbt war. Anschließend

wurde das Gel in Wasser äquilibriert, bis es seine ursprüngliche Größe wieder erreicht

hatte, und auf dem Geltrockner unter Vakuum auf einem Filterpapier getrocknet.

Coomassie-Färbelösung: Coomassie-Entfärber:

2,5 g Coomassie Blau R 250 500 ml Methanol

500 ml Methanol 100 ml Essigsäure

100 ml Essigsäure ad 1 l Aqua dest.

ad 1 l Aqua dest.

3.7.10 Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf Nitrocellulosemembranen (Western-Blot)

Beim Western-Blot werden die aufgetrennten Proteingemische aus der Polyacrylamid-

matrix über ein senkrecht zum Gel angelegtes elektrisches Feld auf eine

Nitrocellulosemembran transferiert. An der Membranoberfläche bleiben diese aufgrund

hydrophober Wechselwirkungen haften, so dass das Muster der elektrophoretischen

Auftrennung erhalten bleibt. Der Transfer der Proteine erfolgte über das Tank-Blot

Verfahren für 90 min bei 400 mA und 4 °C.

Blotpuffer:

9,1 g Tris

43,2 g Glycin

600 ml Methanol p.a.

ad 3 l Aqua dest.

3.7.11 Proteinfärbung mit Ponceau S

Membranen, die für Immunodetektionen verwendet wurden, konnten mit Ponceau S

reversibel angefärbt werden, um das Gesamtprotein-Profil zu überprüfen. Dazu wurden

die Membranen 5 min bei Raumtemperatur in Ponceau S geschwenkt und mit TBST so

lange entfärbt, bis das Proteinbandenmuster in geeignetem Kontrast sichtbar wurde. Für

die weitere Verwendung wurden die Membranen in TBST vollständig wieder entfärbt.


10x TBS pH 7,5: 1x TBST:

60,5 g Tris 100 ml 10x TBS pH 7,5

87,6 g NaCl 3 ml Tween 20


Ponceau S-Lösung:

0,5 g Ponceau S

1 ml Essigsäure

ad 100 ml Aqua dest.

3.7.12 Immundetektion von Proteinen

Nach dem Transfer der Proteine auf die Nitrocellulosemembran wurden diese für eine

Stunde bei Raumtemperatur in Block-Puffer geschwenkt, um freie Bindungsstellen

abzusättigen. Die Inkubation mit den entsprechenden Konzentrationen des ersten

Antikörpers gegen das gewünschte Protein erfolgte über Nacht bei 4 °C in

10 ml Block-Puffer auf dem Schwenktisch. Nicht gebundener Antikörper wurde durch

dreimaliges 10 minütiges Waschen mit TBST entfernt. Der zweite, Peroxidase-gekoppelte

Antikörper war gegen die IgGs des ersten Antikörpers gerichtet. Diese Inkubation erfolgte

in Block-Puffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nicht gebundener Antikörper wurde

durch dreimaliges 10 minütiges Waschen mit TBST entfernt. Die Membranen wurden mit

Super Signal West Pico (Femto) Luminol/Enhancer Solution und Super Signal West Pico

(Femto) Stable Peroxide Buffer (1:1) der Firma PIERCE benetzt, mit Klarsichtfolie bedeckt

und die Chemilumineszenz auf einem Röntgenfilm festgehalten.

10x TBS pH 7,5: 1x TBST:

60,5 g Tris 100 ml 10x TBS pH 7,5



Block-Puffer:

1 g Magermilchpulver

ad 10 ml 1x TBST


3.7.13 Affinitätsaufreinigung von Antikörpern

Um Kontaminationen und damit verursachte unspezifische Bindungen eines Antikörpers

bei der Immunodetektion zu entfernen, wurde dieser mit Hilfe des „Affi-Gels 15“ der Firma

Biorad aufgereinigt. Dazu wurde 0,1 ml Affi-Gel in einem 1,5 ml-Reaktionsgefäß zweimal

mit eiskaltem Aqua dest. gewaschen. Die Zentrifugationsschritte für das Waschen

erfolgten für 30 sec bei 6000 rpm. Danach erfolgte die Bindung von 1 mg nativ

aufgereinigtem Protein, gegen das der Antikörper gerichtet war, in einem Volumen von

400 μl an die Affi-Gel Agarose durch Invertieren für vier Stunden bei 4 °C. Zuvor musste

das Protein gegen 50 mM Hepes (pH 8,0) dialysiert werden, um das bei der Bindung an

das Affi-Gel störende Imidazol des Elutionspuffers zu entfernen. Die Affi-Gel Agarose

wurde bei 6000 rpm und 4 °C für 30 sec abzentrifugiert und vom Überstand zur Kontrolle

der Bindung des Proteins eine Proteinbestimmung gemacht. Die Absättigung der

Bindestellen erfolgte durch Zugabe von 400 μl 1 M Ethanolamin (pH 8,0) und Invertieren

für 1 Stunde bei 4 °C. Danach wurde die Affi-Gel Agarose dreimal mit 0,5 ml eiskaltem

TBS gewaschen. Für die Bindung des Antiserums wurde zunächst ein Aliquot von 1,5 ml

für 30 min bei 56 °C inaktiviert und sofort auf Eis abgekühlt. Nach der Zentrifugation

(2 min, 14000 rpm) wurde der Überstand zu der vorbereiteten Agarose gegeben und über

Nacht bei 4 °C invertiert. Das Affi-Gel wurde abzentrifugiert und der Überstand zur

Kontrolle der Bindung des Antiserums aufbewahrt. Danach wurde die Agarose zweimal

mit 0,5 ml eiskaltem TBS und zweimal mit 0,5 ml 500 mM NaCl in 20 mM Tris (pH 7,5)

gewaschen. Die Elution des gebundenen Antiserums erfolgte zunächst fünfmal mit 250 μl

100 mM Glycin (pH 2,5). Die Eluate wurden sofort in 1,5 ml-Reaktionsgfäße, die mit 21 μl

1 M Tris und 25 μl 5 mg/ml BSA vorbereitet waren, überführt. Nach dem Waschen der

Affi-Gel Agarose mit zweimal 0,5 ml 50 mM Tris (pH 8,5) erfolgte der nächste

Elutionsschritt fünfmal mit 250 μl 100 mM Ethanolamin (pH 11,5). Die Eluate wurden

sofort in 1,5 ml-Reaktionsgfäße, die mit 25 μl 1 M Tris (pH 7,5) und 25 μl 5 mg/ml BSA

vorbereitet waren, überführt. Danach wurde noch zweimal mit 0,5 ml TBS gewaschen und

der letzte Elutionsschritt fünfmal mit 250 μl 3,5 M MgCl2 in 20 mM Tris (pH 7,5)

durchgeführt. Das Affi-Gel wurde mit TBS gewaschen und bei 4 °C aufbewahrt. Zur

Kontrolle der Aufreinigung wurde zunächst das Antigen über SDS-PAGE aufgetrennt und

ein Western-Blot mit einer 1:100 Verdünnung der Eluate durchgeführt. Anhand des

Western-Blots konnten die Bedingungen und Eluate bestimmt werden, mit denen das

Antiserum von den Beads eluiert werden konnte.


3.7.14 In vitro Transkription

Über die in vitro Transkription konnten Gene, die im pSS-Vektor der Regulation durch

einen SP6-Promotor unterlagen, transkribiert werden. Der Reaktionsansatz von 50 µl

setzte sich aus 40 Units RNase-Inhibitor, 20 Units SP6-Polymerase, 5 μl NT-Mix mit CAP,

10 μl 5x Transkriptionspuffer und 5 µg Plasmid-DNA (in 10 µl DEPC-Wasser) zusammen

und wurde für 30 min bei 37 °C inkubiert. Danach wurde der Ansatz mit 50 μl 10 M

Ammoniumacetat und 100 μl DEPC-Wasser auf eine Endkonzentration von 2,5 M

Ammoniumacetat eingestellt. Nach der Extraktion mit 200 μl Phenol/Chloroform

(1:1, sauer) wurde die wässrige Phase abgenommen und die mRNA durch Zugabe von

400 μl eiskaltem Ethanol für 30 min bei -20 °C gefällt. Die mRNA wurde für 15 min bei

14000 rpm und 4 °C abzentrifugiert, das Pellet in 70%igem eiskaltem Ethanol gewaschen,

getrocknet und in 60 μl DEPC-Wasser aufgenommen.

NT-Mix: NT-Mix mit CAP:

5 μl 100 mM GTP 233 μl NT-Mix

50 μl 100 mM CTP 25 Units CAP (Natrium-

50 μl 100 mM ATP Diguanosintriphosphat)

50 μl 100 mM UTP

ad 1 ml Aqua dest.

3.7.15 In vitro Translation

Die in vitro Translation wurde über das Weizenkeimlysat-System der Firma Promega

durchgeführt, um sowohl radioaktiv markierte Proteine als auch nicht markierte Proteine

zu erhalten. Dazu wurden 12 μl der in vitro transkribierten mRNA bei 68 °C für 10 min

denaturiert und auf Eis abgekühlt. Das Weizenkeimlysat wurde für 5 min bei 6500 rpm

und 4 °C zentrifugiert und der Überstand weiter verwendet. Der Translationsansatz setzte

sich aus 20 μl Weizenkeimlysat, 4 μl Aminosäuremix ohne Methionin, 40 Units RNase-

Inhibitor, 5 μl 1 M Kaliumacetat, 12 μl mRNA und 2 μl [35S]-Methionin bzw. 8 µl

unmarkiertem Methionin (10 mM) zusammen. Die Translation erfolgte für 90 min bei 25

°C. Zur Translationskontrolle wurde 1 μl radioaktiv markiertes bzw. 5 µl nicht markiertes

Translationsprodukt über SDS-PAGE aufgetrennt und mit anschließender

Autoradiographie bzw. Immundetektion überprüft.


3.7.16 In vitro Expression mit RTS 100 Wheat Germ

Über das RTS 100 Wheat Germ Kit der Firma Roche konnten Gene, die im pIVEX1.3WG-

Vektor der Regulation durch einen T7-Promotor unterlagen, in einem Schritt und in

größerer Ausbeute transkribiert und translatiert werden. Dazu mussten zunächst die

Komponenten des Kits in folgenden Volumina des Rekonstitutionspuffers gelöst werden:

Wheat Germ (in 140 µl Rekonstitutionspuffer), Reaktionsmix (in 140 µl

Rekonstitutionspuffer), Feeding Mix (in 7,7 ml Rekonstitutionspuffer), Aminosäuren (in

800 µl Rekonstitutionspuffer) und Methionin (in 2,2 ml Rekonstitutionspuffer). Daraufhin

wurden die folgenden Reaktionslösungen angesetzt:

Feeding-Lösung:

900 µl Feeding Mix

80 µl Aminosäuren

20 µl Methionin

Reaktions-Lösung:

15 µl Reaktionsmix

4 µl Aminosäuren

1 µl Methionin

15 µl Wheat Germ

4 µg DNA

ad 50 µl RNase/DNase freies Wasser

Die Reaktions-Lösung wurde in die durch einen roten Ring gekennzeichnete Kammer

eingefüllt und die Feeding-Lösung in die benachbarte Kammer. Die Öffnungen der

Kammern wurden mit Parafilm verschlossen und die Ansätze für 24 Stunden bei 24 °C

und 900 rpm inkubiert. Das Translationsprodukt wurde aus der mit einen roten Ring

gekennzeichnete Kammer in ein frisches Reaktionsgefäß überführt. Zur

Translationskontrolle wurde 1 μl Translationsprodukt über SDS-PAGE aufgetrennt und mit

anschließender Immundetektion überprüft.

3.7.17 Pull down Experiment

Mit Hilfe des pull down Experiments sollte die in vitro Interaktion von His-Fusionsproteinen

mit in vitro Translationsprodukten analysiert werden. Dazu wurden 5 µg eines His-

Fusionsproteins, 15 µl Proteaseinhibitor (7x Stocklösung complete Mini Protease Inhibitor

Cocktail Tablets) und gleiche Mengen verschiedener in vitro Translationsprodukte mit


Inkubationspuffer auf ein Volumen von 100 µl gebracht und für 30 min bei

Raumtemperatur auf dem Drehrad inkubiert. Danach wurden 20 µl Ni-NTA beads zu den

Ansätzen gegeben und diese weitere 30 min bei Raumtemperatur auf dem Drehrad

belassen, um das His-Fusionsprotein gemeinsam mit dem möglichen Interaktionspartner

an die beads zu binden. Anschließend wurden die beads in Wizard Minisäulen

abzentrifugiert und dreimal mit je 200 µl Waschpuffer gewaschen, um nicht gebundene

Proteine zu entfernen. Die Elution erfolgte nach 10 minütiger Inkubationszeit mit 30 µl

Elutionspuffer. Zusammen mit dem His-Fusionsprotein coeluiertes Translationsprodukt

wurde, nach Auftrennung der Proben über SDS-PAGE, mittels Immundetektion

nachgewiesen.

Inkubationspuffer pH 8,0: Waschpuffer pH 8,0:

50 mM HEPES 50 mM HEPES

10 mM MgCl2 300 mM NaCl

1 mM DTT

20 mM Imidazol

Elutionspuffer pH 8,0:

50 mM HEPES

300 mM NaCl

1 mM DTT

250 mM Imidazol

3.7.18 Peptide-Scanning

Die Methode des Peptide-Scanning wurde genutzt, um die Bindestelle eines Proteins für

ein anderes Protein zu identifizieren. Dazu wurde eine PepSpot-Membran bestellt

(PepSpots, JPT Peptide Technologies, Berlin), auf der pro spot 15 Aminosäuren lange

Peptide des einen Proteins verlinkt sind. Die nebeneinander liegenden spots sind jeweils

um 3 andere Aminosäuren versetzt aufgetragen. Die Membran wurde mit einem

rekombinanten Protein inkubiert, dessen Bindestelle auf der PepSpot-Membran somit

analysiert werden konnte.

3.7.18.1 Bindung des rekombinanten Proteins an die PepSpot-Membran

Alle folgenden Inkubations- und Waschschritte wurde auf dem Schwenktisch

durchgeführt. Die PepSpot-Membran wurde zunächst für 1 min in einer Petrischale mit

Ethanol inkubiert und dreimal 10 min mit TBS (I) gewaschen. Danach wurde die Membran


in 10 ml Blockpuffer für 3 Stunden bei Raumtemperatur geblockt, um unspezifische

Bindungen zu vermeiden. Nach dem Waschen der Membran mit TBST (I) für 10 min,

erfolgte die Inkubation mit 50 µg rekombinantem Protein in 10 ml Blockpuffer für zunächst

2 Stunden bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4 °C. Daraufhin wurde die

Membran dreimal 1 min mit TBST (II) gewaschen und das gebundene rekombinante

Protein konnte über einen elektrophoretischen Transfer auf eine PVDF-Membran

transferiert werden.

TBS (I) pH 8,0: TBST (I):

50 mM Tris TBS pH 8,0

137 mM NaCl 0,05 % Tween 20

2,7 mM KCl

10x TBS (II) pH 7,5: 1x TBST (II):

60,5 g Tris 100 ml 10x TBS pH 7,5



Blockpuffer:

TBST (II)

3 % BSA

3.7.18.2 Elektrophoretischer Transfer eines rekombinanten Proteins von der PepSpot-Membran auf eine PVDF-Membran

Um das an die PepSpots gebundene, rekombinante Protein auf eine PVDF-Membran zu

transferieren wurde das Semi-Dry Blotverfahren durchgeführt. Zunächst wurde die PVDF-

Membran kurz in Methanol und dann für 10 min in Anodenpuffer I geschwenkt. Vor dem

Blotverfahren wurden je 2 Stücke Blotting Papier in Kathodenpuffer, Anodenpuffer I und

Anodenpuffer II äquilibriert. Der Aufbau des Blots erfolgte nach folgender Anordnung:

Anode

2x Blotting Papier in Anodenpuffer II

2x Blotting Papier in Anodenpuffer I

PVDF-Membran

PepSpot-Membran

2x Blotting Papier in Kathodenpuffer

Kathode


Der Proteinfransfer erfolgte in drei aufeinander folgenden Blotverfahren. Es wurden zwei

Blotschritte für je 30 min und der letzte Blotschritt für 1 Stunde bei 1 mA/cm2 durchgeführt,

wobei jeweils die PVDF-Membran und das Blotting Papier gewechselt wurden. Die PVDF-

Membranen wurden zunächst in TBST (II) aufbewahrt und schließlich zweimal für 10 min

mit TBST (II) gewaschen. Das Blocken der Membranen erfolgte in je 10 ml Blockpuffer für

3 Stunden bei Raumtemperatur. Die Inkubation mit dem ersten Antikörper gegen das auf

die PVDF-Membranen transferierte, rekombinante Protein und die anschließende

Immundetektion erfolgte wie in Kapitel (Immundetektion von Proteinen) beschrieben.

Anhand der auf dem Röntgenfilm detektierten spots konnte die Bindestelle des

rekombinanten Proteins auf der PepSpot-Membran zugeordnet werden.

Anodenpuffer I: Anodenpuffer II:

30 mM Tris 300 mM Tris

20 % Methanol 20 % Methanol

Kathodenpuffer (pH 9,2): Blockpuffer:

25 mM Tris TBST (II)

40 mM 6-Aminohexansäure 3 % BSA

20 % Methanol

10x TBS (II) pH 7,5: 1x TBST (II):

60,5 g Tris 100 ml 10x TBS pH 7,5



3.7.18.3 Regeneration der PepSpot-Membran

Zur Regeneration und damit Wiederverwendung der PepSpot-Membran wurde diese

zunächst dreimal für 10 min mit Aqua dest. bei Raumtemperatur und daraufhin viermal

für 30 min mit Regenerationspuffer bei 50 °C gewaschen. Im Anschluss erfolgten drei

Waschschritte für je 20 min mit 10x PBS, drei Waschschritte für je 20 min mit TBST (I)

und drei weitere Waschschritte für je 10 min mit TBS (I) bei Raumtemperatur. Um zu

überprüfen, ob die regenerierte Membran frei von rekombinantem Protein ist, erfolgte ein

Semi-Dry Blotverfahren von der PepSpot-Membran auf PVDF-Membranen wie bereits in

Kapitel 3.7.18.2 beschrieben. Das Ausbleiben von spots auf dem Röntgenfilm nach einer

Immundetektion gegen das zuvor eingesetzte rekombinante Protein zeigte den Erfolg der

Regeneration der PepSpot-Membran.


Regenerationspuffer: 1x PBS (pH 7,2):

62,5 mM Tris 9,2 mM Na2HPO4 x 12 H2O

2 % SDS 1,6 mM NaH2PO4 x H2O

mit HCl auf pH 6,7 einstellen 150 mM NaCl

70 µl β-Mercaptoethanol/10 ml Puffer

TBS (I) pH 8,0: TBST (I):

50 mM Tris TBST pH 8,0

137 mM NaCl 0,05 % Tween 20

2,7 mM KCl

3.7.19 Präparation von Thylakoidmembranen aus Arabidopsis thaliana

Für die Präparation von Thylakoidmembranen wurden 20 g Blattmaterial von fünf Wochen

alten Pflanzen geerntet und die Blätter im Mixer (Warring Blender) mit 3 kurzen Intervallen

in 400 ml frisch angesetztem Homogenisierungspuffer zerschlagen. Wichtig für die

Aufarbeitung war, dass alle Arbeitsschritte im Kühlraum bzw. auf Eis mit kalten Puffern

stattfanden. Die groben Gewebeteile wurden durch das Filtrieren über 2 Lagen Miracloth

abgetrennt und das Filtrat für 5 min bei 4000 rpm und 4 °C abzentrifugiert. Das Pellet

wurde vorsichtig mit einem Haarpinsel in 40 ml SH-Puffer resuspendiert. Nach erfolgter

Zentrifugation (5 min, 4000 rpm, 4 °C) wurde das Pellet in 15 ml HM-Puffer resuspendiert

und 5 min auf Eis inkubiert, um die Chloroplasten osmotisch aufzuschließen. Die

Thylakoidmembranen wurden zentrifugiert und in 10 ml HM-Puffer für eine

Chlorophyllbestimmung aufgenommen. Anschließend wurden die Membranen pelletiert

und in 20 mM HEPES (pH 8) auf eine Chlorophyllkonzentration von 2 mg Chlorophyll/ml

eingestellt.

Homogenisierungspuffer: SH-Puffer:

330 mM Sorbitol 330 mM Sorbitol

50 mM HEPES pH 8,0 50 mM HEPES pH 8,0

10 mM EDTA pH 8,0

0,05 % BSA

5 mM Ascorbinsäure

HM-Puffer:

10 mM HEPES pH 8,0

5 mM MgCl2


3.7.19.1 Chlorophyllbestimmung

Für die Chlorophyllbestimmung wurden 20 μl der Thylakoidmembranen in 980 μl

80 %igem Aceton durch Vortexen gelöst und die unlösliche Komponenten durch

Zentrifugation für 2 min bei 14000 rpm entfernt. Die Absorption des Überstandes wurde im

Photometer bei 645 nm und 663 nm gegen einen Leerwert von 80 %igem Aceton

gemessen. Die Berechnung des Chlorophyllgehaltes erfolgte nach:

( ) 5002,82,20 663645 ××+×=⎥⎦⎤

⎢⎣⎡ AAmlgμ

3.7.19.2 Salzwaschung der Thylakoidmembranen

Die isolierten Thylakoidmembranen von Arabidopsis thaliana wurden pelletiert (5 min,

4000 rpm, 4 °C) und im gleichen Volumen Salzwaschpuffer resuspendiert. Nach einem

erneuten Waschschritt mit Salzwaschpuffer und IBM-Puffer, wurde das Pellet in dem

Ausgangsvolumen mit IBM-Puffer aufgenommen.

Salzwaschpuffer: IBM-Puffer:



1 M Kaliumacetat 10 mM MgCl2

3.7.19.3 Solubilisierung der Thylakoidmembranen

Für die Solubilisierung der Thylakoidmembranen wurden gleiche Mengen kaltem

2x Detergenzpuffer und Thylakoidmembranen (2 mg Chlorophyll/ml) gemischt und für

30 min auf Eis inkubiert. Nach erfolgter Zentrifugation (14000 rpm, 15 min, 4 °C) wurden

die solubilisierten Proteine aus dem Überstand in ein frisches Reaktionsgefäß überführt

und standen für weitere Versuche zur Verfügung.

2x Detergenzpuffer: (frisch ansetzen)

3 % Detergenz (Dodecyl-β-D-maltosid, Digitonin)

400 mM NaCl

2 mM PMSF

20 mM HEPES


3.7.20 Crosslinking der Thylakoidmembranproteine von Arabidopsis thaliana

Für die Crosslinking Versuche wurden 500 µl Thylakoidmembranen (0,2 mg

Chlorophyll/ml) in IBM-Puffer auf eine Endkonzentration der Crosslinking-Reagenzien von

0,6 mM gebracht und für 30 min bei 25 °C auf dem Drehrad inkubiert. Danach wurden die

Membranen zentrifugiert (4000 rpm, 5 min, 4 °C), zweimal mit Waschpuffer gewaschen

und das Pellet in 200 µl SDS-Probenpuffer aufgenommen.

IBM-Puffer: Waschpuffer:



10 mM MgCl2 1 M KAc

3.7.21 Coimmunpräzipitation

3.7.21.1 Kopplung des Antikörpers an Protein-A-Sepharose beads

Zur Coimmunpräzipitation der Thylakoidmembranproteine wurden zunächst 10 mg

Protein-A-Sepharose beads in 1 ml TBS für 30 min bei Raumtemperatur im Drehinkubator

äquilibriert, kurz anzentrifugiert und der Überstand verworfen. Die beads wurden in 200 µl

Antikörperserum aufgenommen, mit TBS auf 800 µl aufgefüllt und über Nacht bei 4 °C auf

dem Drehinkubator belassen. Danach wurden die beads anzentrifugiert und dreimal mit

1 ml Borat-Puffer gewaschen. Zur Kontrolle der darauf folgenden Kopplung wurden 10 µl

der Ansätze entnommen. Die Kopplung des Antikörpers erfolgte in einer

Dimethylpimelimidat-Endkonzentration von 20 mM für 30 min bei Raumtemperatur im

Drehinkubator. Danach wurden erneut 10 µl der Ansätze entnommen und die Proben (vor

und nach der Kopplung) durch eine SDS-PAGE mit anschließender Coomassie-Färbung

auf ausreichende Verringerung der freien IgGs überprüft. Die beads wurden sedimentiert

und mit 1 ml 0,2 M Tris (pH 8,0) gewaschen. Eine anschließende 30 minütige Inkubation

in 1 ml 0,2 M Tris (pH 8,0) diente dem Quenchen des überschüssigen Crosslinkers. Die

beads wurden sedimentiert, in 1 ml 0,3 M Essigsäure aufgenommen und die freien IgGs

für 5 min bei Raumtemperatur im Drehinkubator entfernt. Die Neutralisation der

Essigsäure erfolgte durch zweimaliges Waschen mit 1 ml 0,2 M Tris (pH 8,0). Die mit

Antikörpern gekoppelten Protein-A Sepharose beads wurden in 300 µl 0,2 M Tris (pH 8,0)

aufgenommen und konnten bei 4 °C gelagert werden.


10x TBS: Borat-Puffer (pH 9,0):

60,5 g Tris 12,37 g Borsäure

87,6 g NaCl ad 800 ml Aqua dest.

ad 1 l Aqua dest. pH einstellen mit 10 M NaOH

ad 1 l Aqua dest.

3.7.21.2 Präzipitation

Für die Präzipitation wurden Thylakoidmembranen von Arabidopsis thaliana mit 1,5 %

Digitonin bzw. Dodecyl-β-D-maltosid solubilisiert und 1:1 in 1x Detergenzpuffer (ohne

Detergenz) verdünnt. Des weiteren wurden 300 µl mit Antikörper gekoppelte Protein-A-

Sepharose (PAS) beads sedimentiert und der Überstand entfernt. Die beads wurden in

1 ml solubilisierter, verdünnter Thylakoidmembranen (0,5 mg Chlorophyll/ml)

aufgenommen. Zur Antikörperbindung wurde der Ansatz auf dem Drehrad für eine Stunde

bei 4 °C inkubiert. Die PAS-beads wurden zweimal mit 1 ml kaltem Waschpuffer im batch

gewaschen, in Wizard-Mini-Säulen überführt und abzentrifugiert. Zur Elution wurden die

Ansätze mit 30 µl 4x SDS-Probenpuffer für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und

abzentrifugiert. Die Auswertung erfolgte über SDS-PAGE mit anschließender

Immundetektion.

1x Detergenzpuffer (ohne Detergenz): Waschpuffer:

200 mM NaCl 20 mM HEPES pH 8,0

1 mM PMSF 80 mM NaCl

10 mM HEPES pH 8,0

3.7.22 Thylakoidmembran-Bindungstest

Um die Proteininteraktionen zwischen rekombinanten Proteinen und isolierten

Thylakoidmembranen zu analysieren, wurden die Thylakoidmembranen zunächst durch

Salzwaschung (3.7.19.2) von peripher gebundenen Proteinen befreit. Für den

Bindungstest wurden 25 µl salzgewaschene Thylakoidmembranen (2 mg Chlorophyll/ml)

mit 2 µg rekombinantem Protein gemischt und auf ein Volumen von 200 µl mit IBM-Puffer

aufgefüllt. Die Inkubation des rekombinanten Proteins mit den Membranen erfolgte für

30 min bei 4 °C auf dem Drehrad. Anschließend wurden die Membranen pelletiert (5 min,

4000 rpm, 4 °C) und nicht gebundenes Protein durch zweimaliges Waschen der

Membranen mit je 200 µl Waschpuffer entfernt. Nach den Waschschritten wurden die

Thylakoidmembranen in 80 µl 4x SDS-Probenpuffer resuspendiert. Die Bindung der


rekombinanten Proteine an die Membranen konnte über eine SDS-PAGE mit

anschließender Immundetektion nachgewiesen werden.




10 mM MgCl2 10 mM MgCl2

1 M NaCl

3.7.23 Thylakoidmembran-Bindungstest mit Peptidinhibierung

Um die Bedeutung einer bestimmten Bindestelle zwischen einem rekombinanten Protein

und einem Protein der Thylakoidmembran zu bestätigen, wurde ein synthetisches Peptid

eingesetzt. Dazu wurden 2 µg des rekombinanten Proteins und 250 µg bzw. 500 µg des

Peptids auf ein Volumen von 175 µl mit IBM-Puffer aufgefüllt und für 30 min bei 4 °C auf

dem Drehrad vorinkubiert. Danach wurden den Ansätzen 25 µl salzgewaschene

Thylakoidmembranen hinzugefügt und erneut für 30 min bei 4 °C auf dem Drehrad

inkubiert. Anschließend wurden die Membranen pelletiert (5 min, 4000 rpm, 4 °C) und

nicht gebundenes Protein durch zweimaliges Waschen der Membranen mit je 200 µl

Waschpuffer entfernt. Nach den Waschschritten wurden die Thylakoidmembranen in 80 µl

4x SDS-Probenpuffer resuspendiert. Die Bindung der rekombinanten Proteine an die

Membranen konnte über eine SDS-PAGE mit anschließender Immundetektion

nachgewiesen werden.




10 mM MgCl2 10 mM MgCl2

1 M NaCl

3.7.24 Expressionsnachweis der YFP-Fusionsproteine in Arabidopsis thaliana Protoplasten

Für den Expressionsnachweis der YFP-Fusionsproteine wurden 4 ml Arabidopsis thaliana

Protoplasten (2x105/ml) mit 240 µg Plasmid-DNA transfiziert und für 16-18 Stunden

inkubiert. Die Protoplasten wurden pelletiert (1500 rpm, 5 min, 4 °C) und in 400 µl HM-

Puffer und 40 µl Proteaseinhibitor (7x Stocklösung complete Mini Protease Inhibitor

Cocktail Tablets) für 3 min auf Eis lysiert. Nach der Zentrifugation (14000 rpm, 5 min,


4 °C) wurde der Überstand abgenommen und einer Trichloressigsäure-Präzipitation

unterzogen. Im Anschluss erfolgte das Waschen des Pellets mit 400 µl 0,2 M NaOH und

eine erneute Zentrifugation (14000 rpm, 5 min, 4 °C). Der Überstand (Waschfraktion)

wurde ebenfalls einer Trichloressigsäure-Präzipitation unterzogen und das Membranpellet

in 10 µl SDS-Probenpuffer aufgenommen. Die Proteine des Membranpellets, des

Überstands und der Waschfraktion wurden über eine SDS-PAGE aufgetrennt und eine

Immundetektion durchgeführt. Die Proteinexpression der YFP-Fusionsproteine konnte

über die Immundetektion mittels eines anti-HA Antikörpers für die cYFP-Fusionsproteine

und eines anti-c-myc Antikörpers gegen die nYFP-Fusionsproteine nachgewiesen

werden.

HM-Puffer:

10 mM HEPES pH 8,0

5 mM MgCl2

3.7.25 Trichloressigsäure-Präzipitation

Das Aufkonzentrieren von Proteinen erfolgte durch Zugabe von einem zehntel Volumen

100 %iger Trichloressigsäure (TCA) zur Proteinlösung mit anschließender Inkubation für

30 Minuten auf Eis. Nach einer Zentrifugation (14000 rpm, 5 min, 4 °C) wurde das

Proteinpellet in 200 µl 10 %iger TCA aufgenommen, für 10 min auf Eis inkubiert und

erneut zentrifugiert (14000 rpm, 5 min, 4 °C). Anschließend wurde der Überstand

abgenommen, das Pellet in 10 µl 4x SDS-Probenpuffer aufgenommen und bis zum

Farbumschlag mit 1 M Tris titriert.

3.8 Biophysikalische Methoden

3.8.1 Massenspektrometrie

Die massenspektrometrische Proteinsequenzierung erfolgte mittels eines Q-TOF

Massenspektrometers. Dazu wurde die entsprechende Proteinbande aus einem

Polyacrylamidgel ausgeschnitten und entfärbt. Es folgte der enzymatische Verdau über

Trypsin und die Elution der Peptide aus dem Gel. Nach Einkonzentrieren der Peptide

standen diese für die Proteinsequenzierung zur Verfügung. Die anschließende


Auswertung der Proteinsequenzierung erfolgte über Mascot (Matrix Science,

http://www.matrixscience.com/search_form_select.html).

3.8.2 Gelfiltration

Die Gelfiltration ist ein chromatographisches Verfahren, bei dem die Trennung der

Proteine aufgrund unterschiedlicher Teilchengröße erfolgt. Das Säulenmaterial enthält

Poren, die von den Molekülen passiert werden müssen. Die Proteine und

Proteinkomplexe diffundieren in einem konstanten Laufmittelfluss anhand ihrer Größe

unterschiedlich schnell durch das Säulenmaterial. Kleine Moleküle durchlaufen die Säule

langsamer. Es kommt zur Fraktionierung der aufgrund ihrer Größe aufgetrennten

Proteine.

3.8.2.1 Eichung der Gelfiltrationssäule

Die Chromatographiesäule wurde mit dem Gelfiltrationspuffer bei einer Flussrate von

0,2 ml/min über 20 Stunden äquilibriert. Darauf erfolgte die Eichung der Säule mit sechs

Markerproteinen (je 500 µl) nach folgendem Programm:

Eichprogramm:

0-10 ml Äquilibrierung mit Gelfiltrationspuffer

10-12 ml Injektion der Eichlösung

15-135 ml Elution

Flussrate: 0,5 ml/min

Folgende Proteine wurden zur Eichung verwendet:

1. Dextran blue (1 mg/ml) Ausschlussvolumen

2. Thyroglobulin 669 kDa

3. Apoferritin 443 kDa

4. ß-Amylase 200 kDa

5. Alkoholdehydrogenase 150 kDa

6. BSA 66 kDa

Über die Elution der Proteine, die vom Detektor bei 280 nm gemessen wurde, konnte das

Ausschlussvolumen bestimmt und eine Eichgerade erstellt werden.


3.8.2.2 Gelfiltration der solubilisierten Thylakoidmembranproteine

Die solubilisierten Thylakoidmembranproteine (500 µl, 1 mg Chlorophyll/ml) wurden filtriert

und über eine Superose 6 10/300 GL Säule nach folgendem Programm aufgetrennt.

Gelfiltrationsprogramm:


10-12 ml Injektion der Probe

18-38 ml Fraktionierung von je 1 ml


Flussrate: 0,4 ml/min

Die erhaltenen Fraktionen wurden zu je 1 ml aufgefangen. Aliquots von 75 µl der

Fraktionen wurden über eine SDS-PAGE aufgetrennt und die Proteine in einer

anschließenden Immundetektion nachgewiesen.

Gelfiltrationspuffer, entgast und filtriert:

20 mM HEPES pH 8,0

200 mM NaCl

0,1 % Dodecyl-β-D-maltosid

4 Ergebnisse 63

4. Ergebnisse

4.1 Herstellung spezifischer Antikörper gegen Alb3 und Alb4

Um die beiden homologen Proteine Alb3 und Alb4 in biochemischen Untersuchungen

getrennt voneinander nachweisen zu können, mussten zunächst spezifische Antikörper

gegen diese Proteine hergestellt werden. Es lag bereits ein spezifischer Antikörper gegen

Alb4 (generiert in Kaninchen) vor, der in Gerdes et al., 2006 beschrieben wurde.

Ausgehend von dem Antigen, welches für diesen Antikörper genutzt wurde, sollte nun das

gleiche Antigen für die Herstellung eines Alb4 Antikörpers in Ratte dienen. Die Herstellung

eines zweiten Antikörpers in einem anderen Organismus wurde besonders für die

Coimmunpräzipitationsanalysen wichtig und wird an der entsprechenden Stelle dieser

Arbeit näher erläutert.

Des Weiteren sollte ein spezifischer Antikörper gegen Alb3 (generiert in Kaninchen)

hergestellt werden. Die Proteine Alb3 und Alb4 zeigen eine Ähnlichkeit von 72 % und eine

Identität von 55 %. In einem Alignment der Proteinsequenzen von Alb3 und Alb4

(Abbildung 4-1) sind die Antigensequenzen markiert, die für die Antikörperherstellung

ausgewählt wurden. Bei dem Alb4 Antikörper wurde das bereits erwähnte Antigen des

C-terminalen Bereichs von Alb4 verwendet (AS 347-494). Entscheidend für die

Gewinnung von spezifischen Antikörpern ist es, einen Bereich des Proteins für das

Antigen auszuwählen, welcher zu dem anderen Protein nicht so homolog ist. Die Proteine

Alb3 und Alb4 weisen die geringste Homologie im N-terminalen und C-terminalen Bereich

auf. Daher wurden für die Sequenzen der Antigene von Alb3 die Aminosäuren 56-108 im

N-Terminus (nAlb3) und die Aminosäuren 397-462 im C-Terminus (cAlb3) ausgewählt.

4 Ergebnisse 64

Alb3 MARVLVSSPSSFFGSPLIKPSSSLRHSGVGGGGTAQFLPYRSNNNKLFTTSTTVRFSLNEAlb4 ---------------MSSTISLKPTHLILSSFSTGKVLQFRRSRFSHTPSSSSSRYRTLV . * . * :.. .*.:.* :* .. . .:*:: *: Alb3 IPPFHGLDSSVDIGAIFTRAESLLYTIADAAVVG--ADSVVTTDSSAVQKSGGWFGFISD Alb4 AQLGFRPDS---FDFIKDHAENLLYTIADAAVSSSETFESVAGTTTKTTQSNDWFSGIAN . ** :. * :**.********** . : . *: :: . :*..**. *:: Alb3 AMELVLKILKDGLSAVHVPYAYGFAIILLTIIVKAATYPLTKQQVESTLAMQNLQPKIKA Alb4 YMETILKVLKDGLSTVHVPYSYGFAIILLTVLVKAATFPLTKKQVESAMAMKSLTPQIKA ** :**:******:*****:*********::*****:****:****::**:.* *:*** Alb3 IQQRYAGNQERIQLETSRLYKQAGVNPLAGCLPTLATIPVWIGLYQALSNVANEGLFTEG Alb4 IQERYAGDQEKIQLETARLYKLAGINPLAGCLPTLATIPVWIGLYRALSNVADEGLLTEG **:****:**:*****:**** **:********************:******:***:*** Alb3 FFWIPSLGGPTSIAARQSGSGISWLFPFVDGHPPLGWYDTVAYLVLPVLLIASQYVSMEI Alb4 FFWIPSLAGPTTVAARQNGSGISWLFPFIEGHPPLGWPDTLAYLVLPLLLVFSQYLSIQI *******.***::****.**********::******* **:******:**: ***:*::* Alb3 MKPPQTDDPAQKNTLLVFKFLPLMIGYFALSVPSGLSIYWLTNNVLSTAQQVYLRKLGGA Alb4 MQSSQSNDPAMKSSQAVTKLLPLMIGYFALSVPSGLSLYWLTNNILSTAQQVWLQKYGGA *:..*::*** *.: * *:*****************:******:*******:*:* *** Alb3 KPNMDENASKIISAG---------------------------RAKRSIAQPDDAGERFRQ Alb4 KNPVEKFTNLVTKEDKTQQIEKSFSEPLVQKSVSELKIPREKGGEKVTPECPKPGERFRL * ::: :. : . . .:: .: ..***** Alb3 LKEQEKRSKKNK--------AVAKDTVELVEESQSESEEGSDDEEEEAREGALASSTTSK Alb4 LKEQEAKRRREKEERQKAEAALSNQNTDKAHEQDEKSDTAIVAEDDKKTELSAVDETSDG ***** : :::* *::::..: ..*.:.:*: . *::: * : ...*:. Alb3 PLPEVGQRRSKRSKRKRTV------------------ (462 AS mit TP) Alb4 TVAVNGKPSIQKDETTNGTFGIGHDTEQQHSHETEKR (499 AS mit TP) .:. *: ::.: .. .

Abbildung 4-1: Alignment der Aminosäuresequenz von Alb3 und Alb4 Das Alignment zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von Alb3 und Alb4. Dargestellt

sind die mittels ChloroP (http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/) vorhergesagten Transitpeptide

(TP) für das chloroplastidäre Targeting der Proteine (grün) sowie der maximal vorhergesagte

Bereich der fünf Transmembrandomänen (Aramemnon, http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de/)

(grau hinterlegt). Die in blau gezeigten Sequenzen von Alb3 umfassen die Regionen der Alb3

Antigene nAlb3 (AS 56-108) und cAlb3 (AS 397-462), die zum Zweck der Antikörperherstellung

rekombinant überexprimiert wurden. Die in rot dargestellte Sequenz des Alb4 C-Terminus

beinhaltet den Bereich des Alb4 Antigens (AS 347-494).

4.1.1 Expression der Antigene GST-nAlb3, GST-cAlb3 und cAlb4-his

Für die Herstellung der Antigene von Alb3 wurden die entsprechenden Gensequenzen

des N-terminalen und C-terminalen Bereichs von Alb3 in den Expressionsvektor

pGEX4T3 kloniert und in den Überexpressionsstamm E. coli BL21(DE3) transformiert. Die

Antigene nAlb3 und cAlb3 wurden über diesen Vektor als GST-Fusionsproteine

exprimiert, da die errechnete Größe der Antigene mit 6 kDa (nAlb3) und 7 kDa (cAlb3) für

eine Immunisierung in Kaninchen nicht ausreichend war. Die Aufreinigung der Antigene

von Alb3 erfolgte über den angefügten GST-tag mittels Glutathion-Sepharose. Da für die

vorliegende Arbeit letztendlich lediglich der Antikörper gegen den C-Terminus von Alb3

4 Ergebnisse 65

eingesetzt wurde, ist die Funktionalität des Antikörpers gegen den N-Terminus nicht

abschließend getestet worden. Die Aufreinigung des Antigens GST-cAlb3 wurde über

eine SDS-PAGE mit anschließender Coomassie Färbung überprüft (Abbildung 4-2). Die

errechnete Größe des GST-Fusionsproteins beträgt 33 kDa und stimmt mit dem

tatsächlichen Laufverhalten bei 37 kDa gut überein. Eine weitere Proteinbande auf Höhe

von 32 kDa lässt auf ein Abbauprodukt des Proteins schließen. Das Problem des

Proteinabbaus bei rekombinant exprimiertem Alb3 Protein war bereits aus vorherigen

Versuchen im Labor bekannt. Die Gensequenz des Antigens von Alb4 (cAlb4) lag bereits

in dem Expressionsvektor pET29b in dem E. coli Überexpressionsstamm BL21(DE3) vor

(Gerdes et al., 2006). Nach der Überexpression erfolgte die Aufreinigung des Proteins

unter denaturierenden Bedingungen über den angefügten C-terminalen His-tag mittels Ni-

NTA Agarose. Anhand der Expressionskontrolle über SDS-PAGE mit anschließender

Coomassie Färbung zeigte sich ein zu der errechneten Größe des Proteins von 19 kDa

abweichendes Laufverhalten, das bei 26 kDa lag und bereits in Gerdes et al., 2006

beschrieben wurde (Abbildung 4-2). Nach erfolgter Aufreinigung wurden die Antigene

gegen PBS dialysiert und je 800 µg lyophilisiertes Protein zur Standardimmunisierung von

Kaninchen und Ratte an die Firma SeqLab (Göttingen) verschickt.

4.1.2 Test der Antikörper α-Alb3 und α-Alb4 gegen die Antigene

Nach Erhalt der Antiseren α-Alb3 (aus Kaninchen) und α-Alb4 (aus Ratte) wurden diese

zunächst gegen die Antigene getestet. Zu diesem Zweck wurde der GST-tag des cAlb3

Antigens durch Thrombin abgespalten und die erfolgreiche Abspaltung über eine SDS-

PAGE mit anschließender Coomassie Färbung überprüft (Abbildung 4-2). Nach dem

Thrombinverdau ist sowohl das 26 kDa große GST-Protein, als auch eine unterhalb von

17 kDa laufende Bande des abgespaltenen cAlb3 zu erkennen. Für den Antikörpertest

wurden das GST-cAlb3 Fusionsprotein, das gespaltene GST/cAlb3 Proteingemisch und

das cAlb4-his Protein über eine SDS-PAGE aufgetrennt und eine Immundetektion mit den

beiden Seren α-Alb3 (aus Kaninchen) und α-Alb4 (aus Ratte) durchgeführt. Mit dem

α-Alb3 Antikörper konnten das GST-cAlb3 Fusionsprotein und die durch Thrombin-

spaltung erhaltenen GST und cAlb3 Proteine detektiert werden. In der Spur, in der das

cAlb4 Antigen aufgetragen worden war, konnte kein Signal detektiert werden. Der Test

des α-Alb4 Antikörpers (aus Ratte) ergab, dass dieser das eigene cAlb4 Antigen und nicht

das GST-cAlb3 Fusionsprotein und die gespaltenen Proteine GST und cAlb3 detektierte.

Die Western Blots, die mit den Präimmunseren der beiden Antikörper behandelt wurden,

zeigten keine Signale. Diese Versuche belegen die Spezifität des α-Alb4 und des α-Alb3

Antikörpers im Hinblick auf die Detektion der verwendeten Antigene.

4 Ergebnisse 66

7255403324

17

kDa

α-Alb3 α-PI Alb3

α-PI Alb4α-Alb4

Coomassie

7255403324

17

kDa

Coomassie

**

*

*

*#

Abbildung 4-2: Test der Antikörper und Präimmunseren gegen die Antigene GST-cAlb3 und cAlb4-his

Für die Kontrolle der Aufreinigung der Antigene GST-cAlb3 und cAlb4-his wurden Aliquots der

Eluate über eine SDS-PAGE aufgetrennt und mit Coomassie angefärbt. Zur Überprüfung des

Thrombinverdaus wurde ein Aliquot des verdauten Proteingemisches GST/cAlb3 über SDS-PAGE

mit anschließender Coomassie Färbung analysiert. Für den Antikörpertest wurden die Antigene

GST-cAlb3 und cAlb4-his sowie das gespaltene GST/cAlb3 Proteingemisch über SDS-PAGE

aufgetrennt und eine Immundetektion mit den Antikörpern (α-Alb3 und α-Alb4) und den

entsprechenden Präimmunseren (α-PI Alb3 und α-PI Alb4) durchgeführt. (* Abbauprodukte des

GST-cAlb3 und cAlb4-his, # unspezifisches Signal)

4 Ergebnisse 67

4.1.3 Test der Antikörper α-Alb3 und α-Alb4 gegen die in vitro translatierten Volllängenproteine

Die Spezifität der α-Alb3 und α-Alb4 Antikörper sollte über den Test gegen die

Volllängenproteine in Form der in vitro Translationsprodukte des Alb3 und Alb4 bestätigt

werden (Abbildung 4-3). Dazu wurde das Alb3 und das Alb4 (mit Transitpeptid, pAlb4)

über die SP6-Polymerase in vitro transkribiert und anschließend mit Hilfe eines

Weizenkeimlysats in vitro translatiert. Die Translationskontrolle erfolgte über den Einsatz

von radioaktiv markiertem [35S]-Methionin, durch dessen Einbau die Proteine nach

Auftrennung mittels einer SDS-PAGE und anschließender Autoradiographie detektiert

werden konnten. Die Autoradiographie erbrachte in dem Translationsansatz des Alb3 ein

spezifisches Signal bei etwa 49 kDa und bei dem Ansatz des pAlb4 ein spezifisches

Signal bei etwa 60 kDa. Die Molekulargewichte dieser Signale entsprachen daher in etwa

den theoretischen Molekulargewichten von Alb3 (45 kDa) und dem pAlb4 inklusive des

Transitpeptids (55 kDa).

α-Alb3 α-Alb4

kDa

pAlb4

Alb3

72

55

43

Translations-kontrolle

Abbildung 4-3: Test der Antikörper gegen die in vitro translatierten Volllängenproteine

Für die Translationskontrolle wurden die radioaktiv markierten Translationsprodukte von Alb3 und

pAlb4 (TP [35S]-Alb3 und TP[35S]-pAlb4, 1 µl) über eine SDS-PAGE aufgetrennt und mittels

Autoradiographie nachgewiesen. Des Weiteren wurde die Spezifität der Antikörper α-Alb3 und

α-Alb4 mit nicht radioaktiv markierten Translationsprodukten (TP Alb3 und TP pAlb4, 5 µl) über

eine Immundetektion gezeigt.

Für den Antikörpertest wurden die Translationsansätze, in denen die Proteine nicht

radioaktiv markiert waren, über eine SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend Western

Blot Analysen durchgeführt. Durch den Einsatz des α-Alb3 Antikörpers wurde das in vitro

translatierte Alb3 auf der Höhe von 49 kDa erkannt. Die Spezifität des α-Alb3 Antikörpers

4 Ergebnisse 68

wurde dadurch bestätigt, dass dieser Antikörper nicht das in vitro translatierte pAlb4

Volllängenprotein detektieren konnte. Zudem zeigte sich, dass der α-Alb4 Antikörper

ausschließlich das in vitro translatierte pAlb4 Volllängenprotein auf der Höhe von 60 kDa

und nicht das Translationsprodukt von Alb3 detektierte. Damit war es gelungen, die

Spezifität des α-Alb3 und α-Alb4 Antikörpers auch für das entsprechende

Volllängenprotein zu bestätigen.

4.1.4 Test der Antikörper α-Alb3 und α-Alb4 mit Thylakoidmembran-proteinen

Für den folgenden Antikörpertest wurden Thylakoidmembranproteine von Arabidopsis

thaliana über eine SDS-PAGE aufgetrennt und Western Blot Analysen durchgeführt

(Abbildung 4-4). Dabei wurde das Alb3 Protein durch den α-Alb3 Antikörper auf der Höhe

von 45 kDa nachgewiesen, während das auf der Höhe von 50 kDa zu erwartende Alb4

nicht detektiert wurde. Durch den Einsatz des α-Alb4 Antikörpers wurde ausschließlich

das Alb4 Protein auf der Höhe von 50 kDa erkannt. Die Western Blots, die mit den

Präimmunseren der beiden Antikörper behandelt wurden, zeigten keine Signale.

Insgesamt lässt sich festhalten, dass die in den Abschnitten 4.1.2 bis 4.1.4 beschriebenen

Versuche eindeutig die Spezifität der beiden Antikörper gegen Alb3 und Alb4 belegen.

Damit war eine wichtige Voraussetzung für weitere biochemische Analysen von Alb3 und

Alb4 erfüllt.

α-Alb4

kDaTM TMTM TM

α-PI Alb4α-PI Alb3α-Alb3

72

55

43

95

Abbildung 4-4: Test der Antikörper gegen Thylakoidmembranproteine Zur Überprüfung der Spezifität der Antikörper wurden Thylakoidmembranproteine (äquivalent zu

5 µg Chlorophyll) über eine SDS-PAGE aufgetrennt und ein immunologischer Nachweis mit den

Antikörpern α-Alb3 und α-Alb4 durchgeführt. Weitere Western Blot Analysen dienten der Kontrolle

auf Reaktion der Präimmunseren (α-PI Alb3 und α-PI Alb4) mit den Thylakoidmembranproteinen.

4 Ergebnisse 69

4.2 Analyse der Interaktionen von Alb3 und Alb4 mit den Proteinen des cpSRP-Transportwegs

Bisherige Studien zeigten, dass der Transport der Lichtsammelkomplexproteine (LHCP)

durch das Stroma zur Thylakoidmembran über den cpSRP-Transportweg erfolgt. Des

Weiteren stellt das integrale Membranprotein Alb3 die Translokase für die Integration der

LHCPs in die Membran dar. Ein entscheidender Aspekt innerhalb dieses Transportwegs,

der sich auf den docking-Prozess des Transitkomplexes an die Thylakoidmembran

bezieht, ist allerdings bisher noch ungeklärt. In dem folgenden Teil dieser Arbeit sollte

geklärt werden, ob der docking-Prozess des Transitkomplexes möglicherweise durch eine

direkte Interaktion der Proteine des cpSRP-Wegs mit der Translokase Alb3 vermittelt wird.

Außerdem sollte über die Proteininteraktionsstudien untersucht werden, ob das zur

Translokase Alb3 homologe Protein Alb4 eine Funktion innerhalb des cpSRP-

Transportwegs ausübt.

4.2.1 Interaktionen von Alb3 und Alb4 mit den Proteinen des cpSRP-Transportwegs im Hefe Split-Ubiquitin System

Um die Interaktion der beiden Membranproteine Alb3 und Alb4 mit den Proteinen des

cpSRP-Wegs cpSRP43, cpSRP54 und cpFtsY zu analysieren, wurde zunächst das Hefe

Split-Ubiquitin System eingesetzt. Das Split-Ubiquitin System ist ein in vivo Verfahren, bei

dem die Interaktion von Membranproteinen getestet werden kann. Dabei ist das Ubiquitin

in ein N-terminales Nub-Fragment und ein C-terminales Cub-Fragment gespalten. Das

N-terminale Fragment des Ubiquitins (NubI) besitzt eine hohe Affinität zum C-terminalen

Bereich des Ubiquitins (Cub). Bei räumlicher Nähe eines Fusionsproteins, bestehend aus

dem Cub-Fragment und dem zu analysierenden Protein (Alb3 bzw. Alb4), und dem NubI-

Fragment des Kontrollproteins Alg5-NubI kommt es zur Rekonstitution des Ubiquitins und

damit zur Abspaltung des Reporters. Dieser Reporter ist an das Cub-Protein angefügt und

besteht aus einer DNA-bindenden Domäne (LexA-Protein) und einer

transkriptionsaktivierenden Domäne (Virionenprotein 16). Die Lokalisation des Reporters

im Cytosol kann durch eine erfolgte Aktivierung der Reportergene nachgewiesen werden.

Zur Kontrolle auf Transaktivierung diente das Protein Alg5-NubG, das aufgrund einer

Punktmutation im Nub-Fragment (NubG) die Affinität zwischen den Ubiquitin-Hälften

verringert. Mit Hilfe des Split-Ubiquitin Systems wurden bereits erfolgreiche

Untersuchungen des Alb3 mit potentiellen Bindungspartnern durchgeführt (Pasch et al.,

2005). Das Cub-Protein wird mit dem angefügten Reporter von dem pAMBV4-Vektor und

das NubG-Protein durch den Vektor pADSL-Nx kodiert. Für den Interaktionstest wurden

die Gensequenzen von Alb3 und Alb4 in den pAMBV4-Vektor und die Gensequenzen von

4 Ergebnisse 70

cpSRP43, cpSRP54 und cpFtsY in den pADSL-Vektor kloniert. Die Kontrolle der

Cotransformation der bait- und prey-Plasmide in die Hefezellen verlief in allen Ansätzen

positiv. Die Transformationsraten konnten durch das Wachstum der Hefekolonien auf dem

–LT-Medium, dem die Aminosäuren Leucin und Tryptophan fehlten, erkannt werden

(Daten nicht gezeigt). Der Einsatz der Konstrukte pAMBV4-Alb3 bzw. pAMBV4-Alb4 mit

dem Kontrollplasmid (kodiert für Alg5-NubI) wies durch ein deutliches Wachstum der

cotransformierten Hefezellen auf dem –LTH-Medium auf eine erfolgreiche Rekonstitution

des Ubiquitins hin. Zur Kontrolle auf Transaktivierung des Alb3 und Alb4 wurden die

Plasmide pAMBV4-Alb3 bzw. pAMBV4-Alb4 mit dem Kontrollplasmid (kodiert für Alg5-

NubG) cotransformiert. Ein Wachstum der transformierten Hefezellen auf –LTH-Medium

wies auf eine schwache Eigenaktivierung hin (Daten nicht gezeigt). Der Zusatz von

15 mM 3-Aminotriazol (3-AT), einem kompetitiven Inhibitor des His3-Genproduktes,

verringerte die Eigenaktivierung jedoch so weit, dass kein Wachstum beim Einsatz des

Kontrollplasmids auf –LTH-Medium mehr möglich war.

Für die Interaktionsanalysen (Tabelle 4-1) wurden die Konstrukte pAMBV4-Alb3 bzw.

pAMBV4-Alb4 sowie die Kontrolle pMBV4-Alg5 mit den Konstrukten der potentiellen

Bindungspartner (pADSL-cpSRP43, pADSL-cpSRP54 und pADSL-cpFtsY) in die

Hefezellen cotransformiert. Interessanterweise deuteten die Ergebnisse auf eine

Interaktion des Alb3 mit cpSRP43, während eine Interaktion mit cpSRP54 oder cpFtsY im

Split-Ubiquitin System nicht nachgewiesen wurde. Um auszuschließen, dass die

negativen Ergebnisse auf eine fehlende Expression des cpSRP54 oder cpFtsY

zurückzuführen sind, wurde die korrekte Expression der Proteine in den Hefezellen

nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Das Alb4 zeigte mit keinem der getesteten Proteine

eine Interaktion im Hefe Split-Ubiquitin System. Von den Hefekolonien, die auf dem –LTH-

Medium gewachsen sind, wurde ein β-Galaktosidase Filtertest durchgeführt. Bei allen

Transformationen, bei denen ein Wachstum der Hefezellen auf diesem Selektionsmedium

zu verzeichnen war, konnte auch eine Blaufärbung im Filtertest gezeigt werden (Tabelle

4-1). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das cpSRP43 in der Lage ist direkt mit

Alb3 zu interagieren und dass diese Interaktion möglicherweise den docking-Prozess des

Transitkomplexes an die Thylakoidmembran über eine Interaktion mit der Translokase

Alb3 vermittelt.

4 Ergebnisse 71

Tabelle 4-1: Alb3 interagiert mit cpSRP43 im Split-Ubiquitin System Dargestellt sind die Interaktionstests von Alb3 und Alb4 mit den löslichen Proteinen des cpSRP-

Wegs im Hefe Split-Ubiquitin System. Der Hefe Stamm DSY-1 wurde mit den Plasmiden pAMBV4-

Alb3, pAMBV4-Alb4, pMBV4-Alg5 und den angegebenen NubG-Fusionsproteinen des cpSRP-

Wegs cotransformiert und die Aktivierung der Reportergene ausgewertet. Durch das Wachstum

der cotransformierten Hefezellen auf Minimalmedium (-his) (++ = deutliches Wachstum,

+ = geringes Wachstum, - = kein Wachstum) und über die Bestimmung der Enzymaktivität der

β-Galaktosidase (β-gal), die durch eine Blaufärbung der Hefekolonien im β-Galaktosidase Filtertest

getestet wurde (+ = Blaufärbung, - = keine Blaufärbung), konnten Aussagen über die Interaktion

der Proteine gemacht werden. Die Plasmide pADSL-Alg5-NubI und pADSL-Alg5-NubG wurden als

Positiv- bzw. Negativkontrollen eingesetzt.

pAMBV4-Alb3 pAMBV4-Alb4 pMBV4-Alg5

pADSL-Nx -his β-gal. -his β-gal. -his β-gal

Alg5-NubI ++ + ++ + + +

Alg5-NubG - - - - - -

cpSRP43 ++ + - - - -

cpSRP54 - - - - - -

cpFtsY - - - - - -

4.2.2 Proteininteraktionen von Alb3 und Alb4 mit den Proteinen des cpSRP-Transportwegs im Split-YFP System

Um die gezeigte in vivo Interaktion von Alb3 mit cpSRP43 zu bestätigen, sollten die im

Split-Ubiquitin System getesteten Proteine im Split-YFP System in Arabidopsis thaliana

Protoplasten eingesetzt werden. Dieses ist ein weiteres in vivo Verfahren, um mit Hilfe

der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation die Interaktion von Proteinen in ihrer

natürlichen Umgebung zu testen. Dazu ist das YFP in zwei Hälften gespalten. Das N-

terminale nYFP wird durch den Vektor pSPYNE (split YFP N-terminal fragment

expression) und das C-terminale cYFP durch den Vektor pSPYCE (split YFP

C-terminal fragment expression) kodiert. Für die Interaktionstests wurden die

Membranproteine Alb3 und Alb4 N-terminal an die YFP-Fragmente fusioniert, so dass die

YFP-Hälften nach der Integration der Proteine in die Thylakoidmembran auf der Stroma

gelegenen Seite lokalisiert sind. Damit war gewährleistet, dass die YFP-Fragmente der

Membranproteine mit den entsprechenden YFP-Hälften der möglichen stromalen

Interaktionspartner cpSRP43, cpSRP54 und cpFtsY in räumliche Nähe geraten konnten.

Der Transport der Proteine (Alb3, Alb4 und cpFtsY) aus dem Cytosol in den Chloroplasten

4 Ergebnisse 72

wurde über die jeweilige chloroplastidäre Transitsequenz der Proteine vermittelt. Lagen

die Gensequenzen der Proteine ohne eigene Transitsequenz vor (cpSRP43 und

cpSRP54), wurde die Transitsequenz der kleinen Untereinheit der Rubisco (TS-rbcs) vor

das jeweilige Konstrukt kloniert, um den chloroplastidären Import zu erreichen. Für die

Analyse der Interaktion wurde die Gensequenz des einen Interaktionspartners in den

pSPYCE-Vektor und die des anderen Partners in den pSPYNE-Vektor kloniert und diese

Konstrukte in Arabidopsis thaliana Protoplasten cotransformiert. Bei einer Interaktion

zweier YFP-Fusionsproteine rekonstituieren sich die beiden nicht-fluoreszierenden YFP-

Hälften zu dem fluoreszierenden YFP, dessen Fluoreszenz an einem Laserscanning

Mikroskop (LSM 510 Meta) visualisiert und dokumentiert werden konnte.

Zunächst sollte getestet werden, ob die bereits bekannte Interaktion von cpSRP43 und

cpSRP54 mit diesem System gemessen werden kann. In Abbildung 4-5 ist gezeigt, dass

cpSRP43-nYFP mit dem cpSRP54-cYFP in Arabidopsis thaliana Protoplasten

interagierte, wodurch die Fluoreszenz des YFP rekonstituiert werden konnte. Die

Überlagerung der YFP-Fluoreszenz mit der Autofluoreszenz des Chlorophylls zeigte

zudem die Interaktion der beiden Proteine innerhalb der Chloroplasten. Es zeigte sich

ebenfalls eine Interaktion von Alb3-cYFP mit cpSRP43-nYFP und Alb3-nYFP mit

cpSRP43-cYFP in vivo in Arabidopsis Protoplasten, wodurch das Ergebnis der Interaktion

der beiden Proteine im Hefe Split-Ubiquitin System bestätigt werden konnte (Abbildung

4-5, Tabelle 4-3). Als Kontrolle wurden die Vektoren pSPYNE-TS(rbcs) und pSPYCE-

TS(rbcs) eingesetzt und mit den einzelnen Fusionskonstrukten cotransformiert. Bei diesen

Konstrukten ist die Transitsequenz der kleinen Untereinheit der Rubisco (TS-rbcs) vor das

jeweilige YFP-Fragment fusioniert, wodurch der Import der einzelnen YFP-Hälften ohne

weiteres Fusionsprotein in die Chloroplasten garantiert ist. Die Kontrollen zeigten, dass

weder das Fusionsprotein Alb3-cYFP noch das cpSRP43-nYFP in der Lage waren die

YFP-Fluoreszenz mit dem jeweiligen nYFP- oder cYFP-Fragment zu rekonstituieren

(Abbildung 4-5, Tabelle 4-2). Diese Ergebnisse deuteten auf eine direkte Interaktion

zwischen Alb3 und cpSRP43, da eine unspezifische und zufällige Rekonstitution des

YFPs auszuschließen war.

Des Weiteren sollten die Proteine cpSRP54 und cpFtsY auf Interaktion mit Alb3 getestet

werden. Es konnte keine YFP-Fluoreszenz und damit keine Interaktion von Alb3 mit

cpSRP54 oder cpFtsY im Split-YFP System erkannt werden. Zudem zeigte sich, dass

Alb4 im Vergleich zu Alb3 nicht in der Lage war mit cpSRP43 zu interagieren (Tabelle

4-2). Alle Proteine wurden sowohl als Fusionsproteine mit der N-terminalen Hälfte, als

auch als Fusionsproteine mit der C-terminalen Hälfte des YFP getestet. Dazu lagen die

Gensequenzen für diese Proteine im pSPYCE- und pSPYNE-Vektor vor (Tabelle 4-2). In

allen Kontrollexperimenten konnte ebenfalls keine YFP-Rekonstitution beobachtet werden

(Tabelle 4-3).

4 Ergebnisse 73

Abbildung 4-5: Alb3 interagiert mit cpSRP43 in Arabidopsis thaliana Protoplasten Die Interaktion von Alb3 mit cpSRP43 wurde über die bimolekulare Fluoreszenzkomplementation

(Split-YFP System) in Arabidopsis Protoplasten (in vivo, in planta) gemessen. Die zu testenden

Proteine wurden an die N- bzw. C-terminale Hälfte des YFP fusioniert und die Protoplasten mit den

entsprechenden Plasmiden transient transfiziert. Die rekonstituierte Fluoreszenz des YFP im Falle

einer Interaktion der Proteine konnte über die konfokale Laserscanning Mikroskopie sichtbar

gemacht werden. Dargestellt sind die YFP-Fluoreszenz, die Chlorophyll-Autofluoreszenz und die

Überlagerung beider Bilder. In den Kontrollen wurden die Protoplasten mit dem Plasmid der

angegebenen Fusionsproteine und dem entsprechenden Kontrollplasmid pSPYNE-TS(rbcs) bzw.

pSPYCE-TS(rbcs) cotransfiziert. Bei den Kontrollplasmiden wurde die Transitsequenz der kleinen

Untereinheit der Rubisco vor die entsprechende Hälfte des YFP fusioniert, wodurch der Import der

einzelnen YFP-Hälften in den Chloroplasten erfolgte. Als Positivkontrolle wurde die Interaktion der

stromalen Proteine cpSRP54 und cpSRP43 gemessen.

YFP Chlorophyll Überlagerung

cpSRP43-nYFP/ cpSRP54-cYFP

cpSRP43-nYFP/ Alb3-cYFP

cpSRP43-nYFP/ TS(rbcs)-cYFP

TS(rbcs)-nYFP/ Alb3-cYFP

4 Ergebnisse 74

Tabelle 4-2: Interaktionstests im Split-YFP System Dargestellt sind die Interaktionstests von Alb3 und Alb4 mit den löslichen Proteinen des cpSRP-

Wegs im Split-YFP System. Die zu testenden Proteine wurden sowohl an die N-terminale Hälfte,

als auch an die C-terminale Hälfte des YFP fusioniert. Die Protoplasten wurden mit den

entsprechenden Plasmiden in beiden Kombinationen transient transfiziert und die Interaktion der

Proteine analysiert.

nYFP-Konstrukte cYFP-Konstrukte Interaktion

cpSRP43 cpSRP54 + cpSRP54 cpSRP43 + cpSRP43 Alb3 + Alb3 cpSRP43 + cpSRP54 Alb3 - Alb3 cpSRP54 - cpFtsY Alb3 - Alb3 cpFtsY - cpSRP43 Alb4 - Alb4 cpSRP43 -

Tabelle 4-3: Negativkontrollen der Interaktionstests im Split-YFP System Gezeigt sind die im Rahmen des Split-YFP Systems durchgeführten Negativkontrollen. Dazu

wurden die Plasmide, die das zu testende Protein als Fusion mit dem nYFP oder cYFP kodieren,

mit dem jeweiligen Kontrollplasmid pSPYNE-TS(rbcs) bzw. pSPYCE-TS(rbcs) transient

cotransfiziert.

nYFP-Konstrukte cYFP-Konstrukte Interaktion

cpSRP43 TS-rbcs - cpSRP54 TS-rbcs - cpFtsY TS-rbcs - Alb3 TS-rbcs - Alb4 TS-rbcs - TS-rbcs cpSRP43 - TS-rbcs cpSRP54 - TS-rbcs cpFtsY - TS-rbcs Alb3 - TS-rbcs Alb4 -

4 Ergebnisse 75

Um die spezifische Interaktion von Alb3 und cpSRP43 weiter zu bestärken, sollte die

korrekte Lokalisation der Fusionsproteine Alb3-cYFP und Alb4-cYFP in der

Thylakoidmembran und des cpSRP43-nYFP in der löslichen Fraktion der Protoplasten

nachgewiesen werden. Dazu wurden die Protoplasten mit dem jeweiligen

Fusionskonstrukt transfiziert. Für den Nachweis der Expression wurden die lysierten

Zellen abzentrifugiert und die Proteine des Überstands mit Trichloressigsäure (TCA)

gefällt. Das Waschen des Membranpellets mit 0,2 M NaOH sollte peripher gebundene

Proteine ablösen. Mit dem entstehenden Überstand (Waschfraktion) wurde ebenfalls eine

TCA-Fällung durchgeführt. Die Proteine des gewaschenen Membranpellets sowie die

Proben aus der TCA-Fällung wurden über eine SDS-PAGE aufgetrennt und mittels

Immundetektion ausgewertet (Abbildung 4-6). Dabei konnten die nYFP-Fusionsproteine

über den angefügten c-myc-tag und die cYFP-Fusionsproteine über den HA-tag

nachgewiesen werden.

Alb3-cYFP

cpSRP43-nYFP

Kontrolle

P

α-HA

α-c-myc

Ü W

P Ü W

Alb4-cYFP

Kontrolle

Abbildung 4-6: Expressionsnachweis der YFP-Fusionsproteine cpSRP43-nYFP,

Alb3-cYFP und Alb4-cYFP Arabidopsis Protoplasten wurden mit den entsprechenden Konstrukten transient transfiziert und die

Expression der YFP-Fusionsproteine (cpSRP43-nYFP, Alb3-cYFP und Alb4-cYFP) über

Immundetektion nachgewiesen. Dazu wurden die lysierten Zellen abzentrifugiert und der

Überstand (Ü) mittels TCA-Fällung präzipitiert. Das Membranpellet (P) wurde mit 0,2 M NaOH

gewaschen, zentrifugiert und der Überstand (W=Waschfraktion) mittels TCA-Fällung präzipitiert.

Die Proben des gewaschenen Membranpellets (P), des Überstands (Ü) und der Waschfraktion (W)

wurden über SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Immundetektion analysiert. Die Expression

konnte über einen anti-HA Antikörper (α-HA) für die cYFP-Fusionsproteine und einen anti-c-myc

Antikörper (α-c-myc) für das nYFP-Fusionsprotein gezeigt werden. Als Kontrolle wurden nicht

transfizierte Protoplasten eingesetzt (Kontrolle).

4 Ergebnisse 76

Es zeigte sich, dass das stromale cpSRP43-nYFP in der Fraktion des Überstands nach

der Lyse zu finden war. Eine geringe Menge befand sich auch in der Waschfraktion, was

darauf hindeutet, dass das cpSRP43-nYFP zum Teil noch an der Membran gebunden

vorlag. Die integralen Membranproteine Alb3 und Alb4 konnten als YFP-Fusionsproteine

ausschließlich in der Membranfraktion nachgewiesen werden. Als Kontrollen wurden

jeweils nicht transfizierte Protoplasten aufgearbeitet. In diesen Proben waren keine

Signale auf der entsprechenden Größe der YFP-Fusionsproteine zu detektieren

(Abbildung 4-6). Durch den Nachweis der Expression und der korrekten Lokalisation der

YFP-Fusionsproteine in der Membran bzw. im Stroma, konnte die spezifische Interaktion

von Alb3 und cpSRP43 in vivo in planta unterstützt werden.

4.2.3 Analyse der Binderegion zwischen Alb3 und cpSRP43 über das Split-YFP System

Um die Binderegion des Alb3 für cpSRP43 genauer zu untersuchen, wurden zunächst

verschiedene Konstrukte aus unterschiedlichen Bereichen von Alb3 und Alb4 über die

overlap-PCR hergestellt. Wie bereits in Abschnitt 4.2.2 beschrieben, interagierte Alb4

nicht mit cpSRP43. Die Erstellung von solchen chimären Proteinen bot sich an, da beide

Proteine fünf putative Transmembrandomänen besitzen (Abbildung 4-7).

462

499

133-155 203-225 236-258 272-294 315-337

130-159 201-226 233-267 271-299 311-340

119-141 183-205 216-236 260-282 300-322

114-143 183-210 216-237 257-286 297-324

56

46

Alb3

Alb4

Abbildung 4-7: Schematische Darstellung der vorhergesagten Membrantopologie von Alb3 und Alb4

Die Membrantopologie von Alb3 und Alb4 zeigt eine Lokalisation des N-Terminus im Lumen und

des C-Terminus im Stroma. Mit Hilfe des Internetprogrammes Aramemnon

(http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de/) wurden die Bereiche der vorhergesagten

Transmembrandomänen bestimmt (Rechtecke). Die oberhalb der Transmembrandomänen

dargestellten Nummern der Aminosäuren zeigen die gemeinsame Vorhersage (Consensus) aller

Vorhersageprogramme, während die unterhalb dargestellten Nummern die maximale Länge der

Transmembrandomänen in allen Vorhersageprogrammen anzeigen.

4 Ergebnisse 77

Der Austausch der entsprechenden Bereiche von Alb3 durch Alb4 ermöglichte daher die

Aufrechterhaltung der Membrantopologie. Dieses ist ein deutlicher Vorteil gegenüber der

Erstellung von Deletionskonstrukten, denen große Teile des Proteins fehlen und die somit

möglicherweise keine korrekte Membrantopologie zur Folge hätten.

Für die Messung im Split-YFP System wurden verschiedene chimäre Proteine erzeugt,

wobei das Alb3 Protein vom N-Terminus ausgehend durch entsprechende Bereiche von

Alb4 ersetzt wurde. Die Proteine Alb4(1-142)Alb3(159-462), Alb4(1-210)Alb3(227-462),

Alb4(1-239)Alb3(256-462) und Alb4(1-255)Alb3(272-462) bestanden aus entsprechenden

N-terminalen Bereichen einschließlich der 1., 2. und 3. Transmembrandomäne von Alb4

und des dazugehörigen C-terminalen Bereichs von Alb3. Diese cYFP-Fusionsproteine

waren alle noch in der Lage mit cpSRP43-nYFP zu interagieren (Daten nicht gezeigt.)

Auch die Proteine Alb4(1-288)Alb3(296-462) und Alb4(1-300)Alb3(314-462), welche bis

zum Ende der 4. Transmembrandomäne bzw. bis zu Beginn der 5. Transmembran-

domäne aus dem Alb4 Protein bestanden, interagierten ebenfalls noch mit dem cpSRP43

und konnten somit die YFP-Fluoreszenz rekonstituieren (Abbildung 4-8). Dagegen war

das Fusionsprotein Alb4(1-326)Alb3(343-462), welches nur noch den C-Terminus von

Alb3 und den Rest des Proteins von der Alb4 Proteinsequenz aufwies, nicht mehr in der

Lage mit dem cpSRP43 zu interagieren. Dieses Ergebnis wies darauf hin, dass die

5. Transmembrandomäne von Alb3 für die Bindung des cpSRP43 erforderlich ist.

Weiterhin zeigte sich, dass eine bestimmte Region innerhalb der 5. Transmembran-

domäne von Alb3 für die cpSRP43 Bindung wichtig ist. Das Protein Alb4(1-300)Alb3(314-

462), welches noch die gesamte 5. Transmembrandomäne und den C-Terminus von Alb3

aufwies, konnte das cpSRP43 noch binden (Abbildung 4-8). Das Protein Alb4(1-

302)Alb3(319-462), bei dem nur wenige Aminosäuren der 5. Transmembrandomäne von

Alb3 durch die Alb4 Sequenz ersetzt wurden, zeigte dagegen keine Interaktion mehr

(Abbildung 4-8).

4 Ergebnisse 78

N

C

Alb4(1-288)Alb3(296-462)

N

C

Alb4(1-300)Alb3(314-462)

Alb4(1-326)Alb3(343-462)

N

C

Alb3(1-342)Alb4(327-499)

N

C


Alb4(1-302)Alb3(319-462)

N

C

Abbildung 4-8: Identifizierung der Alb3 Bindestelle für das cpSRP43 in Arabidopsis

Protoplasten Für die Bestimmung der interagierenden Bereiche von Alb3 mit cpSRP43 wurden chimäre Proteine

aus unterschiedlich großen Bereichen von Alb3 und Alb4 eingesetzt, die an die

C-terminale Hälfte des YFPs fusioniert waren. Die Anteile des jeweiligen Proteins sind anhand des

Schemas und der Aminosäuren angegebenen. Arabidopsis Protoplasten wurden mit den

entsprechenden Plasmiden, bei denen die Gensequenzen der chimären Proteine an das cYFP und

die des cpSRP43 an das nYFP fusioniert waren, transient transfiziert und die YFP-Fluoreszenz

analysiert. Dargestellt sind die YFP-Fluoreszenz, die Chlorophyll-Autofluoreszenz und die

Überlagerung beider Bilder.

4 Ergebnisse 79

Ein Alignment dieser beiden Proteinsequenzen gibt Aufschluss auf die entscheidenden

Aminosäuren (Abbildung 4-9). Es wird deutlich, dass die Aminosäuren 314-318 (LVFKF)

von Alb3 den Unterschied zwischen diesen beiden Proteinen ausmachen und damit eine

Bindestelle für das cpSRP43 darstellen könnten. Bemerkenswerterweise liegt diese

putative Bindestelle auf der lumenalen Seite der Thylakoidmembran, was die Frage nach

der Zugänglichkeit dieser Bindestelle für das cpSRP43 eröffnet (siehe Diskussion). Um zu

testen, ob diese Bindestelle hinreichend für die Interaktion mit cpSRP43 ist, wurde das

Konstrukt Alb3(1-342)Alb4(327-499) erstellt. Das Protein Alb3(1-342)Alb4(327-499)

beinhaltet die Alb3 Sequenz bis einschließlich der 5. Transmembrandomäne. Lediglich

der Bereich des stromalen C-Terminus des Proteins ist von Alb4. Dieses chimäre Protein

konnte das cpSRP43 nicht binden, da keine YFP-Fluoreszenz im Laserscanning

Mikroskop zu detektieren war (Abbildung 4-8). Das bedeutet, dass die Bindestelle in der

5. Transmembrandomäne für die Interaktion nicht ausreichend war. Der C-Terminus von

Alb3 hat somit ebenfalls eine essentielle Bedeutung für die stabile Interaktion mit

cpSRP43, da er nicht durch die Alb4 Sequenz ersetzt werden konnte. Zusammenfassend

lässt sich sagen, dass der C-Terminus und die Aminosäuren 314-318 innerhalb der

5. Transmembrandomäne eine entscheidende Rolle für die Bindung des cpSRP43

besitzen.

Alb3 MKPPQTDDPAQKNTL---LVFKFLPLMIGYFALSVPSGLSIYWLTNNVLSAlb4(1-300)Alb3(314-462) MQSSQSNDPAMKSSQAVTLVFKFLPLMIGYFALSVPSGLSIYWLTNNVLSAlb4(1-302)Alb3(319-462) MQSSQSNDPAMKSSQAVT---KLLPLMIGYFALSVPSGLSIYWLTNNVLS *:..*::*** *.: *:***************************

Abbildung 4-9: Alignment der YFP-Fusionsproteine zur Identifizierung der Bindestelle

Das Alignment der Proteine Alb3, Alb4(1-300)Alb3(314-462) und Alb4(1-302)Alb3(319-462)

veranschaulicht die putative Bindestelle von Alb3 für das cpSRP43. Die Aminosäuren der Alb4

Sequenz sind in schwarz und die der Alb3 Sequenz in rot dargestellt. Der Verlust der Aminosäuren

314-318 (LVFKF) von der Alb3 Sequenz in dem Protein Alb4(1-302)Alb3(319-462) führt zum

Verlust der Interaktion mit cpSRP43.

4 Ergebnisse 80

4.2.4 Peptide Scanning von Alb3 mit rekombinantem cpSRP43

Da die 5. Transmembrandomäne und der C-Terminus von Alb3 für die Interaktion mit

cpSRP43 wichtig war und daher möglicherweise zwei Bindestellen vorhanden zu sein

schienen, wurde ein Peptide Scanning durchgeführt. Dazu wurde eine PepSpot Membran

bestellt, welche die Aminosäuren 299-462 und damit den 2. lumenalen loop, die

5. Transmembrandomäne und den C-Terminus von Alb3 umfasste. Auf der Membran

waren pro Spot 15 Aminosäuren lange Peptide verlinkt, wobei die Proteinsequenz jeweils

um 3 Aminosäuren versetzt war. Für die Analyse der Binderegionen wurde zunächst die

Gensequenz des cpSRP43 in den pET-Duet1 Vektor kloniert und in den E. coli

Überexpressionsstamm Rosetta (DE3) transformiert. Das überexprimierte, rekombinante

cpSRP43 wurde über den angefügten N-terminalen His-tag aufgereinigt (Abbildung 4-10

A). Die PepSpot Membran wurde mit dem rekombinanten Protein inkubiert, dessen

Bindestelle(n) auf der Membran und somit innerhalb der Alb3 Sequenz über eine

Immundetektion analysiert werden konnte. Es zeigte sich, dass das rekombinante His-

cpSRP43 an die Aminosäuren 305-328 innerhalb der 5. Transmembrandomäne und die

Aminosäuren 374-388 im C-Terminus binden konnte (Abbildung 4-10 B,C). Die

Bindestelle innerhalb der Transmembrandomäne umfasst vier PepSpots auf der Membran

(Abbildung 4-10 C). Vergleicht man die vier Peptidsequenzen dieser spots, fällt eine

gemeinsame Sequenz der Aminosäuren 314-319 (LVFKFL) auf, die in jedem dieser

15 Aminosäuren langen Peptide präsent ist (Abbildung 4-10 D). Diese Bindestelle enthält

die bereits durch das Split-YFP System gezeigte Bindestelle der Aminosäuren 314-318

(LVFKF). Das Split-YFP System ergab außerdem, dass es noch eine mögliche

Bindestelle innerhalb des C-Terminus von Alb3 geben musste. Die Pepspot Analyse

zeigte diese Bindestelle als einen Spot, der die Aminosäuren 374-388 umfasste

(Abbildung 4-10 C). Demnach unterstützt das Ergebnis des Peptide Scanning die Befunde

der Split-YFP Experimente und verstärkt die Vermutung, dass es eine Bindestelle

innerhalb der 5. Transmembrandomäne und eine weitere Bindestelle auf dem C-Terminus

von Alb3 gibt.

4 Ergebnisse 81

Aminosäuren 305-328:

DDPAQKNTLLVFKFLAQKNTLLVFKFLPLMNTLLVFKFLPLMIGYLVFKFLPLMIGYFAL

1 MARVLVSSPS SFFGSPLIKP SSSLRHSGVG GGGTAQFLPY RSNNNKLFTT 51 STTVRFSLNE IPPFHGLDSS VDIGAIFTRA ESLLYTIADA AVVGADSVVT 101 TDSSAVQKSG GWFGFISDAM ELVLKILKDG LSAVHVPYAY GFAIILLTII 151 VKAATYPLTK QQVESTLAMQ NLQPKIKAIQ QRYAGNQERI QLETSRLYKQ 201 AGVNPLAGCL PTLATIPVWI GLYQALSNVA NEGLFTEGFF WIPSLGGPTS 251 IAARQSGSGI SWLFPFVDGH PPLGWYDTVA YLVLPVLLIA SQYVSMEIMK 301 PPQTDDPAQK NTLLVFKFLP LMIGYFALSV PSGLSIYWLT NNVLSTAQQV 351 YLRKLGGAKP NMDENASKII SAGRAKRSIA QPDDAGERFR QLKEQEKRSK 401 KNKAVAKDTV ELVEESQSES EEGSDDEEEE AREGALASST TSKPLPEVGQ 451 RRSKRSKRKR TV

Aminosäuren 305-328:DDPAQKNTLLVFKFLPLMIGYFAL

Aminosäuren 374-388:RAKRSIAQPDDAGER

B

D

C

A

7255

43

34

26

17

kDa

Abbildung 4-10: Peptide Scanning von Alb3 Peptiden mit rekombinantem cpSRP43 Für die Methode des Peptide Scanning wurde zunächst das cpSRP43 rekombinant überexprimiert

und über den angefügten N-terminalen His-tag aufgereinigt. Ein Aliquot des Eluats His-cpSRP43

(His-43) wurde über eine SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend mit Coomassie gefärbt, um die

erfolgreiche Aufreinigung zu überprüfen (A). Die Interaktion von rekombinantem His-cpSRP43 und

den Alb3 Peptiden wurde über eine Pepscan Methode (PepSpots, JPT Peptide Technologies,

Berlin) analysiert. Die dargestellte Sequenz von Alb3 zeigt die Aminosäuren, die für die PepSpot

Membran eingesetzt wurden (blau) (B). Der Bereich umfasst den 2. lumenalen loop, die

5. Transmembrandomäne (grau: Consensus Sequenz, hellgrau: zusätzliche Aminosäuren der

maximalen Vorhersage) sowie den C-Terminus von Alb3. Die Membran enthält 51 Peptide mit

jeweils 15 Aminosäuren Länge, die jeweils um drei Aminosäuren versetzt aufgetragen waren. Das

gebundene, rekombinante His-cpSRP43 wurde über einen Western Blot mit Hilfe eines Antikörpers

gegen das cpSRP43 (α-chaos) detektiert (C). Die interagierenden Peptide 3-6 umfassen die

Aminosäuren 305-328 und das Peptid 26 die Aminosäuren 374-388 von Alb3 und sind als

Bindestellen in der Alb3 Sequenz unterstrichen dargestellt (B). Die Analyse der PepSpots 3-6

erbrachte ein gemeinsames Bindemotiv der Aminosäuren 314-319 (LVFKFL) und ist in rot

hervorgehoben (D).

4 Ergebnisse 82

4.2.5 Bestätigung der mittels Peptide Scanning gezeigten Binderegionen im Split-YFP System

Die Auswertung des Peptide Scanning bestätigte die bereits über die Fusionskonstrukte

von Alb4 und Alb3 im Split-YFP gezeigte Bindestelle innerhalb der

5. Transmembrandomäne von Alb3. Aus diesem Grund wurden gezielt Mutationen und

Deletionen in diesem Bereich des Alb3 erzeugt und diese Proteine auf Interaktion mit

cpSRP43 im Split-YFP System getestet. Auf Grundlage eines Alignments der

Proteinsequenzen von Alb3 und Alb4 wurden die Aminosäuren von Alb3 innerhalb des

putativen Bindemotivs (LVFKFL) zu den entsprechenden Aminosäuren der Alb4 Sequenz

mutiert (Abbildung 4-11).

Alb3 MKPPQTDDPAQKNTLLVFKFLPLMIGYFALSVPSGLSIYWLTNNVLSAlb4 MQSSQSNDPAMKSSQAVTKLLPLMIGYFALSVPSGLSLYWLTNNILS

*:..*::*** *.: * *:*****************:******:**

310 315 320

Abbildung 4-11: Alignment von Alb3 und Alb4 im Bereich des Bindemotivs Das Alignment von Alb3 und Alb4 zeigt die Aminosäuren (rot), die bei den Mutationskonstrukten

Alb3(F316T), Alb3(L314A) und Alb3(L313Q,L314A) gegeneinander ausgetauscht worden sind.

Während das mutierte Protein Alb3(F316T) noch in der Lage war durch Interaktion mit

cpSRP43 die YFP-Fluoreszenz zu rekonstituieren, konnten die Proteine Alb3(L314A) und

Alb3(L313Q,L314A) nicht mehr mit dem cpSRP43 interagieren (Tabelle 4-4). Die

Deletionskonstrukte Alb3(Δ314,315) und Alb3(Δ314-317) zeigten ebenfalls keine

Interaktion mit dem cpSRP43, was auf eine entscheidende Bedeutung dieser Bindestelle

innerhalb der 5. Transmembrandomäne deutet (Tabelle 4-4). Die Analyse des Peptide

Scanning ergab weiterhin, dass die Aminosäuren 374-388 eine Bindestelle für das

cpSRP43 auf dem C-Terminus von Alb3 bilden. Um dieses zu bestätigen wurden die

Aminosäuren 374-388 mittels overlap-PCR in dem Alb3 Protein deletiert und die

Interaktion mit dem cpSRP43 ebenfalls über die bimolekulare Fluoreszenzkomplemetation

getestet. Die Deletion der Aminosäuren 374-388 hatte zur Folge, dass das Alb3(Δ374-

388) nicht mehr mit cpSRP43 interagieren konnte (Tabelle 4-4). Als Kontrolle wurde mit

den Aminosäuren 389-415 ein weiterer Bereich des C-Terminus von Alb3 deletiert. Das

Protein Alb3(Δ389-415) konnte im Vergleich zu dem Alb3(Δ374-388) noch mit dem

cpSRP43 interagieren (Tabelle 4-4). Die Aminosäuren 389-415 haben daher keinen

Einfluss auf die Bindung des cpSRP43. In weiteren Versuchen wurden C-terminal

verkürzte Alb3 Proteine im Split-YFP System getestet. Man konnte feststellen, dass die

4 Ergebnisse 83

Proteine Alb3(1-359) und Alb3(1-366) nicht mehr mit dem cpSRP43 interagieren konnten,

währenddessen die Proteine Alb3(1-415) und Alb3(1-442) eine Interaktion zeigten

(Tabelle 4-4). Damit führte die C-terminale Verkürzung des Proteins von 415 auf 366

Aminosäuren zum Ausbleiben der Bindung von cpSRP43. Da sich innerhalb dieses

deletierten Bereiches die gezeigte Bindestelle der Aminosäuren 374-388 befindet,

unterstützen auch diese Ergebnisse die Präsenz dieses Bindemotivs im C-Terminus von

Alb3.

Tabelle 4-4: Interaktion der Alb3 Deletions- und Mutationsproteine mit cpSRP43-nYFP in Arabidopsis Protoplasten

Die mittels overlap-PCR und Mutagenese-PCR erzeugten Deletions- und Mutationsproteine von

Alb3 wurden im Split-YFP System auf Interaktion mit cpSRP43 getestet. Die Alb3 Konstrukte

wurden an das cYFP und das cpSRP43 an das nYFP fusioniert. Arabidopsis Protoplasten wurden

mit den angegebenen Konstrukten transient transfiziert und die Proteine auf Interaktion analysiert.

cYFP-Konstrukte Interaktion mit cpSRP43-nYFP

Alb3(F316T) + Alb3(L314A) - Alb3(L313Q,L314A) - Alb3(Δ314,315) - Alb3(Δ314-317) - Alb3(Δ374-388) - Alb3(Δ389-415) + Alb3(1-442) + Alb3(1-415) + Alb3(1-366) - Alb3(1-359) -

Im nächsten Schritt sollte die Expression der entscheidenden Deletionskonstrukte von

Alb3 und deren Integration in die Thylakoidmembran gezeigt werden. Dazu wurden

Arabidopsis thaliana Protoplasten mit den Konstrukten pSPYCE-Alb3, pSPYCE-

Alb3(L313Q,L314A), pSPYCE-Alb3(Δ314-317) und pSPYCE-Alb3(Δ374-388) transfiziert.

Wie bereits in Abschnitt 4.2.2 beschrieben, wurden für den Nachweis der Expression die

Proteine des gewaschenen Membranpellets sowie die Proben aus der TCA-Fällung

(Überstand nach Lyse und Waschfraktion) über eine SDS-PAGE aufgetrennt und mittels

Immundetektion ausgewertet (Abbildung 4-12). Dabei konnten die cYFP-Fusionsproteine

über den angefügten HA-tag detektiert werden. Es zeigte sich, dass die Proteine Alb3-

cYFP, Alb3(L313Q,L314A)-cYFP, Alb3(Δ314-317)-cYFP und Alb3(Δ374-388)-cYFP als

4 Ergebnisse 84

YFP-Fusionsproteine ausschließlich in der Membranfraktion nachgewiesen werden

konnten. Als Kontrolle wurden nicht transfizierte Protoplasten eingesetzt. In dieser Probe

waren keine Signale bei der entsprechenden Größe der YFP-Fusionsproteine

nachzuweisen. Damit konnte gezeigt werden, dass die Deletionsproteine von Alb3 in der

Membran integriert vorlagen. Der Verlust der Bindung des cpSRP43 ist daher auf die

Deletion und die Mutation der entscheidenden Binderegionen zurückzuführen und nicht

auf eine fehlende Integration der Proteine in die Membran.

Alb3(Δ374-388)-cYFP

Alb3(Δ314-317)-cYFP

Alb3(L313Q,L314A)-cYFP

Alb3-cYFP

Kontrolle

α-HA

P Ü W

Abbildung 4-12: Expressionsnachweis ausgewählter Alb3 Deletions- und Mutationskonstrukte in Arabidopsis Protoplasten

Arabidopsis Protoplasten wurden mit den angegebenen Konstrukten transient transfiziert und die

Expression der YFP-Fusionsproteine über Immundetektion nachgewiesen. Dazu wurden die

lysierten Zellen abzentrifugiert und der Überstand (Ü) mittels TCA-Fällung präzipitiert. Das

Membranpellet wurde mit 0,2 M NaOH gewaschen (P), zentrifugiert und der Überstand

(W=Waschfraktion) mittels TCA-Fällung präzipitiert. Es folgte die Auftrennung der Proben über eine

SDS-PAGE und die Analyse mittels Immundetektion. Die Expression der cYFP-Fusionsproteine

konnte über einen anti-HA Antikörper (α-HA) nachgewiesen werden. Als Kontrolle wurden nicht


4.2.6 Verifizierung der Binderegionen im Hefe Split-Ubiquitin System

Die Binderegionen im Bereich der Aminosäuren 314-317 und 374-388 von Alb3 sollten im

Hefe Split-Ubiquitin System bestätigt werden. Für den Interaktionstest wurden die

Gensequenzen von Alb3, Alb3(Δ314-317), Alb3(Δ374-388) und Alb3(Δ389-415) in den

pAMBV4-Vektor und die Gensequenz von cpSRP43 in den pADSL-Vektor kloniert. Die

Kontrolle der Cotransformation anhand der Transformationsraten auf dem –LT-Medium

war in allen Ansätzen positiv (Daten nicht gezeigt). Die Cotransformation der Konstrukte

pAMBV4-Alb3, pAMBV4-Alb3(Δ314-317), pAMBV4-Alb3(Δ374-388) und pAMBV4-

4 Ergebnisse 85

Alb3(Δ389-415) mit dem Kontrollplasmid (kodiert für Alg5-NubI) resultierte in einem

Wachstum der Hefezellen auf –LTH-Medium und deutete damit auf einen korrekten

Einbau der Proteine in die Membranen. Durch den Zusatz von 15 mM 3-Aminotriazol

(3-AT), einem kompetitiven Inhibitor des His3-Genproduktes, verringerte sich eine

schwache Eigenaktivierung der Proteine so weit, dass kein Wachstum beim Einsatz des

Kontrollplasmids (kodiert für Alg5-NubG) auf –LTH-Medium mehr sichtbar war.

Die Interaktionsstudien ergaben, dass die Deletionsproteine Alb3(Δ314-317) und

Alb3(Δ374-388) schwächer mit dem cpSRP43 interagierten, als das Volllängenprotein

Alb3 (Tabelle 4-5). Der Einsatz des Deletionsproteins Alb3(Δ389-415) zeigte im Vergleich

zum Volllängenprotein kein verringertes Wachstum der Hefezellen auf –LTH-Medium und

damit eine gleich starke Interaktion der Proteine im Split-Ubiquitin-System (Tabelle 4-5).

Diese Deletion hatte demnach keinen Einfluss auf die Bindung des cpSRP43. Daraus

lässt sich schließen, dass die Deletionen der Aminosäuren 314-317 und 374-388 von Alb3

auch im Hefe System einen deutlichen Effekt auf die Interaktion mit cpSRP43 haben. Bei

allen Transformationen, die ein Wachstum der Hefezellen auf –LTH-Medium aufwiesen,

konnte eine Blaufärbung im Filtertest nachgewiesen werden (Tabelle 4-5). Die

β-Galaktosidase Aktivität basiert auf einer Aktivierung des Reportergens lacZ und damit

auf einer Interaktion der getesteten Proteine.

Tabelle 4-5: Interaktionstest von Alb3 Deletionsproteinen mit cpSRP43 im Hefe Split-Ubiquitin System

Dargestellt sind die Interaktionstests von Alb3 und Alb3 Deletionsproteinen mit cpSRP43 im Hefe

Split-Ubiquitin System. Der Hefe Stamm DSY-1 wurde mit den entsprechenden pAMBV4-

Plasmiden und dem pADSL-cpSRP43 Plasmid cotransformiert und die Aktivierung der

Reportergene ausgewertet. Durch das Wachstum der cotransformierten Hefezellen auf

Minimalmedium (-his) (++ = deutliches Wachstum, + = geringes Wachstum, - = kein Wachstum)

und über die Bestimmung der Enzymaktivität der β-Galaktosidase (β-gal), die durch eine

Blaufärbung der Hefekolonien im β-Galaktosidase Filtertest analysiert wurde (+ = Blaufärbung, - =

keine Blaufärbung), konnten Aussagen über die Interaktion der Proteine getroffen werden.

pADSL-Nx -his β-gal. -his β-gal. -his β-gal -his β-gal

Alg5-NubI ++ + ++ + ++ + ++ +

Alg5-NubG - - - - - - - -

cpSRP43 ++ + + + + + ++ +

pAMBV4-Alb3 (Δ374-388)

pAMBV4-Alb3 (Δ389-415)pAMBV4-Alb3 pAMBV4-Alb3

(Δ314-317)

4 Ergebnisse 86

4.2.7 Pull down Analysen zur Interaktion von Alb3 und cpSRP43

Anhand von pull down Analysen sollte die in vitro Interaktion von Alb3 und cpSRP43

gezeigt werden. Eine rekombinante Expression des Alb3 in E. coli war bisher nicht in

ausreichenden Mengen und ohne deutlichen Abbau des Proteins möglich. Deshalb

wurden die entsprechenden Gensequenzen von Alb3(299-462) und dessen

Deletionskonstrukte in die Vektoren pSS und pIVEX1.3WG kloniert und eine in vitro

Transkription und Translation durchgeführt. Die Translationskontrolle erfolgte über eine

SDS-PAGE mit anschließender Immundetektion. Die erhaltenen Translationsprodukte

konnten für die pull down Versuche mit rekombinantem His-cpSRP43 eingesetzt werden.

Als Kontrollprotein wurde rekombinant erzeugtes His-cpSRP54 auf Interaktion mit den

Translationsprodukten überprüft. Zunächst wurden rekombinantes His-cpSRP43 und His-

cpSRP54 mit den Translationsprodukten von Alb3 inkubiert. Nach Zugabe von Ni-NTA

Agarose erfolgte die Bindung der mit einem His-tag versehenen rekombinanten Proteine.

Durch die Waschung der beads wurden nicht gebundene Proteine entfernt, und die

rekombinanten Proteine His-cpSRP43 und His-cpSRP54 konnten zusammen mit den

gebundenen Translationsprodukten eluiert werden. Der Nachweis der coeluierten

Translationsprodukte erfolgte über eine SDS-PAGE mit anschließender Immundetektion

(Abbildung 4-13 A). Das Translationsprodukt Alb3(299-462) umfasste die Aminosäuren

299-462 und damit den 2. lumenalen loop, die 5. Transmembrandomäne und den

C-Terminus von Alb3. Diese Sequenz von Alb3 wurde bereits für die Methode des

Peptide Scanning eingesetzt. Nach der Immundetektion mit einem Alb3 Antikörper konnte

das Alb3(299-462) in der Eluatfraktion des His-cpSRP43 nachgewiesen werden. Damit

war das Alb3(299-462) in der Lage an das His-cpSRP43 zu binden. In dem Eluat des His-

cpSRP54 war kein Translationsprodukt zu detektieren. Diese Negativkontrolle zeigte,

dass das Alb3(299-462) nicht mit cpSRP54 interagierte. Damit konnte zunächst die

spezifische Interaktion von Alb3 und cpSRP43 bestätigt werden. Im weiteren Vorgehen

sollten die in den vorangegangenen Versuchen identifizierten Bindestellen des Alb3 über

die pull down Versuche bestätigt werden. Dazu wurde das Alb3(299-462) N-terminal

verkürzt, so dass es nur noch die Aminosäuren 320-462 umfasste. Mit dieser Verkürzung

wurde die bisher analysierte Bindestelle im Bereich der Aminosäuren 314-317 entfernt.

Das Protein Alb3(320-462) war allerdings immer noch in der Lage an das cpSRP43 zu

binden. Das gleiche Ergebnis war auch mit dem Protein Alb3(299-462/Δ314-317), bei

dem die Bindestelle der Aminosäuren 314-317 deletiert war, zu verzeichnen. Damit

scheint die Bindestelle innerhalb der 5. Transmembrandomäne von Alb3 für die in vitro

Interaktion im pull down nicht essentiell zu sein. Es zeigte sich allerdings weiterhin durch

den Einsatz des Proteins Alb3(336-462), dass der C-Terminus von Alb3 allein nicht in der

Lage war, mit dem cpSRP43 zu interagieren. Auch das Translationsprodukt Alb3(328-

4 Ergebnisse 87

462), welches den C-Terminus von Alb3 um einen Teil der 5. Transmembrandomäne

verlängerte, reichte noch nicht für eine Coelution mit dem His-cpSRP43 aus. Das Protein

Alb3(320-462) umfasste einen erheblichen Anteil der 5. Transmembrandomäne von Alb3

und ist in der Lage an das His-cpSRP43 zu binden. Damit lässt sich sagen, dass in dem

pull down Versuch nicht exakt die Bindestelle der Aminosäuren 314-317 bestätigt werden

konnte. Jedoch ist ein erheblicher Teil der 5. Transmembrandomäne wichtig, der auch

durch das Peptide Scanning mit den Aminosäuren 305-328 identifiziert wurde (siehe

Abschnitt 4.2.4). Um die zweite Bindestelle von Alb3 innerhalb des C-Terminus zu testen,

wurden in dem Translationsprodukt Alb3(299-462) die Aminosäuren 374-388 deletiert. In

Abbildung 4-13 ist gezeigt, dass das Protein Alb3(299-462/Δ374-388) nicht mehr mit dem

cpSRP43 interagierte. Im Vergleich dazu konnte das Kontrollprotein Alb3(299-462/Δ389-

415), bei dem die Aminosäuren 389-415 fehlten, noch im Eluat der His-cpSRP43 Probe

nachgewiesen werden. Die Bindestelle im C-Terminus mit den Aminosäuren 374-388

konnte daher auch in den pull down Analysen verifiziert werden. Für alle in den Analysen

eingesetzten Alb3 Translationsprodukte war keine Interaktion mit dem His-cpSRP54 zu

verzeichnen. Als weitere Kontrolle wurde der C-Terminus von Alb4 für die in vitro Studien

eingesetzt. Das Translationsprodukt Alb4(328-499) zeigte weder eine Interaktion mit dem

His-cpSRP43 noch mit dem His-cpSRP54.

In einem weiteren pull down Ansatz wurde rekombinantes cpSRP43 mit C-terminalem

His-tag (zur Verfügung gestellt von Beatrix Dünschede, AG Schünemann) eingesetzt. Das

Translationsprodukt Alb3(299-462) wurde sowohl von dem His-cpSRP43, als auch von

dem cpSRP43-His gebunden (Abbildung 4-13 B). Die Lage des tags scheint daher für die

Interaktion keine Rolle zu spielen. Des Weiteren kam ein vorgeformter cpSRP-Komplex

(His-cpSRP43 + cpSRP54 ohne tag) zum Einsatz (zur Verfügung gestellt von Beatrix

Dünschede, AG Schünemann). Auch das im cpSRP-Komplex vorliegende His-cpSRP43

konnte das Translationsprodukt Alb3(299-462) binden (Abbildung 4-13 B). Das His-

cpSRP54 zeigte in dem Kontrollansatz wiederum keine Interaktion mit dem Alb3

Translationsprodukt (Abbildung 4-13 B). Die geringe Menge an coeluiertem

Translationsprodukt war auf nicht ausreichendes Waschen dieses Ansatzes

zurückzuführen, da in dieser mehrfach durchgeführten Kontrolle in weiteren Versuchen

keine Bindung zu beobachten war.

4 Ergebnisse 88

His-43 His-54

Alb3 (299-462)

Alb3 (320-462)

Alb3 (328-462)

Alb3 (336-462)

TP

Alb3 (320-442)

Alb3 (299-462/Δ374-388)

Alb3 (299-462/Δ389-415)

Alb4 (328-499)

Alb3 (299-462/Δ314-317)

A

His-5443-His His-43His-

cpSRP

Alb3 (299-462)

B

Abbildung 4-13: Pull down Analysen von rekombinantem cpSRP43 und cpSRP54

mit in vitro Translationsprodukten von Alb3 und Alb4 Gezeigt sind pull down Analysen von 5 μg rekombinantem His-cpSRP43 (His-43) und His-

cpSRP54 (His-54) mit den angegebenen in vitro translatierten Deletionsproteinen von Alb3 und

Alb4. Zur Kontrolle der in vitro Translation wurden die Translationsprodukte (TP) über eine SDS-

PAGE aufgetrennt, mittels Immundetektion (α-Alb3, α-Alb4) überprüft und gleiche Mengen für den

pull down eingesetzt. Die mögliche Coelution der Translationsprodukte mit den rekombinanten

Proteinen konnte über eine Immundetektion in den jeweiligen Eluatfraktionen nachgewiesen

werden (A). In weiteren pull down Analysen wurden 5 μg rekombinantes cpSRP43-His (43-His),

His-cpSRP43 (His-43), His-cpSRP54 (His-54) und 10 µg His-cpSRP (His-43+54) mit in vitro

translatiertem Alb3(299-462) eingesetzt. Die Eluatfraktionen wurden über eine SDS-PAGE

aufgetrennt und die Coelution des Alb3(299-462) mittels Immundetektion (α-Alb3) nachgewiesen

(B).

4 Ergebnisse 89

4.2.8 Untersuchung der Alb3 Bindestelle im Thylakoidmembran-Bindungstest

Ein Thylakoidmembran-Bindungstest sollte weiteren Aufschluss über die Interaktion von

Alb3 und cpSRP43 an der Thylakoidmembran geben. Die Thylakoidmembranen wurden

zunächst salzgewaschen, um peripher gebundene Proteine zu entfernen. Darauf erfolgte

die Inkubation von 2 µg rekombinantem His-cpSRP43 mit den Thylakoidmembranen, das

Waschen der Membranen mit 1 M NaCl und die Aufnahme des Membranpellets in SDS-

Probenpuffer. Die Überprüfung der Bindung des His-cpSRP43 an die Membranen erfolgte

über eine SDS-PAGE mit anschließender Immundetektion. Das Ergebnis zeigte eine

salzresistente Bindung des His-cpSRP43 an die Thylakoidmembranen, da das

rekombinante Protein in den Waschschritten mit 1 M NaCl nicht entfernt werden konnte

(Abbildung 4-14). Unter gleichen Bedingungen wurde keine Bindung des Kontrollproteins

GST an die Membranen beobachtet (Daten nicht gezeigt). Im darauf folgenden Ansatz

wurde versucht, die Bindung des rekombinanten His-cpSRP43 an die Membranen mit

einem synthetischen Peptid von Alb3 zu inhibieren (Abbildung 4-14). Das synthetische

Peptid umfasste die Aminosäuren 367-388 und beinhaltet damit die bereits identifizierte

Bindestelle des C-Terminus von Alb3 (Aminosäuren 374-388). Das rekombinante His-

cpSRP43 wurde zunächst mit dem synthetischen Alb3-Peptid vorinkubiert, bevor die

Bindung an die Thylakoidmembranen erfolgte. Die Zugabe von 250 µg des Peptids

verringerte im Vergleich zu dem Ansatz ohne Peptidvorinkubation die Bindung des His-

cpSRP43 an die Membranen. Bei Steigerung der Peptidmenge auf 500 µg wurde der

inhibierende Effekt größer. Es konnte weniger rekombinantes Protein an die

Thylakoidmembranen binden, als bei Vorinkubation mit 250 µg Alb3-Peptid und ohne

Peptid. Als Kontrolle wurde ein Peptid eingesetzt, welches die Aminosäuren 382-395 des

C-Terminus von Alb4 umfasste. Die Vorinkubation des His-cpSRP43 mit 250 µg des Alb4-

Peptids zeigte keine Verringerung der Bindung an die Membranen. Auch die Steigerung

der Peptidmenge auf 500 µg hatte keinen Einfluss auf die Membraninteraktion des His-

cpSRP43. Als Ladekontrolle der Ansätze diente der Nachweis des Alb3 Proteins in der

Thylakoidmembran. Mit dem Thylakoidmembran-Bindungstest konnte eine salzresistente

Bindung des rekombinanten His-cpSRP43 an die Membranen ermittelt werden. Zudem

wurde gezeigt, dass das Alb3-Peptid vermutlich mit dem cpSRP43 interagierte und somit

die Membranbindung verringerte. Dieses Ergebnis stützt daher die Identifizierung der

Bindestelle innerhalb des C-Terminus (Aminosäuren 374-388) von Alb3.

4 Ergebnisse 90

His-43

Alb3 Peptid

250 µg 500 µg

Alb4 Peptid

250 µg 500 µg0 µg

Alb3

Abbildung 4-14: Einfluss eines synthetischen Peptids von Alb3 auf die Thylakoidmembranbindung von cpSRP43

Für den Thylakoidmembran-Bindungstest wurden 2 µg rekombinantes His-cpSRP43 (His-43) mit

Thylakoidmembranen (50 µg Chlorophyll) inkubiert. Die Membranen wurden mit 1 M NaCl

gewaschen und das Membranpellet in SDS-Probenpuffer aufgenommen. Für die Peptidinhibierung

wurde das rekombinante Protein His-cpSRP43 zunächst mit 250 µg und 500 µg des Alb3 Peptids

bzw. Alb4 Peptids vorinkubiert. Das Alb3 Peptid umfasste die Aminosäuren 367-388 von Alb3 und

das Alb4 Peptid die Aminosäuren 382-395 der Alb4 Sequenz. Aliquots der Proben wurden über

eine SDS-PAGE aufgetrennt und die Bindung des His-cpSRP43 an die Thylakoidmembranen

mittels Immundetektion (α-chaos) analysiert. Als Ladekontrolle diente ein Western Blot Nachweis

des Alb3 in den Thylakoidmembranen.

4.2.9 Analyse der Bindedomäne des cpSRP43 für das Alb3

In einer Masterarbeit, die in unserer Arbeitsgruppe parallel zu dieser Arbeit angefertigt

wurde, sollte die Interaktionsdomäne des cpSRP43 für das Alb3 identifiziert werden

(Vörös, 2007). Das cpSRP43 Protein besitzt eine N-terminale Chromodomäne (CD1),

gefolgt von vier Ankyrin repeats (Ank1-4) und zwei C-terminalen Chromodomänen (CD2,

CD3). Es wurden vorab verschiedene GST-cpSRP43 Deletionsproteine auf mögliche

Interaktion mit den Membranen im Thylakoidmembran-Bindungstest analysiert. Dabei

stellte sich heraus, dass die Ankyrin repeat Region 4 des cpSRP43 eine entscheidende

Bedeutung für die Bindung des Proteins an die Thylakoidmembran haben könnte, da das

GST-cpSRP43ΔAnk4, bei dem die Ankyrin repeat Region 4 deletiert wurde, nicht mehr in

der Lage war, an die Membranen zu binden (Vörös, 2007). Ausgehend von diesem

Ergebnis sollte nun überprüft werden, ob die Deletion der anderen Ankyrin repeats 1-3

einen Effekt auf die Membranbindung des jeweiligen Proteins hat. Die Deletionen der

Ankyrin repeats innerhalb der cpSRP43 Sequenz sind anhand von Strukturvorhersagen

(Klimyuk et al., 1999; Jonas-Straube et al., 2001; Goforth et al., 2004) für die Regionen

vorgenommen worden. Diese Vorhersagen weichen allerdings teilweise von der kürzlich

4 Ergebnisse 91

publizierten Kristallstruktur des cpSRP43 ab (Stengel et al., 2008) und sind vergleichend

in Abbildung 4-15 dargestellt. Während die α-Helices der Ankyrin repeats 1, 2 und 3 (α1-

6) in dem Bereich der vorhergesagten Sequenz liegen, gibt es bei der Ankyrin repeat

Region 4 eine Abweichung zu der Kristallstruktur. Die Kristallstruktur zeigt einen direkten

Übergang von Ankyrin repeat 4 (α7+8) zur Chromodomäne 2, während in den

Vorhersageprogrammen zwischen Ankyrin repeat 4 und Chromodomäne 2 eine linker

Sequenz (Aminosäuren 252-267) liegt.

1 MQKVFLAMDTCALVIHQSLSRIKLSPPKSSSSSSSAFSPESLPIRRIELCFRGAICAAVQ

61 RNYEETTSSVEEAEEDDESSSSYGEVNKIIGSRTAGEGAMEYLIEWKDGHSPSWVPSSYI

121 AADVVSEYETPWWTAARKADEQALSQLLEDRDVDAVDENGRTALLFVAGLGSDKCVRLLA

181 EAGADLDHRDMRGGLTALHMAAGYVRPEVVEALVELGADIEVEDERGLTALELAREILKT

241 TPKGNPMQFGRRIGLEKVINVLEGQVFEYAEVDEIVEKRGKGKDVEYLVRWKDGGDCEWV

301 KGVHVAEDVAKDYEDGLEYAVAESVIGKRVGDDGKTIEYLVKWTDMSDATWEPQDNVDST

361 LVLLYQQQQPMNE

Transitsequenz

β1 β2 β3CD1

CD2

CD3

α1a/b α2 α3 α4

α5 α6 α7

α8

Ank1 Ank2

Ank3 Ank4

B

A cpSRP43 A1 A2 A3 A4 CD3CD2CD2CD1

Abbildung 4-15: Schematische Darstellung des cpSRP43 Das stromale Protein cpSRP43 besteht aus einer N-terminalen Chromodomäne (CD1), gefolgt von

vier Ankyrin repeats (Ank1-4) und zwei C-terminalen Chromodomänen (CD2, CD3) (A). In der

Aminosäuresequenz sind die β-Faltblätter der Chromodomäne 1 (β1-3, graue Pfeile) sowie die

α-Helices der Ankyrin repeats (α1-8, graue Balken) aus der Kristallstruktur näher dargestellt

(verändert nach Stengel et al., 2008) (B). Die Bereiche der Ankyrin repeats, die aus

Vorhersageprogrammen für diese Arbeit verwendet wurden, sind in der Aminosäuresequenz rot

dargestellt (Klimyuk et al., 1999; Jonas-Straube et al., 2001; Goforth et al., 2004). Während die α-

Helices der Ankyrin repeats 1-3 innerhalb der vorhergesagten Bereiche liegen, zeigt die Ankyrin

repeat Region 4 auf Grundlage der Kristallstruktur einen zur Chromodomäne 2 verlängerten

Bereich im Vergleich zur Vorhersage.

4 Ergebnisse 92

Die Deletionen der Ankyrin repeats innerhalb des cpSRP43 Proteins konnten über die

overlap-PCR erzeugt werden. Die entsprechenden Gensequenzen wurden in den

Expressionsvektor pGEX4T3 kloniert und in den E. coli Überexpressionsstamm

BL21(DE3) transformiert. Die exprimierten Proteine GST-cpSRP43ΔAnk1, GST-

cpSRP43ΔAnk2 und GST-cpSRP43ΔAnk3 konnten über den N-terminal angefügten GST-

tag mittels Glutathion Sepharose mit einer Größe von etwa 65 kDa aufgereinigt werden

und standen für den Thylakoidmembran-Bindungstest zur Verfügung (Abbildung 4-16 A).

Das Volllängenprotein GST-cpSRP43 sowie das Deletionsprotein GST-cpSRP43ΔAnk4

lagen bereits vor.

72554334

kDa

A

72

55433426

TM - +kDa

- + - + - + - +

GST-43ΔA2

GST-43ΔA3

GST-43ΔA4

GST-43ΔA1

GST-43

B

Abbildung 4-16: Thylakoidmembran-Bindungstest mit GST-cpSRP43 Deletionsproteinen (I)

Aliquots der aufgereinigten GST-Fusionsproteine von cpSRP43 wurden über eine SDS-PAGE

aufgetrennt und die Proteine mit Coomassie angefärbt (A). Für den Thylakoidmembran-

Bindungstest wurden 2 µg aufgereinigtes Protein mit salzgewaschenen Thylakoidmembranen

(50 µg Chlorophyll) inkubiert, diese mit 1 M NaCl gewaschen und das Pellet in SDS-Probenpuffer

aufgenommen. Aliquots dieser Proben wurden über eine SDS-PAGE aufgetrennt und die Bindung

der rekombinanten Proteine mittels Immundetektion (α-chaos) nachgewiesen (+TM). Als Kontrolle

der eingesetzten Mengen wurden die rekombinanten Proteine ebenfalls über eine SDS-PAGE

aufgetrennt und eine Immundetektion (α-chaos) durchgeführt (-TM) (B). (TM: Thylakoid-

membranen; A: Ankyrin repeat)

4 Ergebnisse 93

Die rekombinant erzeugten GST-Fusionsproteine des cpSRP43 wurden zunächst mit

salzgewaschenen Thylakoidmembranen inkubiert. Nach Waschen mit 1 M NaCl und

Resuspendieren der Membranen in SDS-Probenpuffer, konnte die Bindung der Proteine

über eine Immundetektion ausgewertet werden. Das Volllängenprotein GST-cpSRP43

war in der Lage an die Membranen zu binden. Des Weiteren konnte bestätigt werden,

dass die Deletion der Ankyrin repeat Region 4 einen Verlust der Bindung des

rekombinanten Proteins an die Thylakoidmembranen zur Folge hatte (Abbildung 4-16 B).

Die Deletion der Ankyrin repeats 1, 2 und 3 hatte keinen Einfluss auf die

Membranbindung der entsprechenden Proteine. Die Proteine GST-cpSRP43ΔAnk1, GST-

cpSRP43ΔAnk2 und GST-cpSRP43ΔAnk3 zeigten alle eine Interaktion mit der

Thylakoidmembran und konnten somit über die Immundetektion nachgewiesen werden

(Abbildung 4-16 B). Als Kontrolle der eingesetzten Mengen wurden die rekombinanten

Proteine ebenfalls über eine SDS-PAGE aufgetrennt und eine Immundetektion

durchgeführt. Das Ergebnis des Thylakoidmembran-Bindungstests deutet darauf hin, dass

spezifisch die Ankyrin repeat Region 4 für die Membranbindung des cpSRP43

verantwortlich ist.

Um weiterhin die Spezifität der Ankyrin repeat Region 4 des cpSRP43 für die Interaktion

mit den Thylakoidmembranen zu zeigen, wurden weitere Deletionsproteine des cpSRP43

erstellt. Aus bereits vorangegangenen Arbeiten (Vörös, 2007) war ersichtlich, dass das

Deletionsprotein GST-cpSRP43(Ank4+CD2) inklusive der linker Sequenz noch für eine

Membranbindung ausreichend war. Mittels overlap-PCR war es möglich jeweils die

anderen Ankyrin repeats 1-3 vor die linker Sequenz und die Chromodomäne 2 zu

klonieren. Die Gensequenzen dieser Deletionsproteine wurden ebenfalls in den

Expressionsvektor pGEX4T3 kloniert und die Proteine im E. coli Expressionsstamm

BL21(DE3) überexprimiert. Die Fusionsproteine GST-cpSRP43(Ank1+CD2), GST-

cpSRP43(Ank2+CD2) und GST-cpSRP43(Ank3+CD2) konnten über den N-terminal

angefügten GST-tag mittels Glutathion Sepharose mit einer Größe von etwa 36 kDa

aufgereinigt werden. Die Eluate der neu erstellten, aufgereinigten Deletionsproteine

wurden mit den bereits vorhandenen Proteinen GST-cpSRP43, GST-

cpSRP43(Ank4+CD2) sowie GST-cpSRP43(CD2+3) über eine SDS-PAGE mit

anschließender Coomassie Färbung überprüft (Abbildung 4-17 A). Das Volllängenprotein

GST-cpSRP43 sowie die Deletionsproteine GST-cpSRP43(Ank1+CD2), GST-

cpSRP43(Ank2+CD2), GST-cpSRP43(Ank3+CD2), GST-cpSRP43(Ank4+CD2) und GST-

cpSRP43(CD2+3) wurden in den Thylakoidmembran-Bindungstest eingesetzt. Als

Kontrolle der eingesetzten Mengen wurden die rekombinanten Proteine über eine SDS-

PAGE aufgetrennt und eine Immundetektion durchgeführt (Abbildung 4-17 B). Es konnte

zunächst bestätigt werden, dass neben dem Volllängenprotein GST-cpSRP43 auch das

Deletionsprotein GST-cpSRP43(Ank4+CD2) noch an die Thylakoidmembranen binden

4 Ergebnisse 94

konnte. Ein Kontrollprotein bestehend aus der Chromodomäne 2 und 3 (GST-

cpSRP43(CD2+3)) war nicht in der Lage mit den Membranen zu interagieren. Die

Western Blot Analysen des Thylakoidmembran-Bindungstest zeigten weiterhin, dass

durch eine Kombination der Ankyrin repeats 1, 2 und 3 mit der Chromodomäne 2 keine

Bindung der Proteine an die Membran erreicht werden konnte (Abbildung 4-17 B). Das

Ergebnis lässt darauf schließen, dass spezifisch die Ankyrin repeat Region 4 gemeinsam

mit der Chromodomäne 2 die Membranbindung des cpSRP43 ermöglichte. Ein Austausch

der Ankyrin repeat Region 4 gegen die anderen Ankyrin repeats bedeutete einen Verlust

der Bindefähigkeit.

72554334

26

kDa

GST-43 GST-43(A1+CD2)

GST-43(A2+CD2)

GST-43(A3+CD2)

GST-43(A4+CD2)

GST-43(CD2+3)

- + - + - + - + - + - + TM

B

A

Abbildung 4-17: Thylakoidmembran-Bindungstest mit GST-cpSRP43 Deletionsproteinen (II)

Zur Kontrolle der Aufreinigung wurden Aliquots der GST-Fusionsproteine von cpSRP43 mittels

SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend mit Coomassie angefärbt (A). Für den

Thylakoidmembran-Bindungstest wurden 2 µg aufgereinigtes Protein mit salzgewaschenen

Thylakoidmembranen (50 µg Chlorophyll) inkubiert, diese mit 1 M NaCl gewaschen und das Pellet

in SDS-Probenpuffer aufgenommen. Aliquots dieser Proben wurden über eine SDS-PAGE

aufgetrennt und die Bindung der rekombinanten Proteine mittels Immundetektion (α-chaos)

nachgewiesen (+ TM). Als Kontrolle der eingesetzten Mengen wurden die rekombinanten Proteine

ebenfalls über eine SDS-PAGE aufgetrennt und eine Immundetektion (α-chaos) durchgeführt

(- TM) (B). (TM: Thylakoidmembranen; A: Ankyrin repeat; CD: Chromodomäne)

4 Ergebnisse 95

4.3 Analyse der Interaktion von Alb3 und Alb4 mit den Proteinen der Thylakoidmembran

Nachdem die Rolle von Alb3 und Alb4 innerhalb des cpSRP-Transportwegs näher

untersucht worden war, sollte in einem weiteren Projekt die Interaktion der beiden

Proteine untereinander und mit anderen Thylakoidmembranproteinen analysiert werden.

Dazu wurden mit dem chemischen Crosslinking, der bimolekularen

Fluoreszenzkomplementation, der Gelfiltration und der Coimmunpräzipitation mehrere

methodische Ansätze gewählt.

4.3.1 Crosslinking der Thylakoidmembranproteine

Um mögliche Interaktionspartner von Alb3 und Alb4 innerhalb der Thylakoidmembran zu

identifizieren, wurde die Methode des chemischen Crosslinkings durchgeführt. Dabei

werden Proteine, die sich in der Thylakoidmembran in räumlicher Nähe befinden, kovalent

aneinander gebunden. Zur Analyse der Protein-Protein Interaktion standen bereits eine

Auswahl an chemischen Crosslinkern im Labor zur Verfügung (AEDP, BS3, DSG, MBS,

sMBS, SPDP). Dabei handelte es sich um homo- und heterobifunktionale Crosslinker, die

gleiche bzw. zwei unterschiedliche reaktive Gruppen besaßen. Die Wahl unterschiedlicher

Crosslinker ermöglichte es verschiedene Bedingungen abzudecken. So dienen z. B.

unterschiedlich lange spacer für die Vernetzung von Proteinen mit verschiedenen

Abständen. Die unterschiedlichen Eigenschaften der Crosslinking Reagenzien dienen

dazu hydrophobe, membranständige und hydrophile, lösliche Bereiche der

Thylakoidmembranproteine zu vernetzen.

Für die Studien wurden Thylakoidmembranen mit den verschiedenen Crosslinkern

inkubiert, gewaschen und in SDS-Probenpuffer aufgenommen. Aliquots der vernetzten

Thylakoidmembranproteine wurden über eine SDS-PAGE aufgetrennt und mögliche

Crosslinking-Produkte von Alb3 und Alb4 über eine Immundetektion identifiziert. Durch

den Einsatz des Crosslinkers sMBS (m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide

ester) konnte ein Crosslinking-Produkt bei ca. 170 kDa erzeugt werden, welches das Alb4

Protein enthielt (Abbildung 4-18). Es zeigte sich, dass eine Konzentration von 0,6 mM des

sMBS zu einem spezifischen Produkt führte. In allen anderen Ansätzen mit den

verschiedenen Crosslinking Reagenzien, die zudem in variablen Konzentrationen

eingesetzt worden waren, konnten nach der Immundetektion mit dem Alb3 und dem Alb4

Antikörper keine weiteren Crosslinking-Produkte identifiziert werden (Daten nicht gezeigt).

Die Spezifität des Alb4 Crosslinking-Produktes wurde durch den Einsatz des

affinitätsgereinigten α-Alb4 Antikörpers bestärkt. Als Kontrolle wurden Thylakoid-

membranen ohne vorherige Inkubation mit dem Crosslinker sMBS aufgetragen. Dieser

4 Ergebnisse 96

Western Blot zeigte auf der Höhe von 170 kDa kein Signal (Abbildung 4-18). Im nächsten

Schritt sollten die weiteren Proteinkomponenten des Crosslinking-Produktes und damit

mögliche Proteine eines gemeinsamen Komplexes von Alb4 identifiziert werden. Dazu

wurden die mit sMBS vernetzten Thylakoidmembranen über eine SDS-PAGE aufgetrennt

und die Proteine mit Coomassie angefärbt. Die Coomassie gefärbte Proteinbande des

170 kDa großen Crosslinking-Produktes wurde entfärbt, mittels Trypsin verdaut und die

Peptide aus der Gelmatrix zum Zweck der Massenspektrometrie eluiert. Mit Hilfe des

massenspektrometrischen Verfahrens (in Kooperation mit PD Dr. Markus Piotrowski,

Ruhr-Universität Bochum) konnten die Proteinuntereinheiten CF1α und CF1β der

chloroplastidären ATP-Synthase in dem Crosslinking-Produkt identifiziert werden (Daten

nicht gezeigt). Unter Verwendung eines vorliegenden spezifischen Antikörpers wurde die

ATP-Synthase Untereinheit CF1β als Bestandteil des Crosslinking-Produktes bestätigt, da

die Western Blot Analyse ein spezifisches 170 kDa großes Crosslinking Signal in den mit

dem Crosslinking Reagenz sMBS behandelten Thylakoidmembranen zeigte. In der

Kontrollspur ohne Reagenz blieb das Signal auf der entsprechenden Höhe aus (Abbildung

4-18). Für die Kontrolle der Spezifität wurden die Crosslinking Ansätze zudem mit

Antikörpern gegen Alb3 und cpSecY behandelt. Die Western Blot Analysen zeigten in den

Spuren mit und ohne Crosslinker keine Signale auf der Höhe von 170 kDa (Abbildung

4-18). Die Proteine Alb3 und cpSecY waren somit keine Komponenten dieses vernetzten

170 kDa großen Proteinkomplexes. Mit Hilfe des chemischen Crosslinkings und dem

damit identifizierten Produktes wurde eine mögliche Assoziation von Alb4 mit der ATP-

Synthase gezeigt.

72

55

43

kDa

95

130170

sMBS - + - + - + - +

α-Alb4 α-CF1β α-Alb3 α-cpSecY

* *

Abbildung 4-18: Crosslinking von Alb4 und CF1β Thylakoidmembranen (100 µg Chlorophyll) wurden mit (+) und ohne (-) dem chemischen

Crosslinker sMBS (m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester) (0,6 mM) inkubiert, über

eine SDS-PAGE aufgetrennt und unter Verwendung spezifischer Antikörper gegen Alb4, CF1β,

Alb3 und cpSecY in einer Immundetektion analysiert. (*spezifisches 170 kDa Crosslinking-Produkt)

4 Ergebnisse 97

4.3.2 Interaktion von Alb4 mit den kernkodierten ATP-Synthase Untereinheiten im Split-YFP System

Um die direkte Assoziation von Alb4 mit der ATP-Synthase zu untersuchen, wurde die

bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (Split-YFP System) verwendet. Für diese

Technik wurden lediglich die kernkodierten Untereinheiten der ATP-Synthase (CF1γ, CF1δ

und CF0II) eingesetzt, da der Transport der Proteine in den Chloroplasten einem

posttranslationalen Transport entspricht. Die chloroplastidär kodierten Untereinheiten der

ATP-Synthase (CF1α, CF1β, CF1ε, CF0I, CF0III, CF0IV) werden cotranslational in die

Thylakoidmembran inseriert. Im Falle der Protoplastentransfektion müssten diese

Proteine über die chloroplastidäre Transitsequenz der kleinen Untereinheit der Rubisco

posttranslational in den Chloroplasten transportiert werden. Deshalb wurden diese

Untereinheiten im Split-YFP System nicht eingesetzt, da der Mechanismus des

cotranslationalen Transports nicht mehr gegeben wäre. Die Gensequenzen der

kernkodierten ATP-Synthase Untereinheiten (CF1γ, CF1δ und CF0II) wurden in den

pSPYNE-Vektor kloniert. Die Konstrukte pSPYCE-Alb4 und pSPYCE-Alb3 lagen bereits

aus anderen Messungen vor (Kapitel 4.2.2). Für die Interaktionsmessungen wurden

Arabidopsis Protoplasten mit den entsprechenden Konstrukten transient transfiziert und

die YFP-Fluoreszenz am Laserscanning Mikroskop analysiert. Im Fall der Expression, des

Imports in die Chloroplasten und des korrekten Einbaus in die Thylakoidmembranen

kommt es bei einer Proteininteraktion zur Rekonstitution des funktionalen YFP. Die

Messungen ergaben eine Interaktion der YFP-Fusionsproteine Alb4-cYFP und CF0II-

nYFP, wodurch die Fluoreszenz des YFP rekonstituiert werden konnte (Abbildung 4-19).

Die Überlagerung der YFP-Fluoreszenz mit der Autofluoreszenz des Chlorophylls zeigte

die Interaktion der beiden Proteine innerhalb der Chloroplasten. Als Kontrolle wurden die

Vektoren pSPYNE-TS(rbcs) und pSPYCE-TS(rbcs) eingesetzt und die Protoplasten mit

den entsprechenden Konstrukten cotransfiziert. Die Kontrollen zeigten, dass weder das

Fusionsprotein Alb4-cYFP noch das CF0II-nYFP die YFP-Fluoreszenz mit dem jeweiligen

einzelnen YFP-Fragment rekonstituieren konnte. Es zeigte sich jedoch keine Interaktion

von Alb4-cYFP mit den anderen getesteten ATP-Synthase Untereinheiten (CF1γ-nYFP

und CF1δ-nYFP). Im Vergleich zu dem Alb4 konnte das Alb3 mit keiner der getesteten

ATP-Synthase Untereinheiten interagieren (Daten nicht gezeigt).

4 Ergebnisse 98


CF0II-nYFP/Alb4-cYFP

TS(rbcs)-nYFP/Alb4-cYFP

CF0II-nYFP/TS(rbcs)-cYFP

Abbildung 4-19: Alb4 interagiert mit der ATP-Synthase Untereinheit CF0II in Arabidopsis thaliana Protoplasten

Anhand der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (Split-YFP System) wurde die Interaktion

von Alb4 mit der ATP-Synthase Untereinheit CF0II in Arabidopsis Protoplasten (in vivo, in planta)

gemessen. Die zu testenden Proteine wurden an die N- bzw. C-terminale Hälfte des YFP fusioniert

und die Protoplasten mit den entsprechenden Plasmiden transient transfiziert. Die rekonstituierte

Fluoreszenz des YFP im Falle einer Interaktion der Proteine konnte über die konfokale

Laserscanning Mikroskopie visualisiert werden. Dargestellt sind die YFP-Fluoreszenz, die

Chlorophyll-Autofluoreszenz und die Überlagerung beider Bilder. In den Kontrollen wurden die

Protoplasten mit dem Plasmid der angegebenen Fusionsproteine und dem entsprechenden

Kontrollplasmid pSPYNE-TS(rbcs) bzw. pSPYCE-TS(rbcs) cotransfiziert. Bei den

Kontrollplasmiden wurde die Transitsequenz der kleinen Untereinheit der Rubisco vor die

entsprechende Hälfte des YFP fusioniert, wodurch der Import der einzelnen YFP-Hälften in den

Chloroplasten erfolgte.

Die spezifische Interaktion von Alb4-cYFP und CF0II-nYFP sollte weiterhin durch den

Nachweis der Expression und den korrekten Einbau der Proteine in die

Thylakoidmembran bestärkt werden. Dazu wurden die transient transfizierten

Protoplasten pelletiert und die Zellen lysiert. Nach der Lyse und anschließender

Zentrifugation wurden die Proteine des Überstands mit Trichloressigsäure gefällt. Durch

4 Ergebnisse 99

die Waschschritte des Membranpellets mit 0,2 M NaOH sollten peripher gebundene

Proteine abgelöst werden. Der entstehende Überstand (Waschfraktion) wurde ebenfalls

einer TCA-Fällung unterzogen. Die Proteine des gewaschenen Membranpellets sowie die

Proben aus den TCA-Fällungen wurden über eine SDS-PAGE aufgetrennt und mittels

Immundetektion ausgewertet. Dabei konnte das nYFP-Fusionsprotein über den

angefügten c-myc-tag und das cYFP-Fusionsprotein über den HA-tag nachgewiesen

werden (Abbildung 4-20). Es zeigte sich, dass die YFP-Fusionsproteine Alb4-cYFP und

CF0II-nYFP ausschließlich in der Membranfraktion lokalisiert waren und nicht in den

löslichen Fraktionen vorlagen. Als Kontrollen wurden jeweils nicht transfizierte

Protoplasten aufgearbeitet. In diesen Proben waren keine Signale bei der entsprechenden

Größe der YFP-Fusionsproteine zu detektieren. Durch den Nachweis der Expression und

die korrekte Insertion der YFP-Fusionsproteine in die Membran konnte die Interaktion von

Alb4 und CF0II bekräftigt werden.

Alb4-cYFP

Kontrolle

Kontrolle

CF0II-nYFP

P

α-HA

α-c-myc

Ü W

P Ü W

Abbildung 4-20: Expressionsnachweis der YFP-Fusionsproteine Alb4-cYFP und CF0II-nYFP

Arabidopsis Protoplasten wurden mit den entsprechenden Konstrukten transient transfiziert und die

Expression der YFP-Fusionsproteine (Alb4-cYFP und CF0II-nYFP) über Immundetektion

nachgewiesen. Dazu wurden die lysierten Zellen abzentrifugiert und der Überstand (Ü) mittels

TCA-Fällung präzipitiert. Das Membranpellet wurde mit 0,2 M NaOH gewaschen (P), zentrifugiert

und der Überstand (W=Waschfraktion) mittels TCA-Fällung präzipitiert. Die Proben wurden über

eine SDS-PAGE aufgetrennt und über Immundetektion analysiert. Die Expression konnte über

einen anti-HA Antikörper (α-HA) für das Alb4-cYFP-Fusionsprotein und einen anti-c-myc Antikörper

(α-c-myc) für das CF0II-nYFP-Fusionsprotein gezeigt werden. Als Kontrolle wurden nicht


4 Ergebnisse 100

4.3.3 Gelfiltrationsanalyse solubilisierter Thylakoidmembranproteine

Um eine Assoziation von Alb4 mit der ATP-Synthase zu verifizieren, wurden die

Proteinkomplexe solubilisierter Thylakoidmembranen über eine Gelfiltrations-

chromatographie fraktioniert. Die Präsenz der Proteine Alb4, Alb3, cpSecY, CF1β, CF0II

und CF0III in den einzelnen Fraktionen wurde mittels Immundetektion über spezifische

Antikörper ausgewertet (Abbildung 4-21). Die Western Blot Analysen zeigten, dass der

überwiegende Teil von Alb4 mit den ATP-Synthase Untereinheiten CF1β, CF0II und CF0III

bei einem Molekulargewicht von 360-450 kDa von der Gelfiltrationssäule coeluierte.

Weiterhin konnte aus vorangegangenen Arbeiten (Klostermann et al., 2002) bestätigt

werden, dass die Alb3 und cpSecY beinhaltenden Proteinkomplexe mit einer Größe von

etwa 150-200 kDa von der Gelfiltrationsmatrix eluiert wurden. Diese Fraktionen

überlappten nur geringfügig mit den Alb4 Eluaten. Somit konnte gezeigt werden, dass

Alb4 mit der ATP-Synthase cofraktioniert und nur geringfügig mit Alb3 oder cpSecY.

~150 kDa ~15 kDaTM

~360 kDa

Alb3

cpSecY

Alb4

CF1β

~3600 kDa

CF0III

CF0II

Abbildung 4-21: Alb4 cofraktioniert mit den ATP-Synthase Untereinheiten Thylakoidmembranen (500 µg Chlorophyll) wurden mit 1,5 % Dodecyl-β-D-maltosid solubilisiert

und die Proteinkomplexe über eine Gelfiltrationssäule in 1 ml Fraktionen eluiert. Aliquots der

Fraktionen und solubilisierter Thylakoidmembranen wurden über eine SDS-PAGE aufgetrennt und

mittels spezifischer Antikörper gegen Alb4, Alb3, cpSecY, CF1β, CF0II und CF0III in einer

Immundetektion analysiert. (TM, solubilisierte Thylakoidmembranen)

4 Ergebnisse 101

4.3.4 Coimmunpräzipitation solubilisierter Thylakoidmembranproteine

Anhand von Coimmunpräzipitationsexperimenten sollte zunächst bestätigt werden, dass

Alb4 mit der ATP-Synthase assoziiert vorliegt und keine Komponente der Alb3 und

cpSecY beinhaltenden Proteinkomplexe ist. Dazu wurden solubilisierte Thylakoid-

membranen mit den an Protein-A-Sepharose gekoppelten Antikörpern α-Alb3, α-Alb4 und

α-cpSecY inkubiert. Die Präzipitate wurden über eine SDS-PAGE aufgetrennt und mittels

Immundetektion analysiert (Abbildung 4-22). Da die Präzipitate nicht vollständig frei von

den Antikörper IgGs waren, musste für die Präzipitation des Alb4 der α-Alb4 Antikörper

aus Kaninchen und für die Detektion des Alb4 der in dieser Arbeit bereits beschriebene

α-Alb4 Antikörper aus Ratte verwendet werden. Dieses war erforderlich, da die IgGs mit

einer Größe von etwa 55 kDa auf der gleichen Höhe wie das Alb4 liefen. Der Nachweis

mit dem Antikörper aus Kaninchen wäre somit nicht möglich gewesen, da die IgGs das

Alb4 bei einer Immundetektion überdecken würden. Die Herstellung eines spezifischen

α-Alb4 Antikörpers aus Ratte (oder einem anderen Organismus) war für die Methode der

Coimmunpräzipitation von entscheidender Bedeutung und Notwendigkeit.

TM IP

cpSecY

Alb3

Alb4

Abbildung 4-22: Coimmunpräzipitation von Alb3, Alb4 und cpSecY Thylakoidmembranen (500 µg Chlorophyll) wurden mit 1,5 % Digitonin solubilisiert und mit den an

Protein-A-Sepharose gekoppelten α-Alb3, α-Alb4 (Kaninchen) und α-cpSecY Antikörpern

immunpräzipitiert. Aliquots der Coimmunpräzipitate und solubilisierter Thylakoidmembranen

wurden über eine SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Immundetektion analysiert. Der Nachweis

des Alb4 in den Präzipitaten erfolgte mit einem α-Alb4 Antikörper aus Ratte zur Vermeidung der

Detektion der Kaninchen IgGs auf Höhe des Alb4 Proteins. (IP: Immunpräzipitation, TM:

solubilisierte Thylakoidmembranen)

4 Ergebnisse 102

Die Western Blot Analysen zeigten, dass bei Verwendung des α-Alb3 Antikörpers das

Alb3 zusammen mit cpSecY copräzipitiert werden konnte. Gleiches gilt bei Einsatz des α-

cpSecY Antikörpers, wodurch die Coimmunpräzipitation der Proteine Alb3 und cpSecY

gezeigt werden konnte. Dieses Ergebnis ist eine Bestätigung der bereits in Klostermann

et al., 2002 veröffentlichten Daten. Weiterhin zeigte sich, dass weder Alb3 noch cpSecY

mit dem Alb4 unter Verwendung des α-Alb4 Antikörpers coimmunpräzipitiert werden

konnte. Auch die Präzipitate des α-Alb3 Antikörpers und α-cpSecY Antikörpers

beinhalteten kein Alb4 Protein. Dieses unterstützt die Aussage, dass die Proteine Alb3

und Alb4 in verschiedenen Thylakoidmembrankomplexen assoziiert sind. Weiterhin

musste allerdings festgestellt werden, dass die Analyse der Alb4 Präzipitate keine

Coimmunpräzipitation von Alb4 mit den ATP-Synthase Untereinheiten zeigte. Die

Assoziation von Alb4 mit der ATP-Synthase konnte daher mittels Coimmunpräzipitation

nicht bestätigt werden.

5 Diskussion 103

5. Diskussion

Die Mitglieder der Oxa1/YidC/Alb3-Proteinfamilie haben eine essentielle Bedeutung für

der Insertion und Assemblierung von Membranproteinen in Mitochondrien, Bakterien und

Chloroplasten (Kuhn et al., 2003; Xie und Dalbey, 2008). In der vorliegenden Arbeit sollte

die Rolle der chloroplastidären Homologe der Oxa1/YidC/Alb3-Proteinfamilie (Alb3 und

Alb4) bei der Biogenese der Thylakoidmembran von Arabidopsis thaliana analysiert

werden. Das integrale Thylakoidmembranprotein Alb3 ist für die posttranslationale

Insertion der Lichtsammelkomplexproteine (LHCPs) verantwortlich (Sundberg et al., 1997;

Moore et al., 2000). Zudem ist Alb3 mit der cpSec-Translokase assoziiert und scheint

daher an der cotranslationalen Insertion von plastidär kodierten Membranproteinen

beteiligt zu sein (Klostermann et al., 2002). Das Alb4 ist ebenfalls in der

Thylakoidmembran lokalisiert und hat einen Einfluss auf die Biogenese der Chloroplasten

(Gerdes et al., 2006). Die genaue Funktion von Alb4 ist jedoch noch nicht geklärt.

5.1 Die cpSRP-Untereinheit cpSRP43 interagiert direkt mit dem integralen Membranprotein Alb3

Bisherige Studien zum posttranslationalen cpSRP-Transportweg haben gezeigt, dass das

cpSRP43, cpSRP54, cpFtsY, GTP und die Translokase Alb3 für die Integration der

LHCPs in die Thylakoidmembran notwendig sind (Tu et al., 1999; Yuan et al., 2002). Das

cpSRP54 und der cpSRP-Rezeptor cpFtsY sind zusammen in der Lage mit dem

integralen Membranprotein Alb3 einen Komplex an der Thylakoidmembran zu bilden

(Moore et al., 2003). Moore et al., 2003 zeigten weiterhin, dass weder das Substrat LHCP,

noch das cpSRP43 für die Ausbildung dieses Komplexes nötig waren. Eine direkte

Interaktion zwischen cpSRP43 und Alb3 wurde durch die angewendeten Crosslinking

Studien nicht nachgewiesen. Damit wurde vermutet, dass das cpSRP43 für den docking-

Prozess des Transitkomplexes an die Thylakoidmembran keinen entscheidenden Einfluss

hat.

Einige Fragen, wie z. B. der docking-Prozess des Transitkomplexes an die

Thylakoidmembran, die Freisetzung und Insertion der LHCPs sowie die Regulation des

cpSRP-Transportwegs sind noch nicht ausreichend erforscht. In der vorliegenden Arbeit

sollte zunächst untersucht werden, ob der docking-Prozess des Transitkomplexes an die

Thylakoidmembran möglicherweise durch eine direkte Interaktion der löslichen Proteine

des cpSRP-Wegs mit der Translokase Alb3 vermittelt wird.

Die Ergebnisse der in vivo Interaktionsstudien über das Hefe Split-Ubiquitin System und

die bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (Split-YFP System) zeigten, im Vergleich

zu den zuvor beschriebenen Beobachtungen aus Moore et al., 2003, eine direkte

5 Diskussion 104

Interaktion von cpSRP43 mit Alb3 (Kapitel 4.2.1 und 4.2.2). Dieses war sowohl in der

Hefe, als auch in der natürlichen Umgebung der Arabidopsis thaliana Protoplasten der

Fall. Es wurde ausschließlich eine Interaktion des cpSRP43 mit dem Alb3 nachgewiesen,

während das cpSRP54 und cpFtsY mit Alb3 keine Interaktion zeigten (Kapitel 4.2.1 und

4.2.2). In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von R. Goforth (University of Arkansas)

wurden diese Daten in einer gemeinsamen Publikation zusammengestellt (Marty et al.,

2009, eingereicht). Ergebnisse aus der Arbeitsgruppe Goforth zeigten eine Copräzipitation

von rekombinantem cpSRP43 und Alb3. Diese Versuche erfolgten mit

Thylakoidmembranen aus Pisum sativum (Erbse), so dass es sich bei dem

copräzipitierten Alb3 um das Homolog PPF1 aus der Erbse handelte. Die Ansätze mit

rekombinantem cpSRP54 und cpFtsY zeigten sowohl einzeln, als auch in Kombination

kein copräzipitiertes Alb3 (PPF1). In den Ansätzen mit einer Kombination der

rekombinanten Proteine konnte nur in den Proben das Alb3 (PPF1) copräzipitiert werden,

in denen auch das cpSRP43 vorlag. Das cpSRP43 könnte somit als Brücke innerhalb der

cpSRP-Komponenten im Verlauf des docking-Prozesses an das Alb3 wirken.

Im Laufe dieser vorliegenden Doktorarbeit sind weitere Daten publiziert worden, die eine

Komplementation einer cpSRP43-defizienten chaos-Mutante von Arabidopsis thaliana mit

einem cpSRP43(ΔCD2) Protein zeigten (Tzvetkova-Chevolleau et al., 2007). Das

cpSRP43(ΔCD2) ist nicht mehr in der Lage mit dem cpSRP54 zu interagieren und einen

Transitkomplex mit dem cpSRP54 und LHCP zu bilden (Goforth et al., 2004). Aufgrund

der Komplementation wurde vermutet, dass cpSRP43 unabhängig von cpSRP54 den

LHCP-Transport vermitteln kann. Weiterhin wurde durch Immunlokalisationsstudien eine

Colokalisation von cpSRP43 mit der Translokase Alb3 gezeigt, die allerdings nur in

Abwesenheit von cpSRP54 zu beobachten war (Tzvetkova-Chevolleau et al., 2007). Die

direkte Interaktion der beiden Proteine wurde durch eine Copräzipitation des Alb3 mit

rekombinantem cpSRP43 gezeigt (Tzvetkova-Chevolleau et al., 2007). Die Autoren

vermuten daher einen alternativen Transportweg der LHCPs über cpSRP43 und Alb3, der

unabhängig von cpSRP54 und cpFtsY verläuft.

Pull down Analysen aus der vorliegenden Doktorarbeit zeigten allerdings, dass cpSRP43

sowohl allein, als auch im Komplex mit cpSRP54, mit Alb3 interagierte. Dieses Ergebnis

könnte einerseits die Möglichkeit eines alternativen Transportwegs unterstützen, bei dem

das cpSRP43 auch unabhängig von cpSRP54 den LHCP-Transport zur Translokase Alb3

vermittelt (Tzvetkova-Chevolleau et al., 2007). Andererseits ist aber bemerkenswert, dass

cpSRP43 auch im Komplex mit cpSRP54 und nicht nur in Abwesenheit des cpSRP54 mit

Alb3 interagierte.

5 Diskussion 105

5.2 Identifizierung der Alb3-Interaktionsbereiche für das cpSRP43 und Charakterisierung der Alb3-cpSRP43 Interaktion

Weiterführende Experimente sollten die Interaktionsdomäne des Alb3 für das cpSRP43

ermitteln. Als erster Ansatzpunkt sollten durch die Inkubation von salzgewaschenen und

proteaseverdauten Thylakoidmembranen mit den Proteinen cpSRP43, cpSRP54 und

cpFtsY mögliche stromale Bereiche des Alb3 als Interaktionsdomäne identifiziert werden

(Marty et al., 2009, eingereicht). Es zeigte sich, dass rekombinantes cpSRP43 und cpFtsY

an salzgewaschene Thylakoidmembranen von Arabidopsis thaliana binden konnten,

während eine Bindung des Kontrollproteins GST ausblieb. Ein Proteaseverdau der

Membranen führte zu einem vollständigen Verlust der Bindung des cpSRP43. Das cpFtsY

konnte jedoch, aufgrund seiner Membranaffinität, an die mit Protease behandelten

Thylakoidmembranen binden (Marty et al., 2009). Diese Ergebnisse wurden durch die

Bindungsversuche von radioaktiv markiertem cpSRP43, cpSRP54 und cpFtsY an

Thylakoidmembranen aus der Erbse bestätigt. Der Proteaseverdau der Membranen

bewirkte eine Abspaltung des stromalen C-Terminus von Alb3 (PPF1) (Marty et al., 2009,

eingereicht). Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die Bindung des cpSRP43 an

die Thylakoidmembranen über den stromalen C-terminus des Alb3 erfolgen könnte.

Weitere Daten aus der vorliegenden Doktorarbeit und der Kooperation (Marty et al., 2009,

eingereicht) zeigten, dass der C-Terminus von Alb3 tatsächlich direkt mit dem cpSRP43

interagierte, während keine Interaktion zwischen cpSRP54 und cpFtsY mit Alb3

nachgewiesen wurde. Ausführliche pull down Versuche mit rekombinantem cpSRP43 und

rekombinantem Alb3 C-Terminus (PPF1) bestätigten die Bedeutung des C-Terminus von

Alb3 für die Interaktion mit cpSRP43 (Marty et al., 2009, eingereicht). Die Messung der

Interaktion von cpSRP43 und dem C-Terminus von Alb3 mittels isothermaler

Titrationskalorimetrie bekräftigten, dass das cpSRP43 direkt mit dem löslichen C-

Terminus von Alb3 interagierte (Marty et al., 2009, eingereicht).

Ein Vergleich innerhalb der Oxa1/YidC/Alb3-Proteinfamilie zeigt, dass der C-Terminus für

die anderen homologen Proteine ebenfalls eine entscheidende Bedeutung als funktionale

Domäne hat. Das bakterielle Homolog YidC und das mitochondriale Homolog Oxa1 sind

in der Lage mit ihrem C-Terminus Ribosomen zu binden und damit die cotranslationale

Insertion von Membranproteinen zu ermöglichen (Szyrach et al., 2003; Kohler et al.,

2009). Es wird vermutet, dass das cpSRP43 im posttranslationalen cpSRP-Transportweg

anstelle von Ribosomen an das Alb3 bindet. Weitere Arbeiten zeigten, dass Alb3 mit der

cpSec-Translokase assoziiert ist und bei der cotranslationalen Insertion des plastidär

kodierten D1 beteiligt ist (Klostermann et al., 2002; Ossenbühl et al., 2004). Demnach

bleibt zu klären, in welcher Form und durch welchen Mechanismus sich der co- und

posttranslationale Import der Proteine über Alb3 in die Thylakoidmembran unterscheidet

5 Diskussion 106

und reguliert wird.

Der Nachweis der Interaktion von cpSRP43 und Alb3 stellte die Frage nach der

funktionellen Bedeutung und physiologischen Relevanz dieser Interaktion innerhalb des

posttranslationalen cpSRP-Transportwegs. Bisherige Arbeiten wiesen einen Einfluss der

GTP-Bindung und Hydrolyse der beiden GTPasen cpSRP54 und cpFtsY bei der

Integration der LHCPs nach (Tu et al., 1999; Moore et al., 2003). Zudem wurde ein

regulierender Effekt des cpSRP43 auf die GTP-Hydrolyse der GTPasen gezeigt (Goforth

et al., 2004). In Marty et al., 2009 (eingereicht) wird weiterhin gezeigt, dass das cpSRP43

die GTPase Aktivität des cpSRP54 und cpFtsY in Abhängigkeit von dem Alb3 C-Terminus

(PPF1) stimulierte. Daher wurde vermutet, dass die GTP-Hydrolyse innerhalb des cpSRP-

Transportwegs nur bei Anwesenheit der Translokase Alb3 erfolgt und dass die GTP-

Hydrolyse ein entscheidender Schritt für das Recycling der cpSRP-Komponenten ist. Das

cpSRP43 könnte damit als Vermittler zwischen dem Alb3, cpSRP54, cpFtsY und LHCP

dienen und die Interaktion zwischen cpSRP43 und Alb3 könnte eine regulatorische

Funktion an der Thylakoidmembran einnehmen.

Die Ergebnisse der vorliegenden Doktorarbeit deuten darauf hin, dass neben dem C-

Terminus noch die 5. Transmembrandomäne des Alb3 für eine Interaktion mit dem

cpSRP43 wichtig ist. Dieses wurde zunächst durch die bimolekulare

Fluoreszenzkomplementation gezeigt (Kapitel 4.2.3). Die Existenz einer neben dem C-

Terminus zusätzlichen Bindestelle für das cpSRP43 wurde durch das Peptide Scanning

unterstützt (Kapitel 4.2.4). So umfasste ein Cluster der detektierten PepSpots die

Aminosäuren 305-328 der 5. Transmembrandomäne von Alb3. Diese Spots zeigten eine

gemeinsame Sequenz der Aminosäuren 314-319 (LVFKFL). Die Identifizierung dieser

Aminosäuren war eine Bestätigung der Messung der Alb3-Alb4 overlap-Konstrukte im

Split-YFP System, bei der das Bindemotiv LVFKF (Aminosäuren 314-318) innerhalb des

Alb3 eine wesentliche Bedeutung für die Interaktion mit cpSRP43 hatte. Dieses Motiv

wurde weiterhin durch die Deletionen und Mutationen in diesem Sequenzmotiv des Alb3

als Bindestelle für das cpSRP43 im Split-Ubiquitin System und Split-YFP System bestätigt

(Kapitel 4.2.5). Erstaunlicherweise liegt diese Bindestelle auf der lumenalen Seite der

5. Transmembrandomäne von Alb3. Daher stellt sich die Frage nach der Zugänglichkeit

dieser Bindestelle für das stromale cpSRP43 innerhalb des cpSRP-Transportwegs.

Kürzlich veröffentlichte Daten haben gezeigt, dass die homologen Proteine YidC und

Oxa1 in Anwesenheit von translatierenden Ribosomen möglicherweise eine Pore bilden

(Kohler et al., 2009). Die Interaktion des YidC und Oxa1 mit den Ribosomen erfolgt über

den jeweiligen C-Terminus. Mit Hilfe von BN-PAGE und Crosslinking Studien wurde

gezeigt, dass die Ribosomen die dimere Form von YidC und Oxa1 stabilisieren. Weitere

Analysen ergaben, dass die Dimere von YidC und Oxa1 über dem Ausgang des

Ribosomentunnels lokalisiert vorliegen.

5 Diskussion 107

Mit der Existenz des Bindemotivs innerhalb der 5. Transmembrandomäne des Alb3

könnte ein Mechanismus vermutet werden, bei dem das Alb3 für den docking-Prozess

des Transitkomplexes und die Insertion der LHCPs in die Thylakoidmembran eine Pore

ausbildet. Die Topologie des Alb3 beruht jedoch bisher nur auf Strukturvorhersagen.

Daher kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Bindestelle möglicherweise bei einer

abweichenden Struktur des Alb3 innerhalb der Thylakoidmembran für die Interaktion mit

dem cpSRP43 auch ohne Ausbildung einer Pore zugänglich wäre.

Die Ergebnisse der Messungen im Split-YFP ergaben außerdem, dass der C-Terminus

von Alb3, wie bereits beschrieben, für eine Interaktion mit dem cpSRP43 essentiell ist

(Kapitel 4.2.3). Über die Methode des Peptide Scanning wurden die Aminosäuren 374-

388 des Alb3 C-Terminus als Bindestelle für das cpSRP43 identifiziert (Kapitel 4.2.4). Die

Deletion dieser Bindestelle innerhalb des Alb3 führte sowohl im Split-YFP System, als

auch im Split-Ubiquitin System zum Verlust der Interaktion mit cpSRP43 (Kapitel 4.2.5

und 4.2.6). Die Bindestelle innerhalb des C-Terminus von Alb3 wurde durch den Einsatz

eines Alb3-Peptids (Aminosäuren 367-388), welches die Aminosäuren der potentiellen

Bindestelle (374-388) umfasste, bestätigt, da die Vorinkubation des cpSRP43 mit dem

Alb3-Peptid zu einer verringerten Bindung des cpSRP43 an die Thylakoidmembranen

führte (Kapitel 4.2.8).

Um zu untersuchen, ob die beiden Bindestellen des Alb3 für das cpSRP43 konserviert

vorliegen, wurde ein Alignment der Alb3 Homologe einiger Streptophyten in diesen

Sequenzbereichen durchgeführt (Abbildung 5-1). Phylogenetische Analysen (Zhang et al.,

2009) zeigten, dass während der Entwicklung der Landpflanzen von den Grünalgen eine

Kopie des Alb3 Gens verloren gegangen ist und eine Duplikation der anderen Kopie zu

zwei Genen geführt hat, welche die beiden Proteine Alb3 und Alb4 kodieren. In Populus

trichocarpa wurden diese beiden Gene erneut dupliziert, so dass es dort

dementsprechend vier Gene, zwei für Alb3 und zwei für Alb4, gibt.

Die identifizierte Bindestelle innerhalb der 5. Transmembrandomäne des Alb3 aus

Arabidopsis thaliana umfasst die Aminosäuren 314-318 (LVFKF). In dem

Sequenzvergleich der Alb3 Homologe dieser Streptophyten fällt auf, dass das Leucin (L)

an Position 314 sehr konserviert vorliegt (Abbildung 5-1). In dieser Arbeit wurde gezeigt,

dass Mutationen und Deletionen dieser Aminosäure des Alb3 in einem Verlust der

Bindung des cpSRP43 resultierten, während z. B. die Mutation des Phenylalanin an

Position 316 (F), welches innerhalb der Alb3 Proteine dieser Streptophyten nicht

konserviert vorliegt, keine Auswirkungen hatte. Die Aminosäuren Lysin und Phenylalanin

an Position 317 und 318 (KF) liegen ebenfalls sehr konserviert vor. Da diese

Aminosäuren allerdings auch in der Alb4 Sequenz vorkommen (Abbildung 5-2) und Alb4

keine Interaktion mit cpSRP43 zeigte, scheinen diese Aminosäuren innerhalb des LVFKF-

5 Diskussion 108

Motivs keine essentielle Bedeutung für die Bindung des cpSRP43 zu haben. Demzufolge

scheint in dem ersten Bindemotiv die Aminosäure Leucin an Position 314 für die Bindung

des cpSRP43 von besonderer Bedeutung zu sein.

314-318 Arabidopsis_t._Alb3 HPPLGWYDTVAYLVLPVLLIASQYVSMEIMKPPQTDDPAQKNTLLVFKFL Oryza_s._Alb3 HPPLGWHDTICYLVLPVLLVASQFVSMEIMKPPQTDDPSQKNTLLVLKFL Pisum_s._Alb3 HPLLGWYDTAAYLVLPVLLIVSQYVSMEIMKPPQTNDPNQKNTLLIFKFL Populus_t._Alb3_a-1 HPPLGWHDTAAYLVLPVLLIASQYVSMEIMKPPQTDDPTQKNTLLVFKFL Populus_t._Alb3_a-2 HPPLGWNDTAAYLVLPVLLVVSQYVSMEIMKPPQTDDPTQKNTLLVFKFL Selaginella_m._Alb3 HPPLGWGDTIAYLVLPVLLIGSQYASMQIMQPP--QDPSQKNTQLILKFL Physcomitrella_p._Alb3 APSLGWADTIAYLVLPVLLIGSQYVSMQIMQPPTTNDPAQNQSQLILKFL * *** ** .********: **:.**:**:** :** *::: *::*** Arabidopsis_t._Alb3 PLMIGYFALSVPSGLSIYWLTNN--VLSTAQQVYLRKLGGAKPNMDENAS Oryza_s._Alb3 PFMIGWFSLSVPSGLSIYWFTNN--ILSTAQQVWLRKLGGAKPVVNQGGS Pisum_s._Alb3 PLMIGYFSLSVPSGLTIYWFTNN--VLSTAQQVWLRKLGGAKPAVNENAG Populus_t._Alb3_a-1 PIMIGYFSLSVPSGLSIYWFTNN--VLSTAQQVWLRKLGGAKPVVNENAS Populus_t._Alb3_a-2 PLMIGYFSLSVPSGLSIYWFTNN--VLSTAQQVWLRQLGGAKPVVNENAS Selaginella_m._Alb3 PLMIGYFALSVPSGLSLYWLSLTNNILSTGQQVWLRKLGGAKPVVASGGG Physcomitrella_p._Alb3 PLMIGYFSLSVPSGLSLYWLTNN--VLSTAQQVYLRQLGGAQPIVDKEGS *:***:*:*******::**:: . :***.***:**:****:* : . .. 374-388 _____ Arabidopsis_t._Alb3 KIISAGRAKRSIAQPDDAGERFRQLKEQEKRSKKNKAVAKDTVELVEESQ Oryza_s._Alb3 GIITAGRAKRTSAQPAQPGERFKQLKEEESKRKGNKALAAGDSDLSASTS Pisum_s._Alb3 GIITAGQAKRSASKPEKGGERFRQLKEEEKKKKLIKALPVEEVQPLASAS Populus_t._Alb3_a-1 GIITAGRAKRSASQPGQPGDRFKQLKEQDKSKTLRKALPTEGVQALDSAS Populus_t._Alb3_a-2 GIITAGRAKRSAAQPGQPGDRFRLK-EEEKGKKLSKALQSEDVQALDSAS Selaginella_m._Alb3 DIISAGQAKRSTPSP--PAARFRQLKAAESKRKAERA------------- Physcomitrella_p._Alb3 GIISAGQAKRTPLPPS-ASTSATQLKEEDAKKKGSRRKSAEEASKAAAAK **:**:***: * . : . : Arabidopsis_t._Alb3 ----SESEEGSDDEEEEAREGALASSTTSKPLPEVGQRRSKRSKRKRTV Oryza_s._Alb3 EDEESDDETTEEGGPEERYNSSSNKKLPNYSGKKGKRSKRKRMVQ Pisum_s._Alb3 ASNDGSDVENNK--EQEVTEESNTSKVSQEVQSFSRERRSKRSKRKPVA Populus_t._Alb3_a-1 GSDEDSDEETNDKGEEVLEETYASS-ASKRVPDISRPKRSKRSKRKRTV Populus_t._Alb3_a-2 --DEDSDEETKDKGEEVLEEAYASSSASKKVSDISRPKRSKRSKRKRAV Selaginella_m._Alb3 ------------------------------------------------- Physcomitrella_p._Alb3 GAEERDN------------------------------------------

Abbildung 5-1: Alignment der C-terminalen Proteinsequenzen der Alb3 Homologe Die Abbildung zeigt ein Alignment der Proteinsequenzen der Alb3 Homologe im Bereich der 5.

Transmembrandomäne und des C-Terminus von Alb3 aus Arabidopsis thaliana. Die konservierten

Aminosäuren der Bindemotive im Bereich der Aminosäuren 314-318 und 374-388 sind in rot

dargestellt. Der Bereich der 5. Transmembrandomäne des Alb3 aus Arabidopsis thaliana ist grau

hinterlegt.

Die zweite Bindestelle im C-Terminus umfasst die Aminosäuren 374-388. Innerhalb dieser

identifizierten Bindestelle konnte ein konserviertes Motiv der Aminosäuren 375-377 (AKR)

gefolgt von einem Prolin an Position 382 innerhalb der gezeigten Alb3 Homologe der

Streptophyten erkannt werden (Abbildung 5-1). Interessanterweise ist dieser Bereich der

Bindestelle (Aminosäuren 374-388) und der etwas verlängerte Bereich des eingesetzten

synthetischen Peptids (Aminosäuren 367-388), welches zu einer Verringerung der

Bindung des cpSRP43 an die Thylakoidmembran führte, im Vergleich zu dem restlichen

5 Diskussion 109

C-Terminus dieser Streptophyten sehr homolog und konserviert. Diese Tatsache

bekräftigt somit die Bindestelle innerhalb des C-Terminus, da funktionelle Domänen

allgemein sehr konserviert vorliegen.

Das Alignment der Alb3 Sequenz aus Arabidopsis thaliana mit homologen Alb4 Proteinen

der Streptophyten zeigt, dass beide Motive der identifizierten Bindestellen für das

cpSRP43 in den Alb4 Proteinen nicht konserviert vorliegen (Abbildung 5-2). Dieses

unterstützt weiterhin das Ergebnis dieser Doktorarbeit, dass Alb4 nicht mit cpSRP43

interagierte. Dieses ist möglicherweise auf das Fehlen dieser in den Alb3 Proteinen

konservierten Bereiche zurückzuführen.

314-318 Arabidopsis_t._Alb3 MKPPQTDDPAQKNTLLVFKFLPLMIGYFALSVPSGLSIYWLTNNVLSTAQ Arabidopsis_t._Alb4 MQSSQSNDPAMKSSQAVTKLLPLMIGYFALSVPSGLSLYWLTNNILSTAQ Oryza_s._Alb4 MQPPQNNDPSQQGAQAVVKFLPLLIGYFALSVPSGLSLYWLTNNILSTAQ Populus_t._Alb4_b-1 MQSSQSDDPNVKNSQAIMKFLPLMIGYFSLSVPSGLSLYWLTNNILSTTQ Populus_t._Alb4_b-2 MQSSQSDDPNVKNSQAITKFLPLMIGYFSLSVPSGLSLYWLTNNILSTAQ *:..*.:** :.: : *:***:****:********:******:***:* Arabidopsis_t._Alb3 QVYLRKLGGAKPNMDEN---------------------------ASKIIS Arabidopsis_t._Alb4 QVWLQKYGGAKNPVEKFTNLVTKEDKTQQIEKSFSEPLVQKSVSELKIPR Oryza_s._Alb4 QVWLQKLGGAKNPVKEYIDKLAKEESTN----LGKPEPAIKSDPLPKVGK Populus_t._Alb4_b-1 QVWLQKLGGAK--------------------------------------- Populus_t._Alb4_b-2 QVWLQKSGGAKNPMMKSSDDIV---------------------------- **:*:* **** 374-388 _____ Arabidopsis_t._Alb3 AGRAKRSIAQPDDAGERFRQLKEQEKRSKK--------NKAVAKDTVELV Arabidopsis_t._Alb4 EKGGEKVTPECPKPGERFRLLKEQEAKRRREKEERQKAEAALSNQNTDKA Oryza_s._Alb4 PPASQEPEPSGPQRGERFRKLKEEESRRKVFLEKAEQTEQAGTQAGIVDG Populus_t._Alb4_b-1 -------------------------------------------------- Populus_t._Alb4_b-2 -------------------------------------------------- Arabidopsis_t._Alb3 EESQSESEEGSDDEEEEAREGALASSTTSKPLPEVGQRRSKRSKRKRTV- Arabidopsis_t._Alb4 HEQDEKSDTAIVAEDDKKTELSAVDETSDGTVAVNGKPSIQKDETTNGTF Oryza_s._Alb4 KQNSDASGDNIDEQESHENEP--IIANGNGGLSHSTNEMIPNGSMKEVCF Populus_t._Alb4_b-1 -------------------------------------------------- Populus_t._Alb4_b-2 --------------------------------------------------

Abbildung 5-2: Alignment des Alb3 aus Arabidopsis thaliana mit den Alb4 Proteinen anderer Streptophyten

Die Abbildung zeigt ein Alignment der Proteinsequenz des Alb3 aus Arabidopsis thaliana im

Bereich der 5. Transmembrandomäne und des C-Terminus mit den Alb4 Homologen anderer

Streptophyten. Die konservierten Aminosäuren der Bindemotive des Alb3 im Bereich der

Aminosäuren 314-318 und 374-388 sind in rot dargestellt. Der Bereich der

5. Transmembrandomäne des Alb3 aus Arabidopsis thaliana ist grau hinterlegt.

5 Diskussion 110

5.3 Das cpSRP43 interagiert mit Alb3 über die Ankyrin repeat Region

Das cpSRP43 besteht aus einer N-terminalen Chromodomäne (CD1), gefolgt von vier

Ankyrin repeats (Ank1-4) und zwei C-terminalen Chromodomänen (CD2, CD3). Die

Bestimmung der Region des cpSRP43, die mit Alb3 interagiert, wurde ebenfalls in

Kooperation mit der Arbeitsgruppe von R. Goforth (University of Arkansas) durchgeführt.

In Marty et al., 2009 (eingereicht) wurden pull down Versuche mit verschiedenen GST-

cpSRP43 Deletionskonstrukten und rekombinantem Alb3 C-Terminus (PPF1)

durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Existenz der Ankyrin repeats im cpSRP43

für die Coreinigung des Alb3 unbedingt erforderlich war. Bei den getaggten

Fusionsproteinen des cpSRP43, in denen die Ankyrin repeat Region deletiert war, wurde

eine starke Verringerung des cogereinigten Alb3 beobachtet. Die Interaktion des Alb3 C-

Terminus mit der Ankyrin repeat Region des cpSRP43 wurde durch weitere pull down

Analysen bestätigt. Dabei wurden diejenigen cpSRP43 Deletionsproteine, die noch die

Ankyrin repeats beinhalteten über den getaggten Alb3 C-Terminus cogereinigt. Fehlten

die Ankyrin repeats innerhalb der cpSRP43 Proteine, blieb die Coreinigung über das

rekombinante Alb3 aus. Auffällig war allerdings auch, dass bei Deletion der

Chromodomäne 2 eine leichte Verringerung der Bindung zu erkennen war (Marty et al.,

2009, eingereicht).

Die Ergebnisse der pull down Analysen wurden mit Hilfe der isothermalen

Titrationskalorimetrie bestätigt. Die Messung der Bindungsaffinitäten zwischen den

cpSRP43 Deletionsproteinen und dem Alb3 waren abhängig von dem Vorhandensein der

Ankyrin repeat Region innerhalb des cpSRP43. Zusammenfassend besagten diese

Ergebnisse, dass die Ankyrin repeat Region und möglicherweise unterstützend die

Chromodomäne 2 die Bindestelle für den Alb3 C-Terminus darstellten.

Ergänzende Versuche zeigten, dass das Deletionsprotein cpSRP43(Ank1-CD2), ebenso

wie das Volllängen cpSRP43, einen stimulierenden Einfluss auf die GTP-Hydrolyse der

GTPasen cpSRP54 und cpFtsY hatte (Marty et al., 2009, eingereicht). Der Einsatz

weiterer Deletionsproteine von cpSRP43 zeigte, dass bei Deletion der Chromodomäne 2

des cpSRP43 die Stimulation der GTP-Hydrolyse in Kombination mit dem Alb3 verloren

ging. Dieser Effekt ist in dem Verlust der Bindedomäne des cpSRP43 für das cpSRP54

begründet, welche durch die Chromodomäne 2 gestellt wird (Sivaraja et al., 2005;

Hermkes et al., 2006; Kathir et al., 2008). Die Interaktion von cpSRP43 und Alb3 konnte

somit keinen Einfluss auf die GTPasen nehmen. In bisherigen Arbeiten wurde bereits

beschrieben, dass die Chromodomäne 1 einen negativ regulatorischen Effekt auf die

GTP-Hydrolyse der GTPasen des cpSRP-Transportwegs besitzt (Goforth et al., 2004).

Demzufolge führte ein Verlust der Chromodomäne 1 des cpSRP43 bereits in Abwesenheit

des Alb3 zu einem Anstieg der GTPase Aktivität des cpSRP54 und cpFtsY (Marty et al.,

5 Diskussion 111

2009, eingereicht). Die Deletion der Chromodomäne 3 hatte keinen Effekt auf die GTP-

Hydrolyse der cpSRP GTPasen (Marty et al., 2009, eingereicht). Demnach zeigte sich,

dass die Ankyrin repeat Region in Verbindung mit der Chromodomäne 2 des cpSRP43

ausreichte, um die GTPase Aktivität in Abhängigkeit des Alb3 C-Terminus zu stimulieren.

In einer Masterarbeit, die in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. D. Schünemann parallel zu

dieser vorliegenden Doktorarbeit und unabhängig von unserem späteren

Kooperationspartner (Marty et al., 2009, eingereicht) angefertigt wurde, konnte die

Interaktionsdomäne des cpSRP43 für das Alb3 bereits identifiziert werden (Vörös, 2007).

Ein Thylakoidmembran-Bindungstest ergab, dass Ankyrin repeat 4 eine wesentliche

Bedeutung für die Bindung des cpSRP43 an die Membranen haben könnte. Die Deletion

der Ankyrin repeat Region 4 bewirkte einen Verlust der Membranbindung des cpSRP43.

In der vorliegenden Doktorarbeit wurde ergänzend bestätigt, dass spezifisch die Ankyrin

repeat Region 4 für die Membranbindung wichtig ist, da die Deletion der anderen Ankyrin

repeats keinen Einfluss auf die Membranbindung des cpSRP43 zeigte (Kapitel 4.2.9). Die

cpSRP43 Deletionsproteine interagierten trotz des Verlusts der einzelnen Ankyrin repeats

1-3 mit den Thylakoidmembranen.

Um die Spezifität der Ankyrin repeat Region 4 des cpSRP43 für die Bindung an die

Thylakoidmembran zu bestätigen, wurden Proteine erzeugt, die die einzelnen Ankyrin

repeats in Verbindung mit der Chromodomäne 2 beinhalteten. Vorangegangene Arbeiten

zeigten, dass das Protein GST-cpSRP43(Ank4+CD2) noch für eine Interaktion mit der

Thylakoidmembran ausreichte (Vörös, 2007). In der vorliegenden Arbeit zeigte sich, dass

der Austausch der Ankyrin repeat Region 4 gegen die anderen Ankyrin repeats 1-3 einen

Verlust der Bindefähigkeit der Proteine an die Thylakoidmembranen bedeutete. Die

Proteine GST-cpSRP43(Ank1+CD2), GST-cpSRP43(Ank2+CD2) und GST-

cpSRP43(Ank3+CD2) waren nicht mehr in der Lage an die Membranen zu binden, was

die Spezifität der Ankyrin repeat Region 4 bestätigte.

Die Erstellung der Konstrukte GST-cpSRP43(Ank1+CD2), GST-cpSRP43(Ank2+CD2),

GST-cpSRP43(Ank3+CD2) und GST-cpSRP43(Ank4+CD2) erfolgte anhand von

Strukturvorhersageprogrammen. Ein Vergleich der Vorhersagen mit der kürzlich

publizierten Kristallstruktur des cpSRP43 (Stengel et al., 2008) ergab, dass die α-Helices

der Ankyrin repeats 1, 2 und 3 innerhalb der vorhergesagten Sequenz liegen. Die Ankyrin

repeat Region 4 besitzt mit der α-Helix 8 einen zur Chromodomäne 2 verlängerten

Bereich, der bisher als linker Sequenz angenommen wurde (Abbildung 4-15). Die

Konstrukte GST-cpSRP43(Ank1+CD2), GST-cpSRP43(Ank2+CD2), GST-

cpSRP43(Ank3+CD2) und GST-cpSRP43(Ank4+CD2) wurden so erstellt, dass auf die

Ankyrin repeats zunächst der linker und dann die Chromodomäne 2 folgten. Das

bedeutet, dass die Ankyrin repeats 1-3 jeweils um einen Teil der α-Helix 8 der Ankyrin

repeat Region 4 verlängert waren, was die Proteine allerdings nicht dazu befähigte, an die

5 Diskussion 112

Thylakoidmembranen zu binden. Der Einbau dieses zusätzlichen Teils der α-Helix 8

könnte allerdings einen strukturellen Einfluss auf die Deletionsproteine haben. Schließlich

lässt sich festhalten, dass die Binderegion des cpSRP43 für das Alb3 in der

Thylakoidmembran möglicherweise auf die Ankyrin repeat Region 4 einzugrenzen ist.

LHCP

Alb3TMD

TMD L-18 Motiv

cpSRP43 A1 A2 A3 A4 CD3

cpSRP54 G-Domäne M-Domäne

Bindemotiv

CD2CD2CD1

Abbildung 5-3: Proteininteraktionen des cpSRP43 Das cpSRP43 besitzt drei Chromodomänen (CD1-3) und vier Ankyrin repeats (A1-4). Das

cpSRP54 besteht aus einer G-Domäne, welche für die GTPase Aktivität zuständig ist, und einer

methioninreichen M-Domäne. Bei der Heterodimerisierung des cpSRP kommt es zur Interaktion

der Chromodomäne 2 mit einem 10 Aminosäuren langen Bindemotiv innerhalb der M-Domäne des

cpSRP54. Das LHCP besitzt drei Transmembrandomänen (TMD). Es interagiert über das L-18

Motiv mit der Ankyrin repeat Region des cpSRP43. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit zeigen eine

Interaktion des Alb3 mit cpSRP43. Als Bindedomänen sind die 5. Transmembrandomäne und der

C-Terminus des Alb3 sowie die Ankyrin repeat Region 4 des cpSRP43 identifiziert worden.

Das cpSRP43 scheint über die einzelnen Interaktionsdomänen eine Vielzahl von

Funktionen sowohl im Stroma, als auch an der Thylakoidmembran innerhalb des

posttranslationalen cpSRP-Transportwegs einzunehmen (Abbildung 5-3). Bisherige Daten

zeigten, dass die Heterodimerisierung des cpSRP-Komplexes auf einer Interaktion

zwischen der α-Helix in Chromodomäne 2 des cpSRP43 und einem 10 Aminosäuren

langen Bindemotiv innerhalb der M-Domäne des cpSRP54 beruht (Goforth et al., 2004;

Funke et al., 2005; Hermkes et al., 2006; Kathir et al., 2008). Die Bildung des

5 Diskussion 113

Transitkomplexes erfolgt durch Interaktion der Ankyrin repeat Domäne des cpSRP43 mit

einem konservierten sogenannten L18-Motiv des LHCPs (DeLille et al., 2000; Tu et al.,

2000; Jonas-Straube et al., 2001; Stengel et al., 2008). In dieser Doktorarbeit wurde die

Ankyrin repeat Region 4 des cpSRP43 als Interaktionsdomäne für die Translokase Alb3

identifiziert. Erstaunlicherweise stellt das cpSRP43 mit der Ankyrin repeat Region die

gleiche Binderegion für das Alb3, wie für das LHCP. In Stengel et al, 2008 wurde gezeigt,

dass das L18-Peptid des LHCP an die Oberfläche der Ankyrin repeats 2-4 bindet.

Weiterhin bewirkte eine Mutation des Tyrosin 204 der Ankyrin repeat Region 3 des

cpSRP43 einen Verlust der Bindung des L18-Peptids.

In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage nach dem Zeitpunkt der Interaktion von

cpSRP43 und Alb3. Möglicherweise erfolgt die Interaktion des cpSRP43 und Alb3 erst zu

einem späteren Zeitpunkt der LHCP-Insertion. Das LHCP muss von den cpSRP-

Komponenten abgelöst und in die Membran integriert werden, bevor es zur Freisetzung

der Komponenten für nachfolgende Transportprozesse kommt. Daher ist es nötig den

Mechanismus der Freisetzung des LHCPs aus dem Transitkomplex für die Insertion in die

Thylakoidmembran zu analysieren. In Marty et al., 2009 (eingereicht) wurde gezeigt, dass

der Alb3 C-Terminus einen Effekt auf die Transitkomplexbildung zwischen cpSRP43,

cpSRP54 und LHCP hatte. In Anwesenheit des Alb3 C-Terminus kam es nicht zum

Einwandern des Transitkomplexes in ein nichtdenaturierendes Gel. Es konnte bereits

gezeigt werden, dass das LHCP nur in Form des Transitkomplexes in die Gelmatrix

einwanderte (DeLille et al., 2000). Das bedeutet, dass Alb3 einen spezifischen Effekt auf

die Stabilität des Transitkomplexes oder auf das Einwandern des Komplexes in das

nichtdenaturierende Gel hatte. Man nimmt an, dass Alb3 mit dem cpSRP43 des

Transitkomplexes interagieren kann, und dass diese Interaktion eine Bedeutung für die

Freisetzung und Insertion der LHCPs haben könnte. Messungen über die isothermale

Titrationskalorimetrie zeigten, dass nicht nur das cpSRP43, sondern auch der Alb3 C-

Terminus, das L18-Motiv des LHCPs bindet (Marty et al., 2009, eingereicht). Weitere

Analysen ergaben, dass zwischen dem Alb3 C-Terminus und cpSRP43 eine ähnliche

Bindungsaffinität vorlag wie zwischen dem Alb3 C-Terminus und einem vorgeformten

Komplex aus cpSRP43 und dem L18-Peptid (Marty et al., 2009, eingereicht).

Interessanterweise hatte ein vorgeformter Komplex aus dem Alb3 C-Terminus und

cpSRP43 eine geringere Bindungsaffinität für das L18-Peptid, als der Alb3 C-Terminus

und das cpSRP43 allein. Diese Beobachtung könnte so interpretiert werden, dass die

Interaktion zwischen Alb3 und cpSRP43 eine nachträgliche Bindung des LHCPs

verhindert, sobald es aus dem Transitkomplex freigesetzt wurde.

Die Bedeutung der Interaktion von Alb3 und cpSRP43 wird möglicherweise in dem

docking-Prozess des Transitkomplexes an die Thylakoidmembran, in der Regulation der

GTPase Aktivität des cpSRP54 und cpFtsY und in der Freisetzung der LHCPs für die

5 Diskussion 114

Insertion in die Membran liegen.

In Abbildung 5-4 ist ein Modell des posttranslationalen cpSRP-Transportwegs dargestellt.

Das LHCP wird von dem cpSRP43 und cpSRP54 gebunden und über den Transitkomplex

zum Thylakoidmembran assoziierten cpSRP-Rezeptor cpFtsY transportiert. An der

Thylakoidmembran kommt es zur Interaktion von Alb3 mit dem cpSRP43. Aufgrund dieser

Interaktion des membrangebundenen Komplexes mit der Translokase Alb3 erfolgt nach

GTP-Hydrolyse die Insertion der LHCPs und Freisetzung der löslichen cpSRP-

Komponenten.

Transit-komplex

LHCP

Thylakoidmembran

Alb3

cpSRP

cpFtsY43 54 43 54

43 54

43 54

43 54

TT

TT D

D

Abbildung 5-4: Modell des posttranslationalen cpSRP-Transportwegs Das cpSRP (chloroplast signal recognition particle) besteht aus den beiden Proteinkomponenten

cpSRP43 und cpSRP54 und bildet zusammen mit dem LHCP (light-harvesting chlorophyll-a/b-

binding protein) den Transitkomplex. Der Transitkomplex ermöglicht den Transport der

hydrophoben LHCPs durch das Stroma zur Thylakoidmembran und bildet mit dem cpSRP-

Rezeptor cpFtsY einen membrangebundenen Komplex. Nach erfolgter Interaktion von Alb3 mit

cpSRP43 kommt es nach GTP-Hydrolyse zur Insertion der LHCPs und zur Freisetzung der

löslichen cpSRP-Komponenten.

5 Diskussion 115

5.4 Alb4 interagiert nicht mit den Komponenten des cpSRP-Transportwegs

Das Alb4 wurde als zweites chloroplastidäres Homolog der Oxa1/YidC/Alb3-Proteinfamilie

in Arabidopsis thaliana identifiziert (Gerdes et al., 2006). GFP-Lokalisationsstudien und

Importstudien zeigten, dass Alb4 im Chloroplasten lokalisiert ist und als Membranprotein

vorliegt. Die Analyse chloroplastidärer Subfraktionen (Stroma, Hüllmembranen und

Thylakoidmembranen) ergab eine ausschließliche Lokalisation des Alb4 in der

Thylakoidmembran von Arabidopsis thaliana. Eine T-DNA Insertionsmutante und eine

RNAi-Mutante von Arabidopsis thaliana mit einem Alb4 Proteinlevel von weniger als 10 %

zeigten Defekte in der chloroplastidären Ultrastruktur, währenddessen diese Pflanzen

keinen offensichtlichen äußerlichen Phänotyp aufwiesen. Elektronenmikroskopische

Aufnahmen verzeichneten vergrößerte Plastiden und eine aufgelockerte Struktur der

Thylakoidmembranen mit vergrößerten stromalen Bereichen. Diese Ergebnisse deuteten

darauf hin, dass Alb4 für die Biogenese der Chloroplasten verantwortlich zu sein scheint.

Die genaue Funktion des Alb4 war jedoch zu Beginn der vorliegenden Arbeit noch

ungeklärt.

In dieser Doktorarbeit galt es zunächst zu untersuchen, ob Alb4 eine Funktion innerhalb

des posttranslationalen cpSRP-Transportwegs einnimmt. Ergebnisse aus dem Hefe Split-

Ubiquitin System und der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (Split-YFP System)

erbrachten im Vergleich zu Alb3 keine Interaktion von Alb4 mit den Proteinen des cpSRP-

Transportwegs (Kapitel 4.2.1 und 4.2.2). Zudem wies die bereits beschriebene RNAi-

Mutante von Alb4 keinen verringerten LHCP-Gehalt auf (Gerdes et al., 2006), so dass der

Transport und die Insertion der LHCPs in die Thylakoidmembran nicht beeinträchtigt zu

sein schien. Die alb3-Mutante hingegen zeigte einen drastischen Albino-Phänotyp mit

weißen bis leicht gelblichen Kotyledonen und einem Chlorophyllgehalt von nur etwa 5 %

verglichen mit dem Wildtyp (Sundberg et al., 1997). Diese Mutanten waren nicht in der

Lage unter normalen Wachstumsbedingungen über das Kotyledonen-Stadium hinaus zu

überleben. Elektronenmikroskopische Aufnahmen dieser Mutanten erbrachten eine

veränderte chloroplastidäre Ultrastruktur mit nur wenigen Thylakoidmembranen und kaum

Granastapelung. Der starke Phänotyp der alb3-Mutante lässt vermuten, dass Alb4 den

Verlust von Alb3 nicht kompensieren kann und somit eine andere Funktion haben muss.

Diese Daten verdeutlichen, dass speziell Alb3, und nicht das Alb4, für die

posttranslationale Insertion der LHCPs in die Thylakoidmembran verantwortlich ist.

5 Diskussion 116

5.5 Alb4 ist mit der chloroplastidären ATP-Synthase assoziiert und interagiert nicht mit Alb3 und cpSecY

Um den Einfluss von Alb4 in der Chloroplastenbiogenese zu ermitteln, sollte in der

vorliegenden Doktorarbeit die Interaktion der Homologe Alb3 und Alb4 untereinander und

mit anderen Thylakoidmembranproteinen analysiert werden. Mit Hilfe des chemischen

Crosslinkings sollten zunächst Proteine identifiziert werden, die sich mit Alb4 in räumlicher

Nähe befanden. Die Analysen ergaben, dass das Alb4 in einem ca. 170 kDa großen

Crosslinking-Produkt vorlag (Kapitel 4.3.1). Über die Massenspektrometrie wurden die

ATP-Synthase Untereinheiten CF1α und CF1β als weitere Proteinkomponenten des

Crosslinking-Produkts identifiziert. Western Blot Analysen bestätigten die Existenz des

CF1β in dem Crosslinking-Produkt. Die Proteine Alb3 und cpSecY hingegen waren keine

Komponenten des 170 kDa großen Crosslinking-Produkts.

Die chloroplastidäre ATP-Synthase besteht aus einem zum Stroma gerichteten, löslichen

CF1-Komplex und einem integralen CF0-Komplex. Der CF1-Komplex vollzieht die ATP-

Synthese, während der transmembrane CF0-Komplex dem Protonentransport zwischen

Thylakoidlumen und Stroma dient. Der lösliche Kopf der ATP-Synthase umfasst die

Untereinheiten CF1α, CF1β, CF1γ, CF1δ und CF1ε. Der integrale Teil wird von den

Proteinen CF0I, CF0II, CF0III und CF0IV gebildet. Die Untereinheiten CF1γ, CF1δ und CF0II

sind kernkodiert, während die anderen Untereinheiten auf dem Plastom kodiert sind

(Richter et al., 2000).

Die Crosslinking-Studien ergaben somit eine Vernetzung des Alb4 mit den Untereinheiten

CF1α und CF1β des löslichen Komplexes der ATP-Synthase. Die direkte Assoziation von

Alb4 mit der ATP-Synthase wurde mittels bimolekularer Fluoreszenzkomplementation

bestätigt (Kapitel 4.3.2). Für diesen Versuch wurden ausschließlich die kernkodierten

ATP-Synthase Untereinheiten CF1γ, CF1δ und CF0II auf Interaktion mit Alb4 in

Arabidopsis thaliana Protoplasten getestet. Die plastidär kodierten Untereinheiten hätten

mit dieser Technik nicht aussagekräftig untersucht werden können, da sie einem

cotranslationalen Insertionsmechanismus unterliegen. Die Technik der bimolekularen

Fluoreszenzkomplementation beinhaltet einen posttranslationalen Transport der Proteine

in die Chloroplasten. Die Messungen ergaben, dass Alb4 mit der ATP-Synthase

Untereinheit CF0II interagierte, während eine Interaktion mit den Proteinen CF1γ und CF1δ

ausblieb. Es muss beachtet werden, dass eine fehlende Interaktion zweier Proteine in

diesem System möglicherweise auf eine unzureichende Zugänglichkeit der YFP-

Fragmente zurückzuführen sein könnte.

Mit dem chemischen Crosslinking und der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation

wurde über zwei verschiedene Methoden eine Assoziation von Alb4 mit der ATP-

Synthase gezeigt. Diese Ergebnisse wurden mit weiteren Daten aus einer Kooperation mit

5 Diskussion 117

der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. J. Soll (Universität München) in einer gemeinsamen

Publikation zusammengestellt (Benz et al., 2009, im Druck). In diesem Manuskript wurde

Alb4 als funktionelles Mitglied der Oxa1/YidC/Alb3-Proteinfamilie bestätigt. Es zeigte sich,

dass Alb4 einen YidC-defizienten E. coli Stamm komplementierte und dass der C-

Terminus von Alb4 für diese Funktion essentiell war.

Bisherige Komplementationsstudien haben eine funktionelle Einordnung der Proteine in

die Oxa1/YidC/Alb3-Proteinfamilie bereits beschrieben (Jiang et al., 2002; Preuss et al.,

2005; van Bloois et al., 2007). Die Bedeutung einer C-terminalen Extension dieser

Proteine wurde nicht nur für das genannte Alb4 nachgewiesen. Daten aus der

vorliegenden Doktorarbeit ergaben eine entscheidende Bedeutung des C-Terminus von

Alb3 für die Bindung des cpSRP43 im posttranslationalen cpSRP-Transportweg (Marty et

al., 2009, eingereicht). Des Weiteren wurde bereits der Einfluss der C-Termini des

bakteriellen YidC und mitochondrialen Oxa1 auf die Ribosomenbindung gezeigt (Szyrach

et al., 2003; Kohler et al., 2009).

Ein Schwerpunkt des Manuskripts (Benz et al., 2009, im Druck) lag auf der Analyse von

zwei unabhängigen Alb4 TILLING-Mutanten, die kein Alb4 Protein mehr aufwiesen. Diese

Arabidopsis Mutanten zeigten ein reduziertes Wachstum während der ersten drei bis vier

Wochen der pflanzlichen Entwicklung, erreichten allerdings die Samenreife zur gleichen

Zeit wie der Wildtyp und waren fertil. Gleiche Beobachtungen wurden für die T-DNA

Insertionsmutante von Alb4, die bereits in Gerdes et al., 2006 beschrieben wurde, gezeigt.

Das bedeutet, dass diese Wachstumsverzögerung in den drei unabhängigen Arabidopsis-

Linien auf einem Funktionsverlust des Alb4 Proteins beruhte. Da die Mutanten allerdings

die Wachstumsdefekte im Verlauf der Entwicklung wieder ausgleichen konnten und fertil

waren, scheint das Alb4 nicht so eine essentielle Bedeutung zu haben, wie das homologe

Alb3. Möglicherweise könnten die Defekte in der frühen Wachstumsphase auch durch

andere Faktoren kompensiert werden.

Die Analyse der chloroplastidären Ultrastruktur der TILLING-Mutanten ergab Defekte in

der Anordnung der Granathylakoide, wie sie bereits für die Mutanten in Gerdes et al.,

2006 gezeigt wurden. Verglichen zu der bereits publizierten alb3-Mutante zeigten die

elektronenmikroskopischen Aufnamen der TILLING-Mutanten einen viel schwächeren

Phänotyp. Die alb3-Mutante wies eine drastische Reduktion der Thylakoidmembranen

und nahezu fehlende Granastapelung auf (Sundberg et al., 1997).

Interessanterweise zeigten die TILLING-Mutanten von Alb4 Defekte im steady-state-level

der ATP-Synthase Untereinheiten (Benz et al., 2009, im Druck). Damit war, neben der

bereits geschilderten direkten Assoziation des Alb4 mit der ATP-Synthase, ein weiterer

Hinweis auf eine mögliche Funktion von Alb4 im Zusammenhang mit der ATP-Synthase

gegeben. Der Proteinlevel der kernkodierten und plastidärkodierten ATP-Synthase

Untereinheiten war im Vergleich zum Wildtyp deutlich reduziert. Die Reduktion der

5 Diskussion 118

Proteinlevel der ATP-Synthase Untereinheiten in den alb4-Mutanten war allerdings nicht

auf eine verringerte Transkription der entsprechenden Gene zurückzuführen (Benz et al.,

2009, im Druck). Das bedeutet, dass die Reduktion dieser Proteine posttranslationale

Ursachen, wie z. B. Defekte in der Insertion und Assemblierung der Proteine, haben

könnte.

Mittels 2D BN/SDS-PAGE wurde die Assemblierung der ATP-Synthase in den TILLING-

Mutanten analysiert (Benz et al., 2009, im Druck). Die Analyse der TILLING-Mutanten

ergab, dass der Level der hochmolekularen ATP-Synthase Komplexe reduziert war und

neben den anderen Subkomplexen weitere Intermediate der ATP-Synthase zu detektieren

waren (Benz et al., 2009, im Druck). Diese Ergebnisse deuten an, dass der Verlust des

Alb4 zu einem Defekt in der Assemblierung und Stabilität der ATP-Synthase führt.

Damit stellte sich die Frage, welchen physiologischen Einfluss die Reduktion der ATP-

Synthase Untereinheiten und die gezeigten Defekte in der Assemblierung und Stabilität

der ATP-Synthase in den alb4-Mutanten haben könnten. Durch die Analyse der

Photophosphorylierung zeigte sich, dass die TILLING-Linien 30-50 % weniger ATP

synthetisierten, als der Wildtyp (Benz et al., 2009, im Druck). Die gleichen Beobachtungen

ließen sich für die in Gerdes et al., 2006 bereits beschriebene T-DNA Insertionsmutante

machen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Reduktion der ATP-Synthase Untereinheiten

aufgrund der alb4-Mutation eine Verringerung der ATP-Synthese zur Folge hatte.

Ein Vergleich innerhalb der Oxa1/YidC/Alb3-Proteinfamilie macht deutlich, dass das Alb4

möglicherweise eine neuartige Funktion in den Chloroplasten einnimmt. Für das

homologe Protein Alb3 in Arabidopsis thaliana ist das LHCP als bisher einziges Substrat

identifiziert worden (Sundberg et al., 1997; Moore et al., 2000). Das Alb3 ist für die

Insertion der LHCPs in die Thylakoidmembran verantwortlich. In Chlamydomonas

reinhardtii wurden zwei Alb3-Homologe (Alb3.1 und Alb3.2) nachgewiesen (Bellafiore et

al., 2002; Göhre et al., 2006). Die Inaktivierung des Alb3.1 führte zu einer starken

Reduktion des LHCI und LHCII im Photosystem I und II und zu einem verringerten

Chlorophyllgehalt von etwa nur 30% des Wildtyplevels. Zudem scheint Alb3.1 bei der

Insertion und Assemblierung der Proteine des Photosystems II einen wichtigen Einfluss

zu haben (Bellafiore et al., 2002; Ossenbühl et al., 2004). Eine Reduktion des Alb3.2 in

der Chlamydomonas RNAi-Mutante hatte eine starke Reduktion der Photosysteme I und II

zur Folge (Göhre et al., 2006). Somit konnte bisher nicht gezeigt werden, dass die

anderen chloroplastidären Homologe der Oxa1/YidC/Alb3-Proteinfamilie einen

entscheidenden Einfluss auf die ATP-Synthase hatten. Andere Studien ergaben, dass das

bakterielle YidC und das mitochondriale Oxa1 mit den Untereinheiten der ATP-Synthase

interagieren konnten. Das YidC vermittelt die Sec-unabhängige, cotranslationale Insertion

der ATP-Synthase Untereinheit F0c (van der Laan et al., 2004). Das Oxa1 in

Mitochondrien interagiert mit der Atp9 Untereinheit der ATP-Synthase und vermittelt die

5 Diskussion 119

Assemblierung des ATP-Synthase Komplexes (Jia et al., 2007). Die in der oxa1-Mutante

beschriebenen Assemblierungsdefekte und reduzierten Proteinlevel einiger ATP-

Synthase Untereinheiten könnten zusätzlich eine Bedeutung von Alb4 in der

Assemblierung und Stabilisierung der ATP-Synthase in Chloroplasten unterstützen.

Weitere Studien ergaben, dass Alb4, Alb3 und die ATP-Synthase in den

Stromathylakoiden lokalisiert sind (Benz et al., 2009, im Druck). Versuche aus der

vorliegenden Doktorarbeit und der gemeinsamen Kooperation (Benz et al., 2009, im

Druck) sollten klären, ob Alb4, Alb3 und die ATP-Synthase in gemeinsamen Komplexen

der Thylakoidmembran vorliegen. Ergebnisse einer 2D BN/SDS-PAGE zeigten eine

Comigration von Alb4 mit den ATP-Synthase Untereinheiten (Benz et al., 2009, im Druck).

Gelfiltrationsexperimente von solubilisierten Thylakoidmembranen bestätigten eine

Cofraktionierung von Alb4 mit den Untereinheiten der ATP-Synthase (Kapitel 4.3.3).

Weiterhin wurden die bereits veröffentlichten Daten der Coelution von Alb3 und cpSecY

bestätigt (Klostermann et al., 2002) (Kapitel 4.3.3). Gelfiltrationsanalysen, BN-PAGE,

Coimmunpräzipitationsexperimente, Immunlokalisationsstudien und chemisches

Crosslinking zeigten eine Assoziation von Alb3 mit cpSecY und damit eine mögliche

Funktion in der cotranslationalen Insertion von plastidär kodierten Thylakoidmembran-

proteinen (Klostermann et al., 2002). Interessanterweise cofraktionierte Alb4 nur

geringfügig mit den Proteinen Alb3 und cpSecY, so dass es vermutlich keinen

gemeinsamen Komplex dieser drei Proteine in der Thylakoidmembran gibt.

Coimmunpräzipitationsexperimente bestätigten, dass Alb4 nicht in einem gemeinsamen

Komplex mit Alb3 und cpSecY in der Thylakoidmembran vorliegt (Kapitel 4.3.4). Das Alb3

und cpSecY wurden miteinander copräzipitiert, wodurch die Daten aus Klostermann et al.,

2002 verifiziert wurden. Alb4 hingegen zeigte keine Copräzipitation mit Alb3 und cpSecY.

Damit ist eine direkte Interaktion von Alb4 mit Alb3 und cpSecY auszuschließen.

Die Assoziation von Alb4 mit der ATP-Synthase ließ sich nicht mit Hilfe der

Coimmunpräzipitation ergänzend unterstützen. Allerdings kam es zur Copräzipitation von

Alb3 mit der ATP-Synthase Untereinheit CF1γ (Daten nicht gezeigt). Demnach ist eine

Funktion von Alb3 bei der Insertion und Assemblierung der ATP-Synthase nicht

auszuschließen.

Für alle durchgeführten biochemischen Analysen war der Einsatz spezifischer Antikörper

für Alb3 und Alb4 unbedingt erforderlich. Die Herstellung und ausführliche Überprüfung

der Spezifität der verwendeten Antikörper trug entscheidend für die Analyse der

unterschiedlichen Funktion der homologen Proteine Alb3 und Alb4 bei.

Zusammenfassend deuteten die Ergebnisse darauf hin, dass Alb4 einen Einfluss auf die

ATP-Synthase besitzt und eine Funktion unabhängig von Alb3 und cpSecY einnimmt. Die

homologen Proteine Alb3 und Alb4 scheinen demnach in verschiedenen Komplexen der

Thylakoidmembran zu agieren.

6 Zusammenfassung 120

6. Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion der chloroplastidären Homologe Alb3 und

Alb4 bei der Biogenese der Thylakoidmembran von Arabidopsis thaliana genauer

analysiert.

Zunächst war die Herstellung spezifischer Antikörper für Alb3 und Alb4 von

entscheidender Bedeutung, um die homologen Proteine in biochemischen

Untersuchungen getrennt voneinander detektieren zu können. Die Spezifität der

Antikörper wurde durch detaillierte Antikörpertests gegen die Antigene, die in vitro

translatierten Volllängenproteine und Thylakoidmembranproteine belegt.

In einem ersten Teilprojekt dieser Arbeit sollte die Frage geklärt werden, ob für den

docking-Prozess des Transitkomplexes an die Thylakoidmembran eine direkte Interaktion

der Proteine des cpSRP-Transportwegs mit der Translokase Alb3 vorliegt. Die in vivo

Interaktionsstudien über das Hefe Split-Ubiquitin System und die bimolekulare

Fluoreszenzkomplementation zeigten eine direkte Interaktion von cpSRP43 mit Alb3,

während eine Interaktion des cpSRP54 und cpFtsY mit Alb3 ausblieb. Zudem zeigten pull-

down Versuche, dass cpSRP43 auch im Komplex mit dem cpSRP54 mit Alb3 interagiert.

Die Interaktion zwischen cpSRP43 und Alb3 lässt vermuten, dass das cpSRP43 neben

einer Funktion bei der Transitkomplexbildung auch einen Einfluss auf die

membranassoziierten Prozesse der LHCP-Insertion über die Translokase Alb3 ausübt.

Anhand detaillierter Analysen mittels bimolekularer Fluoreszenzkomplementation,

peptide-scanning, pull-down Analysen und Peptidinhibierungsstudien wurden zwei

Bindestellen des Alb3 für das cpSRP43 identifiziert. Das Bindemotiv innerhalb der

5. Transmembrandomäne des Alb3 umfasst die Aminosäuren 314-318 (LVFKF) und die

Bindestelle im C-Terminus des Alb3 die Aminosäuren 374-388. Im weiteren Verlauf der

Arbeit wurde die Bindedomäne des cpSRP43 für die Interaktion mit Alb3 eingegrenzt.

Thylakoidmembran-Bindungsversuche deuten auf eine essentielle Bedeutung der Ankyrin

repeat Region 4 für die Bindung des cpSRP43 an die Thylakoidmembran.

In dem zweiten Teilprojekt dieser Arbeit sollten durch Proteininteraktionsstudien Hinweise

auf die Funktion des Thylakoidmembranproteins Alb4 gewonnen werden. Anhand von

crosslinking Studien, bimolekularer Fluoreszenzkomplementation und Gelfiltrations-

analysen wurde eine direkte Interaktion und Assoziation von Alb4 mit der

chloroplastidären ATP-Synthase nachgewiesen. Des Weiteren weisen die Ergebnisse von

Gelfiltrationsanalysen und Coimmunpräzipitationsstudien darauf hin, dass Alb4 nicht mit

Alb3 und cpSecY in einem Komplex vorliegt. Demnach lässt sich eine von Alb3 und der

cpSec-Translokase unabhängige Funktion von Alb4 bei der Insertion und Assemblierung

der ATP-Synthase vermuten.

7 Summary 121

7. Summary

This thesis addressed the function of the chloroplast homologs Alb3 and Alb4 in the

biogenesis of thylakoid membranes in Arabidopsis thaliana.

The production of specific antibodies against Alb3 and Alb4 was crucial to detect those

homologous proteins independent from each other in biochemical analyses. The

specificity of the antibodies was shown by detailed antibody tests against the antigen, in-

vitro translation products and thylakoid membrane proteins.

The first part of the thesis addressed the question whether the docking-process of the

transit complex at the thylakoid membrane is based on a direct interaction of the proteins

of the cpSRP transport pathway with the translocase Alb3. In-vivo interaction studies

carried out by the yeast split-ubiquitin system and the bimolecular fluorescence

complementation studies revealed a direct interaction between cpSRP43 and Alb3,

whereas there was no interaction of cpSRP54 and cpFtsY with Alb3. Pull-down analyses

also indicated an interaction of cpSRP43 with Alb3 when in a complex with cpSRP54. The

interaction of cpSRP43 and Alb3 may indicate that cpSRP43 has an influence on the

membrane associated processes of the LHCP insertion by the translocase Alb3 in

addition to its function in transit complex formation. Detailed analyses carried out by

bimolecular fluorescence complementation studies, peptide-scanning, pull-down analyses

and peptide inhibition studies identified two binding sites of Alb3 for the cpSRP43. The

binding motif within the fifth transmembrane domain of Alb3 consists of the amino acids

314-318 (LVFKF) whilst the binding domain in the C-Terminus comprises the amino acids

374-388. Furthermore the binding domain of cpSRP43 for the interaction with Alb3 was

narrowed down. Thylakoid membrane binding studies suggested an essential role of

ankyrin repeat 4 for thylakoid membrane binding of cpSRP43.

The aim of the second part of the thesis was to provide an indication of the function of the

thylakoid membrane protein Alb4 by protein interaction studies. Crosslinking studies,

bimolecular fluorescence complementation studies and gelfiltration analyses revealed a

direct interaction and association of Alb4 with the chloroplast ATP-synthase. In addition

gelfiltration analyses and coimmunoprecipitation studies indicated that Alb4 is not

associated in the same complex as Alb3 and cpSecY. According to this contention, Alb4

seems to have an independent function of Alb3 and the cpSec-translocase in the insertion

and assembly of the ATP-synthase.

8 Literaturverzeichnis 122

8. Literaturverzeichnis

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9 Abkürzungsverzeichnis 131

9. Abkürzungsverzeichnis

Ala Alanin

Alb3 Albino3

Ank Ankyrin repeat

Aqua dest. lat. Aqua destillata

AS Aminosäure(n)

ATP Adenosintriphosphat

BCA Bicinchoninsäure

bp Basenpaar(e)

BSA engl. bovine serum albumin

CD Chromodomäne

cpSRP engl. chloroplast signal recognition particle

DEPC engl. Diethylpyrocarbonate

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraacetat

GST Glutathion S-Transferase

GTP Guanosintriphosphat

His Histidin

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

kDa kilo-Dalton

LHCP engl. light harvesting chlorophyll a/b binding protein

mRNA messenger-RNA

Ni-NTA engl. Nickel-nitrilotriacetic acid

NTP Nukleosidtriphosphat

OD Optische Dichte

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

RNA Ribonukleinsäure

rpm engl. rotations per minute

SDS engl. sodium dodecyl sulfate

TEMED N,N,N’,N’,-Tetramethylethylendiamin

UV ultraviolett

YFP engl. yellow fluorescent protein

Weitere allgemein gebräuchliche Abkürzungen und Maßeinheiten sind nicht gesondert

aufgeführt.

10 Abbildungsverzeichnis 132

10. Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1-1: Transportwege der Proteine innerhalb des Chloroplasten......................3 Abbildung 1-2: Modell des co- und posttranslationalen cpSRP-Transportwegs .............7 Abbildung 1-3: Proteininteraktionen der Komponenten des cpSRP-Transportwegs ......9 Abbildung 1-4: Membrantopologie von Alb3, YidC und Oxa1.......................................11 Abbildung 1-5: Proteininsertionen durch Alb3, YidC und Oxa1 ....................................16 Abbildung 4-1: Alignment der Aminosäuresequenz von Alb3 und Alb4........................64 Abbildung 4-2: Test der Antikörper und Präimmunseren gegen die Antigene GST-

cAlb3 und cAlb4-his ............................................................................66 Abbildung 4-3: Test der Antikörper gegen die in vitro translatierten

Volllängenproteine ..............................................................................67 Abbildung 4-4: Test der Antikörper gegen Thylakoidmembranproteine........................68 Abbildung 4-5: Alb3 interagiert mit cpSRP43 in Arabidopsis thaliana Protoplasten .....73 Abbildung 4-6: Expressionsnachweis der YFP-Fusionsproteine cpSRP43-nYFP,

Alb3-cYFP und Alb4-cYFP..................................................................75 Abbildung 4-7: Schematische Darstellung der vorhergesagten Membrantopologie

von Alb3 und Alb4 ...............................................................................76 Abbildung 4-8: Identifizierung der Alb3 Bindestelle für das cpSRP43 in Arabidopsis

Protoplasten ........................................................................................78 Abbildung 4-9: Alignment der YFP-Fusionsproteine zur Identifizierung der

Bindestelle...........................................................................................79 Abbildung 4-10: Peptide Scanning von Alb3 Peptiden mit rekombinantem cpSRP43..81 Abbildung 4-11: Alignment von Alb3 und Alb4 im Bereich des Bindemotivs ................82 Abbildung 4-12: Expressionsnachweis ausgewählter Alb3 Deletions- und

Mutationskonstrukte in Arabidopsis Protoplasten ...............................84 Abbildung 4-13: Pull down Analysen von rekombinantem cpSRP43 und cpSRP54

mit in vitro Translationsprodukten von Alb3 und Alb4 .........................88 Abbildung 4-14: Einfluss eines synthetischen Peptids von Alb3 auf die

Thylakoidmembranbindung von cpSRP43..........................................90 Abbildung 4-15: Schematische Darstellung des cpSRP43 ...........................................91 Abbildung 4-16: Thylakoidmembran-Bindungstest mit GST-cpSRP43

Deletionsproteinen (I)..........................................................................92 Abbildung 4-17: Thylakoidmembran-Bindungstest mit GST-cpSRP43

Deletionsproteinen (II).........................................................................94 Abbildung 4-18: Crosslinking von Alb4 und CF1β .........................................................96 Abbildung 4-19: Alb4 interagiert mit der ATP-Synthase Untereinheit CF0II in

Arabidopsis thaliana Protoplasten.......................................................98 Abbildung 4-20: Expressionsnachweis der YFP-Fusionsproteine Alb4-cYFP und

CF0II-nYFP..........................................................................................99 Abbildung 4-21: Alb4 cofraktioniert mit den ATP-Synthase Untereinheiten................100 Abbildung 4-22: Coimmunpräzipitation von Alb3, Alb4 und cpSecY...........................101 Abbildung 5-1: Alignment der C-terminalen Proteinsequenzen der Alb3 Homologe ..108

10 Abbildungsverzeichnis 133

Abbildung 5-2: Alignment des Alb3 aus Arabidopsis thaliana mit den Alb4 Proteinen anderer Streptophyten ......................................................................109

Abbildung 5-3: Proteininteraktionen des cpSRP43.....................................................112 Abbildung 5-4: Modell des posttranslationalen cpSRP-Transportwegs ......................114

11 Tabellenverzeichnis 134

11. Tabellenverzeichnis

Tabelle 3-1: Chemikalienliste ........................................................................................18 Tabelle 3-2: Verbrauchsmaterial ...................................................................................19 Tabelle 3-3: Kits ............................................................................................................19 Tabelle 3-4: Geräte .......................................................................................................20 Tabelle 3-5: Verwendete Plasmide ...............................................................................22 Tabelle 3-6: Escherichia coli-Stämme...........................................................................29 Tabelle 3-7: Saccharomyces cerevisiae-Stamm...........................................................29 Tabelle 3-8: Trenngel pH 8,8 (4 Minigele):....................................................................46 Tabelle 4-1: Alb3 interagiert mit cpSRP43 im Split-Ubiquitin System ...........................71 Tabelle 4-2: Interaktionstests im Split-YFP System......................................................74 Tabelle 4-3: Negativkontrollen der Interaktionstests im Split-YFP System ...................74 Tabelle 4-4: Interaktion der Alb3 Deletions- und Mutationsproteine mit cpSRP43-

nYFP in Arabidopsis Protoplasten ............................................................83 Tabelle 4-5: Interaktionstest von Alb3 Deletionsproteinen mit cpSRP43 im Hefe

Split-Ubiquitin System ...............................................................................85

12 Anhang 135

12. Anhang

12.1 Publikationen

Naomi J. Marty*, Nathaniel E. Lewis*, Thomas Bals*, Karuppanan Muthusamy Kathir, Dakshinamurthy Rajalingam, Alicia D. Kight, Beatrix Dünschede, Aniko Vörös, Thallapuranam Krishnaswamy Suresh Kumar, Ralph L. Henry, Danja Schünemann, and Robyn L. Goforth A Dynamic CpSRP43-Alb3 Interaction Mediates

Translocase Regulation of CpSRP Targeting Components; eingereicht * gleichberechtigte Erstautoren

Benz M., Bals T., Gügel I.L., Piotrowski M., Kuhn A., Schünemann D., Soll J., Ankele E. (2009) Alb4 of Arabidopsis promotes assembly and stabilisation of a none

chlorophyll-binding photosynthetic complex, the CF1CF0-ATP synthase. Mol. Plant; im

Druck

Gerdes L*, Bals T*, Klostermann E, Karl M, Philippar K, Hunken M, Soll J, Schünemann D (2006) A second thylakoid membrane-localized Alb3/OxaI/YidC

homologue is involved in proper chloroplast biogenesis in Arabidopsis thaliana. J Biol Chem 281: 16632-16642

* gleichberechtigte Erstautoren

12 Anhang 136

12.2 Lebenslauf

Persönliche Daten: Name: Bals

Vorname: Thomas

Geburtsdatum : 21.08.1979

Geburtsort: Unna

Staatsangehörigkeit: deutsch

Schulische Ausbildung: 06/2000 Abitur, Walburgisgymnasium Menden

Zivildienst: 08/2000-06/2001 Zivildienst

Studium: 10/2001-04/2006 Studium der Biologie an der Ruhr-Universität Bochum

(Fakultät für Biologie und Biotechnologie), Abschlussarbeit:

„Untersuchungen zum plastidären Proteintransport von Arabidopsis

thaliana: Identifizierung und Charakterisierung eines Alb3-

Homologs“ (Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik,

Betreuerin: Frau Prof. Dr. Danja Schünemann), Abschluss als

Diplom Biologe

Promotion: seit 05/2006 Wissenschaftlicher Mitarbeiter an der Ruhr-Universität

Bochum (Fakultät für Biologie und Biotechnologie) im Rahmen

eines Promotionsstudiengangs (Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie,

Betreuerin: Frau Prof. Dr. Danja Schünemann)

06/2007 Aufnahme in die Research School der Ruhr-Universität Bochum

12 Anhang 137

12.3 Danksagung

Ich danke Frau Prof. Dr. Danja Schünemann sehr herzlich für die Überlassung des

aktuellen und interessanten Themas, die Gewährleistung optimaler Arbeitsbedingungen

und die fortwährende Unterstützung während meiner Doktorarbeit.

Herrn Prof. Dr. Matthias Rögner danke ich sehr für die Übernahme des Korreferats.

Ein besonderer Dank gilt auch Silke Funke, die mich hervorragend in allen technischen

Herausforderungen unterstützt hat und so wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit

beigetragen hat.

Des Weiteren danke ich Christine, Bea und Chantal aus meiner Arbeitsgruppe für die sehr

gute Zusammenarbeit und die überaus gute Arbeitsatmosphäre.

Allen Mitarbeitern der Lehrstühle „Allgemeine und Molekulare Botanik“ und

„Pflanzenphysiologie“ danke ich für die stetige Hilfsbereitschaft und das gute Arbeitsklima.

Ich danke dem SFB480 (Molekulare Biologie komplexer Leistungen von botanischen

Systemen, Teilprojekt B11: Analyse der Proteintransport-Mechanismen in Chloroplasten

(Prof. Dr. Danja Schünemann)) und der Research School der Ruhr-Universität Bochum

für die finanzielle Unterstützung dieser Arbeit.

Danken möchte ich auch meinen Freunden, die mir geholfen haben, immer den nötigen

Abstand vom Labor zu gewinnen.

Schließlich möchte ich mich noch ganz besonders bei meinen Eltern, meinem Bruder und

meiner Freundin bedanken, die mich während dieser Zeit zuverlässig unterstützt haben.

12 Anhang 138

ERKLÄRUNG

Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig verfasst und bei keiner anderen

Fakultät eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel

verwendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um

sechs in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare.

Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in

keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.

Bochum, den 13.10.2009

____________________

Thomas Bals

Documents

Untersuchungen zur Rolle von Alb3 und Alb4 bei der ... · 3.7.23 Thylakoidmembran-Bindungstest mit Peptidinhibierung.....59 3.7.24 Expressionsnachweis ... 0II, PsbW, PsaK TD TD Alb3