Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems · Bei der HPLC handelt es sich um ein chromatographisches Trennverfahren, bei dem die zu untersuchende Substanz, zusammen mit

Validierungsplan eines

Chromatographie-Datensystems

Diplomarbeit

von

Markus Keller

Hochschule München

Fakultät Feinwerk- und Mikrotechnik, Physikalische Technik

Studiengang Mechatronik/Feinwerktechnik (Diplom)

Studienrichtung Produktion & Automatisierung

Erstprüfer: Prof. Dr. Otto Parzhuber

Zweitprüfer: Prof. Dr. Richard Schulz

Betreuer: Dipl.-Ing. Ludwig Jaufmann, Firma Goebel

Tag der Einreichung: 15.09.2008

Sperrvermerk:

Die vorliegende Diplomarbeit beinhaltet interne vertrauliche Informationen der

Firma Goebel.

Die Weitergabe des Inhaltes der Arbeit und eventuell beiliegender Zeichnungen und

Daten im Gesamten oder in Teilen ist grundsätzlich untersagt. Es dürfen keinerlei

Kopien oder Abschriften - auch in digitaler Form - gefertigt werden.

Ausnahmen bedürfen der schriftlichen Genehmigung der Firma Goebel.

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS........................................................................................1

ABBILDUNGSVERZEICHNIS...............................................................................4

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS............................................................................. 6

VORWORT.............................................................................................................7

1 ABSTRAKT....................................................................................................... 8

1.1 deutsch....................................................................................................... 8

1.2 english........................................................................................................ 8

2 EINLEITUNG..................................................................................................... 9

2.1 Motivation................................................................................................... 9

2.2 Die HPLC....................................................................................................11

2.2.1 Grundlagen der HPLC......................................................................... 11

2.2.2 Trennverfahren der Substanzen..........................................................13

2.2.3 Arbeitsweise einer HPLC-Anlage........................................................ 15

2.3 Erläuterung der Gliederung........................................................................ 17

3 AUFGABEN EINES CHROMATOGRAPHIE-DATENSYSTEMS..................... 18

3.1 Steuerung der Anlage................................................................................ 18

3.2 Datenaufnahme und Rohdatenspeicherung.............................................. 19

3.3 Auswertung................................................................................................ 20

3.3.1 Bestimmung der Peak-Flächen.......................................................... 20

3.3.2 Manuelle Integration........................................................................... 21

3.3.3 Erstellen von Kalibrierungskurven...................................................... 22

3.3.4 Mengenbestimmung aus Kalibrierfunktionen..................................... 22

3.4 Reporting................................................................................................... 23

3.4.1 Flexibler Reportgenerator................................................................... 23

3.4.2 Druck / Export..................................................................................... 24

3.5 Qualitative Information durch Spektrenvergleich....................................... 25

3.5.1 Darstellung des 3D - Datenfeldes........................................................25

3.5.2 Extraktion von Spektren und Chromatogramen aus 3D..................... 26

3.5.3 Spektren-Bibliothekensuche............................................................... 27

3.5.4 Peak-Reinheits-Berechnung............................................................... 29

- 1 -


4 DETAILLIERTE FUNKTIONSBESCHREIBUNG.............................................. 30

4.1 Geminyx Main Menü...................................................................................30

4.2 Data............................................................................................................ 30

4.2.1 Sample Editor...................................................................................... 31

4.2.2 Calibration........................................................................................... 32

4.2.3 Methods.............................................................................................. 33

4.2.3.1 General........................................................................................ 33

4.2.3.2 Chart Layout................................................................................ 34

4.2.3.3 Integration.................................................................................... 36

4.2.3.4 Print..............................................................................................45

4.2.3.5 Calibration.................................................................................... 45

4.2.3.6 Results......................................................................................... 46

4.2.4 Data..................................................................................................... 47

4.3 Configuration.............................................................................................. 51

4.3.1 Edit Variables...................................................................................... 51

4.3.2 Option................................................................................................. 54

4.3.2.1 General........................................................................................ 54

4.3.2.2 Company...................................................................................... 54

4.3.2.3 Charts...........................................................................................55

4.3.2.4 Integration defaults.......................................................................55

4.3.2.5 Spectra defaults........................................................................... 62

4.3.3 Print Templates....................................................................................62

4.3.3.1 Template Groups..........................................................................62

4.3.3.2 Templates.....................................................................................63

5 TEST ZUR PRÜFUNG...................................................................................... 64

5.1 Test der Funktion „ Sample Editor“............................................................. 64

5.2 Test der Funktion „Integration“....................................................................65

5.3 Test der Funktion „Data“............................................................................. 77

5.3.1 Lineare Kalibrierung ohne Offset, externer Standard........................ 77

5.3.2 Lineare Kalibrierung mit Offset, externer Standard........................... 78

5.3.3 Lineare Kalibrierung ohne Offset, interner Standard......................... 79

5.3.4 Lineare Kalibrierung mit Offset, interner Standard............................ 80

5.3.5 Lineare Kalibrierung ohne Offset, interner Standard gewichtet.........81

5.3.6 Lineare Kalibrierung mit Offset, interner Standard gewichtet............ 82

5.3.7 Quadratische Kalibrierung ohne Offset, externer Standard...............83

- 2 -


5.3.8 Quadratische Kalibrierung mit Offset, externer Standard..................84

5.3.9 Quadratische Kalibrierung ohne Offset, interner Standard................85

5.3.10 Quadratische Kalibrierung mit Offset, interner Standard...................86

5.3.11 Quadratische Kalibrierung ohne Offset, interner Standard gew. ...... 87

5.3.12 Quadratische Kalibrierung mit Offset, interner Standard gewichtet...88

5.4 Test der Funktion „Configuration“................................................................89

5.4.1 Test der Funktion „Edit Variables“........................................................89

5.4.2 Test der Funktion „Option“................................................................... 91

6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK........................................................ 92

ÜBERSICHT CD-ROM.......................................................................................... 94

LITERATURVERZEICHNIS...................................................................................95

ERKLÄRUNG ZUR DIPLOMARBEIT....................................................................96

- 3 -


ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Abbildung 1: Komplette HPLC-Anlage der Firma Goebel.......................... 11

Abbildung 2: Typischer Aufbau einer HPLC-Anlage................................... 12

Abbildung 3: Trennsäule............................................................................. 13

Abbildung 4: Schematischer Aufbau einer HPLC-Anlage........................... 15

Abbildung 5: Chromatogram....................................................................... 16

Abbildung 6: Modularer Aufbau...................................................................19

Abbildung 7: Chromatogram mit Peak-Grenzen......................................... 20

Abbildung 8: Kalibrierungskurve am Beispiel Ethyl Ester........................... 22

Abbildung 9: Kalibrierungskurve mit Mengenbestimmung......................... 22

Abbildung 10: Integriertes Chromatogram mit Reportgenerator................... 23

Abbildung 11: „Template“ - Konfigurator........................................................24

Abbildung 12: 3D - Datenfeld........................................................................ 25

Abbildung 13: Extraktion aus dem 3D - Datenfeld........................................ 26

Abbildung 14: Spektrenvergleich über Bibliothekensuche............................27

Abbildung 15: „Peak-Purity“ - Berechnung....................................................29

Abbildung 16: Geminyx III Hauptmenü......................................................... 30

Abbildung 17: „Sample“ - Editor.................................................................... 31

Abbildung 18: „Calibration Table“.................................................................. 32

Abbildung 19: Method Table „General“ - Funktion........................................ 33

Abbildung 20: Method Table „Chart Layout“ - Funktion................................ 34

Abbildung 21: „Chart Parameter“ - Editor..................................................... 34

Abbildung 22: „Spectra Parameter“ - Editor.................................................. 35

Abbildung 23: Method Table „Integration“ - Funktion.................................... 36

Abbildung 24: Basislinie mit Drift.................................................................. 37

Abbildung 25: „Peak Identification“ - Funktion.............................................. 39

Abbildung 26: Chromatogram ohne „Inhibit Integration“............................... 42

Abbildung 27: Chromatogram mit „Inhibit Integration“.................................. 43

Abbildung 28: Peak mit detektiertem Rider-Peak......................................... 44

Abbildung 29: „Result Layout“.......................................................................46

Abbildung 30: Unterfunktion „Data“...............................................................47

Abbildung 31: Kalibrierungskurve................................................................. 48

Abbildung 32: „Edit Variables“ - Funktion......................................................51

Abbildung 33: „Sum“ - Funktion.................................................................... 52

- 4 -


Abbildung 34: „Integration defaults“ - Funktion............................................. 55

Abbildung 35: Peak mit Rider-Peaks............................................................ 56

Abbildung 36: „Rider Threshold“ - Funktion.................................................. 56

Abbildung 37: „Rider Ratio“ - Funktion..........................................................57

Abbildung 38: „Negative Peak Detection“ - Funktion.................................... 58

Abbildung 39: „Lock Baseline“ = 0................................................................ 59




Abbildung 43: Beispiel „Template“ - Vorlage................................................. 63

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ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

EDQM Europäische Direktion für die Qualität von Medikamenten

HPLC High Performance Liquid Chromatography( Hochauflösende Flüssigkeits-Chromatographie )

DAD Dioden Array Detector

RT Retentionszeit

IS Interner Standard

- 6 -


VORWORT

Die hier vorgestellte Diplomarbeit ist bei der Firma Goebel in Au in der Hallertau erstellt

worden.

Der Bereich Instrumentelle Analytik umfasst den Vertrieb, die Installation und den

Service für Komplettlösungen der HPLC sowie der Photometrie.

Durch meine Diplomarbeit bekam ich einen guten Einblick in die Entwicklung und

Validierung von Datensystemen. Auch im Bereich Instrumentelle Analytik konnte ich

mein Hintergrundwissen sehr stark verbessern.

Ein ganz besonderer Dank geht an dieser Stelle an Herrn Thomas Weißbach, der mir

ermöglicht hat, diese interessante Diplomarbeit zu schreiben.

Des Weiteren möchte ich mich bei meinem Betreuer Herrn Ludwig Jaufmann bedanken,

der mir eine gute Vorgehensweise für die Diplomarbeit aufgezeigt und mir trotzdem viel

Freiheit bei der Ausarbeitung gelassen hat.

Auch die Herren Klaus Lux, Jürgen Deya und Andreas Dieges standen mir stets mit Rat

und Tat zur Seite.

Ein weiteres Dankeschön gebührt meinem Betreuer an der Hochschule München, Herrn

Prof. Dr. Otto Parzhuber für seine Unterstützung.

Generell herrscht innerhalb der Firma Goebel in Au ein angenehmes und sehr

kollegiales Betriebsklima, was sich auf die Erstellung meiner Diplomarbeit sehr hilfreich

und motivierend ausgewirkt hat.

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1. Abstrakt

1.1 deutsch

Diese Arbeit „Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems“ beschäftigt

sich zunächst mit den Grundlagen der HPLC ( High Performance Liquid

Chromatography ), in dessen Bereich die zu validierende Software verwendet wird.

Ein strukturierter Validierungsplan gewährleistet, dass alle wichtigen Funktionen des

Chromatographie-Datensystems gründlich überprüft werden. Dies ist wichtig, um zu

garantieren, dass ein qualitativ hochwertiges Produkt zeitnah auf den Markt gebracht

werden kann. Anschließend wird das Datensystem selbst genauer beschrieben, welche

Aufgaben es bewältigen muss und welche Funktionalitäten gefordert werden.

Den Hauptteil dieser Diplomarbeit bildet aber der erarbeitete Validierungsplan selber.

Der Validierungsplan enthält eine komplette Auflistung aller Funktionen. Darüber

hinaus werden Funktionen der Wichtigkeit nach beurteilt. Die Prüfung aller Funktionen

ist im Validierungsplan abgedeckt und muss nachweisbar sein.

Durch diesen Plan soll die Qualität des Produktes bereits während der Entwicklung

abgesichert werden.

1.2 english

This assignment „Validation Plan of a Chromatography-Data System“ is about the

basics of the HPLC ( High Performance Liquid Chromatography ), where the Software

is used for.

A structured validation plan ensures that all important functions of the chromatography

data system software are well checked. This is important because it guarantees to

release a quality product in time to the market. Further the data system will be

discribed, which problems it has to handle and what kind of functions it must have.

The mainpart of this degree dissertation is the validation plan. The validation plan

contains a complete list of all functions and all functions will be assessed because of

their priority. This validation plan is including the tests for all functions and it has to be

verifiable. Because of this plan the quality of the product has to be confirmed already

during the development time.

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2. Einleitung

2.1 Motivation

Alle Arzneimittel, die in Europa hergestellt oder verkauft werden, unterliegen strengen

Regeln über Zusammensetzung, Herstellungsverfahren und Qualität - von der

einfachen Tablette, die mit einem Glas Wasser geschluckt wird, bis hin zu komplexen

Behandlungen. Unter der Schirmherrschaft des Europarates nimmt in Europa und

weltweit die Europäische Direktion für die Qualität von Medikamenten ( EDQM ) einen

Großteil dieser Aufgaben wahr.

[ COE ]

Da Software zunehmend zu einem integralen Bestandteil von Produkten und Systemen

wird und in Kenntnisnahme der zunehmenden Wichtigkeit von Software, insbesondere

im Bereich der Medizinprodukte, sind in den letzten Jahren eine ganze Reihe von

spezifischen normativen Anforderungen entstanden.

Die Risikobeherrschung durch einen sicherheits- und qualitätsorientierten

Softwareentwicklungsprozess gewinnt daher immer mehr an Bedeutung. Die

entwicklungsbegleitende Unterstützung des normkonformen Entwurfs und der Wartung

von Software, soll die Entwicklung von Anfang an zu einem zertifizierungsfähigem

Produkt lenken.

Durch die Validierung einer Software wird laut der europäischen Normung ( EN 60601-

1-4 und EN 62304 ) ein Dokumentationsverfahren zum Erbringen, Aufzeichnen und

Interpretieren von Ergebnissen verstanden, die zeigen, dass ein Verfahren dauerhaft

die vorgegebenen Spezifikationen erzeugen kann.

[ UNI ]

Um eine zeitgemäße, konkurrenzfähige und vor allem für den Kunden intuitiv zu

bedienende Softwaremöglichkeit bieten zu können, wird bei der Firma Goebel ein

komplett neu aufgesetztes Datensystem ( Geminyx III ) zur Steuerung und Auswertung

von HPLC-Anwendungen in Zusammenarbeit mit einem externen Softwarehaus

entwickelt.

In diesem Zusammenhang wurde von der Firma Goebel eine Verfahrensanweisung zur

Regelung der Softwareentwicklung und Pflege mit externen Software-Häusern erstellt.

- 9 -


Diese Regelungen umfassen im allgemeinen das Verhältnis mit externen Software-

Häusern zur Entwicklung und Validierung neuer Software, aber auch zur Pflege, zur

Funktionserweiterung und zum Debugging existierender Software.

Dadurch soll gewährleistet werden, dass die Software-Entwicklung exakt nach den

Vorgaben des Lastenhefts der Kunden und dem daraus resultierenden Pflichtenheftes

des Software-Hauses erfolgt. Des weiteren müssen die definierten Qualitätsziele

unbedingt eingehalten werden und der Zeit- und Kostenrahmen für die Projekte darf

nicht gesprengt werden. Auch Änderungen zur Fehlerbeseitigung und zur

Funktionserweiterung müssen kontrolliert durchgeführt werden, sodass der hohe

Qualitätsstandard, auch während der Lebenszeit einer Software, aufrecht erhalten bzw.

sogar noch weiter gesteigert werden kann.

- 10 -


2.2 Die HPLC

2.2.1 Grundlagen der HPLC

Abbildung 1: Komplette HPLC-Anlage der Firma Goebel

Die HPLC ( High Performance Liquid Chromatography ) hat sich im vergangenen

Jahrzehnt zu einer leistungsfähigen Trenn- und Analysentechnik entwickelt, deren

Anwendungsbereich von der Analytik von anorganischen und organischen Ionen,

neutralen organischen Stoffen, Metallchelaten bis zu den Polymeren reicht. Diese

Anwendungsbreite und ihre Verwendung als Multikomponentenanalysentechnik haben

sie zu einem unentbehrlichen Werkzeug in der Umweltanalytik, pharmazeutischen

Industrie, Lebensmittelchemie, Biochemie u.a. werden lassen.

Die moderne HPLC ergänzt die stoffbedingt eingeschränkten Möglichkeiten der

unzweifelhaft höchst leistungsfähigen Kapillargaschromatographie.

Flüssigkeitschromatographisch sind schwerflüchtige, flüssige und thermolabile Proben

auch mit komplexer Zusammensetzung analysierbar. Voraussetzung ist eine

ausreichende Löslichkeit des Analyten im Laufmittel. [ HPLC 1 ]

Bei der HPLC handelt es sich um ein chromatographisches Trennverfahren, bei dem

die zu untersuchende Substanz, zusammen mit einem Laufmittel , der mobilen Phase,

( auch "Elutionsmittel" oder "Eluent" genannt ) durch eine so genannte Trennsäule,

welche die stationäre Phase enthält, gepumpt wird. Eine Trennsäule in einem HPLC-

Gerät ist zwischen 1,8 und 30 cm lang und hat zumeist einen Innendurchmesser von 2-

6 mm, im Falle von analytischen HPLC-Systemen. Gelegentlich wird eine so genannte

Vorsäule aus wirtschaftlichen Gründen vorgeschaltet; dabei handelt es sich um eine

kurze Säule, die Verunreinigungen von der Hauptsäule abhalten soll.

Der auf die wesentlichen Elemente reduzierte Aufbau einer typischen HPLC-Apparatur

kann der unten stehenden Abbildung 2 entnommen werden.

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Abbildung 2: Typischer Aufbau einer HPLC-Anlage

Legende der Buchstaben:

A = Eluentenreservoirs

B = Elektromagnetische Mischventile mit Doppelhubkolbenpumpe

C = Überdruckventil

D = Druckkompensationsschleife um Pumpimpulse der Pumpe zu egalisieren

E = Mischkammer

F = Einspritzventil

G = Trennsäule

H = HPLC-Einheit

I = Detektor-Einheit ( z.B. UV-Spektrometer )

J = Computer-Interface

K = PC

L = Drucker zur Ausgabe der Ergebnisse

[ HPLC 2 ]

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2.2.2 Trennverfahren der Substanzen

Die HPLC ist, wie oben schon erwähnt, ein Verfahren der Säulen-Flüssigkeits-

Chromatographie. Sie stellt ein Trennverfahren dar, bei dem die Probenflüssigkeit

mittels einer flüssigen Phase ( Eluent ) unter hohem Druck über die stationäre Phase

( Trennsäule ) transportiert wird.

Je nach Art der Wechselwirkung zwischen stationärer Phase, mobiler Phase und Probe

unterscheidet man in der Flüssigkeitschromatographie folgende Trennmechanismen:

Adsorptions-, Verteilungs-, Ionenaustausch-, Ausschluss- und

Affinitätschromatographie.

Bei der HPLC finden hauptsächlich die Verfahren der Adsorptions- und

Verteilungschromatographie Anwendung.

Bei der Adsorptionschromatographie werden

die Probenmoleküle durch Dipol-Dipol-

Wechselwirkungen reversibel an die stationäre

Phase gebunden. Die Verweildauer der

Substanzen an der stationären Phase ist

aufgrund der unterschiedlich starken

Wechselwirkung mit der Oberfläche der

stationären Phase unterschiedlich lang. So

werden die Probesubstanzen voneinander

getrennt.

Bei der Verteilungschromatographie nutzt

man die unterschiedliche Löslichkeit der zu

trennenden Substanzen in den beiden Phasen

aus. In der Normalphasenverteilungs-

Abbildung 3: Trennsäule Chromatographie ist die stationäre Phase polarer

als die mobile Phase. In der Reversed-Phase ( RP-Umkehrphase )-Chromatographie

ist die mobile Phase polarer als die stationäre Phase. Die stationäre Phase kann an ein

Trägermaterial chemisch gebunden werden, oder das Trägermaterial wird einfach mit

der stationären Phase belegt. Die Reversed-Phase-Chromatographie wird vorwiegend

bei unpolaren oder wenig polaren Substanzen angewendet.

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In der HPLC unterscheidet man zwei Arbeitsweisen:

1. isokratisch:

Dabei bleibt die Zusammensetzung des Eluenten und die Fließmittelstärke während

des Trennvorganges konstant.

2. Gradientenelution:

Der Eluent wird während des Trennvorgangs variabel zusammengesetzt und die

Fließmittelstärke erhöht.

Wie man oben in Abbildung 3 erkennen kann, wandern die einzelnen Substanzen

eines Stoffgemisches unterschiedlich schnell durch die Trennsäule und somit durch

den gesamten Kreislauf. Dabei kann es dazu kommen, dass der gesamte

Analysevorgang viel zu lange dauert oder die einzelnen Peaks zu sehr abflachen. Es

entsteht das Problem, die Peak-Grenzen für die softwareinterne Flächenintegration

nicht mehr genau definieren zu können, wodurch die einwandfreie

Konzentrationsbestimmung einer Teil-Substanz nicht mehr gewährleistet ist.

Um diesem Problem Abhilfe zu schaffen, verwendet man die Gradientenelution.

Hierbei verwendet man zwei oder mehrere mobile Phasen( = Eluenten ). Zunächst

wird nur ein Eluent eingesetzt, bis die ersten Substanzen durch die Säule diffundiert

sind. Dann erst wird die zweite mobile Phase allmählich beigemischt und erreicht so,

dass auch die letzten Substanzen zügig und mit einem halbwegs schlanken Peak aus

der Säule kommen.

Wenn hingegen, bei einfacheren Aufgaben, nur ein Eluent ausreicht, spricht man von

einer isokratischen Trennung.

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2.2.3 Arbeitsweise einer HPLC-Anlage

Abbildung 4: Schematischer Aufbau einer HPLC-Anlage

Ein HPLC-Aufbau besteht aus 4 Hauptteilen:

Pumpe, Einspritzsystem ( Autosampler ), Trennsäule und Detektor mit

Auswertesystem.

Die HPLC verwendet Trennpartikel mit Korngrößen von 3 bis 10 µm ; sie erreicht damit

hohe Trennstufenzahlen, erfordert aber gleichzeitig die Überwindung eines relativ

hohen Gegendrucks beim Transport der mobilen Phase durch die dünne Trennsäule

( 2 - 6 mm Durchmesser ). Alle Teile müssen möglichst totvolumenfrei miteinander

verbunden werden und druckstabil sein ( bis ca. 300 bar ).

Bei der Probenaufgabe wird die Probe zunächst drucklos in eine Probenschleife

injiziert, die sich in einem 4-Wege-Ventil befindet ( Autosampler ). Durch Umschalten

wird der Elutionsmittelstrom dann durch die Probenschleife geführt, wodurch die Probe

in die Säule gelangt. Die analytische Trennsäule, meist aus Edelstahl, sollte

thermostatisierbar sein. Zur Detektion werden UV/VIS-, Fluoreszens-Spektrometer,

RI-amperometrische und Leitfähigkeits-Detektoren mit Durchflusszellen verwendet.

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Die Darstellung des Ergebnisses der Stofftrennung erfolgt in Form eines

Chromatograms, einer Elutionskurve. Sie stellt die Abhängigkeit der Menge

( Konzentration ) der eluierten Substanzen von der Zeit dar. Die einzelnen Stoffe

haben unterschiedliche Retentionszeiten. [ HPLC 3 ]

Abbildung 5: Chromatogram

- 16 -


2.3 Erläuterung der Gliederung

In Kapitel 2 werden die Grundlagen der HPLC erklärt. Dabei wird zunächst

beschrieben, was man sich unter HPLC vorzustellen hat und wie es sich über die

letzten Jahrzehnte entwickelt hat. Des weiteren werden die chemischen Hintergründe,

der hier angewendeten Analyse, angesprochen, um die Arbeitsweise dieser Anlagen

und somit auch der zu validierenden Software zu verstehen.

Kapitel 3 beschäftigt sich mit den grundlegenden Aufgaben eines Chromatographie-

Datensystems. Angefangen mit der Steuerung einer solchen Anlage, über die

Aufnahme der Daten und deren Auswertung, bis hin zu qualitativen Aussagen, die

getroffen werden können.

Die detaillierte Funktionsbeschreibung der Software erfolgt in Kapitel 4. Es werden

hier alle möglichen Funktionen der Software vorgestellt und deren Funktionen erklärt.

Dies ist wichtig, um später die Testprozeduren verstehen zu können.

Den Kern der Arbeit stellt Kapitel 5 dar, in dem die Testabläufe vorgestellt werden. Da

der Test der kompletten Software zu umfangreich wäre, werden hier nur die wichtigsten

Teile des Datensystems behandelt.

- 17 -


3 AUFGABEN EINES CHROMATOGRAPHIE-DATENSYSTEMS

3.1 Steuerung der Anlage

Wie oben schon kurz erwähnt, wird von der Firma Goebel ein neues Datensystem

entwickelt, die Geminyx III.

Ein großer Aufgabenbereich der Software ist es, die in dem System eingebundenen

Komponenten, wie Pumpen, Detektoren etc., steuern zu können. Geminyx III kann

zwei komplette Chromatographie-Anlagen gleichzeitig steuern.

Jede der beiden Anlagen kann folgende Komponenten beinhalten:

● Ein bis drei Pumpen ( für isokratische Applikationen oder Gradientenelution )

● Einen automatischen Probengeber ( Autosampler )

● Einen Ofen

● Verschiedene Detektoren

● 8 Relais Anschlüsse

● Einen Dioden Array Detektor ( DAD )

Um all diese Komponenten, flexibel nach Benutzeranforderungen, zu einem System

zusammenstellen zu können, kann man mit Hilfe eines Konfigurationsprogramms die

unterschiedlichsten Varianten ermöglichen. Hierbei werden die benötigten

Gerätschaften ausgewählt und nach Kundenwunsch vorkonfiguriert.

In Abbildung 6 sieht man ein Beispiel eines kundenspezifischen, so genannten

modularen Aufbaus eines Systems.

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Abbildung 6: Modularer Aufbau

Man kann dieses System manuell steuern indem man, für jede Komponente einzeln,

die Werte definiert. Dies wird häufig nur bei Sonder- und Probeläufen verwendet.

Oder man kann ein Steuerprogramm, das so genannte Programm File, erstellen,

wobei eine automatische Abarbeitung erfolgt. Der Vorteil eines Programm Files ist, es

bei gleichen Applikationen immer wieder aufrufen zu können und nicht ständig aufs

neue manuelle Eingaben machen zu müssen.

3.2 Datenaufnahme und Rohdatenspeicherung

Dies gilt auch bei der Datenaufnahme. Man kann einen Lauf entweder manuell starten

oder über das oben erwähnte Programm File. Bei beiden Möglichkeiten kann man die

Datenaufnahme über eine Online-Maske in Echtzeit verfolgen. Aufgenommen werden

die Daten einerseits mittels eines A/D-Konverters, von Detektoren mit analogem

Signalausgang oder digital von einem DAD. Wenn man mehrere verschiedene

Programm Files oder immer das gleiche Programm-File verwenden möchte, kann man

dies über eine so genannte Sequenz automatisieren. Dies bietet die Möglichkeit,

einfach und bequem, auch langwierige Applikationen selbstständig automatisch

ablaufen zu lassen, ohne immer aufs Neue, Werte und Parameter einstellen zu

müssen. Wie genau die Rohdatenspeicherung funktioniert und gesteuert wird, wird in

Kapitel 4.2 Data näher erläutert.

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3.3 Auswertung

3.3.1 Bestimmung der Peak-Flächen

Ein sehr grundlegender Bestandteil der Software ist die genaue Erkennung von Peak-

Grenzen, bzw. die Bestimmung der Peak-Flächen. Durch die Peak-Fläche können

Aussagen über die Konzentration der einzelnen Substanzen eines Stoffgemisches

getroffen werden.

Abbildung 7: Chromatogram mit Peak-Grenzen

Bei der Berechnung der Peak-Fläche gilt:

Conc ~ ∫ Abs dFlow

mit: Conc = Konzentration einer Substanz im Stoffgemisch

Abs = Absorption ( Lichtabsorbtionen )

dFlow = Ableitung nach dem Fluss

Da aber der Eluentenfluss durch das HPLC-System immer konstant sein muss, wird

die Absorption nach der Zeit abgeleitet:

Conc ~ ∫ Abs dt

- 20 -


Diese Berechnungen laufen normalerweise über die Peak-Fläche. Alternativ dazu gibt

es noch die Möglichkeit die Höhenauswertung zu wählen. Hier besteht der Unterschied

darin, dass die Konzentration nicht über die Fläche, sondern über die Höhe eines

Peaks bestimmt wird.

Die Höhenauswertung bietet bei manuellen Messungen die Möglichkeit, schneller und

mit weniger Aufwand, auch bei schlecht getrennten Peaks, eine Konzentrations-

berechnung durchzuführen. Da aber, durch leistungsfähigere Computer, der geringere

Rechenaufwand der Peaks-Höhenmessung nicht mehr so sehr ins Gewicht fällt, stellt

sich nicht die Frage welche Methode besser oder schlechter ist. Man muss abwägen,

welche von beiden Methoden man bei welchen Voraussetzungen verwendet. Dabei

spielen viele Faktoren, wie das Rauschen oder die Peak-Asymmetrie, eine

entscheidende Rolle.

3.3.2 Manuelle Integration

Man kann aber auch, durch Veränderung der Parameter, Einfluss auf die Peak-

Erkennung nehmen. Beispiele hierfür sind, die manuelle Verschiebung von Peak-

Grenzen, Anpassung der Basislinie oder die graphische Definition von

Aufsetzer-Peaks.

Was dies im Einzelnen bedeutet, sowie die genaue Funktionalität der Peak-Erkennung,

wird in Kapitel 4.2.3.3 Integration genauer erläutert.

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3.3.3 Erstellen von Kalibrierungskurven

Anhand der gewonnenen Rohdaten mehrerer Läufe können Kalibrierungskurven der

Einzelnen Peaks ( Substanzen ) erstellt werden. Bei der graphischen Darstellung der

Kalibrierungskurve sollten, neben dem Graphen selber, auch sämtliche

Kalibrierungspunkte sichtbar sein. Ausgehend von der eingespritzten Substanzmenge

und der daraus resultierenden Peak-Fläche, wird von der Software die

Kalibrierungskurve errechnet.

Abbildung 8: Kalibrierungskurve am Beispiel Ethyl Ester

3.3.4 Mengenbestimmung aus Kalibrierfunktionen

Auf der Y-Achse wird die Response des Systems aufgetragen, was der Peak-Fläche

entspricht. Auf der X-Achse die eingespritzte Substanzmenge.

Ausgehend von der ermittelten Peak-Fläche, kann man nun die Kalibrierkurve

verwenden, um die eingespritzte Menge Wirksubstanz unbekannter Proben zu

bestimmen.

Abbildung 9: Kalibrierungskurve mit Mengenbestimmung

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3.4 Reporting

3.4.1 Flexibler Reportgenerator

Das Reporting ist ein wichtiger Bestandteil der Software, um die aufgezeichneten

Daten für den Endanwender verständlich und nach seinen Bedürfnissen angemessen

darstellen zu können.

Dies umzusetzen, gewährleistet der flexible Reportgenerator. Hier können, die aus

dem Chromatogram berechneten Resultate, wie Substanzname, Menge usw.,

kundenspezifisch zusammengesetzt und in beliebiger Reihenfolge angeordnet werden.

Abbildung 10: Integriertes Chromatogram mit Reportgenerator

In Abbildung 10 sieht man, zum Einen das Chromatogram oben mit den berechneten

Peaks und zum Anderen darunter die Berechnungsresultate wie Menge ( Amount ),

Retentionszeit, Peakhöhe, Peakfläche und relative Fläche der einzelnen

Komponenten.

Diese Resultate werden vorher aus einer Liste ausgewählt und beliebig angeordnet.

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3.4.2 Druck / Export

Für Ausdrucke können so genannte „Templates“ erstellt werden. Dies sind

Dokumentvorlagen, die während der Berechnung, automatisch mit dem tatsächlichen

Inhalt der Probe gefüllt werden. Es ermöglicht dem Anwender, sich sein Dokument mit

den für ihn wichtigsten Daten, zu erstellen. Auch der äußere Rahmen lässt sich sehr

kundenspezifisch realisieren.

Abbildung 11: „Template“ - Konfigurator

Abbildung 11 zeigt eine solche Schablone. In diesem Beispiel wird ein Dokument, mit

Firmenanschrift und Logo im Kopf, Sequenz- und Methodenname, Chromatogram und

den Daten der berechneten Peaks, erstellt.

Neben dem üblichen Ausdruck, kann das erstellte Dokument auch in verschiedene

Formate, wie PDF-Files oder Excel-Tabellen bis hin zu HTML-Files, exportiert und

somit in den einzelnen Programmen weiterbearbeitet werden.

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3.5 Qualitative Information durch Spektrenvergleich

3.5.1 Darstellung des 3D - Datenfeldes

Mit Einführung des DAD´s und unter Verwendung von leistungsfähigeren Computern

wurde es möglich, Analysen von Stoffgemischen auch über das komplette Licht-

Spektrum, Wellenlänge für Wellenlänge abzutasten. Das bedeutet zum Beispiel, im

UV-Bereich von 195 nm bis 380 nm werden 186 Datenpunkte aufgezeichnet, wodurch

sich eine sehr hohe Auflösung ergibt. Dies ermöglicht es, zwei sich sehr stark ähnelnde

Substanzen einwandfrei voneinander unterscheiden zu können, was früher mit

konventionellen Methoden ( Detektor mit einer Wellenlänge ) nicht festzustellen war.

Mit konventionellen Detektoren konnte die Identität nur anhand der Retentionszeit, also

der Bindung der Komponente an die stationäre Phase der Trennsäule, bestimmt

werden.

Abbildung 12: 3D - Datenfeld

Ein solches 3D - Datenfeld ist in Abbildung 12 dargestellt. Die nach rechts verlaufende

X-Achse zeigt die Retentionszeit an, die nach oben gerichtete Y-Achse die Stoffmenge

und die nach hinten verlaufende Y-Achse bei welcher Wellenlänge gemessen wurde.

Bei näherer Betrachtung dieses Spektrums, hinsichtlich der für diese Auflösung

benötigten Datenpunkte, wird klar, welche hohen Rechnerleistungen benötigt werden.

- 25 -


3.5.2 Extraktion von Spektren und Chromatogramen aus 3D

Aus dem in Abbildung 12 aufgezeichneten 3D - Datenfeld kann man nun ein Spektrum

zu jedem Zeitpunkt, sowie ein Chromatogram bei beliebiger Wellenlänge, erstellen

lassen. Dadurch hat man alle relevanten Daten einer Analyse kompakt und auf einem

Blick zusammengestellt. Man kann über das Spektrum, mithilfe einer so genannten

Bibliothekensuche, genau die Substanz bestimmen ( siehe Kapitel 3.5.3 Spektren-

Bibliothekensuche ). Aus dem Chromatogram kann man die einzelnen Komponenten

eines Stoffgemisches und deren Konzentration auslesen ( siehe Kapitel 2.2.3

Arbeitsweise einer HPLC-Anlage ).

Abbildung 13: Extraktion aus dem 3D - Datenfeld

In Abbildung 13 sieht man oben links die Draufsicht des Datenfeldes aus Abbildung 12.

Hier kann man auswählen bei welcher Retentionszeit und bei welcher Wellenlänge

man das Spektrum, sowie das Chromatogram extrahieren will.

In diesem Beispiel wird ein Spektrum bei der Retentionszeit 2,4 Minuten und ein

Chromatogram bei 245 nm gewählt.

- 26 -


3.5.3 Spektren-Bibliothekensuche

Wie in Kapitel 3.5.2 Extraktion von Spektren und Chromatogramen aus 3D schon

kurz erwähnt, kann man mit der Software Substanzen über eine Spektrenbibliothek

genau bestimmen. Diese Bibliotheken werden durch wissenschaftliche Institute für

diesen bestimmten Zweck angelegt. Die hier verwendete Spektrenbibliothek wurde an

der Charité in Berlin entwickelt und von der Firma Goebel für die neue Software

zugekauft.

Alternativ kann der Benutzer durch die Analyse von Reinsubstanzen, unter den hier

benutzten applikativen Bedingungen, eine Spektrenbibliothek selbst erstellen.

Man kann anhand dieser Bibliotheken vordefinierte Spektren mit den Eigens

gemessenen vergleichen um festzustellen, um welche Substanzen es sich dabei

handelt.

Abbildung 14: Spektrenvergleich über Bibliothekensuche

In Abbildung 14 oben, wird zunächst das gesamte Chromatogram mit vier Substanzen

dargestellt. Unten sieht man die Spektren der gemessenen Substanzen, sowie die

darübergelegten Referenzproben des Instituts.

- 27 -


Daraus kann man ersehen, inwieweit die Proben übereinstimmen, oder ob

Verunreinigungen in die Proben gelangt sind. Im obigen Beispiel handelt es sich um

exakt die gleichen Substanzen. Eventuelle kleinere Abweichungen können natürlich

möglich sein. Sie basieren einerseits auf eventuell differenzierende Messaufbauten des

Instituts und des Kunden oder werden durch vergleichen des Rauschsignals ( siehe

Spektrum 1 und 2 ) hervorgerufen. Bei Spektrum 3 erkennt man visuell 100 prozentige

Übereinstimmung und bei Spektrum 4, bis auf das Rauschsignal im hinteren Teil,

besteht ebenfalls annähernde Simularität.

- 28 -


3.5.4 Peak-Reinheits-Berechnung

Eine wichtige Grundvoraussetzung für das korrekte Ergebnis der Bibliothekensuche ist

es, dass der gesuchte Peak nur aus einer einzigen und nicht aus mehreren

verschiedenen Substanzen besteht. Wichtig bei der Peak-Reinheitsberechnung ist vor

allem, dass sich das UV Spektrum nicht ändert. Andernfalls kann bei Peaks, mit genau

der selben Retentionszeit, die einwandfreie Unterscheidung nicht gewährleistet

werden.

Abbildung 15: „Peak-Purity“ - Berechnung

In Abbildung 15 sieht man eine solche „Peak-Purity“ - ( Reinheits - ) Berechnung. Das

obere Schaubild zeigt vier Substanzen bei 240 nm. Die Reinheit ist hier farblich

unterschieden worden. Grün ist noch im Toleranzfeld für eine reine Probe, wobei blau

und rot Abstufungen bis hin zur verunreinigten Probe sind.

Das untere Diagramm veranschaulicht dies auch nochmal auf eine andere Art und

Weise. Hier entspricht der Wert 1000 ( ± der angegebenen Toleranz unter „Edit

Spectra Chart Parameter“ ) einer reinen Probe.

- 29 -


4 DETAILLIERTE FUNKTIONSBESCHREIBUNG

4.1 Geminyx Main Menü

Das Hauptmenü der Geminyx III bietet eine komplette Übersicht über die

Hauptfunktionen „Data“ und „Configuration“ der einzelnen Sequenzen, die

Chromatograme der einzelnen Proben und deren Datenauswertung. Ebenso enthält

das Hauptmenü die Funktion „Import“, um Daten aus der Vorgängerversion

Geminyx II zu importieren.

Abbildung 16: Geminyx III Hauptmenü

4.2 Data

Die erste Hauptfunktion „Data“ ist in die folgenden vier wesentlichen Unterfunktionen

unterteilt:

● Sample Editor● Calibration● Methods● Data

In diesen Unterfunktionen steuert man hauptsächlich die Verarbeitung und

Berechnung, sowie die Darstellung der aufgezeichneten Daten der Analysen.

- 30 -


4.2.1 Sample Editor

Für jede einzelne Probe können hier Parameterwerte angegeben werden, die für den

Analyselauf wichtig sind.

Test zur Prüfung: Kapitel 5.1 Test der Funktion „Sample Editor"

Abbildung 17: „Sample“ - Editor

Sample Name

Der „Sample Name“ wird für Identifizierungszwecke genutzt.

Sample Position

Hier wird die Position der Probe im Autosampler angegeben. Diese wird automatisch

an den Autosampler übertragen. Somit wird sichergestellt, dass auch die gewünschte

Probe verwendet wird.

Weight

Dieser Parameter stellt einen Korrekturfaktor für die Mengenberechnung, falls

unterschiedliche Einwaagen der Probe benutzt werden.

Dilution

Der „Dilution“-Faktor ist ein Korrekturfaktor, der für die Mengenberechnung verwendet

wird, falls die Probe vor der Injektion verdünnt wird.

Calibration / Integration

Unter dieser Funktion wird festgelegt, ob mit dieser Probe kalibriert werden soll, oder

ob eine Flächenberechnung durchgeführt wird.

Calibration Level

Falls die Probe kalibriert werden soll, wird hier angegeben, in welchem Kalibrierungs-

Level die Probe verwendet wird.

- 31 -


Internal Standard Weight

Dies ist ein weiterer Korrekturfaktor für die Mengenberechnung, falls ein unkonstanter

Interner Standard verwendet wird.

4.2.2 Calibration

In dieser Funktion kann man mittels eines „Calibration Table“ Kalibrierungsgruppen

bearbeiten, die vorher in den entsprechenden Methoden erstellt worden sind.

Neben der Wahl des Druckreports ( Report ) können hier auch Angaben zur

Mengeneinheit ( Amount Dim ) und zur Art der Mengenberechnung ( Response )

gemacht werden. Hierbei kann man sich zwischen Flächen-, Höhen-, oder keiner

Kalkulation entscheiden.

Abbildung 18: „Calibration Table“

Zusätzlich können hier Parameter, für die Kalibrierung jeder einzelnen detektierten

Substanz, eingestellt werden. Es kann angegeben werden, welcher Kalibrierungstyp

verwendet werden soll, ob die Kalibrierungskurve durch den Ursprung gehen soll,

welche Gewichtung die Substanz hat, ob sie einen Internen Standard darstellt, oder

welche Substanz als Referenzsubstanz gilt. Alle diese Parameter werden in Kapitel

4.2.4 Data nochmal genauer ausgeführt.

Außerdem kann hier unter „Level“ noch bestimmt werden, in welcher Menge die

Substanz pro Kalibrierungs-Level eingespritzt werden soll.

- 32 -


4.2.3 Methods

„Methods“ ist in sechs Unterfunktionen aufgeteilt:

● General● Chart Layout● Integration● Print● Calibration● Results

Mit diesen sechs Unterfunktionen kann man für jeden aufgezeichneten Kanal einer

Methode einzeln, die Parameter für die graphische Darstellung, die Berechnung der

Peaks, den Ausdruck, die Kalibrierung und der darzustellenden Ergebnisse bestimmen.

4.2.3.1 General

Unter „General“ werden Daten wie Methodenname und aufzeichnender Kanal

angezeigt bzw. ausgewählt. Somit sind alle weiteren Parameter, die zum Beispiel in

„Chart Layout“ oder „Integration“ gesetzt werden, für jede Probe, die mit dieser

Methode und auf diesem Kanal aufgezeichnet werden, generell gültig.

Abbildung 19: Method Table „General“ - Funktion

- 33 -


4.2.3.2 Chart Layout

Die Funktion „Chart Layout“ unterteilt sich in die folgenden Funktionen:

● Chromatogram Chart Editor● Spectra Chart Editor

Abbildung 20: Method Table „Chart Layout“ - Funktion

Chromatogram Chart Editor

Hier kann man in der Funktion „Chart“, von Achsenskalierung über

Achsenbeschriftung, bis hin zu farblichen Hintergründen, alles für die graphische

Gestaltung eines Chromatograms erstellen lassen.

Unter der zweiten Funktion „Series“ können alle Parameter der Peakdarstellung, wie

zum Beispiel Beschriftungsorientierung oder Schriftart, gewählt werden. Hauptsächlich

wird hier aber bestimmt, wie sich die Peakbezeichnung zusammensetzen soll.

Angefangen bei Peak-Fläche, Peak-Höhe, Peak-Nummer etc. kann man aus über 50

bestehenden Komponenten wählen.

Abbildung 21: „Chart Parameter“ - Editor

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Spectra Chart Editor

Ähnlich wie für das Chromatogram, kann man hier Parameter für die Darstellung im

Spektrenbereich vornehmen. ( siehe Kapitel 3.5 Qualitative Information durch

Spektrenvergleich )

Einerseits kann man Minimal- bzw. Maximalwerte der drei Achsen X, Y und Z, für die

3D-Darstellung bestimmen. Zusätzlich kann man hier X- und Y-Werte für den

„Contour-Plot“ angeben, sowie Parameter für die Peak-Reinheitsberechnung

bestimmen.

Abbildung 22: „Spectra Parameter“ - Editor

- 35 -


4.2.3.3 Integration

Bei der Funktion „Integration“ kann man Parameter folgender Unterfunktionen

einstellen:

● Baseline Subtraction● Smooth Type● Peak Table● Group Table● Integration Events

Test zur Prüfung: Kapitel 5.2 Test der Funktion „Integration"

Abbildung 23: Method Table „Integration“ - Funktion

Baseline Subtraction

Diese Funktion wird verwendet, um den Drift einer Basislinie rechnerisch kompensieren

zu können. Das ist wichtig, um die Fläche des Peaks und somit auch die

Substanzmenge korrekt bestimmen zu können. Gerade bei Gradientenläufen mit

Lösungsmitteln starker Unterschiede im Brechungsindex, steigt die Basislinie nicht

unerheblich an. Bei empfindlichen Läufen könnte dieser Basislinienanstieg zu

spürbaren Verfälschungen in der Flächenberechnung und damit in der Quantifizierung

führen.

Bei dieser Subtraktion wird zunächst ein Gradientenlauf aufgenommen, wobei

keinerlei Substanzen mit eingespritzt werden. Dieser Lauf zeigt somit nur die Basislinie

mit dem Drift ohne Peaks.

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Dann wird der normale Analyselauf gestartet, bei dem das zu analysierende

Stoffgemisch eingespritzt wird. Nun kann man vom System den ersten Referenzlauf

gegen den zweiten Analyselauf abziehen lassen. Dadurch wird der Drift der Basislinie

kompensiert und es bleiben die Peak-Flächen der einzelnen Substanzen zur

Integration übrig.

Abbildung 24: Basislinie mit Drift

Unter „Baseline Reference“ kann man den Lauf angeben, der bei der

Basisliniensubtraktion als Referenzlauf gelten soll.

- 37 -


Smooth Type

Unter „Smooth Type“ kann man zwischen zwei verschiedenen Glättungsvarianten

eines Peaks entscheiden:

● Savitzky● Rolling Average

Die „Savitzky-Golay-Glättung“, wie sie richtig bezeichnet wird, wird bei der

Auswertung von Spektren mit verrauschten Spektrallinien unterschiedlicher Breite

angewandt. Hierbei führt die Tiefpass-Filterung dazu, dass sich die Linien verbreitern

und in der Höhe reduziert werden.

Eingesetzt wird das Verfahren besonders, wenn ein Peak durch nur wenige Punkte

abgetastet wurde. Es lässt sich die Lage und die Höhe des Peaks schätzen, auch

wenn das Maximum zwischen zwei Abtastpunkte fällt.

Typische Anwendungen sind die Auswertungen von Infrarot-Spektren.

[ CES ]

„Rolling Average“ ist eine Methode zur Glättung eines verrauschten Signals, das die

Mittelwertbildung der Datenpunkte anwendet.

Man kann aber unter „Smooth Type“ auch komplett auf eine Glättung der Signale

verzichten.

Mit der Funktion „Smooth Level“ besteht weiterhin noch die Möglichkeit, die Intensität

der Glättung zwischen „Low“, „Medium“ und „High“, zu wählen.

Zu beachten ist aber besonders, dass bei unterschiedlichen Varianten und

unterschiedlicher Intensität auch abweichende Integrationsergebnisse entstehen

können.

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Peak Table

Dieser Abschnitt wird verwendet, um die Peaks eines Chromatograms zu identifizieren.

Hierbei können für Peaks, die bei bestimmten Retentionszeiten identifiziert werden,

Namen zugewiesen werden.

Normalerweise werden Peaks automatisch, mithilfe der Spektrenbibliothek ( siehe

Kapitel 3.5.3 Spektren-Bibliothekensuche ), erkannt. Dies ist aber nicht möglich,

wenn sich die Retentionszeiten der Peaks verschieben.

Aus diesem Grund kann man ein so genanntes „Identification Table“ manuell mit

Peak-Namen und Retentionszeiten anlegen.

Wenn das Chromatogram schon berechnet wurde, wird diese „Identification Table“

automatisch mit den Retentionszeiten der integrierten Peaks gefüllt.

Abbildung 25: „Peak Identification“ - Funktion

Jede Zeile dieses „Tables“ steht für einen Peak. Hierbei sind Name der Komponenten,

Retentionszeit und Breite des Identifikationsfensters angegeben.

Bei diesem Fenster kann man zwischen absoluten ( min ) oder relativen Teil ( % )

unterscheiden. Diese definieren den maximalen Bereich um die angegebene

Retentionszeit, in der der genannte Peak spezifiziert ist.

Das absolute Identifikationsfenster wird in Minuten angegeben, wobei das relative

Fenster ein prozentualer Anteil der gewählten Retentionszeit ist.

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Unter „Peak ID“ wird definiert, welcher Peak gewählt wird, wenn mehrere in einem

Identifikationsfenster gefunden werden:

First: Der Peak, der zuerst in diesem Fenster gefunden wird.

Highest: Der höchste Peak.

Nearest: Der Peak, dessen Retentionszeit am wenigsten von der definierten Zeit

abweicht.

Max. Area: Der flächenmäßig größte Peak.

Last: Der Peak, der zuletzt in diesem Fenster gefunden wird.

Zusätzlich kann ein jeder Peak auch als so genannter Interner Standard ( IS )

ausgewählt werden.

Ein IS ist ein Hilfsmittel bei quantitativen Analysen, zur Erkennung von Fehlern,

während des Analyseverfahrens. Sie dienen als relative Bezugsgrößen, die den

Einfluss des Verfahrens auf das Ergebnis abbilden und eine Einschätzung der Qualität

des Verfahrens erlauben.

IS sind Stoffe, die dem Analyten möglichst ähnlich sind, in der Analysenprobe jedoch

nicht vorkommen. Ein IS wird jeder Probe in einem möglichst frühen Stadium des

Analyseverfahrens in definierter Menge hinzugefügt. Nach erfolgter Analyse wird das

Ergebnis des IS`s mit der erwarteten Menge verglichen ( Bestimmung des

Korrekturfaktors ). Hat der IS durch das Verfahren seine Konzentration verändert, wird

angenommen, dass sich die Konzentration des Analyten in gleicher Weise verändert

hat. Das Ergebnis des Analyten kann mit dem Korrekturfaktor des IS korrigiert werden.

[ INT 1 ]

mit:

KF = Korrekturfaktor

IS Soll = Interner Standard SOLL

IS Ist = Interner Standard IST

- 40 -

KF = IS Soll / IS Ist


Group Table

Hier gibt es zwei Arten von Gruppen: „Result Groups“ und „Calibration Groups“.

Beim erstellen einer „Result Group“ wählt der Benutzer ein Retentionszeitfenster aus,

wobei alle Peaks innerhalb dieses Zeitintervalls, zu einer Gruppe

zusammengeschlossen werden. Weiterhin können separat noch außerhalb liegende

Peaks, manuell hinzugefügt werden.

Diese Gruppe beinhaltet die integrierten und quantifizierten Ergebnisse dieser

Komponenten.

Bei der „Calibration Group“ werden die Peaks verschiedener Stoffe, zu einer Gruppe

zusammengefasst. Diese werden dann bei der Kalibrierung wie eine einzige Substanz

behandelt.

Gruppen werden gebildet, wenn chemisch instabile Stoffe Abbauprodukte bilden, wobei

aber nur die Gesamtmengen dieser Stoffgemische relevant sind und nicht die der

Einzelkomponenten. Das erleichtert die Berechnung und Auswertung einer solchen

Analyse.

Integration Event

Unter „Integration Event“ können genau die selben Parameter für die

Integrationsberechnung der Chromatograme eingestellt werden, wie unter „Integration

defaults“. Ausnahmen sind die beiden Parameter „Inhibit Integration“ und „Average

Noise“, die nur als lokale Parameter unter „Integration Event“ sinnvoll verwendet

werden können.

„Integration Event“-Parameter sind applikationsbezogene Werte, die nur lokal für

eine spezielle Methode gültig sind. Sind hier keine Werte eingestellt, werden zur

Berechnung die globalen, allgemein gültigen Parameterwerte der „Integration

defaults“-Funktion vom Programm verwendet.

- 41 -


Welche Parameter für die Berechnungen eingestellt werden können, wird unter Kapitel

4.3.2.4 Integration defaults ausführlich beschrieben.

Die nur unter „Integration Event“ gültigen Parameter, „Inhibit Integration“ und

„Average Noise“, sind wie folgt definiert:

● Inhibit Integration

Diese Funktion wird verwendet, wenn die Peak-Detektion und -Integration

für ein definiertes Zeitfenster unterdrückt werden soll.

Abbildung 26: Chromatogram ohne „Inhibit Integration“

Wie hier in Abbildung 26 gezeigt, können vor dem ersten entscheidenden

Peak Verunreinigungen auftreten, die aber für die Auswertung des

Chromatograms unwichtig sind.

Wenn diese Verunreinigungen, die bis zur Retentionszeit( RT ) 2.00 Minuten

auftreten, unterdrückt werden sollen, kann man die „Inhibit Integration“-

Funktion bei 0.00 Minuten starten lassen und beim Zeitpunkt RT = 2.00 Minuten

beenden. Die daraus resultierende Integration zeigt Abbildung 27.

- 42 -


Abbildung 27: Chromatogram mit „Inhibit Integration“

Man sieht nun in dem gewählten Zeitfenster keine Basislinienberechnung mehr.

Somit findet auch keine Integration der Peaks mehr statt. Erst ab dem

Zeitpunkt RT = 2.00 Minuten ist wieder eine Basislinie zu erkennen. Ab dort wird

das Chromatogram wie üblich integriert.

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● Average Noise

„Average Noise“ erlaubt es identifizierte Peaks zu filtern, die aber nur das

Ergebnis des Detektorrauschens sind. Laut Definition sind nur Peaks, die höher

als das angegebene Rausch-Level sind, wahre Peaks.

Die Geminyx III-Software kontrolliert das Detektor-Rauschen normalerweise

immer vor jedem Lauf automatisch, wodurch diese Funktion nur bei signifikanten

Veränderungen des Rauschens während der Läufe notwendig wird.

Abbildung 28: Peak mit detektiertem Rider-Peak

Wie in Abbildung 28 dargestellt, wird hier vom System ein Rider-Peak auf einem

Haupt-Peak detektiert. Dieser Rider-Peak resultiert aber nur aus dem

Signalrauschen des Detektors.

Die Höhe dieses Rider Peaks beträgt in etwa 100µV.

Wenn nun das „Average Noise“- Level auf 200 µV gesetzt wird, wird dieser

Rider- Peak nicht mehr als solches erkannt, sondern automatisch als Basislinie

definiert.

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4.2.3.4 Print

Unter „Print“ wird nur ein „Print Template“, dass unter der Funktion

„Configuration → Print Templates“ vordefiniert wird, für die gewünschte

Ausdrucksform ausgewählt ( siehe Kapitel 4.3.3 Print Templates ).

4.2.3.5 Calibration

In der Funktion „Calibration“ wird ebenfalls nur eine „Calibration Group“

ausgewählt, die in einem „Calibration Table“ vordefiniert wird ( siehe Kapitel 4.2.2

Calibration ).

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4.2.3.6 Results

Hier kann sich der Benutzer über das „Result Layout“ seinen „Result Report“, der

nach der Berechnung unter dem Chromatogram erscheint, individuell

zusammenstellen. Er kann bestimmen, welche berechneten Kenngrößen des

Chromatograms für ihn wichtig sind und seinem Ausdruck beinhalten soll.

Man kann zwischen ca. 50 verschiedenen Datentypen wählen, wobei man unter der

Funktion „Configuration → Edit Variables“ ( siehe Kapitel 4.3.1 Edit Variables )

seinen eigenen Datentyp, mit eigener Berechnungsformel erstellen kann und diesen

jederzeit in den „Result Report“ mit einfügen. Auch die Reihenfolge der Auflistung ist

für den Benutzer frei wählbar.

Abbildung 29: „Result Layout“

In dem in Abbildung 29 gewählten Beispiel wird zunächst der Probenname, sowie der

Komponentenname angezeigt. Neben der Retentionszeit und der Peak-Höhe sind mit

Peak-Fläche und relative Peak-Fläche, sowie der Substanz-Menge, die fünf wichtigsten

Daten eines Chromatograms aufgeführt.

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4.2.4 Data

In der Unterfunktion „Data“ sind alle Daten der analysierten Proben folgendermaßen

aufgeführt:

Sequence Name

└ Sample Name

└ Method Name

└ Calibration Name

└ Component Name

Test zur Prüfung: Kapitel 5.3 Test der Funktion „Data"

Abbildung 30: Unterfunktion „Data“

Hier sind die Funktionalitäten der beiden Unterfunktionen „Calibration“ und

„Methods“ in einem zusammengefasst.

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Sample Name

Unter „Sample Name“ wird das Chromatogram mit den berechneten Ergebnissen

dargestellt ( siehe Abbildung 30 ).

Method Name

Hier kann man, wie schon in Kapitel 4.2.3 Methods beschrieben, die wesentlichen

Parameter einer Methode einstellen.

Calibration Name

Unter „Calibration Name“ kann man die Einstellungen für eine Kalibrierungsgruppe

ändern ( siehe Kapitel 4.2.2 Calibration ).

Component Name

In der Funktion „Component Name“ werden zusätzliche Parameter, für die

Berechnung der Kalibrierungskurve einer Substanz, angegeben und eingestellt.

Abbildung 31: Kalibrierungskurve

In Abbildung 31 werden die Parameter einer Kalibrierungskurve, sowie die

Kalibrierungskurve selbst, mit Konzentrations- ( X-Achse ) und Flächenangabe

( Y-Achse ) gezeigt.

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● Component

Hier wird der Name der Substanz angezeigt, dessen Kalibrierungskurve gerade

modifiziert wird.

● Calibration Type

Unter „Calibration Type“ wird festgelegt, wie die Kalibrierungskurve berechnet

werden soll. Da diese mit steigender Konzentration immer nichtlinearer wird,

kann man, bezogen auf den Anwendungsbereich, diese Kurve linear,

quadratisch oder auch exponentiell berechnen lassen.

Bei normalen Konzentrationen, der zu analysierenden Probe, kann

weitestgehend die lineare Berechnung angewandt werden. Bei höheren

Konzentrationen, sollte die Berechnung quadratisch erfolgen.

Eine Kalibrierungskurve kann bis hin zum fünften Polynom berechnet werden,

falls die Anwendung diese Genauigkeit erfordert, wobei dies analytisch gesehen

wenig Sinn macht.

● Forcing Origin

Hierbei handelt es sich um die Berechnungen, mit sehr geringen

Stoffkonzentrationen, an der so genannten Nachweisgrenze. Diese befindet sich

am Schnittpunkt der Kalibrierungskurve und der X-Achse. Mit „Forcing Origin“

kann nun dieser Punkt in den Ursprung des Koordinatensystems gezwungen

werden. Dies ist aber in den seltensten Fällen ratsam, da dies die komplette

Berechnung der Originalkurve verfälscht.

● Scaling Factor

Dieser „Scaling Factor“ ist ein Multiplikator. Er wird als Faktor verwendet, wenn

man chemisch instabile Substanzen analysieren will und das Verhältnis

zwischen dieser und einer bereits bekannten Substanz kennt. Dieses Verhältnis

kann einschlägiger Fachliteratur entnommen werden.

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● Weighting

Je nach Kundenbedarf, wird bei „Weighting“ die Gewichtung auf die

Konzentrationen geändert. Je nachdem, in welchem Bereich der Anwender

seine Berechnungen durchführen will, wird die Gewichtung entweder auf einen

höheren bzw. niedrigeren Konzentrationsbereich gelegt.

x; x² : Gewichtung steigt mit zunehmendem x-Wert der

Kalibrierungskurve ( Bereich hoher Konzentrationen ).

1/x; 1/x² : Gewichtung fällt mit zunehmendem x-Wert der Kalibrierungskurve

( Bereich niedriger Konzentrationen ).

● Internal Standard Reference

Hier kann angegeben werden, welcher der definierten Internen Standards für

diese Substanz als Referenz gelten soll.

● Calib is in Band

Für die Steigung der Kalibrierungskurve, wird hier ein Minimal- und ein

Maximalwert festgelegt. Falls nun ein neuer Kalibrierungslauf nicht in den

definierten Grenzen liegt, steht fest, dass in diesem Lauf Komplikationen

aufgetreten sind und er somit nicht für die Berechnung der Kalibrierfunktion

herangezogen werden darf.

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4.3 Configuration

Die zweite Hauptfunktion neben „Data“ besteht aus den unten aufgeführten drei

Nebenfunktionen:

● Edit Variables● Option● Print Templates

In diesen drei Funktionen werden die wesentlichen Konfigurationen und die

übergeordneten und allgemein gültigen Parameter, zur Berechnung und Ausgabe der

aufgezeichneten Daten, gesetzt.

4.3.1 Edit Variables

Test zur Prüfung: Kapitel 5.4.1 Test der Funktion „Edit Variables"

Abbildung 32: „Edit Variables“ - Funktion

Wie schon unter Kapitel 4.2.3.6 Results erwähnt, kann der Anwender unter „Edit

Variables“ eigene Berechnungsvariablen mit eigens erstellten Formeln editieren, die

später in den „Result Report“ eingefügt werden können.

Zum erstellen einer solchen Variablen, ist zunächst ein eindeutiger und eventuell

selbsterklärender Variablenname wichtig. Zudem wird hier jeder Variablen eine ID-

Kennung zugewiesen, die zusätzlich eine eindeutige Erkennung ermöglicht.

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Falls kein selbsterklärender Variablenname zugewiesen werden konnte, besteht

weiterhin die Möglichkeit unter „Description“ eine kurze Beschreibung der Variablen

einzufügen, die durch die Help-Funktion dem Benutzer auch angezeigt wird. Diese drei

Parameter bilden den Kopf der Variablen, der zur eindeutigen Erkennung und

Zuweisung der Variablen dient.

Um jede Änderungen der Parameter nachvollziehen zu können, werden neben dem

Erstellungsdatum und Ersteller auch das Änderungsdatum automatisch erfasst und

dem eingeloggten Benutzer zugewiesen. Dies dient einerseits zur Vermeidung

unerwünschter Manipulationen aber auch zur lückenlosen Nachvollziehbarkeit der

Variablenerstellung.

Display Format

Hier kann der Benutzer festlegen, mit welcher Genauigkeit die Variable im „Result

Report“ angegeben wird, indem er unter „Display Format“ die gewünschten

Nachkommastellen angibt.

Sum

Abbildung 33: „Sum“ - Funktion

Unter „Sum“ wird lediglich ausgewählt, ob die berechneten Ergebnisse der

Einzelsubstanzen im „Result Report“ aufsummiert werden sollen oder nicht.

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Var Type

In „Var Type“ wird grundsätzlich ausgewählt, welche Art von Variablen erstellt werden

soll.

Es gibt folgende drei Variablentypen:

● String: eine Abfolge von Buchstaben und Sonderzeichen, also eine

Zeichenkette.

● Integer: ganzzahlige Werte.

● Float: Gleitkommazahl.

User Definition

Hier wird nun die gewünschte Berechnungsformel der Variablen erstellt. Der Benutzer

hat hierbei die Auswahl, aus ca. 55 verschiedenen, automatisch bei der Integration des

Chromatograms berechneten, Ergebnissen. Diese können beliebig miteinander addiert,

subtrahiert, multipliziert und dividiert oder auch mit gewünschten Faktoren verrechnet

werden.

Hierbei gelten aber grundsätzlich immer die allgemeinen Rechenregeln und müssen

auch unbedingt eingehalten werden, um aussagekräftige und gültige Ergebnisse zu

erhalten.

Scope

Die Funktion „Scope“ wird verwendet, um zu definieren, ob eine Variable für einen

Peak, für eine Peak-Gruppe oder für die komplette Probe ( global ) gültig ist.

Peak-Variable werden in dem Peak-Report dargestellt, Gruppen-Variablen in den

Gruppen-Reports und globale Variablen können für alle Reports verwendet werden.

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Origin

Das „Origin“ einer Variablen hängt ab von der Art, wie der Wert einer Variable

verfügbar ist. Für eine Standard-Variable ist die Quelle das System, das heißt, hier

werden die Variablenwerte vom System übernommen. Ist eine Variable als „User

Input“ definiert, können keine Werte übernommen werden, denn durch den Anwender

muss eine Eingabe erfolgen.

Benutzerdefinierte Variablen können, über ein „User Formular“, aus bestehenden

Kenngrößen, zusammengesetzt werden.

Dimension

Hier wird festgelegt, in welcher physikalischen Einheit die berechnete Variable

angezeigt werden soll.

4.3.2 Option

Die Funktion Option ist in vier wesentliche Unterfunktionen unterteilt:

● General● Company● Charts● Integration defaults● Spectra defaults

In diesen vier Funktionen werden die grundlegenden Konfigurationen für den

Seitenkopf des „Print Reports“ eingestellt, sowie die allgemein gültigen

Benutzerfestwerte der Integration der Peaks eines Chromatograms festgelegt.

Test zur Prüfung: Kapitel 5.4.2 Test der Funktion „Option"

4.3.2.1 General

Unter „General“ wird der Konfiguration ein eindeutiger Name zugewiesen.

4.3.2.2 Company

In der Funktion „Company“ wird der zu verwendete Firmenkopf für den „Print

Report“ erstellt. Neben dem Firmennamen, der Abteilung und dem Bürositz, kann das

Firmenlogo mit eingefügt werden. Dieser Kopf wird somit bei jedem Ausdruck auf jeder

Seite mit ausgegeben.

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4.3.2.3 Charts

Hier können die Farben ausgewählt werden, die verwendet werden sollen, wenn

Chromatograme verschiedener Läufe übereinander gelegt werden.

4.3.2.4 Integration defaults

In der Konfiguration „Integration defaults“ werden die allgemein gültigen Parameter

für die Integration der Peaks eines Chromatograms gesetzt.

Abbildung 34: „Integration defaults“ - Funktion

Unter „Min. Area“, „Min. Height“ und „Min. Width“ werden Minimumwerte für

Fläche, Höhe und Breite angegeben, ab denen ein Peak erst berechnet werden soll.

Das dient dazu, unerwünschte Rauschsignale zu unterdrücken und aus der Peak-

Erkennung und Peak-Berechnung auszugrenzen. Laut Definition sind demnach alle

unterdrückten Peaks als Basislinie zu betrachten. Dies erleichtert dem Benutzer die

Bewertung eines Chromatograms.

Um die unten aufgeführten Funktionen „Rider Threshold“ und „Max. Rider Ratio“

besser verstehen zu können, wird hier zunächst der Begriff „Skimming“ näher erklärt.

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Das so genannte „Skimming“ erlaubt es dem Benutzer einen nicht berücksichtigten

Peak, nahe eines größeren erkannten Peaks, entweder als so genannten Rider-Peak

zu berechnen oder beide Peaks durch eine Lotfällung an geeigneter Stelle zu trennen

und als zwei separate Peaks zu integrieren.

Wenn nun der Peak als Rider-Peak berechnet werden soll, wird die Fläche des

kleineren Peaks so bestimmt, dass von Anfang bis Ende des Peaks eine Tangente

gebildet wird, wodurch die Fläche unterhalb dieser Tangente zu der Fläche des

größeren Peaks hinzu addiert wird

Abbildung 35: Peak mit Rider-Peaks

Rider Threshold

„Rider Threshold“ unterdrückt den Algorithmus des „Skimmings“, wenn das Tal

zwischen den beiden relevanten Peaks schon relativ nahe der eigentlichen Basislinie

liegt. Falls das „Rider Ratio“-Kriterium erfüllt sein sollte, das Tal aber unterhalb des

eingestellten Grenzwertes liegt, so werden die beiden Peaks, wie oben schon erwähnt,

durch Lotfällung getrennt und die Flächen separat für jeden Peak einzeln berechnet.

Abbildung 36: „Rider Threshold“ - Funktion

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Max. Rider Ratio

„Max. Rider Ratio“ definiert die obere Grenze, bei der der kleinere Peak noch als

Rider-Peak berechnet werden kann.

Wenn der Anteil der Höhe, zwischen dem Scheitel des kleineren Peaks und dem Tal

zwischen den beiden Peaks und der totalen Höhe des größeren Peaks, kleiner ist als

des eingestellten Wertes des „Max Rider Ratio“, dann ist neben dem „Rider

Threshold“-Kriterium auch dieses Kriterium erfüllt.

Abbildung 37: „Rider Ratio“ - Funktion

Allgemein gilt:

h < [ Max. Rider Ratio ] * H UND d > [ Rider Threshold ] * H

Nur wenn beide Kriterien erfüllt sind, kann der kleinere Peak als Rider-Peak des

größeren Peaks berechnet werden.

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Detect Negative Peaks

Diese Funktion wird angewendet, wenn negative Peaks identifiziert und integriert

werden sollen.

Abbildung 38: „Negativ Peak Detection“ - Funktion

In Abbildung 38 erkennt man die Basislinie, die unter dem positiven und über dem

negativen Peak verläuft. Dies bedeutet, die „Detect Negative Peak“-Funktion ist aktiv.

Somit wird neben dem ersten Peak auch der zweite, negative Peak berechnet.

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Lock Baseline

Geminyx III berechnet die Basislinie automatisch, nachdem das komplette

Chromatogram analysiert und charakterisiert wurde. Deshalb ist es normalerweise

nicht notwendig, die Basislinienberechnung durch Parameter zu beeinflussen.

Falls der Anwender dennoch eine andere Basislinienberechnung wünscht, kann diese

folgendermaßen durch drei verschiedene Einstellungen beeinflusst werden:

● Lock Baseline = 0

Die „Lock Baseline“-Funktion mit dem eingestellten Parameter = 0 beeinflusst

die automatische Berechnung der Basislinie nicht.

Abbildung 39: „Lock-Baseline“ = 0

Hier wird die Basislinie automatisch von „Valley“ zu „Valley“ zwischen den

einzelnen Peaks berechnet.

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Diese Basislinie wird immer vom Anfang bis zum Ende einer Peak-Gruppe

berechnet.

Falls das Tal zwischen zwei Peaks einer Gruppe oberhalb der Basislinie liegt,

was normalerweise immer der Fall ist, werden die beiden Peaks durch eine

Lotfällung getrennt und die Flächen dann separat berechnet.



Hier zählt der Zeitpunkt, ab dem der „Lock Baseline“-Parameter auf Zwei

gesetzt wird. Der zu diesem Zeitpunkt bestehende Signalwert wird als

Basislinien-Level definiert und ist solange gültig, bis entweder der „Lock

Baseline“-Parameter auf Null gesetzt oder gelöscht wird.


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Mit dem eingestellten Parameter Drei, wird der niedrigste Signalwert des

Chromatograms als Baseline-Level gewählt. Auch dieses Level ist solange

gültig, bis entweder der „Lock Baseline“-Parameter auf Null gesetzt oder

gelöscht wird.


Valley to Valley

Diese Funktion hat die gegenteilige Wirkung wie oben in „Lock Baseline“

beschrieben. Hier wird das Tal zwischen zwei Peaks für die Berechnung der Flächen

immer mit der Basislinie verbunden. Aus diesem Grund kann die „Valley to

Valley“-Funktion nie zusammen mit der „Lock Baseline“-Funktion verwendet werden.

Die zuletzt ausgewählte Funktion deaktiviert automatisch die zuvor ausgewählte.

Filter Length

Diese Funktion erlaubt eine Filterung von vermeintlich erkannten Peaks, die aber nur

durch kurzzeitig auftretendes Signalrauschen des Detektors verursacht werden. Per

Definition werden nur Peaks als reale Peaks erkannt, deren Flanken breiter sind, als

die in der Funktion „Filter Length“ angegeben.

Ein Richtwert hierfür ist üblicherweise 50% der Flanke des kürzesten realen Peaks.

Smooth Type & Smooth Level

Hier wird die Peak-Glättung und deren Intensität eingestellt. Diese Funktionen werden

unter Kapitel 4.2.3.3 Integration → Smooth Type ausführlich beschrieben.

- 61 -


4.3.2.5 Spectra defaults

Match Factor Exponent

Hier kann die Sensibilität der Reinheitsberechnung der einzelnen Substanzen eines

Chromatograms eingestellt werden. Man kann zwischen dem Faktor 2 und 3 des

Exponenten wählen, wobei mit aufsteigendem Faktor die Sensibilität erhöht wird.

Die Reinheitsberechnung wird in Kapitel 3.5.4 Peak-Reinheits-Berechnung

ausführlicher beschrieben.

4.3.3 Print Templates

„Print Templates“ sind Vorlagen für einen Druckreport ( siehe auch Kapitel 3.4.2

Druck / Export ). Hier wird eine Maske erstellt mit fixen und variablen Texteinheiten,

die dann nach der Berechnung einer Analyse vom System automatisch eingesetzt

werden.

4.3.3.1 Template Groups

Hier kann eine Gruppe erstellt werden, in denen einzelne Reportvarianten

zusammengefasst werden können. Somit kann man immer auf verwendete Standards

zurückgreifen und muss nicht ständig neue Templates für die einzelnen Anwendungen

zusammenstellen. Es stehen folgende Reportarten zur Verfügung:

● Single Chromatogram● Spectra Surface● Spectra Contour● Spectra all● Calibration● Method● Chromatogram

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4.3.3.2 Templates

Hier können die einzelnen „Templates“ nochmal benutzerspezifisch variiert werden.

Abbildung 43: Beispiel „Template“ - Vorlage

In Abbildung 43 sieht man ein Beispiel eines solchen „Templates“. Es können Fix-

Texte vom Benutzer frei wählbar eingefügt werden. Zusätzlich können diesen Fix-

Texten Variablen zugewiesen werden, die nach einer Analyseberechnung automatisch

eingesetzt werden. Logos bzw. Graphiken können ebenfalls verwendet werden.

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5 TEST ZUR PRÜFUNG

5.1 Test der Funktion „Sample Editor“

Schritt Operation �

Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird angezeigt.

Eingabe Wähle „Data“→ Sample Editor→ Sequenz „EXAMPLE“.

Ausgabe Der Sample Editor wird angezeigt.

Eingabe Wähle in der Toolbar „Sequential“.

Eingabe Bestätige mit �

Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ Sample 1-30.

Eingabe Bilde einen Overlay aller Läufe und lass sie integrieren.

Ausgabe Das Overlay-Chromatogram, sowie die Results aller Läufewerden angezeigt.

Eingabe Lass von allen Läufen Single Chromatograme in PDF-Format erstellen.

Eingabe Vergleiche die Werte der Flächen des PDF-Dokuments mitden Flächenwerten des Result-Reports. ( Toleranz: maximal0,1% ).

Beachte Die ersten vier Läufe bilden die Referenz für die weiterenzehn Läufe und Lauf 15-18 die Referenz für Lauf 19-26.

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5.2 Test der Funktion „Integration“

Test der Funktion „Integration Events“

Diese Tests sind geeignet um die Peak-Detektion und -Integration zu testen.

Min. Area

Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wirdangezeigt.

�

Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“→Methodenname „EXAMPLE“→ „Integration“→ „IntegrationEvent“.

Ausgabe Der „Integration Event“-Editor wird angezeigt.

Überprüfe, ob nur eine Zeile angezeigt wird.

Kontrolliere, ob unter „Value“ der Wert 30 eingetragen ist.Falls nicht, ändere den Wert.

Eingabe Verlass den „Integration Event“-Editor. Bestätige unter„Method Table“ mit �

Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“.

Ausgabe Das Chromatogram für „EXAMPLE.SMP“ wird angezeigt.

Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.

Ausgabe Das Chromatogram wird integriert.

Es dürfen nur noch die Werte für „Propyl Ester“ und „ButylEster“ angezeigt werden.

Die Werte müssen mit den unten angezeigten Wertenübereinstimmen ( Toleranz: maximal 0,1% bei der Fläche ):

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Min. Height



Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „INTEG“→ „Sample 1“→Methodenname „INTEG“→ „Integration“→ „IntegrationEvent“.


Überprüfe, ob nur eine Zeile angezeigt wird:

Active RT[min] Name Value

� 0,00 Min. Height 10,00



Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „INTEG“→ „Sample 1“.

Ausgabe Das Chromatogram für „INTEG.SMP“ wird angezeigt.


Ausgabe Das Chromatogram wird integriert. Die Werte müssen mitden unten angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz:maximal 0,1% bei der Fläche ):

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Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „INTEG“→ „Sample 1“→Methodenname „INTEG“→ „Integration“→ „IntegrationEvent“.

Ausgabe Der „Integration Event“-Editor wird angezeigt. Überprüfe, obnur eine Zeile angezeigt wird:

Kontrolliere, ob unter „Value“ der Wert 20 eingetragen ist.Falls nicht ändere den Wert.


Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „INTEG“→ „Sample 1“.

Ausgabe Das Chromatogram für „INTEG.SMP“ wird angezeigt.



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Min Width






Kontrolliere, ob unter „Value“ der Wert 0,50 eingetragen ist.Falls nicht, ändere den Wert.


Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz “EXAMPLE“→ „Sample 1“.



Ausgabe Das Chromatogram wird integriert.

Es dürfen nur noch die Werte für „Ethyl Ester“, „PropylEster“und „Butyl Ester“ angezeigt werden.

Die Werte müssen mit den unten angezeigten Wertenübereinstimmen ( Toleranz: maximal 0,1% bei der Fläche ):

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Rider Threshold & Max. Rider Ratio



Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „080212“→ „Sample b“→Methodenname „CASPO“→ „Integration“→ „IntegrationEvent“.


Überprüfe, ob nur zwei Zeilen angezeigt werden.

Kontrolliere, ob in der ersten Zeile „Max Rider Ratio“ und in„Value“ der Wert 75 eingetragen ist. Und in der zweiten Zeile„Rider Ratio“ und in „Value“ der Wert 25 eingetragen ist.

Falls nicht, ändere den Wert.


Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz “080212“→ „Sample b“.

Ausgabe Das Chromatogram für „080212.SMP“ wird angezeigt.



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Detect Negativ Peaks







Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz “EXAMPLE“→ „Sample 1“.



Ausgabe Das Chromatogram wird integriert. Der Wert für dennegativen Peak ( Nr. 3 ) muss mit dem unten angezeigtenWert übereinstimmen ( Toleranz: maximal 0,1% bei derFläche ):

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Lock Baseline






Kontrolliere, ob unter „Value“ der Wert 0 eingetragen istFalls nicht, ändere den Wert.





Ausgabe Das Chromatogram wird integriert. Die Werte müssen mitden unten angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz:maximal 0,1% bei der Fläche der 4 großen Peaks ):





Eingabe Verlass den „Integration Event“-Editor. Bestätige unter

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„Method Table“ mit �














- 72 -












- 73 -


Inhibit Integration





Überprüfe, ob nur zwei Zeilen angezeigt werden

Kontrolliere, ob unter „RT“ zuerst der Wert 0,00 eingetragenist und in der zweiten Zeile der Wert 2,00. Falls nicht,ändere die Werte.





Ausgabe Das Chromatogram wird integriert und muss wie folgtangezeigt werden.

Die detektierten Peaks vor RT = 2.00 min dürfen nichtintegriert werden.

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Überprüfe, ob nur zwei Zeilen angezeigt werden.

Kontrolliere, ob unter „RT“ zuerst der Wert 5,50 eingetragenist und in der zweiten Zeile der Wert 6,00. Falls nicht,ändere die Werte.





Ausgabe Das Chromatogram wird integriert. Die Werte für „PropylEster“ müssen mit den unten angezeigten Wertenübereinstimmen ( Toleranz: maximal 0,1% bei der Fläche ):

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Filter Length



Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „080212“→ „Sample b“→Methodenname „CASPO“→ „Integration“→ „IntegrationEvent“.





Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „080212“→ „Sample b“.

Ausgabe Das Chromatogram für „080212.SMP“ wird angezeigt.


Ausgabe Das Chromatogram wird integriert. Die Werte f müssen mitden unten angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz:maximal 0,1% bei der Fläche ):

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5.3 Test der Funktion „Data“

5.3.1 Lineare Kalibrierung ohne Offset, externer Standard



Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „LIN“→ „Sample 9“.


Ausgabe Das berechnete Chromatogram mit dem „Result Report“wird angezeigt. Die „Amount“-Werte müssen mit den untenangezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz: maximal0,1% beim Amount ):

Eingabe Wähle Sequenz „LIN“→ „Sample 9“→ Methode „LIN“→Kalibrierung „CAL“→ Komponente „Methyl Ester“.

Ausgabe Die Kalibrierungskurve mit den Kalibrierungsdaten wirdangezeigt. Die Werte müssen, im Rahmen derToleranzgrenzen, mit den unten angezeigten Wertenübereinstimmen:

Eingabe Überprüfe die Werte zusätzlich anhand einer Excel-Tabelle.

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5.3.2 Lineare Kalibrierung mit Offset, externer Standard



Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „LINOFF“→ „Sample 9“



Eingabe Wähle Sequenz „LINOFF“→ „Sample 9“→Methode „LINOFF“→ Kalibrierung „CAL“→ „Methyl Ester“.



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5.3.3 Lineare Kalibrierung ohne Offset, interner Standard



Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „LINIS“→ „Sample 9“.



Eingabe Wähle Sequenz „LINIS“→ „Sample 9“→Methode „LINIS“→ Kalibrierung „CAL“→ „Methyl Ester“.



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5.3.4 Lineare Kalibrierung mit Offset, interner Standard



Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „LINOFFIS“→ „Sample 9“.



Eingabe Wähle Sequenz „LINOFFIS“→ „Sample 9“→Methode „LINOFFIS“→ Kalibrierung „CAL“→ „MethylEster“.



- 80 -


5.3.5 Lineare Kalibrierung ohne Offset, interner Standard gewichtet



Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „LINIW“→ „Sample 9“.



Eingabe Wähle Sequenz „LINIW“→ „Sample 9“→Methode „LINIW“→ Kalibrierung „CAL“→ „Methyl Ester“.



- 81 -


5.3.6 Lineare Kalibrierung mit Offset, interner Standard gewichtet



Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „LINOFFIW“→ „Sample 9“.



Eingabe Wähle Sequenz „LINOFFIW“→ „Sample 9“→Methode „LINOFFIW“→ Kalibrierung „CAL“→ „MethylEster“.



- 82 -


5.3.7 Quadratische Kalibrierung ohne Offset, externer Standard



Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „QUA“→ „Sample 9“.



Eingabe Wähle Sequenz „QUA“→ „Sample 9“→Methode „QUA“→ Kalibrierung „CAL“→ „Methyl Ester“.



- 83 -


5.3.8 Quadratische Kalibrierung mit Offset, externer Standard



Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „QUAOFF“→ „Sample 9“.



Eingabe Wähle Sequenz „QUAOFF“→ „Sample 9“→Methode „QUAOFF“→ Kalibrierung „CAL“→ „Methyl Ester“.



- 84 -


5.3.9 Quadratische Kalibrierung ohne Offset, interner Standard



Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „QUAIS“→ „Sample 9“.



Eingabe Wähle Sequenz „QUAIS“→ „Sample 9“→Methode „QUAIS“→ Kalibrierung „CAL“→ „Methyl Ester“.



- 85 -


5.3.10 Quadratische Kalibrierung mit Offset, interner Standard



Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „QUAOFFIS“→ „Sample 9“.



Eingabe Wähle Sequenz „QUAOFFIS“→ „Sample 9“→Methode „QUAOFFIS“→ Kalibrierung „CAL“→ „MethylEster“.



- 86 -


5.3.11 Quadratische Kalibrierung ohne Offset, interner Standard gewichtet



Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „QUAIW“→ „Sample 9“.



Eingabe Wähle Sequenz „QUAIW“→ „Sample 9“→Methode „QUAIW“→ Kalibrierung „CAL“→„Methyl Ester“.



- 87 -


5.3.12 Quadratische Kalibrierung mit Offset, interner Standard gewichtet



Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „QUAOFFIW“→ „Sample 9“.



Eingabe Wähle Sequenz „QUAOFFIW“→ „Sample 9“→Methode „QUAOFFIW“→ Kalibrierung „CAL“→ „MethylEster“.



- 88 -


5.4 Test der Funktion „Configuration“

5.4.1 Test der Funktion „Edit Variables“

Hier wird getestet, ob die Berechnungen der zusammengesetzten Variablen korrektsind.



Eingabe Wähle „Configuration“→ „Edit Variables“

Ausgabe Der „Variable“-Editor wird angezeigt.

Eingabe Füge mit dem „+“ Zeichen aus der oberen Toolleiste eineneue Variable ein.

Ausgabe Das Formular für die Erstellung einer neuen Variablen wirdangezeigt.

Eingabe Fülle das Formular folgendermaßen aus:Name: ValidierungsvariableID: VVDecimals: 2Sum: jaVar Type: floatUser Definition: Amount+AreaScope: PeakOrigin: User

Eingabe Bestätige die Eingabe mit �

Ausgabe Unter den bestehenden Variablen auf der linken Seiteerscheint eine neue Variable mit dem Namen„Validierungsvariable“.

Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“→Methode „EXAMPLE“.

Ausgabe Der Methoden-Editor wird angezeigt.

Eingabe Wähle „Results“→ „Grid Layout“.

Ausgabe Der „Result Layout“-Editor wird angezeigt.

Eingabe Klicke oben unter „Available Items“ die Variable„Validierungsvariable“ an und ziehe diese bei gedrücktenMouse-Button nach unten in den „Grid Layout“.

Ausgabe Das Feld für die Variable erscheint im „Grid Layout“.

Eingabe Bestätige mit OK.



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Ausgabe Das berechnete Chromatogram mit dem „Result Report“wird angezeigt. Die Validierungsvariablen-Werte müssenmit den unten angezeigten Werten übereinstimmen.

Area Amount Validierungs-

variable

Unknown 2,70 0,00 2,70

Methyl Ester 23,30 10,03 33,33

Ethyl Ester 23,37 10,06 33,43

Propyl Ester 40,54 10,06 50,60

Butyl Ester 43,61 10,21 53,82

133,53 40,35 173,88

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5.4.2 Test der Funktion „Option“



Eingabe Wähle „Configuration“→ „Option“.

Ausgabe Der Options-Editor wird angezeigt.

Eingabe Füge mit dem „+“ Zeichen aus der Toolbar ein neuesFormular ein.

Eingabe Fülle das Formular folgendermaßen aus:

Configuration Name: ValidierungCompany Name: Muster CompanyDepartment: Muster DepartmentOffice: Muster Office

Eingabe Bestätige die Eingabe mit �



Eingabe Lass das berechnete Chromatogram entweder im „SingleChromatogram“-Modus oder im „Chromatogram“-Modusdrucken.

Ausgabe Der Kopf des Ausdrucks muss folgendermaßen angezeigtwerden:

- 91 -


6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK

Um dem heutigen Qualitätsstandard, in Sachen Software, gerecht zu werden, ist es

unabdingbar, schon während der Entwicklungsphase eines Datensystems, auf

Normkonformität zu achten. Dies wird bei Softwareentwicklung grundsätzlich durch

einen Validierungsplan realisiert.

Der Validierungsplan gewährleistet, die gesetzten Qualitätsziele, in den vorgegebenen

Zeit- und Kostenrahmen, verwirklichen zu können. Des weiteren gestaltet sich die

Softwarepflege, auch nach dem Entwicklungszeitraum, mit einem Validierungsplan

wesentliche einfacher.

Das hier beschriebene Chromatographie-Datensystem wird im Bereich der HPLC

angewandt. Die HPLC beschäftigt sich mit der Trennung und der chemischen Analyse

von flüssigen Stoffgemischen. Dies wird hauptsächlich in der Pharmaindustrie genutzt,

um die Zusammensetzung der produzierten Wirkstoffe kontrollieren zu können. Vor

allem im medizinischen Bereich ist es wichtig, eine sicherheits- und qualitätsorientierte

Softwareentwicklung zu gewährleisten.

In dieser Arbeit werden die Funktionen im Vorfeld genau beschrieben, um den

Zusammenhang zwischen den in der Software verwendeten Funktionen und dem

erstellten Validierungsplan besser verstehen zu können.

Im Hauptteil der Diplomarbeit wird der, von mir erstellte, Validierungsplan behandelt.

Dabei steht im Vordergrund, die wichtigsten Funktionen des Datensystems, sorgfältig

und bis ins kleinste Detail zu testen.

Es ist klar, dass ein Validierungsplan in vollem Umfang den Rahmen einer Diplomarbeit

deutlich überschreiten würde. Aus diesem Grund werden in dieser Arbeit auch nur die

wichtigsten Funktionstests näher beschrieben.

Das nächste Ziel wird sein, den Validierungsplan für die Alpha-Version für alle

implementierten Funktionen zu vervollständigen und eine erste Test-Version an

ausgewählte Betatest-Kunden auszuliefern. Der vollständige Validierungsplan gibt

dann Aufschluss darüber, dass alle Funktionen zu 100% und darüber hinaus alle

wichtigen Funktionen in mehreren Kombinationen getestet werden. Die Software wird

dazu auch firmenintern, mit Hilfe des Validierungsplans, sorgfältig getestet.

- 92 -


Ziel dieser umfangreichen Validierung ist es, möglichst alle Fehler in der Validierung zu

erkennen und bereits vor der ersten Release zu beheben. Nur durch diese sorgfältigen

und umfassenden formalen Tests können die hohen Anforderungen an eine Qualitäts-

Software für den Einsatz im Bereich "pharmazeutische Qualitätskontrolle" erfüllt

werden.

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ÜBERSICHT CD-ROM

Ordner Inhalt

01 Diplomarbeit Diplomarbeit-Keller-2008.pdf

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LITERATURVERZEICHNIS

[ COE ] http://www.coe.int/T/d/Com/Dossiers/Themen/Pharmakopoee/

[ UNI ] http://www.unitransferklinik.de/cc/software_validierung.php

[ HPLC 1 ] Universität Ulm, Abteilung Analytische Chemie und Umwelttechnik:

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC).

[ HPLC 2 ] http://de.wikipedia.org/wiki/Hochleistungsfluessigkeitschromatographie

[ HPLC 3 ] http://www-proj.loel.hs-anhalt.de/oeko/vitamine/grdlhplc.html

[ CES ] https://ces.karlsruhe.de/culm/mathematik/filterung/savitzky.html

[ INT 1 ] http://de.wikipedia.org/wiki/Interner_Standard

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ERKLÄRUNG ZUR DIPLOMARBEIT

( gemäß § 13 Abs.5 RaPO )

Name: Markus Keller

geb.: 09.04.1980

Matrikelnummer: 13702101

06MFB im SS 2008

Hiermit erkläre ich, dass ich die Diplomarbeit selbstständig verfasst, noch nicht

anderweitig für Prüfungszwecke vorgelegt, keine anderen als die angegebenen

Quellen oder Hilfsmittel benützt sowie wörtliche und sinngemäße Zitate als solche

gekennzeichnet habe.

___________________ ___________________

Ort, Datum Unterschrift

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Documents

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems · Bei der HPLC handelt es sich um ein chromatographisches Trennverfahren, bei dem die zu untersuchende Substanz, zusammen mit