Aus der Strahlenklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. med. R. Fietkau

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Variabilität der vorbestehenden und unreparierten DNA

Doppelstrangbrüche in Lymphozyten bei Patienten mit

Rektumkarzinom

Der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades Doktor der Medizin (Dr. med.)

vorgelegt von

Jana Christina Ulrich, geb. Kröber

aus Nürnberg

Als Dissertation genehmigt von der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. med. Dr. h. c. J. Schüttler

Gutachter: PD Dr. med. L. Distel

Gutachter: Prof. Dr. med. R. Fietkau

Tag der mündlichen Prüfung: 03.12.2013

Für meine Eltern und Christian

Inhaltsverzeichnis

1. Zusammenfassung ............................................................................................. 5

1.1. Hintergrund und Ziele ..................................................................................... 5

1.2. Methoden ....................................................................................................... 5

1.3. Ergebnisse und Beobachtungen ..................................................................... 5

1.4. Praktische Schlussfolgerungen ....................................................................... 5

2. Summary ........................................................................................................... 6

2.1. Background ..................................................................................................... 6

2.2. Method ........................................................................................................... 6

2.3. Results and observations ................................................................................ 6

2.4. Conclusion ....................................................................................................... 6

3. Einleitung .......................................................................................................... 7

3.1. Strahlensensibilitätsdiagnostik ....................................................................... 7

3.2. γH2AX als Biomarker ....................................................................................... 7

3.3. Ziele dieser Arbeit ........................................................................................... 8

4. Material und Methoden ..................................................................................... 9

4.1. Studiendesign ................................................................................................. 9

4.2. Durchführung ................................................................................................ 10

4.3. Auswertung ................................................................................................... 11

5. Ergebnisse ....................................................................................................... 13

6. Diskussion ....................................................................................................... 20

7. Literaturverzeichnis ......................................................................................... 25

8. Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................... 29

9. Danksagung ..................................................................................................... 30

10. Lebenslauf ....................................................................................................... 31

5

1. Zusammenfassung

1.1. Hintergrund und Ziele

In den letzten Jahren wurde die Aufmerksamkeit stark auf γH2AX als sensitiven

Biomarker für DNA Doppelstrangbrüche (DSB) gerichtet. Man vermutet, dass γH2AX

die individuelle Strahlensensibilität vorhersagen könne. Das Ziel der Arbeit war es, die

Induktion und Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen mittels γH2AX in einer

großen Studienpopulation zu verfolgen.

1.2. Methoden

Die Lymphozyten von 136 Patienten mit kolorektalem Karzinom (CRC) und 59

gesunden Probanden wurden isoliert und in vitro bestrahlt. Somit wurden DNA Schäden

mittels γH2AX Foci für drei unterschiedliche Bedingungen verglichen, nämlich der

bereits vorhandene bzw. spontane DNA Schaden, der maximal induzierte DNA Schaden

nach einer Bestrahlung mit 0,5Gy und einer Inkubationszeit von 30 Minuten und

letztlich der fortbestehende bzw. nicht reparierte Schaden nach einer Bestrahlung mit

2Gy und einer Inkubationszeit von 24 Stunden.

1.3. Ergebnisse und Beobachtungen

Es wurde festgestellt, dass der durchschnittliche Wert der DNA Doppelstrangbrüche

nach der Reparaturzeit von 24 Stunden in der Patientengruppe höher war als in der

Kontrollgruppe. Das bestätigt die These, dass eine erhöhte Anzahl von DNA

Doppelstrangbrüchen bei Krebspatienten vorhanden ist. Zusätzlich fanden wir heraus,

dass in der Patientengruppe einige Ausreißer außerhalb der zweifachen

Standardabweichung der Gauß’schen Verteilung liegen. Dies gilt sowohl für die

Verteilung der spontanen DNA Doppelstrangbruchrate als auch für die Rate nach 2Gy

Bestrahlung und 24 Stunden Reparaturzeit.

1.4. Praktische Schlussfolgerungen

Wir konnten zeigen, dass die Anzahl der Foci bei Krebspatienten bereits spontan erhöht

ist und diese zusätzlich nach einer in vitro Bestrahlung schlechter repariert werden.

Somit liegt bei einem Teil der Patienten mit Rektumkarzinom eine verminderte

6

Reparaturfähigkeit vor. γH2AX ist in der Lage, diese Ausreißer, die vermutlich erhöht

strahlensensibel sind, aus einem homogenen Patientenkollektiv herauszufiltern.

2. Summary

2.1. Background

In recent years attention has focused on γH2AX as a very sensitive double strand break

indicator. It has been suggested that γH2AX might be able to predict individual radio

sensitivity. Our aim was to study the induction and repair of DNA double strand breaks

labelled by γH2AX in a large cohort.

2.2. Method

Lymphocytes of 136 Colorectal Cancer (CCRC) patients and 59 healthy individuals

were in vitro irradiated and initial DNA damage was compared to remaining DNA

damage after 2Gy irradiation and 24 hours repair time and not irradiated lymphocytes.

2.3. Results and observations

We found out that the mean number of DSB in the reparation time for the patient group

is higher as in the control group, associated with a higher number of DSB in cancer

patients. In addition we found that the patients’ collective has a number of outliers (2-

standard deviation) from a Gaussian distribution for the spontaneous DSB. Mainly the

same patients are also outliers for the normal Gaussian distribution for the 24 hours

repair time.

2.4. Conclusion

We are able to show that the number of DSB is elevated in cancer patients and γH2AX

is capable to detect those outliers of a homogenous patient collective who might be

increased radio sensitive.

7

3. Einleitung

3.1. Strahlensensibilitätsdiagnostik

In der Strahlentherapie ist es notwendig eine Methode zu entwickeln, mit der man die

individuelle Strahlensensibilität eines Patienten vorhersagen kann. So kann das Risiko

des Patienten, eine frühe oder späte Gewebereaktion zu entwickeln, prognostiziert

werden und die Dosis der Strahlentherapie dementsprechend angepasst werden. Ein

prognostischer Test der Krebspatienten vor Therapiebeginn würde die Möglichkeit

eröffnen die Therapie genau an den individuellen Patienten anzupassen und könnte

somit die Nebenwirkungen stark reduzieren. Es wurden bereits unterschiedliche Ansätze

dafür erprobt. Der am häufigsten getestete prädiktive Test dürfte die Messung der

Chromosomenaberrationen im G0 oder G2 – Assay sein. Häufig wurde auch die

Messung der Apoptose und der Zellzyklusregulation durchgeführt. Ebenso wurde das

Zellüberleben im Koloniebildungstest als prädiktiver Test ausprobiert.

Doppelstrangbrüche wurden auch mit gelelektrophoretischen Methoden durchgeführt,

die aber wesentlich aufwendiger und unsensitiver waren als die heutzutage zur

Verfügung stehenden Methoden.

3.2. γH2AX als Biomarker

Um die Entstehung von Doppelstrangbrüchen aufzuzeigen wurde in den letzten Jahren

γH2AX als Biomarker etabliert und seine Wertigkeit als prädiktiver Test erreichte große

Aufmerksamkeit. H2Ax gehört zu der Familie der Histon H2A Familie (Bonner et al.

2008). H2Ax wird, nachdem es ionisierender Strahlung ausgesetzt wurde, rasch

phosphoryliert. Die Phosphorylierung von γH2AX entsteht innerhalb von Minuten und

erreicht ihren Höhepunkt nach ungefähr 30 Minuten (Rogakou et al. 1999). Die Anzahl

der Foci korreliert direkt mit der Anzahl der Doppelstrangbrüche, die in einer Zelle kurz

nach der DNA Schädigung vorhanden sind (Sedelnikova et al. 2002), da gezeigt werden

konnte, dass ein γH2AX Focus einen Doppelstrangbruch (DSB) repräsentiert

(Rothkamm et al. 2002).

Rothkamm et al. proklamierten, dass die Phosphorylierung von γH2AX und dadurch die

Entstehung von Foci generell als konstant akzeptiert werden und somit als quantitativer

Marker für DSB angesehen werden kann, sogar dann wenn nur wenige Foci darstellbar

sind (Rothkamm et al. 2002). Die Effizienz des Nachweises von DNA

8

Doppelstrangbrüchen mittels γH2AX eröffnet die Möglichkeit dieses Protein als

therapeutischen Marker zu nutzen, um die Leistungsfähigkeit von Strahlentherapie,

Medikamenten und anderen Therapiemethoden zu optimieren (Halicka et al. 2009, Kao

et al. 2006, Kuefner et al. 2009).

Dickey et al zeigten, dass γH2AX ein sensitiver Indikator von DNA-

Doppelstrangbrüchen ist und daher möglicherweise als nützliches Werkzeug in der

Erkennung von genotoxischem Stress dienen kann. Solch ein Indikator könnte sowohl

für die Beobachtung von Krebsentstehung und –entwicklung als auch in anderen Fällen

von Zellstress wertvoll sein. Die zukünftige Arbeit in diesem Bereich muss darauf

abzielen, die γH2AX Methode für den klinischen Alltag nutzbar zu machen und so als

praktische Methode einzusetzen, um Krebs zu entdecken und den therapeutischen

Fortschritt zu überwachen (Dickey et al. 2009).

3.3. Ziele dieser Arbeit

Weiterhin besteht die Notwendigkeit dieses Verfahren genau zu untersuchen, um zu

sehen was die γH2AX Methode in der Lage ist zu erreichen. Wir haben es uns zum Ziel

gesetzt, diese Methode an einem großen Patientenkollektiv zu erforschen. Die

Fragestellung war, ob mit dieser Methode Patienten identifiziert werden können, die als

erhöht strahlenempfindlich kategorisiert werden müssten. Untersucht wurde ein

Kollektiv von Patienten mit Rektumkarzinom und diese wurden mit gesunden

Kontrollpersonen verglichen.

9

4. Material und Methoden

4.1. Studiendesign

Die prospektive Studie umfasst eine Gesamtzahl von 195 Personen. Aufgenommen

wurden 136 Patienten mit kolorektalem Karzinom (CRC) und 59 gesunde Probanden.

Das Alter der Patienten liegt zwischen 23 und 87 Jahren, das durchschnittliche Alter

beträgt 63,7 Jahre. Das Alter der Personen der Kontrollgruppe liegt zwischen 27 und 80

Jahren, das durchschnittliche Alter beträgt 56,0 Jahre (Abbildung 1).

Abbildung 1

Geschlechtsverteilung der Studienpopulation

A). Die ganze Studienpopulation geteilt in Patienten- und Kontrollgruppe

B). Die Patientengruppe aufgeteilt nach Geschlecht

C). Die Kontrollgruppe aufgeteilt nach Geschlecht

10

Tabelle 1 gibt einen Überblick über das Stadium des CRC und die Radiochemotherapie

der Patienten.

Tabelle 1: Überblick über die Patientencharakteristika

Tumorstadium Chemotherapie

n/a 4,41% n/a 0,74%

1 0,00% 5-FU 25,74%

2 8,09% 5FU/Oxa 63,24%

3 71,32% Irinotecan wöchentlich 2,94%

4 16,18% keine 0,74%

FU/Irinotecan 3,68%

andere 2,96%

Metastasen Gesamtdosis

(Durchschnitt)

Dosis x

Volumen/Masse

(Durchschnitt)

Ja 89,47% 50,39Gy 0,23

Nein 10,53%

Alle Patienten und alle gesunden Probanden haben ihr schriftliches Einverständnis zur

Teilnahme an dieser Studie gegeben. Die Blutproben wurden kurz vor der ersten

Bestrahlung abgenommen. Danach erhielten die Patienten eine konventionelle

Strahlentherapie mit 1,8Gy pro Fraktion bis zu einer Gesamtdosis von 50,4Gy.

4.2. Durchführung

Die Blutproben der gesunden und kranken Probanden wurden in drei weitere Ansätze

unterteilt. Ein Ansatz wurde als Kontrolle genutzt, um die spontanen γH2AX Foci zu

ermitteln. Die anderen Proben wurden in vitro bestrahlt. Eine Probe wurde mit 0,5Gy

bestrahlt und wurde danach 30 Minuten bei 37°C inkubiert, die andere Probe wurde mit

2Gy bestrahlt und hatte eine Inkubationszeit von 24 Stunden. Die Lymphozyten wurden

mittels Ficollgradienten und Zentrifugation isoliert und auf einen Objektträger

zytozentrifugiert (StatspinCytofuge, Kreatech, Germany). Die Proben wurden mit

Methanol und Aceton fixiert und danach mit einer salzhaltigen, phosphatgepufferten mit

11

FKS versetzten Lösung gewaschen. Anschließend wurden die Proben mit dem anti-

γH2AX (Abcam, Cambridge, UK) inkubiert, erneut mit PBS gewaschen und danach mit

einem sekundären fluoreszierenden Antikörper (Molecular Probes, Karlsruhe,

Deutschland) inkubiert. Abschließend wurden die Lymphozyten erneut in PBS

gewaschen, mittels DAPI eingefärbt und mit Vectashield Medium (Vector

Laboratoriers, Peterborough, UK) eingedeckt.

4.3. Auswertung

Die Bilder wurden mit einem mittels Laser scannenden Mikroskop (Zeiss Oberkochen,

Deutschland) in 40 Z-Ebenen mit einem Abstand von 0,23µm (Metasystem, siehe

Abbildungen) aufgenommen und zu einem 3D Bild fusioniert, so dass die Foci aller

Ebenen dargestellt werden können (Abb. 2 + 3).

Abbildung 2

Mikroskopische Bilder der Zellen mit ihren Doppelstrangbrüchen, die durch Immunofluoreszenz sichtbar

gemacht werden. Man sieht die einzelnen Ebenen, die von dem Mikroskop gescannt wurden.

12

Abbildung 2 + 3:

Mikroskopische Bilder der Zellen mit ihren Doppelstrangbrüchen, die durch Immunofluoreszenz sichtbar

gemacht werden. Das Mikroskop scannt unterschiedliche Ebenen, die dann zu einem 3D Bild fusioniert

werden. Auf diese Weise können alle Foci einer Zelle erfasst werden, egal in welcher Ebene sie liegen.

Ein Bereich von 2mm2 (630x) wurde automatisch aufgenommen. Für jede der Proben

wurden mindestens 1000 Lymphozyten mittels einer Bildanalysesoftware (Biomas,

Erlangen, Deutschland) ausgezählt. Alle Kerne wurden nach morphologischen Kriterien

überprüft und bewertet, apoptotische Zellen und Zell-in-Zell-Fusionen wurden

ausgeschlossen. Mittels einer Bildanalysesoftware wurden die γH2AX Foci jedes

Kernes ausgezählt (Endt et al. 2011). Die Durchschnittswerte der Foci pro Zelle wurden

für jede Person vor Bestrahlung, nach 0,5Gy Bestrahlung und 30 Minuten

Inkubationszeit und nach 2Gy Bestrahlung und 24 Stunden Inkubationszeit bestimmt.

13

5. Ergebnisse

Die Anzahl der γH2AX Foci pro Zelle wurde für die Gruppe der 136 CRC Patienten mit

den 59 gesunden Personen der Kontrollgruppe verglichen (Abbildung 4).

Abbildung 4:

Überblick über die Verteilung der Studienpopulation für die drei Bedingungen. Die Verteilung der

spontanen und 2Gy/24h Doppelstrangbruchrate sind signifikant unterschiedlich (p > 0,001). Außerdem

zeigt sich ein unterschiedliches Verteilungsintervall.

Die genaueren Patientendaten sind in Tabelle 1 aufgelistet. Pro Patient wurden drei

Blutproben analysiert. Die ermittelten γH2AX Foci vor Bestrahlung wurden als Rate der

spontanen Doppelstrangbrüche angesehen und von den anderen Werten als Hintergrund

abgezogen. Die initial induzierten Foci wurden anhand der Anzahl nach 0,5Gy

Bestrahlung und 30 Minuten Inkubationszeit bestimmt. Die unreparierten Foci wurden

nach einer Bestrahlung mit 2Gy und einer Reparaturphase von 24 Stunden ermittelt.

14

Zuerst wurde festgestellt, wie viele Zellen gezählt werden müssen, um zuverlässige

γH2AX Werte zu erhalten. Eine adäquate Mindestanzahl, um reproduzierbare γH2AX

Werte zu erreichen, wurde mittels einer Blend Altmann Analyse errechnet. Der Wert,

der eine exakte Übereinstimmung zeigt, soll 100% betragen und zeigt sich bei einer

Auswertung von 1000 Zellen. Abweichungen nach oben oder unten spiegeln sich in

höheren bzw. niedrigeren Prozentzahlen wieder. Eine Abweichung von ± 15% wurde

als Toleranzgrenze festgelegt. Wenn nur 400 unbestrahlte Zellen gezählt wurden, war

der Bereich, in dem sich die γH2AX Foci zeigten, sehr breit. Wenn 600 Zellen

ausgewertet wurden, befanden sich 75% der erhaltenen Werte innerhalb der

Toleranzgrenze (Abb. 5). 95% der Werte befanden sich innerhalb des Toleranzbereichs,

sobald man 800 Zellen auswertete. Daraus wurde erschlossen, dass ein Minimum von

600 Zellen ausgezählt werden muss, wenn möglich wurden jedoch 1000 Zellen

ausgewertet (Abb. 6).

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0

MItte

lwert

dif

fere

nz

Foci / Zelle

Abbildung 5:

Blend-Altmann-Blot für die Anzahl der Foci pro Zelle bei einer Bestrahlung mit 0,5Gy und einer

Inkubationszeit von 30 Minuten . Es wurde verglichen, wie hoch die Mittelwertdifferenz liegt, wenn man

600 Zellen im Vergleich zu 200 Zellen auszählt.

15

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0

MItte

lwert

dif

fere

nz

Foci / Zelle

Abbildung 6:

Blend-Altmann-Blot für die Anzahl der Foci pro Zelle bei einer Bestrahlung mit 0,5Gy und einer

Inkubationszeit von 30 Minuten . Es wurde verglichen, wie hoch die Mittelwertdifferenz liegt, wenn man

1000 Zellen im Vergleich zu 600 Zellen auszählt.

Die bereits vorbestehende Anzahl an γH2AX Foci war bei der Gruppe der Patienten mit

CRC im Vergleich zu der Gruppe der gesunden Personen (p < 0,001) signifikant erhöht.

Hingegen zeigte sich kein Unterschied zwischen den zwei Gruppen bezüglich der

initialen γH2AX Foci nach 0,5Gy Bestrahlung und 30 Minuten Inkubationszeit. Die

restlichen Foci nach 24 Stunden Erholungszeit waren wiederum bei der Gruppe der

Patienten mit CRC signifikant gegenüber den gesunden Probanden erhöht (p<0.001)

(Abbildung 4). Zusätzlich wurden in der Patientengruppe einige Personen mit einer

deutlich höheren γH2AX Anzahl beobachtet. Um diese Beobachtung zu analysieren,

wurden die γH2AX Foci pro Zelle sowohl von den gesunden Probanden als auch von

den Patienten für die drei unterschiedlichen Bedingungen mittels einer Gauß’schen

Verteilung dargestellt. Diese Aufstellung dient dazu, Probanden, die eindeutig nicht

unter die normale Standardverteilung fallen, herauszufiltern und als Ausreißer zu

klassifizieren.

Die Gauß’schen Verteilungen für die Patientengruppe und die Gruppe der gesunden

Probanden wurden angepasst, so dass die Personen außerhalb der 2-fachen bzw. 3-

fachen Standardabweichung identifiziert werden konnten (Abbildung 7 - 9). Der

Kolmogorov-Smirnov Test zeigte, dass alle Gruppen normal verteilt waren. Hingegen

zeigte der strengere Lilliefors Test für alle Bedingungen und Gruppen eine

16

Normalverteilung, außer für die Gruppe der CRC Patienten für die vorbestehenden und

unreparierten γH2AX Foci

Nichts desto trotz, waren die durchschnittlichen Doppelstrangbrüche pro Metaphase für

die meisten Gruppen ähnlich oder nur leicht erhöht verglichen mit dem Mittelwert ihrer

normalen Verteilungen (Tabelle 2).

Tabelle 2:

Diese Tabelle zeigt wie viele Personen der gesunden Probanden (1. Spalte) bzw. der CRC Patienten (2.

Spalte) außerhalb der einfachen bis dreifachen Standardabweichung ihrer Gauß’schen Verteilung liegen,

sowohl für die spontanen, als auch für die unreparierten Doppelstrangbrüche. Die 3. Spalte zeigt das

Verhältnis an, nämlich wie viel Prozent der CRC-Patienten außerhalb der einfachen bis dreifachen

Standardabweichungen der Gauß’schen Verteilung der gesunden Probanden liegen.

Gruppe Gesunde Probanden CRC Patienten CRC Patienten

Verteilung Gesunde Probanden CRC Patienten Gesunde Probanden

Bedingung spontan 2 Gy, 24h spontan 2 Gy, 24h spontan 2 Gy, 24h

> 1 x SD 17,2% 11,9% 21,9% 21,2% 42,3% 33,6%

> 2 x SD 5,2% 3,4% 14,6% 8,8% 22,6% 14,6%

> 3 x SD 3,4% 0,0% 5,1% 2,9% 18,2% 8,8%

Eine Gruppe von Ausreißern konnte identifiziert werden, die außerhalb der zwei- bzw.

dreifachen Standardabweichung der Gauß’schen Verteilung liegt. Dies gilt in der

Patientengruppe sowohl für die bereits vorbestehenden γH2AX Foci sowie für die

unreparierten γH2AX Foci nach 2Gy Bestrahlung und 24 Stunden Reparaturzeit. Für die

Kontrollgruppe zeigte sich für alle drei Bedingungen durchwegs eine Normalverteilung

(Abb. 7 + 8).

Zusätzlich lässt sich anhand der Abbildungen 7 +8 feststellen, dass die Gauß’sche

Verteilung für die Patientengruppe bei den spontanen DSB und bei den DSB nach 2Gy

Bestrahlung und 24 Stunden Reparaturzeit nach rechts verschoben ist (Abb. 7 +8).

17

Abbildung 7:

Verteilungsbreite der individuellen DNA-Doppelstrangbrüche, die bei in vitro bestrahlten Lymphozyten

mittels Immunofluoreszenz gemessen wurde. Die Daten wurden anhand einer Gauß’schen Verteilung für

spontane DNA-Doppelstrangbrüche aufgetragen. Die vertikalen durchgezogenen Linien zeigen den Wert

der zweifachen und dreifachen Standardabweichung von dem Mittelwert der CRC Gruppe (Distel et al.

2006). Zusätzlich ist die Gauß’sche Verteilung der CRC Patienten nach rechts verschoben.

18

Abbildung 8:

Verteilungsbreite der individuellen DNA-Doppelstrangbrüche, die bei in vitro bestrahlten Lymphozyten

mittels Immunofluoreszenz gemessen wurde. Die Daten wurden anhand einer Gauß’schen Verteilung für

2Gy/24h aufgetragen. Die vertikalen durchgezogenen Linien zeigen den Wert der zweifachen und

dreifachen Standardabweichung von dem Mittelwert der CRC Gruppe (Distel et al. 2006). Zusätzlich ist

die Gauß’sche Verteilung der CRC Patienten nach rechts verschoben.

Hingegen zeigte sich, dass auch die Patientengruppe bei einer Bestrahlung mit 0,5Gy

und 30 Minuten Inkubationszeit gut durch eine Gauß’sche Verteilung gefittet werden

kann (Abbildung 9).

19

Abbildung 9:

Verteilungsbreite der individuellen DNA-Doppelstrangbrüche, die bei in vitro bestrahlten Lymphozyten

mittels Immunofluoreszenz gemessen wurde. Die Daten wurden anhand einer Gauß’schen Verteilung für

0,5Gy und 30min Reparaturzeit aufgetragen. Die vertikalen durchgezogenen Linien zeigen den Wert der

zweifachen und dreifachen Standardabweichung von dem Mittelwert der CRC Gruppe (Distel et al.

2006). Die Gauß’sche Verteilung zeigt eine Normalverteilung.

20

6. Diskussion

Es gibt bereits mehrere Studien, die den klinischen Nutzen von γH2AX als einen

Marker für die individuelle Strahlensensibilität eines Patienten diskutieren. Olive et al.

proklamierten die These, dass die unterschiedlichen Reparatureigenschaften von DNA

Doppelstrangbrüchen zu einer unterschiedlichen Strahlensensibilität der Individuen

führen. Demnach wurde ein schnellerer Verlust von γH2AX Foci in menschlichen

Zelllinien mit höheren Überlebensraten in Verbindung gebracht, da diese eine bessere

Reparaturkapazität von DNA Doppelstrangbrüchen und dadurch eine höhere Resistenz

gegenüber ionisierender Strahlung indizieren (Olive et al. 2004). Das führt zu der

Schlussfolgerung, dass eine korrekt durchgeführte Schadensprozessierung der DNA

Doppelstrangbrüche mit dem zeitlichen Entstehen und Verschwinden von γH2AX Foci

assoziiert sein könnte (Werbrouck et al. 2009).

Eine andere Studie kam zu dem Ergebnis, dass eine durchflusszytometrische Methode,

die auf der γH2AX Induktion in periphere Blutlymphozyten von Patienten mit

strahlentherapeutischer Behandlung basiert, ein robustes, schnelles und zuverlässiges

Verfahren darstellen könnte, um normale Gewebsreaktionen während einer

Strahlentherapie vorhersagen zu können. Es wurden jedoch weitere Untersuchungen mit

einem größeren Patientenkollektiv gefordert, um die wichtige Studie zu validieren

(Bourton et al. 2011).

Allerdings gab es in letzter Zeit einige Studien die widersprüchliche Resultate

erbrachten und einige Schwächen der γH2AX Methode aufzeigten. Werbrouck et al

kamen durch ihre Studie zu dem Schluss, dass das Zählen von γH2AX Foci, nach einer

in vitro Bestrahlung von isolierten T-Lymphozyten bei gynäkologischen

Tumorpatientinnen, keine Vorhersage über spätere Gewebereaktionen treffen kann

(Werbrouck et al. 2009).

Die Autoren zeigten in einer weiteren Arbeit auch, dass keine Korrelation zwischen

dem γH2AX Foci Modell und dem Risiko für akute Gewebereaktionen bei Patienten

mit IMRT Behandlung bei Kopf-Hals-Tumoren gefunden wurde (Werbrouck et al.

2011).

21

Fleckenstein et al versuchten eine Korrelation zwischen dem Grad der Mucositis und

der Menge von γH2AX Foci nach 24 Stunden herzustellen. Hier zeigte sich jedoch

keine eindeutige Verbindung zwischen der Schwere der Mucositis und der Anzahl der

γH2AX Foci nach 24 Stunden. Es zeigte sich aber, dass die Patienten ein höheres Risiko

hatten, eine schwere Mucositis zu entwickeln, wenn die Anzahl der γH2AX Foci erhöht

war. Die Autoren führen diese Beobachtungen darauf zurück, dass nur eine Minderheit

der Patienten erhöht strahlensensibel ist und diese dadurch ein erhöhtes Risiko haben,

ernsthafte Gewebereaktionen zu entwickeln. Diese Gruppe wird von der Mehrheit der

Patienten mit normaler Strahlensensibilität übertroffen, die dennoch das Risiko haben

therapiebedingte Komplikationen zu erleiden, wenn auch mit einer geringeren

Wahrscheinlichkeit. Dadurch treten in der Gruppe der nicht erhöht

strahlenempfindlichen Patienten absolut mehr therapiebedingte Nebenwirkungen auf als

in der Gruppe der strahlenempfindlichen Patienten. Die Autoren sehen das als

Erklärung, warum keine enge Verbindung zwischen der Reparaturrate der

Doppelstrangbrüche und dem Grad der Mucositis hergestellt werden kann. Des

Weiteren vermuteten sie, dass das Auftreten einer Mucositis auch mit einer genetisch

determinierten, individuellen Doppelstrangbruchreparaturkapazität in Verbindung steht.

Der Grund dafür ist, dass sie einen Patienten entdeckten, der sowohl eine erhöhte

Doppelstrangbruchrate als auch schwerwiegende Gewebereaktionen zeigte

(Fleckenstein et al. 2011).

Aufgrund dieser unterschiedlichen Ergebnisse forderten Ivashkevich et al weitere

Untersuchungen der γH2AX Methode um zu zeigen, ob diese spezifisch genug ist,

strahlensensible Patienten vorherzusagen. Zugleich unterstützen die Autoren die

Meinung, dass das Verfahren die Möglichkeit schaffe, die spezifische Teilmenge der

strahlensensiblen Patienten mit einem defekten DNA

Doppelstrangbruchreparatursystem herauszufiltern, selbst wenn die Korrelation

zwischen der γH2AX Methode und der Strahlensensibilität im klinischen Gebrauch

ungenügend ist (Ivashkevich et al. 2012).

Dennoch gaben Dikomey et al zu bedenken, dass bei Patienten mit unterschiedlichen

Schweregraden von Spätkomplikationen die individuelle Strahlensensibilität vielleicht

nicht der ausschlaggebende Faktor in klinischen Studien sei (Dikomey et al. 2003).

Zusätzlich haben genetische Tests, die sich mit feinen Variationen in Genen des DNA

Doppelstrangbruchreparatursystems beschäftigen (z. B. ein einziger Nukleotid

22

Polymorphismus) gezeigt, dass diese mit Strahlenschäden nach einer Strahlentherapie

assoziiert sind (Löbrich et al. 2005, Andreassen et al. 2003, Werbrouck et al. 2009).

Ergänzend proklamiert eine weitere Studie, dass eine Persistenz von γH2AX Foci nach

der initialen Schädigung der DNA impliziert, dass etwas von dem Schaden nicht

repariert wird und damit eine verminderte Reparaturfähigkeit vorliegt. Dies wiederum

macht γH2AX zu einem guten Kandidaten, um eine schnelle Beurteilung

strahlensensibler Personen durchzuführen (Hamasaki et al. 2007) und somit Zelllinien

und Personen mit defektem DNA Reparatursystem identifizieren zu können (Taneja et

al. 2004).

Zusätzlich wurde bereits veröffentlicht, dass eine erhöhte γH2AX Foci Anzahl oft in

menschlichen Krebsmodellen gefunden werden kann, wie zum Beispiel bei Zellen des

Gebärmutterhalskrebs (Banath et al. 2004, Yu et al. 2006), Melanoms (Warters et al.

2005), Kolokarzinoms, Fibrosarkoms, Osteosarkoms, Glioms und Neuroblastoms

(Sedelnikova et al. 2006). Die Ergebnisse lassen vermuten, dass eine erhöhte Anzahl

von Doppelstrangbrüchen bzw. DNA Schädigung ein generelles Charakteristikum der

Krebsentstehung ist (Banath et al. 2004, Yu et al. 2006, Warters et al. 2005,

Sedelnikova et al. 2006, Bartkova et al. 2005, Gorgoulis et al. 2005).

Diese Aussage korreliert mit unserem Ergebnis, dass die Gauß’sche Verteilung der

Patientengruppe nach rechts verschoben ist im Vergleich zur Kontrollgruppe für die

spontanen Doppelstrangbruchraten und die Doppelstrangbrüche nach 2Gy Bestrahlung

und 24 Stunden Reparaturzeit, die dadurch erhöhte Doppelstrangbruchraten für die CRC

Patienten zeigen (Abbildung 7 + 8). Abbildung 10 zeigt die Ausreißer, die außerhalb der

zwei- bzw. dreifachen Standardabweichung der Gauß’schen Verteilung der CRC-

Patienten liegen, sowohl für die spontanen Doppelstrangbrüche, also auch für die DSB

nach einer Bestrahlung mit 2Gy und anschließenden 24 Stunden Regenerationszeit.

23

Abbildung 10:

Überblick über den Zusammenhang der spontan vorliegenden DNA-Doppelstrangbrüche im Vergleich zu

den Doppelstrangbrüchen nach 2Gy Bestrahlung und einer 24 stündigen Reparaturzeit.

Hingegen zeigt die Gauß’sche Verteilung nach einer Bestrahlung mit 0,5 Gy und einer

Inkubationszeit von 30 Minuten, die uns den initialen Schaden darstellt, eine

Normalverteilung ohne Ausreißer (Abbildung 9). Wir schlussfolgern aus diesen

Beobachtungen, dass man anhand der Normalverteilung diejenigen Patienten als

Ausreißer ermitteln kann, die strahlensensibler sind (Abbildung 7 + 8).

Es gibt diese Gruppe von Ausreißern für die spontanen und die unreparierten

Doppelstrangbrüche, nicht aber für diese, die den initialen maximalen Schaden

darstellen. Daraus kann man wohl vermuten, dass dieser Beobachtung ein Mangel an

ausreichender Kapazität Doppelstrangbrüche zu reparieren zu Grunde liegt, egal ob

diese durch Umweltfaktoren oder Strahlung verursacht sind. Nicht ausschlaggebend

scheint zu sein, dass durch eine erhöhte Strahlensensibilität deutlich mehr

Doppelstrangbrüche initiiert werden. Als Konsequenz daraus lässt sich schließen, dass

diese Patienten wegen einer schlechteren Reparatur der DNA-Doppelstrangbrüche mit

einer erhöhten Wahrscheinlichkeit an einer Krebserkrankung zu erkranken behaftet

sind. Ebenso kann man postulieren, dass diese verminderte Reparaturfähigkeit für eine

erhöhte Normalgewebsreaktion verantwortlich ist und dies weniger von dem

24

verursachten Schaden als von einer verminderten Fähigkeit, DNA-Doppelstrangbrüche

zu reparieren, ausgeht.

Wir denken, dass die Stärke der γH2AX Methode darin liegt, eine Gruppe von

Ausreißern zu identifizieren, die entweder eine defektes Reparatursystem für

Doppelstrangbrüche haben oder erhöht strahlenempfindlich sind, wodurch sie auch eine

erhöhte Tendenz zur Krebsentstehung haben. Den genauen Defekt aufzuzeigen, ist das

Verfahren jedoch nicht in der Lage. Um Spätkomplikationen mit den erhöhten γH2AX

Foci Werten in Verbindung zu setzen ist ein weiteres Follow-up in drei bis fünf Jahren

notwendig.

25

7. Literaturverzeichnis

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29

8. Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

bzw. beziehungsweise

ca. circa

CRC Kolorektales Karzinom

DAPI 6-Diamidino-2-phenylindol

DNA Desoxyribonukleinsäure

DSB Doppelstrangbruch

DSBs Doppelstrangbrüche

FBS fetal bovine serum

Gy Gray

IR ionisierende Strahlung

PBS Phosphate buffered saline

PCNA proliferierende Zellkern-Antigen

SD Standardabweichung

u. a. unter anderem

z. B. zum Beispiel

γH2AX Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139)

30

9. Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen meiner Arbeit

beigetragen haben.

Ich danke Prof. Dr. med. Rainer Fietkau, Direktor der Strahlenklinik der Friedrich-

Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, für die Möglichkeit, eine klinisch-

experimentelle Arbeit mit einem so großen Patientenkollektiv durchführen zu können

und außerdem für das Bereitstellen des Arbeitsplatzes im Labor für Strahlenbiologie

und der zahlreichen Arbeitsmaterialien.

Ein ganz spezieller Dank gilt meinem Doktorvater PD Dr. med. Luitpold V. Distel, der

immer ein offenes Ohr für alle Fragen und Probleme hat und dessen Betreuung durch

seine stetige Anwesenheit im Labor einmalig ist. Vielen Dank für eine unkomplizierte,

offene und hilfsbereite Arbeitsatmosphäre.

Ein ganz besonders großer Dank gilt Elisabeth Müller und Doris Mehler für ihre

fortwährende Hilfe und Unterstützung in jeglicher Hinsicht, ohne die ein Arbeiten im

Labor so nicht möglich gewesen wäre und die diese Arbeit zu etwas ganz besonderem

gemacht haben.

Abschließend gilt mein Dank meinem Freund Christian Ulrich und meinen Eltern

Angela und Christoph Kröber, die mich stets unterstützt und ermutigt haben.

31

10. Lebenslauf

Persönliche Daten:

Name: Jana Christina Kröber

Geburtsdatum: 21. Juli 1984

Geburtsort: Nürnberg

Eltern: Johann Christoph Kröber (Wirtschaftsberater)

Angela Elisabeth Kröber (Grundschullehrerin)

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: ledig

Konfession: römisch-katholisch

1991-1995 Billroth Grundschule Nürnberg

1995-2004 Melanchthon Gymnasium Nürnberg, Abschluss:

Allgemeine Hochschulreife

08 - 12/ 2001 Schüleraustausch USA Wilson High-School Florence,

South Carolina

10/ 2002 - 06/ 2013 geringfügige Beschäftigung bei Christoph Kröber e.K.

10/ 2004 - 02/2005 Studium der Kulturwirtschaft an der Universität Passau

09/ 2005 – 02/2006: Praktikum am Caritas Pirckheimer Haus

04 - 08/ 2005 Pflegepraktika am Krankenhaus Martha Maria, Klinikum

Nürnberg Süd und Krankenhaus Altdorf

04/ 2006 - 05/2013 Studium der Humanmedizin an der Friedrich-Alexander

Universität in Erlangen

02/ 2007 - 11/ 2012 selbstständige Tätigkeit als Messehostess und für die

Firma Business & Service

10/ 2008 -02/ 2011 Studententutorin am Lehrstuhl Anatomie II für den Kurs

„Funktionelle Anatomie“

03/ 2009 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

08 - 09/ 2009 Famulatur Allgemeine und gynäkologische Onkologie,

Frauenklinik AKH Wien

32

08 - 09/ 2010 Famulatur Unfallchirurgie und Traumatologie,

Berufsgenossenschaftlichen Unfallklinik Murnau

02 - 04/ 2011 Praxisfamulatur Chirurgische und Unfallchirurgische

Gemeinschaftspraxis Dr. Bäuerle, Dr. Mederer, Altdorf

02 - 06/ 2012 Praktisches Jahr: Medizinische Klinik 4, Schwerpunkt

Nephrologie / Hypertensiologie - Klinikum Nürnberg

seit 11/ 2010 Klinisch-experimentelle Promotion an der Strahlenklinik

der Universität Erlangen bei Prof. Dr. Fietkau unter

Betreuung von PD Dr. Distel

06- 09/ 2012 Praktisches Jahr: Allgemeinchirurgische und

Unfallchirurgische Abteilungen - Klinikum Nürnberg

10/ 2012 - 01/ 2013 Klinik für Frauenheilkunde – Universitätsklinik Erlangen

05/ 2013 Abschluss Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

Ab 08/ 2013 Assistenzärztin an der Klinik für Unfallchirurgie und

Orthopädie des Klinikum Nürnberg Süds

Erlangen, Juli 2013