Gentechnik/Biotechnikdingerma/Podcast/5.BiotechWS10.pdf · Kinder zwei DNA-Fragmente. • Dagegen hybridisiert die gleiche Sonde in der DNA kranker Kinder nur mit einem DNA-Fragment

Gentechnik/Biotechnik

Vorlesung im WS 2010/2011

Prof. Theo DingermannInstitut für Pharmazeutische Biologie

Goethe-Universität Frankfurt/[email protected]

Rekombinante Wirkstoffe

Dienstag, 23. November 2010

1984•Klonierung und Sequenzierung des kompletten HIV-Genoms;

Die Geschichte der Gentechnik

• Entwicklung des genetischen Fingerabdrucks;


Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)an repetitiven Allelen (Minisatelliten)

Allel 1 Allel 2

Gelelektrophorese

repetitive Allele:zwei Banden pro diploidem Chromosom

Banden auf mehrern Chromosomen



Die Geschichte der Gentechnik DNA-Typisierung



TatortspurDienstag, 23. November 2010


VerdächtigeDienstag, 23. November 2010


ÜbereinstimmungDienstag, 23. November 2010

Repetitive DNA-Sequenzen

GAGGACCACCAGGAAG

Minisatellit

MikrosatellitShort Tandem Repeat (STR)

AGAT



PCR-Analyse mit Mikrosatelliten (STRs = Short Tandem RepeatsDie Geschichte der Gentechnik

STR Allel 1 STR Allel 2

STR Allel 3 STR Allel 4

spezifische, STR-flankierende Primer!


Repetitive DNA-Sequenzen für DNA-Typisierungen mit PCR Minisatelliten Größe 400-1000 bp (Kernmotive 10-100 bp) u.U. schlechte Ergebnisse mit degradierter DNA Probleme mit allelic dropout

Mikrosatellieten (STRs) Größe 100-400 bp (Kernmotive 2-6 bp) bessere Ergebnisse mit stark degradierter DNA geringere allelic dropout Problematik kleinere Fragmente sind mit besserer Auflösung trennbar

Neue PCR-spezifische Probleme: Kontaminationen PCR-Inhibitoren Allelic dropout



DNA-Typisierung

Multiplex STR-Analyse (2 Individuen)

Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Nachweis der Amplimeredurch Autoradiographie

Allel# 1 9 7 6 5 4 3 2 8 Σ


D16S539

DNAChromosom 16

"single copy" (Einzelsequenz)

539. Genlocus auf Chromosom 16

Die Geschichte der Gentechnik Nomenklatur der STR-Marker


Die Geschichte der Gentechnik Vergleich RFLP und PCR

RFLP PCR

benötigte Zeit 6-8 Wochen 1-2 Tagebenötigte DNA-Menge 50-500 ng 0,1-1 ngbenötigte DNA-Qualität hochmolekular, intakt fragmentiertautomatisierbar? nein ja


DNA-Typisierung durch Multiplex STR-AnalysenDiskriminierungsgrade – praktische Berechnungen

Ein Individuum hat die Wahrscheinlichkeit F, an einem Locus zwei bestimmte Allele zu besitzen:

F = 2pqIst ein Individuum homozygot für ein Allelpaar, gilt:

F = p2

Beispiel:Am Genlocus D3S1358 werden zwei Allele mit 15 bzw. 18 Repeats gefunden. Die Frequenzen sind 0,2825 bzw. 0,1450

F = 2 • 0,2825 • 0,1450 = 0,0819 oder 8,2%



DNA-Typisierung durch Multiplex STR-AnalysenMultiplex STR-AnalyseBeispiel: PowerPlex® 16

16 verschiedene Loci werden gleichzeitig amplifiziertCSF1PO

FGATPOXTH01VWA

D3S1358D5S818D7S820D8S1179D13S317D16S539D18S51D21S11Penta DPenta E

Amelogenin

1 : 1,8•1017



1984•Klonierung und Sequenzierung des kompletten HIV-Genoms;


• Entwicklung des genetischen Fingerabdrucks;• Entwicklung der ersten gentechnisch hergestellten Vakzine.

Das Hepatitis-B-Virus (HBV) gehört zur Gruppe der Hepadnaviren, die ein zirkuläres, teils doppelsträngiges DNA-Genom und einer Lipidhülle besitzen. Der zweitgrößte Leserahmen codiert für die verschiedenen Formen des Oberflächenproteins HBsAg der acht verschiedene Genotypen (A – H).


Die Geschichte der Gentechnik Hepatitis-B-Impfstoff


1985:•Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose;





Funktionelles Klonieren: Voraussetzung ist, dass die biochemische Basis der Erkrankung bekannt ist oder dass Kenntnisse über das Protein vorliegen, das unmittelbar an der Krankheit beteiligt ist.




Positionelles Klonieren: Für diesen Ansatz müssen Kenntnisse über die subchromosomale Position des vermeintlichen Gens vorliegen. Den genauen Pathogenitäts-Mechanismus bzw. die biochemische Funktion des Genproduktes braucht man nicht zu kennen.




Positions-unabhängiges Klonieren eines Kandidaten-Gens: Besteht ein begründeter Verdacht, dass ein Defekt in einem bestimmten Gen die Krankheit verursacht, kann das ohne Kenntnisse der chromosomalen Lokalisation Gen kloniert werden. Ein solches Gen bezeichnet man als ein „Kandidaten-Gen“.




Positionelles Klonieren eines Kandidaten-Gens: Für diesen Ansatz werden sowohl Kenntnisse über die Pathogenitäts-Mechanismen als auch über die chromosomale Lokalisation des Gens benötigt, das im Verdacht steht, eine Erbkrankheit zu verursachen. Ist das gegeben, dann ist dieser Ansatz sehr effizient.




RFLP-Marker D7S15




• Der RFLP-Marker D7S15 markiert in der DNA von Eltern kranker Kinder zwei DNA-Fragmente.

• Dagegen hybridisiert die gleiche Sonde in der DNA kranker Kinder nur mit einem DNA-Fragment.

• Die Eltern sind also für diesen Marker heterozygot und daher gesund.

• Dagegen haben die kranken Kinder von beiden Eltern jeweils das defekte Allel geerbt. Sie sind somit für den Marker homozygot und folglich krank.

Durch in-situ-Hybridisation konnte die chromosomale Position dieses Markers als 7q31.3 identifiziert werden. Damit war die Voraussetzung für positionelles Klonieren geschaffen.




Es konnte nicht nur das Gen identifiziert werden, sondern es wurde auch eine entscheidende Mutation entdeckt, die bei mehr als 70% aller Patienten mit Cystischer-Fibrose in Nordeuropa vorkommt.Diese Patienten tragen die DF508-Mutation, die dadurch gekennzeichnet ist, dass an Position 508 im CFTR-Protein (cystic fibrosis transmembrane conductants regulator) die Aminosäure Phenylalanin fehlt.Das CF-Gen ist 230 kBp lang, besteht aus 24 Exons und codiert für ein Protein aus 1.480 Aminosäuren. Das Protein ist bekanntlich ein Chloridkanal und somit ein Protein, das in der Membran verankert ist.




• Erfindung der PCR-Technik:

Kary B. Mullis 1993


1985:•Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose;•Erfindung der PCR-Technik;


• Sequenzierung des humanen Insulinrezeptors


1985:•Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose;•Erfindung der PCR-Technik;


• Sequenzierung des humanen Insulinrezeptor• Zulassung von rekombinantem, humanem Wachstumsfaktor

durch die FDA.


1986:•Einführung von AIDS- und Hepatitis-Tests für Blutkonserven;




Anfang der 80er-Jahre gab es erste Verdachtsfälle auf Kontaminationen in Blutkonserven.1984 stand fest: Viele Blutkonserven und für Bluter lebenswichtige Blutprodukte waren mit HIV verseucht.Zu diesem Zeitpunkt hatten sich jedoch bereits 50 Prozent aller deutschen Bluter, also rund 1500 Menschen mit dem tödlichen Virus infiziert. Obwohl Mitte der 80er-Jahre bereits bekannt war, dass die Produkte lebensgefährlich sind, versäumte die Regierung, eine Regelung zum Schutz der Bluter zu schaffen. Dass die Blutpräparate auch mit Hepatitis A, B und C belastet waren, wurde kaum erwähnt. So kommt es, dass zum Beispiel alle Bluter mit Hepatitis C infiziert sind.



Erst als Anfang der 90er-Jahre der Skandal richtig zum Kochen kam, entschuldigte sich der damalige Gesundheitsminister Horst Seehofer offiziell bei den Blutern wegen Verletzung der Aufsichtspflicht.Das BGA wurde aufgelöst und das BfArM geschaffen. Heute garantiert die PCR-Testung auf Hepatitis A-, B- und C-, HI- und Parvoviren, dass Blutkonserven sicher sind.


1986:•Einführung von AIDS- und Hepatitis-Tests für Blutkonserven;•Zulassung der ersten Interferone – Intron A® und Roferon A® – für die Krebstherapie;



Biochemische und pharmakologische Eigenschaften der Interferone:

Protein Funktion Induktion durchInduktion durch

Typ-I-IFN Typ-II-IFN

2'-5'(A)-Synthetase dsRNA-abhängige Synthese von 2'-5'(A); Aktivator der RNase L

+ +

Protein (p68) Kinase (PKR) (durch dsRNA aktivierbare Proteinkinase)

Phosphorylierung des Translations-Initiationsfaktors eIF-2a

+ ±

Klasse-I-MHC-Antigene (HLA-A,B,C) (incl.β2-Mikroglobulin)

Antigenpräsentation gegenüber zytotoxische T-Lymphozyten

+ +

Klasse-II-MHC-Antigene (HLA-DR)

Antigenpräsentation gegenüber TH-Lymphozyten

± +



Biochemische und pharmakologische Eigenschaften der Interferone:Die Geschichte der Gentechnik



Indolamin-2,3-dioxygenase

Tryptophanmetabolismus (Katabolismus)

± +

Guanylat-Bindeproteine (GPB; γ67)

GTP-, GDP-Bindung ± +

Mx-Protein GTPase, spezifischer Inhibitor des Influenza-Virus

+ -

IP-10 CXC-Chemokin ± +

Metallothionin Metall-Entgiftung + +

TNF-Rezeptoren Vermittler von TNF-Effekten ± +

IL-2-Rezeptoren Vermittler von IL-2-Effekten - +


Biochemische und pharmakologische Eigenschaften der Interferone:Die Geschichte der Gentechnik



GM-CSF-Rezeptor Vermittler von GM-CSF-Effekten

- +

Interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1; CD54)

Endotheliales Zelladhäsionsmolekül GTP-, GDP-Bindung

- +

Immunglobulin-Fc-Rezeptor (FcR)

Immunglobulinbindung durch Makrophagen/Neutrophile

± +

Thymosin β4 Induktion der Terminalen Transferase in B-Lymphozyten

+ ?


1986:•Einführung von AIDS- und Hepatitis-Tests für Blutkonserven;•Zulassung der ersten Interferone – Intron A® und Roferon A® – für die Krebstherapie;•Zulassung des ersten monoklonalen Antikörpers – Orthoclone® OKT3 – als Medikament zur Prophylaxe von Abstoßungsreaktionen bei der Nierentransplantation;



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