Vergleich der Auswirkung einer oralen Therapie mit ... · Aus dem Pathologisch-Anatomischen Institut der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med

Aus dem Pathologisch-Anatomischen Institut der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. med. Arndt Hartmann

Vergleich der Auswirkung einer oralen Therapie mit

Metformin und EMD 387008 auf renale Schäden im

Tiermodell der diabetogenen ZDF-Ratte

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Mareile Arntrudis Bezold

aus

Bayreuth

2009

Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler Referent: Prof. Dr. med. Kerstin Amann Korreferent: Prof. Dr. med. Karl Hilgers Tag der mündlichen Prüfung: 20. Januar 2010

Für Frank Bauer

Inhaltsverzeichnis

Zusammenfassung ............................................................................................................... 1

Zusammenfassung auf Englisch......................................................................................... 3

1 Einleitung .............................................................................................................. 5

1.1 Diabetes mellitus .................................................................................................... 5 1.2 Komplikationen des Diabetes mellitus................................................................... 7 1.3 Diabetische Nephropathie....................................................................................... 8

2 Zielsetzung der Arbeit........................................................................................ 13

3 Material und Methodik...................................................................................... 17

3.1 Versuchstiere ........................................................................................................ 17 3.2 Studiendesign ....................................................................................................... 18 3.3 Versuchsbedingungen........................................................................................... 19 3.4 Behandlung der Tiere ........................................................................................... 19 3.4.1 Medikamentenbeschreibung................................................................................. 19 3.4.2 Verabreichung der Medikamente ......................................................................... 23 3.5 Laboranalyse......................................................................................................... 23 3.5.1 Urinanalyse........................................................................................................... 23 3.5.2 Serum- und Plasmaanalyse................................................................................... 23 3.6 Fixation und Gewebeaufbereitung ....................................................................... 24 3.6.1 Perfusionsfixation................................................................................................. 24 3.6.2 Histologische Gewebeaufbereitung...................................................................... 24 3.7 Auswertung........................................................................................................... 25 3.7.1 Semiquantitative Untersuchungen der Glomerula hinsichtlich ihres

Schädigungsausmaßes .......................................................................................... 25 3.7.2 Morphometrische und stereologische Untersuchung der Glomerula ................... 28 3.8 Statistik ................................................................................................................. 34

4 Ergebnisse ........................................................................................................... 37

4.1 Tierparameter........................................................................................................ 38 4.1.1 Körpergewicht ...................................................................................................... 38 4.1.2 Körpergröße.......................................................................................................... 39 4.1.3 Nierengewicht....................................................................................................... 40 4.2 Futter- und Wasseraufnahme............................................................................... 40 4.3 Urinparameter....................................................................................................... 41 4.3.1 Diurese.................................................................................................................. 42 4.3.2 Albumin-Exkretion............................................................................................... 42 4.3.3 Kreatinin ............................................................................................................... 43 4.3.4 Kreatinin-Clearance.............................................................................................. 44 4.3.5 Harnstoff-Exkretion.............................................................................................. 44 4.4 Blutparameter und Werte des Glucosestoffwechsels ........................................... 44 4.4.1 Parameter des Glucosestoffwechsels.................................................................... 46 4.4.2 Elektrolyte ............................................................................................................ 50 4.4.3 Parameter des Fettstoffwechsels........................................................................... 52 4.5 Schädigungsindizes und Morphometrie der Nieren ............................................. 53 4.5.1 Glomeruloskleroseindex....................................................................................... 54 4.5.2 Mesangiolyseindex ............................................................................................... 54 4.5.3 Tubulointerstitieller Schädigungsindex................................................................ 55 4.5.4 Vaskulärer Schädigungsindex .............................................................................. 56

4.5.5 Umfang des Kapillarkonvoluts............................................................................. 56 4.5.6 Durchmesser, Fläche und Volumen des Kapillarkonvoluts ................................. 57 4.6 Semidünnschnitte ................................................................................................. 59 4.6.1 Werte des Kapillarkonvoluts und der Kapillaren ................................................. 61 4.6.2 Volumendichte der einzelnen Zellarten................................................................ 62 4.6.3 Gesamtvolumen der jeweiligen Zellart................................................................. 63 4.6.4 Durchschnittsvolumen der jeweiligen Zellart....................................................... 63 4.6.5 Anzahl der jeweiligen Zellart pro Fläche ............................................................. 63 4.6.6 Anzahl der jeweiligen Zellart pro Volumen......................................................... 64 4.6.7 Gesamtzahl der jeweiligen Zellart pro Glomerulum ............................................ 65 4.7 Photodokumentation der Befunde ........................................................................ 66 4.7.1 Glomerulosklerose................................................................................................ 66 4.7.2 Tubulointerstitielle Schädigung............................................................................ 69 4.7.3 Vaskuläre Schädigung .......................................................................................... 73

5 Diskussion............................................................................................................ 77

5.1 Pathogenetische Grundlagen ................................................................................ 77 5.1.1 Auswirkung einer Hyperglykämie auf die Niere.................................................. 77 5.1.2 Albuminurie und Nephropathie............................................................................ 80 5.1.3 Auswirkungen einer Dyslipidämie auf die Niere................................................. 81 5.2 Diskussion der eigenen Ergebnisse ...................................................................... 82 5.2.1 Blut- und Urinparameter....................................................................................... 82 5.2.2 Wirkung von Metformin und EMD auf Gefäße und Endothel............................. 85 5.2.3 Auswirkungen von Metformin und EMD auf die Nierenfunktion und

Morphologie ......................................................................................................... 87 5.2.4 Schlussfolgerung .................................................................................................. 91

Literaturverzeichnis .......................................................................................................... 93

Abkürzungsverzeichnis..................................................................................................... 99

Danksagung...................................................................................................................... 100

Lebenslauf ........................................................................................................................ 101

1 Zusammenfassung

Zusammenfassung

Hintergrund und Ziele Die diabetische Nephropathie stellt in Deutschland die häufigste Ursache einer

Dialysepflicht dar [41]. Sie manifestiert sich als zunehmende glomeruläre Okklusion

und tubulointerstitielle Fibrose und führt zu Proteinurie, zur Entwicklung oder

Verstärkung von Hypertonie und Dyslipoproteinämie sowie zu einer kontinuierlichen

Abnahme der Nierenfunktion [32].

Mehrere Studien belegen, dass normoglykämische Blutzuckerwerte das Fortschreiten

einer Nierenschädigung verzögern können [10, 12, 19, 26]. Das Biguanid Metformin ist

heute das am weitesten verbreitete blutzuckersenkende Medikament in der Behandlung

des Typ-2-Diabetes [10]. Neben seiner antihyperglykämischen Wirkung führt es zu

einer Verminderung der mikro- und makrovaskulären Schäden, die für die Pathogenese

der diabetischen Nephropathie von entscheidender Bedeutung sind. Ein ähnlich

positives Wirkspektrum wird von dem von der Firma Merck® entwickelten oralen

Antidiabetikum EMD 387008 erwartet, wobei es gegenüber dem Metformin jedoch eine

bessere metabolische Verträglichkeit aufweisen soll.

Im Rahmen dieser Arbeit verglichen wir daher im diabetischen Tiermodell die

Auswirkungen einer Therapie mit Metformin bzw. EMD 387008 auf die Entwicklung

und Progression einer renalen Schädigung.

Methoden Für die Versuche wurde das Tiermodell der „Zucker-Diabetic-Fatty“-Ratte (ZDF-Ratte)

verwendet. Die männlichen Phänotypen des Stamms „ZDF-fatty“ entwickeln einen

Typ-2-Diabetes und im Verlauf eine diabetische Nephropathie [62]. Als Kontrolle

dienten Tiere des Wildtyps „ZDF-lean“, welche keinen Diabetes entwickeln.

Nach 10 Versuchswochen wurden Tiere der Gruppen ZDF-fatty (n=10) und ZDF-lean

(n=9) untersucht, um Ausgangswerte vor der nachfolgenden Behandlung zu erhalten.

Die verbleibenden ZDF-fatty-Ratten wurden randomisiert 3 Gruppen zugeordnet, die

nun für den Zeitraum von 16 Wochen entweder mit Metformin (150 mg/kg/24h; n=10;

ZDF-F-Met), EMD 387008 (200 mg/kg/24h; n=9; ZDF-F-EMD) oder einem Placebo

(n=8; ZDF-F-P) behandelt wurden. Die ZDF-lean-Tiere erhielten ebenfalls ein

Placebopräparat (n=8; ZDF-L-P).

2 Zusammenfassung

Am Ende des Versuchs wurden die Nierenfunktion und physiologische Parameter der

Tiere untersucht. Der Grad der renalen Schädigung wurde histologisch an Paraffin- und

Semidünnschnitten bestimmt und zwischen den einzelnen Gruppen verglichen.

Ergebnisse und Beobachtungen Die Wirkung von EMD war mit der des Metformins in vielen untersuchten Parametern

vergleichbar. So unterschieden sich die Glucose- und Insulinserumspiegel beider

Gruppen nicht signifikant voneinander, wenngleich die Tiere der Gruppe ZDF-F-EMD

geringfügig niedrigere Werte aufwiesen als die Tiere der Gruppe ZDF-F-Met. In Bezug

auf die Nierenfunktion ließ sich unter Therapie mit EMD keine Verbesserung erreichen:

die Tiere der Gruppe ZDF-F-EMD wiesen, wenn auch nicht signifikant, eine niedrigere

Kreatinin-Clearance und eine stärkere Albuminurie auf als die Tiere der Gruppe ZDF-F-

Met. Ein erhöhtes glomeruläres Volumen und eine verstärkte Diurese der mit EMD

behandelten Tiere könnten Hinweise für eine diabetestypische glomeruläre

Hypertrophie mit konsekutiver Hyperfiltration sein.

Morphologische Veränderungen wie Glomerulosklerose sowie vaskuläre und tubulo-

interstitielle Schädigung wurden durch EMD dagegen effektiver bekämpft als durch

Metformin. Die Gruppe ZDF-F-EMD zeigte signifikant niedrigere Werte des

vaskulären Schädigungsindex als die Gruppen ZDF-F-P und ZDF-F-Met. Die

signifikante Erhöhung der Volumendichte von Endothelzellen und der Endothelzellzahl

pro Fläche zeigt, dass EMD offenbar einer Hyperglykämie-induzierten Apoptose von

Endothelzellen entgegenwirken konnte. Auch die Glomerulosklerose und die Störung

der tubulointerstitiellen Architektur konnten durch EMD wirksamer bekämpft werden

als durch Metformin.

Praktische Schlussfolgerungen Die vorliegenden Ergebnisse der morphologischen und biochemischen Untersuchungen

lassen noch kein abschließendes Urteil über die Wirkung des EMD im Vergleich zu

Metformin zu. Wenngleich sich das neu entwickelte Medikament hinsichtlich

Parametern der Nierenfunktion sowie hämatologischer Parameter des

Glucosestoffwechsels nicht signifikant positiv vom Metformin abhob, zeigte EMD

jedoch vor allem auf morphologische Veränderungen wie vaskuläre Schäden,

tubulointerstitielle Fibrose und Glomerulosklerose vielversprechend positive

Wirkungen. Eine genauere Untersuchung des neu entwickelten Medikaments erscheint

daher lohnenswert.

3 Zusammenfassung auf Englisch

Zusammenfassung auf Englisch

Background and Aims Diabetic nephropathy represents the most common cause for dialysis in Germany [41].

It manifests itself as an increasing glomerular occlusion and tubulointerstitial fibrosis

and leads to proteinuria, to the development or aggravation of hypertension, and to

dyslipoproteinemia, as well as to a continuous decrease of the renal function [32].

Different studies prove that normoglycemic blood glucose levels can delay renal

damage [10, 12, 19, 26]. Today, the biguanide Metformin is the most commonly used

antidiabetic agent for decreasing blood glucose concentration in type 2 diabetes patients

[10]. Besides its antihyperglycemic effect, it results in a reduction of micro- and

macrovascular damage, which are of crucial importance for the pathogenesis of diabetic

nephropathy. The oral antihyperglycemic agent EMD 387008, developed by the

pharmaceutical company Merck®, is expected to show a similarly positive effect.

However, a better metabolic tolerance is anticipated.

In this study, we used an animal model to compare the effects of a Metformin therapy to

the effects of EMD 387008 with regard to the development and progression of renal

damage using morphological and functional parameters.

Methods The „Zucker diabetic fatty rat“ (ZDF rat) animal model was employed in this study. The

male phenotypes of the ZDF-fatty stock develop type 2 diabetes and diabetic

nephropathy [62]. Animals of the ZDF-lean wild type, which do not develop diabetes,

but hypertension, were used as a control group. After 10 weeks, animals assigned to the

ZDF-fatty (n=10) and ZDF-lean (n=9) groups were examined to obtain baseline values

for the subsequent therapy. The remaining ZDF-fatty rats were randomly assigned to 3

groups that were from now on and for a duration of 16 weeks treated with Metformin

(150 mg/kg/24h; n=10; ZDF-F-Met), EMD 387008 (200 mg/kg/24h; n=9; ZDF-F-

EMD), or placebo (n=8; ZDF-F-P) respectively. The ZDF-lean animals were also given

placebo (n=8; ZDF-L-P). At the end of the study renal function and physiological

parameters of the animals were examined. The degree of renal damage was determined

histologically using paraffin and semi-thin sections and compared among the different

groups.

4 Zusammenfassung auf Englisch

Results and Observations The effects of EMD were comparable to the effects of Metformin with regard to many

of the examined parameters. Glucose and insulin serum levels of both groups were not

significantly different. However, the ZDF-F-EMD animals showed slightly lower levels

than the ZDF-F-Met animals. With regard to the renal parameters an EMD therapy did

not show improvements: the ZDF-F-EMD group had, although not significantly, a

lower creatinine clearance and a stronger albuminuria than the ZDF-F-Met group. An

increased glomerular volume and an enhanced diuresis of the animals treated with EMD

can indicate a glomerular hypertrophy with consecutive glomerular hyperfiltration that

is characteristical for diabetes.

Morphological alterations, such as glomerular sclerosis, vascular damage, and

tubulointerstitial fibrosis, were reduced more effectively by EMD than by Metformin.

The ZDF-F-EMD group showed significantly lower levels of the vascular damage index

than the ZDF-F-P and ZDF-F-Met groups. The significant enlargement of the volume

density of endothelial cells and the number of endothelial cells per area shows that

EMD can antagonize a hyperglycemia-induced apoptosis of endothelial cells. Moreover,

the glomerular sclerosis and the changes of the tubulointerstitial architecture were

fought more successfully by EMD than by Metformin.

Conclusion The presented results of the morphological and biochemical examinations do not allow

for a final judgement about the effect of EMD compared to Metformin. On the one

hand, the new antidiabetic agent does not significantly improve the effect of Metformin

with regard to renal function parameters as well as hematological parameters of the

glucose metabolism. On the other hand, EMD yielded promising results especially for

morphological alterations such as vascular damage, tubulointerstitial fibrosis, and

glomerular sclerosis. Therefore, a more detailed examination of the new antidiabetic

agent seems worthwile.

5 Einleitung

1 Einleitung

Dieses Kapitel stellt Grundlagen der Epidemiologie und Pathophysiologie des Diabetes

mellitus und seiner Komplikationen vor. Besonders berücksichtigt wird hierbei die

diabetische Nephropathie als Komorbidität, der durch ihre hohe Prävalenz ein

bedeutsamer Stellenwert bei der Behandlung des Diabetes und der Diabetes-assoziierten

Erkrankungen beizumessen ist. Ein entscheidender Beurteilungsparameter bei der

Erforschung neuer Arzneimittel muss daher auch eine wirksame Verhinderung von

Auftreten und Progression renaler Schäden sein.

1.1 Diabetes mellitus

Der Begriff „Diabetes mellitus“ leitet sich vom altgriechischen „διαβαίνειν“ (=

hindurchgehen, hindurchfließen) und dem lateinischen „mellitus“ (= honigsüß) ab und

bedeutet so viel wie honigsüßer Durchfluss. Antike Ärzte prägten die Bezeichnung für

dieses Krankheitsbild, das sich durch einen in Folge der Glukosurie süßlich

schmeckenden Urin auszeichnete. Heute wissen wir, dass es sich beim Diabetes mellitus

um eine chronische Regulationsstörung des Stoffwechsels handelt, die auf einem

absoluten oder relativen Insulinmangel beruht und durch den Leitbefund der

chronischen Hyperglykämie charakterisiert ist.

Die moderne Lebensweise in den Industrieländern, die bei geringerer körperlicher

Aktivität in Verbindung mit einer unausgewogenen Ernährungsweise zu einem

erheblichen Anstieg an Übergewichtigkeit in der Allgemeinbevölkerung führte, ließ den

Diabetes mehr und mehr zur Volkskrankheit werden. Weltweit ist von einer Zunahme

der Diabetesprävalenz auszugehen (vgl. Abbildung 1): Daten der WHO zeigen, dass die

globale Krankheitsprävalenz im Jahr 2000 bei 2,8 % lag und 2030 schätzungsweise

4,4 % betragen wird. Das bedeutet, dass sich die Patientenzahlen von 171 Mio. im Jahr

2000 auf 366 Mio. im Jahr 2030 erhöhen würden [81].

6 Einleitung

Abbildung 1: Geschätzte Zahl erwachsener Diabetespatienten, unterschieden nach Alter, Jahr und Herkunft (aus [81])

Den größten Anteil der Diabetespatienten machen mit 90-95 % die Typ 2-Diabetiker

aus [82]. Der Diabetes mellitus Typ 2 lässt sich auf zwei pathogenetische Mechanismen

zurückführen: zum einen ist die frühe postprandiale Insulinsekretion gestört, was zu

einer postprandialen Hyperglykämie führt [33, 46]. Zum anderen weisen die Patienten

eine herabgesetzte Insulinwirkung (Insulinresistenz) auf, die auf einen

Insulinrezeptordefekt mit konsekutiver Herabregulierung oder auf einen Post-Rezeptor-

Defekt mit gestörter Signaltransduktion (z.B. Tyrosinkinasen) zurückgeführt werden

kann. Auch Veränderungen in Stoffwechselvorgängen wie dem insulinsensitiven

Glucose-Transport oder der Glycogensynthese können für die Insulinresistenz

verantwortlich sein [46, 65]. Am Anfang der Erkrankung steht meist die Insulinresistenz

der Zellen von Skelettmuskel, Fettgewebe und Leber, so dass erhöhte Glucosespiegel

für die Glucoseverwertung benötigt werden. Die daraus resultierende Hyperinsulinämie

7 Einleitung

führt zu einer Herabregulation der Insulinrezeptoren und damit der Insulinwirkung, was

kompensatorisch wiederum eine erhöhte Insulinausschüttung nach sich zieht. Dieser

Circulus vitiosus führt über die permanent vorhandene Hyperinsulinämie auch zu einem

verstärkten Hungergefühl bei den Patienten und begünstigt das Auftreten von

Adipositas und Atherosklerose. Dieser Umstand erklärt, warum in der Therapie des

Typ-2-Diabetes, im Gegensatz zum Typ 1, weniger die Insulinsubstitution als vielmehr

eine Ernährungsumstellung, körperliche Aktivität sowie die Behandlung mit oralen

Antidiabetika im Vordergrund stehen.

Manifestationsfaktoren des Typ-2-Diabetes können neben einer genetischen Disposition

Stressfaktoren wie z.B. Operationen, Traumata oder Infektionen, aber auch

Endokrinopathien und Medikamente sein. Die Mehrzahl der Erkrankungen entwickelt

sich jedoch auf dem Boden eines metabolischen Syndroms (sog. Wohlstandssyndrom),

das durch das Zusammentreffen der vier Risikofaktoren „abdominelle Adipositas“,

„Dyslipoproteinämie“ (d.h. Erhöhung von Triglyceriden und LDL-Cholesterin bei

gleichzeitiger Verminderung von HDL-Cholesterin im Blut), „essentielle Hypertonie“

und „Glucosetoleranzstörung“ gekennzeichnet ist [7]. Die Bezeichnung dieser

Befundkonstellation mit „Wohlstandssyndrom“ verweist auf die entscheidende

Bedeutung des modernen Lebensstils, der durch Überernährung bei gleichzeitig

mangelnder körperlicher Bewegung als Hochrisikofaktor für ein metabolisches

Syndrom und damit für den Diabetes mellitus Typ 2 gilt.

Die Vererbung des Diabetes mellitus erfolgt polygen-multifaktoriell. Allerdings sind die

zu Grunde liegenden genetischen Faktoren im Detail noch unbekannt. Untersuchungen

an eineiigen Zwillingen zeigten, dass die Wahrscheinlichkeit einer Erkrankung beider

Geschwister an einem Typ-2-Diabetes zwischen 50 und 100 % liegt [54]. Die

genetische Penetranz ist also sehr hoch.

Ein Typ-2-Diabetes kann in seltenen Fällen auch bei Jugendlichen auftreten [6].

International wurde in den letzten Jahren eine Zunahme dieser Fälle beschrieben [38].

1.2 Komplikationen des Diabetes mellitus

Die meisten Spätfolgen des Diabetes mellitus sind auf Veränderungen der Blutgefäße,

sog. Angiopathien, zurückzuführen, die sich als sog. Endorganschäden an einer Vielzahl

von Organen manifestieren (siehe Tabelle 1).

8 Einleitung

Tabelle 1: Alters- und geschlechtsadjustierte „Odds Ratios“ für Komorbiditäten von Patienten mit Diabetes mellitus im Vergleich zu Personen ohne Diabetes mellitus (vgl. [28])

Komorbidität

Odds Ratio

95%iges KI

KHK 3,32 3,12 – 3,53 Periphere arterielle Verschlusskrankheit 3,14 2,79 – 3,53 Zerebrovaskuläre Erkrankungen 2,26 1,94 – 2,62

Arterielle Hypertonie 2,83 2,71 – 2,90

Augenerkrankungen 3,10 2,94 – 3,27

Nierenerkrankungen 4,63 3,86 – 5,54

Periphere Nervenerkrankungen 2,26 1,98 – 2,58 Man unterscheidet dabei zwischen den diabetesassoziierten makrovaskulären und den

diabetesspezifischen mikrovaskulären Komplikationen.

Die diabetische Makroangiopathie ist mit der Atherosklerose des Nichtdiabetikers

vergleichbar. Die wichtigsten Folgezustände sind Koronarsklerose, periphere

Durchblutungsstörungen und zerebrovaskuläre Schädigungen [82].

Die diabetische Mikroangiopathie hingegen ist charakterisiert durch eine Verdickung

der kapillären Basalmembran und abhängig von der Krankheitsdauer und der Güte der

Stoffwechseleinstellung. Dabei führt eine erhöhte Glucosekonzentration langfristig zu

einer nichtenzymatischen Kohlenhydratbindung an Proteine (Glykosylierung) und

Kollagen sowie zu einer Lamininvermehrung. Diese irreversible Glykosylierung führt

zu einer Beeinträchtigung der Kollagenvernetzung der kleinen Gefäße vorwiegend im

Augenhintergrund und in den Nierenglomerula (renoretinales Syndrom) [69]. Prinzipiell

kann allerdings jedes Kapillargebiet betroffen sein. So wird die diabetische

Mikroangiopathie auch als ätiopathogenetischer Faktor der diabetischen Neuropathie

diskutiert [28].

1.3 Diabetische Nephropathie

Tabelle 1 zeigt das stark erhöhte Risiko von Diabetes-Patienten, sekundär eine

Nierenerkrankung zu entwickeln. 20-40 % aller Patienten mit Typ-1- oder Typ-2-

Diabetes entwickeln im Verlauf ihrer Erkrankung eine Nierenschädigung [3]. Als

diabetische Nephropathie werden Nierenläsionen im Spätstadium eines Diabetes

mellitus bezeichnet, die klinisch zu einer zunehmenden Albuminausscheidung und zur

Veränderung der glomerulären Filtrationsrate führen und die mit einem erhöhten

kardiovaskulären Morbiditäts- und Mortalitätsrisiko assoziiert sind [32].

9 Einleitung

Nach Mogensen wird die Erkrankung in 5 Stadien eingeteilt [50] (vgl. Tabelle 2).

Tabelle 2: Nephropathie-Stadien nach Mogensen, 1983 (vgl. [32])

Nephropathie-Stadium

Albumin-ausscheidung

Serum-Kreatinin

GFR

I Stadium der Hyperfunktion Erhöht Normal Erhöht

II Stadium der klinischen Latenz Normal Normal Normal bis erhöht

III Beginnende Nephropathie Persistierende Mikroalbumin-urie

Im Normbereich ansteigend

Abnehmend

IV Kinisch-Manifeste Nephropathie

Makroalbumin-urie

Im Normbereich ansteigend

Abnehmend

V Niereninsuffizienz Makroalbumin-urie

Erhöht Erniedrigt

Die anhaltende Hyperglykämie führt einerseits über eine Erhöhung der Glukagon- und

Wachstumshormonkonzentration im Blut zu einer Zunahme der glomerulären

Filtrationsrate (GFR) (Stadium I und II). Auch Veränderungen der Konzentration an

Angiotensin-II, Katecholaminen und Prostaglandinen können zur glomerulären

Hyperfiltration beitragen [34].

Andererseits begünstigt die erhöhte Blutglukosekonzentration auch die Aktivierung von

Wachstumsfaktoren, wie TGF-β und das oben erwähnte Angiotensin-II in den Nieren.

Diese sind verantwortlich für eine Hypertrophie renaler Strukturen und eine

Größenzunahme der Glomerula. Gleichzeitig findet eine Verdickung der Basalmembran

statt, die auf einem gesteigerten Anbau und einem verminderten Abbau von

Basalmembrankollagenen beruht. Diese enthalten vermehrt Glukosyl-Galaktosyl-

Disaccharide und vermindert Sialinsäure und Heparansulfat. Daraus resultiert eine

funktionelle Beeinträchtigung der Filtrationsbarriere gegenüber kleinmolekularen

Proteinen, die eine glomeruläre Permeabilitätsstörung zur Folge hat [69]. Eine

Mikroalbuminurie, also das Auftreten von 30-300 mg Albumin im 24-Stunden-Urin

[32], setzt als erstes klinisches Symptom ein (Stadium I). Aus einer intermittierenden

Mikroalbuminurie kann sich bei 20-40 % der Typ-2-Diabetiker über eine persistierende

Mikroalbuminurie (Stadium III) eine Makroalbuminurie (Stadium IV und V) bis hin

zum terminalen Nierenversagen entwickeln, wenn die Krankheit nicht spezifisch

therapiert wird. Im weiteren Verlauf führen eine Verbreiterung des Mesangiums und im

10 Einleitung

Spätstadium eine glomeruläre Okklusion und tubulointerstitielle Fibrose nicht selten zur

terminalen Niereninsuffizienz (Stadium V) [3]. Morphologisch sind die Nieren zunächst

leicht vergrößert und weisen bei begleitender Arteriolosklerose eine fein granuläre

Oberfläche auf. Die Glomerula sind im Frühstadium eines Diabetes messbar vergrößert

und zeigen eine Mesangiumzellproliferation [69]. Im Spätstadium steht die noduläre

Glomerulosklerose nach Kimmelstiel und Wilson [40] im Vordergrund. Dabei handelt

es sich um eine Verbreiterung des Mesangiums durch eine diffuse, später noduläre

Ablagerung von PAS-positivem Material. Häufig lagert sich dieses Material auch

tropfenförmig zwischen der Bowmannschen Kapsel und dem Kapselepithel ab (sog.

Kapseltropfen) und Plasmasubstanzen sickern zwischen Basalmembran und Deckzellen

ein (sog. fibrinoide Kappen). Ferner sind die glomerulären Hilusgefäße

arteriosklerotisch verändert [69].

Die pathogenetischen Mechanismen, die eine diabetische Nephropathie verursachen,

sind noch nicht eindeutig bekannt. Mehrere Faktoren, die unmittelbar mit einer

Hyperglykämie verknüpft sind, werden diskutiert. Dazu zählen die Bildung von

„advanced glycosylation end products“ (AGEs) [13], die intrazelluläre Akkumulation

von Sorbitol über den sogenannten Polyol-Pathway [13], eine Aktivierung der

Proteinkinase C (PKC) in den Glomerula [13, 15] und eine Stimulation der Synthese

von „transforming growth factor beta-1“ (TGF-β-1) und „plasminogen activator

inhibitor-1“ (PAI-1) über den sogenannten Hexosamin-Pathway [13]. Veränderungen

des Blutflusses, eine erhöhte Kapillarpermeabilität, mesangiale Matrixvermehrung,

Thrombosierung und Proliferation glatter Muskelzellen der Kapillaren sowie die

Freisetzung proinflammatorisch wirkender Moleküle sind die Folge [13].

Neben einer unzureichenden Blutzuckereinstellung stellen Hypertonie, Nikotinkonsum,

erhöhte Eiweißzufuhr und eine genetische Prädisposition Risikofaktoren für die

Entwicklung einer diabetischen Nephropathie dar [32]. Bei Patienten mit Typ-2-

Diabetes zeigt eine Mikroalbuminurie ein erhöhtes kardiovaskuläres Morbiditäts- und

Mortalitätsrisiko an [32, 48]. Überdies ist die diabetische Nephropathie assoziiert mit

der Entwicklung von Hypertonie, koronarer Herzkrankheit, Schlaganfall, peripherer

arterieller Verschlusskrankheit und vorzeitiger Mortalität [3].

Alle in diesem Kapitel dargestellten Befunde verweisen auf die Anfälligkeit immer

größerer Personenkreise für den Diabetes mellitus sowie die diabetische Nephropathie

in den westlichen Industrienationen. Dies hat nicht nur die Minderung der

Lebensqualität einer steigenden Anzahl von Menschen zur Folge, sondern auch eine

11 Einleitung

stärkere Belastung der Sicherungssysteme unseres Gesundheitswesens. Die Entwick-

lung neuer effizienter Medikamente liegt daher nicht nur im Interesse gegenwärtiger

wie zukünftiger Patienten, sondern ihr kommt darüber hinaus eine gesundheitspolitische

Bedeutung zu.

In den folgenden Kapiteln werden Ergebnisse einer Studie vorgestellt, welche die

Auswirkungen eines von der Firma Merck® neu entwickelten Antidiabetikums, des

Medikaments EMD 387008, auf die Verhinderung von renalen Schäden im diabetischen

Tiermodell untersuchte.

12 Einleitung

13 Zielsetzung der Arbeit


Mit der Verbesserung der Überlebensprognose von Diabetikern hat die

Niereninsuffizienz infolge renaler Diabeteskomplikationen eine erschreckende

Dimension angenommen. So sind in den westlichen Industrienationen 30-50 % der

Dialysepatienten Diabetiker [64]. In Europa, Japan und den USA ist die diabetische

Nephropathie mit 25-42 % der Fälle die Hauptursache der terminalen Niereninsuffizienz

[61]. Eine optimale Stoffwechseleinstellung sowie die Prävention und Behandlung der

diabetischen Nephropathie ist daher von essentieller Bedeutung.

Mehrere Studien belegen, dass normoglykämische Blutzuckerwerte das Fortschreiten

einer Nierenschädigung verzögern können [1, 2, 19, 26, 32, 71]. Das Biguanid

Metformin findet breite Anwendung in der Behandlung des Typ-2-Diabetes,

insbesondere bei übergewichtigen Patienten. Seine unmittelbaren Stoffwechseleffekte,

wie die Minderung der hepatischen Glucosefreisetzung, Verbesserung der peripheren

Glucoseverwertung sowie eine positive Beeinflussung des Lipidstatus gehen einher mit

einer messbaren Verminderung von diabetesassoziierten Komplikationen. So konnte

eine in Großbritannien durchgeführte Studie (UK Prospective Diabetes Study, UKPDS)

bei nach Diagnosestellung mit Metformin behandelten Patienten eine Risikoreduktion

von 32 % für das Auftreten von diabetesbedingten mikro- und makrovaskulären

Komplikationen (plötzlicher Tod, Tod durch Hypo- oder Hyperglykämie,

Myokardinfarkt, Angina pectoris, Herzversagen, Apoplex, Nierenversagen, Amputation,

Glaskörperhämorrhagien, koagulations-bedürftige Retinopathie, einseitige Blindheit,

Kataraktextraktion), von 42 % für diabetes-assoziierte Todesfälle (Tod nach

Myokardinfarkt, Apoplex, pAVK, renaler Schädigung, Hypoglykämie, Hyperglykämie,

plötzlicher Tod), sowie von 36 % für die Gesamtmortalität gegenüber der rein diätetisch

behandelten Kontrollgruppe zeigen [2]. Auch im Vergleich zu einer Behandlung mit

Sulfonylharnstoffen oder Insulin war die Risikoreduktion für diabetesassoziierte

Komplikationen durch Metformin signifikant [1].

Diese positiven Effekte sind nicht nur durch die antihyperglykämischen Effekte dieses

Medikaments zu erklären, sondern auch durch davon unabhängige vasoprotektive

Wirkungen. So kann Metformin in frühen Stadien des Diabetes den kapillären Blutfluss

erhöhen, die arterielle Vasomotorik stimulieren und die lokale Aktivität der NO-

Synthase erhöhen. Ferner reduziert Metformin die Endothelpermeabilität und somit die

Entstehung von Ödemen. Diese Wirkung lässt sich laut Bailey [10] durch die


verminderte Glykosilierung der Basalmembran erklären, die mit erhöhter

Wandelastizität der Gefäße einhergeht.

Nach wie vor gehört Metformin zu den am häufigsten eingesetzten Antidiabetika, unter

anderem, weil es sich in vielerlei Hinsicht positiv von anderen Präparaten abhebt. Dazu

gehört etwa die Blutzuckersenkung ohne Hypoglykämie und ohne Hyperinsulinämie,

eine günstige Beeinflussung des Lipidprofils und des Körpergewichts sowie ein

antiatherogener Effekt [49].

Allerdings erfährt der Indikationsbereich durch zahlreiche Kontraindikationen eine

gewisse Einschränkung. Hierzu zählen ein hohes Lebensalter, Zustände mit schlechter

Sauerstoffversorgung des Gewebes, Lebererkrankungen und besonders die bei

Diabetikern häufig eingeschränkte Nierenfunktion (ab einer Serum-Kreatinin-

Konzentration von 1,2 mg/dl) [5]. Wünschenswert wäre daher die Entwicklung eines

Antidiabetikums, das die positiven Effekte von Metformin mit einem breiteren

Indikationsspektrum vereint.

Die Firma Merck® (Darmstadt, Deutschland) entwickelte in diesem Zusammenhang

das Medikament EMD 387008, im Folgenden kurz „EMD“ genannt, das sich derzeit in

präklinischer Testung befindet. In der vorliegenden Arbeit wurde im Tiermodell der

„Zucker-Diabetic-Fatty“-Ratte (ZDF-fatty) der Therapieerfolg von EMD 387008 und

Metformin hinsichtlich des Auftretens renaler Schäden verglichen. Die Untersuchungen

erfolgten mittels laborchemischer und histopathologischer Parameter. Als Kontrolle

diente ein Rattenwildtyp (ZDF-lean), der bei identischem genetischen Hintergrund

keine Symptome eines Diabetes und den sich daraus ergebenden Endorganschäden

ausbildet, wohl aber einen Hypertonus. Eine Veränderung der Nieren von ZDF-lean und

-fatty-Ratten, die bereits vor Beginn der Behandlung untersucht wurden, konnte als

Ausgangswert für die Progression der Erkrankung über den 16-wöchigen

Versuchszeitraum herangezogen werden. Mit Placebo behandelte ZDF-lean- und -fatty-

Tiere der entsprechenden Altersgruppen dienten als direkter Vergleich für mögliche

protektive Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf die diabetische

Nephropathie.

Die folgenden Parameter wurden untersucht:

• Tierparameter wie Körpergewicht [g], Körperlänge [mm] und Nierengewicht [g]

• Futter- [g/24 h] und Wasseraufnahme [ml/24 h] der Tiere

• Diurese [ml/24 h]


• Albumin-Exkretion [mg/24 h]

• Kreatinin-Exkretion [mmol/24 h]

• Serum-Kreatinin [µmol/l]

• Kreatinin-Clearance [ml/min]

• Harnstoff-Exkretion [mg/24 h]

• Urin-Albumin-Kreatinin-Ratio

• Serum-Glucose [mg/dl]

• Urin-Glucose [g/dl]

• Serum-Insulin [ng/ml]

• HbA1c [%]

• Serum- Natrium, Serum-Kalium, Serum-Calcium, Serum-Chlorid [mmol/l]

• Serum-Lactat [mmol]

• Serum-Cholesterin, Serum-HDL, Serum-LDL [mg/dl]

• An Paraffinschnitten:

- Glomerulärer, Mesangialer, Tubulointerstitieller und Vaskulärer

Schädigungsindex

- Umfang [µm], Fläche [µm²] und Volumen [10³ µm³] des Kapillarkonvoluts

- größter und kleinster Glomerulumdurchmesser [µm]

• An Semidünnschnitten:

- Mittlere Kapillarquerschnittsfläche [µm²]

- Längendichte [1/mm²] und Volumendichte [%] der Kapillaren

- Volumendichte von Podozyten, Mesangiumzellen und Endothelzellen [%]

- Gesamtvolumen von Podozyten, Mesangiumzellen und Endothelzellen

[10³ µm³]

- Zahl der Podozyten, Mesangiumzellen und Endothelzellen pro Fläche

[1/mm²]

- Zahl der Podozyten, Mesangiumzellen und Endothelzellen pro Volumen

[1/mm³]

- Gesamtzahl der Podozyten, Mesangiumzellen und Endothelzellen pro

Glomerulum

- Durchschnittsvolumen eines Podozyten, einer Mesangiumzelle und einer

Endothelzelle [µm³]


17 Material und Methodik


3.1 Versuchstiere

In der nachfolgend beschriebenen Versuchsreihe wurde das Modell der „Zucker-

Diabetic-Fatty“-Ratte (ZDF-Ratte) verwendet. Die ZDF-Ratte stellt ein klinisch

relevantes Tiermodell für die Untersuchung der Typ-2-diabetischen Nephropathie des

Menschen dar und wurde durch partielle Inzucht aus dem Stamm der „Zucker-Fatty“-

Ratten herausgezüchtet, welche in den 1960er Jahren vom Ehepaar Zucker beschrieben

wurden [87]. Diese Ratten tragen eine autosomal-rezessiv vererbte Mutation des Leptin-

Rezeptors (fa), die eine Verkürzung des Rezeptors und in der Folge eine ungenügende

Hormon-Rezeptor-Interaktion bedingt. Bei homozygoten männlichen Tieren (fa/fa)

führt diese Mutation zu Hyperphagie, Hyperlipidämie, Adipositas und nur leicht

verminderter Glucosetoleranz [16, 62]. Immer wieder trat jedoch auch ein männlicher

Phänotyp stark übergewichtiger Ratten mit sehr hohem Glukosespiegel und einer

gestörten Glukosetoleranz auf. Diese, ausschließlich männliche Tiere betreffende,

Spontanmutation wurde mit normalgewichtigen Zucker Ratten (+/fa) gepaart, die ein

hohes diabetisches Potential in sich trugen. Es handelte sich dabei fast ausschließlich

um Bruder x Schwester-Inzucht. Bereits ab der zweiten Generation konnte ein

konstanter Phänotyp herausgezüchtet werden, bei dem der Diabetes monogenetisch

determiniert ist und autosomal ausschließlich an männliche Nachkommen vererbt wird

[62]. Diese weisen im Alter von sieben Wochen eine Hyperglykämie auf, im Alter von

zwölf Wochen zeigt sich ein manifester Typ-2-Diabetes. Im Verlauf sind erhöhte

Plasmaspiegel des Glykoproteins HbA1c, als Marker für eine erhöhte Blutglukose, sowie

eine Proteinurie, Hypertriglyceridämie, Hypercholesterinämie und ein erhöhter Spiegel

freier Fettsäuren im Blut zu finden. Neuropathie, diabetische Nephropathie, gestörte

Wundheilung und ein milder Hypertonus sind weitere Kennzeichen dieses

Rattengenotyps (ZDF-fatty) [14, 25, 31, 62, 76]. Während die Serum-Insulinspiegel

zwischen der 7. und 10. Woche ansteigen, fallen sie später auf Grund der abnehmenden

Fähigkeit der β-Zellen, adäquat auf Glucosereize zu reagieren, wieder auf ein niedriges

Niveau ab [14, 76]. Die weiblichen Nachkommen bilden bei handelsüblicher Diät trotz

Fettleibigkeit und Insulinresistenz keinen Diabetes aus. Eine spezielle Nahrung (RD

13004 von Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ, USA) führt jedoch auch bei


weiblichen Tieren zur Ausbildung eines Diabetes mellitus im Alter von 6 bis 25

Wochen [14].

Tiere, die heterozygot für die Mutation im fa-Gen (ZDF-lean fa/+) sind oder dem

Wildtyp entsprechen, entwickeln keinen Diabetes, jedoch einen Hypertonus. Sie stellen

in diesem Versuch die Kontrollgruppe dar. Somit kann sichergestellt werden, dass

renale Veränderungen der Versuchstiere im Vergleich zur Kontrollgruppe auf den

Diabetes und nicht auf eine hypertensive Schädigung zurückzuführen sind.

3.2 Studiendesign

Dem hier beschriebenen Experiment lag folgender Versuchsaufbau zu Grunde:

Sechzig „Zucker-Diabetic-Fatty“-Ratten wurden randomisiert 6 Gruppen zugeordnet.

Um Ausgangswerte der histologischen Nierenveränderungen der Ratten vor der

nachfolgenden Behandlung zu erhalten, wurden jeweils 10 Tiere der Gruppen ZDF-fatty

und ZDF-lean bereits nach 10 Versuchswochen untersucht.

Die verbleibenden ZDF-fatty-Ratten wurden randomisiert 3 Gruppen zugeordnet, die

nun für den Zeitraum von 16 Wochen entweder mit Metformin (150 mg/kg/24 h im

Futter), EMD 387008 (200 mg/kg/24 h im Futter) oder einem Placebo behandelt

wurden. Tiere aus der Gruppe ZDF-lean erhielten ebenfalls ein Placebo für den

Zeitraum von 16 Wochen.

Somit ergab sich die in Tabelle 3 gezeigte Gruppeneinteilung.

Tabelle 3: Gruppeneinteilung

Gruppe Behandlung

Behandlungszeitraum,

Versuchsdauer Gruppengröße

ZDF-lean ZDF-lean, unbehandelt Woche 1-10, Versuchsende nach

10 Wochen

N=10

ZDF-fatty ZDF-fatty, unbehandelt Woche 1-10, Versuchsende nach

10 Wochen

N=10

ZDF-L-P ZDF-lean, Placebogabe Woche 10-16, Versuchsende nach

26 Wochen

N=10

ZDF-F-P ZDF-fatty, Placebogabe Woche 10-16, Versuchsende nach

26 Wochen

N=10

ZDF-F-Met ZDF-fatty, Behandlung mit

Metformin

Woche 10-26, Versuchsende nach

26 Wochen

N=10

ZDF-F-EMD ZDF-fatty, Behandlung mit

EMD 387008

Woche 10-26, Versuchsende nach

26 Wochen

N=10


Das Experiment endete nach 10 bzw. 26 Wochen mit einer retrograden

Perfusionsfixation der Organe (vgl. Abschnitt 3.6).

Ziel des Versuchsaufbaus war ein Vergleich der renalen Schädigung zwischen der mit

EMD 387008 behandelten Gruppe (ZDF-F-EMD), der mit Metformin behandelten

Gruppe (ZDF-F-Met) und der mit Placebo behandelten Gruppe (ZDF-F-P) bezüglich

ihrer physiologischen, biochemischen und histologischen Parameter. Eine

Verlaufsbeurteilung wurde möglich durch den Vergleich der unbehandelten Gruppen

(ZDF-lean, ZDF-fatty) mit den mit Placebo behandelten Gruppen (ZDF-L-P, ZDF-F-P).

Die unbehandelten Gruppen wurden ausschließlich histologisch untersucht.

3.3 Versuchsbedingungen

Die Tierversuche wurden unter kontrollierten äußeren Bedingungen durchgeführt: die

Raumtemperatur betrug 21-24 °C und die relative Luftfeuchte lag zwischen 45 und

60 %. Auf Grund einer automatischen Lichtanlage konnte den Tieren ein künstlicher

Tag-Nacht-Rhythmus von jeweils 12 Stunden Tag und 12 Stunden Nacht auferlegt

werden. Wasser und Futter in Form einer Kliba/Nafag-Diät (Provimi Kliba/Nafag Nr.

3433, Kaiseraugst, Schweiz) erhielten sie ad libitum.

3.4 Behandlung der Tiere

3.4.1 Medikamentenbeschreibung

Zehn Tiere der Gruppe ZDF-fatty wurden mit Metformin (Glucophage®, Merck,

Darmstadt, Deutschland) behandelt, einem Antidiabetikum aus der Gruppe der

Biguanide, die vor mehr als 40 Jahren in die Diabetestherapie eingeführt wurden.

Der genaue Wirkmechanismus dieser Stoffklasse ist bislang ungeklärt. Diese Stoffe

wirken nur in Gegenwart von Insulin, also bei genügender Produktion, jedoch

mangelnder Wirkung dieses Hormons an den Zielorganen, was typisches Kennzeichen

eines Typ-2-Diabetes ist. Metformin verbessert die Diabeteseinstellung durch eine

Verminderung der Insulinresistenz vorwiegend an der Leber und zusätzlich im Bereich

der Muskulatur, während die pankreatische Betazellsekretion nicht gesteigert wird [31].

Das Biguanid passiert als protoniertes Kation die innere Mitochondrienmembran von

Hepatozyten, reichert sich stark in der mitochondrialen Matrix an und verursacht von

dort aus eine Hemmung der Atmungskette. Dies führt zu einer Abnahme der oxidativen

Phosphorylierung und einem gleichzeitigen Anstieg der cytosolischen AMP-


Konzentration als Folge des Adenylatcyclase-Gleichgewichts. AMP stimuliert nun die

AMP-aktivierte Proteinkinase. Dies resultiert in einer Hemmung von Enzymen, die an

der Produktion von Glucose und Triglyceriden beteiligt sind und in einer verminderten

Expression von Genen, die in die Lipidsynthese involviert sind. Dies erklärt sowohl die

blutzuckersenkende Wirkung des Metformins als auch eine Minderung der Triglycerid-

und VLDL-Werte im Blut [5].

Nach oraler Gabe wird Metformin langsam und unvollständig resorbiert. Die

Bioverfügbarkeit beträgt nur 50-60 %, weil Metformin nicht metabolisiert, sondern

unverändert über die Niere ausgeschieden wird. Die Plasmahalbwertszeit beträgt 1,5-

4,5 Stunden. Das Biguanid wird zu weniger als 10 % an Plasmaeiweiß gebunden, wobei

sein Verteilungsvolumen 1 bis 4 l/kg beträgt. Ein geringer Anteil des resorbierten

Metformins wird in ein tiefes Kompartiment verteilt und hieraus mit einer Halbwertszeit

von 9 bis 19 Stunden eliminiert. Im Gegensatz zur sofortigen Wirkung von

Sulfonylharnstoffen setzt der blutglukosesenkende Effekt von Metformin erst nach

einigen Applikationstagen ein.

Das Medikament wird vor allem bei übergewichtigen Patienten (BMI > 25 bis 27

kg/m²) mit Diabetes mellitus Typ 2 eingesetzt, bei denen ein Therapieversuch mit

Gewichtsabnahme und Diät nicht zum Erreichen der HbA1c-Zielwerte geführt hat [1].

Durchschnittlich kommt es hier zu einer Blutglukosesenkung um 20 %, welche jedoch

nicht auf übergewichtige Patienten beschränkt ist, sondern auch bei Patienten mit

normalem Körpergewicht (BMI 24 bis 25 kg/m²) beobachtet werden kann [10].

Im Hinblick auf die blutglukosesenkende Wirkung ist Metformin mit den ebenfalls breit

eingesetzten Sulfonylharnstoffen vergleichbar [12, 49]. Von dieser Stoffklasse hebt sich

Metformin jedoch durch das fehlende Auftreten von Hypoglykämien sowie durch

seinen gewichtsregulierenden Effekt vorteilhaft ab [49].

Eine Sonderstellung nimmt Metformin bei der Wirkung auf diabetestypische

Komplikationen ein: die UKPD-Studie zeigt, dass eine verbesserte Diabeteskontrolle

durch Metformin zu einer signifikanten Reduktion mikrovaskulärer Komplikationen

führt [2], wobei die Risikoreduktion in allen Therapiegruppen (Sulfonylharnstoffe,

Metformin und Insulin) statistisch nicht signifikant unterschiedlich war.

Makrovaskuläre Komplikationen wie Schlaganfall, koronare Ereignisse und

diabetesbezogener Tod wurden dagegen nur durch Metformin signifikant reduziert [1].

Da die HbA1c-Reduktion unter einer Therapie mit Sulfonylharnstoffen, Metformin und

Insulin vergleichbar war, scheint der vasoprotektive Effekt von Metformin in der


UKPD-Studie unabhängig von der Blutglukosesenkung zu sein und auf zusätzlichen

Faktoren zu beruhen. Dazu gehört etwa die günstige Beeinflussung der bekannten

Risikofaktoren für Atherosklerose wie Hyperglykämie, Dyslipidämie, gesteigerte

Thrombozytenaggregation und endotheliale Dysfunktion durch diese Substanz [31].

Gleichwohl geht man von einem zusätzlichen Effekt von verbesserter Stoffwechsel-

kontrolle und verminderter Insulinresistenz auf die Gefäßprotektion aus [10].

Neben seinen Effekten auf den Blutglucosespiegel, wirkt Metformin auch auf andere

metabolische Parameter (vgl. Tabelle 4).

Tabelle 4: Effekte von Metformin auf Komponenten des Insulinresistenzsyndroms (vgl. [31])

Änderung gegenüber Ausgangswert

Berichtete Effekte Bereich %

Effekte auf die Diabeteseinstellung

Nüchternblutglukose (mmol/l) � 2-4 � 20-30

Postprandiale Blutglukose

(mmol/l)

� 3-6 � 30-40

HbA1c (%) � 1-2 � 10-25

Effekt auf Insulinspiegel

Nüchtern-Plasmainsulinspiegel

(µU/ml)

� 0-3,50 � 0-20

Effekte auf Lipidstoffwechsel

Serumtriglyceride (mmol/l) � 0-0,10 � 0-30

Serumcholesterin (mmol/l) � 0-0,35 � 0-10

Serum-LDL-Cholesterin (mmol/l) � 0-1,00 � 0-25

Serum-VLDL-Cholesterin

(mmol/l)

� 0-0,60 � 0-39

Serum-HDL-Cholesterin

(mmol/l)

� 0-0,16 � 0-17

Freie Fettsäuren (mmol/l) � 0-0,15 � 0-14

Effekt auf vaskuläre und

Hämostaseparameter

Blutdruck (mmHg) Keine Änderung Keine Änderung

PAI-1-Spiegel (ng/ml) � 10-15 � 10-45

Peripherer Blutfluss (ml/100ml

Gewebe /min)

� 0-1,0 � 0-25

Effekt auf das Körpergewicht (kg) � 0-4 � 0-6


Es konnte nachgewiesen werden, dass unter einer Metformin-Therapie ein signifikanter

Anstieg von HDL-Cholesterin sowie ein Abfall von VLDL-Triglyzeriden zu beobachten

ist.

Auch ein antithrombotischer Effekt konnte für Metformin beobachtet werden. In zwei

Studien zeigte sich unter Metformin-Therapie ein signifikanter Abfall der

thrombusstabilisierenden Serinprothease PAI-1, assoziiert mit einer Senkung der

Triglyzeride. Ein zusätzlicher antithrombotischer Effekt von Metformin wurde durch

eine günstige Beeinflussung der gesteigerten Thrombozytenaggregation belegt [1, 12].

Darüber hinaus wurde unter Metformin über eine signifikante Verminderung der AGE-

Bildung um 25 % bei niedriger und 72 % bei hoher Metformindosis berichtet [31].

Als Nebenwirkungen einer Metformintherapie treten besonders zu Beginn der

Behandlung Übelkeit, Magendruck, Blähungen, Durchfälle und metallischer

Mundgeschmack auf. Am häufigsten sind Appetitlosigkeit und Magendruck,

wohingegen Durchfälle relativ selten sind. Bei einer Langzeittherapie kann es zur

herabgesetzten Resorption von Vitamin B 12 und Folsäure kommen. Die gefährlichste

Nebenwirkung ist jedoch die Laktatazidose (Blut-pH < 7,25, Laktatkonzentration > 5

mmol/l) [42]. Ihre Inzidenz unter Metformin beträgt 0,01-0,08 Fälle/1000

Patientenjahre bei einem Mortalitätsrisiko von bis zu 50 % [12]. Es sind daher

bestimmte Kontraindikationen beim Einsatz dieses Medikaments zu beachten. Dazu

gehört die mangelnde Eliminationsfähigkeit des Metformins durch den Organismus bei

Niereninsuffizienz oder eine stark eingeschränkte Stoffwechsellage. Das Medikament

sollte daher bereits bei einem Kreatininwert von über 1,5 mg/dl bei Männern und über

1,4 mg/dl bei Frauen sowie bei anderen Zuständen, die zur Stoffwechselentgleisung mit

Gefahr der Laktatazidose prädisponieren (Reduktionskost, Infekte, Neoplasien,

eingeschränkte Leberfunktion, kardiorespiratorische Insuffizienz, Hypoxie), nicht

angewendet werden [12].

Das Medikament EMD 387008 (EMD) wurde von der Firma Merck® als orales

Antidiabetikum mit einem dem Metformin vergleichbaren Wirkspektrum bei besserer

metabolischer Verträglichkeit entwickelt. Der Wirkmechanismus ist noch nicht

vollständig aufgeklärt.


3.4.2 Verabreichung der Medikamente

Die medikamentös behandelten Versuchstiere erhielten ab der 10. Woche täglich 150

mg/kg Körpergewicht Metformin bzw. 200 mg/kg Körpergewicht EMD im Futter. In

gleicher zeitlicher Anordnung wie die Tiere der Medikamentengruppen wurde den

Tieren der Vergleichsgruppen das Placebo verabreicht. Die Behandlung wurde über 16

Wochen fortgesetzt.

3.5 Laboranalyse

3.5.1 Urinanalyse

Für die Sammlung eines 24-h-Urins wurden die Tiere in einem metabolischen Käfig

untergebracht, der eine stuhlfreie Sammlung des Urins ermöglichte.

Folgende Parameter wurden im Urin analysiert:

• Glucose

• Kreatinin und Harnstoff

• Kreatinin-Clearance (Berechnung unter Zuhilfenahme der Parameter Plasma-

und Urinkonzentration von Kreatinin)

• Albumin-Exkretion

• Um eine Verfälschung der Ergebnisse für die Albumin-Exkretion durch

Unterschiede in der Diuresemenge vorzubeugen, wurde zusätzlich der Parameter

„Albumin-Exkretion pro Kreatininausscheidung“ (µg/µg Kreatinin) berechnet.

3.5.2 Serum- und Plasmaanalyse

Die Blutentnahme erfolgte bei der Perfusion aus der Bauchaorta unter Thiopental-

Narkose in Li-Heparin und K2EDTA-Röhrchen, die mit 3000 rpm bei 4°C für 10

Minuten zentrifugiert wurden.

Das Plasma wurde umgehend untersucht auf:

• Kreatinin, Cholesterin, LDL-Cholesterin, HDL-Cholesterin, Natrium, Kalium,

Calcium, Chlorid, Laktat

• Glucose, Serum-Insulin, HbA1c


3.6 Fixation und Gewebeaufbereitung

3.6.1 Perfusionsfixation

Die Perfusionsfixation wurde nach einem im Labor des Pathologischen Instituts der

Universität Erlangen-Nürnberg entwickelten standardisierten Verfahren durchgeführt

[8]. Nach einer Vornarkotisierung mit Äther wurden die Tiere mit einem Gemisch aus

0,4 ml Rompun® 2 % und 1,6 ml Ketavet®, in der Konzentration 100 mg/ml,

vollnarkotisiert. Dazu wurden die beiden Medikamente mit 2 ml NaCl 0,9 % verdünnt

und den Tieren pro 10 g Körpergewicht ca. 0,1 ml dieser Lösung i.m. gespritzt.

Anschließend wurde der Bauchraum der Tiere über einen medianen Längsschnitt

eröffnet und die Aorta abdominalis katheterisiert. Nun wurde das Gefäßsystem des

Tieres etwa zwei Minuten mit Dextran 40 (Rheomakrodex®) unter Zusatz von 2 %

Novocain gespült. Dextran 40 fungierte hierbei als hyperonkotische Lösung, die durch

Weitstellung der Gefäße die Ausbildung eines artifiziellen Ödems des Interstitiums

verhindern und einer thrombotischen Verlegung der perfundierten Gefäße

entgegenwirken sollte. Um einen Abfluss der Perfusionslösung zu gewährleisten und

einen übermäßigen Druckanstieg innerhalb der Gefäße zu verhindern, wurde

unmittelbar nach Beginn der Perfusionsbehandlung die Vena Cava eröffnet. Danach

wurde das Gefäßsystem zunächst mit 0,9 % NaCl und anschließend bei einem

Perfusionsdruck von 110 mmHg mit 3%igem Glutaraldehyd in 0,2 molarer Phosphat-

pufferlösung gespült. Nach der Perfusionsfixation wurden die Organe entnommen und

nach einer Gewichtsbestimmung in 3%igem Glutaraldehyd und 0,2 molarer

Phosphatpufferlösung eingelagert.

3.6.2 Histologische Gewebeaufbereitung

Zur Gewebaufbereitung wurden die in Pufferlösung eingelagerten Nieren von ihren

Faszien gereinigt, gewogen und anschließend senkrecht zu ihrer Interpolarachse in ca.

1,5-2 mm dicke Scheiben geschnitten. Mittels des „Area weighted sampling“-

Verfahrens [60] wurden aus diesen Scheiben pro Niere 10 kleine Rindenstücke

ausgewählt: auf ein Gitter mit 99 Punkten wurden die 10 Nierenscheiben zufällig

platziert und diejenigen Rindenanteile bestimmt, die auf Gitterpunkte zufällig gezogener

Koordinaten fielen. Hieraus schnitt man mit einer scharfen Rasierklinge sektorförmige

Rindenanteile (ca. 2x2x2 mm³), die dann als Material für die Semidünnschnitttechnik


dienten. Aus den verbleibenden Nierenquerschnittsscheiben wurden Paraffinschnitte

angefertigt.

3.6.2.1 Paraffinschnitttechnik

Die gemäß Abschnitt 3.6.2 gewonnenen Nierenscheiben wurden in Sörensenpuffer (pH

7,2-7,4) gewaschen und in aufsteigender Isopropanol-Reihe und anschließend in einem

Intermedium dehydriert. Nach Einbettung der Präparate in Einbettkassetten wurde das

Gewebe mit Paraffin ausgegossen und auf einem Rotations-Mikrotom (Leica RM 2145,

Wetzlar, Deutschland) in 1 µm dicke Scheiben geschnitten. Diese wurden dann mit

Hämatoxylin-Eosin (HE), Periodic Acid Schiff Reaktion (PAS) und Siriusrot, einer

speziellen Bindegewebsfärbung, gegengefärbt.

3.6.2.2 Semidünnschnitttechnik

Die durch „Area weighted sampling“ (vgl. Abschnitt 3.6.2) gewonnenen

Nierensektoren wurden gemäß des in Abschnitt 3.6.2.1 erläuterten Verfahrens

gewaschen, in 1%igem Osmiumtetroxid nachfixiert, entwässert und in Epon-Araldit

eingebettet. Danach folgte eine Aushärtungsperiode von 18 bis 20 Stunden bei 70°C im

Brutschrank. Im Anschluss wurde eine zufällige Auswahl 5 fertiger Eponblöcke bis zu

der Tiefe angetrimmt, in der man erstes Gewebe antraf. Mit einem Rotations-Mikrotom

(Leica RM 2145, Wetzlar, Deutschland) wurden Schnitte mit einer Dicke von 1 µm

hergestellt und anschließend hitzefixiert. Diese wurden auf einem Objektträger zunächst

mit Fuchsin beschichtet und anschließend mit Methylenblau gegengefärbt.

3.7 Auswertung

3.7.1 Semiquantitative Untersuchungen der Glomerula hinsichtlich ihres Schädigungsausmaßes

3.7.1.1 Glomeruloskleroseindex (GSI)

Der Glomeruloskleroseindex (GSI) erlaubt eine Quantifizierung der glomerulären

Schädigung hinsichtlich einer Proliferation von Mesangiumzellen und Sklerosierung der

mesangialen Matrix. Dazu wurden die PAS-gefärbten Paraffinschnitte in 400-facher

Vergrößerung unter dem Lichtmikroskop (Standard 25, Firma Zeiss, Oberkochen,

Deutschland) mäanderförmig durchfahren und pro Tier 100 Glomerula beurteilt.


Wie in Tabelle 5 zu sehen, wurde das Schädigungsausmaß jedes Glomerulums gemäß

der Methode von El Nahas et al. [24] in 5 verschiedenen Stadien angegeben:

Tabelle 5: Stadien der Glomerulosklerose

Stadium Histologische Veränderungen

Anteil der Veränderungen des Konvoluts

0 Normales Glomerulum 0 %

1 Mesangiale Verdickung mit und ohne Proliferation von Mesangiumzellen.

Keine Kapillarbeteiligung. < 25 %

2 Mesangiale Proliferation mit partieller

Gefäßwandbeteiligung. Segmentale Sklerose.

< 50 %

3 Obliteration eines Großteils der Kapillaren

durch mesangiale Proliferation oder Narbenformation. Diffuse Sklerose.

< 75 %

4 Totale Obliteration der Kapillaren mit oder ohne Kapillarthrombose. Globale Sklerose

mit Kapillarkollaps. 100 %

Aus den 100 Einzelwerten lässt sich der Glomeruloskleroseindex wie folgt berechnen:

43210

43210 )4()3()2()1()0(

nnnnn

nnnnnGSI

++++⋅+⋅+⋅+⋅+⋅

= (1)

(n0, n1, n2, n3, n4: Anzahl der Glomerula mit Stadium 0 bis 4)

3.7.1.2 Mesangiolyseindex (MSI)

Neben dem GSI dient auch der Mesangiolyseindex (MSI) der Erfassung eines

glomerulären Schadens. Wiederum an PAS-gefärbten Paraffinschnitten beurteilte man

hierfür den Verlust an Mesangiumzellen und die damit einhergehenden

Kapillaraussackungen unter dem Lichtmikroskop bei 400-facher Vergrößerung.

Einhundert Glomerula wurden untersucht und das Ausmaß ihrer Schädigung 5

verschiedenen Stadien zugeordnet (siehe Tabelle 6).

Tabelle 6: Stadien der Mesangiolyse

Stadium Histologische Veränderungen Anteil der Veränderung des Konvoluts

0 Keine Veränderung der Kapillaren 0 % 1 Erweiterung einzelner Kapillaren <25 %


2 Erweiterung von Kapillaren

ODER Kapillaraneurysma

> 25 %

< 50 % 3 Kapillaraneurysma 50 – 75 % 4 Kapillaraneurysma > 75 %

Der Mesangiolyseindex errechnet sich aus den 100 Einzelwerten wie folgt:

43210

43210 )4()3()2()1()0(

nnnnn

nnnnnMSI

++++⋅+⋅+⋅+⋅+⋅=

(2)

(n0, n1, n2, n3, n4: Anzahl der Glomerula mit Stadium 0 bis 4)

3.7.1.3 Tubulointerstitieller Schädigungsindex (TSI )

Zur Beurteilung tubulärer und interstitieller Veränderungen wurden die Sirius-gefärbten

Präparate unter dem Lichtmikroskop bei 200-facher Vergrößerung mäanderförmig

durchfahren und pro Niere jeweils 40 Gesichtsfelder in der Mark-Rinden-Grenze

beurteilt. Eine Einteilung in 4 Schweregrade erfolgte nach der Methode von Véniant et

al. [75] (vgl. Tabelle 7).

Tabelle 7: Stadien der tubulointerstitiellen Schädigung

Stadium Histologische Veränderungen

Anteil der tubulointerstitiellen Schädigung am Gesichtsfeld

0 Normales Tubulussystem 0 %

1 Zeichen einer interstitiellen Entzündung und Fibrose, tubuläre Atrophie

< 25 %

2 Zeichen einer interstitiellen Entzündung und Fibrose, tubuläre Atrophie und Dilatation

25 – 50 %

3 Zeichen einer interstitiellen Entzündung und Fibrose, tubuläre Atrophie und Dilatation

> 50 %

Aus den 40 Einzelwerten lässt sich der tubulointerstitielle Schädigungsindex (TSI) wie

folgt berechnen:

3210

3210 )3()2()1()0(

nnnn

nnnnTSI

+++⋅+⋅+⋅+⋅

= (3)

(n0, n1, n2, n3: Anzahl der bestimmten Gesichtsfelder mit Stadium 0 bis 3)


3.7.1.4 Vaskulärer Schädigungsindex (VSI)

Auch vaskuläre Veränderungen sind Marker, die auf eine Schädigung des Glomerulums

hinweisen. Entscheidend ist dabei das Ausmaß der Gefäßwandverdickung und der

fibrinoiden Nekrose der Aa. arcuatae, der Aa. interlobulares und der Kapillaren im

Nierenrindenbereich. Unter dem Lichtmikroskop wurden dabei in 200-facher

Vergrößerung 40 Gesichtsfelder pro Tier untersucht. Gemäß der Methode von Véniant

et al. [75] erfolgte die Einteilung in 5 Stadien (vgl. Tabelle 8).

Tabelle 8: Stadien der vaskulären Schädigung

Stadium Histologische Veränderungen Gefäßwandverdickung 0 Normale Gefäße 0 %

1 Geringe Gefäßwandverdickung < 25 %

2 Moderate Gefäßwandverdickung 25 – 50 %

3 Schwere Gefäßwandverdickung > 50 %

4 Fibrinoide Nekrose der Gefäße

Der Vaskuläre Schädigungsindex (VSI) errechnet sich aus den 40 Einzelwerten wie

folgt:

43210

43210 )4()3()2()1()0(

nnnnn

nnnnnVSI

++++⋅+⋅+⋅+⋅+⋅= (4)

(n0, n1, n2, n3, n4: Anzahl der Gefäße mit Stadium 0 bis 4)

3.7.2 Morphometrische und stereologische Untersuchu ng der Glomerula

3.7.2.1 Morphometrie und Stereologie

Morphometrie (griechisch: Gestaltmessung) und Stereologie (griechisch: Raumlehre)

sind Begriffe aus der Naturwissenschaft und bezeichnen Verfahren, die bei der

Beschreibung räumlicher Strukturen Verwendung finden.

Morphometrische Verfahren dienen der quantitativen Analyse von Partikeln und

Strukturelementen [57]. Mit Hilfe stereologischer Methoden ist es möglich, aus

zweidimensionalen Abbildungen dreidimensionaler Strukturen Informationen über

deren dreidimensionale Struktur zu erhalten [78, 79]. Ermöglicht wird dies durch die

Gesetze der geometrischen Wahrscheinlichkeit, wonach sich eine dreidimensionale

Struktur anhand ihrer zufällig getroffenen zweidimensionalen Abschnitte abbildet. Das


bedeutet, dass nach adäquatem „Sampling“ Aussagen über die räumliche Struktur eines

Gewebes im histologischen Schnittpräparat gemacht werden können.

3.7.2.2 Punktezählverfahren

Ein Beispiel für die Anwendung stereologischer Verfahren gibt das Delesse’sche

Prinzip [22], das besagt, dass die volumetrische Zusammensetzung eines Gewebes,

unabhängig von seiner Orientierung, direkt in der Flächenzusammensetzung der

Schnittflächen repräsentiert ist. Somit kann das Volumen einer Struktur anhand eines

histologischen Schnittes durch das sog. Punktezählverfahren ermittelt werden. Dazu

wurde im aktuellen Versuch ein 10er Okular mit einer Integrationsplatte (Firma

Olympus, Hamburg, Deutschland), auf dem sich ein quadratisches Gitter mit 121

symmetrisch verteilten Punkten befand, verwendet. Durch das Okular projizierte sich

das Messgitter auf den jeweiligen histologischen Schnitt.

Der gemessene zweidimensionale Flächenanteil AA einer Struktur entspricht nun,

gemäß des Delesse’schen Prinzips, ihrem Volumenanteil VV. Damit ergibt sich folgende

Formel:

AA = VV (5)

Es kann gefolgert werden, dass die Zahl der gezählten Punkte PP eines Messgitters, die

auf das zu messende Gewebe projiziert werden, deren Flächenanteil entspricht. Somit

ergibt sich:

PP = AA (6)

PP steht dabei für die Anzahl der gezählten Punkte des Messgitters, die zufällig auf die

zu vermessende Struktur fallen, im Verhältnis zur Gesamtpunktzahl des Gitters.

Aus den beiden oben genannten Formeln ergibt sich dann:

PP = AA = VV (7)

Das bedeutet, dass der Volumenanteil VV dem Anteil der Trefferpunkte PP, bezogen auf

die Gesamtpunktzahl, entspricht.


3.7.2.3 Morphometrische Untersuchung des glomerulär en Umfangs, der Fläche, des Volumens sowie des minimalen und maxima len Durchmessers an Paraffinschnitten

Mit Hilfe eines halbautomatischen Bildanalysesystems (Analysis Pro, SIS, Münster,

Deutschland) wurden an PAS-gefärbten Paraffinschnitten in 400-facher Vergrößerung

planimetrische Untersuchungen der oben genannten glomerulären Parameter

durchgeführt. Dabei wurde der Leuchtpunkt einer Steuerungsmaus über ein

Spiegelsystem des Mikroskops in den Strahlengang projiziert. Damit konnte die zu

vermessende Struktur umfahren und markiert werden. Unter mäanderförmigem

Abfahren der Nierenrinde konnte auf diese Weise von 50 Glomerula pro Tier der

Umfang der Kapillarknäuel manuell umfahren und mit Hilfe des angeschlossenen

Bildanalysesystems die glomeruläre Fläche berechnet werden. Auch der minimale und

maximale Durchmesser eines Glomerulums konnten auf diese Art bestimmt werden.

Das Volumen eines Glomerulum konnte anhand folgender Formel aus der Fläche

bestimmt werden:

[ ] 3/2²)(04,1

38,1mmFläche⋅ = Volumen in mm³ (8)

3.7.2.4 Morphometrische Untersuchung des Kapillarko nvoluts und der glomerulären Zellen an Semidünnschnitten

An den gemäß Abschnitt 3.6.2.2 angefertigten Semidünnschnitten wurden quantitative

Untersuchungen der Feinstruktur der Glomerula durchgeführt. Unter dem

Lichtmikroskop wurden pro Tier zufällig 20 Glomerula ausgewählt und in 1000-facher

Vergrößerung unter Verwendung von Immersionsöl ausgewertet.

Zunächst wurde die Anzahl folgender Zellen und Strukturen ausgezählt:

- Podozyten

- Mesangiumzellen

- Endothelzellen

- Parietalzellen

- Kapillaranschnitte


Außerdem wurden, gemäß des unter Abschnitt 3.7.2.2 erläuterten Punktezählverfahrens,

pro Glomerulum die Anzahl der Gitterpunkte des Zählgitters ermittelt, die jeweils auf

eine der folgenden Strukturen entfiel:

- Podozyten

- Mesangiumzellen

- Endothelzellen

- Parietalzellen

- Kapillaranschnitte

- Bowman-Kapselraum

- Mesangiale Matrix

Bei Auszählung am Gitterrand liegender Zellen wurden nur 2 der 4 Außenseiten in

Betracht gezogen. Glomerula, deren Größe das Gitter überschritt, wurden getrennt

ausgewertet, indem man das Gitter auf die Überschnittfläche erneut ansetzte und den

Überschnitt auszählte.

Nach den oben erwähnten Messungen konnten mit Hilfe der in den folgenden

Abschnitten dargestellten Formeln die morphometrischen Eigenschaften der Glomerula

und bestimmter Zelltypen ermittelt werden.

Die Fläche der dabei verwendeten Integrationsplatte mit 121 (11x11) Gitterpunkten

betrug entsprechend der 1000-fachen Vergrößerung 9,801 ⋅ 10-3 mm².

Längendichte der Kapillaren

Eine Berechnung der Längendichte der Kapillaren setzt die Kenntnis der Anzahl der

Kapillaranschnitte pro Fläche Kapillarkonvolut (QA) voraus. Diese wird ermittelt aus

der Anzahl der Kapillaranschnitte pro Glomerulum (nkap) im Verhältnis zur Fläche des

Kapillarkonvoluts Akon:

QA = nkap / Akon [1/mm²] (9)

Akon errechnet sich aus der Gesamtzahl der Gitterpunkte, die auf das Kapillarkonvolut

entfallen (GPkon), und der Gitterfläche.


Akon = (GPkon/121) ⋅ 9,801 ⋅ 10-3 [mm²] (10)

GPkon schließt dabei alle Gitterpunkte, die auf Endothelzellen (ez), Podozyten (pz),

Mesangiumzellen (mz), Kapillaranschnitte (kap) und mesangiale Matrix (mm) entfallen,

ein. Es ergibt sich somit:

GPkon = GPez + GPpz + GPmz + GPkap + GPmm (11)

Volumendichte der Kapillaren

Das Verhältnis von Gitterpunkten, die auf Kapillaranschnitte entfielen (GPkap), zur

Gesamtzahl der Gitterpunkte, die auf dem Kapillarkonvolut zu liegen kamen, entspricht

der Volumendichte der Kapillaren (Vvkap ).

Es ergibt sich somit folgende Formel:

Vvkap = (GPkap/ GPkon) ⋅ 100 [%] (12)

Mittlere Kapillarquerschnittsfläche

Aus der Volumendichte der Kapillaren kann die mittlere Kapillarquerschnittsfläche a

ermittelt werden. Da Vvkap in Prozent angegeben wird, ist eine Multiplikation mit 0,01

nötig.

a = (Vvkap / L vkap) ⋅ 0,01 ⋅ 106 [µm²] (13)

Volumendichte der jeweiligen Zellart

Die Volumendichte der jeweiligen Zellart pro Glomerulum (VvZellen) entspricht dem

Verhältnis der Gitterpunktzahl, die auf die jeweilige Zellart entfallen (GPZellen), zu der

sich auf das gesamte Konvolut projizierenden Gitterpunktzahl (GPkon):

VvZellen = GPZellen / GPkon ⋅ 100 [%] (14)

Die Volumendichte wurde für Podozyten, Mesangiumzellen und Endothelzellen

bestimmt.


Gezählte Zellart pro Fläche

Die Anzahl der gezählten Zellen pro Glomerulumfläche (nAZellen) wird wie folgt

berechnet:

nAZellen = n Zellen /Akon [1/mm²] (15)

nZellen steht dabei für die ausgezählte Zellzahl der jeweiligen Zellart (Podozyten,

Mesangiumzellen und Endothelzellen) pro Glomerulum.

Gesamtvolumen der jeweiligen Zellart

Aus der Volumendichte der jeweiligen Zellart (VvZellen) und dem mittleren

glomerulären Volumen (Vglom semi) kann das Gesamtvolumen der jeweiligen Zellart

(VgesZellen) bestimmt werden. Da die Volumendichte in Prozent angegeben wird, muss

auch hier der Faktor 0,01 in die Formel einfließen:

VgesZellen = VvZellen ⋅ Vglom semi ⋅ 0,01 [10³µm³] (16)

Es wurde das Gesamtvolumen von Podozyten, Mesangiumzellen und Endothelzellen

berechnet.

Vglom semi wurde dabei wie folgt ermittelt

Vglom semi = (β/κ) x Akon 3/2 ⋅ 106 [10³ µm³] (17)

Dabei ist κ der Größenkoeffizient der untersuchten Strukturen und hat, in Abhängigkeit

von Form und Volumendichte, in diesem Fall den Wert 1,04. Der Koeffizient β fungiert

als Formfaktor, der die Gestalt der gemessenen Partikel beschreibt und der für die

annähernd sphärische Form der Glomerula 1,38 beträgt [56].

Nummerische Dichte der jeweiligen Zellart pro Konvo lutvolumen

Folgende Gleichung gilt für die Berechnung der nummerischen Dichte einer Zellart pro

Konvolutvolumen (NVZellen) :

NVZellen = (κ /β) ⋅ [nAZellen3/2/ (VvZellen ⋅ 0,01)1/2] [1/mm³] (18)


Der Koeffizient κ hat stets den Wert 1,04, während β für Mesangium- und

Endothelzellen den Wert 1,4 und für Podozyten den Wert 1,5 besitzt.

Gesamtzahl der jeweiligen Zellart

Aus der nummerischen Dichte der Zellen (NVZellen ) und dem mittleren glomerulären

Volumen (Vglom semi ) kann die Gesamtzahl der jeweiligen Zellart (ngesZellen) ermittelt

werden:

ngesZellen = NVZellen ⋅ Vquer glom / 106 (19)

Gesamtzahl der Zellen pro Glomerulum

Aus der Addition der Zellzahlen aller Zellarten (Podozyten, Mesangiumzellen und

Endothelzellen) ergibt sich die Anzahl aller Zellen eines Glomerulums:

ngesGlom = ngesPod + ngesMes + ngesEnd (20)

Durchschnittliches Volumen der jeweiligen Zellart

Das durchschnittliche Volumen (VZellen) der jeweiligen Zellart wird folgendermaßen

berechnet:

VZellen = VgesZellen/ ngesZellen [10³µm³] (21)

3.8 Statistik

Von sämtlichen gemessenen und errechneten Parametern aller sechs Versuchsgruppen

wurden im Rahmen einer statistischen Untersuchung zunächst Mittelwerte und

Standardabweichungen der jeweiligen Gruppe ermittelt. Diese wurden computergestützt

mit Hilfe des Statistikprogramms SPSS (Version 15.0, SPSS Inc., Chicago, Illinois,

USA) verglichen und auf signifikante Unterschiede hin untersucht.


Dabei wurden die Messwerte auf Normalverteilung und Homogenität getestet. Als

normalverteilt und homogen galten die Werte, wenn sie in der Darstellung als Boxplots

diesen Kriterien entsprachen.

Für die Mehrfachvergleiche zwischen den verschiedenen Gruppen wurde bei nicht

normalverteilten bzw. nicht homogenen Werten der Kruskal-Wallis-Test eingesetzt. Ein

signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen wurde für eine Irrtumswahrschein-

lichkeit (p) ein Wert von kleiner als 0,05 angenommen. War dieser gegeben, wurde

anschließend ein paarweiser Gruppenvergleich mit Hilfe des nicht-parametrischen

Wilcoxon-Rangsummentests (U-Test) durchgeführt. Signifikanz wurde auch hier

angenommen, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit (p) unter 0,05 lag.

Unterschiede zwischen den nicht diabetogenen Gruppen ZDF-lean/ZDF-L-P und den

diabetogenen ZDF-fatty/ZDF-F-P/-Met/-EMD wurden wegen der mangelnden

Vergleichbarkeit der unterschiedlichen Genotypen nicht berücksichtigt und nur in

bestimmten Graphiken zur Verdeutlichung mit angegeben. Auf Differenzen zwischen

den Paaren ZDF-lean und ZDF-fatty sowie zwischen ZDF-L-P und ZDF-F-P wird in

den Wertetabellen verwiesen, sie werden jedoch der Übersichtlichkeit halber nicht

graphisch dargestellt.


37 Ergebnisse

4 Ergebnisse

Die in dieser Arbeit vorgestellten histopathologischen Parameter wurden für die Tiere

aller Gruppen in eigenen Untersuchungen ermittelt, während die laborchemischen

Untersuchungsdaten von den Laboratorien der Firma Merck® (Darmstadt, Deutschland)

zur Verfügung gestellt und nur für die Tiere der Gruppen ZDF-L-P, ZDF-F-P, ZDF-F-

Met und ZDF-F-EMD erhoben wurden. Die Daten zu Körpermaßen der Tiere, die

ebenfalls durch die Firma Merck® ermittelt wurden, standen für die Tiere aller Gruppen

zur Verfügung.

Die Zahl der untersuchten Tiere pro Gruppe unterschied sich bei den jeweiligen

Parametern. Bei den an Semidünnschnitten untersuchten Größen wurden jeweils vier

Tiere pro Gruppe ausgewertet, während für die an Paraffinschnitten durchgeführten

Messungen folgende Gruppengrößen zur Verfügung standen:

- ZDF-lean: n = 10

- ZDF-fatty: n = 9

- ZDF-L-P: n = 8

- ZDF-F-P: n = 8

- ZDF-F-Met: n = 10

- ZDF-F-EMD: n = 9

Die Differenz zwischen den Gruppengrößen bei Versuchsbeginn und den tatsächlich

ausgewerteten Tieren entstand durch den vorzeitigen Tod von Versuchstieren sowie

durch Organpathologien und Artefakte bei der Gewebeaufbereitung, die eine adäquate

Auswertung verhinderten.

Die Labordaten und Tierparameter waren bis auf die Gruppe ZDF-L-P, die nur 9 Tiere

umfasste, vollständig (10 Tiere pro Gruppe). Standen für den statistischen Vergleich bei

einzelnen Parametern weniger Tiere pro Gruppe zur Verfügung, wurde dies in der

zugehörigen Wertetabelle vermerkt.

38 Ergebnisse

4.1 Tierparameter

Tabelle 9: Körpergewicht, Körperlänge, Nierengewicht

ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P

ZDF-F-Met

ZDF-F-EMD

Kruskal-Wallis-Test

Körpergewicht bei Versuchs-ende (g)

265±19,5ae 349±27,0b 387±20,9 421±62,5 481±79,0 461±110,4 p<0,001

∆ KG nach Behandlung (g)

- - 120±27,2 80±60,6 133±79,9 117±105,7 n. s.

Körpergröße (mm) [Gruppe ZDF-fatty: n = 9]

216±6,2a 218±6,2b 235±3,5 229±7,5 233±4,8 228±4,3d p<0,001

Nierengewicht (g) 0,83±0,06ae 1,11±0,14 1,02±0,06 1,51±0,11ae 1,50±0,09 1,53±0,19 p<0,001

a: p<0,001 vs. ZDF-L-P b: p<0,01 vs. ZDF-F-P c: p<0,05 vs. ZDF-F-EMD d: p<0,05 vs. ZDF-F-Met e: p<0,001 vs. ZDF-fatty Der Wert ∆ KG entspricht der Differenz der Körpergewichte der Tiere aus den Gruppen

ZDF-L-P, ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD vor und nach 16-wöchiger

Behandlung.

4.1.1 Körpergewicht

Abbildung 2: Körpergewicht

*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,001) besteht zu allen anderen Gruppen.

0

100

200

300

400

500

600

700

ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD

g

10 Wochen

26 Wochen

p < 0,001

p < 0,01

*

39 Ergebnisse

Erwartungsgemäß wogen sowohl die Tiere der Gruppe ZDF-L-P als auch der Gruppe

ZDF-F-P nach 16-wöchiger Placebo-Behandlung signifikant mehr als die Tiere der

Gruppen ZDF-lean und ZDF-fatty, die bereits nach den ersten 10 Versuchswochen

untersucht wurden.

Im Vergleich zum Placebo führten sowohl Metformin als auch EMD zu einer stärkeren

Gewichtszunahme, jedoch waren die Unterschiede nicht signifikant.

4.1.2 Körpergröße

Abbildung 3: Körpergröße

Mit durchschnittlich 228 mm war die Körpergröße der mit EMD behandelten Tiere

signifikant geringer als die der mit Metformin behandelten Tiere (233 mm). Sie lag

somit näher an derjenigen der mit Placebo behandelten Tiere (229 mm).

Erwartungsgemäß unterscheiden sich die mit Placebo behandelten Tiere sowohl

hinsichtlich des Körpergewichts als auch hinsichtlich der Körpergröße signifikant von

den nicht medikamentös behandelten Tieren.

0

50

100

150

200

250

300


mm

p < 0,001

p < 0,01

p < 0,05

10 Wochen

26 Wochen

40 Ergebnisse

4.1.3 Nierengewicht

Abbildung 4: Nierengewicht

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2


g

*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,01) besteht zu allen anderen Gruppen. ◊◊◊◊: Ein signifikanter Unterschied (p<0,001) besteht zu allen anderen Gruppen außer zur Gruppe ZDF-fatty.

Das durchschnittliche Nierengewicht unterschied sich nicht signifikant zwischen den

mit Placebo, Metformin und EMD behandelten Gruppen, nahm aber mit zunehmendem

Alter der Tiere signifikant zu.

4.2 Futter- und Wasseraufnahme

Tabelle 10: Futter- und Wasseraufnahme

ZDF-L-P (n=9)

ZDF-F-P (n=10)

ZDF-F-Met (n=10)

ZDF-F-EMD (n=10)

Kruskal-Wallis-Test

Futteraufnahme (g/24h)

12,5±4,58 32,5±10,36a 31,6±4,67 34,4±5,21 p<0,001

Wasseraufnahme (ml/24h)

16,3±4,88 126,9±43,38b 86,5±37,77 107,3±51,33 p<0,001

a: p<0,01 vs. ZDF-L-P b: p<0,001 vs. ZDF-L-P Die Tiere der Gruppe ZDF-F-P nahmen jeweils signifikant mehr Wasser und Nahrung

zu sich als die Tiere der Gruppe ZDF-L-P. Signifikante Unterschiede zwischen den

medikamentös behandelten Gruppen zeigten sich nicht.

p < 0,001

p < 0,001

10 Wochen

26 Wochen

*

◊◊◊◊

41 Ergebnisse

4.3 Urinparameter

Tabelle 11: Urinparameter

ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD Kruskal-

Wallis-Test

Diurese (ml/24h) 8,8±3,06a 125,1±38,9b 85,1±40,7 100,73±51,5 p<0,001

Albumin-Exkretion

(mg/24h)

[Gruppe ZDF-L-P:

n=9)

0,48±0,35a 208,9±105,7 186,0±171,1 233,4±335,1 p<0,001

Kreatinin-Exkretion

(mmol/24h)

94,6±32,5 89,3±14,3 96,2±16,3 92,1±12,2 n.s.

S-Kreatinin (µmol/l)

[Gruppen ZDF-F-P,

ZDF-F-Met, ZDF-F-

EMD: n=9]

35,7±8,59 28,3±14,3 17,4±9,52 23,7±13,0 p<0,05

Kreatinin-Clearance

(ml/min)

[Gruppen ZDF-F-P,

ZDF-F-Met, ZDF-F-

EMD: n=9]

2,08±1,28 3,04±2,45b 4,93±2,72 4,13±3,93 p<0,05

Harnstoff-Exkretion

(mg/24h)

[Gruppe ZDF-F-P:

n=4; Gruppe ZDF-F-

EMD: n=9]

654,4±199,9 603,7±202,3 663,6±371,5 538,8±423,3 n.s.

U-Albumin/Kreatinin-

Ratio

0,05±0,02a 20,72±9,75 17,22±14,76 25,64±41,56 P<0,001

a: p<0,001 vs. ZDF-F-P

b: p<0,05 vs. ZDF-F-Met

42 Ergebnisse

4.3.1 Diurese

Abbildung 5: Diurese

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD

ml/m

in


Die Tiere der mit Placebo behandelten Gruppe ZDF-F-P zeigten am Ende des

Experiments eine signifikant höhere Diurese als die mit Metformin behandelten Tiere.

Auch die Diureserate der mit EMD behandelten Tiere war tendenziell niedriger als die

der Placebo-Gruppe. Mit durchschnittlich 101 ml/24 h lag sie jedoch 16 % über der

Diureserate der Gruppe ZDF-F-Met.

4.3.2 Albumin-Exkretion

Abbildung 6: Albumin-Exkretion

0

100

200

300

400

500

600


mg/

24 h


p < 0,001

*

*

43 Ergebnisse

Ein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Albumin-Ausscheidung zeigte sich

lediglich zwischen den Gruppen ZDF-L-P und ZDF-F-P. Eine signifikante Differenz

zwischen den drei mit Placebo, Metformin oder EMD behandelten Gruppen zeigte sich

nicht. Die höchste Albumin-Exkretion wiesen die Tiere der Gruppe ZDF-F-EMD auf.

Diese Verhältnismäßigkeit blieb auch beim Bezug auf die Kreatinin-Ausscheidung

gleich.

4.3.3 Kreatinin

Die Kreatinin-Exkretion unterschied sich zwischen den Gruppen nicht signifikant. Das

Serum-Kreatinin unterschied sich zwischen den mit Placebo, Metformin und EMD

behandelten Tieren ebenfalls nicht signifikant. Dieser Retentionsparameter wies jedoch

bei der mit Metformin behandelten Gruppe die geringsten Werte auf, während Tiere der

Gruppe ZDF-L-P die höchsten Werte zeigten.

Abbildung 7: Serum-Kreatinin

0

10

20

30

40

50

60


µmol

/l

*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,05) besteht zu den Gruppen ZDF-F-Met und ZDF-F-

EMD.

*

44 Ergebnisse

4.3.4 Kreatinin-Clearance

Abbildung 8: Kreatinin-Clearance

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9


ml/m

in

Am Ende des Experiments konnte eine signifikant höhere Kreatinin-Clearance bei den

mit Metformin behandelten Tieren gegenüber der Placebo-Gruppe verzeichnet werden.

Auch die Kreatinin-Clearance der mit EMD behandelten Tiere lag um 26 % höher als

die der Placebo-Gruppe, jedoch fand sich hier kein signifikanter Unterschied.

4.3.5 Harnstoff-Exkretion

Die Harnstoff-Exkretion zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den

Gruppen.

4.4 Blutparameter und Werte des Glucosestoffwechsel s

Tabelle 12: Blutparameter und Werte des Glucosestoffwechsels

ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD Krsukal-

Wallis-Test

Serum-Glucose

(mg/dl)

118,2±10,2a 508,6±166, 5 435, 5±125,5 427,8±163,9 p<0,001

Urin-Glucose

(g/dl)

0,03±0,02a 10,10±1,37 10,20±3,23c 7,83±4,22 p<0,001

Serum-Insulin

(ng/ml)

[Gruppe ZDF-

F-EMD: n=9]

0,79±0,17a 2,58±1,19 5,23±6,70 4,49±3,66 p<0,001

HbA1c (%) 2,23±0,39b 5,59±2,07 5,07±1,12 6,06±2,42 p<0,001

p < 0,05

45 Ergebnisse

Serum-Natrium

(mmol/l)

[Gruppe ZDF-

F-Met: n=8]

151±1,57b 144±3,44 144±3,74 145±3,45 p<0,01

Serum-Kalium

(mmol/l)

[Gruppe ZDF-

F-Met: n=8]

4,68±0,21 4,88±0,41 4,63±0,28 4,65±0,26 n.s.

Serum-Calcium

(mmol/l)

[Gruppe ZDF-

F-Met: n=8]

2,72±0,08 2,69±0,11 2,75±0,16 2,83±0,11 n.s.

Serum-Chlorid

(mmol/l)

[Gruppe ZDF-

F-Met: n=8]

97,8±1,09b 89,5±3,91 88,5±2,51 88,9±2,78 p<0,01

Serum-Lactat

(mmol/l)

[Gruppe ZDF-

F-Met: n=8]

2,90 ±0,48b 3,95±0,53 5,30±0,63a 5,39±0,80a p<0,001

Serum-

Cholesterin

(mg/dl)

126±23,1b 224±59,4 270±63,19 243±45,8 p<0,001

Serum-LDL

(mg/dl)

31,5±15,9 39,5±15,3 34,3±13,6 37, 8±16,4 n.s.

Serum-HDL

(mg/dl)

43,9±10,6a 90,1±23,1 108,3±39,3 97,9±24,1 p<0,001

a: p<0,001 vs. ZDF-F-P; b: p<0,01 vs. ZDF-F-P; c: p<0,05 vs. ZDF-F-EMD

46 Ergebnisse

4.4.1 Parameter des Glucosestoffwechsels

Abbildung 9: Serum-Glucosespiegel

0

100

200

300

400

500

600

700

800


mg/

dl


Neben den erwartungsgemäß stark erhöhten Blutzuckerwerten der diabetischen Tiere

der Gruppen ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF- F-EMD im Vergleich zur Gruppe ZDF-

L-P zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen. Die mit EMD

behandelten Tiere wiesen zwar im Vergleich zur Placebo-Gruppe einen um 16 %

niedrigeren Glucosespiegel auf, allerdings war dieser Unterschied nicht signifikant.

Im Zeitverlauf wiesen die mit Placebo behandelten Tiere der Gruppe ZDF-L-P zu allen

Messzeitpunkten die niedrigsten Serum-Glucosespiegel auf, während bei den Tieren der

Gruppe ZDF-F-P stets die höchsten Blutzuckerwerte gemessen wurden. Während die

Serum-Glucosespiegel der mit EMD behandelten Tiere zu den ersten beiden

Messzeitpunkten über denjenigen der mit Metformin behandelten Tiere lagen, wurden

nach 22 und 26 Wochen in der Gruppe ZDF-F-EMD geringfügig niedrigere Werte für

die Serum-Glucose gemessen als in der Gruppe ZDF-F-Met. Signifikant waren die

Unterschiede zwischen diesen beiden Gruppen jedoch zu keinem Messzeitpunkt.

Tabelle 13: Serum-Glucosespiegel im Zeitverlauf.


Serum-Glucose nach

10 Wochen (mg/dl)

139,0±35,1a 380,7±111,9 342,6±143,9 362,9±124,4

Serum-Glucose nach

14 Wochen (mg/dl)

150,9±16,1a 434,5±150,1b 287,4±177,3 353,5±167,7

*

47 Ergebnisse

Serum-Glucose nach

18 Wochen (mg/dl)

143,0±22,7a 460,0±131,3 352,6±165,4 418,3±187,0

Serum-Glucose nach

22 Wochen (mg/dl)

141,2±18,2a 624,4±86,2 554,4±186,3 538,3±166,2

Serum Glucose nach

26 Wochen (mg/dl)

118,2±10,2a 508,6±166,5 435,5±125,5 427,8±163,9

a: p< 0,001 vs. ZDF-F-P b: p< 0,05 vs. ZDF-F-Met

Abbildung 10: Urin-Glucosespiegel

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000


mg/

dl


Die Urin-Glucosekonzentration war bei den mit EMD behandelten Tieren signifikant

gegenüber den mit Metformin behandelten Tieren erniedrigt. Auch eine nicht

signifikante Verminderung um 23 % gegenüber der Placebo-Gruppe war hier zu

verzeichnen.

p < 0,05

*

48 Ergebnisse

Abbildung 11: Serum-Insulinspiegel

0

2

4

6

8

10

12

14


ng/m

l


Unter den Tieren der diabetogenen Gruppen ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD

waren keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Serum-Insulin-Konzentration zu

verzeichnen. Auf Grund der Insulinresistenz in diesen Gruppen wiesen die Tiere

deutlich höhere Spiegel auf, als die Tiere der Gruppe ZDF-L-P, die keinen Diabetes

ausbilden.

Tabelle 14: Serum-Insulinspiegel im Zeitverlauf.


Serum-Insulin nach

10 Wochen (ng/ml)

0,62±0,32a 15,64±9,61 16,60±7,36 15,74±9,10

Serum-Insulin nach

14 Wochen (ng/ml)

0,62±0,25a 9,07±9,43 10,54±5,47b 5,80±5,22

Serum-Insulin nach

18 Wochen (ng/ml)

0,65±0,33a 5,22±3,90 9,80±7,58 5,83±4,21

Serum-Insulin nach

22 Wochen (ng/ml)

1,16±0,93a 4,21±2,62 8,32±8,07 8,73±8,45

Serum-Insulin nach

26 Wochen (ng/ml)

0,79±0,17a 2,58±1,19 5,23±6,70 4,49±3,66

a: p<0,001 vs. ZDF-F-P b: p<0,05 vs. ZDF-F-EMD

*

49 Ergebnisse

Bei der Untersuchung der Serum-Insulinspiegel im Zeitverlauf wiesen die mit Placebo

behandelten Gruppen ZDF-L-P und ZDF-F-P zu allen Messzeitpunkten (Ausnahme:

Messung nach 14 Wochen) geringere Insulinspiegel im Blut auf als die medikamentös

behandelten Gruppen ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD. Die höchsten Serum-

Insulinspiegel wurden bei den Tieren der Gruppe ZDF-F-Met gemessen, wobei der

Unterschied zu den Tieren der Gruppe ZDF-F-EMD lediglich bei der Messung nach 14

Wochen signifikant war. Zu den anderen Messzeitpunkten zeigten sich keine

signifikanten Unterschiede zwischen den diabetogenen Gruppen ZDF-F-P, ZDF-F-Met

und ZDF-F-EMD.

Abbildung 12: HbA 1c im Blut

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10


%


Die Tiere der 16 Wochen lang behandelten Gruppen ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF-F-

EMD unterschieden sich nicht signifikant bezüglich ihres HbA1c-Wertes. Als Indikator

für einen chronisch erhöhten Blutzucker war dieser Parameter jedoch in der Gruppe

ZDF-F-P signifikant gegenüber der nicht diabetogenen Gruppe ZDF-L-P erhöht.

*

50 Ergebnisse

Abbildung 13: Serum-Laktat

0

1

2

3

4

5

6

7


mm

ol/l


Sowohl die mit Metformin als auch die mit EMD behandelten Tiere wiesen am Ende

der Behandlung signifikant höhere Laktatspiegel im Serum auf als die Placebo-Gruppe.

Die Werte der Gruppen ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD unterschieden sich kaum. Die

niedrigsten Laktatspiegel wies die Gruppe ZDF-L-P auf.

4.4.2 Elektrolyte

Abbildung 14: Serum-Natrium

138

140

142

144

146

148

150

152

154


mm

ol/l


Die mittleren Natrium-Konzentrationen befanden sich bei allen Tieren der Gruppe ZDF-

fatty im Normbereich (135-145 mmol/l). Bei Tieren der Gruppe ZDF-L-P war der Wert

mit durchschnittlich 150,7 mmol/l leicht erhöht und lag signifikant über dem

Durchschnittswert der Gruppe ZDF-F-P.

p < 0,001

p < 0,001

*

*

51 Ergebnisse

Die Kaliumkonzentrationen unterschieden sich zwischen den Gruppen nicht signifikant.

Abbildung 15: Serum-Calcium

Die mittleren Calcium-Konzentrationen aller Gruppen lagen geringfügig über dem

Normbereich von 2,2-2,6 mmol/l. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen

zeigten sich dabei nicht.

Abbildung 16: Serum-Chlorid


Die mit Placebo behandelten Tiere der Gruppe ZDF-L-P wiesen signifikant höhere

Serum-Chlorid-Spiegel auf als die ebenfalls mit Placebo behandelten diabetogenen

Tiere der Gruppe ZDF-F-P.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5


mm

ol/l

0

20

40

60

80

100

120


mm

ol/l

*

52 Ergebnisse

Zwischen den Tieren der Gruppen ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD waren nur

unwesentliche Unterschiede zu verzeichnen. Bei allen Gruppen lag die mittlere Serum-

Chloridkonzentration im Normbereich (97-108 mmol/l).

4.4.3 Parameter des Fettstoffwechsels

Abbildung 17: Serum-Cholesterin

0

50

100

150

200

250

300

350


mg/

dl


Die Serum-Cholesterinwerte aller diabetogenen Gruppen lagen außerhalb des

Normbereichs (< 200 mg/dl). Damit unterschieden sie sich signifikant von der Gruppe

ZDF-L-P. Die mit EMD behandelten Tiere wiesen mit durchschnittlich 243 mg/dl

niedrigere Gesamt-Cholesterin-Werte auf als die mit Metformin behandelten (270

mg/dl), wobei jedoch keine Signifikanz bestand.

Abbildung 18: Serum-HDL

0

20

40

60

80

100

120

140

160


mg/

dl


Zwischen den 16 Wochen lang behandelten Gruppen ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF-

F-EMD fand sich auch bei den mittleren Konzentrationen des Serum-HDL kein

signifikanter Unterschied. Entsprechend der Gesamtcholesterinwerte zeigten sich bei

*

*

53 Ergebnisse

der Gruppe ZDF-L-P signifikant niedrigere Durchschnittswerte als bei den anderen

Gruppen. Die höchsten Serum-HDL-Spiegel konnten bei den mit Metformin

behandelten Tieren gemessen werden.

Keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen zeigten sich dagegen bei den

LDL-Konzentrationen im Serum.

4.5 Schädigungsindizes und Morphometrie der Nieren

Tabelle 15: Schädigungsindizes und Morphometrie der Nieren

ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P

ZDF-F-

Met

ZDF-F-

EMD

Kruskal-

Wallis-

Test

GSI1 (Score) 0,18±0,10ac 0,42±0,26 0,34±0,13 0,57±0,09c 0,44±0,10e 0,40±0,06f p<0,001

MSI2

(Score)

0,19±0,04b 0,33±0,06 0,24±0,10 0,29±0,07 0,24±0,05 0,24±0,07 P<0,01

TSI3 (Score) 1,50±0,25 1,35±0,17 1,72±0,14 1,62±0,19a 1,18±0,15f 0,93±0,16fg p<0,001

VSI4 (Score) 0,21±0,13c 0,22±0,10 0,64±0,50 0,54±0,33a 0,64±0,49 0,18±0,18eg p<0,001

Umfang des

Kapillar-

konvoluts

(µm)

335±13,4ac 373±30,9 369±34,6 420±12,8ac 415±12,6 422±19,0 p<0,001

Fläche des

Kapillar-

konvoluts

(µm²)

5515±344bd 6898±458 6756±478 9610±486bd 9648±729 10219±652eg p<0,001

Volumen

des Kapillar-

konvoluts

(10³ µm³)

548±49,5bd 767±77,2 740±85,3 1235±162,4bd 1267±146,1 1382±130,6eg p<0,001

Größter

Durch-

messer des

Kapillar-

konvoluts

(µm)

92,4±2,05bd 103,9±2,97 101,9±3,01 120,7±3,13bd 121,9±4,61 125,4±4,03eg p<0,001

Kleinster

Durch-

messer des

Kapillar-

konvoluts

(µm)

72,9±3,79ad 79,7±4,11 80,7±3,21 96,9±2,53bd 96,1±3,92 99,4±2,95g p<0,001

54 Ergebnisse

a: p<0,05 vs. ZDF-fatty b: p<0,001 vs. ZDF-fatty c: p<0,05 vs. ZDF-L-P d: p<0,001 vs. ZDF-L-P e: p<0,05 vs. ZDF-F-P f: p<0,001 vs. ZDF-F-P g: p<0,05 vs. ZDF-F-Met

4.5.1 Glomeruloskleroseindex

Abbildung 19: Glomeruloskleroseindex

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

ZDF-Lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD

Sco

re


Der Glomeruloskleroseindex zeigte sich am Ende des Experiments bei allen „fatty“-

Gruppen stärker ausgeprägt als bei den „lean“-Gruppen. Auch ein mit der längeren

Versuchsdauer korrelierender Anstieg bei den Gruppen ZDF-L-P, ZDF-F-P, ZDF-F-

Met und ZDF-F-EMD im Vergleich zu den Gruppen ZDF-lean und ZDF-fatty ließ sich

beobachten. Am stärksten betroffen war dabei die Gruppe ZDF-F-P, deren

Glomeruloskleroseindex signifikant höher lag als derjenige der mit Metformin

behandelten Tiere. Die mit EMD behandelten Tiere wiesen signifikant weniger

Glomerulosklerose auf als die Placebogruppe.

4.5.2 Mesangiolyseindex

Das Ausmaß der Mesangiolyse war in allen Gruppen ähnlich und lediglich in der

Gruppe ZDF-fatty signifikant höher als in der Gruppe ZDF-lean. Höhere Werte zeigten

sich auch in den mit Placebo behandelten Gruppen im Vergleich zu den unbehandelten

1 GSI = Glomeruloskleroseindex 2 MSI = Mesangiolyseindex 3 TSI = tubulointerstitieller Schädigungsindex 4 VSI = vaskulärer

Schädigungsindex

p < 0,05

p < 0,05

p < 0,001

10 Wochen

26 Wochen

*

55 Ergebnisse

Gruppen ZDF-lean und ZDF-fatty, jedoch waren diese Unterschiede nicht signifikant.

Die mit Metformin und EMD behandelten Gruppen unterschieden sich im Ausmaß der

Mesangiolyse kaum voneinander.

4.5.3 Tubulointerstitieller Schädigungsindex

Abbildung 20: Tubulointerstitieller Schädigungsindex

Die tubulointerstitielle Schädigung der mit Placebo behandelten Tiere der Gruppen

ZDF-L-P und ZDF-F-P nahm gegenüber den Durchschnittswerten vor der Behandlung

in den Gruppen ZDF-lean und ZDF-fatty zu. Signifikant war dabei der Unterschied

zwischen den Gruppen ZDF-fatty und ZDF-F-P. Im Verlauf der Behandlung zeigten

sich sowohl durch Gabe von Metformin als auch durch Gabe von EMD signifikant

bessere Werte für den TSI als durch Verabreichung eines Placebopräparates. EMD

schnitt dabei signifikant besser ab als Metformin.

0

0,5

1

1,5

2


Sco

re

p < 0,05 p < 0,001

p < 0,001

p < 0,05

10 Wochen

26 Wochen

56 Ergebnisse

4.5.4 Vaskulärer Schädigungsindex

Abbildung 21: Vaskulärer Schädigungsindex

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4


Sco

re

Die Schädigung der renalen Gefäße war bei den mit EMD behandelten Tieren

signifikant geringer ausgeprägt als bei den mit Placebo bzw. den mit Metformin

behandelten Tieren. Der mittlere vaskuläre Schädigungsindex konnte in der Gruppe

ZDF-F-EMD sogar auf ein Niveau gesenkt werden, das mit dem vor

Behandlungsbeginn (ZDF-fatty) vergleichbar ist.

Im Verlauf zeigte sich bei den mit Placebo behandelten Tieren jeweils eine signifikante

Zunahme der vaskulären Schäden im Vergleich zu den unbehandelten Gruppen.

4.5.5 Umfang des Kapillarkonvoluts

Der Konvolutumfang wies neben dem auf Grund des längeren Beobachtungszeitraums

erwarteten Anstieg in den Gruppen ZDF-L-P und ZDF-F-P im Vergleich zu den

unbehandelten Gruppen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen auf.

p < 0,05

p < 0,05

p < 0,05

p < 0,05

10 Wochen

26 Wochen

57 Ergebnisse

4.5.6 Durchmesser, Fläche und Volumen des Kapillark onvoluts

Abbildung 22: Größter Durchmesser des Kapillarkonvoluts

0

20

40

60

80

100

120

140

ZDF-lean ZDF-f atty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD

µm

p < 0,001 p < 0,05

p < 0,05

Abbildung 23: Kleinster Durchmesser des Kapillarkonvoluts

0

20

40

60

80

100

120


µm

Die minimalen und maximalen Durchmesser des Kapillarkonvoluts nahmen im Verlauf

des Experiments zu, wie sich an signifikant höheren Werten der mit Placebo

behandelten Gruppen im Vergleich zu den unbehandelten Gruppen zeigt. Außerdem

wies die Gruppe ZDF-F-EMD im Mittel signifikant höhere Durchmesser als die Gruppe

ZDF-F-Met auf. Auch im Vergleich zur Placebo-Gruppe fielen bei den mit EMD

p < 0,001

p<0,05

p<0,001

p<0,001

10 Wochen

26 Wochen

10 Wochen

26 Wochen

58 Ergebnisse

behandelten Tieren höhere Durchmesser auf. Beim maximalen Konvolutdurchmesser

war dieser Unterschied signifikant.

Auch in der Fläche und im Volumen des Kapillarkonvoluts setzte sich diese Tendenz

fort.

Abbildung 24: Fläche des Kapillarkonvoluts

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000


µm²


Die glomeruläre Konvolutfläche zeigte am Ende der Behandlung mit EMD einen

signifikanten Anstieg im Vergleich zu den Gruppen ZDF-F-P und ZDF-F-Met. Die mit

Placebo behandelten Tiere wiesen jeweils eine signifikante Zunahme des Volumens im

Vergleich zu den unbehandelten Gruppen auf.

Die gleichen Verhältnismäßigkeiten wie für die Fläche ergaben sich auch für das

Volumen des Kapillarkonvoluts.

10 Wochen

26 Wochen

p<0,001

p<0,001 p<0,05

p<0,05

*

59 Ergebnisse

4.6 Semidünnschnitte

Im folgenden Abschnitt werden die Ergebnisse der Auswertung der Semidünnschnitte

dargestellt.

Tabelle 16: Analyse der glomerulären Kapillaren

ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met

ZDF-F-

EMD

Kruskal-

Wallis-

Test

Längendichte der

Kapillaren (1/mm²)

13564±1635 11524±581,7 12176±927,7 9375±278,9ab 9124±375,7 9170±609,2 p<0,01

Volumendichte der

Kapillaren (%)

39,9±2,63 38,6±1,41 39,4±2,99 38,2±2,04 35,8±3,86 41,9±1,32 n.s.

Mittlere

Kapillarquer-

schnittsfläche (µm²)

29,8±4,88 33,6±1,90 32,4±1,71 40,7±2,42ab 39,2±4,34d 45,6±3,04c p<0,01

a: p<0,05 vs. ZDF-fatty c: p<0,05 vs. ZDF-F-P

b: p<0,05 vs. ZDF-L-P d: p<0,05 vs. ZDF-F-EMD

Tabelle 17: Analyse der glomerulären Zellart.

ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F- EMD

Kruskal-

Wallis-

Test

Volumendichte der

Podozyten (%)

3,98±0,58 3,02±0,97 3,12±0,43 2,29±0,33 2,52±0,33 3,06±0,32 n.s.

Volumendichte der

Mesangiumzellen

(%)

4,91±0,58 4,27±0,79 3,50±0,48a 3,63±0,17 4,15±0,22c 3,54±0,31d p<0,05

Volumendichte der

Endothelzellen (%)

3,57±0,31 3,04±0,51 3,10±0,41c 1,85±0,36b 1,88±0,36 3,17±0,81cd p<0,01

Gesamtvolumen

der Podozyten

(10³ µm³)

21,7±3,89 21,5±4,88 21,01±2,10 28,4±6,32 28,8±3,83 33,0±4,80 p<0,05

Gesamtvolumen

der Mesangium-

zellen (10³ µm³)

26,8±3,89 31,0±6,40 23,8±3,87c 44,7±3,74b 47,7±7,83 38,1±4,09 p<0,05

Gesamtvolumen

der Endothelzellen

(10³ µm³)

19,5±2,83 22,1±4,62 20,9±2,23 23,0±5,94 21,5±5,04 34,6±11,42 n.s.

Podozyten pro

Fläche (1/mm²)

2061±278 1456±396 1705±282c 1037±132 1264±139 1285±143 p<0,01

60 Ergebnisse

Mesangiumzellen

pro Fläche (1/mm²)

4053±913 2914±419 2788±406 2685±233 3011±101 2041±475d p<0,05

Endothelzellen pro

Fläche (1/mm²)

2657±142b 2171±158 2303±254c 1468±196b 1476±125 1805±250dc p<0,01

Podozytenzahl pro

Volumen (1/mm³)

325358

±42221

222107

±56031

276835

±52987c

153919

±24593

196079

±19869

183147

±24701

p<0,01

Mesangiumzellzahl

pro Volumen

(1/mm³)

877659

±286109

576713

±141780

594884

±91194

542692

±61583

603050

±26817

366671

±109239cd

p<0,05

Endothelzellzahl

pro Volumen

(1/mm³)

539541

±35281b

434545

±49064

467065

±54065c

307682

±36185b

310051

±40331

321979

±43734

p<0,01

Gesamtzahl der

Podozyten pro

Glomerulum

178±31,5 160±30,9 186±26,2 189±35,1 223±20,4 197±26,4 n.s.

Gesamtzahl der

Mesangiumzellen

pro Glomerulum

474±144 414±80,3 398±80,0c 670±109,5b 692±99,0 393±110,0cd p<0,05

Gesamtzahl der

Endothelzellen pro

Glomerulum

295±37,2 314±26,2 316±33,0 379±56,6 352±29,0 348±61,2 n.s.

Durchschnitts-

volumen eines

Podozyten (µm³)

122±3,5 135±17,9 114±14,7 151±33,5 129±7,0 168±20,2d p<0,05

Durchschnitts-

volumen einer

Mesangiumzelle

(µm³)

60,7±20,3 79,6±32,0 60,1±4,4 67,4±5,6 68,9±4,9 103,0±30,1 n.s.

Durchschnitts-

volumen einer

Endothelzelle

(µm³)

66,4±7,65 71,1±17,7 66,6±8,07 60,1±7,45 61,6±15,4 99,0±22,1 n.s.

a: p<0,05 vs. ZDF-lean

b: p<0,05 vs. ZDF-fatty

c: p<0,05 vs. ZDF-F-P

d: p<0,05 vs. ZDF-F-Met

61 Ergebnisse

4.6.1 Werte des Kapillarkonvoluts und der Kapillare n

Abbildung 25: Mittlere Kapillarquerschnittsfläche

0

10

20

30

40

50

60


µm²

Auch in den Semidünnschnitten erwies sich die mittlere Kapillarquerschnittsfläche der

Gruppe ZDF-F-EMD als signifikant höher als diejenige der mit Placebo und Metformin

behandelten Tiere. Die Tiere der Gruppe ZDF-F-P wiesen signifikant höhere Werte auf

als die Tiere der unbehandelten Gruppe ZDF-fatty.

Abbildung 26: Längendichte der Kapillaren

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000


1/m

m²

Die Längendichte der Kapillaren lag bei allen behandelten Tieren der Gruppe ZDF-fatty

auf einem ähnlichen Niveau. Eine signifikante Zunahme der Werte fand sich lediglich

zwischen den Tieren der Gruppe ZDF-fatty und ZDF-F-P.

Für den Parameter Volumendichte der Kapillaren ergaben sich keine signifikanten

Unterschiede zwischen den Gruppen.

10 Wochen

26 Wochen

p < 0,05

p < 0,05 p < 0,05

p < 0,05 10 Wochen

26 Wochen

62 Ergebnisse

4.6.2 Volumendichte der einzelnen Zellarten

Abbildung 27: Volumendichte der Mesangiumzellen

0

1

2

3

4

5

6


%

Die mit EMD behandelten Tiere zeigten im Schnitt die, nach der Gruppe ZDF-L-P,

niedrigste Volumendichte der Mesangiumzellen aller 6 Gruppen und unterschieden sich

auch signifikant von der mit Metformin behandelten Gruppe. Die mit Placebo

behandelten Tiere der Gruppe ZDF-F-P wiesen ebenfalls eine signifikant niedrigere

Volumendichte der Mesangiumzellen auf als die Tiere der Gruppe ZDF-F-Met.

Die unbehandelten Tiere der Gruppe ZDF-lean wiesen eine signifikant höhere

Mesangiumzelldichte auf als die mit Placebo behandelten Tiere der Gruppe ZDF-L-P.

Abbildung 28: Volumendichte der Endothelzellen

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5


%

p < 0,05

p < 0,05

p < 0,05

p < 0,05

p < 0,05 p < 0,05

10 Wochen

26 Wochen

10 Wochen

26 Wochen

63 Ergebnisse

Die Volumendichte der Endothelzellen nahm im Verlauf des Versuchs tendenziell ab,

wie ein Vergleich mit den vor Behandlungsbeginn gemessenen Werten der Gruppen

ZDF-lean und ZDF-fatty zeigt. Der Unterschied zwischen den ZDF-fatty- und den

ZDF-F-P-Tieren war hier signifikant. Die Behandlung mit EMD führte jedoch sowohl

gegenüber der Gruppe ZDF-F-P als auch gegenüber der Gruppe ZDF-F-Met zu einer

signifikanten Erhöhung der Endothelzelldichte, die mit dem Niveau vor der 16-

wöchigen Behandlungsdauer vergleichbar war.

In Bezug auf die Volumendichte der Podozyten unterschieden sich die Gruppen nicht

signifikant voneinander.

4.6.3 Gesamtvolumen der jeweiligen Zellart

Signifikante Unterschiede im Gesamtvolumen von Podozyten, Endothel- und

Mesangiumzellen waren zwischen den behandelten Gruppen ZDF-F-P, ZDF-L-P und

ZDF-F-EMD am Ende des Experiments nicht festzustellen.

Das Gesamtvolumen der Mesangiumzellen unterschied sich nur zwischen der

unbehandelten Gruppe ZDF-fatty und der mit Placebo behandelten Gruppe ZDF-F-P,

sowie zwischen ZDF-L-P und ZDF-F-P.

Bei Podozyten und Endothelzellen ließ sich in den durchgeführten Gruppenvergleichen

kein signifikanter Unterschied feststellen.

4.6.4 Durchschnittsvolumen der jeweiligen Zellart

Die mittleren Volumina von Endothel- und Mesangiumzellen unterschieden sich nicht

signifikant voneinander. Auch das durchschnittliche Podozytenvolumen zeigte

zwischen den medikamentös behandelten Gruppen keine signifikanten Unterschiede.

4.6.5 Anzahl der jeweiligen Zellart pro Fläche

Am Ende des Versuchs unterschieden sich die Podozytenzahlen pro Fläche der

einzelnen Gruppen nur unwesentlich voneinander. Lediglich die Differenz zwischen den

mit Placebo behandelten Gruppen ZDF-L-P und ZDF-F-P war signifikant.

64 Ergebnisse

Abbildung 29: Mesangium- und Endothelzellen pro Fläche des Kapillarkonvoluts

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000


1/m

m²

Die Zahl der Mesangiumzellen pro Fläche lag bei den Tieren der Gruppe ZDF-F-EMD

signifikant niedriger als bei den ZDF-F-EMD-Tieren. Die größten Mesangiumzell-

zahlen zeigten die unbehandelten Tiere der Gruppe ZDF-lean.

Im Verlauf der Behandlung fiel die Zahl der Endothelzellen tendenziell ab. Signifikant

wurde dieser Unterschied zum Beispiel zwischen den Gruppen ZDF-fatty und ZDF-F-P.

Die mit EMD behandelten Tiere wiesen allerdings signifikant höhere Werte auf als die

mit Metformin oder Placebo behandelten Tiere.

4.6.6 Anzahl der jeweiligen Zellart pro Volumen

Abbildung 30: Anzahl der Mesangiumzellen pro Volumen

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000


1/m

m³


Mesangiumzellen 10 Wochen 26 Wochen

Endothelzellen 10 Wochen 26 Wochen

p < 0,05

p < 0,05

p < 0,05

p < 0,05

p < 0,05

10 Wochen

26 Wochen

p < 0,05

*

65 Ergebnisse

Die mit EMD behandelten Tiere wiesen die geringste Anzahl von Mesangiumzellen pro

Kubikmillimeter Kapillarkonvolut auf. Im Vergleich zu den Gruppen ZDF-F-P und

ZDF-F-Met war dieser Unterschied signifikant.

Die Anzahl der Podozyten pro Fläche sowie deren Anzahl pro Volumen unterschieden

sich kaum und zeigten lediglich signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen ZDF-

L-P und ZDF-F-P.

Signifikante Unterschiede bezüglich der Endothelzellzahl pro Volumen zeigten sich

zwischen den diabetogenen Tieren der Gruppen ZDF-fatty bzw. ZDF-F-P und den

Gruppen ZDF-lean bzw. ZDF-L-P, die keinen Diabetes entwickeln. Statistisch relevante

Differenzen zwischen den medikamentös behandelten Gruppen waren hier jedoch nicht

zu verzeichnen.

4.6.7 Gesamtzahl der jeweiligen Zellart pro Glomeru lum

Die Gesamtzahl der Podozyten und Endothelzellen pro Glomerulum unterschied sich

zwischen den verschiedenen Gruppen nicht signifikant.

Abbildung 31: Anzahl der Mesangiumzellen pro Glomerulum

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900


Die Betrachtung der Mesangiumzellzahl pro Glomerulum zeigte hingegen bei den mit

EMD behandelten Tieren signifikant niedrigere Werte als bei denjenigen, die

Metformin oder ein Placebo erhalten hatten. Die 16-wöchige Placebo-Behandlung

führte bei den Tieren der Gruppe ZDF-F-P zu signifikant höheren Mesangiumzellzahlen

als in der unbehandelten Kontrollgruppe ZDF-fatty.

p < 0,05 p < 0,05

p < 0,05

10 Wochen

26 Wochen

66 Ergebnisse

4.7 Photodokumentation der Befunde

4.7.1 Glomerulosklerose

Abbildung 32: ZDF-lean: PAS-Färbung, 400-fache Vergrößerung

Abbildung 33: ZDF-fatty: PAS-Färbung, 400-fache Vergrößerung

67 Ergebnisse

Abbildung 34: ZDF-L-P: PAS-Färbung, 400-fache Vergrößerung

Abbildung 35: ZDF-F-P: PAS-Färbung, 400-fache Vergrößerung

68 Ergebnisse

Abbildung 36: ZDF-F-Met: PAS-Färbung, 400-fache Vergrößerung

Abbildung 37: ZDF-F-EMD: PAS-Färbung, 400-fache Vergrößerung

69 Ergebnisse

In den PAS-gefärbten Paraffinschnitten zeigten die meisten Glomerula der

unbehandelten Gruppen ZDF-lean und ZDF-fatty sowie der mit Placebo behandelten

ZDF-L-P-Tiere ein regelmäßiges kapillar- und zellreiches Erscheinungsbild (vgl.

Abbildung 32,

Abbildung 33 und Abbildung 34). Im Vergleich hierzu zeigte sich, wie in Abbildung 35

zu sehen, die normale glomeruläre Struktur bei den ebenfalls mit Placebo behandelten

ZDF-F-P-Tieren zu einem großen Teil stark modifiziert. Der Grad der glomerulären

Schädigung mit zum Teil diffuser Sklerose und kapillärer Obstruktion lag signifikant

höher als jener in der Gruppe ZDF-L-P. Auch in den mit Metformin und EMD

behandelten Gruppen waren Schäden im Sinne einer gesteigerten Bildung mesangialer

Matrix in zahlreichen Glomerula erkennbar (vgl. Abbildung 36 und Abbildung 37).

Diese Veränderungen waren jedoch signifikant geringer ausgeprägt als in der mit

Placebo behandelten Gruppe ZDF-F-P. Dabei ist festzuhalten, dass das Ausmaß der

Glomerulosklerose in der Gruppe ZDF-F-EMD geringer war als in der Gruppe ZDF-F-

Met. Dieser Unterschied war jedoch nicht signifikant.

4.7.2 Tubulointerstitielle Schädigung

Abbildung 38: ZDF-lean: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung

70 Ergebnisse

Abbildung 39: ZDF-fatty: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung

Abbildung 40: ZDF-L-P: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung

71 Ergebnisse

Abbildung 41: ZDF-F-P: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung

Abbildung 42: ZDF-F-Met: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung

72 Ergebnisse

Abbildung 43: ZDF-F-EMD: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung

In der Siriusfärbung der Paraffinschnitte zeigten sich bei den unbehandelten Tieren der

Gruppe ZDF-lean (vgl. Abbildung 38) und ZDF-fatty (vgl. Abbildung 39) dicht

aneinanderliegende Tubulus-Quer- und Längsschnitte. Sie wiesen ähnlich große

Lumina, gleichmäßig angeordnete Epithelzellen und eine homogene Anfärbung auf. Im

weiteren Verlauf des Experiments − dies zeigt sich in den mit Placebo behandelten

Gruppen ZDF-L-P und ZDF-F-P beispielhaft in Abbildung 40 und Abbildung 41 − trat

eine ausgeprägte Fibrose des Interstitiums sowie eine zunehmende unregelmäßige

Dilatation und Epithelatrophie der Tubuli auf, welche durch EMD und Metformin

gebessert werden konnten (vgl. Abbildung 42 und Abbildung 43).

73 Ergebnisse

4.7.3 Vaskuläre Schädigung

Abbildung 44: ZDF-lean: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung

Abbildung 45: ZDF-fatty: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung

74 Ergebnisse

Abbildung 46: ZDF-L-P: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung

Abbildung 47: ZDF-F-P: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung

75 Ergebnisse

Abbildung 48: ZDF-F-Met: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung

Abbildung 49: ZDF-F-EMD: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung

76 Ergebnisse

Die vaskuläre Schädigung lag in den Gruppen ZDF-L-P (vgl. Abbildung 46), ZDF-F-P

(vgl. Abbildung 47 ) und ZDF-F-Met (vgl. Abbildung 48) auf einem ähnlichen Niveau

und zeigte sich in einer moderaten Gefäßwandverdickung mit Proliferation glatter

Muskelzellen. Diese Gruppen unterschieden sich somit signifikant von den

unbehandelten Gruppen ZDF-lean (vgl. Abbildung 44) und ZDF-fatty (vgl. Abbildung

45), aber auch von der mit EMD behandelten Gruppe, bei der sich weitgehend

unauffällige Gefäßverhältnisse zeigten (vgl. Abbildung 49).

77 Diskussion

5 Diskussion

In der vorliegenden Sekundärpräventionsstudie wurden am Modell der „Zucker-

Diabetic-Fatty“-Ratte die Effekte einer Therapie mit dem neu entwickelten Medikament

EMD 387008 auf die Progression diabetischer Folgeschäden an der Niere untersucht

und mit den Effekten einer Therapie mit Metformin bzw. mit dem natürlichen Verlauf

der Erkrankung verglichen. Die Tiere wurden hinsichtlich ihrer Nierenfunktion, ihrer

Glucose- und Lipidstoffwechsellage und ihrer Nierenmorphologie untersucht.

EMD konnte histologisch messbare Nierenveränderungen wie Glomerulosklerose,

tubulointerstitielle Schädigung und vaskuläre Schädigung positiv beeinflussen und

zeigte sich hier als dem Metformin überlegen. Hinsichtlich Nierenfunktion und

Stoffwechsellage setzte sich dieser Trend jedoch nicht fort. Beide Medikamente führten

hier zu ähnlichen Ergebnissen, wobei sich Metformin in einzelnen Parametern

signifikant positiv von EMD abhob.

Zu Beginn der Ergebnisdiskussion soll auf einzelne Faktoren, die maßgeblich an der

Pathogenese der diabetischen bzw. hypertensiven Nephropathie beteiligt sind, näher

eingegangen werden. Anschließend werden die in den voranstehenden Kapiteln

dargestellten Ergebnisse mit diesen Faktoren in Zusammenhang gestellt und diskutiert.

5.1 Pathogenetische Grundlagen

Dieser Abschnitt stellt die Auswirkungen der im Rahmen eines Diabetes mellitus

auftretenden Stoffwechselveränderungen dar, die für die Pathogenese der diabetischen

Nephropathie verantwortlich sind.

5.1.1 Auswirkung einer Hyperglykämie auf die Niere

In mehreren Studien konnte nachgewiesen werden, dass eine andauernde

Hyperglykämie bei diabetischer Stoffwechsellage zu Veränderungen an den Glomerula

führt. Dabei können alle glomerulären Strukturen wie Endothel, Podozyten und

Mesangium sowie das Tubulointerstitium betroffen sein. Eine Verdickung der

Basalmembran, die Synthese extrazellulärer Matrixproteine mit nachfolgender

Glomerulosklerose, Veränderungen der Podozytenschlitzmembran sowie eine

tubulointerstitielle Fibrose werden in der Literatur beschrieben [16, 36, 59]. Auch ein

78 Diskussion

gestörter Zellzyklus sowie das frühzeitige Absterben von Endothelzellen sind Folge zu

hoher Blutglukosespiegel [43].

Von besonderer Bedeutung für die Entwicklung diabetischer Folgeschäden ist die nicht-

enzymatische Glykosylierung von extra- und intrazellulären Proteinen, Lipiden und

Nukleinsäuren, die über zunächst reversible Zwischenprodukte zur Bildung irreversibler

Verbindungen, sogenannter „advanced glycation endproducts“ (AGEs), führt [37].

AGEs entstehen intrazellulär durch Autooxidation von Glucose aus intermediären

Dicarbonylverbindungen. Sie schädigen ihre Zielzellen auf drei verschiedene Arten:

Erstens binden sie an intrazelluläre Proteine und modifizieren deren natürliche Funktion

[13, 36]. Zweitens verändern sie Bestandteile der extrazellulären Matrix, so dass sie mit

anderen Matrixproteinen zu sogenannten „cross-link“-Formationen reagieren oder

abnorme Interaktionen zwischen Matrixproteinen und deren Rezeptoren entstehen [13].

Drittens reagieren auch Plasmaproteine mit AGEs und können so an Rezeptoren von

Endothel- und Mesangiumzellen sowie an Makrophagen binden [36]. Mehrere

zellständige AGE-Rezeptor-Proteine konnten mittlerweile in Zellkulturen auf

Makrophagen, Mesangiumzellen und Endothelzellen identifiziert werden. Bei

Aktivierung führen diese zu einer erhöhten Ausschüttung von Zytokinen und

Wachstumsfaktoren wie „Insulin-like Growth Faktor-1“ (IGF-1), „Interleukin-1“ (IL-1),

„Tumor-Nekrose-Faktor alpha“ (TNF-α) oder „Platelet-derived growth factor“ (PDGF)

durch Makrophagen und Mesangiumzellen, sowie zur Bildung koagulatorischer und

proinflammatorischer Moleküle wie Thrombomodulin, „Tissue Faktor“ (TF) oder dem

Zell-Adhäsionsmolekül „Vascular Cell Adhesion Molecule-1“ (VCAM-1) durch

Endothelzellen. Die AGE-Rezeptor-Interaktion scheint überdies für die diabetestypische

Hyperpermeabilität der Kapillarwand verantwortlich zu sein [13]. Über oben erwähnte

Mechanismen führen dauerhaft erhöhte Werte an AGEs zu mesangialer

Matrixproliferation und tubulointerstitieller Fibrose [71].

Neben der nicht-enzymatischen Glykosylierung von Molekülen tragen weitere durch

Hyperglykämie induzierte Stoffwechselvorgänge zu den Diabetes-typischen vaskulären

Komplikationen bei.

Hier sei als erstes die Aktivierung verschiedener Isoformen der Proteinkinase C (PKC)

genannt. Eine Aktivierung der PKC führt zu endothelialer Dysfunktion mit

Verminderung der endothelialen Stickstoffmonoxid (NO)-Synthese bei gleichzeitig

vermehrter Aktivität von „Endothelin-1“ (ET-1) und von „Vascular Endothelial Growth

Factor“ (VEGF). Zugleich bewirkt die erhöhte Aktivität der PKC die Ausschüttung

79 Diskussion

weiterer Zytokine wie „Transforming Growth Factor beta “ (TGF-β), „Plasminogen-

Aktivator-Inhibitor“ (PAI-1) und „Nuclear Factor - kappa Beta“ (NF-κΒ). Die Folgen

sind Störungen des regelmäßigen Blutflusses, erhöhte Kapillarpermeabilität, sowie die

Induktion einer lokalen Entzündungsreaktion, die zur Thrombosierung von Kapillaren

führt und so die vaskuläre Schädigung verstärkt [37].

Ein weiterer Mechanismus, der die Pathogenese diabetischer Komplikationen

begünstigt, ist der vermehrte Abbau der intrazellulär exzessiv anfallenden Glucose über

den sogenannten Hexosamin-Pathway. Die hierbei entstehenden Stoffwechsel-

endprodukte führen wiederum zu veränderter Genexpression mit vermehrter Bildung

von TGF-β, „Fibroblast Growth Factor alpha“ (FGF-α) und PAI-1, gestörter

Proteinfunktion und dem Entstehen einer Insulinresistenz [35, 80]. Darüber hinaus gibt

es Erkenntnisse, wonach der Hexosamin-Pathway durch die Auslösung von oxidativem

Stress zur Schädigung der β-Zellen beiträgt [35, 80].

Als vierter Faktor führt der sogenannte Polyol-Pathway durch eine vermehrte

Konversion von Glukose zu Sorbitol durch das Enzym Aldose-Reductase und weiter zu

Fruktose durch das Enzym Sorbitol-Dehydrogenase zu Diabetes-assoziierten Schäden.

Die Umwandlung von Glukose über diesen Abbauweg ist jedoch stark gewebe- und

speziesabhängig [13]. Die NAD+-abhängige Sorbitol-Oxidation führt zu einem Anstieg

der NADH/NAD-Ratio, woraus ein vermehrter Anfall von Triosephosphaten resultiert.

Diese bedingen in der Folge die Konzentrationserhöhung sowohl des AGE-

Vorläuferproteins Methylglyoxal als auch von Diacylglycerol, welches die oben

erwähnte Proteinkinase C aktiviert. Der Polyol-Pathway mündet über die

Sorbitolproduktion also in zwei andere, zu Komplikationen führenden Abbauwege ein.

Das zelluläre Redoxpotential ist durch den Verbrauch von NADPH bei der Reduktion

von Glukose zu Sorbitol und der konsekutiven Verminderung reduzierten Glutathions

gestört. Dies kann intrazellulären oxidativen Stress verursachen oder verstärken [13,

15]. Berichte, wonach die Sorbitol-Akkumulation die Zelle durch erhöhten osmotischen

Druck schädigt, sind umstritten, da die Sorbitol-Konzentrationen im Gewebe zu niedrig

sind, um oxidative Schäden verursachen zu können [13].

Einen Überblick über die durch die Hyperglykämie induzierten Stoffwechselnebenwege

zeigt Abbildung 50.

80 Diskussion

Abbildung 50: Möglicher Mechanismus, durch den die Überproduktion von Sauerstoffradikalen verschiedene Stoffwechsel-Nebenwege aktiviert (aus [13])

Als gemeinsame Grundlage der oben beschriebenen Mechanismen gilt eine

Überproduktion von Sauerstoffradikalen durch die mitochondriale Elektronen-

transportkette [13, 36, 37, 55].

5.1.2 Albuminurie und Nephropathie

Neben einer renalen Hypertrophie mit Glomerulosklerose, interstitieller Fibrose und

Basalmembranverdickung gehört zum Krankheitsbild der diabetischen Nephropathie

auch eine Veränderung der Membranpermeabilität des glomerulären Filters. Diese führt,

ebenso wie ein gleichzeitiger Anstieg des effektiven Filtrationsdrucks, zunächst zur

Mikroalbuminurie, d. h. einer Urinausscheidungsrate von 30-300 mg Albumin pro Tag

oder ein Verhältnis von Albumin/Kreatinin von 17-250 mg/g bei Männern bzw. 25-355

mg/g bei Frauen [72]. Liegt die Proteinausscheidung über den genannten Grenzwerten,

so spricht man von einer Proteinurie [72]. Mikroalbuminurie bzw. Proteinurie stellen

prognostisch bedeutsame Marker für die Entwicklung der diabetischen Nephropathie

sowie weiterer Diabetes-assoziierter Komplikationen dar [1, 3, 32, 64].

Die pathophysiologischen Mechanismen, die für den Proteinverlust verantwortlich sind,

liegen im Verlust der negativen Ladung und der Größenselektivität des glomerulären

Filters, so dass größere Mengen an Albumin, aber auch an hochmolekularen Stoffen, die

81 Diskussion

die Filtrationsbarriere normalerweise nicht passieren könnten, in den Harn filtriert

werden [18].

Vermehrte Proteinbelastung und eine direkte toxische Wirkung der Proteine im

Tubulussystem beeinflussen deren Reabsorption negativ, was wiederum zu einer

Verstärkung der Albuminurie führt [18]. Überdies induzieren Proteine im

Tubulussystem die Freisetzung vasoaktiver Substanzen und wirken proinflammatorisch

[68]. Die Folge ist eine tubulointerstitielle Schädigung bis hin zur Entwicklung einer

progressiven interstitiellen Fibrose der Niere [18, 23, 68].

Die Albuminurie stellt jedoch nicht nur einen prognostischen Parameter für die

Nephropathie dar, sie gibt auch Hinweise auf eine generalisierte mikro- und

makrovaskuläre Schädigung. Mehrere epidemiologische Studien konnten belegen, dass

eine erhöhte Proteinurie das Risiko, an einer kardiovaskulären Krankheit zu erkranken

oder daran zu versterben, drastisch erhöht [17, 28, 72, 83, 84]. In einer Metaanalyse

konnte gezeigt werden, dass bei Typ-2-Diabetikern mit Mikroalbuminurie das Risiko

für die kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität um den Faktor 2 erhöht war [72].

5.1.3 Auswirkungen einer Dyslipidämie auf die Niere

Da sich Metformin auch durch seine positiven Auswirkungen auf den Lipidstoffwechsel

auszeichnet (vgl. Abschnitt 3.4.1), soll im Folgenden kurz dargestellt werden, wie eine

im Rahmen des Diabetes mellitus auftretende Dyslipidämie die Niere schädigen kann.

Eine Störung des Lipidhaushalts ist ein häufiger Befund bei Diabetespatienten [7, 66].

Dafür werden vor allem folgende Faktoren verantwortlich gemacht:

Zum einen können Insulinmangel bzw. Insulinresistenz entweder unmittelbar oder

mittelbar über die daraus entstehende Hyperglykämie zu einer Hyperlipidämie führen.

Grund dafür ist eine gesteigerte Aktivität der hormonsensitiven Lipase des Fettgewebes,

die zur Lipolyse und zum Anstieg der freien Fettsäuren im Blut führt [4, 73].

Zum anderen geht auch das bei fortgeschrittener Nephropathie auftretende nephrotische

Syndrom mit einer Hypercholesterinämie einher. Im Allgemeinen ist die Dyslipidämie

umso ausgeprägter, je höher die Proteinurie und je niedriger die Albuminkonzentration

im Blut ist [51, 77].

Überdies führt eine erhöhte Permeabilität der glomerulären Basalmembran zum Verlust

von Aktivatoren der endothelständigen Lipoproteinlipase wie Apolipoprotein-C II und

somit zu einer Beeinträchtigung des normalen Lipoproteinmetabolismus [51].

82 Diskussion

Tierexperimentelle Untersuchungen und klinische Befunde zeigen, dass eine

Hyperlipidämie die Entwicklung einer Glomerulosklerose sowie die Progredienz der

Niereninsuffizienz beeinflussen kann [30, 39, 51]. Bei einer Schädigung der

Kapillarwände des Glomerulums durch einen erhöhten Filtrationsdruck und/oder eine

Hyperglykämie können Lipide und Lipoproteine in die mesangiale Matrix eindringen.

Dies führt zu einer Stimulierung der DNA-Synthese in Mesangiumzellen mit

nachfolgend vermehrter Produktion von Mitogenen und extrazellulären Matrixproteinen

[30, 51]. Außerdem infiltrieren Makrophagen die Glomerula und degenerieren nach

Aufnahme oxidierter LDL-Partikel zu Schaumzellen. Über die Produktion von

Wachstumsfaktoren und inflammatorischen Zytokinen halten die oxidierten LDL-

Lipoproteine den entzündlichen und proliferativen Prozess aufrecht und wirken so

apoptosefördernd. Überdies werden sie verantwortlich gemacht für eine erhöhte

Produktion reaktiver Sauerstoffspezies und vasokonstriktorisch wirkender Substanzen

wie Endothelin, Thromboxan und Renin bei gleichzeitig verminderter

Stickstoffmonoxidbildung. Diese Imbalance vasoaktiver Stoffe führt in der Konsequenz

zu vermehrter Vasokonstriktion [39].

Diese bisherigen Erkenntnisse weisen also auf eine Nephrotoxizität der Lipide hin und

attestieren ihnen eine prognostische Bedeutung für die Manifestation und Progression

der diabetischen Nephropathie.

5.2 Diskussion der eigenen Ergebnisse

Im Folgenden werden die in diesem Versuch ermittelten und in Kapitel 4 dargestellten

Ergebnisse interpretiert und in Bezug auf die aktuelle Datenlage in der Literatur

diskutiert.

5.2.1 Blut- und Urinparameter

Die beiden untersuchten Medikamente Metformin und EMD konnten die Serum-

glucosespiegel jeweils etwa gleich stark um ca. 15 % senken, ohne dass dieser

Unterschied jedoch signifikant war. Erwartungsgemäß waren die Werte der Gruppe

ZDF-L-P bezüglich aller Parameter des Glucosestoffwechsels signifikant gegenüber den

anderen Gruppen erniedrigt.

Die Konzentrationen des Langzeitparameters HbA1c waren in der Gruppe ZDF-F-Met

mit ca. 5 % um knapp einen Prozentpunkt geringer als in der Gruppe ZDF-F-EMD. Die

83 Diskussion

mit EMD behandelten Tiere wiesen sogar höhere HbA1c-Konzentrationen im Serum auf

als die Tiere der Placebogruppe. Wenngleich dieser Unterschied nicht signifikant war,

fällt eine Diskrepanz im Vergleich zu den ermittelten Serumglucosespiegeln dennoch

auf. Diese Ergebnisse können zum Teil erklärt werden durch die Beobachtung der

Blutglucose im Zeitverlauf, in dem die mit EMD behandelten Tiere zu den ersten drei

Messzeitpunkten höhere Werte aufwiesen als die mit Metformin behandelten Tiere. Die

Messungen nach 22 und 26 Wochen ergaben dann bei den Tieren der Gruppe ZDF-F-

EMD jedoch geringfügig niedrigere Serum-Glucosespiegel als bei den Tieren der

Gruppe ZDF-F-Met (vgl. Abschnitt 4.4.1). Die Diskrepanz zwischen den HbA1c-Werten

der Gruppe ZDF-F-P und der Gruppe ZDF-F-EMD kann mit den vorliegenden

Ergebnissen jedoch nicht erklärt werden.

Die Insulinspiegel im Serum unterschieden sich zwischen den Gruppen ZDF-F-EMD,

ZDF-F-Met und ZDF-F-P zwar nicht signifikant voneinander, waren in den

medikamentös behandelten Gruppen jedoch höher als in der Placebogruppe. Die mit

EMD behandelten Tiere wiesen um knapp 15 % niedrigere Insulin-Serumspiegel auf

als die mit Metformin behandelten Tiere. Dieser Trend bestätigte sich auch im

Zeitverlauf (vgl. Abschnitt 4.4.1).

Die bei diesen Werten auftretenden hohen Standardabweichungen weisen jedoch auf die

breite Streuung und die somit nur bedingte Aussagekraft der Ergebnisse hin. So stehen

die im Vergleich zur Placebogruppe erhöhten Insulin-Serumspiegel in den

medikamentös behandelten Gruppen im Widerspruch zu den Ergebnissen zahlreicher

Studien. Diese Studien haben gezeigt, dass Metformin eine effektive Blutzuckersenkung

und Verbesserung der Insulinsensitivität bewirkt, die sich in einer Verminderung der

Serum-Insulinkonzentrationen ausdrückt. Grund hierfür ist eine verminderte

Glucoseabgabe der Hepatozyten, eine vermehrte Aufnahme und Oxidation von Glucose

ins Fettgewebe, eine verbesserte Insulinrezeptorbindung mit nachfolgend erhöhter

Tyrosinkinase-Aktivität sowie eine vermehrte Translokation von GLUT-1- und GLUT-

4-Glucose-Transportern in die Membran verschiedener Zellarten [12]. Metformin

verbessert die orale Glucosetoleranz, wobei die Plasma-Insulin-Antwort auf Glucose

unverändert bleibt oder bei Patienten mit Hyperinsulinämie gesenkt wird [12]. An

isolierten Hepatozyten verstärkten bereits therapeutische Konzentrationen des

Medikaments die insulinbedingte Unterdrückung der Glukoneogenese und verminderten

gleichzeitig die glukoneogenetische Glucagonwirkung [12, 85]. Im Tierversuch konnte

eine gesteigerte Aufnahme von Glukose in den Muskel nachgewiesen werden, die sich

84 Diskussion

in vermehrter Glykogenproduktion und Glucoseoxidation bei gleichzeitig nicht erhöhter

Laktatproduktion zeigte [11].

Die Senkung der Plasmaglucose durch Metformin ist besonders für die Verhinderung

von Komplikationen von Bedeutung, wie sie durch die in Abschnitt 5.1.1 dargestellten

Abbauwege und den daraus resultierenden oxidativen Stress entstehen. So wurde

gezeigt, dass Metformin die Bildung von AGEs reduzieren und antioxidative

Mechanismen, etwa durch den Anstieg von Glutathion oder Superoxiddismutase,

stärken kann [10].

In der vorliegenden Studie konnten diese positiven Ergebnisse jedoch nicht bestätigt

werden. Weder mit Metformin noch mit EMD wurde eine signifikante Senkung der

Glucose- und Insulin-Serumkonzentrationen im Vergleich zur Placebogruppe erreicht.

Ein deutlicher Unterschied zwischen beiden Medikamenten wurde bei der signifikant

stärkeren Senkung der Uringlucose durch EMD im Vergleich zu Metformin beobachtet.

Bei stark erhöhter Diurese in der Gruppe ZDF-F-EMD im Vergleich zur Gruppe ZDF-

F-Met dürfte hier jedoch am ehesten ein Verdünnungseffekt eine Rolle spielen.

Die oben erwähnten, in bisherigen Studien gewonnen Ergebnisse zeigen, dass man im

vorliegenden Versuch positivere Auswirkungen der Metforminbehandlung auf den

Glucosestoffwechsel erwartet hätte. Offenbar gelang es in dieser Studie nicht, die

Insulinresistenz zu durchbrechen, obwohl mit vergleichbaren oder sogar höheren

Metformin-Dosen als in früheren Studien gearbeitet wurde [67, 70].

Eine gefürchtete Nebenwirkung des Metformins ist die Laktatazidose, die durch

vermehrte anaerobe Glykolyse bei Sauerstoffmangelversorgung des Organismus

entsteht. Ab einer Serumkonzentration von 5 mmol/l und einem Blut-pH-Wert von 7,25

spricht man von einer signifikanten Laktatazidose [42]. Es konnte beobachtet werden,

dass eine Metformin-Therapie zu einem Anstieg der basalen und postprandialen

Laktatkonzentration im Blut führt, ohne dass jedoch der Normbereich überschritten

wird [12]. In der vorliegenden Studie lagen die Durchschnittswerte der

Laktatkonzentration in den Gruppen ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD mit durchschnittlich

5,30 mmol/l und 5,39 mmol/l formal über dem oben genannten Grenzwert und

unterschieden sich damit signifikant von der mit Placebo behandelten Gruppe ZDF-F-P.

Obwohl in dieser Studie keine Blut-pH-Messungen durchgeführt wurden, legen diese

Ergebnisse dennoch nahe, dass EMD bezüglich der Gefahr einer Laktatazidose

gegenüber Metformin keine Vorteile mit sich bringt.

85 Diskussion

Wie in Abschnitt 3.4.1 und 4.4.3 erläutert, kann Metformin eine Dyslipidämie, welche

die Entwicklung einer Glomerulosklerose sowie die Progredienz der Niereninsuffizienz

begünstigen kann [30, 39, 51], positiv beeinflussen. Es führt zu einer 10-20%igen

Verminderung der Fettsäureoxidation, einer Reduktion der Plasma-

Trigylceridkonzentration sowie einer herabgesetzten Synthese von „Very Low

Densitiy“-Lipoproteinen (VLDL) in der Leber [10, 12, 53, 86]. In einigen Studien

wurde außerdem ein leichtes Absinken der Cholesterinkonzentrationen im Plasma und

ein leichter Anstieg von „High Densitiy“-Lipoproteinen (HDL) festgestellt [12]. Im

vorliegenden Versuch konnten diese Ergebnisse teilweise reproduziert werden.

Während durch EMD eine effektivere Senkung der Gesamtcholesterinkonzentration

erreicht werden konnte als mit Metformin (243 mg/dl vs. 270 mg/dl), zeigte Metformin

im Hinblick auf den Anstieg der HDL-Konzentrationen eine bessere Wirkung als EMD.

Signifikant waren die Unterschiede, auch gegenüber der Placebogruppe, jedoch nicht.

Alle hypertonen Tiere der Gruppe ZDF-L-P wiesen signifikant niedrigere

Fettstoffwechselparameter auf als die diabetogenen Tiere, die genetisch determiniert

eine Hyperphagie und Hyperlipidämie ausbilden (vgl. Abschnitt 3.1).

Damit konnten die Ergebnisse dieser Studie hinsichtlich des Glucose- und

Fettstoffwechsels sowohl für Metformin als auch für EMD kaum signifikante, positive

Effekte gegenüber der Placebogruppe zeigen.

5.2.2 Wirkung von Metformin und EMD auf Gefäße und Endothel

Die Metformintherapie geht, wie etwa in der UKPD-Studie gezeigt werden konnte, mit

einer signifikanten Reduktion der mikro- und makrovaskulären Komplikationen einher

[1]. Neben der Reduktion weiterer Risikofaktoren für Atherosklerose wie

Hyperglykämie, Dyslipidämie und Gerinnungsstörung verbessert das Medikament auch

die endotheliale Dysfunktion [10, 31, 47]. In Frühstadien der Krankheit kann Metformin

zu einem Anstieg der endothel-vermittelten Vasodilatation sowie zu einer Senkung der

Blutdruckerhöhung auf vasokonstriktorische Stimuli hin führen [10, 47]. Unklar ist

bislang, ob hierbei eine Erhöhung der durch die anhaltende Hyperglykämie bedingten

verminderten Stickstoffmonooxid(NO)-Freisetzung eine Rolle spielt [9, 45, 47]. NO

hemmt die Proliferation vaskulärer glatter Muskelzellen und reguliert „Endothelin-1“

(ET-1), einen sehr wirksamen Vasokonstriktor [27, 29]. Allerdings liegen auch Studien

86 Diskussion

vor, die keinen signifikanten Effekt von Metformin auf die endothelabhängige

Vasodilatation nachweisen konnten [10].

Metformin scheint die bei Typ-2-Diabetes verstärkte Monocytenadhäsion ans Endothel,

die die Ausbildung von Atherosklerose begünstigt, zu reduzieren. Dies wird auf die

verminderte Expression von Adhäsionsmolekülen wie E-Selectin und ICAM-1 (d. h.

Intercellular Adhesions Molecule-1) und auf die Reduktion von AGEs zurückgeführt,

die zu einer verminderten Stimulation der Adhäsionsmoleküle führt [44].

Ferner existieren Hinweise auf eine Metformin-vermittelte Verbesserung der kapillären

Perfusion, etwa durch Antagonisierung der Insulin-induzierten Erythrozyten-

deformation, sowie auf eine verminderte Endothelpermeabilität und eine erhöhte

arterioläre Elastizität [10]. Auch eine signifikante Erhöhung des arteriellen Blutflusses

bei Patienten mit Arteriosklerose wurde beobachtet [74].

Metformin besitzt außerdem antiatherogene und antithrombotische Eigenschaften. Im

Tierversuch konnten aortale Plaqueformationen bei Kaninchen ohne Beeinflussung des

Blutlipidspiegels reduziert werden [10].

Überdies wird Metformin für ein Absinken der Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1-

Konzentrationen (PAI-1), einem Fibrinolyse-Inhibitor, sowie für eine herabgesetzte

Thrombozytensensitivität gegenüber aggregatorischen Substanzen verantwortlich

gemacht [1, 12].

Im vorliegenden Versuch gab der vaskuläre Schädigungsindex Hinweise auf mögliche

vasoprotektive Wirkungen der beiden getesteten Medikamente. Dabei fiel zunächst auf,

dass diejenigen Tiere, die länger den gefäßschädigenden Einflüssen Hypertonie und

Diabetes ausgesetzt waren und erst nach 26 Versuchswochen untersucht wurden (ZDF-

L-P, ZDF-F-P), signifikant höhere Werte im VSI aufwiesen als die bereits nach 10

Wochen untersuchten Gruppen. Ein signifikanter Unterschied zwischen der Gruppe

„lean“ und der Gruppe „fatty“ war dabei nicht zu verzeichnen. Wenngleich In-Vitro-

Studien einen Rückgang der Proliferation glatter Muskelzellen unter Metformintherapie

dokumentieren [10], hob sich der Gefäßzustand der mit Metformin behandelten Tiere

nicht positiv von der Placebo-Gruppe ab. Die mit EMD behandelten Tiere wiesen

dagegen VSI-Werte auf, die mit denjenigen der Tiere vor Behandlungsbeginn (Gruppe

ZDF-fatty) vergleichbar waren (vgl. Abschnitt 4.5.4).

Mögliche vasoprotektive Eigenschaften können dem Medikament EMD auch bei

Betrachtung der Volumendichte der Endothelzellen und der Endothelzellzahl pro Fläche

des Kapillarkonvoluts zugeschrieben werden. Beide Parameter zeigen, dass EMD

87 Diskussion

offenbar einer Hyperglykämie-induzierten Apoptose von Endothelzellen

entgegenwirken konnte (vgl. Abschnitt 4.6.2 und 4.6.5). Während sich die

Volumendichte der Endothelzellen in der Gruppe ZDF-L-P nach 16-wöchiger

Placebobehandlung nur geringfügig im Vergleich zur Kontrollgruppe ZDF-lean

unterschied, nahm die Volumendichte bei den mit Placebo behandelten „fatty“-Tieren

(ZDF-F-P) im Vergleich zur Gruppe ZDF-fatty signifikant ab. Auf einem

vergleichbaren Niveau bewegten sich die Werte für die mit Metformin behandelten

Tiere. Lediglich EMD zeigte eine um über 40 % höhere Volumendichte der

Endothelzellen im Vergleich zu der mit Placebo behandelten Gruppe (vgl. Abschnitt

4.6.2). Ähnliche Ergebnisse ergaben sich auch für den Parameter „Endothelzellzahl pro

Fläche des Kapillarkonvoluts“.

Die in der Literatur beschriebene Zunahme der endothelabhängigen Vasodilatation

sowie die Proliferationshemmung glatter Gefäßmuskelzellen durch Metformin konnte in

diesem Versuch nicht nachgewiesen werden. Die vaskuläre Schädigung unterschied sich

nicht signifikant von der Placebogruppe. Das neu entwickelte Medikament EMD

dagegen konnte eine renale Gefäßschädigung wirkungsvoll reduzieren.

Um eine bessere Wirksamkeit von EMD gegenüber Metformin hinsichtlich seiner

vasoprotektiven Eigenschaften zu attestieren, bedarf es noch weiterer Untersuchungen,

insbesondere im Hinblick auf Auswirkungen auf den systemischen Blutdruck und die

kapilläre Perfusion. Die hier gewonnenen Ergebnisse bescheinigen dem EMD jedoch

äußerst günstige Gefäßwirkungen. Allerdings muss darauf hingewiesen werden, dass

den hier gezeigten unzureichenden experimentellen Wirkungen des Metformins eine

Vielzahl der oben erwähnten Studien mit positiven Ergebnissen gegenüberstehen.

5.2.3 Auswirkungen von Metformin und EMD auf die Ni erenfunktion und Morphologie

Bei der Beurteilung der Nierenfunktionsparameter zeigten sich zwischen den beiden

medikamentös behandelten Gruppen keine signifikanten Unterschiede. Auffallend

waren signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen ZDF-L-P und ZDF-F-P, die für

die mit Placebo behandelten diabetogenen Tiere eine signifikant stärkere Proteinurie

und eine erhöhte Diurese ergaben als für die hypertonen Tiere.

Da der Grad der mikrovaskulären Komplikationen, die zur Nephropathie bis hin zum

Nierenversagen führen können, mit dem Maß der Blutzuckerkontrolle negativ korreliert

88 Diskussion

[10, 12], stellt die effektive Blutzuckersenkung einen entscheidenden Faktor bei der

Reduktion von Auftreten und Schwere dieser Komplikationen dar. Sie trägt dazu bei,

dass weniger toxische Stoffwechselprodukte über den Polyol- und Hexosaminabbauweg

entstehen und vermindert die Bildung von AGEs und die damit verbundene

Glomerulosklerose. Für Metformin wurde in mehreren Studien eine positive Wirkung

auf die Entwicklung einer diabetischen Nephropathie gezeigt [10, 32, 64, 67].

Valensi et al. konnten eine Reduktion der Kapillarpermeabilität und der Ödembildung

durch Metformin nachweisen [74]. Dies könnte auf die verminderte Glykosylierung der

Basalmembran, eine verbesserte arterioläre Elastizität und eine Reduktion von

Hyperglykämie-induzierten Kollagenquervernetzungen zurückzuführen sein [10]. Die

UKPD-Studie konnte ein um 29 % vermindertes Risiko für mikrovaskuläre

Komplikationen und ein langsameres Voranschreiten einer Mikroalbuminurie unter

Metformintherapie im Vergleich zur alleinigen Diät ermitteln [1].

Die mit Metformin und EMD behandelten Versuchstiere unterschieden sich zwar nicht

signifikant von der Placebo-Gruppe, es zeigte sich jedoch die Tendenz zu einer

positiveren Beeinflussung der Nierenfunktion durch Metformin als durch EMD. So wies

die mit Metformin behandelte Gruppe niedrigere Serum-Kreatinin-Konzentrationen und

eine verminderte Diurese auf als die Gruppen ZDF-F-P und ZDF-F-EMD. Auch

hinsichtlich der Albuminurie zeigte EMD mit einer rund 20 % höheren Urin-

Eiweißausscheidung und einer höheren Albumin-Kreatinin-Ratio eine leicht schlechtere

Wirking als Metformin (vgl. Abschnitt 4.3.2). Dieser Trend setzte sich im Volumen des

Kapillarkonvoluts fort, wo sich in der Gruppe ZDF-F-EMD wiederum höhere Werte als

in der Gruppe ZDF-F-Met zeigten. Dies könnte für eine diabetestypische

Nephromegalie sprechen, die mit einer glomerulären Hypertrophie und zunächst einer

begleitenden moderaten Hyperfiltration einhergeht. Im Verlauf sinkt die glomeruläre

Filtrationsrate jedoch trotz der glomerulären Volumenzunahme im Sinne einer

zunehmenden Niereninsuffizienz ab [58, 59, 68]. Im vorliegenden Versuch konnten

beide Medikamente die Kreatinin-Clearance, die Rückschlüsse auf die glomeruläre

Filtrationsrate erlaubt, im Vergleich zur Placebogruppe verbessern (vgl. Abschnitt

4.3.4). Dies könnte auf die oben erwähnte kompensatorische glomeruläre Hypertrophie

zurückzuführen sein, welche im Verlauf zunehmender Glomerulopathie

kompensatorisch auftritt [68]. Eine damit meist verbundene Zunahme des

Nierengewichts konnte im vorliegenden Versuch in der Gruppe ZDF-F-EMD jedoch

nicht gezeigt werden (vgl. Abschnitt 4.1.3). Außerdem wiesen weder die mit EMD noch

89 Diskussion

die mit Metformin behandelten Tiere im Versuchsverlauf eine Vermehrung der

glomerulären Matrix oder eine Zunahme der Mesangiumzellproliferation im Vergleich

zur Placebogruppe auf (vgl. Abschnitt 4.5.1).

Beide Phänomene lassen sich histologisch anhand des Glomeruloskleroseindex (GSI)

bewerten. Die Glomerulosklerose mit Einengung des Gefäßlumens der glomerulären

Kapillaren, Zunahme des Mesangiums, diffuser Verbreiterung der Basalmembran und

Degeneration der Podozyten ist eine typische Komplikation des Diabetes mellitus [58].

Im vorliegenden Versuch konnte im zeitlichen Verlauf erwartungsgemäß sowohl bei

den Tieren der Gruppe „lean“ als auch bei den diabetogenen Tieren der Gruppe „fatty“

eine Zunahme der Glomerulosklerose festgestellt werden. Dabei fiel auf, dass die Tiere

der „lean“-Gruppe grundsätzlich niedrigere Werte aufwiesen als die Tiere der „fatty“-

Gruppe, was möglicherweise mit der häufig zusätzlich zum Typ-2-Diabetes

vorliegenden arteriellen Hypertonie in der „fatty“-Gruppe in Zusammenhang gebracht

werden kann [58, 63]. EMD und Metformin beeinflussten die glomeruläre

Matrixvermehrung ausgesprochen positiv: Im Vergleich zur Placebo-Gruppe zeigten

sowohl die Gruppe ZDF-F-Met als auch die Gruppe ZDF-F-EMD signifikant niedrigere

Werte. Gegenüber Metformin konnte EMD die Glomerulosklerose um weitere 10 %

verbessern (vgl. Abschnitt 4.5.1). Dieses Ergebnis korreliert auch mit einer signifikant

niedrigeren Volumendichte der Mesangiumzellen sowie mit einer signifikant niedrigen

Zahl von Mesangiumzellen pro Fläche und Volumen in der mit EMD behandelten

Gruppe im Vergleich zur Placebo-Gruppe (vgl. Abschnitt 4.6.2, 4.6.5 und 4.6.6). Dies

könnte als eine Hemmung der durch hohe Blutglukosespiegel hervorgerufenen

Proliferation von Mesangiumzellen zu verstehen sein [21]. Osterby und Gundersen [59]

haben für die diabetische Nephropathie bei Typ-1-Diabetikern jedoch gezeigt, dass im

Verlauf der Erkrankung bei unveränderter Zellzahl das Volumen der einzelnen

glomerulären Zellen im Sinne einer Hypertrophie erhöht sein kann. Im vorliegenden

Versuch wies die Gruppe ZDF-F-EMD, wie schon hinsichtlich des glomerulären

Volumens, höhere Volumina von Mesanigum- und Endothelzellen sowie von

Podozyten auf als die Gruppe ZDF-F-Met (vgl. Abschnitt 4.6.3). Allerdings war der

Unterschied nur in Bezug auf das Podozytenvolumen signifikant.

Die Auswertung des Mesangiolyseindex (MSI) zeigte keine signifikanten Unterschiede

zwischen den medikamentös behandelten Gruppen. Als Mesangiolyse bezeichnet man

die Auflösung der mesangialen Matrix durch Apoptose und Nekrose der

90 Diskussion

Mesangiumzellen. Sie äußern sich als eine Erweiterung der glomerulären Kapillaren,

die im Endstadium als Kapillaraneurysmen imponieren [20, 52].

Neben den Schäden an den Glomerula liegen in der diabetisch geschädigten Niere auch

Veränderungen der tubulointerstitiellen Architektur vor, wie etwa eine tubuläre

Atrophie und eine interstitielle Fibrose [68]. Der tubulointerstitielle Schädigungsindex

zeigte sich im Zeitverlauf zwischen der Gruppe ZDF-fatty und der Gruppe ZDF-F-P als

signifikant zunehmend. Die mit Metformin und EMD behandelten Tiere wiesen

signifikant geringere Werte auf als die Tiere, die ein Placebo erhielten. Auch hier waren

die Schädigungen in der Gruppe ZDF-F-EMD signifikant geringer als in der Gruppe

ZDF-F-Met (vgl. Abschnitt 4.5.3).

Wie in Abschnitt 4.5.1, Abschnitt 4.5.3 und Abschnitt 4.5.6 gezeigt wurde, geht in der

vorliegenden Studie die bei den mit EMD behandelten Tieren stark ausgeprägte

glomeruläre Volumenzunahme weder mit einer verstärkten Glomerulosklerose noch mit

einer vermehrten tubulointerstitiellen Fibrose einher. Möglicherweise trägt eine

Zunahme der Kapillarlumina durch die Ausbildung kapillärer Loop-Strukturen mit sehr

dünner Basalmembran, wie sie sowohl bei Typ-1- als auch bei Typ-2-Diabetikern

beschrieben wurde [58], zur glomerulären Volumenexpansion bei. Die im Vergleich zur

Gruppe ZDF-F-P und ZDF-F-Met signifikant erhöhte mittlere

Kapillarquerschnittsfläche in der Gruppe ZDF-F-EMD sowie die ebenfalls erhöhte

Volumen- und Längendichte der Kapillaren in dieser Gruppe sind mit diesem

Erklärungsansatz vereinbar (vgl. Abschnitt 4.6.1).

Die hypertonen Tiere der Gruppe ZDF-L-P zeigten signifikant bessere

Nierenfunktionsparameter als alle Tiere der diabetogenen Gruppen. Auch die

Glomerulosklerose war bei diesen Tieren geringer ausgeprägt als in den

Vergleichsgruppen. Die tubulointerstitielle Fibrose war hier jedoch, ähnlich wie die

vaskuläre Schädigung, stärker ausgeprägt als in den anderen Gruppen. Möglicherweise

sind diese Veränderungen auf proinflammatorische Substanzen zurückzuführen, welche

bei glomerulärer Hypertension vermehrt ausgeschüttet werden und über eine

interstitielle Entzündungsreaktion zu Fibroblastenproliferation und Fibrogenese führen

[68].

Beide Medikamente konnten die diabetesassoziierten morphologischen Veränderungen

an der Niere positiv beeinflussen. Während sich hier eine äußerst günstige Wirkung des

EMD abzeichnete, konnte das neu entwickelte Medikament hinsichtlich der

91 Diskussion

Nierenfunktionsparameter in diesem Versuch keine Verbesserung im Vergleich zur

Placebogruppe bewirken.

5.2.4 Schlussfolgerung

Im vorliegenden Versuch beeinflussten die beiden untersuchten Medikamente den

Glucosestoffwechsel sowie die im Rahmen einer diabetischen Nephropathie

auftretenden renalen Schäden unterschiedlich. Die Serumspiegel von Insulin und

Glucose waren bei Versuchsende in der mit EMD behandelten Gruppe im Vergleich zu

den mit Metformin behandelten Tiere geringfügig erniedrigt, zeigten jedoch keine

signifikanten Unterschiede im Vergleich zur Placebogruppe. Wesentliche Parameter

der Nierenfunktion, wie die Kreatinin-Clearance oder die Diurese, konnten dagegen nur

durch Metformin, nicht aber durch EMD, im Vergleich zur Placebogruppe signifikant

gebessert werden. Bei den mit dem neu entwickelten Medikament behandelten Tieren

zeigten sich vielmehr Hinweise auf eine glomeruläre Hypertrophie mit begleitender

Hyperfiltration.

Beiden Medikamenten konnte diese Studie keine positiven Wirkungen auf den

Fettstoffwechsel und die somit möglicherweise verlangsamte Progredienz von

Glomerulosklerose und Niereninsuffizienz attestieren. Eine Verminderung der Serum-

Cholesterinspiegel im Vergleich zur Placebogruppe und eine damit verbundene

Erniedrigung des Atheroskleroserisikos gelang weder mit EMD noch mit Metformin.

Hinsichtlich der morphologischen Nierenveränderung zeigte EMD eine ausgeprägtere

Wirkung als Metformin. Besonders vaskuläre Schäden, tubulointerstitielle Fibrose und

Glomerulosklerose konnten mit EMD 387008 effektiver bekämpft werden.

Es bleibt festzuhalten, dass EMD im vorliegenden Versuch vor allem hinsichtlich der

morphologischen Veränderungen vielversprechende Ergebnisse zeigte. Auch wenn

hinsichtlich der Nierenfunktion und hämatologischer Parameter des Glucosestoff-

wechsels im Vergleich zu den anderen Vergleichsgruppen teilweise keine signifikanten

Verbesserungen festgestellt werden konnten, erscheint damit eine genauere

Untersuchung des neu entwickelten Medikaments lohnenswert.

92 Diskussion

93 Literaturverzeichnis

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99 Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

AGE Advanced glycosilation end product

AMP Adenosinmonophosphat

EMD Merck© EMD 387008

GFR Glomeruläre Filtrationsrate

GSI Glomeruloskleroseindex

HDL high density lipoproteins

KG Körpergewicht

KI Konfidenzintervall

LDL low density lipoproteins

Met Metformin

MSI Mesangiolyseindex

PAI-1 plasminogen activator inhibitor-1

PAS „Periodic Acid Schiff“-Reaktion

PKC Proteinkinase C

S Serum

TF tissue factor

TGF-β transforming growth factor beta

TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor alpha

TSI Tubulointerstitieller Schädigungsindex

VLDL very low density lipoproteins

VSI Vaskulärer Schädigungsindex

ZDF Zucker diabetic fatty (Ratten-Tiermodell)

ZDF-F-P ZDF-Fatty-Ratte unter Placebogabe

ZDF-L-P ZDF-Lean-Ratte unter Placebogabe

100 Danksagung

Danksagung

Ich möchte mich bei Frau Prof. Dr. med. Kerstin Amann für die Überlassung des

Themas und die gute Betreuung während der gesamten Dauer dieser Arbeit bedanken.

Herrn Prof. Dr. med. A. Hartmann, Direktor des Pathologisch-Anatomischen Instituts

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, danke ich für die

Bereitstellung der Räumlichkeiten und der personellen Kapazitäten, sowie die

Möglichkeit, am Pathologischen Institut zu promovieren.

Besonders bedanken möchte ich mich bei den Mitarbeitern der AG Amann, allen voran

Monika Klewer, Miriam Reutelshöfer und Stefan Söllner, die mir in vielen

Fragestellungen und bei der Einarbeitung in die notwendigen Arbeitsschritte eine große

Hilfe waren. Auch die Mitdoktoranden trugen durch die gute Einweisung in die

Methodik und ihre große Hilfsbereitschaft maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit bei.

Schließlich gilt mein Dank meiner Familie, die den Fortgang der Arbeit mit großem

Interesse verfolgt und mich während jeder Arbeitsphase in vielerlei Hinsicht unterstützt

hat. Ganz besonders danke ich Matthias für seine grenzenlose Geduld, seinen Zuspruch

und seine Unterstützung.

101 Lebenslauf

Lebenslauf

Persönliches

Name Mareile Arntrudis Bezold, geb. Frank

Eltern Bernd Frank

Maria Frank

Geboren 22.09.1984 in Bayreuth

Werdegang

1990 – 1994 Besuch der Grundschule Herzoghöhe, Bayreuth; Klassen 1-4

1994 – 2003 Besuch des Humanistischen Gymnasium Christian Ernestinum, Bayreuth; Klassen 5-13

Abitur im Jahr 2003 mit Notenschnitt 1,0

Juni 2003 Erfolgreiches Ablegen der Stipendienprüfung zur Bayerischen Hochbegabtenförderung

Seit Oktober 2003 Studium der Humanmedizin an der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

September 2005 Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung

Famulaturen

03-04/2006 Famulatur im Labor für klinisch-chemische Demenzdiagnostik

08-09/2006 Unterassistentin in der Inneren Medizin am Universitätsspital Basel

09/2006 Famulatur in der Frauenklinik Bayreuth

8/2007 Famulatur in der Kinder- und Jugendpsychiatrie Erlangen

Dissertation

10/2006 Beginn der Dissertation am Pathologisch-Anatomischen Institut der Universität Erlangen-Nürnberg

Praktisches Jahr

102 Lebenslauf

08-12/08 Innere Medizin am Universitätsspital Basel/Schweiz

12/08-03/09 Chirurgie in der Allgemein- und Unfallchirurgie am Klinikum Bayreuth

03-07/09 Kinder- und Jugendpsychiatrie am Zentrum für psychische Gesundheit von Kindern und Jugendlichen der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Auszeichnungen

Stipendium Stipendiatin der Bayerischen Hochbegabtenförderung (BayBFG)

Documents

Vergleich der Auswirkung einer oralen Therapie mit ... · Aus dem Pathologisch-Anatomischen Institut der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med