Synthese und Charakterisierung von potenziellen Inhibitoren

des „Macrophage infectivity potentiator“ (Mip) Proteins

von Legionella pneumophila

-

Ein neuer Ansatz in der Legionellose-Therapie

Dissertation zur Erlangung des

Naturwissenschaftlichen Doktorgrades

der Julius-Maximilians-Universität Würzburg

Vorgelegt von

Christina Juli

aus Würzburg

Würzburg, 2012

Eingereicht am:……………………………………..

bei der Fakultät für Chemie und Pharmazie

1. Gutachter:………………………………………..

2. Gutachter:………………………………………..

der Dissertation

1. Prüfer:……………………………………………

2. Prüfer:……………………………………………

3. Prüfer:……………………………………………

des Öffentlichen Promotionskolloquiums

Tag des Öffentlichen Promotionskolloquiums:……………….

Doktorurkunde ausgehändigt am:……………………………

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Januar 2008 bis Januar 2012 am Institut für Pharmazie

und Lebensmittelchemie der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg unter der

Anleitung von Frau Professor Dr. Ulrike Holzgrabe mit finanzieller Unterstützung des

Sonderforschungsbereiches 630 angefertigt.

Teile dieser Arbeit wurden bereits in folgender Form veröffentlicht:

Originalarbeiten:

Juli, C.; Sippel, M.; Jäger, J.; Thiele, A.; Weiwad, M.; Schweimer, K.; Rösch, P.; Steinert,

M.; Sotriffer, C.A.; Holzgrabe, U.

Pipecolic Acid Derivatives As Small-Molecule Inhibitors of the Legionella MIP Protein

J. Med. Chem. 2011, 54(1), 277

Vorträge:

Juli, C.

Potential inhibitors of the Macrophage-infectivity-potentiator (MIP) protein of Legionella

pneumophila

Seminar im Rahmen des SFB 630, Würzburg 2012

Abstrakta und Kongreßmitteilungen:

Juli, C.; Sippel, M.; Sotriffer, C.A.; Faber, C.; Steinert, M.; Holzgrabe, U.

Design and Synthesis of novel MIP Inhibitors as Potential Compounds against Legionnaires

Disease

XXth International Symposium on Medicinal Chemistry, Wien 2008

Juli, C.; Sippel, M.; Faber, C.; Steinert, M.; Sotriffer, C.A.; Holzgrabe, U.

Pipecolic Acid Derivatives – Promising Agents against Legionnaires Disease

DPhG – Jahrestagung, Bonn 2008

Juli, C.; Sippel, M.; Faber, C.; Steinert, M.; Sotriffer, C.A.; Holzgrabe, U.

Analogues of Rapamycin as MIP Inhibitors of Legionella pneumophila

SFB 630 – Doktorandentagung, Bronnbach 2008

Chemie – Symposium der Studierenden Mainfrankens, Würzburg 2008

Juli, C.; Sippel, M.; Thiele, A.; Steinert, M.; Sotriffer, C.A.; Holzgrabe, U.

Design and Synthesis of Novel Lead Structures against MIP, a Target of Legionella

pneumophila

DPhG – Jahrestagung, Jena 2009

SFB 544 – Doktorandentagung, Heidelberg 2009

Sippel, M.; Juli, C.; Holzgrabe, U.; Sotriffer, C.A.

Legionnaires´ Disease and the Role of Legionella MIP: Fragment-Based Design and

Synthesis of the first Small-Molecule MIP Inhibitor

International Symposium of the Collaborative Research Center 630, Würzburg 2009

Juli, C.; Sippel, M.; Thiele, A.; Weiwad, M.; Jäger, J.; Steinert, M.; Schweimer, K.; Rösch,

P.; Sotriffer, C.A.; Holzgrabe, U.

The Importance of Inhibiting Infectivity Protein MIP for the Treatment of Legionellosis

DPhG – Jahrestagung, Braunschweig 2010

Chemie – Symposium der Studierenden Mainfrankens, Würzburg 2010

Juli, C.; Sippel, M.; Thiele, A.; Weiwad, M.; Jäger, J.; Steinert, M.; Schweimer, K.; Rösch,

P.; Sotriffer, C.A.; Holzgrabe, U.

MIP Inhibitors of the Pipecolic Acid Type as Potential Drugs against Legionellosis

Frontiers in Medicinal Chemistry, Saarbrücken 2011

Juli, C.; Weiwad, M.; Steinert, M.; Schwarzinger, S.; Rösch, P.; Holzgrabe, U.

Development of novel Inhibitors of MIP, a Target of Legionella pneumophila

Gemeinsame ÖPhG - DPhG – Jahrestagung, Innsbruck 2011

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich recht herzlich bei allen Personen und Freunden (die ich im

Einzelnen nicht nennen kann) bedanken, die mich während der Erstellung dieser Arbeit in den

verschiedensten Bereichen unterstützt haben.

Mein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. Ulrike Holzgrabe für die freundliche Aufnahme in ihren

Arbeitskreis, die äußerst interessante und abwechslungsreiche Aufgabenstellung, ihre Unterstützung

und immerwährende Diskussionsbereitschaft während der Promotion sowie das in mich gesetzte

Vertrauen, das mir selbstständiges und eigenverantwortliches Arbeiten und damit die erfolgreiche

Erstellung dieser Arbeit ermöglichte.

Weiterhin möchte ich all meinen Kooperationspartnern danken:

Prof. Dr. Christoph A. Sotriffer vom Institut für Pharmazie in Würzburg und seinen Mit-

arbeitern Dr. Martin Sippel und Michael Hein für die gute und freundschaftliche Zusammen-

arbeit sowie ihre Untersuchungen im Bereich des computergestützten Wirkstoffdesigns.

Dr. Matthias Weiwad und Dr. Alexandra Thiele sowie ihren Kollegen an der Max-Planck

Forschungsstelle für Enzymologie der Proteinfaltung in Halle für die mir entgegengebrachte

Gastfreundschaft und die Durchführung der enzymatischen Testungen.

Prof. Dr. Michael Steinert vom Institut für Mikrobiologie in Braunschweig sowie seinem

Mitarbeiter Jens Jäger für die Durchführung der In-vivo-Untersuchungen.

Prof. Dr. Paul Rösch vom Department of Biopolymers in Bayreuth sowie seinen Mitarbeitern

Dr. Kristian Schweimer und PD Dr. Stephan Schwarzinger für die Durchführung der NMR-

Bindungsstudien.

Prof. Dr. Thomas Rudel und Dr. Vera Kozjak-Pavlovic vom Institut für Mikrobiologie in

Würzburg für die Substanztestungen an Chlamydien und Neisserien.

Dr. Isobel Norville vom Defence Science and Technology Laboratory in Salisbury (UK) für

die freundliche Zusammenarbeit sowie die Untersuchungen an Burkholderien.

Dem SFB 630 - Teilprojekt Z1 für die Durchführung weiterer antimikrobieller Testungen.

Claudia Steinert und Alexander Hörst für ihre aufopferungsvollen Bemühungen bei der

Bestimmung der Enantiomerenreinheit.

Frau Ebner und Frau Möhler möchte ich recht herzlich für die freundliche Unterstützung in allen

bürokratischen Belangen sowie für die überaus erfrischenden Gespräche zwischendurch danken.

Dr. Sabine Niedermeier, Jessica Klöckner, Dr. Jens Schmitz, Dr. Tim Göbel und Dr. Eberhard Heller

danke ich für die nette Einführung in die chemische Synthese und die gute Zusammenarbeit im

„alten“ Großraumlabor 112.

Dr. Eberhard Heller danke ich für die zahlreichen Tipps und Ratschläge im Laboralltag sowie für die

Unterstützung bei diversen Synthese- bzw. NMR-Fragestellungen, ohne die man als Pharmazeut

manchmal recht hilflos gewesen wäre.

Für jegliche Unterstützung im Labor, sei es bei verschiedenen Synthesen oder der Beseitigung der

allgemeinen Unordnung, sowie für die netten Unterhaltungen bedanke ich mich bei Liana Pogorelaja.

Benjamin Schaefer, Christine Topf, Dr. Eva Kugelmann, Katja Heinig, Michaela Prinz und Dr. Petra

Kapkova danke ich für die angenehmen Gespräche während der Betreuung des Studentenpraktikums,

die die langen Nachmittage immer wieder schnell vergingen ließen.

Ein überaus großer Dank gilt Dr. Jens Schmitz für seine Mühe und Geduld beim Korrekturlesen.

Meinen Kollegen und Freunden Christine Topf, Diana Kesetovic, Georg Hiltensperger, Ines Schmidt,

Maximilian Tischer und Michaela Prinz möchte ich für die tolle Atmosphäre im „neuen“ 6er-

Syntheselabor danken. Die zahlreichen lustigen „Labormomente“ haben sehr zur allgemeinen

Aufhellung des Alltags beigetragen. Des Weiteren danke ich Georg, Max und Andi besonders für

ihre Diskussionsbereitschaft bei allen auftretenden synthetischen Problemen.

Christine, Georg, Max, Michi, Jens, Tim und Julia gilt ein großes Dankeschön für die vielen, auch

außeruniversitären fröhlichen Stunden (v.a. bei German) und eine unvergessliche Zeit in Würzburg.

Christine möchte ich besonders für die vielen Stunden v.a. im Rahmen des SFB 630 (wie bei der

Organisation der Bronnbach-Tagung, diversen Vorträgen und Tagungen) danken. Ohne Dich wäre

diese Zeit nur halb so angenehm und erheiternd geworden.

Den Randersackerern Max und Michi danke ich für die vielen wundervollen, gemeinsamen Abende

auf der Couch.

Ein ganz besonderer Dank geht an meine Eltern, Großeltern und meine Schwester für ihre großartige

Unterstützung während dieser Zeit sowie in allen Lebensbereichen und -lagen. Danke, dass Ihr

immer für mich da seid und mich einfach so nehmt wie ich bin!

Zu guter Letzt, danke ich meinem Schatz André. Danke, dass Du immer für mich da warst und bist.

Dass Du mich bei allem unterstützt und mir oftmals dabei geholfen hast, nicht den Boden unter den

Füßen zu verlieren. Ich freue mich auf eine wunderbare Zeit mit Dir!

„Darin besteht das Wesen der Wissenschaft:

Zuerst denkt man an etwas, das wahr sein könnte.

Dann sieht man nach, ob es der Fall

ist und im Allgemeinen ist es nicht der Fall.“

Bertrand Russell (1872-1970), brit. Philosoph u. Mathematiker

Meinen lieben Eltern und

meiner wunderbaren Schwester

INHALTSVERZEICHNIS I

1 EINLEITUNG ........................................................................................ 1

1.1 Legionellose .......................................................................................................... 1

1.1.1 Historischer Rückblick ..................................................................................................... 1

1.1.2 Erreger – Legionella pneumophila ................................................................................... 1

1.1.2.1 Vorkommen und parasitäre Lebensform .......................................................................... 2

1.1.2.2 Pathogenese und Epidemiologie ....................................................................................... 4

1.1.2.3 Therapie, Präventionsmaßnahmen und Diagnostik .......................................................... 5

1.1.2.4 Aufbau, Eigenschaften und Bestandteile der Zellwand .................................................... 7

1.1.3 Macrophage-Infectivity-Potentiator Protein ..................................................................... 9

1.1.3.1 Strukturelle und enzymatische Eigenschaften .................................................................. 9

1.1.3.2 Biochemische Analyse: Mip als Virulenzfaktor? ........................................................... 11

1.2 Immunsystem und immunsupprimierende Substanzen ................................. 14

1.2.1 Immunophiline ................................................................................................................ 15

1.2.1.1 FKBP12 – Strukturelle und zelluläre Eigenschaften ...................................................... 15

1.2.2 Makrozyklische Immunsuppressiva ............................................................................... 17

1.2.2.1 Immunologische Wirkung .............................................................................................. 17

1.2.2.2 Struktur-Wirkungsbeziehung .......................................................................................... 18

1.3 Strukturen der beiden PPIasen: Mip und FKBP12 ....................................... 20

1.3.1 Mip-Strukturen ............................................................................................................... 21

1.3.2 FKBP12-Strukturen ........................................................................................................ 23

1.3.3 Struktureller Vergleich der PPIasen ............................................................................... 24

1.4 Mip-ähnliche Strukturen anderer Mikroorganismen .................................... 27

1.4.1 Chlamydien ..................................................................................................................... 27

1.4.2 Trypanosomen ................................................................................................................ 28

1.4.3 Neisserien ....................................................................................................................... 29

1.4.4 Burkholderien ................................................................................................................. 30

1.5 Zielsetzung .......................................................................................................... 31

1.5.1 Chemische Synthese ....................................................................................................... 31

1.5.2 Pharmakologische Testung ............................................................................................. 33

II INHALTSVERZEICHNIS

2 DESIGN UND SYNTHESE DER ZIELVERBINDUNGEN .......................... 35

2.1 „Kleine“ Sulfonsäureamide .............................................................................. 35

2.1.1 Computergestützte Entwicklung neuartiger Mip-Inhibitoren ......................................... 35

2.1.2 Synthese der designten Sulfonsäureamid-Derivate ......................................................... 39

2.1.2.1 Darstellung von Derivaten mit der Grundstruktur A ...................................................... 40

2.1.2.1.1 Syntheseweg zur Herstellung der Phenylsulfonsäureamide 1a-1p ................................. 40

2.1.2.1.2 Syntheseweg zur Herstellung der Phenylsulfonsäureamide 2a-2c ................................. 42

2.1.2.1.3 Versuche der Synthese von N-((2-Oxo-oxazolidin-5-yl)methyl)benzylsulfonsäureamid 42

2.1.2.2 Darstellung von Derivaten mit der Grundstruktur B....................................................... 45

2.1.2.2.1 Syntheseweg zur Herstellung der Verbindungen 4a-4e .................................................. 45

2.1.2.2.2 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 5 ............................................................ 46

2.1.2.2.3 Syntheseweg zur Herstellung der Verbindungen 6a-6e .................................................. 46

2.1.2.3 Versuche der Synthese von Aminomethylphenylsulfon ................................................. 48

2.1.3 Diskussion des 1H-NMR-Spektrums von Verbindung 1k .............................................. 49

2.2 Pipecolinsäure-Derivate .................................................................................... 50

2.2.1 Docking-Untersuchungen von bekannten FKBP12-Inhibitoren ..................................... 50

2.2.2 Darstellung der Pipecolinsäure-Derivate ........................................................................ 52

2.2.2.1 Allgemeine Synthesestrategie zur Darstellung der Zielverbindung A ............................ 52

2.2.2.1.1 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 18a ........................................................ 52

2.2.2.1.2 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 18b ....................................................... 56

2.2.2.2 Allgemeine Synthesestrategie zur Darstellung der Zielverbindung B ............................ 57

2.2.2.2.1 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 22a ........................................................ 57

2.2.2.2.2 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 22b ....................................................... 58

2.2.2.2.3 Bestimmung der Enantiomerenreinheit von Verbindung 22b ........................................ 58

2.2.2.3 Allgemeine Synthesestrategie zur Darstellung von Pipecolinsäure-Derivaten mit der

Grundstruktur B .............................................................................................................. 60

2.2.2.3.1 Syntheseweg zur Herstellung der Verbindungen 19-21.................................................. 61

2.2.2.3.2 Syntheseweg zur Herstellung der Verbindungen 22-29.................................................. 62

2.2.2.4 Derivatisierungen am Aromaten der Sulfonsäureamidgruppe ........................................ 64

INHALTSVERZEICHNIS III

2.2.2.4.1 Syntheseweg zur Herstellung der Verbindungen 30a-30c ............................................. 64

2.2.2.4.2 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 33 ......................................................... 65

2.2.2.4.3 Syntheseweg zur Herstellung der Verbindungen 37a und 37b ...................................... 66

2.2.2.5 Variationen des Grundgerüsts der Zielverbindungen ..................................................... 69

2.2.2.5.1 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 38 ......................................................... 69

2.2.2.5.2 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 42 ......................................................... 70

2.2.2.5.3 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 44 ......................................................... 71

2.2.3 Diskussion des 1H-NMR-Spektrums von Verbindung 22a ............................................ 71

2.3 Weitere neu-„designte” Derivate ...................................................................... 75

2.3.1 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 46 ......................................................... 75

2.3.2 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 47 ......................................................... 76

2.3.3 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 48 ......................................................... 77

3 PHARMAKOLOGISCHE TESTUNGEN UND ERGEBNISSE .................... 79

3.1 In-vitro-Testsystem ............................................................................................ 79

3.1.1 Expression von Mip ........................................................................................................ 79

3.1.1.1 Klonierung und Transformation ..................................................................................... 79

3.1.1.2 Anzucht von E. coli-Bakterien ....................................................................................... 79

3.1.1.3 Zellaufschluss mittels mechanischer Lyse ...................................................................... 80

3.1.1.4 Reinigung von Mip ......................................................................................................... 80

3.1.2 Durchführung und Auswertung des PPIase-Assays ....................................................... 82

3.1.3 Ergebnisse ....................................................................................................................... 86

3.2 NMR-Bindungsstudien ...................................................................................... 90

3.2.1 Prinzip und Durchführung der 15

N-HSQC-NMR-Experimente ...................................... 90

3.2.2 Ergebnisse ....................................................................................................................... 91

3.3 In-vivo-Testsystem ............................................................................................. 93

3.3.1 Transwell-Assay ............................................................................................................. 93

3.3.2 Infektionsstudien ............................................................................................................ 93

3.3.2.1 Durchführung .................................................................................................................. 93

3.3.2.2 Ergebnisse ....................................................................................................................... 93

IV INHALTSVERZEICHNIS

3.4 Testungen an Mip-ähnlichen Proteinen .......................................................... 95

3.4.1 Pharmakologische Testungen an Neisserien und Chlamydien ....................................... 95

3.4.1.1 Infektionsstudien an N. gonorrhoeae .............................................................................. 95

3.4.1.2 Infektionsstudien an C. trachomatis ............................................................................... 96

3.4.2 Pharmakologische Testungen an Burkholderien ............................................................. 97

3.5 Antimikrobielle Aktivitäten gegen Protozoen ................................................ 97

4 ZUSAMMENFASSUNG ....................................................................... 101

5 SUMMARY ........................................................................................ 107

6 EXPERIMENTELLER TEIL ............................................................... 113

6.1 Allgemeine Angaben ....................................................................................... 113

6.1.1 Verwendete Geräte ........................................................................................................ 113

6.1.2 Chromatographie........................................................................................................... 114

6.1.3 Chemikalien und Lösungsmittel ................................................................................... 115

6.1.4 Abkürzungen ................................................................................................................. 116

6.2 Synthesevorschriften und analytische Daten ................................................ 117

6.2.1 Darstellung der Sulfonsäureamid-Derivate 1-6 ............................................................ 117

6.2.1.1 Synthese der Phenylsulfonsäureamide 1a-1p ............................................................... 117

6.2.1.2 Synthese der N,N-disubstituierten Phenylsulfonsäureamide 2a-2c............................... 121

6.2.1.3 Synthese von N-Benzylphenylsulfonsäureamid 3 ......................................................... 123

6.2.1.4 Synthese der N,N-Dimethylsulfonsäureamide 4a-4e .................................................... 124

6.2.1.5 Synthese von 3-Amino-N,N-dimethylphenylsulfonsäureamid 5 .................................. 126

6.2.1.6 Synthese der N-alkylierten 3-Amino-N,N-dimethylphenylsulfonsäureamide 6a-6e .... 127

6.2.2 Synthese der Piperidin-2-carbonsäureethylester 7a und 7b .......................................... 129

6.2.3 Synthese von 1-(2-Ethoxy-2-oxoacetyl)piperidin-2-carbonsäureethylester 8 .............. 130

6.2.4 Synthese von 3-Methyl-2-oxopentansäure 9 ................................................................. 131

6.2.5 Synthese von 1-(3-Methyl-2-oxopentanoyl)piperidin-2-carbonsäureethylester 10 ...... 132

6.2.6 Darstellung der Pipecolinsäureethylester-Amide 11 und 12 ......................................... 133

6.2.6.1 Synthese der Carbonsäureamide 11a-11c aus den entsprechenden Säurechloriden ..... 133

INHALTSVERZEICHNIS V

6.2.6.2 Synthese der Sulfonsäureamide 12a-12j aus den entsprechenden Sulfonsäurechloriden

...................................................................................................................................... 136

6.2.7 Synthese der Pipecolinsäure-Amide 13-15 ................................................................... 140

6.2.8 Synthese von 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)propan-1-ol 16 ........................................... 144

6.2.9 Synthese von 1,3-Diphenylpropan-1-ol 17 ................................................................... 145

6.2.10 Darstellung der Piperidinamid-2-carbonsäureester-Derivate 18-29 ............................. 146

6.2.10.1 Synthese der 1-(3-Methyl-2-oxopentanoyl)piperidin-2-carbonsäureester 18a und 18b

..................................................................................................................................... .147

6.2.10.2 Synthese der 1-(2-Phenoxyacetyl)piperidin-2-carbonsäureester 19a-19c .................... 148

6.2.10.3 Synthese der 1-(2-Phenylacetyl)piperidin-2-carbonsäureester 20a-20c ....................... 151

6.2.10.4 Synthese der 1-(2-(4-Chlorphenyl)acetyl)piperidin-2-carbonsäureester 21a-21c ........ 153

6.2.10.5 Synthese der 1-(Benzylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäureester 22a-22e ...................... 156

6.2.10.6 Synthese der 1-((4-Methylbenzyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäureester 23a und 23b

..................................................................................................................................... .158

6.2.10.7 Synthese der 1-((4-Chlorbenzyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäureester 24a und 24b . 160

6.2.10.8 Synthese von 1-((2-Nitrobenzyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(pyridin-3-yl)-

propyl)ester 25 .............................................................................................................. 161

6.2.10.9 Synthese der 1-(Phenylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäureester 26a-26i ....................... 162

6.2.10.10 Synthese der 1-((3-Nitrophenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäureester 27a-27e......... 166

6.2.10.11 Synthese von 1-(3-Methoxyphenylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(pyridin-3-yl)-

propyl)ester 28 .............................................................................................................. 168

6.2.10.12 Synthese von 1-Tosylpiperidin-2-carbonsäure-(3-(pyridin-3-yl)propyl)ester 29 ......... 169

6.2.11 Synthese der 1-((3-Aminophenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäureester 30a-30c ...... 170

6.2.12 Synthese von 1-((3-(3,3-Dimethylureido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäureethyl-

ester 31 .......................................................................................................................... 172

6.2.13 Synthese von 1-((3-(3,3-Dimethylureido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure 32

..................................................................................................................................... .173

6.2.14 Synthese von 1-((3-(3,3-Dimethylureido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-

(pyridin-3-yl)propyl)ester 33 ........................................................................................ 174

6.2.15 Darstellung von BOC-geschützten Aminosäuren 34 .................................................... 175

VI INHALTSVERZEICHNIS

6.2.15.1 Synthese von 4-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)buttersäure 34a und 3-((tert.-Butoxy-

carbonyl)amino)propionsäure 34b ................................................................................ 175

6.2.15.2 Synthese von 2-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)essigsäure 34c ..................................... 176

6.2.16 Synthese von 1-((3-(3-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)propanamido)phenyl)sulfonyl)-

piperidin-2-carbonsäureethylester 35a und 1-((3-(2-((tert.-Butoxy-carbonyl)amino)-

acetamido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäureethylester 35b ............................. 177

6.2.17 Synthese von 1-((3-(3-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)propanamido)phenyl)sulfonyl)-

piperidin-2-carbonsäure 36a und 1-((3-(2-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)acetamido)-

phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure 36b .............................................................. 179

6.2.18 Synthese von 1-((3-(3-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)propanamido)phenyl)sulfonyl)-

piperidin-2-carbonsäure-(3-(pyridin-3-yl)propyl)ester 37a und 1-((3-(2-((tert.-Butoxy-

carbonyl)amino)acetamido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(pyridin-3-yl)-

propyl)ester 37b ............................................................................................................ 180

6.2.19 Synthese von N-(3-Phenylpropyl)-1-(phenylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäureamid 38

...................................................................................................................................... 182

6.2.20 Synthese von 2-Amino-4-methylpentansäureethylester 39 .......................................... 183

6.2.21 Synthese von 4-Methyl-2-(3-methyl-2-oxopentanamido)pentansäureethylester 40 ..... 183

6.2.22 Synthese von 4-Methyl-2-(3-methyl-2-oxopentanamido)pentansäure 41 .................... 184

6.2.23 Synthese von 4-Methyl-2-(3-methyl-2-oxopentanamido)pentansäure-(3-(pyridin-3-yl)-

propyl)ester 42 .............................................................................................................. 185

6.2.24 Synthese von Pyrrolidin-2-carbonsäureethylester 43.................................................... 186

6.2.25 Synthese von 1-(3-Methyl-2-oxopentanoyl)pyrrolidin-2-carbonsäureethylester 44 ..... 187

6.2.26 Synthese von 2-(4-Isopropylphenoxy)essigsäure 45 .................................................... 188

6.2.27 Synthese von 2-(4-Isopropylphenoxy)-1-morpholinessigsäureamid 46 ....................... 189

6.2.28 Synthese von 5-Methyl-2-phenyl-1H-pyrazol-3(2H)-on 47 ......................................... 190

6.2.29 Synthese von 2-Amino-4-(methylsulfinyl)buttersäureethylester 48 ............................. 191

6.3 Expression von Mip ......................................................................................... 192

6.3.1 Verwendete Geräte ........................................................................................................ 192

6.3.2 Klonierung und Transformation des Mip-Gens ............................................................ 192

6.3.3 Anzucht von E. coli-Bakterien ...................................................................................... 192

6.3.4 Aufschluss der E. coli-K12-HB101-Zellkulturen ......................................................... 193

INHALTSVERZEICHNIS VII

6.3.5 Säulenchromatographische Reinigung von Mip ........................................................... 193

6.3.6 Dialyse von gereinigtem Mip ....................................................................................... 195

6.4 Enzymatischer Assay ....................................................................................... 195

6.4.1 Verwendete Geräte ....................................................................................................... 195

6.4.2 Herstellung der Puffer- bzw. Stammlösungen .............................................................. 196

6.4.3 Protease-gekoppelter PPIase-Assay .............................................................................. 196

7 ANHANG .......................................................................................... 199

7.1 Überblick synthetisierter Verbindungen ....................................................... 199

7.2 logP-Werte synthetisierter Verbindungen .................................................... 202

8 LITERATURVERZEICHNIS................................................................ 205

EINLEITUNG 1

1 EINLEITUNG

1.1 Legionellose

1.1.1 Historischer Rückblick

Am 01.01.2001 trat in der Bundesrepublik Deutschland das Gesetz zur Verhütung und Bekämpfung

von Infektionskrankheiten beim Menschen (Infektionsschutzgesetz - IfSG) in Kraft. Ziel des

Gesetzes ist es, „übertragbaren Krankheiten beim Menschen vorzubeugen, Infektionen frühzeitig zu

erkennen und ihre Weiterverbreitung zu verhindern“ (§1 IfSG).1

Aus diesem Grund wird eine Meldepflicht über den Krankheitsverdacht, die eigentliche Erkrankung

oder den durch die Krankheit bedingten Tod für bestimmte Infektionskrankheiten durch §7 des

Gesetzes vorgeschrieben. Neben Infektionskrankheiten wie Tuberkulose, Masern oder Hepatitis zählt

auch die Legionellose zu diesen meldepflichtigen Erkrankungen.

Erstmals trat die Legionellen-Infektion im Jahr 1976 in Philadelphia/USA auf. Bei einem

Veteranentreffen der American Legion im Bellevue Stratford Hotel erkrankten 182 Teilnehmer an

einer schweren Lungenentzündung, wobei in 29 Fällen die Erkrankung, für die bis zu diesem

Zeitpunkt noch kein Erreger bekannt war, tödlich verlief.2 Nach kurzer Zeit, in der zahlreiche

biologische Untersuchungen durchgeführt wurden, gelang es den Mikrobiologen des Center of

Disease Control Joseph McDade und Charles Shepard im Januar 1977 ein gramnegatives Bakterium

als ursächlichen Erreger dieses Ausbruchs zu identifizieren.3 Da alle Erkrankten Mitglieder der

American Legion waren, wurde das Bakterium Legionella pneumophila genannt und die Krankheit

als Legionärskrankheit bezeichnet. In darauf folgenden retrospektiven Studien konnte mittels

Antikörper-Titer-Bestimmung von ehemals Erkrankten gezeigt werden, dass bereits vergangene

Pneumonie-Epidemien wie ein Ausbruch 1957 in Austin4, 1965 im St Elizabeth´s Hospital in

Washington5 und auch 1968 in Pontiac

6 ebenfalls auf das Bakterium L. pneumophila zurückgeführt

werden können. Damals konnte auf Grund der eingeschränkten diagnostischen Möglichkeiten kein

ursächlicher Erreger identifiziert werden.

1.1.2 Erreger – Legionella pneumophila

Da L. pneumophila zunächst keiner Bakteriengattung zugeordnet werden konnte, wurde ein Jahr nach

der Entdeckung die Gattung der Legionellen (Legionella) erschaffen. Neben L. pneumophila wurden

mit Hilfe neuer Methoden im Bereich der Bakterienisolation und Kultivierung nun auch Bakterien,

die in den 40er Jahren irrtümlicher Weise zu der Gattung der Rickettsien gezählt wurden, als

2 EINLEITUNG

Legionella ssp. identifiziert. Bis heute sind mehr als fünfzig gramnegative, stäbchenförmige Vertreter

innerhalb der Familie der Legionellaceae bekannt. Nahezu alle diese Arten kommen ubiquitär in

natürlichem Süßwasser vor. Als einzige Ausnahme ist L. longbeachae zu nennen, welches im

Erdboden seinen natürlichen Lebensraum findet. Fast die Hälfte aller Legionellen-Arten ist potenziell

humanpathogen und kann nach der Aufnahme in den menschlichen Körper schwere

Lungenentzündungen auslösen. In 90 % all dieser Pneumonie-Fälle heißt der Erreger L.

pneumophila. Von dieser Art sind bis heute 15 verschiedene Serotypen bekannt.7

1.1.2.1 Vorkommen und parasitäre Lebensform

L. pneumophila tritt ubiquitär in natürlichen Süßwassersystemen wie Seen und Flüssen und auch in

künstlich geschaffenen, wie z.B. Kühltürmen, Schwimmbädern oder Klimaanlagen auf. Für

optimales Wachstum und Vermehrung benötigen die Bakterien ein zusätzliches Wirtssystem. In der

natürlichen Umgebung parasitiert L. pneumophila hauptsächlich in Protozoen wie Acanthamoeba,

Hartmanella und Naegleria. Während die Legionellen-Konzentration in diesem natürlichen Habitat

jedoch eher gering ist, kann sie in den künstlich geschaffenen Süßwassersystemen relativ hohe Werte

erreichen. Grund dafür ist, dass der Erreger dort meist in Form von komplexen Biofilmen gefunden

wird. Solche Biofilme stellen eine Ansammlung der Mikroorganismen und ihrer Ausscheidungen dar

und entstehen hauptsächlich an Grenzflächen. Eine Vielzahl von äußeren Einflüssen kann die

Bakterienzahl in einem solchen Komplex zusätzlich steigern. Zu den optimalen Wachstums-

bedingungen zählen u.a. Temperaturen zwischen 30 und 40 °C, eine regelmäßige Zufuhr von

Frischwasser und eine lange Verweildauer der Bakterien. Auch in einem solchen Verband sind das

Wachstum und die Vermehrung von L. pneumophila von der Anwesenheit eines Wirtssystems

abhängig.8

Während eines parasitären Lebenszyklus durchläuft das Bakterium zwei verschiedene Phasen: Die

nicht-replikative bzw. stationäre und die replikative Phase. Der erste Kontakt zwischen Bakterium

und Wirtszelle findet in der nicht-replikativen Phase statt, in der der Mikroorganismus in seiner

infektiösen, begeißelten Form vorliegt. In dieser Zeit zeichnet sich das Bakterium vor allem durch

seine Natriumsensitivität und seine Stressresistenz aus. Durch eine Anlagerung an die Wirtszelle

gelangt L. pneumophila zuerst durch unterschiedliche Transportmechanismen in die Zelle. Dort wird

das Bakterium sofort in einem Phagosom eingeschlossen. Die Phagosomenmembran wird zunächst

von Mitochondrien und Wirtszellvesikeln, später von Teilen des rauen Endoplasmatischen

Retikulums umgeben.9 Auf Grund dieser besonderen Ummantelung kann das bakterielle Phagosom

nicht mehr mit Lysosomen fusionieren, weshalb die Legionellen vor schädlichen äußeren Einflüssen

und intrazellulärem Abbau geschützt sind.10

Auf die Bildung des Phagosoms folgt die replikative

EINLEITUNG 3

Phase, in der sich das Bakterium vermehrt. Dabei befindet es sich in einem nicht begeißelten, nicht

infektiösen und weniger Stress resistenten Zustand. Nach vollständiger Replikation wird zuerst die

Phagosomenmembran aufgelöst und anschließend die bakteriellen Nachkommen durch speziell

gebildete Poren oder in Vesikeln eingelagert an die wässrige Umgebung abgegeben. Von dort werden

die Bakterien entweder erneut von Protozoen phagozytiert oder bilden komplexe Biofilme auf

natürlichem Untergrund, um dort zu persistieren.11

In einem solchen Verbund sind die Legionellen

zwar überlebensfähig, jedoch nicht kultivierbar. In eben diesem Zustand gelangen sie zuerst in unser

Trinkwassersystem und von dort über technische Vektoren wie Klimaanlagen, Schwimmbäder oder

Duschköpfe in den menschlichen Organismus. Durch die Inhalation kontaminierter Aerosole sind die

Bakterien in der Lage die menschliche Lunge zu befallen und eine pulmonale Infektion auszulösen.12

Die Fähigkeit, die menschliche Lunge zu besiedeln und sich gleichzeitig dort zu vermehren, lässt auf

einen humanen Lebenszyklus von L. pneumophila schließen, der dem natürlichen Parasitismus

ähnlich ist. Anstelle von Protozoen werden im menschlichen Körper jedoch hauptsächlich alveoläre

Makrophagen als Wirtssystem herangezogen.

Legionellen Legionellen-tragende Vakuole

ER Mitochondrien

Abb. 1: Parasitärer Lebenszyklus von L. pneumophila in einer Makrophagenzelle: (1) Phagozytose; (2)

Speziell ummanteltes Phagosom; (3) Replikation; (4) Ausschleusen der bakteriellen Nachkommen (modifiziert

nach 13

)

Der Phagozytosemechanismus (siehe (1) in Abb. 1) in der menschlichen Lunge ist bis heute noch

nicht vollkommen aufgeklärt. In der Literatur werden mehrere sehr unterschiedliche

Transportmechanismen beschrieben, weshalb in diesem Kapitel nicht näher darauf eingegangen

werden soll.7 Nach der Aufnahme in die Makrophagenzelle befinden sich die Legionellen zunächst

eingeschlossen in einer Vakuole (siehe (2) in Abb. 1), die wie ihr natürliches Vorbild nicht mit

Makrophagenzelle

Nukleus

1

1

1

2

3

4

4 EINLEITUNG

Lysosomen fusionieren kann. Somit werden die Bakterien auch im Inneren einer humanen

Makrophagenzelle nicht abgebaut. Nach dieser stationären Phase folgt, wie oben beschrieben, die

replikative, in der sich die Bakterien zuerst vermehren (siehe (3) in Abb. 1) und anschließend die

Vakuole auflösen. Um die Makrophagenzelle danach wieder verlassen zu können, bilden die

Legionellen Poren in der Wirtszellwand (siehe (4) in Abb. 1) und verursachen damit den Untergang

der Zelle.7 Wie erwähnt, persistieren die Legionellen nun solange in der menschlichen Lunge bis der

parasitäre Lebenszyklus von Neuem beginnt. In dieser Zustandsform sind die Bakterien in der Lage

auch auf andere Organe wie die Milz überzugehen.

Der Übergang aus einem nicht kultivierbaren in einen kultivierbaren, infektiösen Zustand und die

parasitäre Lebensform im Allgemeinen bestätigen auch die Tatsache, dass eine Übertragung dieser

Bakterien von Mensch zu Mensch bisher nie stattgefunden hat.

1.1.2.2 Pathogenese und Epidemiologie

Nach der Inhalation kontaminierter Aerosole und der damit verbundenen Besiedelung der

menschlichen Lunge ist L. pneumophila in der Lage eine pulmonale Infektion hervorzurufen. Hierbei

muss zwischen zwei verschiedenen Krankheitsverlaufsformen differenziert werden: Dem Pontiac-

Fieber und der Legionärskrankheit. Die Verwendung des Begriffs „Legionellose“ steht in der

nachfolgenden Arbeit für die Zusammenfassung der beiden Verlaufsformen.

Das Pontiac-Fieber, benannt nach dem Ort des ersten Ausbruchs,6 ist eine milde Atemwegs-

erkrankung, die in ihren Symptomen einer gewöhnlichen Influenza ähnelt. Die Krankheit zeichnet

sich durch leichtes Fieber, Kopfschmerzen, Myalgien und allgemeines Unwohlsein aus. Obwohl es

sich um eine Atemwegserkrankung handelt, können weder eine Entzündung noch Infiltrationen der

Lunge beobachtet werden. Nach einer Inkubationszeit von ca. 36 h limitiert sich die Krankheit in

einem Zeitraum von zwei bis fünf Tagen selbst.6 Die Inzidenzrate bei dieser Form der Legionellose

liegt bei ca. 95 %.14

Die Legionärskrankheit ist eine starke, zum Teil tödlich verlaufende Lungenentzündung. Nach einer

relativ langen Inkubationszeit, die bis zu zehn Tage andauern kann, klagen die Erkrankten über

Symptome wie Kopfschmerzen, hohes Fieber, Myalgien, Husten, Dyspnoen, Schmerzen beim Atmen

und Diarrhoen. Nicht selten wird auch ein Deliriums-artiger Zustand beschrieben. Im Gegensatz zum

Pontiac-Fieber manifestiert sich in fast allen Fällen eine schwere Lungenentzündung mit

Infiltrationen von Fibrin, Makrophagen und Neutrophilen (siehe Abb. 2), die unbehandelt zum Tod

führen kann. Im Fall der schweren Verlaufsform überschreitet die Zahl der Neuerkrankungen die 5 %

nicht.14

Dieser eher niedrige Wert bestätigt die Hypothese, dass hauptsächlich ältere,

immunsupprimierte Personen, Raucher und Patienten mit Herz-Kreislaufproblemen von der

EINLEITUNG 5

Legionärskrankheit betroffen sind. Des Weiteren sei zu erwähnen, dass die Inzidenzrate bei Männern

deutlich höher ist als bei Frauen. Fast 40 Jahre nach der Entdeckung des Bakteriums liegt die

Mortalitätsrate im Fall der Legionärskrankheit heute - trotz einer großen Bandbreite an Antibiotika -

noch immer zwischen 5 und 30 %.15

Auf Grund dieser hohen Letalität haben die Suche nach neuen

Angriffspunkten für bereits bekannte Arzneistoffe und die Entwicklung strukturell neuartiger

Chemotherapeutika höchste Priorität für die pharmazeutische Arzneimittelentwicklung.

Abb. 2: Aufnahme eines Thorax mit Legionellen-Pneumonie: Verschattung im rechten Lungenunterfeld mit

Auslöschung der rechten Herzkontur und einer scharfen Begrenzung zum rechten Oberlappen (freundlicher

Weise zur Verfügung gestellt: PD Dr. Langen, CA Radiologie, Missionsärztliches Institut, Würzburg)

1.1.2.3 Therapie, Präventionsmaßnahmen und Diagnostik

Die ersten Fälle der Legionärskrankheit wurden 1976 erfolgreich mit dem Makrolid-Antibiotikum

Erythromycin behandelt. Im Tiermodell konnte kurz darauf gezeigt werden, dass eine

Kombinationstherapie mit Rifampicin vor allem bei schweren Fällen eine tödlich verlaufende

Infektion verhindern kann, während β-Lactam-Antibiotika wie Penicillin G und Aminoglykoside wie

Gentamicin kaum eine Wirkung zeigten.16

Bis heute ist Erythromycin das Mittel der Wahl bei der

Therapie der Legionärskrankheit. Das Robert-Koch-Institut (RKI) empfiehlt eine Behandlung über

einen Zeitraum von 14 Tagen, wobei die Einnahmedauer des Antibiotikums bei immungeschwächten

Patienten auf drei Wochen ausgedehnt werden sollte.17

Für eine erfolgreiche Therapie sollte in einem

Zeitraum von sechs Stunden eine Dosis von 500 mg (oral oder i.v.) nicht unterschritten werden.18

Neben Erythromycin können auch neuere Makrolide wie Azithromycin und Clarithromycin oder

Chinolone, wie z.B. Ciprofloxacin und Moxifloxacin, zur Infektionsbekämpfung herangezogen

werden.

6 EINLEITUNG

Im Gegensatz zur Therapie der Legionärskrankheit, ist der Einsatz von Antiinfektiva im Fall des

Pontiac-Fiebers nicht erforderlich. In den Therapieleitlinien des RKI für Ärzte wird lediglich eine

symptomatische Behandlung empfohlen.17

Sobald dem RKI ein Legionellosefall vorliegt, versucht man mittels Standardmethoden wie der

Bakterienkultivierung oder serologischen Methoden, wie z.B. der Pulsed-Field-Elektrophorese oder

der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), den bakteriellen Vektor zu ermitteln. Ist der Erreger sowie

sein Aufenthaltsort eindeutig identifiziert, wird sofort die dort auftretende bakterielle Konzentration

bestimmt. Als quantitative Messgröße dient hierbei die Angabe von Koloniebildenden Einheiten

(KbE). Steigt dieser Parameter über einen Wert von 1 KbE/ml, sollten desinfizierende Maßnahmen

eingeleitet werden.12

In der Vergangenheit zeigten der Einsatz von heißem Wasser, ultraviolettem

Licht, Silberionen oder Chlor den größten Erfolg.19

Um das Risiko einer Legionellen-Epidemie jedoch schon vorher weitgehend zu minimieren,

verpflichtet die am 01.11.2011 in Kraft getretene Änderung der Trinkwasserverordnung (TrinkwV)20

Eigentümer von Mehrfamilienhäusern mit Großanlagen zur Trinkwassererwärmung (Inhalt ≥ 40 L)

einerseits zur Anzeige der Anlage, andererseits zu einer jährlichen Untersuchung auf Legionellen.

Generell sollte bei der Trinkwassererwärmung beachtet werden, dass die Zirkulationstemperatur des

Wassers 55 °C nicht unterschreitet und dass das in Boilern stehende Wasser mindestens einmal am

Tag auf 60 °C erhitzt wird. Desweitern sind lange und stagnierende Leitungsabschnitte sowie

Toträume generell zu vermeiden.

Vor der Einführung dieser Richtlinien kam es auch in der heutigen Zeit immer wieder zu vor allem

Reise-assoziierten oder nosokomialen Epidemien. Der letzte große Ausbruch in Deutschland

ereignete sich im Januar 2010 in einer Firma in Ulm. In diesem Fall wurde wahrscheinlich eine

unzureichende Menge an Biozid zur Verhinderung der Trinkwasserverkeimung verwendet, so dass

sich der Erreger sehr leicht über das Kühlwassersystem ausbreiten konnte. Infolgedessen wurden 64

Legionellosefälle verzeichnet, von denen fünf tödlich verliefen.21,22

Im gleichen Jahr wurden dem

RKI insgesamt 690 Fälle einer klinisch manifestierten Legionellose gemeldet.23

Diese Zahl stellt

jedoch keinesfalls die tatsächliche Rate an Neuinfektionen innerhalb eines Jahres dar.

Hochrechnungen einer Pneumonie-Studie des Kompetenznetzwerks „Community acquired

Pneumonia“ (CAPNETZ) zufolge, liegt die Zahl der Neuerkrankungen in Deutschland bei 15.000-

20.000 pro Jahr.24

Der Grund der unverhältnismäßig niedrigen Anzahl an Meldungen im Vergleich

zu den tatsächlich auftretenden Krankheitsfällen ist vermutlich die Tatsache, dass eine Legionellose

nur durch spezielle mikrobiologische Untersuchungen von anderen eher harmlosen Pneumoniearten

abgegrenzt werden kann. In der bakteriellen Diagnostik finden diese teilweise aufwendigen

Methoden aber auf Grund der hohen Kosten kaum Anwendung.

Den Goldstandard der diagnostischen Verfahren stellt die Anzucht von Legionellen dar. Als

Untersuchungsquelle kann entweder Sputum, Lungengewebe oder Blut herangezogen werden, wobei

die Anzucht aus Lungengewebe am besten gelingt. Nach erfolgreicher Kultivierung folgt bei dieser

EINLEITUNG 7

diagnostischen Methode eine serologische Typisierung der Bakterien, meist mit Hilfe monoklonaler

Antikörper. Diese Typisierung ist von großer Bedeutung, da im Fall von L. pneumophila 15

verschiedene Serogruppen bekannt sind. Nicht alle dieser Unterarten sind jedoch in der Lage eine

pulmonale Erkrankung hervorzurufen. Da Serogruppe 1 in 84 % aller Infektionen die Hauptursache

darstellt, kann bei einem solchen positiven Nachweis eine gezielte Therapie erfolgen. Da die

Kultivierung von Bakterien jedoch oft mit hohem Aufwand und nicht selten auch mit schlechtem

Erfolg verbunden ist, soll der Nachweis von Nukleinsäuren aus respiratorischem Material mittels

PCR in Zukunft die Diagnostik der Legionellose verbessern.

Als weitere diagnostische Methode sei der Antigennachweis aus diversen Untersuchungsmaterialien

zu nennen. Am häufigsten wird die Bestimmung aus Urin durchgeführt. Im Urin können bereits ein

bis drei Tage nach Ausbruch der Infektion spezifische Lipopolysaccharide von L. pneumophila

identifiziert und mit Hilfe eines speziellen Enzymimmunoassays (ELISA) detektiert werden. Bei

diesem Nachweisverfahren wird jedoch nur eine Serogruppe erfasst, während beim Antigennachweis

aus respiratorischem Material alle Serogruppen des Bakteriums nachgewiesen werden können. Als

Antigen fungiert dabei ein äußeres Membranprotein von L. pneumophila. Dieses Protein bindet

während eines direkten Immunofluoreszenzassays (DFA) an einen fluoreszenzmarkierten, Spezies-

spezifischen monoklonalen Antikörper und kann somit detektiert werden.

Seit Entdeckung des Erregers bis heute wird als Standardmethode jedoch der Antikörpernachweis in

Form eines indirekten Immunofluoreszenztests (IFA) durchgeführt. Als Testantigen sollten mehrere

Serogruppen von L. pneumophila, nicht nur die infektiöse Serogruppe 1, herangezogen werden. Da

es bei einigen Patienten jedoch zu einer zeitlich verzögerten Antikörperbildung kommen oder diese

in 30 % aller Infektionen sogar ganz ausbleiben kann, sollte der Enzymimmunoassay aus Urin dem

Antikörpernachweis vorgezogen werden.25

1.1.2.4 Aufbau, Eigenschaften und Bestandteile der Zellwand

Um für die Legionellosetherapie neue Antiinfektiva zu entwickeln, müssen zum einen die

Mechanismen der bakteriellen Infektion, zum anderen der genaue Aufbau der Legionellen bekannt

sein. Eine wichtige Rolle spielt hier die Beschaffenheit und die Zusammensetzung der bakteriellen

Zellwand. Wie bei anderen gramnegativen Bakterien setzt sich diese aus drei verschiedenen

Schichten zusammen (siehe Abb. 3).

8 EINLEITUNG

Abb. 3: Schematischer Aufbau der Zellwand von L. pneumophila (modifiziert nach Shevchuk et al.26

)

Das Zellinnere, auch Zytoplasma genannt, wird von einer inneren Membran (IM) umgeben, die auch

als zytoplasmatische oder Plasmamembran bezeichnet werden kann. Sie besteht aus einer

Phospholipiddoppelschicht, in die viele verschiedene Proteine eingelagert sind, die eine wichtige

Rolle im bakteriellen Metabolismus spielen. Zu ihnen zählen Eisen- bzw. Peptidtransporter,

Adenylatzyklasen und Methyltransferasen. Direkt an die IM schließt sich das Periplasma (PP) an,

welches sich aus Peptidoglykanen und größtenteils detoxifizierenden Proteinen zusammensetzt. Ihre

Hauptaufgabe besteht darin, radikalische Sauerstoffspezies abzufangen und abzubauen. An das PP

grenzt die Außenmembran (AM), die das Bakterium von seiner Umwelt abgrenzt und somit eine

erste Kontaktstelle für andere Zellen, Substanzen und auch für Arzneistoffe darstellt. Wie die

Innenmembran besteht die äußere Membran aus zwei Schichten, die sich jedoch in ihrer

Zusammensetzung unterscheiden: Während die nach innen gewandte Seite zum Großteil aus

Phospholipiden besteht, sind Lipopolysaccharide (LPS) die Hauptbestandteile der äußeren Schicht.

Diese LPS fungieren hauptsächlich als immundominante Antigene der Legionellen und können somit

während eines diagnostischen Verfahrens mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern detektiert werden

(siehe Kapitel 1.1.2.3). Neben den LPS beinhaltet die äußere Membran noch ungefähr 250 weitere

Proteine, deren gesamte Funktionen noch nicht vollständig aufgeklärt sind. In Tabelle 1 sind einige

wichtige Vertreter dieser AM-Proteine und ihre Aufgaben aufgelistet.

EINLEITUNG 9

Protein Bezeichnung Funktion

Peptidoglykan-assoziiertes

Lipoprotein PAL

Aktivierung von murinen

Makrophagen;

Induktion der Sekretion von

Zytokinen

Typ-4-Sekretionssystem DotC/DotD

IcmN Intrazelluläres Überleben

Phospholipase A /

Lysophospholipase A PlaB Hämolytische Aktivität

„Major outer membrane“-

Protein MOMP Adhäsion an Wirtszelle

Hitze-Schock-Protein 60 HSP60 Adhäsion und Invasion von

HeLa-Zellen

Kollagen-ähnliches Protein Lcl Adhäsion und Invasion von

Wirtszellen

„Macrophage infectivity

potentiator“-Protein Mip

Transmigration in Wirtszelle

und effiziente Replikation

Tabelle 1: Wichtige Oberflächenstrukturen von L. pneumophila und ihre Funktionen26

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Zellwand von L. pneumophila eine große Zahl an

diversen Funktionen umfasst: Zum einen bietet sie dem Mikroorganismus Schutz vor äußeren

schädlichen Einflüssen und stellt eine erste Kontaktfläche für andere Organismen dar, zum anderen

beinhaltet sie Bestandteile auf ihrer Oberfläche, die nicht selten den Grund für die bakterielle

Pathogenität darstellen. D.h. die Oberflächenproteine von L. pneumophila sind größtenteils für die

bakterielle Adhäsion an die Wirtszelle und die Invasion in die Wirtszelle verantwortlich und scheinen

eine besondere Stellung innerhalb der humanen Pathogenitätsfaktoren der Legionellen

einzunehmen.26

Die AM-Proteine könnten demnach mögliche neue Angriffspunkte für Chemo-

therapeutika darstellen.

1.1.3 Macrophage-Infectivity-Potentiator Protein

1.1.3.1 Strukturelle und enzymatische Eigenschaften

Zu den eben genannten Oberflächenproteinen gehört auch das „Macrophage Infectivity Potentiator“

(Mip)-Protein. In der nachfolgenden Arbeit wird für das Mip-Protein lediglich die Bezeichnung

„Mip“ verwendet. Mip stellt ein nichtglobuläres Homodimer in V-Form dar (siehe Abb. 4). Ein

Monomer besitzt ein Molekulargewicht von 22.8 kDa und setzt sich aus zwei verschiedenen

Domänen zusammen. Eine Domäne bildet der sogenannte N-Terminus. Er spielt eine zentrale Rolle

bei der Bildung des biologisch aktiven Dimers, welches hauptsächlich durch hydrophobe

10 EINLEITUNG

Wechselwirkungen stabilisiert wird. Der N-Terminus ist über eine sehr lange, freistehende und

dadurch flexible α-Helix mit dem C-Terminus verknüpft.

Abb. 4: Kristallstruktur von Mip (1FD9); (Wiedergabe nach Riboldi-Tunnicliffe et al.27

mit Genehmigung der

Nature Publishing Group)

Er ähnelt strukturell sehr den humanen FK506-bindenden Proteinen (FKBP), speziell dem Vertreter

FKBP12. Diese Proteine spielen eine wichtige Rolle innerhalb des menschlichen Immunsystems, wo

sie u.a. als Rezeptoren für immunsuppressive Substanzen fungieren. Eine genauere Betrachtung der

FKBPs und der strukturelle Vergleich von Mip und FKBP12 folgen in Kapitel 1.2 und 1.3. Wie seine

verwandten humanen Proteine weist der C-Terminus von Mip eine Peptidyl-prolyl-cis/trans-

Isomerase (PPIase)-Aktivität auf (siehe Abb. 5), d.h. er ist in der Lage, die cis/trans-Umlagerung von

Prolyl-Peptidbindungen in Oligopeptiden und Proteinen zu katalysieren.27,28

Abb. 5: Cis/trans-Umlagerung eines Prolin-haltigen Peptids

N-Terminus

C-Terminus

EINLEITUNG 11

Während gewöhnlich die Rotationen um die Winkel Cα-(C=O) und N-Cα1 von Peptidbindungen im

gesamten Bereich von 0 – 360 ° sehr schnell verlaufen, ist die freie Drehbarkeit des (C=O)-N-

Winkels durch den partiellen Doppelbindungscharakter stark eingeschränkt - d.h. sie bewegt sich nur

im Bereich von 0 – 180 °. Von einem Peptid können daher zwei Konformationsisomere (0 ° = cis;

180 ° = trans) existieren, wobei der natürliche Anteil des cis-Isomers im Fall von normalen

sekundären Peptidbindungen ((C=O)-NH) gewöhnlich unter einem Prozent liegt. Eine Ausnahme

hiervon stellen jedoch die tertiären Peptidbindungen zwischen einem N-terminalen Prolin und einer

weiteren Aminosäure dar (Xaa-Pro) (siehe Abb. 5). In diesem speziellen Fall kann das cis-Konformer

einen viel höheren Wert (10 - 40 %) im konformeren Gleichgewicht einnehmen. Die cis/trans-

Isomerisierung von solchen Xaa-Pro-Peptiden findet auf Grund der recht hohen Aktivierungsenergie

(ca. 80 kJ/mol) nur langsam statt.29

Dies hat nachfolgend einen erheblichen Einfluss auf die

Proteinfaltung, da die Ausbildung der Tertiärstruktur solcher Peptide teilweise gehemmt ist und nur

in Anwesenheit von PPIasen stattfinden kann. Die Isomerasen agieren in diesem Fall als

„Faltungshelfer“, sogenannte Chaperone, und wandeln die Konformere in die Form um, die für eine

korrekte Faltung benötigt wird. Bei dieser Reaktion handelt es sich oftmals um den

geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Proteinfaltung.

1.1.3.2 Biochemische Analyse: Mip als Virulenzfaktor?

Im ersten Jahrzehnt nach der Entdeckung von L. pneumophila wurden viele biochemische

Untersuchungen durchgeführt, um die Gene, die Informationen über die intrazelluläre Infektiösität

von Makrophagen tragen, zu identifizieren. Cianciotto et al. entwickelten 1989 eine Mutante von L.

pneumophila, deren Gen, das für die Expression eines 24 kDa Oberflächenproteins codiert,

ausgeschaltet wurde.30

Nach der Behandlung einer humanen, Makrophagen-ähnlichen Zelllinie

(U937-Zellen) und humanen alveolären Makrophagen mit dieser Mutante konnten im Zellinneren

verglichen mit dem Inneren der Zellen, die zuvor mit L. pneumophila-Wildtyp inkubiert wurden,

kaum Bakterien gefunden werden. Eine nachträgliche Aktivierung des ausgeschalteten Gens

resultierte im Fall der Mutante in einer spontanen Infektion der Zellen. Diese Beobachtung bestätigte

die Notwendigkeit der Anwesenheit dieses Proteins für eine vollständige Infektion. Um ferner

aufzuklären, welcher Schritt im Infektionsprozess durch das Oberflächenprotein beeinflusst wird,

wurde die Dauer dieser Experimente auf einen Zeitraum von drei Tagen ausgedehnt. In dieser Zeit

wurde die Bakterienkonzentration im Inneren der Zellen mehrfach bestimmt. Dadurch konnte des

Weiteren gezeigt werden, dass das Oberflächenprotein keinen direkten Einfluss auf die anfängliche

bakterielle Replikation hat, sondern erst 40 h nach der Inkubation mit einem späten Schritt der

12 EINLEITUNG

Aktivierung der zellulären Infektion interagiert. Auf Grund dieser intrazellulären Eigenschaften

wurde das Protein Macrophage-Infectivity-Potentiator-Protein genannt.

Zur weiteren strukturellen Aufklärung des Virulenzmechanismus von Mip untersuchten Wintermeyer

et al. mittels ähnlicher Invasionsstudien eine Mip-Mutante mit stark reduzierter PPIase-Aktivität und

fanden keinen Einfluss dieser Enzymaktivität auf die intrazelluläre Wachstumsrate von L.

pneumophila in einzelligen Wirtssystemen wie Acanthamoeba oder U937-Zellen.31

Der genaue

Virulenzmechanismus von L. pneumophila blieb deshalb zunächst bis auf Weiteres ungeklärt,

weshalb Köhler et al. mit Hilfe verschiedener Genmutationen die genaue Funktion der beiden vorher

beschriebenen Domänen bezüglich der bakteriellen Infektiösität zu klären versuchten.32

Mit Hilfe

einer monomeren Mip-Variante sowie einer Mutante mit abgeschwächter PPIase-Aktivität konnte im

Rahmen von Infektionsstudien gezeigt werden, dass der N-Terminus, jedoch nicht die C-terminale

PPIase für das intrazelluläre Wachstum in einzelligen Wirtssystemen verantwortlich ist - d.h.

während bei der Behandlung der Wirtszellen mit der monomeren Mip-Variante die

Legionellenanzahl im Inneren abnahm, war nach der Inkubation mit der PPIase-reduzierten Mutante

keine verminderte Bakterienanzahl im Zellinneren zu verzeichnen. Dieses Resultat bestätigt auch die

früheren Beobachtungen von Wintermeyer et al.31

Im Rahmen dieser Studien wurden In-vivo-

Testungen mit denselben Mutanten durchgeführt. Da Meerschweinchen dem Menschen sehr ähnliche

Symptome einer Legionellen-Infektion zeigen, wurden sie als Tiermodell für alle weiteren In-vivo-

Untersuchungen herangezogen. Im Gegensatz zu den eben beschriebenen In-vitro-Ergebnissen

konnte in vivo eine abgeschwächte Infektion bei denjenigen Meerschweinchen beobachtet werden,

die mit der PPIase-Knock-down-Mutante infiziert worden waren. Dies lässt einerseits auf

unterschiedliche Funktionen der beiden Domänen im einzelligen Wirtssystem sowie im Tiermodell

schließen. Andererseits scheint Mip eine extrazelluläre Rolle in der Pathogenese von L. pneumophila

zu spielen.33

Die menschliche Lunge ist von einer Epithelzellschicht sowie einer extrazellulären Matrix (ECM)

umgeben. Dahinter befinden sich die alveolären Makrophagenzellen (siehe (A) in Abb. 6). Um eine

Makrophagenzelle zu infizieren, muss der Mikroorganismus zuerst diese alveoläre Barriere

überwinden. Dieser Vorgang wird als Transmigration bezeichnet. Zur Bestätigung der Hypothese

einer extrazellulären Funktion von Mip wurde von Wagner et al. ein sogenannter Transwell-Assay

entwickelt (siehe (B) in Abb. 6).33

Für diesen Test wurde in eine Zellkulturkammer eine zweite

Kammer mit einer 3 µm porösen Membran eingesetzt. Auf diese Membran wurden Lungen-

epithelzellen (NCI-H292) gesetzt, die in der Lage sind, ECM zu sekretieren, und damit die natürliche

Barriere der Lunge nachahmen. Mip-positive und Mip-negative Mutanten sowie Wildtyp-

Legionellen wurden auf diese Zellschicht gegeben und nach einer Inkubationszeit von fünf Stunden

die Bakterienkonzentration in der unteren Kammer bestimmt. Als Ergebnis dieses Transwell-Assays

konnte eine Mip-abhängige Transmigration beobachtet werden. Bei weiteren Untersuchungen stellte

sich jedoch heraus, dass Mip nicht - wie angenommen - direkt an die alveolären Epithelzellen,

EINLEITUNG 13

sondern wohl eher an einen Bestandteil der ECM bindet. Mit Hilfe von monomeren Mip-Mutanten

wurde eine Bindung zwischen dem Kollagen der ECM und der C-Domäne von Mip identifiziert.

Diese Beobachtung konnte durch eine von PPIase-Inhibitoren vermittelte Transmigrationshemmung

weiter bestätigt werden. Unter allen Kollagenbindungen erwies sich diejenige zu Kollagen IV,

welches den Hauptvertreter der Kollagene in der menschlichen Lunge darstellt, als die Stabilste.

In Anbetracht dieser Ergebnisse, scheint eine Inhibition von Mip - genauer gesagt die Hemmung

dessen PPIase-Funktion - die Transmigration der Legionellen und damit einen Befall der

menschlichen Lunge zu verhindern. Ein Ziel dieser Arbeit war, diese Hypothese zu überprüfen.

A) B)

NCI-H292 Zellen

Legionellen

Abb. 6: Transmigrationsschema: A) Ausschnitt aus der menschlichen Lunge; B) Transwell-System

Mip

Makrophagenzelle

L. pneumophila

14 EINLEITUNG

1.2 Immunsystem und immunsupprimierende Substanzen

Eine strukturelle Ähnlichkeit zwischen Mip und den humanen FKBPs wurde bereits in Kapitel

1.1.3.1 angedeutet. Aus diesem Grund darf eine Betrachtung des menschlichen Immunsystems in

dieser Arbeit nicht fehlen.

Im Jahr 1796 entdeckte der englische Arzt Edward Jenner, dass diejenigen Patienten, die zuvor mit

für den Menschen harmlosen Kuhpocken in Berührung kamen, von einer humanen Pockeninfektion

weitgehend verschont blieben. Mit der erfolgreichen Durchführung eben solcher Impfungen legte er

kurze Zeit später (1798) den Grundstein für unser heutiges immunologisches Verständnis und gilt

damit als Begründer der Immunologie.34

Die Hauptaufgabe unseres Immunsystems ist die Abwehr von für den menschlichen Organismus

potenziell schädlichen Stoffen oder Mikroorganismen. Dafür stehen ihm mehrere spezifische und

unspezifische Mechanismen zur Verfügung, durch die eine Erkrankung häufig auch ohne zusätzliche

Arzneimitteltherapie geheilt werden kann. In bestimmten Fällen, z.B. nach einer

Organtransplantation, kann eine solche körpereigene Immunreaktion jedoch zu erheblichen

Gesundheitsproblemen führen. In diesen Fällen werden in der Therapie immunsupprimierende

Substanzen eingesetzt, die eine vom menschlichen Organismus eingeleitete Immunantwort

unterdrücken sollten. Heute existieren vier verschiedene Arzneimittelgruppen von solchen

immunsupprimierenden Substanzen: Glucocorticoide, Zytostatika, Antikörper und makrozyklische

Naturstoffe. Als Hauptvertreter der Naturstoffe seien Ciclosporin, Tacrolimus und Sirolimus genannt,

welche in Kapitel 1.2.2 noch genauer betrachtet werden sollen (siehe Abb. 7).

Abb. 7: Immunsuppressiva aus der Gruppe der makrozyklischen Naturstoffe

EINLEITUNG 15

1.2.1 Immunophiline

Immunophiline stellen einen wichtigen Bestandteil des menschlichen Immunsystems dar (siehe

Kapitel 1.2.2.1). Sie zählen zu den intrazellulären Proteinen und wurden bereits in einer Vielzahl von

prokaryotischen und eukaryotischen Zellen identifiziert. Im menschlichen Körper sind sie in vielen

Organen lokalisiert, besonders hohe Konzentrationen findet man im Gehirn.35

Bis heute sind drei verschiedene Immunophilin-Familien bekannt: Cyclophiline, Parvuline und

FK506-bindende Proteine (FKBPs).

1.2.1.1 FKBP12 – Strukturelle und zelluläre Eigenschaften

In dieser Arbeit soll der Fokus auf die Klasse der FKBPs gerichtet werden. Bis heute wurden bereits

15 verschiedene Vertreter der FKBPs in unterschiedlichen Organismen beschrieben. Unter all diesen

weist das humane FKBP12 die größten strukturellen Gemeinsamkeiten mit dem bakteriellen Mip auf.

FKBP12 ist der kleinste Vertreter seiner Proteinfamilie und wurde bis heute am ausführlichsten

charakterisiert - oft wird FKBP12 auch als Prototyp aller FKBPs bezeichnet. Es besitzt ein

Molekulargewicht von 12 kDa und setzt sich aus 108 Aminosäuren zusammen (siehe Abb. 8). Diese

Peptidkette formt eine einzelne Domäne, die als Rezeptor für die makrozyklischen Naturstoffe

FK506 und Rapamycin (siehe Abb. 7) fungieren kann. Diese Rezeptoreigenschaft verhalf dem

Protein auch zu seiner Bezeichnung FK506-bindendes Protein. Die Domäne weist außerdem eine

PPIase-Aktivität auf - eine genaue Beschreibung dieser Enzymaktivität befindet sich in Kapitel

1.1.3.1. Inwieweit die beiden PPIase-Funktionen von Mip und FKBP12 miteinander in Verbindung

stehen, soll zu einem späteren Zeitpunkt dieser Arbeit geklärt werden.

Abb. 8: Kristallstruktur von FKBP12 (2PPN); (Wiedergabe nach Szep et al.36

mit Genehmigung von John

Wiley and Sons)

16 EINLEITUNG

Auf zellulärer Ebene kommt es zu unterschiedlichen Wechselwirkungen zwischen FKBP12 und

seinen natürlichen Bindungspartnern. Da diese bis heute noch nicht vollständig aufgeklärt werden

konnten, sollen nur einige Wichtige davon zum besseren Verständnis im Folgenden kurz dargestellt

werden (siehe Abb. 9).

Im sakroplasmatischen Retikulum kann das Immunophilin FKBP12 an zwei verschiedene

membranständige Calcium-freisetzende Kanäle binden: Zum einen an den Ryanodin-Rezeptor

(RyR1), zum anderen an den Inositol-1,4,5-Triphosphat-Rezeptor (IP3R). Die Komplexbildung von

FKBP12 mit RyR1 im menschlichen Körper führt zu einer Stabilisierung des Ca2+

-Kanals und einer

Modulation in der Kanalsteuerung. Durch diese Veränderung wird nach der Bindung die Anzahl der

RyR1-Rezeptoren auf höchster Leitfähigkeitsstufe erhöht und gleichzeitig die mittlere

Kanalöffnungszeit verlängert. Diese Tatsache bedingt einen erhöhten, zytosolischen Ca2+

-Einstrom,

der daraufhin einen Kontraktionsreiz in der quergestreiften Muskulatur auslöst.37,38

Der IP3-Rezeptor wird durch eine Proteinkinase-A-vermittelte Phosphorylierung aktiviert und durch

die Phosphatase Calcineurin dephosphoryliert und damit inaktiviert. Die Assoziation von FKBP12

mit IP3R führt dazu, dass das Immunophilin nun in der Lage ist, mit Calcineurin einen ternären

Komplex zu bilden. Dies beeinflusst das Phosphorylierungsmuster des IP3-Rezeptors, wodurch

wiederum der Ca2+

-Einstrom des Kanals erhöht und ein Kontraktionsreiz ausgelöst wird.39,40

Eine dritte zelluläre Funktion von FKBP12 wird durch eine Wechselwirkung von FKBP12 mit dem

inaktiven Wachstumsfaktor TGF-ß-R1 (transforming growth factor-ß-Rezeptor Typ 1) beschrieben.

Dieser Rezeptor weist eine Serin/Threonin-Kinaseaktivität auf und beeinflusst verschiedene Prozesse

wie z.B. die Proliferation oder Differenzierung von Zellen. Durch Bindung von FKBP12 kann TGF-

ß-R1 nur noch begrenzt phosphoryliert werden. Diese Downregulation der Phosphorylierung bedingt

anschließend eine Stabilisierung der inaktiven Rezeptorkonformation von TGF-ß-R1 und dadurch

eine Inhibition der TGF-Signaltransduktion.41,42

Abb. 9: Zelluläre Funktionen von FKBP12 (modifiziert nach Breiman et al.39

)

EINLEITUNG 17

1.2.2 Makrozyklische Immunsuppressiva

1.2.2.1 Immunologische Wirkung

Die natürlichen Funktionen der FKBPs sind bis heute noch nicht vollständig aufgeklärt. Eine

Inhibition der FKBPs durch die makrozyklischen Naturstoffe, wie z.B. Rapamycin oder FK506, führt

im menschlichen Körper zu einer Immunsuppression. Eine Hemmung von FKBP12 darf jedoch nicht

als Antagonismus der natürlichen Wirkung angesehen werden. Bei einer solchen Inhibition scheint es

sich vielmehr um eine Modulation des Immunophilins zu handeln, bei der die makrozyklischen

Antibiotika wohl auch eher als „Prodrug“ fungieren. Erst nach der Komplexierung des Arzneistoffs

mit dem entsprechenden Immunophilin kommt es zu einer vollständigen Entfaltung der Wirkung.

In der heutigen Transplantationsmedizin werden hauptsächlich die drei obengenannten

makrozyklischen Naturstoffe verwendet. Ciclosporin A (CsA) ist ein zyklischer Peptidmetabolit aus

der Pilzfamilie Trichoderma polysporum (LINK ex PERS.) Rifai.43

Nach der Verabreichung von CsA

bindet es in den T-Zellen des humanen Immunsystems an die Immunophilingruppe der Cyclophiline

und führt zur Immunsuppression.44

FK506 (Tacrolimus) und Rapamycin (Sirolimus) (siehe Abb. 7) sind bakteriellen Ursprungs und

entstammen der Gattung Streptomyces. FK506 wird aus Streptomyces tsukubaenis, Rapamycin aus

dem Boden der Osterinsel Rapa Nui, genauer aus dem dort lebenden Mikroorganismus Streptomyces

hygroscopius isoliert. Beide Immunsuppressiva binden zwar an das humane Immunophilin FKBP12,

weisen jedoch unterschiedliche Wirkmechanismen auf (siehe Abb. 10). Die Wirkungsweise von

FK506 ist mit der von CsA vergleichbar, - wobei FK506 weitaus potenter als CsA ist.45,46

D.h., trotz

Bindung an unterschiedliche Immunophiline, besitzen CsA und FK506 einen ähnlichen

Wirkmechanismus. Daraus folgt, dass ein dritter, wahrscheinlich identischer Bindungspartner in den

Mechanismus der Immunsuppression involviert ist.

Im Fall von FK506 und CsA ist der dritte Bindungspartner die Calcium/Calmodulin-abhängige

Phosphatase Calcineurin.47

Durch diese Wechselwirkung wird die Enzymaktivität von Calcineurin

gehemmt. Unter physiologischen Bedingungen bewirkt Calcineurin - während einer körpereigenen

Immunreaktion - zunächst eine Dephosphorylierung von nuklearen Transkriptionsfaktoren der

aktivierten T-Zellen (NF-AT) und unterstützt damit die Transkription von T-Zell-Aktivierungsgenen.

Zu diesen Aktivierungsgenen zählt auch Interleukin-2 (IL-2), das wiederum für die Bildung von

zytotoxischen Zellen verantwortlich ist. Eine Inhibition von Calcineurin, die damit verbundene

Hemmung der IL-2-Produktion sowie der Bildung von zytotoxischen Zellen führen somit am Ende

einer solchen Reaktionskaskade zu der gewünschten Immunsuppression.48

Das mit FK506 strukturverwandte Rapamycin bildet im menschlichen Immunsystem nach der

Bindung an das Immunophilin FKBP12 ebenfalls einen ternären Komplex aus. Trotz der

strukturellen Ähnlichkeit zu FK506/FKBP12 interagiert die Rapamycin/FKBP12-Assoziation jedoch

18 EINLEITUNG

nicht mit Calcineurin, sondern mit einem anderen Protein, das auf Grund dieser Bindung

mammalian-target-of-Rapamycin (mTOR) genannt wird. Das Protein mTOR weist eine

Sequenzhomologie zur Familie der Phosphatidyl-Inositolkinasen auf und wird deshalb selbst zu der

Familie der Kinasen gezählt. In IL-2 stimulierten T-Zellen hemmt der Komplex

Rapamycin/FKBP12/mTOR während eines Zellzyklus den Übergang von der G1- zur S-Phase.49

Diese Inhibition führt dann in einem späteren Schritt zu einer Unterdrückung der IL-2-Signal-

Transduktion, was sich letztendlich auf das Wachstum und die Differenzierung von T-Zellen

auswirkt.50

Kommt es nach der Arzneimittelgabe nicht zu einer vollständigen Ausbildung der T-

Zellen, werden, wie oben beschrieben, auch keine zytotoxischen Zellen mehr gebildet und das Ziel

der Immunsuppression ist erreicht.

Abb. 10: Immunologische Wirkung des FKBP12/FK506 bzw. FKBP12/Rapamycin-Komplexes (modifiziert

nach Breiman et al.39

)

1.2.2.2 Struktur-Wirkungsbeziehung

Im folgenden Kapitel werden die strukturellen Besonderheiten der beiden Immunsuppressiva, die für

die Bindung an das entsprechende Immunophilin von Bedeutung sind, näher beleuchtet.

Die Fähigkeit eines chemischen Stoffs einen ternären Komplex zu bilden, setzt voraus, dass er

mindestens zwei Bindestellen aufweist. Im Fall von FK506 und Rapamycin konnte diese „Zwei-

Domänen-Natur“ durch Schreiber et al. im Jahr 1991 mit Hilfe von Domäneanalysen bewiesen

werden.48

EINLEITUNG 19

Abb. 11: Bindedomäne (rot) und Effektordomäne (grau hinterlegt) von Rapamycin (A) und FK506 (B);

Entwicklung nicht-immunsuppressiver FKBP12-Liganden (C und D)

Sowohl FK506 als auch Rapamycin besitzen jeweils eine FKBP-Bindedomäne und eine sogenannte

„Effektor“-Domäne (siehe Abb. 11). Während die Bindedomäne bei beiden Immunsuppressiva durch

eine identische Substruktur (rot) beschrieben wird, stellt die Effektordomäne jeweils einen Ausschnitt

aus der aliphatischen Kette des jeweiligen Makrozyklus (grau hinterlegt) dar und kann somit als eine

stoffspezifische Komponente betrachtet werden. Die Bindedomäne ist für die Bindung an die aktive

Seite von FKBP12 verantwortlich und lässt sich durch eine Pipecolinsäure-Grundstruktur näher

charakterisieren. Die Effektordomäne ragt aus der FKBP12-Kavität heraus, verschließt sie und bietet

somit einem weiteren Protein die Möglichkeit, eine Komplexbindung einzugehen. Im Fall von

FK506 handelt es sich bei diesem dritten Bindungspartner, wie bereits in Kapitel 1.2.2.1 beschrieben,

um Calcineurin, im Fall von Rapamycin um mTOR.

20 EINLEITUNG

Bereits im Vorfeld der Domäneanalysen wurden zahlreiche systematische Studien durchgeführt, um

die molekularen Wechselwirkungen, die die Immunsuppressiva mit den humanen FKBPs eingehen,

näher zu definieren. Zu diesem Zweck entwickelten Bierer et al. im Jahr 1990 das erste

totalsynthetische FK506-Derivat 506BD (siehe Abb. 11).51

Da FK506 und Rapamycin an dasselbe

Immunophilin binden, wurde das neue Molekül nur aus den gemeinsamen Strukturelementen

zusammengestellt. Die Verbindung wurde jedoch trotzdem auf eine mögliche Immunsuppression

untersucht. In Kompetitionsassays konnte keine Auswirkung von 506BD auf die T-Zellaktivierung

beobachtet werden. Vielmehr wurden eine Verdrängung der beiden natürlichen Makrozyklen und

damit eine Blockade ihrer immunsupprimierenden Effekte nachgewiesen. Mit diesem Ergebnis

wurde zwar bestätigt, dass die Effektordomäne allein für die Immunsuppression verantwortlich ist,

die Wirkung des Moleküls auf FKBP12 galt es jedoch noch zu klären. Da sich die FKBP12-Domäne

vor allem durch ihre PPIase-Aktivität auszeichnet und eine Hemmung dieser Enzymaktivität durch

FK506 oder Rapamycin bereits früher nachgewiesen werden konnte,52

wurde der nicht-

immunsuppressive FKBP12-Ligand auf eine mögliche PPIase-Inhibition untersucht. Mit Hilfe eines

Protease-gekoppelten PPIase-Assays53,54

konnte daraufhin durch 506BD ebenfalls eine Hemmung der

PPIase beobachtet werden. Somit war mit dem totalsynthetisierten Molekül ein erster hochaffiner,

jedoch nicht-immunsuppressiver FKBP12-Inhibitor identifiziert worden. In den darauffolgenden

Jahren wurde eine Vielzahl solcher nicht-immunsuppressiver FKBP12-Inhibitoren entwickelt, unter

denen sich 1FKG-lig (siehe Abb. 11) als besonders potent erwies (Ki = 10 nM).55

In der heutigen

medizinischen Forschung gelten diese FKBP12-Inhibitoren u.a. als vielversprechende Kandidaten in

der Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen wie z.B. Alzheimer oder Parkinson.56

Die

Mechanismen dieser neuroprotektiven Aktivität sind jedoch noch nicht vollständig geklärt.

1.3 Strukturen der beiden PPIasen: Mip und FKBP12

Der C-Terminus von Mip setzt sich aus ungefähr 100 Aminosäuren zusammen und weist eine

Sequenzhomologie von 35 % zur FKBP12-Domäne auf.57

Auf die strukturelle Ähnlichkeit von Mip

und FKBP12 und auf die gemeinsame Zugehörigkeit zur Enzymklasse der PPIasen wurde bereits in

einem früheren Kapitel dieser Arbeit hingewiesen (siehe Kapitel 1.1.3.1). Betrachtet man nun diese

Gemeinsamkeiten, so ergibt sich als Schlussfolgerung, dass bereits bekannte FKBP12-Inhibitoren

ebenso an Mip binden und damit neben der humanen auch die bakterielle PPIase hemmen sollten. Im

Jahr 1992 konnten Fischer et al. erstmals mit Hilfe von Inhibitionsstudien eine Hemmung der Mip-

PPIase durch FK506 nachweisen.28

Inwieweit auch kleinere, nicht-immunsuppressive Verbindungen

eine Inhibition der Mip-PPIase ausüben, soll in dieser Arbeit geklärt werden.

EINLEITUNG 21

1.3.1 Mip-Strukturen

Im Jahr 2001 konnten Riboldi-Tunnicliffe et al. die erste Röntgenkristallstruktur (1FD9)27

von Mip

auflösen und damit zeigen, dass Mip als Dimer vorliegt. Ein Mip-Monomer besteht aus 213

Aminosäuren und setzt sich, wie oben beschrieben, aus zwei verschiedenen Domänen zusammen.

Die N-terminale Domäne (Aminosäuren 9-48) wird aus zwei antiparallel verlaufenden α-Helices

geformt und ist für die Dimerisierung des Proteins verantwortlich. Dabei bildet sich ein untypisches

„Vier-Helix-Bündel“ mit einem Inklinationswinkel von ca. 45 ° zwischen den beiden Helices aus.

Eine weitere Besonderheit dieser Dimerverbindung ist ein sogenannter „Methionin-Zipper“, bei dem

die Methioninreste Met38 und Met42 eines Monomers mit Met42 und Met38 des anderen in

Interaktion treten.

Die C-terminale Domäne (Aminosäuren 77-213) zeigt die typische Faltung der FKBPs und beinhaltet

die PPIase-Funktion (siehe Abb. 12). Im folgenden Kapitel soll sich die Bezeichnung „Mip“ nur noch

auf diese C-terminale Domäne beziehen (d.h. die Aminosäuren der C-Domäne werden von 1 bis 137

nummeriert). Sechs β-Stränge formen am C-terminalen Ende ein antiparalleles Faltblatt mit der

topologischen Reihenfolge β1-β2-β5-β6-β3-β4. Während alle β-Stränge über kurze Schleifen (sog.

Haarnadelschlaufen, hair-pins) miteinander verbunden sind, besteht die Haarnadelschlaufe zwischen

β5 und β6 aus 22 Aminosäuren. Dieses β-Faltblatt wird von einer kurzen α-Helix so bedeckt, dass

zwischen der Innenseite der β-Struktur und der α-Struktur eine Kavität entsteht, die sich besonders

durch ihre Hydrophobizität auszeichnet.

Abb. 12: Proteinstruktur (2VCD) der C-Domäne von Mip: Zwischen der α-Helix und dem β-Faltblatt (siehe

Pfeil) formt sich die hydrophobe Bindetasche (erstellt mit PyMOL®)

Diese Bindetasche setzt sich aus folgenden Aminosäuren zusammen: Tyr55, Phe65, Asp66, Ala75,

Phe77, Val82, Ile83, Trp86, Tyr109 und Phe126 (siehe Abb. 13). Der Indolring des Trp86 bildet den

Grund der Kavität und wird von den Resten Tyr55, Ala75, Phe77, Val82, Ile83 und Phe126

umgeben. Phe65, Asp66 und Tyr109 bilden den äußeren Rand der Bindetasche, wobei die

22 EINLEITUNG

letztgenannte Aminosäure einen Bestandteil der langen Schleife zwischen β5 und β6 darstellt, welche

an das aktive Zentrum angrenzt.27,58

Abb. 13: Sekundärstruktur (2VCD) der C-terminalen Domäne von Mip mit der Aminosäurebezeichnung im

aktiven Zentrum; (Wiedergabe nach Sippel58

mit Genehmigung des Autors)

Neben dieser Kristallstruktur existieren mittlerweile zwei weitere Proteinstrukturen von Mip. Mit

Hilfe verschiedener NMR-Analysen lösten Ceymann et al. 2008 eine Apo-Struktur von Mip

(2UZ5)59

, sowie eine Komplexstruktur (2VCD)59

, in der Rapamycin im aktiven Zentrum gebunden

vorliegt, auf. Ein Vergleich der beiden Apo-Strukturen (1FD9 bzw. 2UZ5) zeigt, dass sie sich

erheblich voneinander unterscheiden. Während die Aminosäure Tyr109 in der Kristallstruktur

(1FD9) die Bindetasche am oberen Ende abschließt und somit einen Teil des aktiven Zentrums

darstellt, ist derselbe Rest in der NMR-gelösten Struktur (2UZ5) kein Bestandteil der Kavität; er ragt

vielmehr aus der Bindetasche heraus. Überlagert man jedoch die Mip/Rapamycin-Komplexstruktur

(2VCD) mit beiden Apo-Strukturen, so zeigt sich eine größere Kongruenz mit der Kristallstruktur

(1FD9) als mit der nicht komplexierten NMR-gelösten Struktur (2UZ5) (siehe Abb. 14).

Abb. 14: Überlagerung der Komplexstruktur 2VCD (beige) mit den Apo-Strukturen 2UZ5 (blau, links) und

1FD9 (cyan, rechts); (Wiedergabe nach Sippel58

mit Genehmigung des Autors)

Val82 Ile83 Tyr109

Phe65 Asp66

Phe126 Tyr55

Trp86 Ala75

Phe77

EINLEITUNG 23

1.3.2 FKBP12-Strukturen

Während sich ein Mip-Monomer aus zwei verschiedenen Domänen zusammensetzt, zeichnet sich die

Struktur von FKBP12 nur durch eine einzelne Domäne aus (siehe Abb. 15). 108 Aminosäuren bilden

aus fünf β-Strängen eine antiparallele ß-Faltblattstruktur, die sich rechtsdrehend um eine α-Helix

lokalisiert. Damit wird die α-Helix so umhüllt, dass sich eine hydrophobe Bindetasche zwischen ihr

und dem ß-Faltblatt ausbildet.60

Abb. 15: Proteinstruktur (2PPN) von FKBP12: Zwischen der α-Helix und dem β-Faltblatt (siehe Pfeil) formt

sich die hydrophobe Bindetasche (erstellt mit PyMOL®)

Die FKBP12-Kavität setzt sich aus folgenden Aminosäuren zusammen: Tyr26, Phe36, Asp37,

Phe46, Phe48, Val55, Ile56, Trp59, Tyr82 und Phe99.58

Der Indolring des Trp59 bildet den Grund

der Kavität und wird von den restlichen Aminosäuren umgeben.59

Im Fall von FKBP12 ist in den Proteindatenbanken eine weitaus größere Anzahl an Kristall- sowie

NMR-gelösten Strukturen verfügbar. Als Vertreter der Komplexstrukturen wurde in einer früheren

Arbeit die kristallographische Struktur 1FKB61

herangezogen, während 2PPN36

eine nicht

komplexierte Kristallstruktur und 1FKT62

eine ungebundene NMR-gelöste Struktur darstellen

sollten.58

Der Vergleich der Orientierung der Aminosäuren der gewählten Strukturen zeigte kaum

Abweichungen im aktiven Zentrum. Die Überlagerung der beiden Apo-Strukturen (2PPN bzw.

1FKT, siehe Abb. 16, links), sowie die Überlagerung der Kristallstrukturen (1FKB bzw. 2PPN,

siehe Abb. 16, rechts) deutete lediglich auf kleine Unterschiede in der Stellung der Aminosäure

Asp37 hin.58

Auf Grund der Geringfügigkeit wurde diese Diskrepanz im nachfolgenden

Proteinstruktur-Vergleich vernachlässigt.

24 EINLEITUNG

Abb. 16: Überlagerung der Apo-Strukturen 2PPN (blau) und 1FKT (beige, links), sowie Überlagerung der

Kristallstrukturen 2PPN (blau) und 1FKB (grün, rechts); (Wiedergabe nach Sippel58

mit Genehmigung des

Autors)

1.3.3 Struktureller Vergleich der PPIasen

Für eine Entwicklung selektiver Mip-Inhibitoren müssen die strukturellen Gemeinsamkeiten bzw.

Unterschiede der beiden PPIasen genau erfasst werden. Aus diesem Grund wurden nun zuerst die

Aminosäurereste in beiden aktiven Zentren und anschließend die dort vorherrschende geometrische

Struktur genau miteinander verglichen. Tabelle 2 zeigt die Gegenüberstellung aller relevanten

Aminosäuren im aktiven Zentrum der beiden Proteine:

MIP FKBP12

Tyr55 Tyr26

Phe65 Phe36

Asp66 Asp37

Ala75 Phe46

Phe77 Phe48

Val82 Val55

Ile83 Ile56

Trp86 Trp59

Tyr109 Tyr82

Phe126 Phe99

Tabelle 2: Vergleich der Aminosäuren im aktiven Zentrum von Mip und FKBP1258

Val55 Ile56 Tyr82

Phe36

Asp37

Phe99

Tyr26 Phe46

Phe48 Trp59

EINLEITUNG 25

Fast alle Aminosäuren in Mip entsprechen ihrem jeweiligen Gegenstück in FKBP12. Eine Ausnahme

bildet jedoch die Aminosäure Ala75 des bakteriellen Mips, welche dem Phe46 in der FKBP12-

Bindetasche gegenübersteht. Trotz dieser Inkongruenz weist die Umgebung dieser Aminosäuren in

beiden Proteinen eine ähnlich starke Hydrophobizität auf, so dass dieser kleine Unterschied

vernachlässigbar ist. Vergleicht man jedoch die Geometrie der Aminosäuren im aktiven Zentrum der

bakteriellen sowie der humanen PPIase miteinander, so zeigen sich bereits deutlichere Unterschiede

in der räumlichen Orientierung einzelner Aminosäuren. Die Überlagerung der unkomplexierten

Kristallstrukturen (1FD9, Mip bzw. 2PPN, FKBP12) weist die größte Homologie zwischen dem

bakteriellen und dem humanen Protein auf. Erstaunlicherweise ist bei dieser Überlagerung eine

deutlich höhere strukturelle Kongruenz zu finden als bei der Überlagerung der beiden ungebundenen

Mip-Strukturen (1FD9 bzw. 2UZ5).

Betrachtet man nun die Überlagerung der beiden Rapamycin-Komplexstrukturen (2VCD, Mip und

1FKB, FKBP12, siehe Abb. 17), so zeigen sich ähnlich starke strukturelle Unterschiede. Das

bakterielle Tyr109 ist viel stärker in Richtung der hydrophoben Bindetasche orientiert als sein

humanes Gegenstück Tyr82. Die Position von Tyr109 in der Rapamycin-Komplexstruktur führt

somit zu einer erheblichen Verkleinerung der Mip-Bindetasche, was sich letztendlich auch auf die

Bindung möglicher Liganden auswirken könnte.

Abb. 17: Überlagerung der Rapamycin-Komplexstrukturen (2VCD, Mip (beige; mit Aminosäurebezeichnung)

und 1FKB, FKBP12 (grün)); Tyr109 ragt tiefer in die hydrophobe Mip-Bindetasche, als Tyr82 in die FKBP12-

Bindetasche. (Wiedergabe nach Juli et al.63

mit Genehmigung der American Chemical Society)

Als Komplexpartner wurde in allen beschriebenen Proteinstrukturen das Immunsuppressivum

Rapamycin gewählt. Seine Bindedomäne besteht aus einem Pipecolinsäure-Grundgerüst (siehe

Kapitel 1.2.2.2), das im Fall beider PPIasen starke Wechselwirkungen mit den Aminosäuren im

aktiven Zentrum eingeht und deshalb tief in die jeweilige Bindetasche gebunden wird. Der größere

Teil des Makrozyklus (= Effektordomäne) ragt aus der Kavität heraus und bietet damit eine

Tyr109 / Tyr82

Ala75 / Phe46

Tyr109

Ile83 Val82

Phe77

Ala75

Tyr55 Asp66

Phe65

Phe126 Trp86

26 EINLEITUNG

strukturelle Oberfläche für die Bindung an ein weiteres Molekül. Im Fall von Rapamycin handelt es

sich dabei um die Kinase mTOR (siehe Kapitel 1.2.2.1).

Die feste Verankerung des Pipecolinrings in der FKBP12-Bindetasche ist einerseits durch

hydrophobe Wechselwirkungen des Piperidins, andererseits durch die Bildung von

Wasserstoffbrücken zwischen Ile56 und der Esterfunktion (C=O) bzw. Tyr82 und der Amidfunktion

(C=O) bedingt. Die letztgenannte Bindung kann sich auf Grund der divergierenden räumlichen

Orientierung von Tyr109 in der Mip-Kavität jedoch nicht ausbilden. Vielmehr kommt es hier zu

einer „Kollision“ beider Funktionen. Diese Abstoßung bedingt, dass das Pipecolinsäure-Grundgerüst

in der bakteriellen Bindetasche eine andere Stellung als in der humanen einnehmen muss. Tatsächlich

lagert sich der Piperidinzyklus - im Gegensatz zur FKBP12-Kavität - aufrecht in die Mip-Kavität ein.

Aus diesem Grund können die Aminosäure Tyr109, ebenso wie die gegenüberliegende Aminosäure

Tyr55, in der Mip-Bindetasche auch nicht mehr als Wasserstoffbrücken-Donoren fungieren. Tyr55

wendet sich im Gegensatz zum humanen Tyr26 sogar von der Diketostruktur des Rapamycins ab.

Trotz dieser strukturellen Divergenzen scheinen beide Immunsuppressiva aber über dieselben

funktionellen Gruppen in die Kavitäten von FKBP12 und Mip zu binden (siehe Abb. 18).58

Abb. 18: Rapamycin/FKBP12-Komplex: Wasserstoffbrücken können sich zu Ile56 und Tyr82 ausbilden

(links). Rapamycin/Mip-Komplex: Abstoßung zwischen Tyr109 und dem Amid (C=O); Tyr55 wendet sich ab

(rechts). (Wiedergabe nach Sippel58

mit Genehmigung des Autors)

FKBP12 Mip

EINLEITUNG 27

1.4 Mip-ähnliche Strukturen anderer Mikroorganismen

In den Jahren nach der Entdeckung von Legionella-Mip (Lp-Mip) und der vollständigen Aufklärung

seiner Gensequenz wurden auch in anderen Bakterienarten Mip-ähnliche Proteine identifiziert.

Mittels eines Protease-gekoppelten PPIase-Assays53

konnte nachgewiesen werden, dass diese alle

eine PPIase-Aktivität aufweisen. Die Mip-ähnlichen Proteine greifen jedoch an unterschiedlichen

Stellen des bakteriellen Infektionsprozesses ein. Im folgenden Kapitel sollen die Mikroorganismen

mit ihrem Mip-Protein kurz vorgestellt werden.

1.4.1 Chlamydien

Chlamydia trachomatis gehört neben vielen weiteren Arten zur Gattung der Chlamydien und stellt

ein sehr bedeutendes Humanpathogen dar. Das Bakterium wird in mehrere Serogruppen unterteilt,

die je nach Typ verschiedene Krankheiten verursachen können. Während die Serotypen A bis C vor

allem in Entwicklungsländern schwere Infektionen am Auge (z.B. Trachom) hervorrufen können,

lässt sich der Großteil der Chlamydieninfektionen (Serotyp D-L) über sexuell übertragbare

Erkrankungen im Urogenitalbereich definieren. Bei Frauen kann dies zu schweren Entzündungen der

Gebärmutter oder der Eileiter führen. Bei Männern sind vor allem die Nebenhoden und die Prostata

betroffen. Außer den genannten Krankheiten kann C. trachomatis (Serotyp L1, L2 und L3) auch das

sexuell übertragbare Lymphogranuloma venereum verursachen. Bei dieser Erkrankung kommt es

hauptsächlich zu Lymphknotenschwellungen bzw. Geschwüren in der Leistengegend. C. trachomatis

zählt damit zu den häufigsten sexuell übertragenen Erregern weltweit. Zur Behandlung einer

Chlamydieninfektion eignen sich Antibiotika wie Tetrazykline oder Makrolide. Des Weiteren werden

auch Chinolone erfolgreich angewendet. Die antibiotische Behandlungsdauer sollte einen Zeitraum

von zwei Wochen nicht unterschreiten.64

Chlamydien sind wie Legionellen obligat intrazelluläre Bakterien, die sich vor allem durch ihren

zweiphasigen Lebenszyklus in humanen Schleimhautzellen auszeichnen. Eine Phase wird durch die

sogenannten extrazellulären Elementarkörper (EB) dargestellt. Die EBs sind zwar infektiös, aber

metabolisch völlig inaktiv. In dieser Phase können die Bakterien an eine geeignete humane

Wirtszelle binden. Nach ihrer Aufnahme, die entweder durch Phagozytose oder durch Pinozytose

erfolgt, fusionieren die EBs mit dem Wirtsphagosom und wandeln sich nach 8-10 Stunden in

Retikularkörper (RB) um, die nun nicht mehr durch Lysosome abgebaut werden können. In diesem

zweiten Stadium verlieren die Teilchen ihre Infektiösität und nach weiteren 10-20 Stunden beginnen

28 EINLEITUNG

sie sich zu vermehren. Nach der bakteriellen Replikation nehmen die Retikularkörper wieder die

ursprüngliche Form der EBs ein und zerstören die Wirtszelle, um sich weiter zu verbreiten.65

Lange Zeit war man sich über die Mechanismen der bakteriellen Adhäsion und Infektion im

Unklaren. Im Rahmen der Aufklärung dieser Prozesse und daran beteiligter Proteine, wurde von

Lundemose et al. u.a. ein spezielles Membranprotein identifiziert, das in den Infektionsverlauf

involviert zu sein scheint.65

Die DNA-Strukturaufklärung dieses Proteins zeigte, dass es eine

Molekülmasse von 27 kDa besitzt. Die C-terminale Domäne des Proteins besteht aus 175

Aminosäuren und weist eine Homologie von 37 % zu Lp-Mip auf. Zwei Jahre später konnte gezeigt

werden, dass dieses Mip-ähnliche Protein (Ct-Mip) auch eine PPIase-Aktivität besitzt.66

Mit Hilfe der

bekannten PPIase-Inhibitoren Rapamycin und FK506 wurde durch Inhibitionsstudien im Folgenden

die Rolle des Mip-ähnlichen Proteins während der bakteriellen Infektion aufgeklärt. Es konnte

gezeigt werden, dass die beiden Immunsuppressiva nur bei Gabe in einer frühen Phase des

Infektionsprozesses die Anzahl an Chlamydien im Zellinneren reduzieren können. Eine

Verabreichung der Arzneistoffe zu einem späten Zeitpunkt wirkt sich nicht auf die bakterielle

Vermehrung aus.

1.4.2 Trypanosomen

Die Infektionskrankheit Trypanosomiasis kann in zwei Unterarten eingeteilt werden: Die

afrikanische Form, die oft auch als Schlafkrankheit bezeichnet wird, und die amerikanische Form, die

Chagas-Krankheit. Der Erreger der Schlafkrankheit ist Trypanosoma brucei. T. brucei wird v.a. im

tropischen Afrika über Tsetsefliegen auf den Menschen übertragen. Die Chagas-Krankheit hingegen

wird v.a. im mittel- bis südamerikanischen Raum über Raubwanzen (Reduviidae) durch

Trypanosoma cruzi übertragen. Da im Rahmen dieser Arbeit lediglich die Art T. cruzi von

Bedeutung ist, soll auch nur diese im folgenden Kapitel betrachtet werden.

Bei T. cruzi handelt es sich um Protozoen, die während eines Lebenszyklus in verschiedenen Formen

auftreten können. Nach der Blutmahlzeit eines infizierten Insekts werden sogenannte

Trypomastigoten, die infektiöse Form des Mikroorganismus, im Kot neben der Einbissstelle auf der

menschlichen Haut hinterlassen. Von dort können sie entweder direkt über die Wunde oder über

Schleimhäute in den menschlichen Körper gelangen und nahe gelegene Zellen befallen. Im

Zellinneren transformieren sie zu Amastigoten, vermehren sich und verwandeln sich wieder zurück

in Trypomastigoten. Um in den Blutkreislauf zu gelangen, zerstören sie ihre Wirtszelle und befallen

danach entweder erneut Zellen oder persistieren in einer nicht infektiösen Form. Kommt es nun zu

einem weiteren Kontakt zwischen Insekt und Mensch, gelangen die persistenten Trypomastigoten

zurück in den Mitteldarm der Raubwanze, wo sie sich sofort in Epimastigoten differenzieren und

EINLEITUNG 29

weiter vermehren. Nach der Transformation zurück zur Trypomastigot-Form beginnt der Zyklus

erneut.67

Der Verlauf einer Chagas-Erkrankung kann in vier Stadien gegliedert werden: Nach ödematösen

Entzündungsreaktionen an der Bissstelle leidet der Patient zunächst an Fieber, Luftnot, Durchfall und

Bauchschmerzen. Diese Phase klingt rasch ab (ca. 30 Tage) und auf eine lange Latenzzeit (bis zu

mehreren Jahren) ohne Symptome folgt die chronische Phase der Erkrankung. Diese zeichnet sich

einerseits durch Herzprobleme, andererseits durch Zerstörung von Darmnervenzellen aus.

Unbehandelt kann dies bis hin zum Tode führen. Zum heutigen Zeitpunkt existieren nur zwei

Antibiotika für die Behandlung der Chagas-Krankheit: Nifurtimox und Benznidazol. Beide

Arzneistoffe müssen zu Beginn der akuten Krankheitsphase eingesetzt und die Therapiedauer von

zwei Monaten nicht unterschritten werden.68

Bei Untersuchungen der einzelnen Zustandsformen von T. cruzi zeigten sich viele verschiedene

bakterielle Virulenzfaktoren, u.a. ein Mip-ähnliches Protein (Tc-Mip), das jedoch nur von der

infektiösen Form der Trypomastigoten sekretiert wird.69

Die Gensequenzanalyse von Tc-Mip ergab

ein Monomer aus 167 Aminosäuren, das eine Homologie von 29.6 % zu Lp-Mip aufweist.70

Wie bei

dem verwandten Protein konnte mittels Protease-gekoppelten Enzymassays eine PPIase-Aktivität

nachgewiesen werden. In einem Invasionsassay wurde ferner festgestellt, dass Tc-Mip wie auch Lp-

Mip einen Einfluss auf die Invasion der Bakterien in die Wirtszelle hat. Die darauffolgende exogene

Behandlung der Wirtszellen mit Tc-Mip zeigte, dass das Protein eine Wechselwirkung mit der

Wirtszelle, aber nicht mit der Parasitenzelle eingeht. Dies verdeutlicht, dass das Target der Isomerase

auf der Oberfläche der Wirtszelle liegen muss.69

1.4.3 Neisserien

Neben der Chlamydieninfektion zählt auch die Gonorrhoe (Tripper) zu den häufigsten sexuell

übertragenen Erkrankungen. Auslöser einer solchen Infektion ist das intrazellulär lebende Bakterium

Neisseria gonorrhoeae, das neben Neisseria meningitis zu den bedeutendsten Vertretern der Gattung

Neisseria gehört. Der Lebensraum von N. gonorrhoeae ist hauptsächlich im menschlichen

Genitalbereich zu finden. Hier binden die Bakterien bei einer Infektion zunächst an mukosale

Epithelzellen und werden anschließend von diesen phagozytiert. Der Mechanismus der Phagozytose

wird entweder durch Pili oder sogenannte „opacity outer membrane“-Proteine vermittelt. Im

Zellinneren werden die Bakterien in eine Vakuole eingeschlossen und darin gebunden in

subepitheliales Gewebe transportiert. Dort können sie lokale Entzündungsreaktionen hervorrufen

oder/und sich über den Blutkreislauf auf den gesamten Körper ausbreiten.71

Während eine

Erkrankung bei Frauen eher asymptomatisch verläuft (nur 25 % der Betroffenen entwickeln diverse

30 EINLEITUNG

Unterleibsentzündungen), manifestiert sich beim Mann typischerweise eine akute Urethritis.72

Das

RKI empfiehlt zur Therapie der Gonorrhoe eine zweimalige Gabe von Cefixim in einem Zeitraum

von drei Tagen, oder eine einmalige intramuskuläre Verabreichung von Ceftriaxon.73

Wie bei den vorher beschriebenen Mikroorganismen existieren auch in N. gonorrhoeae zahlreiche

Virulenzfaktoren, die mit unterschiedlichen Prozessen während der humanen Infektion

wechselwirken. Die Anzahl sowie die Funktion dieser Faktoren sind noch nicht vollständig

aufgeklärt. 2005 konnten Leuzzi et al. jedoch ein Oberflächenprotein von N. gonorrhoeae mit

PPIase-Aktivität identifizieren.72

Das dimere Protein besteht aus 272 Aminosäuren und weist eine

Sequenzhomologie von 43.8 % zu Lp-Mip auf. Diese Eigenschaften und eine nachgewiesene

Inhibition durch Rapamycin ordneten das Neisserienprotein (Ng-Mip) in die Klasse der Mips ein. Im

Rahmen dieser Studie konnte auch die Funktion von Ng-Mip geklärt werden. Während alle

beschriebenen Mips in die Invasion des Mikroorganismus bzw. einen frühen Schritt der Infektion

involviert sind, spielt Ng-Mip eine bedeutende Rolle bei der Persistenz des Bakteriums in

Makrophagenzellen. Es konnte gezeigt werden, dass Mip-negative Stämme durch eine Makrophagen-

vermittelte Immunreaktion getötet werden, während Mip-positive Stämme dagegen resistent sind.

1.4.4 Burkholderien

Burkholderia pseudomallei ist der Erreger der Infektionskrankheit Melioidose, die hauptsächlich in

Regionen wie Südostasien und Nordaustralien auftritt. Klinisch manifestiert sich eine solche

Erkrankung in einer akuten Sepsis bis hin zu lokal auftretenden chronischen Infektionen. In 60 %

aller akuten Erkrankungen kann sich zusätzlich eine schwere Pneumonie entwickeln.74

In der

Therapie der akuten Phase gilt die intravenöse Gabe von Ceftazidim als Mittel der Wahl, das aber

auch durch die Reserveantibiotika Meropenem oder Imipenem ersetzt werden kann. Dieser

zweiwöchigen Initialtherapie schließt sich eine Eradikationsphase an, in der Mittel wie Cotrimoxazol

oder Doxyzyklin über mindestens 20 Wochen eingesetzt werden müssen.

B. pseudomallei zählt zu den beweglichen, gramnegativen Bakterien, die ihren Lebensraum sowohl

in der Erde als auch im Wasser finden. Aus ihrer natürlichen Umgebung gelangen sie über

verschiedene Transportmechanismen in den menschlichen Organismus. Typischerweise wird der

Mikroorganismus über die Haut, seltener auch über Inhalation oder über die Nahrung aufgenommen.

Im menschlichen Körper kann B. pseudomallei verschiedene Zellen, zu denen auch Makrophagen

gehören, befallen. Nach der Phagozytose werden die Bakterien im Zellinneren, ähnlich wie bei einer

Legionellen-Infektion, zuerst in ein Phagosom, das vor dem Abbau durch Lysosomen geschützt ist,

eingeschlossen. Anschließend findet die bakterielle Vermehrung statt. Nach der Replikation zerstören

die Bakterien die Phagosomenmembran und breiten sich direkt von Zelle zu Zelle auf den gesamten

EINLEITUNG 31

Organismus aus.75

Auf Grund dieser relativ leichten Art der Verbreitung wird B. pseudomallei auch

als biologischer Kampfstoff eingesetzt. Das Centers for Disease Control and Prevention der USA

teilte die Burkholderien deshalb in die Kategorie B der sogenannten B-Waffen ein.

Obwohl in den letzten Jahren zahlreiche Studien zu den Virulenzmechanismen dieses Bakteriums

durchgeführt wurden, bleiben weiterhin viele Fragen im Bereich der diversen Infektionsprozesse

offen. Kürzlich (2011) konnte jedoch von Norville et al. ein Mip-ähnliches Protein (Bp-Mip) als

Hauptvirulenzfaktor von B. pseudomallei identifiziert werden.74

Dieses Polypeptid setzt sich aus 113

Aminosäuren zusammen, die eine Homologie von 40 %, 45 % und 42 % zu Lp-Mip, Ng-Mip und Ct-

Mip aufweisen. Analog zu seinen verwandten Proteinen besitzt Bp-Mip im Bereich der C-Domäne

eine PPIase-Aktivität und spielt ähnlich zur Funktion von Ng-Mip eine wichtige Rolle im Bereich

des intrazellulären Überlebens und der Vermehrung des Bakteriums. Die Adhäsion an die Wirtszelle

wie im Fall von Lp-Mip und Tc-Mip wird von Bp-Mip jedoch nicht beeinflusst.

1.5 Zielsetzung

1.5.1 Chemische Synthese

Im Zentrum dieser Arbeit stand das Oberflächenprotein Mip des gramnegativen Bakteriums L.

pneumophila. Da bis dato weder eine gezielte Behandlung der Legionellen möglich ist, noch die

Mortalitätsrate der Legionellose durch eine Antibiotikagabe reduziert werden konnte, sollten im

Rahmen dieser Arbeit neue Leitstrukturen für selektive Legionellen-Chemotherapeutika entwickelt

werden. Mip stellt hierfür ein vielversprechendes neues Target dar, da es zum einen durch seine

Position auf der Oberfläche der Legionellen leicht zugänglich ist, zum anderen bislang nicht von den

eingesetzten Antiinfektiva inhibiert wird, d.h. es existieren noch keine Resistenzmechanismen.

Bereits 2008 wurde an der Universität Würzburg mittels NMR-Strukturanalyse eine Mip/Rapamycin-

Komplexstruktur (2VCD) aufgeklärt.59

Da Mip eine große Sequenzhomologie zum humanen

FKBP12 aufweist, wurde in Kooperation mit der Molecular-Modelling-Arbeitsgruppe von Prof. Dr.

Christoph Sotriffer 2VCD mit einer literaturbekannten FKBP12/Rapamycin-Kristallstruktur

verglichen und mit Hilfe verschiedener Docking-Studien nach neuen Leitstrukturen für Mip-

Inhibitoren gesucht. Dabei wurde N,N-Dimethylphenylsulfonsäureamid als ein vielversprechender

Mip-Bindepartner identifiziert, woraufhin diese Verbindung im Rahmen dieser Arbeit zunächst

hergestellt werden sollte. Um anschließend eindeutige Struktur-Wirkungsbeziehungen zwischen dem

Sulfonsäureamid und Mip aufstellen zu können, sollte N,N-Dimethylphenylsulfonsäureamid

zusätzlich strukturell verändert und somit eine kleine Substanzbibliothek von Sulfonsäureamid-

32 EINLEITUNG

Derivaten erzeugt werden. Dabei sollten sowohl Strukturvariationen der Amidseitenkette (R1) als

auch des aromatischen Rests (R2) synthetisiert werden (siehe Abb. 19).

Abb. 19: Strukturelle Variationen zum Erstellen einer Substanzbibliothek von Sulfonsäureamid-Derivaten

Die natürlichen Makrolide FK506 und Rapamycin sind bereits bekannte Mip-Inhibitoren. Auf Grund

ihrer immunsuppressiven Effekte können die Arzneistoffe im Rahmen der Legionellosetherapie

jedoch nicht verwendet werden. In der Literatur existieren neben diesen beiden Makrozyklen weitere,

nicht-zyklische, sowie nicht-immunsuppressive FK506- bzw. Rapamycin-Analoga, die wie ihre

natürlichen Verwandten eine Pipecolinsäure-Grundstruktur aufweisen. Ob diese „kleinen“

Verbindungen Mip ebenfalls hemmen, war zu Beginn dieser Arbeit noch nicht geklärt. In einem

weiteren Projekt wurden daher zwei Vertreter dieser nicht-immunsuppressiven Verbindungen, ein

Pipecolin-α-Ketoamid (A) sowie ein Pipecolin-Sulfonsäureamid (B), ausgewählt und in Zusammen-

arbeit mit der Molecular-Modelling-Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Christoph Sotriffer mittels Docking-

Experimenten auf ihre Mip-Inhibition untersucht (siehe Abb. 20).

Abb. 20: Ausgewählte FKBP12-Inhibitoren für die computergestützte Wirkstoffanalyse58,63

Während das α-Ketoamid A keine reproduzierbaren Werte für eine Mip-Hemmung lieferte, zeigte

das Sulfonsäureamid B sehr gute Ergebnisse. Um diese Resultate zu verifizieren, sollten im Rahmen

dieser Arbeit zunächst beide Verbindungen sowie eine Mischform davon synthetisiert werden. In der

Mischform sollten sich der α-Ketoamid-Grundkörper von A und der Esterrest von B wiederfinden.

Einführung von subst. Phenyl-,

Benzyl- und Cyclohexylresten

Einführung von sekundären

und tertiären Aminen

EINLEITUNG 33

Um anschließend die für die Mip-Inhibition essenziellen Strukturmerkmale zu identifizieren, sollten

des Weiteren verschiedene Derivate der Sulfonsäureamid-Struktur B hergestellt werden (siehe Abb.

21). Dabei sollte sowohl der Benzylrest der Sulfonsäureamidseitenkette durch substituierte Benzyl-

und Phenylreste als auch das Sulfonsäureamid durch Carbonsäureamide ersetzt werden. Ferner

sollten auch Variationen der Esterseitenkette synthetisiert werden.

Die beiden Substanzbibliotheken, die der niedermolekularen Sulfonsäureamide und die der

Pipecolinsäure-Derivate, sollten schließlich mit Hilfe verschiedener pharmakologischer Testsysteme

auf ihre Mip-Wirkung untersucht und basierend auf den erhaltenen Erkenntnissen Struktur-

Wirkungsbeziehungen aufgestellt werden.

Abb. 21: Variationen am Pipecolinsäure-Grundgerüst zum Erstellen einer Substanzbibliothek

1.5.2 Pharmakologische Testung

Für die enzymatischen In-Vitro-Untersuchungen zur Bestimmung der Mip-Inhibition der neu

synthetisierten Verbindungen eignet sich ein Protease-gekoppelter PPIase-Assay.53

Dieser wurde zu

Beginn dieser Arbeit in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Dr. Matthias Weiwad am Max-

Planck-Institut für Enzymologie der Proteinfaltung in Halle durchgeführt und sollte am Institut für

Pharmazie der Universität Würzburg etabliert werden. Dazu sollte Mip im Rahmen dieser Arbeit

zunächst in Halle exprimiert und gereinigt werden.

Da sich die Existenz von Mip nicht nur auf die Familie der Legionellen beschränkt, sollten in

verschiedenen Kooperationsprojekten außerdem die Aktivitäten der hergestellten Verbindungen an

N. gonorrhoeae, C. trachomatis sowie an B. pseudomallei bestimmt werden.

Einführung von

aromatischen Esterseitenketten

mit Alkylspacern n = 1-5

Einführung von subst.

Benzyl- (m = 1) und

Phenylresten (m = 0)

Ersetzen der

Sulfongruppe durch

eine Carbonylfunktion

34 EINLEITUNG

ALLGEMEINER TEIL 35

2 DESIGN UND SYNTHESE DER ZIELVERBINDUNGEN

2.1 „Kleine“ Sulfonsäureamide

2.1.1 Computergestützte Entwicklung neuartiger Mip-Inhibitoren

Das bakterielle Mip sowie das humane FKBP12 gehören zur Enzymklasse der Isomerasen (PPIasen)

(siehe Kapitel 1.1.3.1). Die beiden PPIase-Domänen von Mip und FKBP12 weisen eine große

Sequenzhomologie zueinander auf. Aus diesem Grund können beide Enzyme auch durch identische

Arzneimittel, wie z.B. die makrozyklischen Immunsuppressiva, inhibiert werden. Auf Grund ihrer

immunsuppressiven Effekte dürfen diese Arzneistoffe jedoch nicht in der Therapie der bakteriellen

Legionellose verwendet werden. Daher galt es im Rahmen dieser Arbeit zunächst die strukturellen

Unterschiede zwischen beiden Proteinen aufzuzeigen und anschließend Stoffe zu entwickeln, die

selektiv das bakterielle Mip hemmen. Auf der Suche nach solchen potenziellen Mip-Inhibitoren

wurden die charakteristischen Aminosäuren im aktiven Zentrum näher betrachtet (siehe Kapitel

1.3.3). Die Überlagerung der Mip/Rapamycin-Komplexstruktur mit derjenigen des homologen

Proteins FKBP12 zeigte, dass die Bindetaschen insgesamt ähnlich sind, sich jedoch in einem

wichtigen Punkt unterscheiden: Die Mip-Aminosäure Tyr109 ragt tiefer ins aktive Zentrum der Mip-

Bindetasche hinein als ihr Gegenstück Tyr82 in die FKBP12-Kavität und verkleinert dadurch die

Mip-Bindetasche im Vergleich zur FKBP12-Kavität erheblich. Diese räumliche Diskrepanz wurde

als Ausgangspunkt für die computergestützte Entwicklung selektiver Mip-Inhibitoren genutzt. Da

dem Aminosäurerest Tyr109 eine weitere Tyrosingruppe (Tyr55) gegenüberliegt, wurde der Abstand

zwischen den beiden Tyrosin-Hydroxygruppen (Tyr-OH) berechnet und ergab einen Wert von 7.5 Å.

Unter Berücksichtigung dieses Abstands wurde nach funktionellen Gruppen gesucht, die optimal

diesen Raum ausfüllen und als Wasserstoffbrücken-Akzeptoren für die Tyr-OH-Gruppen fungieren

könnten. Als geeignete Kandidaten hierfür wurden Verbindungen mit einer Sulfon-Teilstruktur

identifiziert: Die beiden Sulfon-Sauerstoff-Atome können sich zwischen den beiden Tyr-OH-

Gruppen so orientieren, dass sich eine günstige Wasserstoffbrücken-Geometrie ausbilden kann (siehe

Abb. 22).

Die gesamten Molecular-Modelling-Untersuchungen dieser Arbeit wurden im Arbeitskreis von Prof. Dr.

Christoph Sotriffer an der Universität Würzburg hauptsächlich von Dr. Martin Sippel im Rahmen seiner

Dissertation58

durchgeführt.

36 ALLGEMEINER TEIL

Abb. 22: Abstand zwischen den Tyr-OH-Gruppen; günstige Wasserstoffbrücken-Geometrie des optimalen

Bindungspartners Sulfon

Im nächsten Schritt wurde versucht, die beiden Reste an der Sulfongruppe ebenfalls an die Mip-

Bindetasche anzupassen. Auf Grund der starken Hydrophobizität der Bindetasche sollten sich weitere

kleinere hydrophobe Gruppen als geeignet erweisen. Zur Bestätigung dieser Hypothese wurde N,N-

Dimethylphenylsulfonsäureamid (siehe Abb. 23) für weitere computergestützte Untersuchungen

ausgewählt.

Abb. 23: Struktur von N,N-Dimethylphenylsulfonsäureamid

Das Molekül ist durch eine Kopplung von Phenylsulfonsäurechlorid mit Dimethylamin synthetisch

leicht zugänglich und sollte sowohl hydrophobe Wechselwirkungen als auch Wasserstoff-

brückenbindungen mit den Aminosäuren der Mip-Kavität eingehen. Die Docking-Untersuchungen

wurden mit dem Programm GOLD 4.0 durchgeführt und zeigten für dieses Molekül sehr gute

Ergebnisse. Während das Sulfon sich, wie vorhergesagt, tatsächlich zwischen die beiden Tyr-OH-

Gruppen platzierte, lag der hydrophobe Phenylring tief in der Bindetasche verankert vor (siehe

Abb. 24).

2.5 Å

7.5 Å

2.5 Å 2.5 Å

ALLGEMEINER TEIL 37

Abb. 24: Docking von N,N-Dimethylphenylsulfonsäureamid in die Mip-Bindetasche (Proteinstruktur 2VCD)

Mit demselben Programm wurde daraufhin zuerst die Lage zahlreicher Phenylsulfonsäureamid-

Derivate, die sich lediglich in ihren hydrophoben Amidseitenketten unterschieden (siehe Abb. 25,

Strukturvariation I), in der Mip-Kavität bestimmt. Die vielversprechendsten Ergebnisse sollten

anschließend synthetisiert werden (siehe Kapitel 2.1.2.1.1 und 2.1.2.1.2).

Abb. 25: Docking-Ergebnisse: Variationen I und II an der Struktur von N,N-Dimethylphenylsulfonsäureamid

Neben den Variationen auf der Seite des Amins, wurden anschließend auch strukturelle

Veränderungen des aromatischen Teils des Moleküls untersucht (siehe Abb. 25, Strukturvariation II).

Während der Docking-Studien zeigten der Austausch des unsubstituierten Phenylrests durch

substituierte aromatische Reste sowie einen Cyclohexylrest sehr gute Ergebnisse, weshalb die

synthetische Herstellung dieser Substanzen ebenfalls angestrebt wurde (siehe Kapitel 2.1.2.2.1).

Des Weiteren fielen bei einer genauen Betrachtung der Bindetasche sowie dem darin gebundenen

N,N-Dimethylphenylsulfonsäureamid zwei Positionen auf, an denen das Molekül durch noch größere

Substituenten als den bereits untersuchten erweitert werden könnte. Einerseits sollte sich die

Einführung einer längeren Alkylseitenkette in meta-Position des Phenylrings (siehe Abb. 24,

Bindetasche A) positiv auf die Verankerung des Moleküls in der Bindetasche erweisen. Deshalb

Tyr55

Tyr109

A B

Strukturvariation I Strukturvariation II

38 ALLGEMEINER TEIL

wurde beabsichtigt, zusätzlich solche meta-substituierten Derivate zu synthetisieren (siehe Abb. 26,

Strukturvariation III / Kapitel 2.1.2.2.2 und 2.1.2.2.3).

Abb. 26: Docking-Ergebnisse: Strukturvariationen III-V von N,N-Dimethylphenylsulfonsäureamid

Andererseits könnte durch die Vergrößerung einer Amidseitenkette eine zusätzliche kleine

Seitentasche optimal adressiert werden (siehe Abb. 24, Bindetasche B). Um hierfür geeignete

Derivate zu finden, wurde ein Pharmakophor-basiertes virtuelles Screening durchgeführt. Basierend

auf N,N-Dimethylphenylsulfonsäureamid wurde mit Hilfe des Programms MOE folgendes

Pharmakophormodell erstellt: Der Phenylring des Ausgangsmoleküls wurde dafür durch ein

hydrophobes aromatisches Grundgerüst (siehe Abb. 27: brauner Polyeder), die beiden Sauerstoff-

gruppen des Sulfons durch zwei Protonen-Akzeptor-Gerüste dargestellt (siehe Abb. 27: blaue

Polyeder). Da das Schwefelatom für eine Mip-Interaktion eine eher unbedeutende Rolle spielt, wurde

es in diesem Modell vernachlässigt. Um einen räumlichen Bezug zum Protein herzustellen, wurden

die beiden Mip-Tyr-OH-Gruppen durch entsprechende Protonen-Donor-Gruppen angezeigt (siehe

Abb. 27: „kleine“ blaue Polyeder). Die Fragment-Datenbank des Programms wurde mit Hilfe dieses

Pharmakophormodells durchsucht und die passenden Fragmente anschließend in die Bindetasche

gedockt. Vielversprechende Bindemodi wurden bei N-((2-Oxo-oxazolidin-5-yl)methylbenzyl-

sulfonsäureamid identifiziert, weshalb die Synthese dieses Moleküls ebenfalls geplant wurde (siehe

Abb. 26, Strukturvariation IV / Kapitel 2.1.2.1.3). Außerdem wies aber auch Aminomethyl-

phenylsulfon recht gute Werte im Bereich der Bindemodi auf und sollte ebenfalls synthetisiert

werden (siehe Abb. 26, Strukturvariation V / Kapitel 2.1.2.3).

ALLGEMEINER TEIL 39

Abb. 27: Pharmakophormodell: Hydrophile Funktionalitäten (blau: Mip-Tyr-OH- (klein), sowie Sulfon-

Sauerstoffgruppen (groß)); hydrophobe Funktionalität (braun: aromatischer Phenylring)

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Sulfongruppe ein fester Bestandteil aller neu zu

entwickelnden Moleküle sein sollte.

2.1.2 Synthese der designten Sulfonsäureamid-Derivate

Ausgehend von den Ergebnissen der Molecular-Modelling-Untersuchungen wurden zahlreiche

Sulfonsäureamid-Derivate hergestellt. Diese Moleküle lassen sich strukturell in zwei Gruppen

unterteilen (siehe Abb. 28):

Abb. 28: Grundstrukturen A und B der Sulfonsäureamid-Derivate

Das Grundgerüst der beiden Zielverbindungen ist N,N-Dimethylphenylsulfonsäureamid. In

Zielverbindung A bleibt der aromatische Bereich unverändert und der sulfonsäureamidische

Stickstoff wird unterschiedlich substituiert: Neben Alkylaminen wie Ethylamin, Propylamin,

Mip-Tyr55-OH

Mip-Tyr109-OH

Phenylrest

Sulfon-Sauer-

stoffgruppen

40 ALLGEMEINER TEIL

Propargylamin, Isopropylamin, Pyrrolidin, Piperidin, Piperazin, Cyclopropylamin, Cyclopentylamin

wurden aromatische Amine wie Benzylamin, 2-Phenylethylamin, S-1-Phenylethylamin, 4-

Methoxyamin, 4-Methylamin sowie Tryptamin anstelle des Dimethylamins an das Sulfon gekoppelt.

In Zielverbindung B stellt der aromatische Teil von N,N-Dimethylphenylsulfonsäureamid den

variablen Bereich des Moleküls dar. Der unsubstituierte Phenylring wurde durch meta- und para-

substituierte Phenylringe, einen Benzylring sowie einen Cyclohexylring ersetzt.

2.1.2.1 Darstellung von Derivaten mit der Grundstruktur A

2.1.2.1.1 Syntheseweg zur Herstellung der Phenylsulfonsäureamide 1a-1p*

Für die Synthese von Verbindungen mit der Grundstruktur A eignete sich die Kopplung von

Phenylsulfonsäurechlorid mit dem entsprechenden Amin nach einer allgemeinen Vorschrift.76

Diese

„kleinen“ Sulfonsäureamide wurden auf klassische Weise in einer nukleophilen Substitutionsreaktion

(SN2-artig) hergestellt.76

Bei dieser Reaktion greift das freie Elektronenpaar des Amins als

Nukleophil das elektrophile Schwefelatom an, wobei unter Abspaltung von Salzsäure das

gewünschte Sulfonsäureamid entsteht. Die entstehende Salzsäure kann das Edukt (Amin) jedoch

bereits während der Reaktion unter Salzbildung ausfällen. Dies hat zur Folge, dass der gewünschten

Reaktion das nukleophile Amin entzogen und damit die Ausbeute des Produkts verringert wird. Aus

diesem Grund muss eine zusätzliche Base als Hilfsbase eingesetzt werden. Die Hilfsbase geht nun

anstelle des Amins die Salzbildung mit der Salzsäure ein und unterdrückt somit die unerwünschte

Nebenreaktion. Zur Darstellung der Zielverbindungen A wurde als Hilfsbase Triethylamin

verwendet. Die Synthese verlief nach folgendem Schema (siehe Abb. 29):

Abb. 29: Syntheseweg zur Herstellung der Verbindungen 1a-1p

* Alle gekennzeichneten Verbindungen im Allgemeinen Teil sind bereits in der Literatur beschrieben (Verweise

siehe Experimenteller Teil).

ALLGEMEINER TEIL 41

Phenylsulfonsäurechlorid wurde in THF mit Überschüssen an Hilfsbase und entsprechendem Amin

umgesetzt. Eine quantitative Umsetzung konnte nach 40 h bei RT beobachtet werden (DC-

Kontrolle). Die erhaltenen Verbindungen 1a-1p lagen nach Reinigung als klare, gelbe, rote sowie

braune Öle bzw. weiße bis braune Pulver vor (Ausbeute: siehe Abb. 30).

Abb. 30: Synthetisierte Verbindungen 1a-1p

42 ALLGEMEINER TEIL

2.1.2.1.2 Syntheseweg zur Herstellung der Phenylsulfonsäureamide 2a-2c

Die Ergebnisse der Docking-Untersuchungen zeigten, dass sich tertiäre Phenylsulfonsäureamide

vermutlich besser in die Mip-Kavität einlagern als sekundäre Amide. Zu diesem Zweck wurden

einige bereits hergestellte sekundäre Amide (Verbindungen 1g-1i) in einer klassischen nukleophilen

Substitutionsreaktion (SN2-artig) zum entsprechenden tertiären Amid umgesetzt (siehe Abb. 31).76

Das sekundäre Amid wurde dafür zuerst mit einer Base deprotoniert und anschließend mit

Methyliodid unter Säurefreisetzung (HI) gekoppelt. Bei dieser Reaktion musste keine weitere

Hilfsbase eingesetzt werden, da die entstandene Säure während der Reaktion durch die bereits

eingesetzte Base Kalium-t-butylat neutralisiert wurde.

Zur Synthese der Verbindungen 2a-2c wurden Verbindung 1g-1i jeweils in DMF mit Überschüssen

an Kalium-t-butylat und Methyliodid umgesetzt. Eine quantitative Umsetzung zum gewünschten

Produkt konnte nach 3 h bei RT beobachtet werden (DC-Kontrolle). Nach säulenchromato-

graphischer Reinigung lagen die erhaltenen Verbindungen 2a-2c als klare Öle vor (Ausbeute: siehe

Abb. 31).

Abb. 31: Syntheseweg zur Herstellung der Verbindungen 2a-2c

2.1.2.1.3 Versuche der Synthese von N-((2-Oxo-oxazolidin-5-yl)methyl)benzylsulfonsäureamid

Neben den Verbindungen 1a-1p sowie 2a-2c lieferte das computergestützte Wirkstoffdesign auch N-

((2-Oxo-oxazolidin-5-yl)methyl)benzylsulfonsäureamid (siehe Abb. 32), das auf Grund seiner

Oxazolidinonsubstruktur optimal den Raum der kleinen Mip-Seitentasche ausfüllen und mit den dort

vorliegenden Aminosäuren in Wechselwirkung treten können sollte.

ALLGEMEINER TEIL 43

Abb. 32: Strukturformel von N-((2-Oxo-oxazolidin-5-yl)methyl)benzylsulfonsäureamid

Da lediglich 5-Chlormethyl-2-oxazolidinon kommerziell erworben werden konnte, war in diesem

Fall eine einstufige Synthese ausgehend von Phenylsulfonsäurechlorid nicht möglich. Deshalb wurde

eine andere Synthesestrategie entwickelt (siehe Abb. 33). Als Edukt wurde Phenylsulfonsäureamid

verwendet, das mit Hilfe einer geeigneten Base zuerst deprotoniert und anschließend über eine SN2-

artige Substitutionsreaktion mit 5-Chlormethyl-2-oxazolidinon unter Säureabspaltung gekoppelt

werden sollte.

Abb. 33: Syntheseweg zur Darstellung von N-((2-Oxo-oxazolidin-5-yl)methyl)benzylsulfonsäureamid

Zur Deprotonierung wurden verschiedene Basen (siehe Tabelle 3) eingesetzt.

Syntheseweg Base Lösungsmittel Temperatur Molverhältnis [Sulfonamid/Chlorid/Base]

1 K2CO3 / KI DMF 100 °C 1 : 3 : 5

2 Kalium-t-butylat DMF RT 1 : 5 : 5

3 NaH THF RT 3 : 1 : 4

4 K2CO3 / Tetrabutyl-

ammoniumbromid Toluol 100 °C 1 : 1 : 1

Tabelle 3: Edukte und Reaktionsbedingungen für die Darstellung von N-((2-Oxo-oxazolidin-5-yl)-

methyl)benzylsulfonsäureamid

Phenylsulfonsäureamid wurde im entsprechenden Lösungsmittel vorgelegt und anschließend bei

einer definierten Temperatur mit der entsprechenden Base versetzt (siehe Tabelle 3). Nach 1 h wurde

5-Chlormethyl-2-oxazolidinon zugegeben und der Ansatz mehrere Stunden gerührt. Unter keiner der

angegebenen Reaktionsbedingungen fand eine Umsetzung zum gewünschten Endprodukt statt. Mit

44 ALLGEMEINER TEIL

Hilfe von DC- sowie NMR-Kontrollen konnte lediglich das Edukt Phenylsulfonsäureamid

identifiziert werden.

Auf Grund dieser „Nicht-Umsetzung“ sowie aus Kostengründen wurde Benzylchlorid anstelle von 5-

Chlormethyl-2-oxazolidinon für weitere Syntheseversuche herangezogen (siehe Abb. 34).

Abb. 34: Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 3

Zuerst wurde n-Butyllithium als sehr starke Base für die Deprotonierung von Phenylsulfonsäureamid

verwendet. Phenylsulfonsäureamid wurde dafür in THF gelöst und auf – 70 °C abgekühlt. Bei dieser

Temperatur wurde n-Butyllithium zugegeben und 10 min gerührt. Danach wurde der Ansatz auf RT

erwärmt und Benzylchlorid zugegeben. Eine chemische Umsetzung konnte nach 6 h bei RT

beobachtet werden (DC-Kontrolle). Um anschließend überschüssiges n-Butyllithium zu entfernen,

wurde H2O zugegeben und mit CHCl3 extrahiert. Nach säulenchromatographischer Reinigung lag

Verbindung 3 als weißes Öl vor (Ausbeute: 1 %).

Auf Grund der schlechten Ausbeute wurde die klassische Reaktion anschließend in einer

Synthesemikrowelle durchgeführt. Bei dieser Synthesevariante wurde anstelle von n-Butyllithium als

basische Komponente K2CO3 verwendet. Zusammen mit den beiden anderen Ausgangsstoffen wurde

die Base in Methanol gelöst und 3 h in der Mikrowelle erhitzt. Nach säulenchromatographischer

Reinigung konnte Verbindung 3 als weißes Pulver in einer Ausbeute von 22 % erhalten werden.

Diese zweite Variante wurde nun auf die Synthese von N-((2-Oxo-oxazolidin-5-yl)methyl)benzyl-

sulfonsäureamid übertragen, zeigte aber auch nach mehreren Tagen keinerlei Stoffumsatz (DC-

sowie NMR-Kontrolle).

Um die Verbindung N-((2-Oxo-oxazolidin-5-yl)methyl)benzylsulfonsäureamid auf dieselbe Weise

wie die Verbindungen 1a-1p, d.h. ausgehend von Phenylsulfonsäurechlorid, herzustellen, müsste 5-

Chlormethyl-2-oxazolidinon zunächst zum entsprechenden Amin umfunktionalisiert werden. Als

weitere Synthesestrategie zur Darstellung der Zielverbindung wäre deshalb eine Umfunktiona-

lisierung mit Kaliumphtalimid in Form einer Gabriel-Synthese und eine anschließende

Substitutionsreaktion von Phenylsulfonsäurechlorid und dem entstandenen 5-Aminomethyl-2-

oxazolidinon denkbar. Da für diese Reaktion jedoch nicht genügend 5-Chlormethyl-2-oxazolidinon

vorhanden war, wurde diese Strategie aus den bereits genannten Kostengründen nicht weiter verfolgt.

ALLGEMEINER TEIL 45

2.1.2.2 Darstellung von Derivaten mit der Grundstruktur B

2.1.2.2.1 Syntheseweg zur Herstellung der Verbindungen 4a-4e

Um Substituenten in den aromatischen Teil von N,N-Dimethylphenylsulfonsäureamid einzuführen,

wurden fünf kommerziell erhältliche Sulfonsäurechloride in einer nukleophilen Substitutionsreaktion

mit Dimethylamin zu ihrem entsprechenden N,N-Dimethylsulfonsäureamid umgesetzt (siehe

Abb. 35).

Abb. 35: Syntheseweg zur Herstellung der Verbindungen 4a-4e

Die Synthese erfolgte analog zur Synthese der am Ring unsubstituierten Phenylsulfonsäureamid-

Derivate (siehe 2.1.2.1.1). Die erhaltenen Verbindungen 4a-4e fielen als weiße bis gelbe Öle bzw.

weiße bis beige Pulver in sehr guten Ausbeuten an (siehe Abb. 36).

Abb. 36: Synthetisierte Verbindungen 4a-4e

46 ALLGEMEINER TEIL

2.1.2.2.2 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 5

Für die Darstellung der meta-substituierten Phenylsulfonsäureamide wurde die Nitroverbindung 4e in

einem ersten Reaktionsschritt zur Aminoverbindung 5 reduziert, um anschließend alkyliert werden zu

können (siehe Abb. 37).

Abb. 37: Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 5

Die Reduktion wurde nach der Vorschrift von Bellamy et al. durchgeführt.77

Die Nitroverbindung 4e

wurde in Ethanol mit einem Überschuss an Zinn(II)chlorid x 2 H2O unter Rückfluss erhitzt. Eine

quantitative Umsetzung konnte nach 2 h beobachtet werden (DC-Kontrolle). Danach wurde H2O

zugegeben, bis sich das überschüssige Zinn(II)chlorid vollständig gelöst hatte, mit ges. NaHCO3-

Lösung auf pH 8 eingestellt und das primäre aromatische Amin mit Essigsäureethylester extrahiert.

Das beige Pulver (Verbindung 5) wurde in einer Ausbeute von 97 % erhalten.

2.1.2.2.3 Syntheseweg zur Herstellung der Verbindungen 6a-6e

Die reduktive Aminierung wurde nach der Vorschrift von Gribble et al. durchgeführt.78

Die

Kombination des Reduktionsmittels Natriumborhydrid mit einer organischen Säure ermöglicht die

einfache Alkylierung eines primären oder sekundären aromatischen Amins. Nach Gribble et al. kann

der Reaktionsverlauf durch eine Temperaturkontrolle zusätzlich in die Richtung der Mono- oder

Dialkylderivate gesteuert werden.78

Im Rahmen dieser Arbeit sollten daher nach folgendem Schema

(siehe Abb. 38) einfach alkylierte Phenylsulfonsäureamide hergestellt werden.

ALLGEMEINER TEIL 47

Abb. 38: Syntheseweg zur Herstellung der Verbindungen 6a-6e

Das primäre aromatische Amin 5 wurde in der entsprechenden Carbonsäure gelöst und vorsichtig ein

Überschuss an Natriumborhydrid zugegeben. Eine quantitative Umsetzung konnte nach 24 h bei RT

beobachtet werden (DC-Kontrolle). Zur Abreaktion des überschüssigen NaBH4 wurde H2O

zugegeben, mit verdünnter Natronlauge auf pH 8 eingestellt und das aromatische Amin mit CHCl3

extrahiert. Nach säulenchromatographischer Reinigung lagen die erhaltenen Verbindungen 6a-6e als

gelbe Öle bzw. weiße Pulver vor (Ausbeute: siehe Abb. 39). Bei der Aminierungsreaktion mit

Ameisensäure konnte die einfach methylierte Verbindung N,N-Dimethyl-3-(methylamino)benzyl-

sulfonsäureamid nicht erhalten werden, es entstand nur das zweifach methylierte Produkt 6d. Wurde

jedoch Propionsäure als Alkylierungsreagenz verwendet, konnte sowohl das Mono- als auch das

Dialkylderivat isoliert werden.

Abb. 39: Synthetisierte Verbindungen 6a-6e

48 ALLGEMEINER TEIL

2.1.2.3 Versuche der Synthese von Aminomethylphenylsulfon

Aminomethylphenylsulfon war ebenfalls ein Ergebnis des virtuellen Screenings. Ausschlaggebend

für die chemische Herstellung von Aminomethylphenylsulfon war die anschließend synthetisch leicht

zugängliche Vergrößerung des Moleküls über eine Kopplungsreaktion des primären Amins. Zuerst

sollte deshalb ausgehend von Phenylsulfonsäurechlorid und Nitromethan Aminomethylphenylsulfon

in einer SN2-artigen Substitutionsreaktion dargestellt werden. Dazu sollte Nitromethan mit einer

geeigneten Base zuerst deprotoniert und anschließend mit Phenylsulfonsäurechlorid unter

Säureabspaltung gekoppelt werden (siehe Abb. 40).

Abb. 40: Syntheseweg zur Darstellung von Aminomethylphenylsulfon

Zu diesem Zweck wurde Nitromethan zusammen mit einer starken Base bei RT im entsprechenden

Lösungsmittel gelöst und nach 15 min ein Äquivalent Phenylsulfonsäurechlorid zugegeben. Dieser

Ansatz wurde mehrere Stunden gerührt, wobei der Reaktionsverlauf dünnschichtchromatographisch

verfolgt wurde. Unter keiner der angegebenen Reaktionsbedingungen (siehe Tabelle 4) fand eine

Umsetzung zum gewünschten Endprodukt statt, so dass die anschließend geplante Reduktion mit

Zinn(II)chlorid gar nicht erst durchgeführt werden konnte.

Syntheseweg Base Lösungsmittel Molverhältnis [Chlorid/Nitromethan/Base]

1 Kalium-t-butylat DMF 1 : 10 : 10

2 KOH DMF 1 : 10 : 10

3 n-Butyllithium DMF 1 : 5 : 5

4 K2CO3 / KI DMF 1 : 5 : 10

5 NaH THF 1 : 3: 4

Tabelle 4: Edukte und Reaktionsbedingungen für die Darstellung von Nitromethylphenylsulfon

ALLGEMEINER TEIL 49

2.1.3 Diskussion des 1H-NMR-Spektrums von Verbindung 1k

Abb. 41: 1H-NMR-Spektrum der Sulfonsäureamid-Verbindung 1k (gemessen in DMSO)

An dieser Stelle soll stellvertretend für alle hergestellten „kleinen“ Sulfonsäureamide das 1H-NMR-

Spektrum von Verbindung 1k diskutiert werden (siehe Abb. 41). Die gegenüberliegenden Protonen

des Phenylrings der Sulfonseitenkette sind auf Grund der symmetrischen Eigenschaften des

Aromaten chemisch äquivalent und wären daher als Dublett (Ha/e) und Triplett (Hb/d) zu erwarten. Im

gemessenen Spektrum erscheinen die Protonen jedoch als Multiplett in den Bereichen δ = 7.81-

7.76 ppm (Ha/e) und δ = 7.67-7.53 ppm (Hb/c/d). Der Grund dafür sind 4J-Kopplungen - d.h. Wechsel-

wirkungen zwischen den aromatischen Protonen in meta-Position -, die zusätzlich zu den vicinalen 3J-Kopplungen auftreten und somit die Signale weiter aufspalten. Die Methylengruppe erscheint auf

Grund ihrer direkten Nachbarschaft zum amidischen Stickstoff als Dublett bei δ = 3.90 ppm mit einer

Kopplungskonstanten von 3J = 6.2 Hz und ist im Gegensatz zu einer gewöhnlichen aliphatischen

Methylengruppe durch den entschirmenden Effekt des Stickstoffs Tieffeld-verschoben. Das be-

nachbarte amidische Proton ist deutlich als Triplett bei δ = 8.04 ppm zu erkennen. Der Aromat der

Amidseitenkette ist ein klassisches AB-Ringsystem. Die gegenüberliegenden aromatischen Protonen

sind chemisch äquivalent und treten deshalb bei δ = 7.12 ppm und δ = 6.82 ppm jeweils als scharfes

Dublett mit einer Kopplungskonstanten von 3J = 8.7 Hz auf. Ein typisches Merkmal eines AB-

Systems ist der sogenannte Dacheffekt, der bei diesen Signalen gut sichtbar wird. Die Protonen der

aromatischen Methoxygruppe erscheinen auf Grund des entschirmenden Effekts der benachbarten

Ethergruppe Tieffeld-verschoben bei δ = 3.70 ppm als scharfes Singulett. Die exakten NMR-Daten

zu allen Sulfonsäureamiden sind im experimentellen Teil dieser Arbeit zu finden.

NH

H1/4

H2/3

7.8 0 7.75 7.70 7.65 7.60 7.55 ppm

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 ppm

Hb/c/d

Ha/e

50 ALLGEMEINER TEIL

2.2 Pipecolinsäure-Derivate

2.2.1 Docking-Untersuchungen von bekannten FKBP12-Inhibitoren

Die PPIase-Domänen der beiden Proteine (Mip und FKBP12) weisen sehr ähnliche hydrophobe

Bindetaschen auf. Auf Grund dessen kann die PPIase-Aktivität der beiden Proteine durch identische

Wirkstoffe gehemmt werden; potente Inhibitoren sind die zyklischen Makrolide Rapamycin und

FK506. Die Pipecolinsäure-Grundstruktur beider Wirkstoffe ist über dieselben Funktionalitäten tief

in der FKBP12- sowie der Mip-Bindetasche verankert (siehe Kapitel 1.3.3). Trotz dieser identischen

Wechselwirkungen bedingt die unterschiedliche geometrische Ausrichtung einzelner Aminosäuren -

Tyr109 in Mip bzw. Tyr82 in FKBP12 - im aktiven Zentrum der hydrophoben Bindetaschen, dass die

Pipecolinsäure-Grundstruktur eine andere Stellung in Mip als in FKBP12 einnimmt. Daher sollte

zunächst mit Hilfe verschiedener Docking-Studien die Lage der Pipecolinsäure-Struktur in Mip näher

untersucht und durch die so gewonnenen neuen Erkenntnisse neuartige, selektive Mip-Inhibitoren

vom Pipecolinsäure-Typ entwickelt werden.

Da für eine Mip-Inhibition die zusätzliche immunsuppressive Wirkung von Rapamycin bzw. FK506

unerwünscht ist, wurden für alle weiteren computergestützten Versuche nur Verbindungen

verwendet, die die Funktionalitäten der Bindedomäne - d.h. der Pipecolinsäure-Struktur -, aber nicht

die der Effektordomäne - d.h. der aliphatischen Kette des Makrozyklus - der Immunsuppressiva

enthalten (siehe Kapitel 1.2.2.2). In der Literatur sind bereits sehr viele solcher sogenannten nicht-

immunsuppressiven FKBP12-Inhibitoren beschrieben, von denen für die computergestützte

Wirkstoffanalyse zwei Moleküle ausgewählt wurden, die FKBP12 im unteren mikromolaren Bereich

inhibieren (1FKG-lig: Ki = 0.010 µM und MI-1: Ki = 0.23 µM) (siehe Abb. 42).

Abb. 42: Ausgewählte FKBP12-Inhibitoren für die computergestützte Wirkstoffanalyse58,63

ALLGEMEINER TEIL 51

Während Verbindung 1FKG-lig (A) die gleichen Strukturmerkmale der Bindedomäne von

Rapamycin beinhaltet, wurde die α-Keto-Amidstruktur in MI-1 (B) durch ein Sulfonsäureamid

ersetzt. Von Verbindung 1FKG-lig existierte bereits eine Struktur (1FKG)55

komplexiert mit

FKBP12. Der Vergleich der Bindemodi von 1FKG bzw. von Rapamycin im Komplex mit FKBP12

(1FKB, siehe Kapitel 1.3.2) zeigte bzgl. der Position der Pipecolinsubstruktur eine Übereinstimmung

von nahezu 100 %. Überträgt man diese FKBP12-Daten nun auf die Mip-Kavität, sollte 1FKG-lig in

ähnlicher Weise gebunden vorliegen wie Rapamycin im entsprechenden Mip-Komplex. Das Docking

dieser nicht-immunsuppressiven Struktur in Mip wurde mit dem Programm AutoDock 3.0 unter

Verwendung der Proteinstruktur 2VCD (siehe Kapitel 1.3.1) durchgeführt. Das in 2VCD gebundene

Rapamycin wurde zu diesem Zweck aus der Bindetasche entfernt und durch 1FKG-lig ersetzt. Die

Docking-Ergebnisse ergaben letztendlich zwar einen sehr guten Bindemodus für das Molekül, jedoch

stimmte er nur in einem geringen Maß mit dem Bindemodus von Rapamycin im Mip-Komplex

überein. Außerdem konnte dieser günstige Bindemodus auch nur in zwei von hundert Docking-

Versuchen reproduziert werden. Zusammenfassend lässt sich daher sagen, dass eine Bindung von

1FKG-lig an Mip zwar potenziell möglich, aber wohl eher unwahrscheinlich ist. Um dieses Ergebnis

zusätzlich noch durch einen pharmakologischen Assay zu bestätigen, wurde das Molekül

anschließend synthetisiert (siehe Kapitel 2.2.2.1).

Die Vorgehensweise bei den Docking-Studien von MI-1 verlief identisch zu den oben be-

schriebenen. Die Pipecolin-Sulfonsäureamidstruktur platzierte sich deutlich besser in die Bindetasche

von Mip als die α-Ketoamidstruktur von 1FKG-lig (siehe Abb. 43). Des Weiteren konnte sogar ein

besserer Bindemodus von MI-1 in der bakteriellen Bindetasche als in der von FKBP12 erzielt

werden. Dies gilt aber lediglich für das S-Enantiomer von MI-1. Das S-Isomer scheint sich bevorzugt

in die Kavität von Mip einzulagern, während das R-Enantiomer zwar auch, jedoch in einer anderen

Position gebunden, in der Bindetasche vorliegen kann. Zur Überprüfung dieser Ergebnisse sollte

MI-1 nun synthetisch als Racemat und als S-Enantiomer hergestellt werden (siehe Kapitel 2.2.2.2).

Abb. 43: Docking von MI-1 in die Mip-Bindetasche (2VCD); bestes Ergebnis aller möglichen Bindemodi;

(Wiedergabe nach Sippel58

bzw. nach Juli et al.63

mit Genehmigung des Autors bzw. der American Chemical

Society)

52 ALLGEMEINER TEIL

2.2.2 Darstellung der Pipecolinsäure-Derivate

2.2.2.1 Allgemeine Synthesestrategie zur Darstellung der Zielverbindung A

2.2.2.1.1 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 18a

Die Synthese von Zielverbindung A wurde bereits 1993 von Holt et al. beschrieben und sollte nach

diesen Angaben durchgeführt werden.55

Diese Vorschrift startet mit der Umsetzung von 1-(2-Ethoxy-

2-oxoacetyl)piperidin-2-carbonsäureethylester 8 und 1,1-Dimethylpropylmagnesiumchlorid in Form

einer klassischen Grignard-Reaktion (siehe Abb. 44, rechtes Schema). Hierbei wird das elektrophile

Carbonyl-C-Atom des Ethylesters der Amidseitenkette von dem Grignard-Reagenz nukleophil

angegriffen. Unter Ethanolabspaltung entsteht nach Holt et al. anschließend der gewünschte α-

Ketoamid-Pipecolinsäureethylester.55

Um zu verhindern, dass die Reaktion möglicherweise über eine

nukleophile Addition bis zum tertiären Alkohol weiterläuft, wird das Grignard-Reagenz nur in einem

kleinen Überschuss eingesetzt.

Das von Holt et al. verwendete Edukt 8 war kommerziell nicht verfügbar und wurde zunächst über

eine zweistufige Synthese hergestellt (siehe Abb. 44).55

Als Ausgangsstoff für Verbindung 8 diente

die kommerziell erhältliche, racemische Pipecolinsäure, die nach Aktivierung mit Thionylchlorid

zum Pipecolinsäureethylester 7a umgesetzt wurde. Dazu wurde das Edukt in Ethanol mit einem

Überschuss an Thionylchlorid 4 h erhitzt, bis die Umsetzung quantitativ war (DC-Kontrolle) und der

Pipecolinsäureethylester 7a in Form eines gelben Öls erhalten wurde (Ausbeute: 90 %).

Dann folgte eine Amidierung von Verbindung 7a mit Monoethyloxalylchlorid in Gegenwart einer

Hilfsbase mittels einer SN2-artigen Substitutionsreaktion. Nach Vereinigung der beiden

Reaktionslösungen, bestehend aus Verbindung 7a in Dioxan sowie Monoethyloxalylchlorid und

Hilfsbase in Dioxan, konnte eine quantitative Umsetzung bei RT nach 6 h beobachtet werden (DC-

Kontrolle). Verbindung 8 lag als braunes Öl vor (Ausbeute: 94 %).

Nun sollte die von Holt et al. beschriebene Grignard-Reaktion durchgeführt werden.55

Bei der In-

situ-Herstellung des Grignard-Reagenzes 1,1-Dimethylpropylmagnesiumchlorid wurde das von Holt

verwendete Chlorid durch die bessere Abgangsgruppe Bromid ersetzt. Daher wurde 1,1-

Dimethylpropylbromid mit äquivalenten Mengen Magnesiumspänen in abs. THF suspendiert. Der

Ansatz wurde mit Iod versetzt und mehrere Stunden unter Rückfluss erhitzt, jedoch keine Umsetzung

beobachtet (DC-Kontrolle). Alternativ sollte deshalb das Grignard-Reagenz nach Mutule et al. durch

eine Mikrowellen-unterstützte Synthese hergestellt werden.79

Hierfür wurde ein Äquivalent der

Halogenkomponente mit 1.1 Äquivalenten Magnesiumspänen in abs. THF bei 80 °C umgesetzt.

Jedoch erfolgte auch nach einstündigem Erhitzen und einer zusätzlichen Zugabe von Jod in die

Reaktionslösung kein Stoffumsatz (DC-Kontrolle).

ALLGEMEINER TEIL 53

Abb. 44: Syntheseweg zur Darstellung der Grundstruktur A55

54 ALLGEMEINER TEIL

Die zweite Synthesestrategie war daher, die gewünschte Seitenkette am Pipecolin-Stickstoff

direkt durch eine Amidierung von Verbindung 7a mit 3,3-Dimethyl-2-oxovaleriansäure einzuführen.

Jedoch ist nur das Natriumsalz der 3-Methyl-2-oxovaleriansäure kommerziell erhältlich; dieses Salz

unterscheidet sich von 3,3-Dimethyl-2-oxovaleriansäure lediglich durch das Fehlen einer

Methylgruppe. Laut Rücksprache mit der Docking-Arbeitsgruppe sollte dieser geringe strukturelle

Unterschied keine Auswirkungen auf die Lage des Moleküls in der Mip-Bindetasche haben. Da das

Natriumsalz einer Säure unter normalen Bedingungen nicht direkt mit einem Amin umgesetzt werden

kann, musste zuerst die entsprechende Säure freigesetzt werden. Dafür wurde 3-Methyl-2-

oxovaleriansäure-Natriumsalz in H2O gelöst, konzentrierte Salzsäure bis pH 1 zugegeben und

anschließend mehrfach mit CHCl3 extrahiert (DC-Kontrolle). Die freigesetzte Säure 9 lag bei 4 °C in

Form weißer Nadeln vor (Ausbeute: 86 %).

Anschließend wurde Verbindung 9 zunächst mit Oxalylchlorid aktiviert und danach in Form einer

nukleophilen Substitutionsreaktion mit Verbindung 7a zum Amid umgesetzt. Dazu wurde

Verbindung 9 in DMF mit Oxalylchlorid 12 h bei RT gerührt. Danach wurde zuerst ein kleiner

Überschuss an N,N-Diisopropylethylamin und nach 5 min Verbindung 7a zugegeben. Eine

chemische Umsetzung konnte nach 1-2 d beobachtet werden (DC-Kontrolle). Nach säulen-

chromatographischer Reinigung wurde Verbindung 10 in Form eines gelben Öls mit einer Ausbeute

von 20 % erhalten.

Abgesehen von der fehlenden Methylgruppe in der Amidseitenkette entspricht Verbindung 10 dem

Zwischenprodukt 1-(3,3-Dimethyl-2-oxopentanoyl)piperidin-2-carbonsäureethylester der anfangs

angestrebten Synthese nach Holt, so dass die literaturbekannte Strategie ab diesem Zeitpunkt

weiterverfolgt werden konnte. Zunächst wurde Verbindung 10 in Methanol auf 0 °C abgekühlt und

mit einer LiOH-Lösung versetzt, bis die Umsetzung nach 1 h quantitativ war (DC-Kontrolle). Nach

Zugabe von verdünnter Salzsäure bis pH 1, wurde mehrfach mit CH2Cl2 extrahiert und schließlich

Verbindung 13 in Form eines gelben Öls erhalten (Ausbeute: 67 %).

Im nächsten Schritt wurde Verbindung 13 nach Steglich mit der gewünschten Alkoholkomponente

verestert.80

Als Reagenzien werden hierbei Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in geringem Überschuss

sowie Dimethylaminopyridin (DMAP) in katalytischer Menge verwendet. DCC wird im ersten

Schritt durch die eingesetzte Carbonsäure protoniert und anschließend durch eine nukleophile

Addition des entstandenen Carboxylat-Anions zum O-Acylisoharnstoff umgesetzt. Daraufhin greift

das freie Elektronenpaar der Hydroxygruppe der Alkoholkomponente am elektrophilen Carbonyl-C-

Atom des O-Acylisoharnstoffs an und es entsteht der gewünschte Ester sowie Dicyclohexylharnstoff.

Da Alkohole im Gegensatz zu Aminen schwache Nukleophile sind, können bei Reaktionen mit

Alkoholen N-Acylharnstoffe als Nebenprodukt entstehen. Um diese unerwünschte Nebenreaktion zu

unterdrücken, verwendet Steglich zusätzlich DMAP als O-Acyltransfer-Reagenz. Anstelle des

Alkohols greift dann das freie Elektronenpaar von DMAP die elektrophile Carbonylverbindung des

O-Acylisoharnstoff an und bildet unter Abspaltung von Dicyclohexylharnstoff ein reaktives Amid,

ALLGEMEINER TEIL 55

das wiederum nukleophil vom Alkohol angegriffen werden kann. Unter Abspaltung von DMAP

entsteht schließlich der gewünschte Ester.

Wie bei Standard-Veresterungsmethoden wurde bei der hier durchgeführten Steglich-Veresterung als

saurer Katalysator die organische p-Toluolsulfonsäure verwendet. Dazu wurden Verbindung 13, ein

kleiner Überschuss an 1,3-Diphenylpropan-1-ol 17 sowie die Reagenzien DCC, DMAP und p-

Toluolsulfonsäure in CH2Cl2 umgesetzt. Eine quantitative Umsetzung wurde nach 72 h bei RT

beobachtet (DC-Kontrolle). Anschließend wurde der Niederschlag von Dicyclohexylharnstoff

abfiltriert und das Lösungsmittel des Filtrats im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde in

Essigsäureethylester suspendiert, wobei sich erneut ein Niederschlag bildete, der wiederum abfiltriert

wurde. Der Vorgang des Fällens und Filtrierens wurde sooft wiederholt, bis sich nach

Essigsäureethylester-Zugabe kein Niederschlag mehr bildete. Nach säulenchromatographischer

Reinigung erhielt man Verbindung 18a in Form eines gelben Öls (Ausbeute: 30 %).

Aus Kostengründen wurde der Alkohol 17 für die Veresterung durch eine klassische Grignard-

Synthese selbst hergestellt (siehe Abb. 45).76

Abb. 45: Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 17

Hierzu wurden Magnesiumspäne in Diethylether mit 2-Phenylethylbromid solange zum Rückfluss

erhitzt, bis alle Magnesiumspäne abreagiert waren. Anschließend wurde auf RT erwärmt und

Benzaldehyd in Diethylether vorsichtig zugetropft. Danach wurde weitere 2 h unter Rückfluss erhitzt

und anschließend mit Eis hydrolysiert. Der entstandene Niederschlag wurde in verdünnter Salzsäure

gelöst und die organische Phase abgetrennt. Die wässrige Phase wurde mit Diethylether extrahiert

und die organischen Phasen vereinigt, um anschließend mehrmals mit NaHCO3-, NaHSO3-Lösung

und H2O gewaschen zu werden. Nach säulenchromatographischer Reinigung entstand Verbindung 17

in Form eines klaren Öls (Ausbeute: 61 %).

56 ALLGEMEINER TEIL

2.2.2.1.2 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 18b

Neben den für die Docking-Untersuchungen ausgewählten Verbindungen A und B sollte auch eine

Mischform der beiden Grundstrukturen hergestellt werden, um mögliche Struktur-Wirkungs-

beziehungen aufstellen zu können. Aus diesem Grund sollte der Esterrest von Zielverbindung B mit

dem Grundkörper von Zielverbindung A gekoppelt werden (siehe Abb. 46).

Abb. 46: Strukturformel von 1-(3-Methyl-2-oxopentanoyl)piperidin-2-carbonsäure-3-(3,4,5-trimethoxy-

phenyl)propylester

Zur Darstellung der Verbindung 18b wurde zuerst die Alkoholkomponente 16 aus der

entsprechenden Carbonsäure durch eine klassische Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid in

64 %iger Ausbeute hergestellt (siehe Abb. 47).76

Abb. 47: Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 16

Die Synthese von Verbindung 18b verlief, mit Ausnahme der eingesetzten Alkoholkomponente im

letzten Schritt, analog zu der von Verbindung 18a. Die Mischform 18b wurde in Form eines weißen

Öls in Ausbeuten von 37 % erhalten.

ALLGEMEINER TEIL 57

2.2.2.2 Allgemeine Synthesestrategie zur Darstellung der Zielverbindung B

2.2.2.2.1 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 22a

Im Gegensatz zu Zielverbindung A existiert in der Literatur keine allgemeine Vorschrift für die

Herstellung der Grundstruktur B. Aus diesem Grund wurde folgendes Schema entwickelt (siehe Abb.

48). Ausgangsstoff war auch in diesem Fall die racemische Pipecolinsäure, die, wie oben beschrieben

(siehe Kapitel 2.2.2.1.1), im ersten Reaktionsschritt zum Pipecolinsäureethylester 7a umgesetzt

wurde. Danach wurde der Piperidin-Stickstoff in einer SN2-artigen Reaktion mit

Benzylsulfonsäurechlorid in Gegenwart einer Hilfsbase amidiert. Dazu wurde Verbindung 7a in

Dioxan zunächst mit einem Überschuss an N,N-Diisopropylethylamin sowie nach 10 min mit

Benzylsulfonsäurechlorid umgesetzt. Eine quantitative Umsetzung konnte nach 4.5 h bei RT

beobachtet werden (DC-Kontrolle). Nach säulenchromatographischer Reinigung entstand

Verbindung 12a in Form eines gelben Öls (Ausbeute: 77 %).

Durch basische Esterhydrolyse mit LiOH entstand im Anschluss 1-(Benzylsulfonyl)piperidin-2-

carbonsäure 15a als gelbes Öl (Ausbeute: 92 %) und durch Steglich-Veresterung schließlich die

Zielstruktur 22a als gelbes Wachs (Ausbeute: 48 %). Die genauen Synthesevorschriften wurden

bereits in Kapitel 2.2.2.1.1 beschrieben.

Abb. 48: Syntheseweg zur Darstellung der Grundstruktur B

58 ALLGEMEINER TEIL

2.2.2.2.2 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 22b

Da die Docking-Studien eindeutig das S-Enantiomer (MI-1) von Grundstruktur B als optimalen

Bindungspartner der Mip-Bindetasche identifizierten, sollte dieses Enantiomer ebenfalls hergestellt

werden. Die Synthese wurde in Analogie zur Herstellung von Verbindung 22a durchgeführt. Als

Ausgangspunkt wurde in diesem Fall die enantiomerenreine, kommerziell erhältliche S-Pipecolin-

säure verwendet. Der erste Schritt lieferte Verbindung 7b als gelbes Öl mit einer Ausbeute von 91 %.

Die anschließende Amidierung mit N,N-Diisopropylethylamin als Hilfsbase zeigte im Fall des S-

Pipecolinsäureethylesters 7b jedoch auch nach mehreren Versuchen nicht die gewünschte Umsetzung

(DC- bzw. NMR-Kontrolle). Deshalb wurden sowohl das Lösungsmittel als auch die zugesetzte

Hilfsbase variiert. Bei Verwendung von Kaliumcarbonat und DMF konnte schließlich eine

quantitative Umsetzung nach 24 h bei RT erzielt (DC-Kontrolle) und Verbindung 12b in Form eines

gelben Öls mit einer Ausbeute von 63 % erhalten werden. Die anschließende basische Esterhydrolyse

sowie die Steglich-Veresterung lieferten die Zwischenstufe 15b als gelbes Öl in sehr guter Ausbeute

(99 %) sowie die Endstufe 22b in Form eines gelben Wachses (Ausbeute: 21 %).

2.2.2.2.3 Bestimmung der Enantiomerenreinheit von Verbindung 22b

Im Verlauf einer chemischen Reaktion mit reinen Enantiomeren chiraler Verbindungen kann es unter

bestimmten Bedingungen zu einer Racemisierung kommen. Auch im Fall der Herstellung des

enantiomerenreinen Sulfonsäureamid-Derivats 22b ist es möglich, dass eine solche Racemisierungs-

reaktion stattgefunden hat. Das Stereozentrum des Pipecolinsäure-Derivats 22b ist durch die

Aktivierung des Esters und der Amin-Funktion in α-Position so stark acidifiziert, dass durch

Deprotonierung und Reprotonierung eine Isomerisierung erfolgen kann. Diese Racemisierung könnte

an zwei verschiedenen Stellen während der beschriebenen Synthese eintreten: Zum einen bei der

Veresterung mit Thionylchlorid und zum anderen bei der basischen Esterhydrolyse mit LiOH.

Während eine Deprotonierung des aciden Protons bei der Aktivierung mit Thionylchlorid auf Grund

der fehlenden Base eher unwahrscheinlich ist,81

findet die Racemisierung mit hoher

Wahrscheinlichkeit im basischen Milieu während der Esterhydrolyse statt. Um diese Hypothese zu

überprüfen bzw. zu widerlegen, wurde daher die Enantiomerenreinheit von Verbindung 22b im

Arbeitskreis von Prof. Dr. Dr. Gerhard Bringmann von Claudia Steinert ermittelt.

Zur Bestimmung des Enantiomerenverhältnisses eignen sich neben spektrometrischen Methoden wie

der Polarimetrie oder elektrophoretischen Techniken wie der Kapillarelektrophorese, besonders

chromatographische Methoden wie die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Bei

letzterem gibt es drei verschiedene Trennprinzipien: 1. die Herstellung diastereomerer Derivate durch

Verwendung optisch aktiver enantiomerenreiner Reagenzien und anschließende achirale Trennung,

ALLGEMEINER TEIL 59

2. die chirale Trennung unter Verwendung optisch aktiver mobiler Phasen an achiralen stationären

Phasen und 3. die chirale Trennung unter Verwendung optisch inaktiver mobiler Phasen an chiralen

stationären Phasen. Im letzten Fall gehen die Enantiomere unterschiedlich starke diastereomere

Wechselwirkungen mit dem optisch aktiven Säulenmaterial ein und können somit auf Grund ihrer

unterschiedlichen Retentionszeiten getrennt werden.

Für die Bestimmung der Reinheit von Verbindung 22b wurde letzteres Verfahren gewählt. Als

chirale Säule wurde eine 0.5 µm „Lux-Cellulose-1”-Säule (250 mm × 4.6 mm; Phenomenex)

verwendet. Um das Enantiomerenverhältnis von Verbindung 22b bestimmen zu können, wurde

zunächst das Racemat 22a untersucht und eine geeignete Trennmethode entwickelt. Mit einem

isokratischen Lösungsmittelsystem, bestehend aus 5 % H2O (+ 0.05 % Trifluoressigsäure) und 95 %

MeOH (+ 0.05 % Trifluoressigsäure), konnte die beste Trennung des Racemats 22a erzielt werden,

weshalb diese Methode auch auf Verbindung 22b angewendet wurde.

A) B)

Abb. 49: Trennung des Racemats 22a (A) sowie des Enantiomers 22b (B) mittels chiraler HPLC

Das Chromatogramm des Racemats 22a zeigte, dass die Signalflächen der beiden Enantiomere

nahezu gleich sind, d.h. das R- und das S-Enantiomer liegen erwartungsgemäß in einem 1 : 1-

Verhältnis vor (siehe Abb. 49, A). Im Chromatogramm der enantiomerenreinen Verbindung 22b

sollte dagegen nur ein Signal zu sehen sein. Jedoch sind zwei Signale zu erkennen, von denen eines

deutlich schwächer erscheint (siehe Abb. 49, B). Dies bedeutet, dass während der Synthese, die von

einem enantiomerenreinen Edukt ausging, in geringem Maße (ca. 10 %) eine Racemisierung

stattgefunden haben muss.

mV mV

t [min] t [min]

60 ALLGEMEINER TEIL

2.2.2.3 Allgemeine Synthesestrategie zur Darstellung von Pipecolinsäure-Derivaten mit der

Grundstruktur B

Die Verbindungen 18a und 18b sowie die Verbindungen 22a und 22b wurden zur Bestätigung der

Docking-Ergebnisse zunächst in einem pharmakologischen Enzym-Assay (siehe Kapitel 3.1) auf ihre

potenzielle PPIase-Inhibition untersucht. Da die Resultate dieser pharmakologischen Testungen mit

den Ergebnissen der computergestützten Wirkstoffanalyse übereinstimmten, sollten anschließend

weitere Derivate mit der Grundstruktur B hergestellt werden (siehe Abb. 50).

Abb. 50: Grundstruktur der Pipecolinsäure-Derivate

Strukturelle Variationen sollten sowohl über die Ester-, als auch über die Sulfonsäureamid-

seitenkette in den Grundkörper eingeführt werden. Aus diesem Grund wurde zuerst der

Benzylsulfonsäurerest des Pipecolinsäureethylesters durch substituierte Benzylsulfonsäure- (m = 1),

substituierte sowie die unsubstituierte Phenylsulfonsäure- (m = 0) und diverse Benzylcarbonsäure-

Gruppen (m = 1) ersetzt. Diese verschiedenen Pipecolinsäureethylester wurden anschließend

willkürlich mit Alkoholkomponenten versetzt, die über einen Alkylspacer unterschiedlicher Länge an

ein aromatisches System gebunden waren. Durch die Einführung dieser verschiedenen Alkoholreste

sollte überprüft werden, welche Rolle der Abstand zwischen Piperidinring und aromatischem System

für eine Mip-Inhibition spielt.

Die Synthesen aller nachfolgenden Verbindungen verliefen nach demselben Schema wie die

Darstellung von Verbindung 22a (siehe Abb. 48 / Kapitel 2.2.2.2.1). Lediglich die Hilfsbasen,

Lösungsmittel oder die Reaktionsdauer variierten im zweiten Reaktionsschritt dieser Vorschrift

(siehe Experimenteller Teil). Nach der vierstufigen Synthese entstanden die Verbindungen 19-29

(siehe Tabelle 5, Tabelle 6 und Tabelle 7) in guten bis sehr guten Ausbeuten.

ALLGEMEINER TEIL 61

2.2.2.3.1 Syntheseweg zur Herstellung der Verbindungen 19-21

Bei der Herstellung der Carbonsäureamide 19-21 wurde im zweiten Reaktionsschritt als Hilfsbase

Kaliumcarbonat verwendet und eine vollständige Umsetzung in DMF nach 12 h bei RT beobachtet

(DC-Kontrolle).

11a (71 %) 11b (75 %) 11c (81 %)

-OH 14a (97 %) 14b (98 %) 14c (83 %)

n.d. 20a (75 %) n.d.

19a (60 %) 20b (33 %) n.d.

19b (55 %) n.d. 21a (68 %)

19c (82 %) 20c (63 %) n.d.

n.d. n.d. 21b (68 %)

n.d. n.d. 21c (51 %)

Tabelle 5: Synthetisierte Verbindungen 11a-11c, 14a-14c, 19a-19c, 20a-c, 21a-21c

n.d. = Synthese nicht durchgeführt

R1

R

2

62 ALLGEMEINER TEIL

2.2.2.3.2 Syntheseweg zur Herstellung der Verbindungen 22-29

Im Fall der Benzyl- bzw. Phenylsulfonsäureamide 22-29 wurden unterschiedliche Basen und

Lösungsmittel (siehe Experimenteller Teil) eingesetzt. Eine vollständige Umsetzung konnte je nach

Derivat nach mehreren Stunden bei RT beobachtet werden (DC-Kontrolle).

Synthetisierte Benzylsulfonsäureamide:

12a (77 %)

12b (S-Enantiomer) (63 %)

12c (50 %) 12d (46 %) 12e (17 %)

-OH 15a* (92 %)

15b (S-Enantiomer) (99 %)

15c (67 %) 15d (91 %) 15e (92 %)

22c (81 %) 23a (55 %) 24a (88 %) n.d.

n.d. n.d. n.d. 25 (69 %)

22a (48 %)

22b* (S-Enantiomer) (21 %)

n.d. n.d. n.d.

22e* (48 %) n.d. n.d. n.d.

22d (96 %) 23b (58 %) 24b (50 %) n.d.

Tabelle 6: Synthetisierte Verbindungen 12a-12e, 15a-15e, 22a-22e, 23a-23b, 24a-24b, 25

n.d. = Synthese nicht durchgeführt

R1

R2

ALLGEMEINER TEIL 63

Synthetisierte Phenylsulfonsäureamide:

12f* (92 %)

12g (S-Enantiomer) (79 %)

12h (97 %) 12i (76 %) 12j* (71 %)

-OH 15f* (98 %) 15h (92 %) 15i* (87 %) 15j* (99 %)

26b (8 %) n.d. n.d. n.d.

26f (9 %) 27a (97 %) n.d. n.d.

26e (22 %) 27b (97 %) n.d. n.d.

26g (76 %) n.d. n.d. n.d.

26h (83 %) 27d (81 %) 28 (55 %) 29 (22 %)

26i* (19 %) n.d. n.d. n.d.

26a (28 %) 27c (40 %) n.d. n.d.

26d* (16 %) n.d. n.d. n.d.

26c (23 %) 27e (70 %) n.d. n.d.

Tabelle 7: Synthetisierte Verbindungen 12f-12j, 15f-15j, 26a-26i, 27a-27e, 28, 29

n.d. = Synthese nicht durchgeführt

R1

R2

64 ALLGEMEINER TEIL

2.2.2.4 Derivatisierungen am Aromaten der Sulfonsäureamidgruppe

Ein weiteres Ergebnis der Docking-Studien der Grundstruktur B

war, dass sich innerhalb der Mip-Kavität eine kleine Seitentasche

befindet, die eventuell durch große Wasserstoffbrücken-ausbildende

Substituenten der Amidseitenkette der Pipecolinsäure-Sulfonamide

adressiert werden kann, und zwar durch einen Wasserstoff-Akzeptor

in meta-Position des Benzylrings (siehe Abb. 51). Zur Einführung

geeigneter Substituenten, sollten die bereits hergestellten meta-

Nitro-Derivate 12h, 27c und 27d zuerst zum primären aromatischen

Amin reduziert und anschließend diese Aminofunktionen mit

verschiedenen Wasserstoff-Akzeptoren funktionalisiert werden.

2.2.2.4.1 Syntheseweg zur Herstellung der Verbindungen 30a-30c

Die Reduktion von primären aromatischen Nitrogruppen mit Zinn(II)chlorid wurde bereits in Kapitel

2.1.2.2.2 beschrieben und daher in Analogie zur Synthese von 3-Amino-N,N-dimethylphenyl-

sulfonsäureamid 5 durchgeführt (siehe Abb. 52). Die Verbindungen 30a-30c wurden als braunes Öl

bzw. gelbe Wachse in sehr guten Ausbeuten erhalten (siehe Abb. 52).

Abb. 52: Syntheseweg zur Darstellung der Verbindungen 30a-30c

Abb. 51: Komplex von

Grundstruktur B in der Mip-

Kavität mit zusätzlich zu

adressierender Seitentasche58,63

ALLGEMEINER TEIL 65

2.2.2.4.2 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 33

Um die gewünschten Wasserstoff-Akzeptoren in meta-Position einzuführen, wurde zunächst

Verbindung 30a mit Dimethylcarbaminsäurechlorid gekoppelt (siehe Abb. 53). Die Umsetzung

erfolgte über eine SN2-artige Reaktion unter Säureabspaltung. Als Hilfsbase wurde Triethylamin

verwendet.

Abb. 53: Syntheseweg zur Darstellung von Verbindung 33

Zur Darstellung von Verbindung 31 wurde im ersten Schritt Dimethylcarbaminsäurechlorid in

CH2Cl2 auf 0 °C gekühlt und mit einem Überschuss an Triethylamin sowie nach 10 min mit

Verbindung 30a versetzt. Eine vollständige Umsetzung konnte nach 1 h bei 0 °C sowie weiteren 14 h

bei RT beobachtet werden (DC-Kontrolle). Der entstandene Niederschlag von Triethylamin

Hydrochlorid wurde abfiltriert und das Filtrat gewaschen. Nach säulenchromatographischer

Reinigung entstand Verbindung 31 in Form eines klaren Öls (Ausbeute: 23 %).

66 ALLGEMEINER TEIL

Diese Synthese sollte daraufhin auf die Verbindungen 30b und 30c übertragen werden. Jedoch zeigte

sich im Fall dieser „größeren“ Pipecolinsäureester 30b und 30c keine Umsetzung zum gewünschten

Endprodukt, so dass der Pipecolinsäureethylester 31 zunächst mit LiOH basisch zu seiner

entsprechenden Carbonsäure 32 hydrolysiert wurde (Ausbeute: 97 %). Anschließend lieferte die

Steglich-Veresterung von Verbindung 32 mit 3-(Pyridin-3-yl)propan-1-ol das gewünschte End-

produkt 33 als weißes Öl in einer Ausbeute von 97 %.

2.2.2.4.3 Syntheseweg zur Herstellung der Verbindungen 37a und 37b

Herstellung der Verbindungen 34a-34c

Eine weitere Strategie zur Einführung von Wasserstoff-Akzeptoren in meta-Position des Benzylrings

war die Einführung von diversen Aminosäuren. Um ein primäres aromatisches Amin mit einer

Aminosäure ohne unerwünschte Nebenreaktionen zum Amid umzusetzen, muss die NH2-Gruppe der

Aminosäure zuvor chemisch geschützt werden. In der Peptidsynthese werden zu diesem Zweck

gewöhnlich Säureanhydride, wie z.B. Di-tert-butyldicarbonat (BOC) bzw. Säurechloride, wie z.B. 9-

Fluorenylmethoxycarbonylchlorid (FMOC) verwendet. Diese bilden mit der Aminofunktion über

eine SN2-artige Reaktion Carbamate, die sich leicht unter Bildung von Kohlendioxid wieder spalten

lassen. Im Rahmen dieser Arbeit sollten 4-Aminobuttersäure, 3-Aminopropionsäure und Glycin mit

der BOC-Gruppe nach dem oberen Syntheseschema (siehe Abb. 54) geschützt werden.

Abb. 54: Syntheseweg zur Darstellung der Verbindungen 34a-34c

Die Einführung der Schutzgruppe wurde nach der Vorschrift von Ponnusamy et al. durchgeführt.82

Dazu wurde die jeweilige Aminosäure in Methanol mit einer methanolischen Triethylamin-Lösung

10 min unter Rückfluss erhitzt. Anschließend wurde das Schutzgruppen-Reagenz (BOC)2O

ALLGEMEINER TEIL 67

zugegeben und solange unter Rückfluss erhitzt, bis sich alle Bestandteile komplett gelöst hatten.

Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wurde der ölige Rückstand in verdünnter Salzsäure

(pH 2) bei 0 °C gelöst, 10 min gerührt und anschließend diese wässrige Phase mehrfach mit

Essigsäureethylester extrahiert. Die Verbindungen 34a und 34b entstanden als klare Öle in guten bis

sehr guten Ausbeuten (siehe Abb. 55). Bei dieser Reaktion konnten lediglich die geschützte 3-

Aminopropionsäure 34a sowie die geschützte 4-Aminobuttersäure 34b isoliert werden, im Fall von

Glycin war keine Umsetzung mit (BOC)2O zu erkennen (DC- bzw. NMR-Kontrolle).

Abb. 55: Synthetisierte Verbindungen 34a-34b

Aus diesem Grund wurde eine neue Synthesestrategie eingeschlagen. Die Umsetzung von Glycin mit

(BOC)2O erfolgte in einer Synthesemikrowelle. Dazu wurde die Aminosäure in H2O mit einem

kleinen Überschuss an NaOH-Plätzchen sowie einer Lösung von (BOC)2O in THF versetzt. Eine

quantitative Umsetzung konnte nach 80 min bei 70 °C beobachtet werden (DC-Kontrolle).

Anschließend wurde verdünnte Salzsäure bis pH 2.5 zugegeben, weitere 30 min bei RT gerührt und

danach mehrfach mit CHCl3 extrahiert. Nach Umkristallisation aus Cyclohexan wurde Verbindung

34c als weißer Feststoff in Ausbeuten von 74 % erhalten.

Herstellung der Verbindungen 37a und 37b

Die geschützten Aminosäuren 34 sollten im nächsten Schritt in einer Amidierungsreaktion mit dem

primären aromatischen Amin (Verbindungen 30) gekoppelt werden. Als Methode wurde eine

Umsetzung mit den Reagenzien DCC und N-Hydroxysuccinimid gewählt.83

Dabei wird die

Carbonsäure zuerst durch DCC aktiviert und anschließend ein sogenannter Aktivester mit N-

Hydroxysuccinimid gebildet. Der Mechanismus dieser Reaktion ist analog zu dem der Steglich-

Veresterung. Durch die Bildung des Aktivesters steigt die Reaktivität der Carbonsäure, so dass diese

anschließend zum Amid umgesetzt werden kann (siehe Abb. 56).

68 ALLGEMEINER TEIL

Abb. 56: Syntheseweg zur Darstellung der Verbindungen 37a-37b

Die Synthese wurde nach der Vorschrift von Schiller durchgeführt.83

Die jeweilige BOC-geschützte

Aminosäure 34, sowie die Reagenzien DCC und N-Hydroxysuccinimid wurden in CH2Cl2 2 h bei RT

umgesetzt. Danach wurde eine Lösung des primären aromatischen Amins 30 in CH2Cl2 zugegeben.

Eine quantitative Umsetzung konnte nach weiteren 8 h bei RT beobachtet werden (DC-Kontrolle).

Anschließend wurde der entstandene Niederschlag abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum

entfernt. Der ölige Rückstand wurde in Essigsäureethylester suspendiert und der erneut auftretende

Niederschlag wieder abfiltriert. Dieser Vorgang des Fällens und Filtrierens wurde sooft wiederholt,

bis der komplette Dicyclohexylharnstoff entfernt war. Nach säulenchromatographischer Reinigung

wurden die Verbindungen 35a und 35b als braune Öle erhalten (Ausbeute: 35a (78 %) und 35b

(21 %)). Diese Kopplungsreaktion wurde mit allen primären aromatischen Aminen 30a-30c sowie

allen BOC-geschützten Aminosäuren 34a-34c durchgeführt. Lediglich von dem Pipecolinsäure-

ethylester 30a konnten auch nach mehreren Versuchen nur die Kopplungsprodukte 35 mit Glycin

und 3-Aminobuttersäure isoliert werden (DC- bzw. NMR-Kontrolle).

Da die gewünschten Zielverbindungen jedoch einen größeren Esterrest als die Ethylgruppe der

Verbindungen 35 beinhalten sollten, wurde der Ethylrest anschließend durch einen großen, sterisch

anspruchsvollen Alkohol ersetzt. Dazu wurden die beiden Pipecolinsäureethylester 35a und 35b mit

ALLGEMEINER TEIL 69

LiOH basisch zu den Carbonsäuren 36a und 36b hydrolysiert, wobei die Verbindungen als weiße bis

braune Wachse in sehr guten Ausbeuten anfielen (36a: 89 % und 36b: 80 %). Durch die

anschließende Steglich-Veresterung mit 3-(Pyridin-3-yl)propan-1-ol wurden die gewünschten

Endprodukte 37a und 37b als weißes Öl bzw. Wachs (Ausbeute: siehe Abb. 57) erhalten.

Abb. 57: Synthetisierte Verbindungen 37a-37b

2.2.2.5 Variationen des Grundgerüsts der Zielverbindungen

Um die Notwendigkeit der Pipecolinsäure-Esterfunktion für eine Bindung in die Mip-Kavität zu

überprüfen, sollte diese gegen eine Amidfunktion ausgetauscht werden (siehe Kapitel 2.2.2.5.1). Des

Weiteren sollte auch der Cyclohexylcharakter des Pipecolinsäure-Grundgerüsts bzgl. der Mip-

Inhibition näher untersucht werden. Dafür sollte der komplette Piperidinring durch eine offenkettige

Form (siehe Kapitel 2.2.2.5.2) und einen Pyrrolidinring (siehe Kapitel 2.2.2.5.3) ersetzt werden.

2.2.2.5.1 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 38

Zur Einführung der Amidfunktion wurde im letzten Schritt der bereits bekannten vierstufigen

Synthese der Pipecolinsäure-Derivate der raumeinnehmende Alkohol durch ein strukturell ähnliches

Amin ersetzt. Um die Pipecolinsäure 15f mit dem primären Amin umzusetzen, wurde die Aktivester-

Methode mit den Reagenzien DCC und N-Hydroxysuccinimid gewählt (siehe Abb. 58). Die

Synthese verlief analog zur Darstellung der Verbindungen 35a und 35b (siehe Kapitel 2.2.2.4.3).

Verbindung 38 wurde in Form eines braunen Öls in Ausbeuten von 70 % erhalten.

70 ALLGEMEINER TEIL

Abb. 58: Syntheseweg zur Darstellung von Verbindung 38

2.2.2.5.2 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 42

Zur Darstellung der offenkettigen Variante wurde die Aminosäure Isoleucin ausgewählt. Die

Synthese wurde analog zur Darstellung von Verbindung 18a durchgeführt (siehe Kapitel 2.2.2.1.1 /

Abb. 59). Die Estersynthese mit Thionylchlorid als Aktivierungsreagenz und Ethanol lieferte

Verbindung 39 als braunes Öl (Ausbeute: 73 %). Durch die anschließende Amidierung des primären

Amins wurde Verbindung 40 in Form eines braunen Öls erhalten (Ausbeute: 77 %). Danach wurde

der Ethylester 40 basisch zur Carbonsäure 41 hydrolysiert und anschießend mit einem „größeren“

Alkohol zu Verbindung 42 umgesetzt. Während die Zwischenstufe 41 als gelbes Öl in sehr guter

Ausbeute (87%) erhalten wurde, fiel das Endprodukt 42 als gelbes Wachs in Ausbeuten von 13 % an.

Abb. 59: Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 42

ALLGEMEINER TEIL 71

2.2.2.5.3 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 44

Nach einem zur Darstellung von Verbindung 42 identischen Syntheseschema sollte auch das

Pyrrolidincarbonsäure-Derivat 44 hergestellt werden (siehe Abb. 60). Anstelle von Isoleucin wurde

dafür die Aminosäure Prolin verwendet. Die Veresterung lieferte den Prolinethylester 43 als klares

Öl in einer Ausbeute von 73 %, so dass das Amin anschließend direkt mit 3-Methyl-2-

oxopentansäure gekoppelt werden konnte. Verbindung 44 wurde als gelbes Öl in sehr niedrigen

Ausbeuten (2 %) erhalten. Da die Ausbeute auch durch diverse Modifikationen nicht gesteigert

werden konnte, wurde die Synthese an dieser Stelle abgebrochen.

Abb. 60: Syntheseweg zur Darstellung von Verbindung 44

2.2.3 Diskussion des 1H-NMR-Spektrums von Verbindung 22a

An dieser Stelle soll stellvertretend für alle hergestellten Pipecolinsäure-Derivate das 1H-NMR-

Spektrum von Verbindung 22a besprochen werden. Um die Auswirkungen der Einführung der

Sulfonsäureamidseitenkette sowie der Estergruppe auf den Piperidinring NMR-spektroskopisch

interpretieren zu können, bietet es sich an, zunächst die Spektren der Vorstufen 7a und 12a näher zu

betrachten.

72 ALLGEMEINER TEIL

Abb. 61: 1H-NMR-Spektrum des Pipecolinsäureethylesters 7a (gemessen in CDCl3)

Der Pipecolinsäureethylester 7a, gemessen in CDCl3, lässt sich folgendermaßen charakterisieren

(siehe Abb. 61): Die Ethylesterprotonen -CH2CH3 sind als Triplett bzw. Quartett erwartungsgemäß

bei δ = 1.15 ppm und δ = 4.05 ppm zu finden. Der Piperidinring der Pipecolinsäure-Derivate liegt in

Sesselkonformation vor. Auf Grund ihrer unterschiedlichen räumlichen Anordnung können die

Piperidinprotonen daher in axiale und äquatoriale Kerne differenziert werden, die durch

zweidimensionale 1H-NMR-Experimente (COSY; HMQC; HMBC) eindeutig zugeordnet werden

konnten. H1 ist auf Grund der direkten Nachbarschaft zur Esterfunktion und zum sekundären Amin

am stärksten Tieffeld-verschoben und erscheint als Dublett vom Dublett bei δ = 3.22 ppm mit den

Kopplungskonstanten 3Jaa = 9.8 Hz und

3Jae = 3.0 Hz, was für eine äquatoriale Stellung des Esters

spricht. Die direkte Nachbarschaft des Stickstoffs bedingt des Weiteren die Tieffeld-Verschiebung

der beiden Protonen H5, die bei δ = 3.01-2.92 ppm und δ = 2.58-2.49 ppm zu finden sind. Die

Protonen H2 werden nur noch geringfügig vom Anisotropie-Effekt der Esterfunktion beeinflusst und

sind jeweils als Multiplett im Bereich von δ = 1.88-1.80 ppm und δ = 1.70-1.63 ppm zu finden. Die

Protonen der Methylengruppen H3 und H4 fallen in einem breiten Multiplett zusammen (δ = 1.49-

1.28 ppm) und konnten deshalb nicht eindeutig zugeordnet werden. Das Proton der sekundären

Aminogruppe erscheint in diesem Spektrum als breites Signal bei einer chemischen Verschiebung

von δ = 2.07 ppm.

-CH2-CH3

H5 H1

NH

H3/4 H2

4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm

-CH2-CH3

ALLGEMEINER TEIL 73

Abb. 62: 1H-NMR-Spektrum des Pipecolinsäureethylesters 12a (gemessen in CDCl3)

In Verbindung 12a wurde der sekundäre Stickstoff des Piperidinrings mit einem Benzyl-

sulfonylsubstituenten verknüpft (siehe Abb. 62). Dieser sterisch anspruchsvolle Substituent bedingt

in der Esterseitenkette die Entstehung einer Rotationsbarriere, so dass der Ethylrest nicht mehr frei

rotieren kann. Die beiden, dem Ester benachbarten Protonen der Methylengruppe -CH2-CH3 verlieren

dadurch ihre chemische Äquivalenz und sind in der Lage, auch untereinander zu koppeln. Sie

erscheinen im Spektrum daher auch nicht, wie in Verbindung 7a, als scharfes Quartett, sondern

vielmehr als ein Oktett. Die eingeführte Sulfonsäuregruppe wirkt sich des Weiteren auch teilweise

auf die Verschiebung der einzelnen Protonen des Piperidinrings aus. Während die Signale der

Protonen H2-4, kaum verschoben, als Multiplett bei δ= 2.22-2.11 ppm, δ = 1.72-1.54 ppm und

δ = 1.51-1.38 ppm auftreten, sind die Protonen H1 und H5 durch den entschirmenden Effekt des

benachbarten Sulfonsäureamids weiter Tieffeld-verschoben zu finden. Das Proton H1 ist um 1.4 ppm

am stärksten verschoben und erscheint bei δ = 4.57 ppm als Dublett mit einer Kopplungskonstanten

von 3J = 4.0 Hz. Die Protonen H5 sind im Vergleich zu Verbindung 7a um ca. 0.5 ppm Tieffeld-

verschoben und als Multiplett im Bereich von δ = 3.50-3.41 ppm sowie als Dublett vom Triplett bei

δ = 3.15 ppm zu erkennen. Die Kopplungskonstante 2J = 12.8 Hz lässt auf eine geminale, die von

3J = 3.1 Hz auf eine vicinale Kopplung der Protonen schließen. Die Methylengruppe der

Sulfonseitenkette ist auf Grund des Anisotropie-Effekts der benachbarten Sulfongruppe und des

Phenylrings Tieffeld-verschoben und erscheint als scharfes Singulett bei δ = 4.2 ppm. Die

H1

H2 H5

H2/3/4

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm

1.8 1.6 1.4 1.2 ppm

7.5 7.3 ppm

4.3 4.2 ppm

74 ALLGEMEINER TEIL

aromatischen Protonen fallen trotz der Symmetrie zu Multipletts bei δ = 7.40-7.35 ppm und δ = 7.31-

7.24 ppm zusammen.

Abb. 63: 1H-NMR-Spektrum des Pipecolinsäureethylesters 22a (gemessen in CDCl3)

In Zielverbindung 22a wurde der Ethylrest der Esterseitenkette durch eine 3-(3,4,5-Trimethoxy-

phenyl)propylgruppe ersetzt (siehe Abb. 63). Diese große Esterkomponente hat auf Grund des

räumlichen Abstands jedoch keinen größeren Einfluss auf die chemische Verschiebung der einzelnen

Protonen des Piperidinrings, was ihre Einführung in das Molekül belegt. Der oben beschriebene

Effekt der Rotationsbarriere ist auch im Spektrum dieser Verbindung deutlich zu erkennen. Die

Methylengruppe Hi erscheint daher nicht als Triplett, sondern als Sextett und ist auf Grund der

Nachbarschaft zum Ester Tieffeld-verschoben. Ebenfalls, jedoch in geringfügigerem Maße Tieffeld-

verschoben wird die Methylengruppe Hiii bei δ = 2.66 ppm erwartungsgemäß als Triplett mit einer

Kopplungskonstanten von 3J = 7.5 Hz sichtbar. Grund hierfür ist der Anisotropie-Effekt des

benachbarten Aromaten. Die Protonen Hii werden kaum durch die beiden entschirmenden Funktionen

beeinflusst und bilden ein Multiplett im Bereich von δ = 2.03-1.95 ppm. Die beiden aromatischen

Protonen fallen aus symmetrischen Gründen zu einem scharfen Singulett bei δ = 6.41 ppm

zusammen. Dasselbe ist auch für die Protonen der aromatischen Methoxygruppen zu beobachten. Sie

bilden Singuletts bei δ = 3.84 ppm und δ = 3.82 ppm. Die exakten NMR-Daten zu allen

Pipecolinsäure-Derivaten sind im experimentellen Teil dieser Arbeit zu finden.

2.65 ppm

2.0 ppm

4.2 ppm 4.3

Hi

Hiii

Hii

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm

ALLGEMEINER TEIL 75

2.3 Weitere neu-„designte” Derivate

Das Pharmakophor-basierte, virtuelle Screening lieferte neben den niedermolekularen Sulfonsäure-

amiden und den Pipecolinsäure-Derivaten weitere Verbindungen, die auf Grund ihrer molekularen

Eigenschaften mit den Aminosäuren der Mip-Bindetasche wechselwirken sollten. Dazu gehörten: 2-

(4-Isopropylphenoxy)essigsäuremorpholinamid, 5-Methyl-2-phenyl-1H-pyrazol-3(2H)-on sowie 2-

Amino-4-(methylsulfinyl)buttersäureethylester.

2.3.1 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 46

2-(4-Isopropylphenoxy)essigsäuremorpholinamid 46 sollte über eine zweistufige Synthese hergestellt

werden (siehe Abb. 64). Im ersten Schritt sollte p-Isopropylphenol in Form einer klassischen

Ethersynthese zu 2-(4-Isopropylphenoxy)essigsäure 45 umgesetzt und im zweiten Schritt die

entstandene Carbonsäure 45 mit Morpholin zum Endprodukt 46 amidiert werden.

Abb. 64: Syntheseweg zur Darstellung von Verbindung 46

Zur Synthese von Verbindung 45 wurde p-Isopropylphenol in methanolischer Natronlauge auf 80 °C

erhitzt und anschließend mit Chloressigsäure versetzt. Eine quantitative Umsetzung wurde nach 2 h

bei 80 °C und weiteren 12 h bei RT beobachtet (DC-Kontrolle). Danach wurden H2O und verdünnte

Salzsäure bis pH 2 zugegeben und anschließend die entstandene freie Säure mit Essigsäureethylester

extrahiert. Verbindung 45 wurde in Form eines braunen Öls in sehr guten Ausbeuten von 98 %

erhalten.

Für die Amidierung musste im nächsten Schritt die Säure 45 zuerst aktiviert werden. Hierzu sollte

mit den Reagenzien 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) und 1-Hydroxy-

benzotriazol (HOBt) ein Aktivester hergestellt werden. Der Mechanismus kann mit der oben

76 ALLGEMEINER TEIL

beschriebenen Steglich-Veresterung gleichgesetzt werden; EDC entspricht hierbei DCC und HOBt

der alkoholischen Komponente.

Zur Darstellung von Verbindung 46 wurden ein Äquivalent Verbindung 45, 1.2 Äquivalente EDC

und HOBt sowie 3 Äquivalente Triethylamin in abs. DMF gelöst und 30 min bei RT gerührt. Danach

wurde ein Äquivalent Morpholin zugegeben und weitere 12 h bei RT gerührt. Der Reaktionsverlauf

wurde dünnschichtchromatographisch verfolgt (DC-Kontrolle: Kieselgel; Hexan : EtOAc = 7 : 3),

zeigte aber eine Vielzahl an Produkten. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum und der

säulenchromatographischen Reinigung (Kieselgel; Hexan : EtOAc = 7 : 3) konnte lediglich das

Edukt isoliert werden (DC- bzw. NMR-Kontrolle).

Als weitere Synthesestrategie wurde daher nach einer Vorschrift von Holzgrabe und Heller ein

Äquivalent Verbindung 45 in abs. THF gelöst und 1.1 Äquivalente Pyridin, 1.05 Äquivalente

(BOC)2O sowie 0.05 Äquivalente DMAP zugegeben.84

Anschließend wurde 30 min bei RT gerührt,

danach ein Äquivalent Morpholin zugegeben und weitere 48 h bei RT gerührt. Der Reaktionsverlauf

wurde dünnschichtchromatographisch verfolgt (DC-Kontrolle: Kieselgel; Cyclohexan : EtOAc =

7 : 3), zeigte aber auch in diesem Fall eine Vielzahl an Produkten. Nach Entfernen des

Lösungsmittels im Vakuum und der säulenchromatographischen Reinigung (Kieselgel; Cyclohexan :

EtOAc = 7 : 3) konnte wiederum lediglich das Edukt isoliert werden (DC- bzw. NMR-Kontrolle).

Nach einer Vorschrift von Burkhart et al. wurde anschließend eine Kopplungsvariante mit den

Reagenzien N-Methylmorpholin und n-Propylphosphonsäureanhydrid verwendet.85

Dafür wurde

Verbindung 45 in DMF mit Morpholin, Überschüssen an N-Methylmorpholin sowie n-Propyl-

phosphonsäureanhydrid versetzt und der Reaktionsverlauf dünnschichtchromatographisch verfolgt.

Da nach 48 h keine Umsetzung sichtbar war, wurde ein weiterer Überschuss an n-

Propylphosphonsäureanhydrid zugeben. Dieser Vorgang wurde nach 7 d, da immer noch keine

Umsetzung zu erkennen war, noch einmal wiederholt. Nach weiteren 7 d wurde das Lösungsmittel

im Vakuum entfernt und nach säulenchromatographischer Reinigung Verbindung 46 in Form eines

braunen Öls isoliert (Ausbeute: 36 %).

2.3.2 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 47

5-Methyl-2-phenyl-1H-pyrazol-3(2H)-on war ein weiteres Ergebnis der computergestützten Wirk-

stofffindung. Pyrazole sind in der heutigen Medizin weit verbreitet und werden hauptsächlich als

nicht-steroidale Antiphlogistika verwendet. Bereits 1883 gelang es dem Chemiker Ludwig Knorr 1,5-

Dimethyl-2-phenyl-1H-pyrazol-3(2H)-on (Phenazon) chemisch herzustellen.86

Die damals

beschriebene Synthese konnte bis heute mehrfach verbessert und weiterentwickelt werden. Der

Mechanismus einer Pyrazol-Synthese verläuft meistens über die 1,3-Cyclisierung von Acetessig-

ALLGEMEINER TEIL 77

säureethylester mit Hydrazin-Derivaten. Der Acetessigsäureethylester kann sowohl in seiner Keto-

als auch Enolform vorliegen. In Anwesenheit eines starken Nukleophils kann dieses - in diesem Fall

handelt es sich um das primäre Amin des Hydrazin-Derivats - am elektrophilen C-Atom des Enols

angreifen, wobei unter Wasserabspaltung zunächst ein Enamin entsteht. Im nächsten Schritt greift

das zweite nukleophile Amin des Hydrazins intramolekular das elektrophile Carbonyl-C-Atom an

und unter Abspaltung von Ethanol entsteht das gewünschte Pyrazol (siehe Abb. 65).

In dieser Arbeit wurde die Synthese des Pyrazols 47 nach einer Vorschrift von Lehmann et al.

durchgeführt.87

Dazu wurde Acetessigsäureethylester in Ethanol mit Phenylhydrazin 3 h zum

Rückfluss erhitzt und anschließend 12 h bei RT stehen gelassen, bis eine quantitative Umsetzung

beobachtet werden konnte (DC-Kontrolle). Nach Umkristallisieren aus n-Pentan wurde Verbindung

47 in Form eines gelben Pulvers erhalten (Ausbeute: 65 %).

Abb. 65: Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 47

2.3.3 Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 48

Zur Synthese von 2-Amino-4-(methylsulfinyl)buttersäureethylester 48 wurde die entsprechende

Säure in Form einer klassischen Veresterung mit Thionylchlorid als Aktivierungsreagenz und

Ethanol umgesetzt (siehe Abb. 66). Die Zielverbindung 48 fiel dabei als gelbes Öl in Ausbeuten von

35 % an.

Abb. 66: Syntheseweg zur Herstellung von Verbindung 48

78 ALLGEMEINER TEIL

ALLGEMEINER TEIL 79

3 PHARMAKOLOGISCHE TESTUNGEN UND ERGEBNISSE

3.1 In-vitro-Testsystem

Das Oberflächenprotein Mip stellt, wie in Kapitel 1.1.3.2 beschrieben, einen Hauptvirulenzfaktor von

L. pneumophila dar. Seine C-Domäne weist eine enzymatische PPIase-Aktivität auf, die durch

Pipecolinsäure-Derivate inhibiert werden kann. Diese Enzymhemmung kann durch den IC50-Wert

(IC50 = mittlere inhibitorische Konzentration) beschrieben werden, für dessen Bestimmung sich der

bereits 1984 entwickelte Protease-gekoppelte Enzymassay eignet.53

Die dazu notwendigen

biologischen Vorarbeiten sowie die pharmakologische Testung der synthetisierten Verbindungen

erfolgten hauptsächlich in der Forschungsgruppe von Dr. Matthias Weiwad am Max-Planck-Institut

für Enzymologie der Proteinfaltung in Halle.

3.1.1 Expression von Mip

3.1.1.1 Klonierung und Transformation

Für eine optimale Expression des Lp-Mip-Gens erwiesen sich in früheren Studien Escherichia coli

K-12-Bakterienstämme als besonders geeignet.88

Vor der Expression in E. coli musste die

gewünschte DNA-Sequenz zunächst aus L. pneumophila isoliert und anschließend in einen

geeigneten Vektor kloniert werden. Zu diesem Zweck wurde eine früher angelegte Genbibliothek des

L. pneumophila-Stamms Philadelphia I88,89

durchsucht, wobei 21 rekombinante Klone identifiziert

wurden, die für verschiedene Proteine mit einer Masse von 24 kDa codierten. Alle Klone wurden mit

Hilfe der Cosmid-Klonierungstechnik in E. coli-K-12-Bakterienstämme transformiert und

anschließend auf ihre exprimierten Proteine untersucht. Da der E. coli-K-12-Stamm HB101 eine

Expression des gewünschten Mips zeigte, wurde er für die weitere Kultivierung verwendet.28

Diese Klonierungs- bzw. Transformationsarbeiten waren bereits abgeschlossen, so dass die

praktische Durchführung in dieser Arbeit mit der Anzucht der Bakterien startete (siehe Kapitel 6.3.3).

3.1.1.2 Anzucht von E. coli-Bakterien

Für die Kultivierung des E. coli-K-12-Stamms HB101 wurde das für dieses Bakterium am häufigsten

eingesetzte LB-Nährmedium („lysogeny broth“) verwendet, da es alle essenziellen Bestandteile, die

80 ALLGEMEINER TEIL

für ein optimales Wachstum von E. coli von Bedeutung sind, enthält. Zur Herstellung des Mediums

wurden ein Gemisch aus verschiedenen Peptiden und Aminosäuren (Pepton), Hefeextrakt und

Natriumchlorid in dem. H2O gelöst, auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Zur Überprüfung des

optimalen Wachstums der Bakterien wurde aus dem LB-Medium eine Probe entnommen und mit

Ampicillin (100 µg/ml) versetzt. Der klonierte Vektor enthält neben dem Mip-Gen ein zusätzliches

Ampicillin-Resistenzgen; somit können in Anwesenheit des Antibiotikums selektiv nur diejenigen

Bakterien überleben, die dieses Resistenzgen enthalten - d.h. alle anderen, v.a. diejenigen, die bei der

Expression stören könnten, sterben ab. Des Weiteren wurde die Probe mit einer klonierten E. coli-K-

12-HB101-Kultur versetzt und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Zeigte diese sogenannte Vorkultur

nach 12 h ausreichend Bakterienwachstum, wurde sie zusammen mit Ampicillin (100 µg/ml) in eine

größere Menge LB-Medium überführt und weitere 24 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden

die gewachsenen Zellen mittels Zentrifugation pelletiert, der flüssige Überstand verworfen und die

Zellpellets für die nachfolgende mechanische Lyse auf Eis abgekühlt.

3.1.1.3 Zellaufschluss mittels mechanischer Lyse

Die vorbereiteten Zellpellets wurden unter Eiskühlung in 2 mM Trizin-Puffer (N-Tris-

(hydroxymethyl)methylglycin) pH 8.5 gelöst und anschließend zu dieser Zellsuspension

verschiedene Protease-Inhibitoren (siehe Kapitel 6.3.4) gegeben, um während der Lyse einen

unerwünschten Proteinabbau durch anwesende Proteasen zu verhindern. Nach Überführung der

Suspension in den Stahlzylinder der hydraulischen Zellaufschluss (French-press)-Anlage wurden die

Bakterienzellen unter Druck aufgeschlossen und das dabei anfallende Lysat ultrazentrifugiert. Die

entstandenen Zellpellets wurden für die folgende Reinigung gesammelt und das Lysat verworfen.

3.1.1.4 Reinigung von Mip

Bei der anschließenden Proteinaufreinigung wurden als Elutionsmittel der bereits hergestellte Trizin-

Puffer und eine 35 %ige wässrige Ammoniumsulfat-Lösung verwendet. Der gesamte Reinigungs-

prozess beinhaltete vier hintereinandergeschaltete chromatographische Trennschritte und wurde bei

einer Temperatur von 4 °C durchgeführt.

Im ersten Schritt wurden die Zellpellets der Ultrazentrifugation in Trizin-Puffer suspendiert und nach

Überprüfung des pH-Werts auf eine mit diesem Puffer equilibrierte Diethylaminoethyl (DEAE)-

Säule (Fractogel®) aufgetragen. Bei dieser Trennmethode handelt es sich um das Prinzip der

schwachen Anionenaustausch-Chromatographie. Dabei geht Mip im Gegensatz zu den ebenfalls

ALLGEMEINER TEIL 81

anwesenden E. coli-PPIasen keine Wechselwirkungen mit dem Säulenmaterial ein. Aus diesem

Grund konnte Mip direkt mit Trizin-Puffer von der Säule eluiert und somit von den störenden

PPIasen abgetrennt werden. Das Eluat wurde dann auf eine mit Trizin-Puffer equilibrierte

Trimethylammoniumethyl (TMAE)-Säule (Fractogel®) gegeben und, da Mip im Verlauf dieser

starken Anionenaustausch-Chromatographie wiederum keine Wechselwirkungen mit dem

Säulenmaterial eingeht, mit Trizin-Puffer direkt von der Säule eluiert. Das hierbei erhaltene Eluat

wurde danach auf eine mit Trizin-Puffer equilibrierte Affigel-Blue-Säule aufgetragen. Bei dieser

Affinitätschromatographie wird als Säulenmaterial ein quervernetztes Agarosegel, an das der

Farbstoff Cibacron® Blue F3GA kovalent gebunden ist, verwendet.

90 Auf Grund der

Wechselwirkungen des Proteins mit dem Säulenmaterial wurde das gebundene Mip zunächst mit

Trizin-Puffer gewaschen und anschließend mit Hilfe eines KCl-Gradienten (0-2 M) in einzelnen

Fraktionen von der Säule eluiert. Diese Fraktionen wurden mittels Natriumdodecylsulfat-

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) auf die Anwesenheit von Mip untersucht. Dabei

wurden Polyacrylamid-Gele mit 15-17.5 % Acrylamid verwendet. Von allen Fraktionen sowie dem

ersten Durchlauf der dritten Säule wurden Aliquote entnommen, in SDS-haltigem Probenpuffer

pH 6.8 gelöst und mit dem Farbstoff Bromphenolblau versetzt, um anschließend das Ende des

Elektrophoreselaufs besser indizieren zu können. Für die eindeutige Identifizierung von Mip wurde

ein Protein-Größenmarker („Pageruler Protein Ladder”) - ebenfalls mit Bromphenolblau versetzt -

verwendet. Dieser Marker besteht aus Proteinen verschiedener Größe und ermöglicht nach der

Elektrophorese die eindeutige Zuordnung des gereinigten Mips. Nach der Elektrophorese wurde das

Trenngel mit dem Triphenylmethanfarbstoff Coomassie-Brilliant-Blue, behandelt, wobei die

einzelnen Proteinbestandteile - durch unspezifische Wechselwirkungen zwischen Farbstoff und

Protein - sichtbar gemacht wurden. Nach vollständiger Färbung wurde das Trenngel mit Hilfe einer

Entfärbelösung wieder entfärbt; die Proteine blieben dabei jedoch gefärbt. Durch einen Vergleich der

Banden der einzelnen Untersuchungslösungen mit denen des Proteinmarkers konnten diejenigen

Fraktionen, die Mip enthielten, identifiziert werden (siehe Abb. 67, links).

Abb. 67: SDS-PAGE-Trenngel nach der Affigel-Blue-Säule (M = Proteinmarker, D = Durchlauf; links); SDS-

PAGE-Trenngel nach der Propyl-Säule (M = Proteinmarker; rechts)

82 ALLGEMEINER TEIL

Die Mip-enthaltenen Fraktionen wurden daraufhin vereinigt, in Ammoniumsulfat-Lösung suspendiert

und einem weiteren chromatographischen Reinigungsschritt unterzogen. Dazu wurde die

Proteinsuspension auf eine mit Trizin-Puffer und Ammoniumsulfat-Lösung equilibrierte Propyl-Säule

aufgetragen und nach dem Prinzip der hydrophoben Interaktionschromatographie mit einem

Ammoniumsulfat-Gradienten (0-35 %) in Fraktionen eluiert. Im Anschluss wurden die einzelnen

Untersuchungslösungen wiederum mittels SDS-PAGE-Elektrophorese (siehe oben) analysiert (siehe

Abb. 67, rechts). Alle Fraktionen, die reines Mip enthielten, wurden vereinigt und für die Dialyse

vorbereitet.

Im letzten Schritt der Reinigung von Mip wurden mittels Dialyse enthaltene Fremdionen, z.B.

Ammoniumsulfat, durch Diffusionsprozesse aus der Proteinlösung entfernt. Die Dialyse erfolgte unter

Verwendung von HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethansulfonsäure)-Puffer pH 7.8 und

einem dünnwandigen Dialyseschlauch für 12 h Stunden. Während der Dialyse wandern nur Ionen und

kleine Moleküle durch die semipermeable Membran des Dialyseschlauchs in Richtung des

Konzentrationsgefälles; die größeren Proteine bleiben im Inneren des Dialyseschlauchs. Auf diese

Weise konnte Mip bis auf eine vernachlässigbare Menge an Ammoniumsulfat aufkonzentriert werden.

3.1.2 Durchführung und Auswertung des PPIase-Assays

Die Untersuchungen der Mip-PPIase-Inhibition durch die hergestellten Verbindungen und die

Bestimmung der entsprechenden IC50-Werte wurden am Max-Planck-Institut durchgeführt (siehe

Kapitel 3.1). Der verwendete Enzymassay sollte während der Promotionszeit an das Institut für

Pharmazie in Würzburg übertragen und dort etabliert werden. Dies scheiterte jedoch daran, dass das

vorhandene UV-Spektrometer im gewünschten Absorptionsbereich zu große Schwankungen aufwies

und somit keine verwertbaren, konstanten Werte gemessen werden konnten. Der In-vitro-Test beruht

auf einer Protease-gekoppelten enzymatischen Reaktion. Das Prinzip dabei ist, dass die

Peptidbindungen des eingesetzten Substrats Succinyl-Ala-Phe-Pro-Phe-p-Nitroanilin durch die

ebenfalls anwesende Hilfsprotease α-Chymotrypsin nur dann gespalten werden können, wenn die

Peptidbindung zwischen Phenylalanin und Prolin in trans-Stellung vorliegt (siehe A). Die Menge an

gespaltenem trans-Substrat kann dann durch eine Absorptionsmessung des Spaltprodukts p-

Nitroanilin bei 390 nm gemessen werden. Bei pH 7.8 stellt sich zwischen den beiden Konformeren

trans und cis des Substrats ein Gleichgewicht von 80-95 : 5-20 ein.28

Dies bedingt zu Beginn der

Reaktion - d.h. innerhalb der ersten 30 Sekunden - eine schnelle Spaltung des trans-Substrats durch

die Hilfsprotease und damit verbunden einen steilen Anstieg der Absorption (siehe A).

ALLGEMEINER TEIL 83

A)

Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-p-Nitroanilin (cis + trans) Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-p-Nitroanilin (cis) +

Suc-Ala-Phe-Pro-Phe (trans) + p-Nitroanilin

B)

Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-p-Nitroanilin (cis) Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-p-Nitroanilin (trans)

C)

Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-p-Nitroanilin (trans) Suc-Ala-Phe-Pro-Phe (trans) + p-Nitroanilin

Das cis-Konformer wird durch die Hilfsprotease nicht gespalten (siehe A) und eine Isomerisierung in

das trans-Konformer findet auf Grund der hohen Aktivierungsenergie (siehe Kapitel 1.1.3.1) bei RT

nur sehr langsam statt. Dies bedeutet, dass sich die Rate der Absorptionszunahme nach der

anfänglichen schnellen trans-Spaltung verringert.

Mip katalysiert als PPIase diese cis/trans-Umlagerung (siehe Kapitel 1.1.3.1), d.h. bei Zugabe von

Mip wird das cis- in das trans-Substrat isomerisiert (siehe B), welches dann von α-Chymotrypsin

gespalten werden kann (siehe C). Infolgedessen steigt die Absorption bei 390 nm an, bis das Substrat

vollständig gespalten wurde.

Durch Zugabe eines Mip-Inhibitors wird die PPIase-Funktion teilweise gehemmt oder aufgehoben,

was konsequenterweise in einem geringeren Absorptionswert resultiert. Umso geringer die Absorption

ist, desto besser inhibiert die Substanz die PPIase und desto kleiner ist der resultierende IC50-Wert

(siehe Abb. 68).

Abb. 68: Schematische Darstellung der Absorptionskurven während der Protease-gekoppelten Reaktion (mit und

ohne PPIase bzw. Inhibitor)91

mit PPIase

mit PPIase + Inhibitor

ohne PPIase

PPIase

Chymotrypsin

Chymotrypsin

84 ALLGEMEINER TEIL

Der Enzymassay wurde UV-spektrometrisch in einem 96-Well-Plate-Format durchgeführt. Im ersten

Schritt wurden jeweils Stammlösungen von Substrat, α-Chymotrypsin und Mip in HEPES/NaCl-

Puffer pH 7.8 sowie Stammlösungen von den zu testenden Inhibitoren in Ethanol hergestellt. In jeder

Messreihe wurden neben den Messwerten der Inhibitorlösungen, bestehend aus Substrat, Mip,

Inhibitor und α-Chymotrypsin, auch ein Nullwert (Substrat und α-Chymotrypsin) sowie ein

Kontrollwert (Substrat, Mip und α-Chymotrypsin) bestimmt. Die Bestimmung der Absorptionswerte

aller Untersuchungslösungen wurde dreimal durchgeführt. Bei allen Messungen sollte ein

Temperaturbereich von 9-11 °C zwingend eingehalten werden, da nur in diesem Bereich die

Geschwindigkeit der cis/trans-Umlagerung über eine Absorptionszunahme beobachtet werden kann.

Bei höheren Temperaturen ist die Reaktion bereits nach einigen Sekunden abgeschlossen, bei

niedrigeren ist eine Isomerisierung nicht zu erkennen. Sobald die Reaktion durch die α-Chymotrypsin-

Zugabe gestartet worden war, wurde über einen Zeitraum von 200 s alle drei Sekunden die Absorption

bei 390 nm bestimmt. Die erhaltenen Absorptionswerte wurden als Funktion gegen die Zeit

aufgetragen, wobei die Absorptionswerte im Intervall von 0-30 s bei der anschließenden Auswertung

nicht berücksichtigt wurden. In dieser Zeit findet die Spaltung des trans-Konformers unabhängig von

der Mip-Aktivität statt. Um die Aktivität der PPIase, d.h. die Geschwindigkeit der cis/trans-

Isomerisierung erfassen zu können, werden diese Absorptionswerte vernachlässigt.

Die Umlagerung der Konformere beschreibt eine Reaktion erster Ordnung, d.h. die

Geschwindigkeitskonstanten (k-Werte) der einzelnen Reaktionen lassen sich nach dem Modell von

Michaelis-Menten berechnen.92

Dieses Modell gilt für Reaktionen mit folgendem prinzipiellen

Mechanismus:

Das Enzym E bindet an das Substrat S unter Bildung eines Enzym/Substrat-Komplexes mit der

Geschwindigkeitskonstanten k1. Der Komplex kann danach entweder wieder in die Ausgangsstoffe E

und S zerfallen (k-1) oder in das Produkt P umgesetzt werden (k2).

Die Geschwindigkeitskonstante der PPIase während der einzelnen Reaktionen wurde über die

nachfolgende Funktionsgleichung (1) mit Hilfe eines geeigneten Analyseprogramms berechnet:

)(0 kxeayy (Gleichung 1)

Aus den Werten der Nullwert-Messung erhielt man nach der Auswertung den nicht-enzymatischen k-

Wert (kn.enz), und aus denen der Kontrolle sowie der einzelnen Inhibitoren den jeweiligen kobs-Wert

ALLGEMEINER TEIL 85

(obs = observed). Der kn.enz-Wert, d.h. der Nullwert, wurde anschließend von allen kobs-Werten

abgezogen und man erhielt die enzymatischen k-Werte (kenz):

kenz = kobs -kn.enz (Gleichung 2)

Anschließend wurde aus den einzelnen kenz-Werten der kcat/KM-Parameter des Enzyms bei den

verschiedenen Inhibitorkonzentrationen nach folgender Formel berechnet:

][MIP

k

K

k enzcat

M

(Gleichung 3)

Der kcat/KM-Wert ist eine Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung und beschreibt die katalytische

Effizienz oder Spezifität des Enzyms. Während kcat als katalytische Konstante erster Ordnung oder

auch „turnover-number“ die maximale Zahl der umgesetzten Substrat-Moleküle pro Enzym und

Sekunde darstellt, gibt KM, die sogenannte Michaelis-Menten-Konstante, die Substratkonzentration bei

halbmaximaler Reaktionsgeschwindigkeit an.

Im Fall des PPIase-Assays wurde der kcat/KM-Wert des ungebundenen Enzyms (ohne Inhibitor;

entspricht der Kontrolllösung) daher als 100 % der Enzymaktivität angenommen und alle anderen

Effizienz-Werte (mit Inhibitor) dazu ins Verhältnis gesetzt. Somit konnte die Restaktivität des Enzyms

bei verschiedenen Inhibitorkonzentrationen erhalten werden. Diese beiden Parameter gegeneinander

aufgetragen (Restaktivität gegen Inhibitorkonzentration), ergeben eine exponentiell abfallende Kurve

(siehe Abb. 69), aus der mit Hilfe geeigneter Analyseprogramme der IC50-Wert für jeden einzelnen

Inhibitor bestimmt werden konnte.

Abb. 69: Restaktivitätskurve von Verbindung 22b (IC50 = 6 µM)

[CJ168] (µM)

0 50 100 150 200

Lp

Mip

PP

Iase

activity (

% o

f co

ntr

ol)

0

20

40

60

80

100

Inhibitorkonzentration

(Verbindung 22b)

Lp-P

PIa

se-A

kti

vit

ät

[% d

er K

ontr

oll

e]

0 50 100 150 200

0

20

40

60

80

100

86 ALLGEMEINER TEIL

3.1.3 Ergebnisse

Um anschließend eine selektive bakterielle PPIase-Inhibition durch die neu synthetisierten

Verbindungen nachweisen zu können, wurden im Rahmen der pharmakologischen Testungen neben

den IC50-Werten an Mip ebenfalls die entsprechenden Werte an FKBP12 ermittelt. Die Bestimmung

der humanen PPIase-Hemmung erfolgte mittels desselben Protease-gekoppelten Enzymassays,

anstelle von Mip wurde lediglich FKBP12 (in einer Konzentration von 20 nM) eingesetzt.

Verbindung Mip

IC50 ± sdv [µM] FKBP12

IC50 ± sdv [µM]

12a 87.0 ± 5.0 2.6 ± 0.4

12d 14.3 ± 0.4 4.57 ±0.77

19a 32.3 ± 7.2 8.78 ± 1.12

19b 60.3 ± 9.8 11.3 ± 1.54

19c 77.0 ± 8.3 > 20

20b 47.1 ± 5.4 > 20

21a 81.0 ± 5.2 > 20

21b 51.3 ± 1.9 > 20

21c 69.3 ± 7.4 > 20

22a 9.0 ± 0.7 0.2 ± 0.02

22b 6.0 ± 0.7 0.2 ± 0.03

22c 27.4 ± 4.9 2.61 ± 0.41

22d 91.3 ± 15.7 11.5 ± 0.9

22e 41.3 ± 16.0 0.19 ± 0.03

23a 6.8 ± 0.6 4.6 ± 0.9

23b 52.0 ± 16.0 > 20

24a 5.8 ± 1.6 1.75 ± 0.31

25 85.0 ± 20.7 1.63 ± 0.86

26a 28.0 ± 1.7 0.12 ± 0.1

26d 46.8 ± 8.4 0.21 ± 0.07

26f 73.9 ± 3.5 3.58 ± 0.96

26i 71.3 ± 2.7 0.42 ± 0.08

27b 91.7 ± 12.4 0.45 ± 0.03

27d 32.0 ± 2.4 0.15 ± 0.01

35a 47.3 ± 9.1 0.47 ± 0.04

35b 63.5 ± 3.0 0.29 ± 0.02

37b 56.1 ± 9.5 0.06 ± 0.006

Tabelle 8: IC50-Werte ausgewählter Verbindungen an Mip und FKBP12

ALLGEMEINER TEIL 87

R

3

CO

-CH

2-

NH

BO

C

35

b

- - - -

37

b

- - - - -

CO

-

(CH

2) 2

-

NH

BO

C

35

a

- - - -

37

a

- - - - -

CO

-

N(C

H3) 2

31

- - - - 33

- - - - -

H

30

a

- - - -

30

b

-

30

c

- - -

R3

p-

Me

12

j

- - - - 29

- - - - -

m-

OM

e

12

i

- - - - 28

- - - - -

m-

NO

2

12

h

-

27

a

27

b

- - -

27

c

-

27

e

-

-

12

f

12

g (

S)

26

b

26

f

26

e

26

g

26

h

26

i

26

a

26

d

26

c -

R3

o-

NO

2

12e - - - - 2

5

- - - - -

p-

Cl

12d

24a

- - - - - - -

24b

-

p-

Me

12c

23a

- - - - - - -

23b

-

-

12a

12b

(S

)

22c - - - - -

22a

22b

(S

)

-

22e

22d

R3

p-

Cl

11c - - - -

21a

- - -

21b

21c

-

11b

20a

-

20b

- - - -

20c

- -

-

11a

- -

19a

-

19b

- -

19c

- -

- 10

- - - - - -

18

b

- -

18

a

A

mid

- se

iten

- k

ette

Est

er-

seit

enk

ette

Eth

yl-

Py

rid

in-3

-

ylm

eth

yl-

2-P

hen

yle

thy

l-

2-(

4-M

eth

oxy

-

ph

eny

l)et

hy

l-

3-P

hen

ylp

rop

yl-

3-(

Py

rid

in-3

-

yl)

pro

py

l-

3-(

4-M

eth

oxy

-

ph

eny

l)

pro

py

l-

3-(

3,4

,5-

Tri

met

ho

xy

-

ph

eny

l)p

rop

yl-

4-P

hen

ylb

uty

l-

5-P

hen

ylp

enty

l-

1,3

-Dip

hen

yl-

pro

py

l-

Tabelle 9: Zusammenstellung aller Pipecolinsäure-Derivate

88 ALLGEMEINER TEIL

In Tabelle 8 sind die IC50-Werte der Substanzbibliotheken an Mip bzw. FKBP12 zusammengestellt. Es

werden nur diejenigen Verbindungen dargestellt, die eine Inhibition der bakteriellen PPIase zeigten.

Bei allen anderen - wie den niedermolekularen Sulfonsäureamiden 1-6, nahezu allen Pipecolinsäure-

ethylestern 10-12, den α-Ketoamiden 18a und 18b, den meta- bzw. para-substituierten Phenyl-

sulfonsäureamid-Derivaten 28-31 und 33, den Pipecolinsäure-Variationen 38-44 sowie den neu-

designten Verbindungen 46-48 - lag der Mip-IC50-Wert deutlich über einem Wert von 100 µM, so dass

eine effiziente PPIase-Hemmung durch diese Verbindungen ausgeschlossen werden kann.

Die niedermolekularen Sulfonsäureamide 1-6 hatten keine Wirkung auf die bakterielle PPIase; eine

Hemmung der FKBP12-PPIase durch diese Verbindungen war ebenfalls nicht zu beobachten. Ein

Grund hierfür könnte sein, dass die Verbindungen 1-6 zwar in die hydrophobe Bindetasche von Mip

bzw. FKBP12 einlagern, aber nicht genügend Aktivität für die PPIase-Inhibition aufweisen, da sie den

Raum der Kavität nicht vollständig ausnutzen. In einem solchen Fall sollten höhere Inhibitor-

konzentrationen eine gewünschte PPIase-Hemmung herbeiführen. Um diese Hypothese zu überprüfen,

wurden daher Konzentrationen bis 100 µM eingesetzt; eine Messung in diesem Bereich war jedoch

nicht möglich, da alle Verbindungen ab einer Konzentration von 60 µM präzipitierten. Um dennoch

die Bindungsverhältnisse zwischen den „kleinen“ Sulfonsäureamiden und Mip zu untersuchen,

wurden NMR-Bindungsstudien durchgeführt (siehe Kapitel 3.2.2).

Bei den Pipecolinsäure-Derivaten konnte zunächst ebenfalls keine Inhibition der enzymatischen

Aktivität von Mip durch die Derivate mit der Grundstruktur A (d.h. der α- Ketoamid-Derivate (siehe

Kapitel 2.2.1); Verbindungen 10, 18a und 18b) beobachtet werden; es zeigte sich aber eine geringe

FKBP12-PPIase-Hemmung (IC50-Wert von Verbindung 18a = 4.2 µM). Auch durch strukturelle

Variationen wie z.B. ein Ersetzen des Piperidinrings in Zielverbindung A durch eine offenkettige

Struktur (Verbindung 42) oder einen Fünfring (Verbindung 44) konnte keine Inhibition von Mip

erzielt werden.

Im Gegensatz dazu wurde im Fall der Verbindungen mit der Grundstruktur B (d.h. der

Sulfonsäureamid-Derivate (siehe Kapitel 2.2.1)) eine Inhibition der bakteriellen PPIase im

mikromolaren Bereich beobachtet, jedoch nur bei „größeren“ Pipecolinsäureestern. „Kleinere“

Pipecolinsäureethylester inhibierten das bakterielle Enzym kaum, mit Ausnahme der Verbindung 12d

(IC50-Wert = 14.3 µM), welche eine Vorstufe von Verbindung 24a darstellt.

Eine sehr gute Aktivität unter den „größeren“ Pipecolinsäureestern zeigten das unsubstituierte

Benzylsulfonsäureamid-Derivat 22b (Zielstruktur B; IC50 = 6.0 µM) und das para-Methyl-

substituierte Benzylsulfonsäureamid-Derivat 23a (IC50 = 6.8 µM); der vielversprechendste Inhibitor

war das para-Chlor-substituierte Benzylsulfonsäureamid-Derivat 24a mit einem IC50-Wert von

5.8 µM. Alle anderen Strukturvariationen der Sulfonsäureamidseitenkette - wie z.B. der Austausch des

Benzylrings durch Phenylreste (Verbindungen 26-30), der Austausch der Sulfonsäureamid-Funktion

durch ein Carbonsäureamid (Verbindungen 19-21) oder die Einführung von längeren meta-

Substituenten (Verbindungen 31, 33, 35 und 37) - zeigten zwar in Einzelfällen eine Hemmung der

ALLGEMEINER TEIL 89

bakteriellen PPIase, der entsprechende IC50-Wert lag aber deutlich höher. Hierbei muss jedoch noch

erwähnt werden, dass nur im Fall der Carbonsäureamide 19c, 20b, 21a-c eine gewünschte bevorzugte

Hemmung von Mip erzielt werden konnte; alle anderen aktiven Sulfonsäureamid-Derivate zeigten

neben der Mip-Inhibition eine zusätzliche FKBP12-Hemmung.

Die Tatsache dieser „Unselektivität“ soll aber bei der weiteren Wirkstoffsuche zunächst nicht

berücksichtigt werden, da davon auszugehen ist, dass die FKBP12-Inhibition in diesen Fällen keine

unerwünschte Immunsuppression nach sich zieht, da die Sulfonsäureamid-Derivate nicht über die

Effektordomäne von Rapamycin bzw. FK506 verfügen, welche für die Wechselwirkungen mit mTOR

bzw. Calcineurin und damit für die Immunsuppression verantwortlich ist. Diese Hypothese gilt es in

Nachfolgearbeiten jedoch noch zu beweisen.

Bei der Betrachtung der inhibitorischen Werte fällt ferner auf, dass - im Widerspruch zur

ursprünglichen Annahme - die Propylkette des Esterrests nicht essenziell für die PPIase-Hemmung ist,

da bei allen Estern mit Alkylketten von n = 1-5 (kombiniert mit unterschiedlichen Sulfonsäureamiden)

eine inhibitorische Wirkung beobachtet werden konnte.

Abb. 71: Mögliche Variationen am Grundgerüst von aktiven Pipecolinsäure-Derivaten

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse der Docking-Studien der Pipecolinsäure-

Derivate (siehe Kapitel 2.2.1) im pharmakologischen Test vollkommen bestätigt werden konnten.

Während Zielverbindungen mit der Grundstruktur A keine Mip-Hemmung zeigten, wiesen diejenigen

mit der Grundstruktur B am bakteriellen Enzym IC50-Werte im mikromolaren Bereich auf. Mit einer

Benzylsulfonsäureamidstruktur konnten die besten inhibitorischen Werte erzielt werden; an dieser

Struktur ist zwar sowohl der Austausch der Sulfongruppe durch eine Carbonylfunktion als auch der

des Benzylrings durch einen Phenylring möglich, beides führt aber zu einer Verschlechterung der

inhibitorischen Aktivität. Im Gegensatz dazu verringert die para-Chlor-Substitution am Benzylring

Bester IC50-Wert bei m = 1;

m = 0 führte zu einer Verringerung

der inhibitorischen Aktivität.

Die Variation der Kettenlänge (n = 1-5)

führte zu keiner Änderung des IC50-Werts.

Die Einführung von p-Cl zeigte keine

Veränderung des IC50-Werts und ist daher möglich.

90 ALLGEMEINER TEIL

den IC50-Wert nicht. Ferner ist der große Esterrest der Verbindungen zwar, wie angenommen, für eine

Inhibition notwendig, sein Alkylspacer, der den aromatischen Teil mit der Pipecolinsäure verbindet,

ist jedoch nicht auf die Propylkette beschränkt, sondern kann zwischen den Kettenlängen n = 1-5

variieren (siehe Abb. 71).

3.2 NMR-Bindungsstudien

3.2.1 Prinzip und Durchführung der 15

N-HSQC-NMR-Experimente

Um die exakten Bindungsverhältnisse zwischen einem Protein und einer chemischen Verbindung zu

bestimmen, eignen sich sogenannte 15

N-HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)-NMR-

Experimente. Dabei werden Wechselwirkungen, die zwischen den Kernen von direkt gebundenen

Protonen und Stickstoff-Atomen entstehen, gemessen. Als Ergebnis erhält man ein zweidimensionales

Spektrum, in dem auf der x-Achse die 1H- und auf der y-Achse die

15N-Verschiebungen aufgetragen

sind. Bei der Bindung eines Inhibitors an ein Protein kommt es u.a. zu Wechselwirkungen mit den

Stickstoff-Atomen des Proteins und damit zu einer Veränderung in der chemischen Verschiebung der

betroffenen Kerne. Misst man zunächst das ungebundene Protein und anschließend dieses im

Komplex mit einem möglichen Bindungspartner, kann man in der Überlagerung der beiden Spektren -

im Fall einer Bindung - deutlich die Veränderung in der chemischen Verschiebung der betroffenen

Atome erkennen und damit die Bindetasche identifizieren.

Um die Ergebnisse des Enzymassays (siehe Kapitel 3.1.3) stichprobenartig zu verifizieren, wurden

ausgewählte Verbindungen mittels solcher NMR-Bindungsstudien untersucht. Diese Experimente

wurden an einem 800 MHz NMR-Spektrometer im Arbeitskreis von Prof. Dr. Paul Rösch am Institut

für Biopolymere an der Universität Bayreuth durchgeführt. Für die Messungen wurde die kürzlich

beschriebene 15

N-markierte C-Domäne von Mip verwendet.59

Die zu testenden Verbindungen wurden

in Acetonitril-d3 in einer Konzentration von 23 mM gelöst und dreimal - jeweils in einem Protein-

Ligand-Verhältnis von 1 : 5; 1 : 10 und 1 : 20 - vermessen. Als Referenz wurde bei der Messung des

ungebundenen Proteins die Menge an Inhibitor durch Acetonitril-d3 ersetzt. Die standardisierten

chemischen Verschiebungen wurden als Durchschnitt der Veränderungen der chemischen

Verschiebungen (1H und

15N) durch folgende Gleichung dargestellt. Hierbei wurde ein Wert von

0.03 ppm als signifikant angesehen.63

normshift = (δ(1H)

2 + (0.1δ(

15N))

2)

1/2 (Gleichung 4)

ALLGEMEINER TEIL 91

3.2.2 Ergebnisse

Um die aufgestellte Hypothese, dass die niedermolekularen Sulfonsäureamide zwar an die PPIase-

Domäne von Mip binden, jedoch nur eine unzureichende Aktivität für die Enzymhemmung aufweisen,

zu überprüfen, wurden zunächst diese Verbindungen mittels der NMR-Experimente untersucht.

Beispielhaft wurde zu diesem Zweck Verbindung 1a vermessen. In der Überlagerung der beiden

gemessenen Spektren (siehe Abb. 72, links) war keine Veränderung der chemischen Verschiebungen

zu beobachten, d.h. die Sulfonsäureamide binden tatsächlich nicht an das Enzym.

Abb. 72: Spektren der 15

N-HSQC-NMR-Experimente: Überlagerung des Spektrums des ungebundenen

Proteins mit dem von Verbindung 1a (links) bzw. mit dem von Verbindung 22a (rechts)

Im Rahmen der NMR-Bindungsstudien wurden des Weiteren verschiedene Pipecolinsäure-Derivate

mit der Grundstruktur B (Verbindungen 12a, 22a und 22b) untersucht. Im Fall aller Verbindungen

war eine deutliche Veränderung der chemischen Verschiebungen zu beobachten. Exemplarisch ist

dafür die Überlagerung der Spektren von ungebundenem und mit Verbindung 22a komplexiertem

Protein in Abb. 72 (rechts) dargestellt. Die ermittelten Veränderungen der chemischen Ver-

schiebungen wurden anschließend für jede Verbindung gegen die entsprechende Mip-Aminosäure-

sequenz in ein zweidimensionales Koordinatensystem aufgetragen (siehe Abb. 73, links). Im Fall des

Pipecolinsäureethylesters 12a konnten die deutlichsten Veränderungen der chemischen Ver-

schiebungen (> 0.03 ppm) nachgewiesen werden; es wurden eindeutig Wechselwirkungen mit den

Aminosäureresten Tyr55, Arg58, Phe65, Asp66, Ser67, Thr76, Val82, Ile83, Tyr102, Ser105, Tyr109

und Phe126 beobachtet. Verbindung 22a zeigte dagegen lediglich Interaktionen mit Tyr55, Ser67

sowie Ile83 und Verbindung 22b mit Tyr55, Phe65, Asp66, Ser67, Val82, Ile83, Gly115 und Phe126.

1H-NMR 1

H-NMR

15N

-NM

R

15N

-NM

R

92 ALLGEMEINER TEIL

Werden die so ermittelten Aminosäuren anschließend auf die Oberfläche von Mip projiziert, können

die Binderegionen, an denen der Inhibitor Wechselwirkungen mit dem Protein eingeht, eindeutig

identifiziert werden (siehe Abb. 73, rechts).

Abb. 73: Veränderungen der chemischen Verschiebungen der Aminosäurereste der Mip-PPIase-Domäne bei

Bindung der Verbindungen 12a, 22a und 22b (links); Mapping der signifikanten Veränderungen der

chemischen Verschiebung auf die Mip-Oberfläche (rechts; orange = Binderegionen von Verbindung 22b)63

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse des Enzymassays durch die NMR-

Bindungsstudien ohne Ausnahme bestätigt werden konnten. Sowohl die „Nicht-Bindung“ der

niedermolekularen Sulfonsäureamide als auch die Bindung der Pipecolinsäure-Derivate konnten

mittels dieser spektrometrischen Methode nachgewiesen werden.

Verbindung

22b

Ver

änder

ung d

er c

hem

isch

en V

ersc

hie

bu

ng [

ppm

]

Verbindung

22a

Verbindung

12a

Aminosäuresequenz

20 40 60 80 100 120

20

20

40 100 60 80

40 100 80 60

120

120

0.08

0.03

0

0.08

0.03

0

0.08

0.03

0

ALLGEMEINER TEIL 93

3.3 In-vivo-Testsystem

3.3.1 Transwell-Assay

Als In-vivo-Testsystem für Lp-Mip eignet sich ein Transwell-Assay, der kürzlich im Arbeitskreis von

Prof. Dr. Michael Steinert an der Universität Würzburg entwickelt und etabliert wurde.33

Mit Hilfe

von Transwell-Systemen kann die Fähigkeit von Mikroorganismen, biologische Barrieren zu

überwinden, untersucht werden. Im Fall von Mip sollte auf diese Weise die Transmigration der

Legionellen durch die Lungenbarriere beobachtet (siehe Kapitel 1.1.3.2) und somit die In-vivo-

Aktivität der in vitro wirksamen Pipecolinsäure-Derivate bestimmt werden. Da bereits zu Beginn der

Studien große Probleme bei der Bildung der Epithelzellschicht auf der porösen Transwell-Membran

auftraten, konnte diese In-vivo-Untersuchung nicht durchgeführt werden. Um dennoch die Aktivität

der Pipecolinsäure-Derivate an lebenden Zellen zu bestimmen, wurde schließlich der Gentamicin-

Infektionsassay verwendet.

3.3.2 Infektionsstudien

3.3.2.1 Durchführung

Mit Hilfe von Infektionsstudien sollte die Aktivität der synthetisierten Verbindungen in vivo

bestimmt werden. Dabei sollte der Einfluss von Verbindung 22b auf die Invasion und die

intrazelluläre Replikation von L. pneumophila in Makrophagen-ähnlichen Zellen (U937) ermittelt

werden. Zu diesem Zweck wurden die Zellen entweder mit dem Legionellen-Wildtyp, einer Mip-

negativen Legionellen-Mutante oder dem E. coli-Stamm HB101 infiziert sowie mit der zu

untersuchenden Verbindung 22b (50 µM) für mehrere Stunden inkubiert. Als Positiv-Kontrolle

wurde der bekannte Inhibitor Rapamycin verwendet. Nach jeweils 2 h, 24 h und 48 h wurde die

Bakterienzahl im Inneren der U937-Zellen bestimmt.

3.3.2.2 Ergebnisse

Das Diagramm (siehe Abb. 74) zeigt die Ergebnisse des Infektionsassays. Es ist in drei Teil-

diagramme untergliedert. Ein Teildiagramm gibt dabei die Anzahl der Bakterien im Zellinneren

(KbE/ml) nach 2 h, 24 h bzw. 48 h wider.

94 ALLGEMEINER TEIL

Abb. 74: Einfluss von Verbindung 22b bzw. Rapamycin auf die Infektion von L. pneumophila in

Makrophagen-ähnlichen Zelllinien63

Bei der Betrachtung des Balkens B der einzelnen Teildiagramme wird deutlich, dass Verbindung 22b

keinen direkten Einfluss auf die Bakterienzahl im Zellinneren hat; genau wie im Fall des

unbehandelten Wildtyps (Balken A) verringert sich die Anzahl der Bakterien im Zellinneren auch

nach 48 h nicht. Dies bedeutet, dass die Legionellen in den Makrophagen-ähnlichen Zellen nach

einer Inkubation mit Verbindung 22b überlebten. Die Bakterien besaßen ferner sogar noch die

Fähigkeit, sich zu vermehren, was an der steigenden Bakterienzahl nach 24 h bzw. 48 h zu erkennen

ist (d.h. die Balken A und B steigen). Im Gegensatz dazu waren aber weder die Mip-negativen

Mutanten (Balken D), noch die E. coli-Bakterien (Balken E), noch die mit Rapamycin infizierten

Legionellen (Balken C) in der Lage, im Zellinneren zu replizieren. Nach 24 h konnte im Fall von

Rapamycin bereits ein signifikanter Untergang der Bakterien beobachtet werden (d.h. Balken C

sinkt). Mip scheint in vivo also nicht, wie durch die Enzymassay-Ergebnisse ursprünglich

angenommen, durch die Pipecolinsäure-Derivate inhibiert zu werden.

Zusammenfassend lässt sich daher sagen, dass die Resultate des In-vivo-Tests zwar einerseits mit

denen des Enzymassays im Widerspruch stehen. Andererseits bestätigen sie aber auch die

Beobachtung von Köhler et al., dass nämlich Mip, aber nicht seine PPIase-Aktivität für die Virulenz

der Bakterien auf zellulärer Ebene der Infektion verantwortlich ist.32

Des Weiteren kann mit diesen

Ergebnissen auch die Hypothese von Wagner et al. - die hydrophobe Bindetasche der PPIase-

Domäne ist für die bakterielle Adhäsion an das extrazelluläre Lungengewebe verantwortlich -

gestützt werden (siehe Kapitel 1.1.3.2).33

Um in Zukunft die genaue Rolle von Mip während des

bakteriellen Infektionsprozesses aufzuklären, gilt es den funktionellen Zusammenhang von Mip und

seiner PPIase zu bestimmen. Aus diesem Grund soll zunächst das Molekül, an das die PPIase in der

menschlichen Lunge bindet, sowie anschließend der Effekt von Verbindung 22b während einer

Meerschweinchen-Infektion näher untersucht werden.63

A = Lp-Wildtyp; B = Lp + 22b; C = Lp + Rapamycin; D = Mip-neg.; E = E. coli

log

Kb

E /

ml

E

D C A B

E

D

C

A B

E

D

C

A B

ALLGEMEINER TEIL 95

3.4 Testungen an Mip-ähnlichen Proteinen

3.4.1 Pharmakologische Testungen an Neisserien und Chlamydien

Alle pharmakologischen Untersuchungen an N. gonorrhoeae und C. trachomatis fanden in der

Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Thomas Rudel und Dr. Vera Kozjak-Pavlovic am Institut für

Mikrobiologie der Universität Würzburg statt. Für beide Bakterienarten wurden zur Bestimmung der

inhibitorischen Aktivität der hergestellten Pipecolinsäure-Derivate In-vivo-Infektionsstudien (siehe

Kapitel 3.3.2.1) durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden exemplarisch die strukturell

unterschiedlichen Verbindungen 18b, 22a, 27d, 30b sowie 38 ausgewählt.

3.4.1.1 Infektionsstudien an N. gonorrhoeae

Zur Bestimmung der Wachstumshemmung von N. gonorrhoeae wurden die Verbindungen in drei

verschiedenen Konzentrationen (1.6 µM, 8 µM und 40 µM) mit Epithelzellen inkubiert. Als Positiv-

Kontrolle wurde der bekannte Inhibitor Fucoidin, ein Polysaccharid aus Seetang, verwendet.

Anschließend wurden die inkubierten Zellen mit Neisserien, die ein zusätzliches Gen zur Expression

von grün-fluoreszierendem Protein (GFP) in sich trugen, infiziert. Nach einer Stunde wurden die

Mikroorganismen, die weder an die Zellen adhärierten noch in diese invadiert waren, entfernt und die

Epithelzellkerne mit dem Fluoreszenzfarbstoff DAPI (4´,6-Diamin-2-phenylindol) gefärbt. Dadurch

konnte anschließend die Anzahl der grün-fluoreszierenden Neisserien, deren Adhäsions- bzw.

Invasionsfähigkeiten durch die Pipecolinsäure-Derivate nicht gehemmt worden waren, UV-

spektroskopisch bestimmt werden.

Während die Verbindungen 18b und 22a lediglich in der höchsten Konzentration (40 µM) einen

hemmenden Effekt auf die Bakterien zeigten, konnte im Fall von Verbindung 27d bei allen Inhibitor-

konzentrationen eine verminderte Bakterienzahl im Zellinneren verzeichnet werden. Verbindungen

30b und 38 zeigten weder eine Auswirkung auf die Adhäsion noch auf die Invasion der Neisserien.

Diese Ergebnisse spiegeln jedoch nur eine Tendenz bzgl. der Neisserien-Inhibition durch die

Pipecolinsäure-Derivate wider und können nicht als repräsentativ für alle Verbindungen angesehen

werden. Daher sollen in Zukunft weitere Testungen folgen, um schließlich auch mögliche Struktur-

Wirkungsbeziehungen aufstellen zu können. Ferner sollte bei diesem In-vivo-Testsystem zwingend

bedacht werden, dass ein positives Ergebnis - d.h. eine Inhibition der Neisserien-Adhäsion bzw.

Invasion - nicht automatisch auch eine Hemmung von Ng-Mip darstellt. Aus diesem Grund sollen die

positiv getesteten Verbindungen des Weiteren auch bzgl. ihres Mip-Effekts in vitro untersucht

werden.

96 ALLGEMEINER TEIL

3.4.1.2 Infektionsstudien an C. trachomatis

Im Rahmen der Infektionsstudien der obligat intrazellulären Chlamydien wurde die extrazelluläre

Form der Mikroorganismen, die sogenannten Elementarkörper (EB, siehe Kapitel 1.4.1), verwendet.

Da diese EBs metabolisch vollkommen inaktiv sind und sich nicht vermehren können, werden die

Bakterien in diesem Stadium durch einen Inhibitor nur in seltenen Fällen gehemmt. Aus diesem

Grund müssen zusätzliche Infektionsuntersuchungen durchgeführt werden, nachdem die EBs in die

Wirtszelle eingedrungen sind und sich in metabolisch aktive, vermehrungsfähige Retikularkörper

(RB) umgewandelt haben. Eine Inhibition der RBs bewirkt, dass die Replikation der Bakterien zwar

nicht gehemmt wird, aber Nachkommen mit verminderter Infektiösität gebildet werden. Um die

Aktivität potenzieller Inhibitoren auf die Chlamydien-Infektion zu bestimmen, muss deshalb neben

der anfänglichen Infektiösität der EBs auch die der Nachkommen untersucht werden.

In zwei Versuchsreihen wurden Epithelzellen mit den Pipecolinsäure-Derivaten in drei

Konzentrationen (10 µM, 20 µM und 40 µM) inkubiert und mit Chlamydia-EBs infiziert. Als

Positiv-Kontrolle wurde Wortmannin, ein Mykotoxin aus verschiedenen Schimmelpilzarten, das in

der Lage ist, die Adhäsion der Chlamydien-EBs an die Wirtszelle zu hemmen, verwendet. Die

infizierten Epithelzellen eines Untersuchungsansatzes wurden nach 24 Stunden von nicht

gebundenen Bakterien getrennt, fixiert und die Zellkerne mit dem Fluoreszenzfarbstoff Hoechst

33258 gefärbt; die eingedrungenen Bakterien wurden mit dem Cyaninfarbstoff Cy3 gefärbt.

Im zweiten Ansatz wurden die bakteriellen Nachkommen isoliert und mit frischen Epithelzellen

weitere 24 Stunden inkubiert. Danach wurde analog zur EB-Infektion vorgegangen. Auf diese Weise

konnte durch die unterschiedliche Färbung von Mikroorganismen und Epithelzellen die Anzahl an

Bakterien, die in die Wirtszelle eingedrungen waren, ermittelt werden.

Die Ergebnisse der Infektionsstudien zeigten, dass lediglich Verbindung 22a einen inhibitorischen

Effekt auf die Chlamydien-Infektion hat. Während im Fall der Nachkommen-Infektion bei einer

Inhibitorkonzentration von 40 µM eine verminderte Bakterienanzahl im Zellinneren bestimmt

werden konnte, war, wie erwartet, keine Auswirkung von Verbindung 22a auf die anfängliche EB-

Infektion zu erkennen. Bei den anderen Pipecolinsäure-Derivaten 18b, 27d, 30b und 38 wurde weder

ein Einfluss auf die EBs noch auf die Nachkommen beobachtet.

Jedoch kann auch hier auf Grund dieser Resultate nicht direkt auf eine Chlamydien-Hemmung durch

alle Pipecolinsäure-Derivate vom Benzylsulfonsäureamid-Typ (Verbindung 22a) geschlossen

werden. Die Ergebnisse des Infektionstests spiegeln lediglich einen dahingehenden Trend wider. Um

aussagekräftigere Informationen für eine Struktur-Wirkungsbeziehung zu bekommen, müssen in

Zukunft weitere Derivate vom Pipecolinsäure-Typ 22a untersucht werden. Außerdem sollen die in

vivo aktiven Substanzen ebenfalls in vitro bzgl. ihrer Wechselwirkungen mit Mip analysiert werden.

ALLGEMEINER TEIL 97

3.4.2 Pharmakologische Testungen an Burkholderien

Die pharmakologischen Testungen im Rahmen von B. pseudomallei wurden in der Arbeitsgruppe

von Dr. Isobelle Norville am Defence Science & Technology Laboratory in Großbritannien

durchgeführt. Um eine mögliche Inhibition von Bp-Mip durch die hergestellten Pipecolinsäure-

Derivate zu ermitteln, bediente man sich dem bereits beschriebenen Protease-gekoppelten

Enzymassay (siehe Kapitel 3.1.2). Die Durchführung verlief analog zu den Testungen an Lp-Mip -

lediglich die enzymatische Komponente wurde ausgetauscht (Bp-Mip-Konzentration = 50 nM).

Wie im Fall von L. pneumophila sollten auch hier alle hergestellten Pipecolinsäureester, auch die

Ethylester-Zwischenstufen, auf ihren Mip-Effekt untersucht werden. Bis dato liegen zu B.

pseudomallei jedoch nur einzelne Ergebnisse vor. Es konnte aber bereits beobachtet werden, dass

eine ganze Reihe der Verbindungen einen inhibitorischen Effekt auf das Burkholderien-Protein hat

(siehe Abb. 75). Die Verbindungen 12a, 18a, 22a, 27c und 27d wiesen im Vergleich zum

immunsuppressiven Rapamycin sogar eine deutlich höhere Inhibition der Reaktionsgeschwindigkeit

der cis/trans-Umlagerung auf, so dass an dieser Stelle unbedingt weitere Testungen (in vitro sowie in

vivo) durchgeführt werden sollen. In diesem Sinne sind Kristallisations- sowie NMR-Bindungs-

Studien bei Emerald Biostructures in Bainbridge Island, USA geplant.

Abb. 75: Einfluss der Bp-PPIase und möglicher PPIase-Inhibitoren auf die cis/trans-Umlagerung von

Peptidbindungen

3.5 Antimikrobielle Aktivitäten gegen Protozoen

Die in dieser Arbeit hergestellten „kleinen“ Sulfonsäureamide sowie die Pipecolinsäure-Derivate

sollten ebenfalls auf ihre antiinfektive Aktivität gegenüber im SFB 630 verfügbaren Infektions-

erregern wie T. brucei, L. major, S. aureus, S. epidermidis, E. faekalis, E. faecium, E. coli, P.

25

20

15

10

5

0

Mip- = Mip-negativ

Mip+ = Mip-positiv

Rap = Positiv-Kontrolle Rapamycin

Mip- Mip

+ Rap 10 18a 18b 12a 22a 26a 27d 27c 30b 30c

Rea

kti

onsr

ate

[x 1

03/1

/s]

98 ALLGEMEINER TEIL

aeruginosa, Y. pseudotuberculosa, Y. pestis und C. albicans untersucht werden. Da inhibitorische

Effekte lediglich im Fall von T. brucei und L. major beobachtet wurden, wurden die Verbindungen

11, 12b-12e, 12j, 19-21, 22c-22e, 23-25, 26b-26f, 26i, 27a-27b, 27e, 29, 33, 35, 37 nur noch auf eine

Inhibition dieser beiden Mikroorganismen untersucht. Tabelle 10 zeigt alle positiven Ergebnisse:

Verbindung T. brucei (48h)

IC50, µM

T. brucei (72h)

IC50, µM

L. major

IC50, µM

J774.1

IC50, µM

18a 13.09 15.95 > 100 > 100

18b 16.00 15.29 66.23 45.9

19a 18.95 19.87 > 100 > 100

20b 18.23 18.30 > 100 95.8

20c 19.66 18.01 65.9 47.2

21a 18.08 17.76 > 100 > 100

21b 16.85 16.92 89 93.4

21c 9.72 7.34 > 100 73.6

22a 14.42 16.84 > 100 44.5

22b 11.62 15.02 > 100 48.4

22d 17.93 17.68 > 100 > 100

22e 18.44 16.89 > 100 > 100

23a 12.42 14.68 > 100 > 100

23b 17.47 16.52 95 > 100

24a 18.22 17.11 > 100 > 100

24b 17.69 16.60 > 100 > 100

25 15.33 16.06 > 100 > 100

26a 16.01 17.17 > 100 49.1

26b 17.91 > 40.00 > 100 > 100

26c 15.62 11.64 > 100 > 100

26d 11.74 17.77 > 100 > 100

26e 17.96 17.48 > 100 > 100

26f 16.47 17.54 > 100 > 100

26g 8.07 13.80 10.2 43.5

26h 17.95 18.47 > 100 > 100

26i 20.79 17.71 > 100 > 100

27a 17.40 17.38 > 100 > 100

27b 17.42 17.52 85.3 > 100

27c 6.28 7.73 > 100 > 100

27d 14.01 15.31 > 100 47.5

27e 14.83 16.55 11.3 > 100

28 20.61 18.85 > 100 45.2

29 16.33 17.53 > 100 > 100

30b 11.34 14.84 > 100 69.3

30c 13.66 16.99 > 100 46.8

31 15.13 17.55 > 100 > 100

33 3.74 3.61 > 100 > 100

35a 17.73 23.09 > 100 > 100

37a 8.58 12.62 56.6 42.1

37b 6.73 10.40 61.2 45.5

38 16.86 16.46 > 100 > 100

42 16.47 17.01 > 100 > 100

Tabelle 10: Antimikrobielle Aktivitäten der generierten Substanzbibliothek der Pipecolinsäure-Derivate

ALLGEMEINER TEIL 99

In Anbetracht aller Ergebnisse wird deutlich, dass die niedermolekularen Sulfonsäureamide

(Verbindungen 1-6) und die Pipecolinsäureethylester kaum eine nennenswerte anti-trypanosomale

und gar keine anti-leishmaniale Aktivität aufweisen. Im Gegensatz dazu zeigten aber nahezu alle

„größeren“ Pipecolinsäureester eine Wirkung gegen T. brucei. Hier waren IC50-Werte nach 48 h bzw.

72 h sogar im mikromolaren Bereich zu beobachten. Einen besonders vielversprechenden Inhibitor

unter allen aktiven Pipecolinsäureestern stellte Verbindung 33 (siehe Abb. 76) mit einem IC50-Wert

von 3.74 µM dar. Ein längerer meta-Substituent scheint sich demnach positiv auf die antiinfektive

Wirkung gegen T. brucei auszuwirken. Diese Hypothese konnte zusätzlich durch die niedrigen

inhibitorischen Werte der ebenfalls meta-substituierten Verbindungen 27c, 37a sowie 37b (siehe

Abb. 76) bestätigt werden. Da T. brucei im Unterschied zu seinem Verwandten T. cruzi jedoch kein

Mip-ähnliches Protein besitzt, konnte die anti-trypanosomale Aktivität nicht auf ein solches

zurückgeführt werden. Der genaue Angriffspunkt der Verbindungen an T. brucei sowie ein

dazugehöriger Wirkmechanismus sind derzeit ungeklärt.

Abb. 76: Pipecolinsäure-Derivate mit anti-trypanosomaler Aktivität

Eine Hemmung von L. major durch die Pipecolinsäureester konnte nur in Einzelfällen

(Verbindungen 18b, 20c, 21b, 26g, 27b, 27e, 37a und 37b) beobachtet werden. Da diese

Verbindungen jedoch eine erhöhte Zytotoxizität an der murinen Makrophagen-Zelllinie (J774.1)

aufwiesen, sollte die Pipecolinsäure-Grundstruktur bzgl. der Leishmanien-Hemmung weiter

modifiziert bzw. optimiert werden. Bei diesen Ergebnissen bleibt jedoch noch zu erwähnen, dass

Verbindung 27e eine Ausnahme unter den Pipecolinsäureestern darstellte; bei einem IC50-Wert von

11.3 µM besitzt diese Verbindung keine zytotoxischen Eigenschaften.

100 ALLGEMEINER TEIL

ALLGEMEINER TEIL 101

4 ZUSAMMENFASSUNG

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese und Charakterisierung potenzieller

Inhibitoren des Oberflächenproteins Mip von Legionella pneumophila. Der gramnegative

Mikroorganismus ist der ursächliche Erreger der Legionellose. Die Erkrankung kann in zwei

verschiedenen Formen auftreten, dem Pontiac-Fieber, einer Grippe-ähnlichen Atemwegserkrankung,

und der Legionärskrankheit, einer schweren Lungenentzündung mit einer Mortalitätsrate von bis zu

30 %. Natürliche und künstlich geschaffene Süßwassersysteme bilden den biologischen Lebensraum

der Bakterien. Aus dieser Umgebung werden sie über technische Vektoren wie Duschen oder

Klimaanlagen durch Inhalation kontaminierter Aerosole auf den Menschen übertragen, wo sie

alveoläre Makrophagen besiedeln und eine pulmonale Infektion hervorrufen. Um die Zellen in der

Lunge zu erreichen, müssen die Mikroorganismen jedoch zuerst die alveoläre Barriere, bestehend aus

einer Epithelzellschicht und extrazellulärer Matrix, überwinden. Dafür ist das Oberflächenprotein

Mip, der Hauptvirulenzfaktor, verantwortlich. Mip ist ein Homodimer, das sich aus einer C- und

einer N-Domäne zusammensetzt. Während der N-Terminus für die Dimerisierung des Proteins

verantwortlich ist, weist der C-Terminus die typische Faltung einer Peptidyl-Prolyl-cis/trans-

Isomerase (PPIase) auf. Der Vergleich der Aminosäuresequenz der Mip-C-Domäne mit der Domäne

verschiedener humaner PPIasen zeigte eine besonders große Homologie zu FKBP12, welches zur

Familie der FK506-bindenden Proteine gehört und eine wichtige Rolle innerhalb des menschlichen

Immunsystems spielt. Bemerkenswerterweise hemmen bekannte immunsuppressive FKBP12-

Inhibitoren wie FK506 und Rapamycin neben der humanen PPIase ebenfalls das bakterielle Mip.

Außerdem wurde beobachtet, dass die C-terminale Mip-PPIase an Kollagen IV, den Hauptbestandteil

in der menschlichen Lunge, bindet und somit für die Transmigration der Legionellen in die Lunge

verantwortlich ist. Mip-Inhibitoren sollten demnach eine Legionellen-Infektion verhindern können.

Zur Verifizierung der Hypothese sollten daher im Rahmen dieser Arbeit neue Leitstrukturen für Mip-

PPIase-Inhibitoren entwickelt werden. Mit Hilfe von Molecular-Modelling-Untersuchungen

basierend auf der NMR-Struktur 2VCD wurde als eine mögliche Leitstruktur N,N-Dimethylphenyl-

sulfonsäureamid identifiziert. Deshalb sollten diese Verbindung sowie Analoga, die diverse

strukturelle Variationen in der Sulfonsäureamidseitenkette oder im aromatischen Rest enthielten,

hergestellt werden (siehe Abb. 77).

102 ALLGEMEINER TEIL

Abb. 77: Synthetisierte Verbindungen 1-6 (basierend auf der Leitstruktur von N,N-Dimethylphenyl-

sulfonsäureamid)

Obwohl die Immunsuppressiva FK506 und Rapamycin Mip-Inhibitoren darstellen, können sie auf

Grund ihrer immunsuppressiven Eigenschaften nicht in der Legionellosetherapie eingesetzt werden.

Die makrozyklischen Immunsuppressiva setzen sich im Gegensatz zu N,N-Dimethylphenyl-

sulfonsäureamid allerdings aus zwei strukturellen Einheiten, einer Binde- sowie einer Effektor-

domäne, zusammen. Die Bindedomäne mit dem Pipecolinsäure-Grundgerüst ist für die Wechsel-

wirkungen mit Mip und FKBP12 verantwortlich. Die Effektordomäne hingegen ist der aliphatische

Teil der Makrozyklen, der erst durch die Bildung eines ternären Komplexes eine Immunsuppression

hervorruft. Somit können Verbindungen vom Pipecolinsäure-Typ keine immunsuppressive Wirkung

haben und stellen demnach optimale, neue Leitstrukturen für Mip-Inhibitoren dar.

Aus diesem Grund wurden die zwei literaturbekannten, nicht-immunsuppressiven FKBP12-

Inhibitoren A und B ausgewählt und in verschiedenen Docking-Studien untersucht. Das Molecular-

Modelling zeigte, dass nur Verbindung B reproduzierbare Interaktionen mit Mip eingehen kann und

demnach ein potenzieller Inhibitor ist. Um dies zu überprüfen, sollten beide Verbindungen sowie

eine Mischform, die die strukturellen Merkmale von A und B kombiniert, hergestellt werden (siehe

Abb. 78).

Da die literaturbekannte Synthese der Grundstruktur A auch durch diverse Optimierungsversuche

nicht reproduzierbar war, wurde eine neue Strategie entwickelt. Diese lieferte als Produkt zwar nicht

die exakte Struktur von A, die hergestellte Verbindung 18a unterschied sich jedoch lediglich durch

ALLGEMEINER TEIL 103

das Fehlen eines Methylrests in der α-Ketoamid-Seitenkette. Grundstruktur B konnte sowohl als

Racemat 22a als auch als S-Enantiomer 22b problemlos synthetisiert werden (siehe Abb. 78).

Abb. 78: Synthesewege zur Darstellung der Grundstrukturen A und B

Neben diesen Verbindungen wurden weiterhin Variationen des Sulfonsäureamidsubstituenten sowie

des Esterrests vorgenommen (siehe Abb. 79).

Alle Verbindungen wurden in einem In-vitro-Enzymassay gezielt auf ihre Mip-Interaktion

untersucht. Dabei wurden die Reaktionsgeschwindigkeiten der durch die PPIase katalysierten

cis/trans-Isomerisierung bestimmt und daraus die entsprechenden IC50-Werte berechnet.

Die In-vitro-Untersuchungen zeigten, dass nur Pipecolinsäure-Derivate vom Sulfonsäureamid-Typ B

die Mip-PPIase inhibieren, die besten Verbindungen sind 22b (IC50 = 6.0 µM), 23a (IC50 = 6.8 µM)

und 24a (IC50 = 5.8 µM) (siehe Abb. 80).

104 ALLGEMEINER TEIL

Abb. 79: Synthetisierte Pipecolinsäure-Derivate 19-37 (basierend auf der Leitstruktur von Verbindung 22a)

Abb. 80: Pipecolinsäure-Derivate mit den niedrigsten IC50-Werten

ALLGEMEINER TEIL 105

Der strukturelle Vergleich dieser drei Verbindungen mit den restlichen Pipecolinsäure-Derivaten

zeigte, dass der Benzylrest der Sulfonsäureamidseitenkette essenziell für eine Mip-Inhibition ist. Der

Aromat kann entweder unsubstituiert oder para-Chlor-substituiert vorliegen. Der Austausch mit

einem Phenylsubstituenten ist prinzipiell möglich, führt aber zu weniger aktiven Verbindungen. Der

Austausch der Sulfonsäureamid- durch eine Carbonsäureamid-Struktur führt ebenfalls zu einem

Aktivitätsverlust. Die Länge der Esterkette spielt keine entscheidende Rolle für eine Mip-Inhibition.

Der Esterrest muss aus einem endständigen aromatischen Teil bestehen, der über einen Alkyllinker

(n = 1-5) mit dem Piperidinring verknüpft ist.

Neben den enzymatischen In-vitro-Testungen wurden exemplarisch für die Verbindungen 1a, 12a,

22a und 22b HSQC-NMR-Experimente zur Bestimmung der Inhibitor-Proteinbindung durchgeführt.

Hier zeigte das „kleine“ Sulfonsäureamid 1a keine Wechselwirkungen mit Mip, weshalb

angenommen wurde, dass die Verbindungen 1-6 die Mip-Kavität nicht ausreichend ausfüllen und

daher nicht genügend Aktivität für eine Inhibition besitzen. Dagegen wurden bei allen drei

Pipecolinsäure-Derivaten 12a, 22a und 22b Interaktionen zwischen Inhibitor und Mip beobachtet,

wodurch die Ergebnisse des Enzymassays bestätigt wurden.

Für Verbindung 22b wurde zusätzlich die In-vivo-Wachstumshemmung der Legionellen mittels

Gentamicin-Infektionsstudien ermittelt. Nach der Inkubation von Makrophagenzellen mit

Mikroorganismen und Inhibitor 22b konnte jedoch keine verminderte Bakterienanzahl im Zell-

inneren beobachtet werden, d.h. das Pipecolinsäure-Derivat 22b hat keine signifikanten

Auswirkungen auf die Legionellen-Infektion in vivo. Eine Erklärung für die gute In-vitro-, aber

schlechte In-vivo-Aktivität ist, dass Mip als Gesamtmolekül, jedoch nicht seine PPIase-Aktivität für

die bakterielle Infektion verantwortlich ist. In Zukunft sollen daher weitere Studien den funktionalen

Zusammenhang von Mip und seiner PPIase aufklären.

Mip-ähnliche Proteine wurden auch in Bakterienarten wie Chlamydia trachomatis, Neisseria

gonorrhoeae und Burkholderia pseudomallei identifiziert. In vorläufigen In-vivo-Untersuchungen

konnte für Verbindung 22a eine Inhibition des Chlamydienwachstums und für die Verbindungen

18b, 22a und 27d eine Inhibition des Neisserienwachstums beobachtet werden. Es bleibt allerdings

offen, ob dies auf eine Mip-Inhibition zurückzuführen ist. Eine mögliche Inhibition der Mip-PPIase

von B. pseudomallei wurde für alle Pipecolinsäure-Derivate 18-38, 42 und 44 untersucht. Eine

Enzymhemmung, die größer war als die von Rapamycin, wurde für die Verbindungen 12a, 18a, 22a,

27c und 27d beobachtet.

106 ALLGEMEINER TEIL

ALLGEMEINER TEIL 107

5 SUMMARY

The present work focused on the synthesis and characterization of potential inhibitors of the surface

protein Mip of Legionella pneumophila. The gram-negative microorganism is the causative agent of

Legionellosis, which may occur in two different progressive forms, the Pontiac fever, a flu-like

respiratory disease, and the Legionnaires disease, a severe pneumonia with mortality rate of up to

30 %. Natural and man-made fresh water systems provide a biological habitat to the bacteria. From

this environment they were transmitted into humans via technical vectors such as showers or air

conditioners by inhaling the contaminated aerosols. Within the human lung, they affect alveolar

macrophages and cause a pulmonary infection. Though, to affect the alveolar macrophages the

microorganisms have first to cross the alveolar barrier, which consists of epithelial cells and an

extracellular matrix. For this, the surface protein Mip, which represents the main virulence factor of

the bacterium, is responsible. Mip forms a stable homodimer, which consists of two domains, a C-

and an N-domain. While the N-terminus is responsible for the dimerization of the protein, the C-

terminus exhibits the typical folding of a peptidyl-prolyl-cis/trans-isomerase (PPIase). The

comparison of the amino acid sequence of the Mip-C-domain and the domain of different human

PPIases shows a particularly high homology to FKBP12. This human PPIase belongs to the family of

the FK506 binding proteins and plays an important role within the human immune system.

Remarkably, known immunosuppressive FKBP12-inhibitors such as FK506 and Rapamycin are also

able to inhibit the bacterial Mip. Furthermore, it was observed that the C-terminal Mip-PPIase binds

to collagen IV, the main component of the human lung, and therefore, Mip is responsible for the

transmigration of Legionella. Due to this fact, Mip-inhibitors should prevent a Legionellosis.

To verify this hypothesis, the intention of this work was to develop novel lead structures for Mip-

PPIase-inhibitors. By means of molecular modeling studies based on the NMR structure 2VCD N,N-

dimethylbenzenesulfonamide was identified as a potential lead structure. Therefore, this compound

as well as analogues, containing structural variations of the sulfonamide side chain or the aromatic

residue, were aimed to prepare (see Fig. 1).

Although the macrolides FK506 and Rapamycin inhibit Mip, they cannot be used for the treatment of

Legionellosis due to their immunosuppressive effects. Compared to N,N-dimethylbenzene-

sulfonamide the macro cyclic, immunosuppressive drugs consist of two structural domains, a binding

domain and an effector domain. The binding domain with the pipecolic acid feature is responsible for

the interactions with Mip and FKBP12, respectively, whereas the effector domain, the aliphatic part

of the molecule, causes the immunosuppression by forming a ternary complex. Therefore,

compounds of the pipecolic acid type cannot affect an immunosuppression and thus, represent

optimal, novel lead structures.

108 ALLGEMEINER TEIL

Due to this fact, the two common, non-immunosuppressive FKBP12-inhibitors A and B were ana-

lyzed by means of different docking studies with the result that only compound B is able to interact

with Mip. Therefore, it was assumed that B must be a potential Mip-inhibitor. To verify this hypo-

thesis, both compounds A and B as well as a hybrid of them should be prepared (see Fig. 2).

Fig. 1: Synthesized compounds 1-6 (based on the lead structure of N,N-dimethylbenzenesulfonamide)

Despite different optimizing strategies, the reported synthetic route for compound A could not be

reproduced. Therefore, a novel strategy has been developed, but did not result in the exact structure

of A. However, compared to structure A the synthesized compound 18a was missing only one

methylene residue in the α-ketoamide side chain. Compound B could be prepared in the racemic

form 22a as well as in the enantiopure form 22b (see Fig. 2).

In addition to these compounds, further variations of the sulfonamide substituent or the ester residue

were prepared (see Fig. 3).

To determine the interaction with Mip, all synthesized compounds were analyzed by means of an in

vitro enzyme assay. For this, the reaction rates of the PPIase catalyzed cis/trans-isomerization were

determined and the corresponding IC50 values calculated. During the in vitro studies, it was observed

that only pipecolic acid compounds of the sulfonamide type B inhibit the Mip-PPIase, the most

promising compounds are 22b (IC50 = 6.0 µM), 23a (IC50 = 6.8 µM) und 24a (IC50 = 5.8 µM) (see

Fig. 4).

ALLGEMEINER TEIL 109

Fig. 2: Synthetic routes to the derivatives A and B

The structural comparison of these three compounds with the other synthesized pipecolic acid

derivatives showed that the benzyl ring of the sulfonamide side chain is essential for Mip-inhibition.

The aromatic residue could be non-substituted or monosubstituted with a chloride in para position.

The replacement with a phenyl substituent is possible, but results in less active compounds. The

replacement of the sulfonamide with a carbonamide structure results also in a loss of activity. The

alkyl chain length of the ester function has no influence on the Mip-inhibition. The ester residue must

consist of a terminal aromatic domain, which is connected with the piperidine ring by an alkyl linker

(n = 1-5).

110 ALLGEMEINER TEIL

Fig. 3: Synthesized pipecolic acid derivatives 19-37 (based on the lead structure of compound 22a)

Fig. 4: Pipecolic acid derivatives with the lowest IC50 values

ALLGEMEINER TEIL 111

To determine the inhibitor-protein binding, compounds 1a, 12a, 22a and 22b were analyzed by

means of HSQC-NMR experiments. During these studies, the small sulfonamide 1a showed no

interaction with Mip, and it was therefore assumed that the compounds 1-6 do not fill sufficient the

Mip-cavity and thus, exhibit not enough activity for inhibition. In contrast, all three pipecolic acid

derivatives 12a, 22a and 22b interact with Mip, which verifies the results of the enzyme assay.

Furthermore, for compound 22b an in vivo determination of growth inhibition of Legionella by

means of a Gentamicin infection assay was carried out. After incubation of macrophages with

microorganisms and compound 22b no reduced number of bacteria in the cellular interior was

observed, which means the pipecolic acid derivative 22b has no significant influence on the

Legionella infection in vivo. One reason for the excellent in vitro and the deficient in vivo activity is

that Mip as an entire molecule, but not its PPIase-activity is responsible for inhibition. As a result,

further studies are directed to elucidate the functional correlation between Mip and its PPIase.

Mip-like proteins are also identified in species of bacteria such as Chlamydia trachomatis, Neisseria

gonorrhoeae and Burkholderia pseudomallei. Preliminary in vivo studies showed an inhibition of the

Chlamydia growth mediated by compound 22a and of the Neisseria growth mediated by compounds

18b, 22a, und 27d. However, it remains to be elucidated, whether these results are related to a Mip-

inhibition. For all pipecolic acid compounds 18-38, 42 and 44 enzymatic studies were carried out to

evaluate the inhibition of the Mip-PPIase of B. pseudomallei. An enzymatic inhibition, which was

greater than that of Rapamycin, was shown for the compounds 12a, 18a, 22a, 27c and 27d.

112 ALLGEMEINER TEIL

EXPERIMENTELLER TEIL 113

6 EXPERIMENTELLER TEIL

6.1 Allgemeine Angaben

6.1.1 Verwendete Geräte

Schmelzpunkte: Schmelzpunktapparatur MPD350:BM 3.5

Fa. Sanyo Gallenkamp B.V., Etten-Leur, Holland

Alle angegebenen Schmelzpunkte sind unkorrigiert.

IR-Spektren: Jasco FT-IR-Spektrometer

Fa. Jasco Labor- und Datentechnik GmbH, Gross-Umstadt, Deutschland

Alle Spektren wurden mit einer Diamant-ATR-Einheit aufgenommen.

1H-NMR-Spektren: Bruker Kernresonanzspektrometer Avance 400 (400.132 MHz)

Fa. Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, Deutschland

Als interner Standard werden die Mittelpunkte der Signale der deuterierten Lösungsmittel verwendet

(CDCl3: 7.26 ppm; DMSO-d6: 2.50; CD3CN: 1.94 ppm).

13C-NMR-Spektren: Bruker Kernresonanzspektrometer Avance 400 (100.613 MHz)

Fa. Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, Deutschland

Als interner Standard werden die Mittelpunkte der Signale der deuterierten Lösungsmittel verwendet

(CDCl3: 77.16 ppm; DMSO-d6: 39.52; CD3CN: 1.32 ppm).

Folgende Abkürzungen werden für die Beschreibung der Multiplizitäten der 1H-, bzw.

13C-Spektren

verwendet:

H-, bzw. C-aromat. = aromatisches Proton bzw. C-Atom, s = Singulett, d = Dublett, dd = Dublett

vom Dublett, ddd = Dublett vom Dublett vom Dublett, dt = Dublett vom Triplett, dq = Dublett vom

Quartett, t = Triplett, td = Triplett vom Dublett, q = Quartett, p = Pentett, sext. = Sextett, sept. =

Septett, m = Multiplett, br = breites Signal.

Die chemischen Verschiebungen sind in ppm, die Kopplungskonstanten J in Hz angegeben.

Mikrowelle: Milestone MLS-Ethos 1600

Fa. Mikrowellen-Laborsysteme, Leutkirch, Deutschland

114 EXPERIMENTELLER TEIL

Reaktionen im offenen System wurden in einem Dreihalskolben und Reaktionen im geschlossenen

System in einem Bombenrohr aus Polytetrafluorethylen (PTFE, 3.0 cm Innendurchmesser, 18 cm

Länge) ummantelt mit einem Polyetheretherketon (PEEK) durchgeführt.

Zur Absorptionssteigerung von Mikrowellenstrahlen wurden bei Reaktionen mit apolaren

Lösungsmitteln Weflon-Scheiben (PTFE mit 100 % Graphit) oder Siliciumcarbid hinzugefügt.

6.1.2 Chromatographie

Dünnschichtchromatographie (DC): DC-Alufolien Kieselgel 60 F254, Fa. Merck, Darmstadt,

Deutschland

DC-Fertigplatten SIL G-25 UV254, Fa. Machery-Nagel,

Düren, Deutschland

DC-Alufolie ALOX N/UV254, Fa. Machery-Nagel, Düren,

Deutschland

Säulenchromatographie (SC): Kieselgel 60, 0.063-0.2 mm (70-320 mesh), Fa. Merck,

Darmstadt, Deutschland

MN-Aluminiumoxid, neutral, Fa. Machery-Nagel, Düren,

Deutschland

Sprühreagenzien: 1. Dimethylaminobenzaldehyd-Lösung R 2 (Ehrlichs-

Reagenz): 0.2 g 4-Dimethylaminobenzaldehyd R werden

ohne Erwärmen in einer Mischung von 4.5 ml Wasser R und

5.5 ml Salzsäure R gelöst.

2. Kaliumpermanganat-Lösung R: 0.3 g Kalium-

permanganat R werden in 100 ml Wasser gelöst.

3. Ninhydrin-Lösung R: 0.2 g Ninhydrin R werden in

100 ml einer Lösung von 5 Volumenteilen verdünnter

Essigsäure R und 95 Volumenteilen 1-Butanol R gelöst.

Alle Sprühreagenzien wurden nach den allgemeinen Vorschriften des Ph. Eur. 5.0 hergestellt.

EXPERIMENTELLER TEIL 115

6.1.3 Chemikalien und Lösungsmittel

Chemikalien und Lösungsmittel wurden von folgenden Firmen bezogen:

Acros Organics, Geel, Belgien

Bachem Distribution Services GmbH, Weil am Rhein, Deutschland

Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Deutschland

Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland

VWR International, Darmstadt, Deutschland

Bei allen Reaktionen wurde ausschließlich demineralisiertes Wasser verwendet.

CH2Cl2 wurde 24 h über CaCl2 chemisch getrocknet, anschließend über P2O5 zum Sieden erhitzt und

destilliert. Et2O wurde mehrere Tage über CaCl2 chemisch getrocknet, anschließend über NaH zum

Sieden erhitzt und destilliert. Dioxan wurde 2 h über Na/K-Legierung unter Rückfluss erhitzt und

anschließend destilliert. DMF wurde über P2O5 bei 40 mbar destilliert. EtOH wurde über

Magnesiumspänen zum Sieden erhitzt und danach destilliert. THF wurde 2 h über Na/K-Legierung

unter Rückfluss erhitzt, anschließend destilliert und über frisch gepresstem Na-Draht aufbewahrt.

116 EXPERIMENTELLER TEIL

6.1.4 Abkürzungen

Äq.: Äquivalente

äq.: äquatorial

abs.: absolutiert

ax.: axial

aromat.: aromatisch

(BOC)2O: Di-tert-butyldicarbonat

DCC: Dicyclohexylcarbodiimid

dem.: demineralisiert

DMAP: Dimethylaminopyridin

DMF: Dimethylformamid

DMSO: Dimethylsulfoxid

Et3N: Triethylamin

Et2O: Diethylether

EtOAc: Essigsäureethylester

EtOH: Ethanol

FS: Feststoff

ges.: gesättigt

Lit.: Literatur

konz.: konzentriert

MeI: Methyliodid

MeOH: Methanol

NMM: N-Methylmorpholin

PE: Petrolether 40-60

PPA: n-Propylphosphonsäureanhydrid

RT: Raumtemperatur

Smp.: Schmelzpunkt

THF: Tetrahydrofuran

Verb.: Verbindung

EXPERIMENTELLER TEIL 117

6.2 Synthesevorschriften und analytische Daten

6.2.1 Darstellung der Sulfonsäureamid-Derivate 1-6

6.2.1.1 Synthese der Phenylsulfonsäureamide 1a-1p

Allgemeine Vorschrift zur Synthese der Verbindungen 1a-1p:

1 Äq (5.7 mmol) Phenylsulfonsäurechlorid wird unter Argonatmosphäre in 40 ml abs. THF gelöst,

anschließend 3 Äq (17.1 mmol) Et3N und nach 10 min 3 Äq (17.1 mmol) des entsprechenden Amins

(siehe Tabelle 11) zugetropft. Der Reaktionsansatz wird 40 h bei RT gerührt und nach vollständiger

Umsetzung (DC-Kontrolle, siehe Tabelle 11) das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der ölige

Rückstand wird in 50 ml CHCl3 suspendiert und dreimal mit je 50 ml wässriger 2 M HCl-Lösung

sowie dreimal mit je 50 ml dem. H2O gewaschen. Die organische Phase wird über Na2SO4 getrocknet

und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.

118 EXPERIMENTELLER TEIL

Summen-

formel Mr

[g/mol] Edukt

DC-Kontrolle (Kieselgel)

1a93

C8H11NO2S 185.24 Dimethylamin Cyclohexan : EtOAc = 80:20;

Rf = 0.31

1b93

C11H15NO2S 225.31 Piperidin Cyclohexan : EtOAc = 90:10;

Rf = 0.17

1c94

C10H13NO2S 211.28 Pyrrolidin Cyclohexan : EtOAc = 90:10;

Rf = 0.10

1d95

C14H15NO2S 261.34 2-Phenylethylamin Cyclohexan : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.71

1e96

C14H15NO2S 261.34 S-1-Phenylethylamin Cyclohexan : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.71

1f97

C9H9NO2S 195.24 Propargylamin Cyclohexan : EtOAc = 90:10;

Rf = 0.14

1g98

C9H13NO2S 199.27 Propylamin Cyclohexan : EtOAc = 90:10;

Rf = 0.15

1h99

C8H11NO2S 185.24 Ethylamin Cyclohexan : EtOAc = 80:20;

Rf = 0.17

1i100

C9H13NO2S 199.27 Isopropylamin Cyclohexan : EtOAc = 80:20;

Rf = 0.23

1j101

C11H15NO2S 225.31 Cyclopentylamin Cyclohexan : EtOAc = 80:20;

Rf = 0.29

1k102

C14H15NO3S 277.34 4-Methoxybenzylamin Cyclohexan : EtOAc = 80:20;

Rf = 0.19

1l102

C14H15NO2S 261.34 4-Methylbenzylamin Cyclohexan : EtOAc = 80:20;

Rf = 0.28

1m103

C9H11NO2S 197.25 Cyclopropylamin Cyclohexan : EtOAc = 80:20;

Rf = 0.23

1n104

C10H14N2O2S 226.30 Piperazin EtOH : Et3N = 95:5;

Rf = 0.33

1o105

C14H15NO2S 261.34 N-Benzylmethylamin Cyclohexan : EtOAc = 70:30;

Rf = 0.56

1p106

C16H16N2O2S 300.38 Tryptamin Cyclohexan : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.59

Tabelle 11: Analytische Daten der Verbindungen 1a-1p

Smp. [°C] Ausbeute [%] Aussehen

1a93

- 80; (Lit. 87)107

klares Öl; (Lit. FS)107

1b93

93; (Lit. 92)108

94; (Lit. 95)108

weißes Pulver; (Lit. FS)108

1c94

155; (Lit. 156)109

75; (Lit. 80)109

weißes Pulver; (Lit. FS)109

1d95

68; (Lit. 60)109

95; (Lit. 98)109

gelbes Pulver; (Lit. FS)109

1e96

105; (Lit. 97)110

95; (Lit. 89)110

gelbes Pulver; (Lit. FS)110

1f97

(Lit. 43)111

91; (Lit. 15)111

gelbes Öl; (Lit. FS)111

1g98

- 98 klares Öl

1h99

- 86 braunes Öl

1i100

- 94 gelbes Öl; (Lit. Öl)100

1j101

(Lit. 69)101

96; (Lit. 13)111

braunes Öl; (Lit. Öl)111

1k102

74; (Lit. 74)112

90; (Lit. 84)102

gelbes Pulver; (Lit. FS)112

1l102

89 98; (Lit. 83)102

gelbes Pulver

1m103

- 95; (Lit. 66)113

rotes Öl; (Lit. Öl)113

1n104

110; (Lit. 109)104

97; (Lit. 62)114

weißes Pulver

EXPERIMENTELLER TEIL 119

Smp. [°C] Ausbeute [%] Aussehen

1o105

93; (Lit. 93)105

97; (Lit. 84)105

weißes Pulver; (Lit. FS)105

1p106

87; (Lit. 89)106

55; (Lit. 90)106

braunes Pulver

Tabelle 12: Analytische Daten der Verbindungen 1a-1p

Die IR-, 1H-NMR-, und

13C-NMR-Daten zu 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, 1h, 1j, 1k, 1l, 1m, 1n, 1o

entsprechen den Literaturstellen107, 108, 109, 110, 111, 115, 112, 116, 113, 114, 106

.

IR [cm-1

]:

1a: 682; 732; 950; 1090; 1162; 1255; 1332; 1445; 2961; 3029;

1b: 685; 737; 1030; 1092; 1157; 1252; 1315; 1444; 2837; 3060;

1c: 645; 751; 1011; 1092; 1155; 1333; 1448; 2858; 2978; 3074;

1d: 685; 727; 1030; 1092; 1155; 1252; 1315; 1444; 2835; 3060; 3277;

1e: 685; 727; 1030; 1092; 1157; 1254; 1315; 1444; 2839; 3060; 3275;

1f: 687; 728; 1030; 1056; 1092; 1154; 1320; 1429; 2923; 2960; 3252;

1g: 688; 753; 998; 1072; 1093; 1155; 1320; 1446; 2967; 3065; 3280;

1h: 690; 758; 943; 1054; 1089; 1156; 1321; 1447; 2978; 3062; 3247;

1i: 689; 755; 995; 1072; 1092; 1156; 1322; 1446; 2975; 3066; 3277;

1j: 686; 753; 908; 1024; 1089; 1147; 1309; 1446; 2963; 3060; 3250;

1k: 690; 758; 1030; 1092; 1155; 1252; 1315; 1444; 2966; 3060; 3277;

1l: 685; 725; 1039; 1092; 1155; 1253; 1317; 1444; 2926; 3035; 3265;

1m: 687; 716; 954; 1093; 1154; 1323; 1446; 1595; 2962; 3035; 3243;

1n: 687; 739; 945; 1093; 1157; 1320; 1444; 1597; 2929; 3060; 3238;

1o: 695; 737; 940; 1089; 1157; 1336; 1448; 1585; 2945; 3035;

1p: 680; 735; 940; 1100; 1160; 1303; 1446; 1636; 3054; 3245; 3406;

1H-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

1a: (CDCl3): 7.82-7.72 (m, 2H, H-a, H-e); 7.63-7.49 (m, 3H, H-b, H-c, H-d); 2.69 (s, 6H, H-1);

1b: 7.76-7.58 (m, 5H, H-a, H-b, H-c, H-d, H-e); 2.90-2.84 (m, 4H, H-1, H-5); 1.57-1.48 (m, 4H,

H-2, H-4); 1.38-1.31 (m, 2H, H-3);

1c: 7.87-7.76 (m, 2H, H-a, H-e); 7.74-7.68 (m, 1H, H-c); 7.66-7.61 (m, 2H, H-b, H-d); 3.16-

3.12 (m, 4H, H-1, H-4); 1.65-1.61 (m, 4H, H-2, H-3);

1d: 7.80-7.76 (m, 2H, H-a, H-e); 7.72-7.68 (m, 1H, H-g); 7.66-7.52 (m, 3H, H-b, H-c, H-d);

7.29-7.10 (m, 5H, H-aromat.); 2.99-2.91 (m, 2H, H-1); 2.66 (t, 2H, 3J = 7.5, H-2);

1e: 8.19 (d, 1H, 3

J = 7.5, H-g); 7.70-7.66 (m, 2H, H-a, H-e); 7.57-7.42 (m, 3H, H-b, H-c, H-d);

7.22-7.10 (m, 5H, H-aromat.); 4.35 (p, 1H, 3J = 7.5, H-2); 1.16 (d, 3H,

3J = 7.5, H-1);

120 EXPERIMENTELLER TEIL

1f: 8.15-8.10 (m, 1H, H-g); 7.86-7.76 (m, 2H, H-a, H-e); 7.68-7.54 (m, 3H, H-b, H-c, H-d);

3.72-3.67 (m, 2H, H-1); 3.03-3.00 (m, 1H, H-3);

1g: 8.07-7.71 (m, 2H, H-a, H-e); 7.66-7.52 (m, 4H, H-b, H-c, H-d, H-g); 2.72-2.65 (m, 2H,

H-1); 1.36 (sext., 2H, 3J = 7.3, H-2); 0.78 (t, 3H,

3J = 7.3, H-3);

1h: 7.89-7.73 (m, 2H, H-a, H-e); 7.66-7.52 (m, 4H, H-b, H-c, H-d, H-g); 2.82-2.73 (m, 2H,

H-1); 0.96 (t, 3H, 3J = 7.2, H-2);

1i: 7.93-7.68 (m, 2H, H-a, H-e); 7.63-7.51 (m, 4H, H-b, H-c, H-d, H-g); 3.27-3.14 (m, 1H,

H-1); 0.91 (d, 6H, 3J = 6.5, H-2);

1j: 7.84-7.76 (m, 2H, H-a, H-e); 7.65-7.54 (m, 4H, H-b, H-c, H-d, H-g); 3.39 (sext., 1H,

3J = 6.8, H-1); 1.62-1.46 (m, 4H, äq., H-2, H-3, H-4; H-5); 1.43-1.21 (m, 4H, ax., H-2, H-3,

H-4; H-5);

1k: 8.04 (t, 1H, 3J = 6.2, H-g); 7.81-7.76 (m, 2H, H-a, H-e); 7.67-7.53 (m, 3H, H-b, H-c, H-d);

7.12 (d, 2H, 3J = 8.7, H-3, H-8); 6.82 (d, 2H,

3J = 8.7, H-4, H-7); 3.90 (d, 2H,

3J = 6.2, H-1);

3.70 (s, 3H, H-6);

1l: 8.08 (t, 1H, 3J = 6.0, H-g); 7.82-7.76 (m, 2H, H-a, H-e); 7.67-7.53 (m, 3H, H-b, H-c, H-d);

7.13-7.05 (m, 4H, H-3, H-4, H-7, H-8); 3.92 (d, 2H, 3J = 6.0, H-1); 2.25 (s, 3H, H-6);

1m: 7.90-7.88 (m, 1H, H-g); 7.84-7.79 (m, 2H, H-a, H-e); 7.69-7.57 (m, 3H, H-b, H-c, H-d);

2.13-2.05 (m, 1H, H-1); 0.51-0.43 (m, 2H, H-2, H-3); 0.34-0.38 (m, 2H, H-2, H-3);

1n: 7.76-7.56 (m, 5H, H-a, H-b, H-c, H-d, H-e); 2.79-2.74 (m, 4H, H-1, H-5); 2.73-2.68 (m, 4H,

H-2, H-4); 2.18 (br, 1H, H-3);

1o: 7.91-7.82 (m, 2H, H-a, H-e); 7.77-7.63 (m, 3H, H-b, H-c, H-d); 7.40-7.27 (m, 5H,

H-aromat.); 4.14 (s, 2H, H-2); 2.54 (s, 3H, H-1);

1p: 10.80 (s, 1H, H-5); 7.84-7.78 (m, 2H, H-a, H-c); 7.74 (t, 1H, 3J = 5.8, H-g); 7.65-7.54 (m,

3H, H-b, H-c, H-d); 7.37 (d, 1H, 3

J = 8.0, H-10); 7.32 (d, 1H, 3J = 8.0, H-7); 7.12-7.10 (m,

1H, H-4); 7.04 (t, 1H, 3J = 8.0, H-9); 6.95 (t, 1H,

3J = 8.0, H-8); 3.06-2.96 (m, 2H, H-1);

2.82-2.76 (m, 2H, H-2);

13C-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

1a: (CDCl3): 135.5 (C-f); 132.6 (C-c); 129.0 (C-b, C-d); 127.6 (C-a, C-e); 37.9 (C-1);

1b: 135.3 (C-f); 132.7 (C-c); 129.0 (C-b, C-d); 127.1 (C-a, C-e); 46.3 (C-1, C-5); 24.4 (C-2,

C-4); 22.5 (C-3);

1c: 135.7 (C-f); 132.5 (C-c); 128.9 (C-b, C-d); 126.7 (C-a, C-e); 47.3 (C-1, C-4); 24.2 (C-2,

C-3);

1d: 140.3 (C-f); 138.6 (C-3); 132.3 (C-c); 129.1 (C-b, C-d); 128.5 (C-5, C-7); 128.2 (C-4, C-8);

126.4 (C-a, C-e); 126.1 (C-6); 44.0 (C-1); 35.2 (C-2);

1e: 142.8 (C-f); 141.0 (C-3); 131.5 (C-c); 128.3 (C-b, C-d); 127.5 (C-5, C-7); 126.2 (C-6);

125.8 (C-a, C-e); 125.5 (C-4, C-8); 52.3 (C-2); 23.0 (C-1);

EXPERIMENTELLER TEIL 121

1f: 139.5 (C-f); 132.0 (C-c); 128.6 (C-b, C-d); 126.1 (C-a, C-e); 78.8 (C-2); 74.1 (C-3); 31.4

(C-1);

1g: 140.1 (C-f); 131.7 (C-c); 128.7 (C-b, C-d); 125.9 (C-a, C-e); 43.8 (C-1); 21.9 (C-2); 10.6

(C-3);

1h: 140.5 (C-f); 132.2 (C-c); 129.1 (C-b, C-d); 126.3 (C-a, C-e); 37.4 (C-1); 14.6 (C-2);

1i: 141.4 (C-f); 131.6 (C-c); 128.6 (C-b, C-d); 125.8 (C-a, C-e); 44.7 (C-1); 22.6 (C-2);

1j: 141.5 (C-f); 132.1 (C-c); 129.0 (C-b, C-d); 126.3 (C-a, C-e); 54.3 (C-1); 32.3 (C-2, C-5);

22.7 (C-3, C-4);

1k: 158.3 (C-5); 140.7 (C-f); 132.2 (C-c); 129.3 (C-2); 129.0 (C-b, C-d); 128.8 (C-3, C-8);

126.3 (C-a, C-e); 113.5 (C-4, C-7); 55.0 (C-1); 45.6 (C-6);

1l: 140.8 (C-f); 136.2 (C-2); 134.5 (C-5); 132.3 (C-c); 129.1 (C-b, C-d); 128.7 (C-3, C-8);

127.5 (C-4, C-7); 126.4 (C-a, C-e); 45.9 (C-1); 20.6 (C-6);

1m: 140.3 (C-f); 132.4 (C-c); 129.1 (C-b, C-d); 126.7 (C-a, C-e); 24.1 (C-1); 5.1 (C-2, C-3);

1n: 134.3 (C-f); 132.6 (C-c); 128.8 (C-b, C-d); 127.0 (C-a, C-e); 46.2 (C-1, C-5); 44.2 (C-2,

C-4);

1o: 136.5 (C-f); 135.5 (C-3); 132.5 (C-c); 129.0 (C-b, C-d); 128.0 (C-5, C-7); 127.6 (C-4, C-8);

127.2 (C-6); 126.6 (C-a, C-e); 52.8 (C-2); 33.9 (C-1);

1p: 140.5 (C-f); 136.1 (C-6), 132.2 (C-c); 129.1 (C-b, C-d); 126.8 (C-11); 126.3 (C-a, C-e);

122.8 (C-4); 120.8 (C-9); 118.2 (C-8); 117.8 (C-10); 111.3 (C-7); 110.8 (C-3); 43.3 (C-1);

25.0 (C-2);

6.2.1.2 Synthese der N,N-disubstituierten Phenylsulfonsäureamide 2a-2c

Allgemeine Vorschrift zur Synthese der Verbindungen 2a-2c:

1 Äq (4.0 mmol) des sekundären Amins (Verbindungen 1, siehe Tabelle 13) wird unter

Argonatmosphäre in 30 ml abs. DMF gelöst, anschließend 6 Äq (24 mmol) Kalium-t-butylat und

nach 10 min langsam 10 Äq (40 mmol) MeI zugegeben. Dieser Reaktionsansatz wird 3 h bei RT

122 EXPERIMENTELLER TEIL

gerührt und nach vollständiger Umsetzung (DC-Kontrolle, siehe Tabelle 13) das Lösungsmittel im

Vakuum entfernt. Der ölige Rückstand wird in 40 ml CHCl3 suspendiert und dreimal mit je 30 ml

wässriger 6 M HCl-Lösung, sowie dreimal mit je 30 ml dem. H2O gewaschen. Die organische Phase

wird über Na2SO4 getrocknet, das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Rohprodukt

anschließend säulenchromatographisch (siehe Tabelle 13) gereinigt.

Summen-

formel Mr

[g/mol] Edukt

DC bzw. SC (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aussehen

2a117

C9H13NO2S 199.27 1h Cyclohexan : EtOAc = 80:20;

Rf = 0.45 61 klares Öl

2b100

C10H15NO2S 213.30 1g Cyclohexan : EtOAc = 80:20;

Rf = 0.38 37 klares Öl

2c100

C10H15NO2S 213.30 1i Cyclohexan : EtOAc = 70:30;

Rf = 0.51

26;

(Lit. 85)100

klares Öl

Tabelle 13: Analytische Daten der Verbindungen 2a-2c

IR [cm-1

]:

2a: 690; 734; 993; 1089; 1160; 1223; 1335; 1446; 2977; 3065;

2b: 690; 730; 961; 1091; 1155; 1214; 1336; 1446; 2967; 3065;

2c: 691; 729; 947; 1089; 1147; 1221; 1331; 1446; 2978; 3065;

1H-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

2a: 7.79-7.73 (m, 2H, H-a, H-e); 7.72-7.59 (m, 3H, H-b, H-c, H-d); 3.01 (q, 2H, 3J = 7.2, H-2);

2.65 (s, 3H, H-1); 1.02 (t, 3H, 3J = 7.2, H-3);

2b: (CDCl3): 7.80-7.76 (m, 2H, H-a, H-e); 7.60-7.47 (m, 3H, H-b, H-c, H-d); 2.96 (t, 2H,

3J = 7.4, H-2); 2.72 (s, 3H, H-1); 1.55 (sext., 2H,

3J =7.4, H-3); 0.91 (t, 3H,

3J =7.4, H-4);

2c: (CDCl3): 7.83-7.78 (m, 2H, H-a, H-e); 7.60-7.44 (m, 3H, H-b, H-c, H-d); 4.22 (sept., 1H,

3J = 6.7, H-2); 2.71 (s, 3H, H-1); 0.97 (d, 6H,

3J = 6.7, H-3);

13C-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

2a: 137.1 (C-f); 132.7 (C-c); 129.3 (C-b, C-d); 127.0 (C-a, C-e); 44.4 (C-2); 33.8 (C-1); 12.7

(C-3);

2b: 137.0 (C-f); 132.7 (C-c); 129.3 (C-b, C-d); 126.9 (C-a, C-e); 51.2 (C-2); 34.3 (C-1); 20.2

(C-3); 10.8 (C-4);

2c: 139.2 (C-f); 132.5 (C-c); 129.3 (C-b, C-d); 126.6 (C-a, C-e); 48.2 (C-2); 27.1 (C-1); 19.0

(C-3);

EXPERIMENTELLER TEIL 123

6.2.1.3 Synthese von N-Benzylphenylsulfonsäureamid 3118

Methode 1:

2.0 g (12.7 mmol) Phenylsulfonsäureamid werden unter Argonatmosphäre in 50 ml abs. THF gelöst,

mit Trockeneis auf -70 °C abgekühlt und langsam 0.8 g (12.7 mmol) n-Butyl-Lithium zugetropft.

Anschließend wird die Mischung 10 min bei -70 °C gerührt und danach auf RT erwärmt. 1.6 g

(12.7 mmol) Benzylchlorid werden bei RT zugetropft und 6 h bei RT gerührt. Danach werden 50 ml

dem. H2O zugegeben und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der organische Rückstand wird in

30 ml dem. H2O suspendiert und dreimal mit je 30 ml CH2Cl2 extrahiert. Die vereinigten organischen

Phasen werden über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt

wird anschließend säulenchromatographisch gereinigt (Kieselgel; Cyclohexan : EtOAc = 1 : 1;

Rf = 0.71) und man erhält 0.03 g (0.1 mmol) von Verbindung 3 in Form eines weißen Öls.

Summenformel: C13H13NO2S

Mr = 247.31 g/mol

Ausbeute: 1 %

Aussehen: weißes Öl

Methode 2:

0.5 g (3.2 mmol) Phenylsulfonsäureamid, 0.44 g (3.2 mmol) K2CO3 und 0.4 g (3.2 mmol)

Benzylchlorid werden in einem Bombenrohr in 40 ml MeOH gelöst, langsam in 9 min auf 100 °C in

der Mikrowelle erhitzt und 3 h bei 100 °C gerührt. Danach wird das Lösungsmittel im Vakuum

entfernt und das Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt (Kieselgel; Cyclohexan : EtOAc =

80 : 20; Rf = 0.28). Man erhält 0.17 g (0.7 mmol) von Verbindung 3 in Form eines weißen Pulvers.

Smp. = 89 °C (Lit. 87 °C)118

Ausbeute: 22 % (Lit. 33 %)109

Aussehen: weißes Pulver (Lit. FS)109

Die 1H-NMR-, und

13C-NMR-Daten zu 3 entsprechen der Literaturstelle

109.

124 EXPERIMENTELLER TEIL

IR [cm-1

]: 687; 749; 837; 1059; 1093; 1149; 1324; 1416; 1447; 2930; 3055; 3327;

1H-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

8.14 (br, 1H, H-g); 7.81-7.77 (m, 2H, H-a, H-e); 7.67-7.52 (m, 3H, H-b, H-c, H-d); 7.31-7.17 (m,

5H, H-aromat.); 3.98 (s, 2H, H-1);

13C-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

140.2 (C-f); 137.1 (C-2); 131.8 (C-c); 128.6 (C-b, C-d); 127.7 (C-4, C-6); 127.0 (C-3, C-7); 126.6

(C-5); 125.9 (C-a, C-e); 45.6 (C-1);

6.2.1.4 Synthese der N,N-Dimethylsulfonsäureamide 4a-4e

Allgemeine Vorschrift zur Synthese der Verbindungen 4a-4e:

1 Äq (Stoffmenge siehe Tabelle 14) des entsprechenden Sulfonsäurechlorids wird unter

Argonatmosphäre in 40 ml abs. THF gelöst, anschließend 3 Äq (12.3-16.5 mmol) Et3N und nach 10

min 3 Äq (12.3-16.5 mmol) Dimethylamin zugetropft. Der Reaktionsansatz wird 40 h bei RT gerührt

und nach vollständiger Umsetzung (DC-Kontrolle, siehe Tabelle 14) das Lösungsmittel im Vakuum

entfernt. Der ölige Rückstand wird in 50 ml CHCl3 suspendiert, dreimal mit je 50 ml wässriger

EXPERIMENTELLER TEIL 125

2 M HCl-Lösung sowie dreimal mit je 50 ml dem. H2O gewaschen, die organische Phase über

Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.

Summenformel Mr

[g/mol]

Edukt [mmol]

DC-Kontrolle (Kieselgel)

4a C9H10F3NO2S 253.24 3-(Trifluormethyl)phenyl-

sulfonsäurechlorid [4.1]

Cyclohexan : EtOAc = 80:20;

Rf = 0.29

4b119

C8H17NO2S 191.29 Cyclohexylsulfonsäure-

chlorid [5.5]

Cyclohexan : EtOAc = 80:20;

Rf = 0.81

4c120

C8H17NO2S 199.27 Benzylsulfonsäurechlorid

[4.5]

Cyclohexan : EtOAc = 80:20;

Rf = 0.19

4d121

C10H13NO3S 227.28 4-Acetylphenyl-

sulfonsäurechlorid [4.6]

Cyclohexan : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.64

4e122

C8H10N2O4S 230.24 3-Nitrophenyl-

sulfonsäurechlorid [4.5]

Cyclohexan : EtOAc = 80:20;

Rf = 0.78

Tabelle 14: Analytische Daten der Verbindungen 4a-4e

Smp. [°C] Ausbeute [%] Aussehen

4a - 85 gelbes Öl

4b119

- 99 weißes Öl

4c120

102; (Lit. 102)120

72; (Lit. 69)123

gelbes Pulver; (Lit. FS)123

4d121

101; (Lit. 102)121

86 beiges Pulver

4e122

121 92 beiges Pulver

Tabelle 15: Analytische Daten der Verbindungen 4a-4e

Die 1H-NMR-, und

13C-NMR-Daten zu 4c entsprechen der Literaturstelle

123.

IR [cm-1

]:

4a: 651; 734; 955; 1070; 1126; 1159; 1281; 1325; 1430; 2967; 3063;

4b: 707; 795; 965; 1013; 1130; 1197; 1259; 1314; 1446; 2923;

4c: 704; 744; 960; 1049; 1140; 1283; 1317; 1458; 2970; 3062;

4d: 687; 729; 947; 1092; 1157; 1254; 1333; 1444; 2947; 3060; 3238;

4e: 685; 735; 1028; 1085; 1120; 1173; 1273; 1350; 1454; 2927; 3277;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

4a: 8.03 (s, 1H, H-e); 7.97 (d, 1H, 3J = 7.8, H-a); 7.87 (d, 1H,

3J = 7.8, H-c); 7.71 (t, 1H,

3J = 7.8, H-b); 2.75 (s, 6H, H-1);

4b: 3.01-2.86 (m, 7H, H-f, H-1); 2.07 (dd, 2H, 2J = 13.2,

3J = 2.0, äq., H-a, H-e); 1.91-1.82 (m,

2H, H-b, H-d); 1.72-1.65 (m, 1H, H-c); 1.53 (dq, 2H, 2J = 13.2,

3J = 2.0, ax., H-a, H-e);

1.33-1.12 (m, 3H, H-b, H-c, H-d);

4c: (DMSO-d6): 7.49-7.21 (m, 5H, H-a, H-b, H-c, H-d, H-e); 4.39 (s, 2H, H-g); 2.70 (s, 6H,

H-1);

126 EXPERIMENTELLER TEIL

4d: (DMSO-d6): 8.18 (d, 2H, 3J = 8.5, H-b, H-d); 7.89 (d, 2H,

3J = 8.5, H-a, H-e); 2.65 (s, 3H,

H-h); 2.64 (s, 6H, H-1);

4e: (DMSO-d6): 8.55 (ddd, 1H, 3J = 8.0,

4J = 2.2,

4J = 1.0, H-c); 8.39-8.37 (m, 1H, H-e); 8.22-

8.15 (m, 1H, H-a); 7.95 (t, 1H, 3J = 8.0, H-b); 2.68 (s, 6H, H-1);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

4a: 137.2 (C-f); 131.8 (q, 2J = 33.4, C-d); 130.8 (C-a); 129.9 (C-b); 129.3 (q,

3J = 4.0, C-c);

124.6 (q, 3J = 4.0, C-e); 124.3 (q,

1J = 235.0, C-g); 37.8 (C-1);

4b: 60.7 (C-f); 37.8 (C-1); 26.6 (C-a, C-e); 25.2 (C-b, C-d); 25.1 (C-c);

4c: (DMSO-d6): 130.8 (C-a, C-e); 129.5 (C-f); 128.3 (C-b, C-d); 128.0 (C-c); 53.0 (C-g); 37.3

(C-1);

4d: (DMSO-d6): 197.2 (C-g); 139.7 (C-f); 138.4 (C-c); 128.9 (C-b, C-d); 127.7 (C-a, C-e); 37.7

(C-1); 26.7 (C-h);

4e: (DMSO-d6): 147.8 (C-d); 136.3 (C-f); 133.1 (C-a); 131.2 (C-b); 127.4 (C-c); 121.7 (C-e);

37.2 (C-1);

6.2.1.5 Synthese von 3-Amino-N,N-dimethylphenylsulfonsäureamid 5124

1 Äq (4.0 mmol) der Verbindung 4e und 5 Äq (20.0 mmol) SnCl2 x 2 H2O werden unter

Argonatmosphäre in 40 ml abs. EtOH suspendiert und 2 h unter Rückfluss erhitzt. Nach vollständiger

Umsetzung (DC-Kontrolle: Kieselgel; EtOH : Et3N = 95 : 5; Rf = 0.65) werden 30 ml dem. H2O und

danach ges. wässrige NaHCO3-Lösung bis pH 8 zugegeben. Danach wird dreimal mit je 50 ml

EtOAc extrahiert, die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel

im Vakuum entfernt. Man erhält 0.78 g (3.9 mmol) von Verbindung 5 in Form eines beigen Pulvers.

Summenformel: C8H12N2O2S

Mr = 200.26 g/mol

Smp. = 155 °C (Lit. 155 °C)124

EXPERIMENTELLER TEIL 127

Ausbeute: 97 % (Lit. 91 %)124

Aussehen: beiges Pulver

IR [cm-1

]: 687; 724; 953; 1080; 1149; 1311; 1450; 1593; 1628; 2972; 3069; 3374; 3468;

1H-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

7.24 (t, 1H, 3J = 7.9, H-b); 6.92 (s, 1H, H-e); 6.84-6.77 (m, 2H, H-a, H-c); 5.61 (br, 2H, H-g); 2.58

(s, 6H, H-1);

13C-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

149.2 (C-d); 134.7 (C-f); 129.3 (C-b); 117.4 (C-c); 113.8 (C-a); 111.5 (C-e); 37.3 (C-1);

6.2.1.6 Synthese der N-alkylierten 3-Amino-N,N-dimethylphenylsulfonsäureamide

6a-6e

Allgemeine Vorschrift zur Synthese der Verbindungen 6a-6e:

1 Äq (3.0 mmol) der Verbindung 5 wird in 30 ml der entsprechenden Säure (siehe Tabelle 16) gelöst,

5 Äq (15.0 mmol) NaBH4 portionsweise zugegeben und 24 h bei RT gerührt. Nach vollständiger

Umsetzung (DC-Kontrolle, siehe Tabelle 16) werden langsam 30 ml dem. H2O und anschließend

eine wässrige 10 M NaOH-Lösung bis pH 8 zugetropft. Die wässrige Phase wird viermal mit je

30 ml CHCl3 extrahiert, die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet und das

128 EXPERIMENTELLER TEIL

Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch (siehe Tabelle

16) gereinigt.

Summen-

formel Mr

[g/mol] Edukt

DC bzw. SC (Kieselgel)

Smp. [°C]

Aus-

beute [%]

Aus-

sehen

6a C10H16N2O2S 228.31 CH3COOH Cyclohexan : EtOAc =

1:1; Rf = 0.63 - 12

gelbes

Öl

6b C11H18N2O2S 242.34 C2H5COOH Cyclohexan : EtOAc =

80:20; Rf = 0.23 78 30

weißes

Pulver

6c C10H13F3N2O2S 282.28 CF3COOH Cyclohexan : EtOH =

80:20; Rf = 0.17 102 4

weißes

Pulver

6d125

C10H16N2O2S 228.31 HCOOCH Cyclohexan : EtOAc =

80:20; Rf = 0.25

71;

(Lit. 54)125

22

weißes

Pulver

6e C14H24N2O2S 284.42 C2H5COOH Cyclohexan : EtOAc =

80:20; Rf = 0.47 - 9

gelbes

Öl

Tabelle 16: Analytische Daten der Verbindungen 6a-6e

IR [cm-1

]:

6a: 687; 726; 944; 1151; 1320; 1471; 1513; 1600; 2876; 2973; 3072; 3393;

6b: 685; 726; 954; 1155; 1333; 1471; 1495; 1591; 2874; 2956; 3083; 3398;

6c: 687; 728; 953; 1141; 1254; 1294; 1325; 1494; 1603; 2945; 3059; 3387;

6d: 686; 713; 942; 989; 1151; 1189; 1329; 1498; 1596; 2812; 2910; 2977; 3076;

6e: 689; 715; 953; 1160; 1258; 1320; 1471; 1509; 1600; 2873; 2959; 3082;

1H-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

6a: 7.31 (t, 1H, 3J = 7.9, H-b); 6.86-6.79 (m, 3H, H-a, H-c, H-e); 6.16-6.12 (m, 1H, H-NH);

3.12-2.99 (m, 2H, H-g); 2.59 (s, 6H, H-1); 1.17 (t, 3H, 3J = 7.2, H-h);

6b: 7.39 (t, 1H, 3J = 7.9, H-b); 6.86-6.79 (m, 3H, H-a, H-c, H-e); 6.19-6.15 (m, 1H, H-NH);

2.99 (q, 2H, 3J = 7.4, H-g); 2.58 (s, 6H, H-1); 1.56 (sext., 2H,

3J = 7.4, H-h); 0.94 (t, 3H,

3J = 7.4, H-i);

6c: 7.35 (t, 1H, 3J = 7.9, H-b); 7.06-7.01 (m, 2H, H-a, H-e); 6.96-6.92 (m, 1H, H-c); 6.75 (t, 1H,

3J = 7.0, H-NH); 4.01 (dq,

3J = 10.0,

3J = 7.0, 2H, H-g); 2.58 (s, 6H, H-1);

6d: (CDCl3): 7.37 (t, 1H, 3J = 8.0, H-b); 7.13-7.07 (m, 2H, H-a, H-e); 6.98-6.93 (m, 1H, H-c);

3.02 (s, 6H, H-g); 2.72 (s, 6H, H-1);

6e: 7.37 (t, 1H, 3J = 8.0, H-b); 6.93 (d, 1H,

3J = 8.0, H-c); 6.85 (d, 1H,

3J = 8.0, H-a); 6.82-6.78

(m, 1H, H-e); 3.30-3.24 (m, 4H, H-g); 2.59 (s, 6H, H-1); 1.56 (sext., 4H, 3J = 7.4, H-h); 0.94

(t, 6H, 3J = 7.4, H-i);

EXPERIMENTELLER TEIL 129

13C-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

6a: 149.2 (C-d); 134.9 (C-f); 129.5 (C-b); 115.4 (C-c); 113.6 (C-a); 109.8 (C-e); 37.4 (C-1);

37.0 (C-g); 13.9 (C-h);

6b: 149.4 (C-d); 135.1 (C-f); 129.6 (C-b); 115.5 (C-c); 113.6 (C-a); 109.9 (C-e); 44.4 (C-g);

37.6 (C-1); 21.6 (C-h); 11.5 (C-i);

6c: 147.7 (C-d); 134.8 (C-f); 129.3 (C-b); 128.1 (q, 1J = 239.4, C-h); 115.8 (C-a); 115.2 (C-c);

110.2 (C-e); 43.2 (q, 2J = 37.8, C-g); 37.1 (C-1);

6d: (CDCl3): 150.3 (C-d); 135.2 (C-f); 129.6 (C-b); 116.0 (C-c); 114.1 (C-a); 109.6 (C-e); 37.6

(C-1); 26.3 (C-g);

6e: 147.5 (C-d); 134.9 (C-f); 129.4 (C-b); 115.0 (C-c); 112.7 (C-a); 108.6 (C-e); 51.4 (C-g);

37.1 (C-1); 19.3 (C-h); 10.6 (C-i);

6.2.2 Synthese der Piperidin-2-carbonsäureethylester 7a und 7b

Allgemeine Vorschrift zur Synthese der Verbindungen 7a und 7b:

1 Äq (6.4 mmol) der Piperidin-2-carbonsäure bzw. der S-Piperidin-2-carbonsäure wird unter

Argonatmosphäre in 40 ml abs. EtOH gelöst. Unter Rühren werden langsam 3 Äq (19.2 mmol)

SOCl2 zugetropft und die Reaktionsmischung 4 h unter Rückfluss erhitzt. Nach vollständiger

Umsetzung (DC-Kontrolle, siehe Tabelle 17) wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, der ölige

Rückstand in 40 ml ges. wässriger NaHCO3-Lösung suspendiert und viermal mit je 30 ml CHCl3

extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Na2SO4 getrocknet und das

Lösungsmittel im Vakuum entfernt.

Summenformel Mr

[g/mol]

DC-Kontrolle (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aussehen

7a126

C8H15NO2 157.21 Cyclohexan : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.1

90;

(Lit. 60)126

gelbes Öl;

(Lit. Öl)126

7b127

C8H15NO2 157.21 Cyclohexan : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.1

91;

(Lit. 88)127

gelbes Öl

Tabelle 17: Analytische Daten der Verbindungen 7a-7b

130 EXPERIMENTELLER TEIL

In der Literaturstelle128

sind nur 1H-NMR-, und

13C-NMR-Daten von 7a und 7b als Hydrochlorid

angegeben.

IR [cm-1

]:

7a: 1046; 1205; 1370; 1456; 1740; 2695; 2906; 3256;

7b: 1045; 1186; 1371; 1444; 1732; 2854; 2933; 3289;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

7a: 4.05 (q, 2H, 3J = 7.1, H-b); 3.22 (dd, 1H,

3J = 9.8,

3J = 3.0, H-d); 3.01-2.92 (m, 1H, H-h);

2.58-2.49 (m, 1H, H-h); 2.07 (s, 1H, H-i); 1.88-1.80 (m, 1H, H-e); 1.70-1.63 (m, 1H, H-e);

1.49-1.28 (m, 4H, H-f, H-g); 1.15 (t, 3H, 3J = 7.1, H-a);

7b: 4.11 (q, 2H, 3J = 7.1, H-b); 3.28 (dd, 1H,

3J = 9.8,

3J = 3.1, H-d); 3.08-2.98 (m, 1H, H-h);

2.64-2.55 (m, 1H, H-h); 2.02 (s, 1H, H-i); 1.95-1.85 (m, 1H, H-e); 1.78-1.66 (m, 1H, H-e);

1.56-1.30 (m, 4H, H-f, H-g); 1.20 (t, 3H, 3J = 7.1, H-a);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

7a: 173.2 (C-c); 60.3 (C-b); 58.4 (C-d); 45.5 (C-h); 28.9 (C-e); 25.6 (C-g); 23.8 (C-f); 13.9

(C-a);

7b: 173.4 (C-c); 60.6 (C-b); 58.6 (C-d); 45.7 (C-h); 29.1 (C-e); 25.8 (C-g); 24.0 (C-f); 14.1

(C-a);

6.2.3 Synthese von 1-(2-Ethoxy-2-oxoacetyl)piperidin-2-carbonsäureethylester 8

0.96 g (7.0 mmol) Monoethyloxalylchlorid und 1.42 g (14.0 mmol) Et3N werden unter

Argonatmosphäre in 30 ml abs. Dioxan gelöst. 1.1 g (7.0 mmol) der Verbindung 7a werden unter

Argonatmosphäre in 30 ml abs. Dioxan gelöst, unter Rühren zum ersten Reaktionsansatz getropft und

6 h bei RT gerührt. Nach vollständiger Umsetzung (DC-Kontrolle: Kieselgel; Cyclohexan : EtOAc =

EXPERIMENTELLER TEIL 131

1 : 1; Rf = 0.64) wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der ölige Rückstand wird in 30 ml

CHCl3 suspendiert, viermal mit je 30 ml wässriger 2 M HCl-Lösung und danach viermal mit je 30 ml

dem. H2O gewaschen. Die organische Phase wird über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel im

Vakuum entfernt. Man erhält 1.7 g (6.6 mmol) von Verbindung 8 in Form eines braunen Öls.

Summenformel: C12H19NO5

Mr = 257.28 g/mol

Ausbeute: 94 % (Lit. 86 %)129

Aussehen: braunes Öl

Die IR-, und 1H-NMR-Daten zu 8 entsprechen der Literaturstelle

129.

IR [cm-1

]: 1020; 1083; 1258; 1445; 1661; 1738; 2961;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

5.20 (d, 1H, 3J = 5.7, H-d); 4.33 (q, 2H,

3J = 7.1, H-b); 4.26-4.16 (m, 2H, H-k); 3.63-3.56 (m, 1H,

H-h); 3.41-3.31 (m, 1H, H-h); 2.34-2.20 (m, 1H, H-e); 1.81-1.62 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.59-1.24

(m, 8H, H-a, H-f, H-g, H-l);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

170.0 (C-c); 162.8 (C-j); 161.7 (C-i); 62.1 (C-b); 61.5 (C-k); 51.6 (C-d); 44.2 (C-h); 26.4 (C-e); 25.0

(C-g); 21.0 (C-f); 14.2 (C-a); 14.0 (C-l);

6.2.4 Synthese von 3-Methyl-2-oxopentansäure 9

2.0 g (13.0 mmol) 3-Methyl-2-oxopentansäure-Natriumsalz werden in 100 ml dem. H2O gelöst und

konz. HCl bis pH 1 zugegeben. Nach mehrfacher Extraktion mit je 50 ml CHCl3 (DC-Kontrolle:

Kieselgel; PE : EtOAc = 1: 1; Rf = 0.26 (Ehrlich)) werden die vereinigten organischen Phasen über

Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der organische Rückstand wird auf

2 °C abgekühlt und man erhält 1.5 g (11.3 mmol) von Verbindung 9 in Form weißer Nadeln.

132 EXPERIMENTELLER TEIL

Summenformel: C6H10O3

Mr = 130.14 g/mol

Smp. = 46 °C

Ausbeute: 86 % (Lit. 48 %)130

Aussehen: weiße Nadeln (Lit. Öl)130

Die IR-, und 1H-NMR-Daten zu 9 entsprechen der Literaturstelle

130.

IR [cm-1

]: 1120; 1185; 1291; 1326; 1460; 1747; 2968; 3041-3588 (b);

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

4.32 (br, 1H, H-g); 3.35-3.24 (m, 1H, H-c); 1.82-1.69 (m, 1H, H-b); 1.52-1.37 (m, 1H, H-b); 1.13 (d,

3H, 3J = 7.0, H-d); 0.89 (t, 3H,

3J = 7.5, H-a);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

199.4 (C-e); 159.6 (C-f); 41.7 (C-c); 25.2 (C-b); 14.8 (C-d); 11.3 (C-a);

6.2.5 Synthese von 1-(3-Methyl-2-oxopentanoyl)piperidin-2-carbonsäureethylester 1063

1.47 g (11.0 mmol) der Verbindung 9 werden unter Argonatmosphäre in 30 ml abs. DMF gelöst, 1.4

g (11.0 mmol) Oxalylchlorid langsam zugetropft und 12 h bei RT gerührt. Im Anschluss werden 1.71

g (13.2 mmol) N,N- Diisopropylethylamin und nach 5 min 1.73 g (11.0 mmol) der Verbindung 7a

zugegeben. Diese Mischung wird 1-2 d bei RT gerührt. Nach vollständiger Umsetzung (DC-

Kontrolle: Kieselgel; EtOAc : EtOH = 80 : 20; Rf = 0.93) wird das Lösungsmittel im Vakuum

entfernt. Der ölige Rückstand wird in 50 ml CHCl3 suspendiert und zunächst viermal mit je 40 ml

wässriger 2 M HCl-Lösung und danach viermal mit je 40 ml dem. H2O gewaschen. Die organische

Phase wird über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Anschließend wird

EXPERIMENTELLER TEIL 133

das Rohprodukt säulenchromatographisch (Kieselgel; PE : EtOAc = 70 : 30; Rf = 0.82) gereinigt.

Man erhält 0.6 g (2.2 mmol) von Verbindung 10 in Form eines weißen Öls.

Summenformel: C14H23NO4

Mr = 269.34 g/mol

Ausbeute: 20 %

Aussehen: weißes Öl

IR [cm-1

]: 1024; 1196; 1235; 1422; 1642; 1734; 2872; 2936;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

5.41 (dd, 1H, 3J = 11.8,

3J = 5.3, H-d); 4.23-4.11 (m, 2H, H-b); 3.86 (d, 1H,

2J = 13.5, H-h); 3.26-

3.17 (m, 1H, H-h); 2.73-2.59 (m, 1H, H-k); 2.30-2.20 (m, 1H, H-e); 1.84-1.52 (m, 4H, H-e, H-f,

H-g, H-m); 1.50-1.29 (m, 3H, H-f, H-g, H-m); 1.24 (t, 3H, 3J = 7.1, H-a); 1.13-1.05 (m, 3H, H-l);

0.95-0.80 (t, 3J = 7.1, 3H, H-n);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

216.4 (C-j); 176.4 (C-c); 171.5 (C-i); 60.9 (C-b); 51.8 (C-d); 43.3 (C-h); 36.8 (C-k); 26.6 (C-m);

25.5 (C-e); 21.1 (C-g); 17.2 (C-f); 16.7 (C-l); 14.2 (C-a); 11.9 (C-n);

6.2.6 Darstellung der Pipecolinsäureethylester-Amide 11 und 12

6.2.6.1 Synthese der Carbonsäureamide 11a-11c aus den entsprechenden Säurechloriden

134 EXPERIMENTELLER TEIL

Allgemeine Vorschrift zur Synthese der Verbindungen 11a-11c:

1 Äq (3.2 mmol) der Verbindung 7a und 5 Äq (16.0 mmol) K2CO3 werden unter Argonatmosphäre in

20 ml abs. DMF gelöst. Nach 10 min wird 1 Äq (3.2 mmol) des entsprechenden Säurechlorids (siehe

Tabelle 18) langsam zugetropft und 12 h bei RT gerührt. Nach vollständiger Umsetzung (DC-

Kontrolle, siehe Tabelle 18) wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, der ölige Rückstand in

20 ml dem. H2O suspendiert und viermal mit je 30 ml CHCl3 extrahiert. Die vereinigten organischen

Phasen werden über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Anschließend

wird das Rohprodukt säulenchromatographisch (siehe Tabelle 18) gereinigt.

Summen-

formel Mr

[g/mol] Edukt

DC bzw. SC (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aus-

sehen

11a C16H21NO4 291.34 2-Phenoxy-

acetylchlorid

PE : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.77 71 klares Öl

11b C16H21NO3 275.34 2-Phenyl-

acetylchlorid

PE : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.78 75 klares Öl

11c C16H20ClNO3 309.79 2-(4-Chlorphenyl)-

acetylchlorid

PE : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.85 81

braunes

Öl

Tabelle 18: Analytische Daten der Verbindungen 11a-11c

IR [cm-1

]:

11a: 690; 752; 1020; 1161; 1220; 1444; 1496; 1653; 1732; 2861; 2940; 3064;

11b: 696; 728; 1026; 1199; 1238; 1420; 1444; 1645; 1735; 2860; 2939; 3061;

11c: 680; 764; 1015; 1156; 1199; 1427; 1492; 1641; 1733; 2860; 2940; 3063;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 70 : 30 vor.

11a: 7.32-7.26 (m, 2H, H-m, H-o); 7.01-6.90 (m, 3H, H-l, H-n, H-p); 5.30 (d, 1H, 3J = 5.0, H-d);

4.70 (d, 2H, 2J = 13.7, H-j); 4.25-4.10 (m, 2H, H-b); 3.88 (d, 1H,

2J = 13.5, H-h); 3.31 (dt,

1H, 2J = 13.5,

3J = 3.0, H-h); 2.33-2.20 (m, 1H, H-e); 1.78-1.55 (m, 3H, H-e, H-f, H-g);

1.55-1.32 (m, 2H, H-f, H-g); 1.23 (t, 3H, 3J = 7.1, H-a);

11a‘: 7.32-7.26 (m, 2H, H-m, H-o); 7.01-6.90 (m, 3H, H-l, H-n, H-p); 4.85 (d, 1H, 3J = 5.0, H-d);

4.79 (d, 2H, 2J = 13.7, H-j); 4.50 (d, 1H,

2J = 13.5, H-h); 4.25-4.10 (m, 2H, H-b); 2.75 (dt,

1H, 2J = 13.5,

3J = 3.0, H-h); 2.33-2.20 (m, 1H, H-e); 1.78-1.55 (m, 3H, H-e, H-f, H-g);

1.55-1.32 (m, 2H, H-f, H-g); 1.23 (t, 3H, 3J = 7.1, H-a);

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

11b: 7.35-7.20 (m, 5H, H-l, H-m, H-n, H-o, H-p); 5.42 (d, 1H, 3

J = 5.5, H-d); 4.24-4.13 (m, 2H,

H-b); 3.80 (s, 2H, H-j); 3.75 (d, 1H, 2J = 13.0, H-h); 3.16 (dt, 1H,

2J = 13.0,

3J = 3.1, H-h);

2.30-2.22 (m, 1H, H-e); 1.74-1.49 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.44-1.20 (m, 5H, H-a, H-f, H-g);

EXPERIMENTELLER TEIL 135

11b‘: 7.35-7.20 (m, 5H, H-l, H-m, H-n, H-o, H-p); 4.64-4.54 (m, 2H, H-d, H-h); 4.13-4.03 (m,

2H, H-b); 3.71 (s, 2H, H-j); 2.73-2.65 (m, 1H, H-h); 2.19-2.11 (m, 1H, H-e); 1.74-1.49 (m,

3H, H-e, H-f, H-g); 1.44-1.20 (m, 5H, H-a, H-f, H-g);

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

11c: 7.35-7.24 (m, 2H, H-l, H-p); 7.23-7.15 (m, 2H, H-m, H-o); 5.39 (d, 1H, 3J = 5.5, H-d); 4.24-

4.14 (m, 2H, H-b); 3.75 (s, 2H, H-j); 3.74-3.68 (m, 1H, H-h); 3.18 (dt, 1H, 2J = 13.0,

3J = 3.0, H-h); 2.32-2.23 (m, 1H, H-e); 1.75-1.54 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.40-1.20 (m, 5H,

H-a, H-f, H-g);

11c‘: 7.35-7.24 (m, 2H, H-l, H-p); 7.23-7.15 (m, 2H, H-m, H-o); 4.58 (d, 1H, 2J = 13.0, H-h); 4.52

(d, 1H, 3J = 5.5, H-d); 4.14-4.06 (m, 2H, H-b); 3.66 (s, 2H, H-j); 2.74-2.67 (m, 1H, H-h);

2.22-2.15 (m, 1H, H-e); 1.75-1.54 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.40-1.20 (m, 5H, H-a, H-f, H-g);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 70 : 30 vor.

11a: 170.9 (C-c); 167.9 (C-i); 158.0 (C-k); 129.5 (C-m, C-o); 121.5 (C-n); 114.7 (C-l, C-p); 67.4

(C-j); 61.2 (C-b); 52.3 (C-d); 43.1 (C-h); 26.6 (C-e); 25.2 (C-g); 20.9 (C-f); 14.2 (C-a);

11a‘: 170.9 (C-c); 167.9 (C-i); 158.0 (C-k); 129.5 (C-m, C-o); 121.5 (C-n); 114.7 (C-l, C-p); 67.4

(C-j); 61.2 (C-b); 55.9 (C-d); 40.0 (C-h); 26.6 (C-e); 25.2 (C-g); 20.9 (C-f); 14.2 (C-a);

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

11b: 171.3 (C-c); 170.8 (C-i); 134.9 (C-k); 128.6 (C-l, C-m, C-o, C-p); 126.7 (C-n); 61.1 (C-b);

52.0 (C-d); 44.1 (C-h); 41.1 (C-j); 26.6 (C-e); 25.2 (C-g); 20.8 (C-f); 14.2 (C-a);

11b‘: 171.3 (C-c); 170.8 (C-i); 134.9 (C-k); 128.6 (C-l, C-m, C-o, C-p); 126.7 (C-n); 61.1 (C-b);

56.6 (C-d); 41.3 (C-j); 39.5 (C-h); 27.2 (C-e); 24.5 (C-g); 20.7 (C-f); 14.2 (C-a);

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

11c: 171.1 (C-c); 170.4 (C-i); 133.4 (C-k); 132.6 (C-n); 130.1 (C-m, C-o) 128.7 (C-l, C-p); 61.2

(C-b); 52.1 (C-d); 44.0 (C-h); 40.3 (C-j); 26.6 (C-e); 25.2 (C-g); 20.8 (C-f); 14.2 (C-a);

11c‘: 171.1 (C-c); 170.4 (C-i); 133.4 (C-k); 132.6 (C-n); 130.1 (C-m, C-o) 128.7 (C-l, C-p); 61.5

(C-b); 56.6 (C-d); 40.4 (C-j); 39.6 (C-h); 27.3 (C-e); 24.5 (C-g); 20.8 (C-f); 14.2 (C-a);

136 EXPERIMENTELLER TEIL

6.2.6.2 Synthese der Sulfonsäureamide 12a-12j aus den entsprechenden Sulfonsäurechloriden

Allgemeine Vorschrift zur Synthese der Verbindungen 12a-12j:

1 Äq (3.2 mmol) der Verbindung 7a bzw. 7b wird unter Argonatmosphäre in dem entsprechenden

abs. Lösungsmittel (siehe Tabelle 19) gelöst. Dazu werden zunächst 2.2 - 5 Äq (7.1-16.0 mmol) der

entsprechenden Base (siehe Tabelle 19) und nach 10 min 1 Äq (3.2 mmol) des jeweils

entsprechenden Sulfonsäurechlorids (siehe Tabelle 19) gegeben. Dieser Reaktionsansatz wird

mehrere Stunden bei RT gerührt. Nach vollständiger Umsetzung (DC-Kontrolle, siehe Tabelle 20)

wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, der ölige Rückstand in 50 ml CHCl3 suspendiert und

zuerst viermal mit je 30 ml wässriger 2M HCl-Lösung und danach viermal mit je 30 ml dem. H2O

gewaschen. Die organische Phase wird über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum

entfernt. Das Rohprodukt wird anschließend säulenchromatographisch (siehe Tabelle 20) gereinigt.

EXPERIMENTELLER TEIL 137

Summen-

formel Mr

[g/mol] Edukt Reaktionsbedingungen

LM Base Temperatur /

Zeit

12a C15H21NO4S 311.40 Benzylsulfonsäure-

chlorid Dioxan

2.2 Äq (7.1 mmol)

Diisopropylethylamin RT / 4.5 h

12b C15H21NO4S 311.40 Benzylsulfonsäure-

chlorid DMF

5 Äq (16.0 mmol)

K2CO3 RT / 24 h

12c C16H23NO4S 325.42 4-Methylbenzyl-

sulfonsäurechlorid DMF

5 Äq (16.0 mmol)

K2CO3 RT / 12 h

12d C15H20ClNO4S 345.84 4-Chlorbenzyl-

sulfonsäurechlorid DMF

5 Äq (16.0 mmol)

K2CO3 RT / 12 h

12e C15H20N2O6S 356.39 2-Nitrobenzyl-

sulfonsäurechlorid DMF

5 Äq (16.0 mmol)

K2CO3 RT / 12 h

12f131

C14H19NO4S 297.37 Phenylsulfonsäure-

chlorid CH2Cl2

3 Äq (9.6 mmol)

Et3N

0 °C / 1 h

RT / 16 h

12g C14H19NO4S 297.37 Phenylsulfonsäure-

chlorid THF

3 Äq (9.6 mmol)

Et3N RT / 12 h

12h C14H18N2O6S 342.37 3-Nitrophenyl-

sulfonsäurechlorid CH2Cl2

3 Äq (9.6 mmol)

Et3N

0 °C / 1 h

RT / 16 h

12i C15H21NO5S 327.4 3-Methoxyphenyl-

sulfonsäurechlorid CH2Cl2

3 Äq (9.6 mmol)

Et3N

0 °C / 1 h

RT / 14 h

12j132

C15H21NO5S 311.40 4-Methylphenyl-

sulfonsäurechlorid DMF

5 Äq (16.0 mmol)

K2CO3 RT / 12 h

Tabelle 19: Synthetische Daten der Verbindungen 12a-12j

Aussehen DC bzw. SC

(Kieselgel)

Ausbeute [%]

Smp. [°C]

12a gelbes Öl Cyclohexan : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.73 77 -

12b gelbes Öl Cyclohexan : EtOAc = 80:20;

Rf = 0.46 63 -

12c weißes Öl PE : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.85 50 -

12d klares Öl PE : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.85 46 -

12e gelbes Öl PE : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.74 17 -

12f131

gelbes Öl Cyclohexan : EtOAc = 80:20;

Rf = 0.41

92;

(Lit. 37)131

-

12g braunes Öl Cyclohexan : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.87 79 -

12h brauner

Feststoff

Cyclohexan : EtOAc = 80:20;

Rf = 0.23 97 94

12i gelbes Öl Cyclohexan : EtOAc = 80:20;

Rf = 0.29 76 -

12j132

klares Öl;

(Lit. FS*)132

PE : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.73

71;

(Lit. 82)132

(Lit. 167)

132

Tabelle 20: Analytische Daten der Verbindungen 12a-12j

* Angaben beziehen sich auf das Dicyclohexylamin-Salz

Die IR-, und 1H-NMR-Daten zu 12f und 12j entsprechen den Literaturstellen

131,132.

138 EXPERIMENTELLER TEIL

IR [cm-1

]:

12a: 697; 739; 962; 1060; 1148; 1200; 1335; 1455; 1732; 2860; 2940; 3062;

12b: 688; 739; 963; 1075; 1145; 1222; 1335; 1455; 1738; 2860; 2942; 3065;

12c: 697; 767; 813; 1024; 1159; 1280; 1444; 1514; 1730; 2857; 2934; 3060;

12d: 717; 730; 961; 1059; 1128; 1199; 1335; 1492; 1732; 2861; 2942; 3062;

12e: 714; 737; 962; 1060; 1147; 1199; 1337; 1528; 1732; 2863; 2943; 3060;

12f: 689; 737; 960; 1093; 1155; 1181; 1337; 1446; 1733; 2862; 2943; 3062;

12g: 689; 737; 959; 1093; 1155; 1182; 1337; 1446; 1736; 2862; 2943; 3064;

12h: 671; 714; 955; 1067; 1125; 1156; 1209; 1350; 1527; 1731; 2863; 2958; 3092;

12i: 685; 727; 959; 1036; 1152; 1240; 1338; 1478; 1597; 1737; 2862; 2942; 3067;

12j: 654; 727; 959; 1093; 1154; 1179; 1337; 1446; 1738; 2862; 2942; 3065;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

12a: 7.40-7.35 (m, 2H, H-k, H-o); 7.31-7.24 (m, 3H, H-l, H-m, H-n); 4.57 (d, 1H, 3

J = 4.0, H-d);

4.29-4.20 (m, 4H, H-b, H-i); 3.50-3.41 (m, 1H, H-h); 3.15 (dt, 1H, 2J = 12.8,

3J = 3.1, H-h);

2.22-2.11 (m, 1H, H-e); 1.72-1.54 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.51-1.38 (m, 1H, H-g); 1.33-1.20

(m, 4H, H-a, H-f);

12b: 7.57-7.40 (m, 2H, H-k, H-o); 7.39-7.33 (m, 3H, H-l, H-m, H-n); 4.60-4.55 (m, 1H, H-d);

4.30-4.17 (m, 4H, H-b, H-i); 3.49-3.41 (m, 1H, H-h); 3.15 (dt, 1H, 2J = 12.7,

3J = 3.1, H-h);

2.20-2.12 (m, 1H, H-e); 1.73-1.35 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.32-1.18 (m, 5H, H-a, H-f, H-g);

12c: 7.20 (d, 2H, 3J = 8.0, H-k, H-p); 7.11 (d, 2H,

3J = 8.0, H-l, H-o); 4.21 (q, 2H,

3J = 7.0, H-b);

3.76 (d, 1H, 2J = 13.2, H-i); 3.37 (d, 1H,

2J = 13.2, H-i); 3.10 (dd, 1H,

3J = 8.0,

3J = 4.3,

H-d); 2.96-2.89 (m, 1H, H-h); 2.33 (s, 3H, H-n); 2.16-2.08 (m, 1H, H-h); 1.89-1.74 (m, 2H,

H-e, H-g); 1.67-1.50 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.39-1.24 (m, 4H, H-a, H-f);

12d: 7.42 (d, 2H, 3J = 8.5, H-l, H-n); 7.34 (d, 2H,

3J = 8.5, H-k, H-o); 4.62 (d, 1H,

3J = 4.7, H-d);

4.31-4.20 (m, 4H, H-b, H-i); 3.46 (d, 1H, 2J = 12.7, H-h); 3.12 (dt, 1H,

2J = 12.7,

3J = 3.1,

H-h); 2.24-2.17 (m, 1H, H-e); 1.75-1.56 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.53-1.40 (m, 1H, H-g);

1.33-1.21 (m, 4H, H-a, H-f);

12e: 8.01 (d, 1H, 3J = 8.0, H-n); 7.59-7.56 (m, 2H, H-k, H-l); 7.52-7.45 (m, 1H, H-m); 4.91 (d,

1H, 2J = 13.7, H-i); 4.81 (d, 1H,

2J = 13.7, H-i); 4.61 (d, 1H,

3J = 4.7, H-d); 4.26-4.18 (m,

2H, H-b); 3.64-3.56 (m, 1H, H-h); 3.20 (dt, 1H, 2J = 12.6,

3J = 3.0, H-h); 2.23-2.16 (m, 1H,

H-e); 1.76-1.59 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.59-1.41 (m, 1H, H-g); 1.31-1.18 (m, 4H, H-a,

H-f);

12f: 7.82-7.77 (m, 2H, H-j; H-n); 7.58-7.43 (m, 3H, H-k, H-l, H-m); 4.73 (d, 1H, 3J = 5.3, H-d);

4.09-3.87 (m, 2H, H-b); 3.83-3.76 (m, 1H, H-h); 3.23 (dt, 1H, 2J = 12.4,

3J = 3.0, H-h); 2.17-

2.08 (m, 1H, H-e); 1.82-1.57 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.56-1.41 (m, 1H, H-g); 1.37-1.20 (m,

1H, H-f); 1.13 (t, 3H, 3J = 7.1, H-a);

EXPERIMENTELLER TEIL 139

12g: 7.79-7.75 (m, 2H, H-j, H-n); 7.69-7.56 (m, 3H, H-k, H-l, H-m); 4.65-4.60 (m, 1H, H-d);

4.05-3.82 (m, 2H, H-b); 3.70-3.63 (m, 1H, H-h); 3.18-3.06 (m, 1H, H-h); 2.03-1.93 (m, 1H,

H-e); 1.63-1.52 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.32-1.10 (m, 2H, H-f, H-g); 1.06 (t, 3H, 3J = 7.1,

H-a);

12h: 8.63-8.59 (m, 1H, H-j); 8.43-8.38 (m, 1H, H-l); 8.12-8.09 (m, 1H, H-n); 7.70 (t, 1H, 3J = 8.1,

H-m); 4.80 (d, 1H, 3J = 5.4, H-d); 4.09-3.92 (m, 2H, H-b); 3.88-3.80 (m, 1H, H-h); 3.18 (dt,

1H, 2J = 12.6,

3J = 3.0, H-h); 2.25-2.17 (m, 1H, H-e); 1.88-1.66 (m, 3H, H-e, H-f, H-g);

1.64-1.51 (m, 1H, H-g); 1.34-1.19 (m, 1H, H-f); 1.16 (t, 3H, 3J = 7.1, H-a);

12i: 7.40-7.35 (m, 2H, H-j, H-o); 7.32-7.30 (m, 1H, H-m); 7.10-7.04 (m, 1H, H-n); 4.73 (d, 1H,

3J = 5.2, H-d); 4.10-3.90 (m, 2H, H-b); 3.84 (s, 3H, H-l); 3.81-3.73 (m, 1H, H-h); 3.25 (dt,

1H, 2J = 12.7,

3J = 3.0, H-h); 2.17-2.08 (m, 1H, H-e); 1.84-1.58 (m, 3H, H-e, H-f, H-g);

1.57-1.46 (m, 1H, H-g); 1.36-1.23 (m, 1H, H-f); 1.15 (t, 3H, 3J = 7.1, H-a);

12j: 7.67 (d, 2H, 3J = 8.0, H-j; H-o); 7.27 (d, 2H,

3J = 8.0, H-k, H-n); 4.73 (d, 1H,

3J = 5.0, H-d);

4.09-3.91 (m, 2H, H-b); 3.79-3.72 (m, 1H, H-h); 3.22 (dt, 1H, 2J = 12.7,

3J = 3.0, H-h); 2.41

(s, 3H, H-m); 2.16-2.08 (m, 1H, H-e); 1.80-1.39 (m, 4H, H-e, H-f, H-g); 1.35-1.22 (m, 1H,

H-f); 1.15 (t, 3H, 3J = 7.1, H-a);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

12a: 171.6 (C-c); 131.1 (C-k, C-o); 129.5 (C-j); 128.7 (C-l, C-n); 128.6 (C-m); 61.5 (C-b); 58.9

(C-i); 56.1 (C-d); 43.6 (C-h); 28.0 (C-e); 25.2 (C-g); 20.5 (C-f); 14.4 (C-a);

12b: 171.4 (C-c); 131.0 (C-k, C-o); 129.4 (C-j); 128.5 (C-l, C-n); 128.4 (C-m); 61.4 (C-b); 58.7

(C-i); 56.0 (C-d); 43.4 (C-h); 27.8 (C-e); 25.1 (C-g); 20.3 (C-f); 14.2 (C-a);

12c: 174.0 (C-c); 136.6 (C-m); 130.7 (C-j); 129.3 (C-k, C-p); 128.8 (C-l, C-o); 64.6 (C-d); 60.3

(C-i); 60.2 (C-b); 50.2 (C-h); 29.6 (C-e); 25.3 (C-g); 22.6 (C-f); 21.1 (C-n); 14.3 (C-a);

12d: 171.4 (C-c); 134.6 (C-m); 132.3 (C-l, C-n); 128.8 (C-k, C-o); 127.9 (C-j); 61.5 (C-b); 57.9

(C-i); 55.0 (C-d); 43.5 (C-h); 27.9 (C-e); 25.1 (C-g); 20.4 (C-f); 14.2 (C-a);

12e: 171.4 (C-c); 149.7 (C-o); 134.1 (C-l); 133.1 (C-k); 129.5 (C-m); 125.6 (C-n); 124.4 (C-j);

61.6 (C-b); 56.1 (C-d); 54.1 (C-i); 43.1 (C-h); 27.9 (C-e); 25.0 (C-g); 20.3 (C-f); 14.2 (C-a);

12f: 170.6 (C-c); 140.1 (C-i); 132.3 (C-l); 128.8 (C-k, C-m); 127.1 (C-j, C-n); 61.0 (C-b); 55.0

(C-d); 42.6 (C-h); 27.9 (C-e); 24.7 (C-g); 20.0 (C-f); 14.0 (C-a);

12g: 170.8 (C-c); 140.5 (C-i); 132.4 (C-l); 128.9 (C-k, C-m); 126.3 (C-j, C-n); 60.4 (C-b); 54.3

(C-d); 42.0 (C-h); 26.8 (C-e); 23.6 (C-g); 19.1 (C-f); 13.5 (C-a);

12h: 170.2 (C-c); 148.1 (C-k); 142.1 (C-i); 132.8 (C-n); 130.0 (C-m); 126.8 (C-j); 122.5 (C-l);

61.4 (C-b); 55.5 (C-d); 42.9 (C-h); 28.0 (C-e); 24.9 (C-g); 20.0 (C-f); 14.1 (C-a);

12i: 170.7 (C-c); 159.8 (C-k); 141.2 (C-i); 129.8 (C-o); 119.3 (C-j); 118.7 (C-n); 112.0 (C-m);

61.1 (C-b); 55.6 (C-l); 55.1 (C-d); 42.7 (C-h); 27.9 (C-e); 24.7 (C-g); 20.0 (C-f); 14.0 (C-a);

140 EXPERIMENTELLER TEIL

12j: 170.8 (C-c); 143.0 (C-i); 137.2 (C-l); 129.4 (C-k, C-n); 127.2 (C-j, C-o); 61.0 (C-b); 55.0

(C-d); 42.5 (C-h); 27.9 (C-e); 24.7 (C-g); 21.5 (C-m); 20.0 (C-f); 14.0 (C-a);

6.2.7 Synthese der Pipecolinsäure-Amide 13-15

Allgemeine Vorschrift zur Synthese der Verbindungen 13-15:

1 Äq (Stoffmenge siehe Tabelle 21) des entsprechenden Pipecolinsäureethylesters (Verbindungen 10-

12, siehe Tabelle 21) wird in 50 ml MeOH gelöst und auf 0 °C abgekühlt. 20 ml einer wässrigen 1 N

LiOH-Lösung werden zugegeben und 1 h bei 0 °C gerührt. Nach vollständiger Umsetzung (DC-

Kontrolle: siehe Tabelle 21) wird 10 % wässrige HCl-Lösung bis pH 1 zugegeben und fünfmal mit je

30 ml CH2Cl2 extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden dreimal mit je 30 ml dem. H2O,

sowie dreimal mit je 30 ml ges. wässriger NaCl-Lösung gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und das

Lösungsmittel im Vakuum entfernt.

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukt [mmol]

DC-Kontrolle (Kieselgel)

Smp. [°C]

Ausbeute [%]

Aussehen

13 C12H19NO4 241.28 10

[2.2]

PE : EtOAc = 80:20;

Rf = 0.11 - 67 gelbes Öl

14a C14H17NO4 263.29 11a

[2.3]

HCOOH : EtOAc =

5:95; Rf = 0.79 160 97

weißes

Pulver

14b C14H17NO3 247.29 11b

[2.4]

HCOOH : EtOAc =

5:95; Rf = 0.83 - 98 klares Öl

14c C14H16ClNO3 281.73 11c

[2.6]

HCOOH : EtOAc =

5:95; Rf = 0.84 158 83 gelbes Pulver

15a133

C13H17NO4S 283.34 12a

[2.5]

Hexan : EtOAc =

70:30; Rf = 0.61 -

92;

(Lit. 100)133

gelbes Öl;

(Lit. FS)133

15b C13H17NO4S 283.34 12b

[2.0]

Hexan : EtOAc =

70:30; Rf = 0.58 - 98.9 gelbes Öl

15c C14H19NO4S 297.37 12c

[1.6]

HCOOH : EtOAc =

5:95; Rf = 0.79 129 67 gelbes Pulver

15d C13H16ClNO4S 317.79 12d

[1.5]

HCOOH : EtOAc =

5:95; Rf = 0.81 147 91

weißes

Pulver

15e C13H16N2O6S 328.34 12e

[0.5]

HCOOH : EtOAc =

5:95; Rf = 0.86 >180 92 gelbes Pulver

15f134

C12H15NO4S 269.32 12f

[3.0]

Cyclohexan : EtOAc =

80:20; Rf = 0.20 - 98 weißes Öl

EXPERIMENTELLER TEIL 141

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukt [mmol]

DC-Kontrolle (Kieselgel)

Smp. [°C]

Ausbeute [%]

Aussehen

15h C12H14N2O6S 314.31 12h

[3.1]

Cyclohexan : EtOAc =

80:20 (+ 5 % HCOOH);

Rf = 0.63

143 92 weißes

Pulver

15i135

C13H17NO5S 299.34 12i

[2.4]

Cyclohexan : EtOAc =

1:1 (+ 5 % HCOOH);

Rf = 0.52

133 87;

(Lit. 31*)135

weißes

Pulver

15j136

C13H17NO4S 283.34 12j

[2.3]

HCOOH : EtOAc =

5:95; Rf = 0.88

96;

(Lit. 100)136

99;

(Lit. 76)136

weißes

Pulver;

(Lit. FS)136

Tabelle 21: Analytische Daten der Verbindungen 13-15 * Angabe gilt für S-Enantiomer

Die IR-, und 1H-NMR-Daten zu 15j entsprechen der Literaturstelle

136.

IR [cm-1

]:

13: 992; 1091; 1154; 1415; 1654; 1718; 2885; 2941; 2759-3390 (b);

14a: 694; 753; 1019; 1082; 1201; 1239; 1432; 1618; 1737; 2858; 2952; 3052; 2642-3429 (b);

14b: 696; 723; 865; 1025; 1140; 1204: 1446; 1592; 1725; 2861; 2939; 3028; 2752-3348 (b);

14c: 689; 746; 1013; 1089; 1160; 1221; 1453; 1600; 1716; 2865; 2933; 3014; 2684-3422 (b);

15a: 699; 732; 959; 1060; 1118; 1317; 1455; 1728; 2854; 2952; 3062; 3012-3393 (b);

15b: 699; 732; 959; 1060; 1118; 1317; 1455; 1728; 2854; 2952; 3065; 3012-3393 (b);

15c: 681; 758; 820; 1050; 1185; 1283; 1454; 1732; 2185; 2868; 2954; 3052; 2785-3405 (b);

15d: 661; 730; 928; 1146; 1214; 1308; 1335; 1495; 1711; 2859; 2933; 3091; 2737-3414 (b);

15e: 715; 733; 963; 1060; 1149; 1259; 1347; 1525; 1704; 2863; 2951; 3016; 2716-3474 (b);

15f: 688; 730; 958; 1075; 1100; 1325; 1445; 1724; 2878; 2960; 3065; 3115-3205 (b);

15h: 710; 736; 878; 1044; 1085; 1353; 1536; 1714; 2894; 2974; 3033; 2785-3428 (b);

15i: 679; 724; 1027; 1099; 1251; 1314; 1487; 1599; 1703; 2874; 2943; 3012; 2703-3327 (b);

15j: 667; 728; 955; 1114; 1157; 1214; 1334; 1445; 1711; 2860; 2937; 3034; 2991-3351 (b);

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

13: 5.45-5.36 (m, 1H, H-d); 3.86-3.78 (m, 1H, H-h); 3.22-3.12 (m, 1H, H-h); 2.72-2.60 (m, 1H,

H-k); 2.27 (d, 1H, 2J = 13.4, H-e); 1.86-1.54 (m, 4H, H-e, H-f, H-g, H-m); 1.53-1.31 (m, 3H,

H-f, H-g, H-m); 1.15-1.04 (m, 3H, H-l); 0.88 (t, 3H, 3J = 7.4, H-n);

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 70 : 30 vor.

14a: (CD3CN): 9.46 (br, 1H, H-b); 7.32-7.25 (m, 2H, H-m; H-o); 6.99-6.87 (m, 3H, H-l, H-n, H-

p); 5.15 (d, 1H, 3J = 5.7, H-d); 4.73 (d, 2H,

2J = 14.8, H-j); 3.75 (d, 1H,

2J = 13.0, H-h); 3.23

(dt, 1H, 2J = 13.0,

3J = 3.0, H-h); 2.22-2.15 (m, 1H, H-e); 1.77-1.27 (m, 5H, H-e, H-f, H-g);

14a‘: (CD3CN): 9.46 (br, 1H, H-b); 7.32-7.25 (m, 2H, H-m; H-o); 6.99-6.87 (m, 3H, H-l, H-n,

H-p); 4.85 (d, 2H, 2

J = 14.8, H-j); 4.78-4.64 (m, 1H, H-d); 4.36 (d, 1H, 2J = 13.0, H-h); 2.66

(dt, 1H, 2J = 13.0,

3J = 3.0, H-h); 2.22-2.15 (m, 1H, H-e); 1.77-1.27 (m, 5H, H-e, H-f, H-g);

142 EXPERIMENTELLER TEIL

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

14b: (CD3CN): 9.51 (br, 1H, H-b); 7.35-7.18 (m, 5H, H-l, H-m; H-n, H-o, H-p); 5.23 (d, 1H,

3J = 5.5, H-d); 3.83 (d, 1H,

2J = 13.5, H-h); 3.73 (d, 2H,

2J = 15.5, H-j); 3.13 (dt, 1H,

2J = 13.5,

3J = 3.1, H-h); 2.20-2.09 (m, 1H, H-e); 1.72-1.44 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.39-

1.25 (m, 2H, H-f, H-g);

14b‘: (CD3CN): 9.51 (br, 1H, H-b); 7.35-7.18 (m, 5H, H-l, H-m; H-n, H-o, H-p); 4.73 (d, 1H,

3J = 5.5, H-d); 4.43 (d, 1H,

2J = 13.5, H-h); 3.60 (d, 2H,

2J = 15.5, H-j); 2.61 (dt, 1H,

2J = 13.5,

3J = 3.1, H-h); 2.20-2.09 (m, 1H, H-e); 1.72-1.44 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.39-

1.25 (m, 2H, H-f, H-g);

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

14c: (CD3CN): 9.46 (br, 1H, H-b); 7.36-7.28 (m, 2H, H-l, H-p); 7.24-7.16 (m, 2H, H-m, H-o);

5.22 (d, 1H, 3J = 5.3, H-d); 3.81 (d, 1H,

2J = 13.0, H-h); 3.71 (d, 2H,

2J = 17.0, H-j); 3.14 (dt,

1H, 2J = 13.0,

3J = 3.0, H-h); 2.20-2.13 (m, 1H, H-e); 1.71-1.52 (m, 3H, H-e, H-f, H-g);

1.42-1.28 (m, 2H, H-f, H-g);

14c‘: (CD3CN): 9.46 (br, 1H, H-b); 7.36-7.28 (m, 2H, H-l, H-p); 7.24-7.16 (m, 2H, H-m, H-o);

4.71 (d, 1H, 3J = 5.3, H-d); 4.41 (d, 1H,

2J = 13.0, H-h); 3.58 (d, 2H,

2J = 17.0, H-j); 2.60 (dt,

1H, 2J = 13.0,

3J = 3.0, H-h); 2.20-2.13 (m, 1H, H-e); 1.71-1.52 (m, 3H, H-e, H-f, H-g);

1.42-1.28 (m, 2H, H-f, H-g);

15a: 7.49-7.33 (m, 5H, H-k, H-l, H-m, H-n, H-o); 4.60-4.55 (m, 1H, H-d); 4.27 (s, 2H, H-i);

3.49-3.41 (m, 1H, H-h); 3.15 (dt, 1H, 2J = 12.4,

3J = 3.1, H-h); 2.20-2.12 (m, 1H, H-e); 1.73-

1.52 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.51-1.18 (m, 2H, H-f, H-g);

15b: 7.48-7.33 (m, 5H, H-k, H-l, H-m, H-n, H-o); 4.58-4.54 (m, 1H, H-d); 4.26 (s, 2H, H-i);

3.48-3.40 (m, 1H, H-h); 3.13 (dt, 1H, 2J = 12.8,

3J = 2.9, H-h); 2.20-2.11 (m, 1H, H-e); 1.75-

1.51 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.49-1.21 (m, 2H, H-f, H-g);

15c: 7.32 (d, 2H, 3J = 8.0, H-k, H-p); 7.17 (d, 2H,

3J = 8.0, H-l, H-o); 4.58 (d, 1H,

3J = 5.0, H-d);

4.23 (s, 2H, H-i); 3.51-3.44 (m, 1H, H-h); 3.14 (dt, 1H, 2J = 12.9,

3J = 3.0, H-h); 2.35 (s, 3H,

H-n); 2.21-2.14 (m, 1H, H-e); 1.77-1.55 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.50-1.25 (m, 2H, H-f,

H-g);

15d: (CD3CN): 9.43 (br, 1H, H-b); 7.45-7.38 (m, 4H, H-k, H-l, H-n, H-o); 4.42 (d, 1H, 3J = 5.1,

H-d); 4.28 (d, 2H, 2J = 4.1, H-i); 3.44 (d, 1H,

2J = 13.0, H-h); 3.18 (dt, 1H,

2J = 13.0,

3J = 3.0, H-h); 2.13-2.05 (m, 1H, H-e); 1.70-1.57 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.45-1.22 (m, 2H,

H-f, H-g);

15e: (CD3CN): 9.53 (br, 1H, H-b); 8.03-7.99 (m, 1H, H-n); 7.74-7.68 (m, 1H, H-l); 7.64-7.58 (m,

2H, H-k, H-m); 4.90-4.79 (m, 2H, H-i); 4.47-4.44 (m, 1H, H-d); 3.50-3.43 (m, 1H, H-h);

3.21 (dt, 1H, 2J = 12.8,

3J = 3.0, H-h); 2.19-2.08 (m, 1H, H-e); 1.73-1.62 (m, 3H, H-e, H-f,

H-g); 1.49-1.21 (m, 2H, H-f, H-g);

EXPERIMENTELLER TEIL 143

15f: 7.83-7.78 (m, 2H, H-j; H-n); 7.59-7.45 (m, 3H, H-k, H-l, H-m); 4.78 (d, 1H, 3

J = 4.8, H-d);

3.80-3.72 (m, 1H, H-h); 3.23 (dt, 1H, 2J = 12.4,

3J = 3.0, H-h); 2.20-2.12 (m, 1H, H-e); 1.80-

1.60 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.51-1.23 (m, 2H, H-g, H-f);

15h: (DMSO-d6): 12.97 (br, 1H, H-b); 8.53-8.41 (m, 2H, H-j, H-l); 8.25-8.21 (m, 1H, H-n); 7.89

(t, 1H, 3J = 8.0, H-m); 4.65 (d, 1H,

3J = 4.2, H-d); 3.76-3.68 (m, 1H, H-h); 3.10 (dt, 1H,

2J = 12.8,

3J = 2.7, H-h); 2.10-2.02 (m, 1H, H-e); 1.68-1.53 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.38-

1.09 (m, 2H, H-f, H-g);

15i: 7.52-7.36 (m, 2H, H-j, H-o); 7.34-7.31 (m, 1H, H-m); 7.12-7.05 (m, 1H, H-n); 4.79 (d, 1H,

3J = 4.9, H-d); 3.84 (s, 3H, H-l); 3.81-3.73 (m, 1H, H-h); 3.22 (dt, 1H,

2J = 12.8,

3J = 3.0,

H-h); 2.20-2.12 (m, 1H, H-e); 1.81-1.59 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.54-1.21 (m, 2H, H-f,

H-g);

15j: (CD3CN): 9.34 (br, 1H, H-b); 7.68 (d, 2H, 3

J = 8.0, H-j; H-o); 7.35 (d, 2H, 3J = 8.0, H-k,

H-n); 4.66 (d, 1H, 3J = 5.3, H-d); 3.70-3.64 (m, 1H, H-h); 3.18 (dt, 1H,

2J = 12.9,

3J = 3.0, H-

h); 2.41 (s, 3H, H-m); 2.09-2.01 (m, 1H, H-e); 1.65-1.52 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.31-1.23

(m, 2H, H-f, H-g);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

13: 216.4 (C-j); 177.6 (C-c); 175.5 (C-i); 51.9 (C-d); 43.5 (C-h); 37.0 (C-k); 26.7 (C-m); 25.4

(C-e); 20.9 (C-g); 17.2 (C-f); 16.6 (C-l); 11.9 (C-n);

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 70 : 30 vor.

14a: (CD3CN): 172.6 (C-c); 168.8 (C-i); 159.3 (C-k); 130.3 (C-m, C-o); 122.0 (C-n); 115.5 (C-l,

C-p); 67.0 (C-j); 52.6 (C-d); 43.4 (C-h); 27.2 (C-e); 25.7 (C-g); 21.5 (C-f);

14a‘: (CD3CN): 172.6 (C-c); 168.8 (C-i); 159.3 (C-k); 130.3 (C-m, C-o); 122.0 (C-n); 115.5 (C-l,

C-p); 67.0 (C-j); 56.0 (C-d); 40.3 (C-h); 27.7 (C-e); 25.3 (C-g); 21.5 (C-f);

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

14b: (CD3CN): 172.8 (C-c); 171.7 (C-i); 136.6 (C-k); 129.8 (C-l, C-p); 129.2 (C-m, C-o); 127.2

(C-n); 52.4 (C-d); 44.5 (C-h); 40.8 (C-j); 27.0 (C-e); 25.6 (C-g); 21.3 (C-f);

14b‘: (CD3CN): 172.8 (C-c); 171.7 (C-i); 136.6 (C-k); 129.8 (C-l, C-p); 129.2 (C-m, C-o); 127.2

(C-n); 55.1 (C-d); 40.6 (C-j); 40.0 (C-h); 27.6 (C-e); 25.2 (C-g); 21.3 (C-f);

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

14c: (CD3CN): 172.9 (C-c); 171.4 (C-i); 135.7 (C-k); 132.7 (C-n); 131.8 (C-m, C-o) 129.2 (C-l,

C-p); 52.6 (C-d); 44.6 (C-h); 40.1 (C-j); 27.2 (C-e); 25.8 (C-g); 21.5 (C-f);

14c‘: (CD3CN): 172.9 (C-c); 171.4 (C-i); 135.7 (C-k); 132.7 (C-n); 131.8 (C-m, C-o) 129.2 (C-l,

C-p); 56.9 (C-d); 40.2 (C-j); 39.9 (C-h); 27.8 (C-e); 25.3 (C-g); 21.7 (C-f);

15a: 176.6 (C-c); 130.9 (C-k, C-o); 129.1 (C-m); 128.6 (C-l, C-n); 126.0 (C-j); 58.9 (C-i); 55.7

(C-d); 43.5 (C-h); 27.5 (C-e); 24.9 (C-g); 20.3 (C-f);

144 EXPERIMENTELLER TEIL

15b: 175.8 (C-c); 130.9 (C-k, C-o); 129.2 (C-m); 128.6 (C-l, C-n); 126.0 (C-j); 58.9 (C-i); 55.7

(C-d); 43.5 (C-h); 27.6 (C-e); 24.9 (C-g); 20.3 (C-f);

15c: 176.1 (C-c); 138.5 (C-m); 130.8 (C-k, C-p); 129.3 (C-l, C-o); 126.0 (C-j); 58.6 (C-i); 55.6

(C-d); 43.5 (C-h); 27.5 (C-e); 24.9 (C-g); 21.2 (C-n); 20.3 (C-f);

15d: (CD3CN): 172.9 (C-c); 134.8 (C-m); 133.5 (C-l, C-n); 130.0 (C-j); 129.4 (C-k, C-o); 58.1

(C-i); 56.3 (C-d); 44.0 (C-h); 28.4 (C-e); 25.6 (C-g); 20.9 (C-f);

15e: (CD3CN): 172.7 (C-c); 146.2 (C-o); 135.3 (C-k); 134.2 (C-l); 130.8 (C-m); 126.3 (C-n);

125.1 (C-j); 56.4 (C-d); 54.9 (C-i); 43.9 (C-h); 28.5 (C-e); 25.6 (C-g); 20.9 (C-f);

15f: 176.6 (C-c); 139.9 (C-i); 132.6 (C-l); 128.9 (C-k, C-m); 127.1 (C-j, C-n); 54.8 (C-d); 42.6

(C-h); 27.5 (C-e); 24.5 (C-g); 20.0 (C-f);

15h: (DMSO-d6): 171.3 (C-c); 147.5 (C-k); 141.3 (C-i); 132.7 (C-n); 131.0 (C-m); 127.0 (C-l);

121.3 (C-j); 54.8 (C-d); 42.3 (C-h); 27.1 (C-e); 24.0 (C-g); 19.4 (C-f);

15i: 175.5 (C-c); 159.8 (C-k); 141.0 (C-i); 130.0 (C-o); 119.3 (C-j); 118.9 (C-n); 111.9 (C-m);

55.6 (C-l); 54.7 (C-d); 42.7 (C-h); 27.5 (C-e); 24.5 (C-g); 20.0 (C-f);

15j: (CD3CN): 172.3 (C-c); 144.4 (C-i); 138.7 (C-l); 130.5 (C-k, C-n); 127.9 (C-j, C-o); 55.7

(C-d); 43.4 (C-h); 28.1 (C-e); 25.1 (C-g); 21.4 (C-m); 20.8 (C-f);

6.2.8 Synthese von 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)propan-1-ol 16

2.4 g (60.0 mmol) LiAlH4 werden langsam unter Argonatmosphäre in 60 ml abs. Et2O suspendiert

und eine Suspension von 1.0 g (4.2 mmol) 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)propionsäure in 20 ml abs.

Et2O zugetropft. Dieser Ansatz wird 6 h unter Rückfluss erhitzt und danach auf RT abgekühlt. Nach

vollständiger Umsetzung (DC-Kontrolle: Kieselgel; Cyclohexan : EtOAc = 1 : 1; Rf = 0.25) wird

tropfenweise zuerst EtOH, danach dem. H2O zugegeben. Sobald keine Gasentwicklung mehr

stattfindet, wird die Mischung mit wässriger 2 M NaOH-Lösung überschichtet und 12 h bei RT

stehen gelassen. Anschließend wird der Niederschlag abfiltriert, der wässrige Rückstand viermal mit

je 30 ml CHCl3 extrahiert, die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet und das

Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Man erhält 0.6 g (2.7 mmol) von Verbindung 16 in Form einer

klaren Flüssigkeit.

EXPERIMENTELLER TEIL 145

Summenformel: C12H18O4

Mr = 226.27 g/mol

Ausbeute: 64 % (Lit. 88 %)137

Aussehen: klare Flüssigkeit (Lit. Flüssigkeit)137

Die 1H-NMR-Daten zu 16 entsprechen der Literaturstelle

138.

IR [cm-1

]: 686; 701; 1082; 1258; 1418; 1590; 2360; 2961; 3059; 3164-3598 (b);

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

6.42 (s, 2H, H-f, H-m); 3.85 (s, 6H, H-h, H-l); 3.82 (s, 3H, H-j); 3.70 (t, 2H, 3J = 6.4, H-b); 2.69-

2.62 (m, 2H, H-d); 1.94-1.85 (m, 2H, H-c); 1.50 (br, 1H, H-a);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

153.0 (C-g, C-k); 137.6 (C-e); 136.0 (C-i); 105.2 (C-f, C-m); 62.0 (C-d); 60.7 (C-j); 55.9 (C-h, C-l);

34.2 (C-b); 32.4 (C-c);

6.2.9 Synthese von 1,3-Diphenylpropan-1-ol 17139

0.26 g (11.0 mmol) Mg-Späne werden bei RT unter Argonatmosphäre in 20 ml abs. Et2O suspendiert

und eine Lösung von 2.0 g (11.0 mmol) 2-Phenylethylbromid in 30 ml abs. Et2O zugetropft. Danach

wird die Reaktionsmischung solange unter Rückfluss erhitzt, bis die Mg-Späne komplett abreagiert

sind. Nach dem Erkalten wird eine Lösung von 1.17 g (11.0 mmol) Benzaldehyd in 30 ml abs. Et2O

zugetropft und 2 h auf dem Wasserbad erhitzt. Nach dem Abkühlen wird Eis zugegeben und der

dadurch entstandene Niederschlag mit halbkonz. wässriger HCl-Lösung gelöst. Die organische Phase

wird abgetrennt und die wässrige Phase zweimal mit je 30 ml Et2O extrahiert. Die vereinigten

organischen Phasen werden dreimal mit je 40 ml ges. wässriger NaHCO3-Lösung, dreimal mit je

40 ml ges. wässriger NaHSO3-Lösung, sowie dreimal mit je 40 ml dem. H2O gewaschen, über

Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wird anschließend

146 EXPERIMENTELLER TEIL

säulenchromatographisch gereinigt (Kieselgel; Cyclohexan : EtOAc = 1 : 1; Rf = 0.69). Man erhält

1.4 g (6.8 mmol) von Verbindung 17 in Form eines klaren Öls.

Summenformel: C15H16O

Mr = 212.29 g/mol

Ausbeute: 61 % (Lit. 54 %)140

Aussehen: klares Öl

Die IR-, 1H-NMR-, und

13C-NMR-Daten zu 17 entsprechen der Literaturstelle

140.

IR [cm-1

]: 697; 746; 1015; 1259; 1453; 1494; 3062; 3115-3520 (b);

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

7.30-7.07 (m, 10H, H-aromat.); 4.60 (dd, 1H, 3J = 7.8,

3J = 5.4, H-i); 2.72-2.53 (m, 2H, H-g); 2.10-

1.89 (m, 2H, H-h); 1.59 (br, 1H, H-p);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

144.6 (C-j); 141.8 (C-f); 128.5 (C-aromat.); 128.4 (4C, C-aromat.); 127.7 (C-aromat.); 125.9 (4C,

C-aromat.); 73.9 (C-i); 40.5 (C-h); 32.1 (C-g);

6.2.10 Darstellung der Piperidinamid-2-carbonsäureester-Derivate 18-29

Allgemeine Vorschrift zur Synthese der Verbindungen 18-29:

1 Äq (Stoffmenge siehe Tabelle 22 - Tabelle 33) des entsprechenden Pipecolinsäureamids

(Verbindungen 13-15, siehe Tabelle 22 - Tabelle 33), 1.1 Äq des entsprechenden Alkohols (siehe

Tabelle 22 - Tabelle 33), 1.6 Äq DCC, 0.35 Äq DMAP und 0.35 Äq p-Toluolsulfonsäure werden

unter Argonatmosphäre in 40 ml abs. CH2Cl2 gelöst. Diese Reaktionsmischung wird 72 h bei RT

gerührt und nach vollständiger Umsetzung (DC-Kontrolle, siehe Tabelle 22 - Tabelle 33) der

Niederschlag abfiltriert. Das Lösungsmittel des Filtrats wird im Vakuum entfernt, der ölige

EXPERIMENTELLER TEIL 147

Rückstand in 30 ml EtOAc suspendiert, abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Dieser

Vorgang des Fällens und der Filtration wird solange wiederholt, bis sich kein weißer Niederschlag

mehr bildet. Um das gewünschte Produkt zu erhalten, wird das Rohprodukt anschließend

säulenchromatographisch (siehe Tabelle 22 - Tabelle 33) gereinigt.

6.2.10.1 Synthese der 1-(3-Methyl-2-oxopentanoyl)piperidin-2-carbonsäureester 18a und 18b

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukte [mmol]

DC bzw. SC (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aussehen

18a C27H33NO4 435.56 13 [1.5];

17 [1.6]

Cyclohexan : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.77 30 weißes Öl

18b C24H35NO7 449.54 13 [1.5];

16 [1.6]

Cyclohexan : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.55 37 weißes Öl

Tabelle 22: Analytische Daten der Verbindungen 18a-18b

IR [cm-1

]:

18a: 698; 744; 1015; 1192; 1236; 1423; 1453; 1643; 1694; 1737; 2860; 2934; 3028;

18b: 669; 746; 1009; 1125; 1235; 1420; 1457; 1589; 1640; 1734; 2873; 2936; 3069;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

18a: 7.39-7.10 (m, 10H, H-aromat.); 5.87-5.63 (m, 1H, H-1); 5.55-5.42 (m, 1H, H-d); 4.68-4.55

(m, 1H, H-h); 3.90-3.80 (m, 1H, H-g); 3.26-3.04 (m, 1H, H-h); 2.80-2.49 (m, 2H, H-9);

148 EXPERIMENTELLER TEIL

2.42-2.00 (m, 4H, H-e, H-k, H-8); 1.80-1.54 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.50-1.20 (m, 3H, H-f,

H-m); 1.15-1.11 (m, 3H, H-l); 0.95-0.86 (m, 3H, H-n);

18b: 6.38 (s, 2H, H-5, H-12); 5.49-5.42 (m, 1H, H-d); 4.15 (t, 2H, 3J = 6.5, H-1); 3.85 (s, 6H,

H-7, H-11); 3.82 (s, 3H, H-9); 3.30-3.20 (m, 1H, H-h); 2.75-2.57 (m, 3H, H-k, H-3); 2.35-

2.25 (m, 1H, H-h); 2.00-1.91 (m, 2H, H-2); 1.78-1.62 (m, 4-H, H-e, H-f, H-g); 1.51-1.30 (m,

4-H, H-e, H-f, H-m); 1.15-1.09 (m, 3H, H-l); 0.97-0.85 (m, 3H, H-n);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

18a: 216.4 (C-j); 176.8 (C-c); 170.8 (C-i); 144.6 (C-2); 141.8 (C-10); 128.5 (4C, C-aromat.);

127.6 (2C, C-aromat.); 125.9 (4C, C-aromat.); 73.8 (C-1); 55.7 (C-d); 51.8 (C-k); 43.3

(C-h); 40.5 (C-8); 32.0 (C-9); 26,9 (C-e); 26.7 (C-m); 25.6 (C-g); 21.1 (C-f); 16.6 (C-l);

11.9 (C-n);

18b: 216.4 (C-j); 176.7 (C-c); 171.8 (C-i); 153.4 (C-6, C-10); 136.9 (C-8); 105.5 (C-5, C-12);

64.5 (C-1); 61.0 (C-9); 56.5 (C-7, C-11); 52.0 (C-d); 43.5 (C-h); 37.3 (C-k); 32.7 (C-3);

30.5 (C-2); 26.9 (C-e); 26.8 (C-m); 25.3 (C-g); 21.3 (C-f); 17.4 (C-l); 11.9 (C-n);

6.2.10.2 Synthese der 1-(2-Phenoxyacetyl)piperidin-2-carbonsäureester 19a-19c

EXPERIMENTELLER TEIL 149

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukte [mmol]

DC bzw. SC (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aus-

sehen

19a C23H27NO5 397.46

14a [2.0];

2-(4-Methoxyphenyl)-

ethanol [2.2]

PE : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.69 60 klares Öl

19b C22H26N2O4 382.45

14a [2.0];

3-(Pyridin-3-yl)-

propan-1-ol [2.2]

EtOAc;

Rf = 0.35 55 klares Öl

19c C24H29NO4 395.49 14a [2.0];

4-Phenylbutan-1-ol [2.2]

PE : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.72 82 gelbes Öl

Tabelle 23: Analytische Daten der Verbindungen 19a-19c

IR [cm-1

]:

19a: 691; 753; 1016; 1161; 1244; 1444; 1512; 1599; 1651; 1733; 2860; 2938; 3065;

19b: 691; 754; 1016; 1162; 1220; 1422; 1496; 1599; 1652; 1733; 2859; 2941; 3029;

19c: 691; 750; 1017; 1162; 1220; 1451; 1496; 1599; 1653; 1734; 2859; 2937; 3026;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 70 : 30 vor.

19a: 7.32-7.26 (m, 2H, H-m; H-o); 7.13-7.06 (m, 2H, H-4, H-9); 7.01-6.88 (m, 3H, H-l, H-n,

H-p); 6.85-6.81 (m, 2H, H-5, H-8); 5.30 (d, 1H, 3J = 5.0, H-d); 4.75 (d, 1H,

2J = 13.7, H-j);

4.67 (d, 1H, 2J = 13.7, H-j); 4.34-4.22 (m, 2H, H-1); 3.84-3.75 (m, 4H, H-h, H-7); 3.15 (dt,

1H, 2J = 13.4,

3J = 3.0, H-h); 2.89-2.78 (m, 2H, H-2); 2.27-2.17 (m, 1H, H-e); 1.69-1.20 (m,

5H, H-e, H-f, H-g);

19a‘: 7.32-7.26 (m, 2H, H-m; H-o); 7.13-7.06 (m, 2H, H-4, H-9); 7.01-6.88 (m, 3H, H-l, H-n,

H-p); 6.85-6.81 (m, 2H, H-5, H-8); 4.82 (d, 1H, 3J = 5.0, H-d); 4.60-4.57 (m, 2H, H-j); 4.45

(d, 1H, 2J = 13.4, H-h); 4.34-4.22 (m, 2H, H-1); 3.84-3.75 (s, 3H, H-7); 2.89-2.78 (m, 2H,

H-2); 2.59 (dt, 1H, 2J = 13.4,

3J = 3.0, H-h); 2.27-2.17 (m, 1H, H-e); 1.69-1.20 (m, 5H, H-e,

H-f, H-g);

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 70 : 30 vor.

19b: 8.50-8.40 (m, 2H, H-5, H-6); 7.50-7.43 (m, 1H, H-8); 7.30-7.24 (m, 2H, H-m; H-o); 7.23-

7.19 (m, 1H, H-7); 6.99-6.90 (m, 3H, H-l, H-n, H-p); 5.32 (d, 1H, 3

J = 5.5, H-d); 4.81-4.63

(m, 2H, H-j); 4.19-4.04 (m, 2H, H-1); 3.90 (d, 1H, 2J = 13.5, H-h); 3.31 (dt, 1H,

2J = 13.5,

3J = 3.0, H-h); 2.69-2.59 (m, 2H, H-3); 2.32-2.20 (m, 1H, H-e); 1.98-1.85 (m, 2H, H-2);

1.79-1.60 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.55-1.29 (m, 2H, H-f, H-g);

19b‘: 8.50-8.40 (m, 2H, H-5, H-6); 7.50-7.43 (m, 1H, H-8); 7.30-7.24 (m, 2H, H-m; H-o); 7.23-

7.19 (m, 1H, H-7); 6.99-6.90 (m, 3H, H-l, H-n, H-p); 4.89 (d, 1H, 3J = 5.5, H-d); 4.81-4.63

(m, 2H, H-j); 4.55-4.49 (m, 1H, H-h); 4.19-4.04 (m, 2H, H-1); 2.74 (dt, 1H, 2J = 13.5,

3J = 3.0, H-h); 2.69-2.59 (m, 2H, H-3); 2.32-2.20 (m, 1H, H-e); 1.98-1.85 (m, 2H, H-2);

1.79-1.60 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.55-1.29 (m, 2H, H-f, H-g);

150 EXPERIMENTELLER TEIL

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 70 : 30 vor.

19c: 7.29-7.22 (m, 4H, H-m, H-o, H-7, H-9) 7.19-7.11 (m, 3H, H-6, H-8, H-10); 6.99-6.87 (m,

3H, H-l, H-n, H-p); 5.29 (d, 1H, 3

J = 5.5, H-d); 4.78-4.60 (m, 2H, H-j); 4.16-4.01 (m, 2H,

H-1); 3.85 (d, 1H, 2J = 13.5, H-h); 3.27 (dt, 1H,

2J = 13.5,

3J = 3.0, H-h); 2.75-2.55 (m, 2H,

H-4); 2.29-2.20 (m, 1H, H-e); 1.74-1.55 (m, 7H, H-e, H-f, H-g, H-2, H-3); 1.50-1.27 (m,

2H, H-f, H-g);

19c‘: 7.29-7.22 (m, 4H, H-m, H-o, H-7, H-9) 7.19-7.11 (m, 3H, H-6, H-8, H-10); 6.99-6.87 (m,

3H, H-l, H-n, H-p); 4.84 (d, 1H, 3

J = 5.5, H-d); 4.78-4.60 (m, 2H, H-j); 4.48 (d, 1H,

2J = 13.5, H-h); 4.16-4.01 (m, 2H, H-1); 2.75-2.55 (m, 3H, H-h, H-4); 2.29-2.20 (m, 1H,

H-e); 1.74-1.55 (m, 7H, H-e, H-f, H-g, H-2, H-3); 1.50-1.27 (m, 2H, H-f, H-g);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 70 : 30 vor.

19a: 170.9 (C-c); 167.9 (C-i); 158.4 (C-k); 158.0 (C-6); 129.8 (C-4, C-9); 129.6 (C-3); 129.5

(C-m, C-o); 121.5 (C-n); 114.7 (C-l, C-p); 113.9 (C-5, C-8); 67.3 (C-j); 65.7 (C-1); 55.3 (C-

7); 52.3 (C-d); 43.0 (C-h); 34.1 (C-2); 26.5 (C-e); 25.2 (C-g); 20.8 (C-f);

19a‘: 170.9 (C-c); 167.9 (C-i); 158.4 (C-k); 158.0 (C-6); 129.8 (C-4, C-9); 129.6 (C-3); 129.5

(C-m, C-o); 121.5 (C-n); 114.7 (C-l, C-p); 113.9 (C-5, C-8); 68.1 (C-j); 65.7 (C-1); 55.9 (C-

d); 55.3 (C-7); 39.9 (C-h); 34.1 (C-2); 27.2 (C-e); 24.5 (C-g); 20.8 (C-f);

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 70 : 30 vor.

19b: 170.9 (C-c); 168.0 (C-i); 158.0 (C-k); 149.9 (C-5); 147.7 (C-6); 136.2 (C-4); 135.8 (C-8);

129.5 (C-m, C-o); 123.4 (C-7); 121.6 (C-n); 114.7 (C-l, C-p); 67.4 (C-j); 64.1 (C-1); 52.3

(C-d); 43.2 (C-h); 29.9 (C-2); 29.2 (C-3); 26.5 (C-e); 25.2 (C-g); 20.9 (C-f);

19b‘: 170.9 (C-c); 168.0 (C-i); 158.0 (C-k); 149.9 (C-5); 147.7 (C-6); 136.2 (C-4); 135.8 (C-8);

129.5 (C-m, C-o); 123.4 (C-7); 121.6 (C-n); 114.7 (C-l, C-p); 68.3 (C-j); 64.1 (C-1); 56.0

(C-d); 40.0 (C-h); 29.9 (C-2); 29.2 (C-3); 27.3 (C-e); 24.5 (C-g); 20.9 (C-f);

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 70 : 30 vor.

19c: 171.0 (C-c); 167.9 (C-i); 158.0 (C-k); 141.9 (C-5); 129.5 (C-m, C-o); 128.4 (C-7, C-9);

128.3 (C-6, C-10); 125.9 (C-8); 121.5 (C-n); 114.6 (C-l, C-p); 67.4 (C-j); 65.1 (C-1); 52.3

(C-d); 43.1 (C-h); 35.3 (C-4); 28.1 (C-3); 27.7 (C-2); 26.6 (C-e); 25.2 (C-g); 21.0 (C-f);

19c‘: 171.0 (C-c); 167.9 (C-i); 158.0 (C-k); 141.9 (C-5); 129.5 (C-m, C-o); 128.4 (C-7, C-9);

128.3 (C-6, C-10); 125.9 (C-8); 121.5 (C-n); 114.6 (C-l, C-p); 67.8 (C-j); 65.1 (C-1); 56.0

(C-d); 40.0 (C-h); 35.3 (C-4); 28.1 (C-3); 27.7 (C-2); 27.2 (C-e); 24.1 (C-g); 21.0 (C-f);

EXPERIMENTELLER TEIL 151

6.2.10.3 Synthese der 1-(2-Phenylacetyl)piperidin-2-carbonsäureester 20a-20c

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukte [mmol]

DC bzw. SC (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aus-

sehen

20a C20H22N2O3 338.40 14b [2.1];

Pyridin-3-ylmethanol [2.3]

EtOAc;

Rf = 0.32 75

klares

Öl

20b C23H27NO4 381.46

14b [2.1];

2-(4-Methoxyphenyl)-

ethanol [2.3]

PE : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.60 33

klares

Öl

20c C24H29NO3 379.49 14b [2.1];

4-Phenylbutan-1-ol [2.3]

PE : EtOAc = 70:30;

Rf = 0.45 63

weißes

Öl

Tabelle 24: Analytische Daten der Verbindungen 20a-20c

IR [cm-1

]:

20a: 697; 730; 1026; 1143; 1190; 1425; 1638; 1736; 2859; 2941; 3030;

20b: 697; 729; 1029; 1176; 1245; 1420; 1512; 1640; 1733; 2859; 2938; 3030;

20c: 697; 728; 1028; 1143; 1199; 1420; 1640; 1732; 2858; 2938; 3026;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

20a: 8.63-8.54 (m, 2H, H-3, H-4); 7.66-7.59 (m, 1H, H-6); 7.33-7.18 (m, 6H, H-l, H-m, H-n,

H-o, H-p, H-5); 5.49-5.46 (m, 1H, H-d); 5.17 (s, 2H, H-1); 3.81-3.68 (m, 3H, H-h, H-j);

3.12 (dt, 1H, 2J = 13.0,

3J = 3.0, H-h); 2.29-2.21 (m, 1H, H-e); 1.70-1.51 (m, 3H, H-e, H-f,

H-g); 1.32-1.15 (m, 2H, H-f, H-g);

152 EXPERIMENTELLER TEIL

20a‘: 8.63-8.54 (m, 2H, H-3, H-4); 7.66-7.59 (m, 1H, H-6); 7.33-7.18 (m, 6H, H-l, H-m, H-n,

H-o, H-p, H-5); 5.04 (s, 2H, H-1); 4.66-4.56 (m, 2H, H-d, H-h); 3.81-3.68 (m, 2H, H-j);

2.67 (dt, 1H, 2J = 13.0,

3J = 3.0, H-h) 2.18-2.10 (m, 1H, H-e); 1.70-1.51 (m, 3H, H-e, H-f,

H-g); 1.32-1.15 (m, 2H, H-f, H-g);

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

20b: 7.35-7.17 (m, 5H, H-l, H-m, H-n, H-o, H-p); 7.12-7.07 (m, 2H, H-4, H-9); 6.87-6.80 (m,

2H, H-5, H-8); 5.43-5.39 (m, 1H, H-d); 4.34-4.18 (m, 2H, H-1); 3.80-3.77 (m, 5H, H-j,

H-7); 3.73-3.65 (m, 1H, H-h); 3.08-2.98 (m, 1H, H-h); 2.91-2.79 (m, 2H, H-2); 2.24-2.15

(m, 1H, H-e); 1.65-1.47 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.39-1.13 (m, 2H, H-f, H-g);

20b‘: 7.35-7.17 (m, 5H, H-l, H-m, H-n, H-o, H-p); 7.12-7.07 (m, 2H, H-4, H-9); 6.87-6.80 (m,

2H, H-5, H-8); 4.59-4.49 (m, 2H, H-d, H-h); 4.34-4.18 (m, 2H, H-1); 3.80-3.77 (m, 5H, H-j,

H-7); 2.91-2.79 (m, 2H, H-2); 2.58 (dt, 1H, 2J = 13.3,

3J = 3.0, H-h) 2.12-2.05 (m, 1H, H-e);

1.65-1.47 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.39-1.13 (m, 2H, H-f, H-g);

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

20c: 7.35-7.11 (m, 10H, H-aromat.); 5.45 (d, 1H, 3J = 5.0, H-d); 4.19-4.02 (m, 2H, H-1); 3.84-

3.70 (m, 3H, H-h, H-j); 3.18 (dt, 1H, 2J = 13.0,

3J = 3.0, H-h); 2.75-2.61 (m, 2H, H-4); 2.31-

2.23 (m, 1H, H-e); 1.74-1.54 (m, 7H, H-e, H-f, H-g, H-2, H-3); 1.46-1.23 (m, 2H, H-f, H-g);

20c‘: 7.35-7.11 (m, 10H, H-aromat.); 4.66-4.56 (m, 2H, H-d, H-h); 4.19-4.02 (m, 2H, H-1); 3.84-

3.70 (m, 2H, H-j); 2.75-2.61 (m, 3H, H-h, H-4); 2.19-2.12 (m, 1H, H-e); 1.74-1.54 (m, 7H,

H-e, H-f, H-g, H-2, H-3); 1.46-1.23 (m, 2H, H-f, H-g);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

20a: 171.1 (C-c); 171.0 (C-i); 149.8 (C-3); 149.5 (C-4); 135.9 (C-6); 134.8 (C-k); 131.3 (C-2);

128.6 (C-l, C-m, C-o, C-p); 126.7 (C-n); 123.5 (C-5); 64.3 (C-1); 52.0 (C-d); 44.1 (C-h);

41.1 (C-j); 26.5 (C-e); 25.0 (C-g); 20.8 (C-f);

20a‘: 171.1 (C-c); 171.0 (C-i); 149.8 (C-3); 149.5 (C-4); 135.9 (C-6); 134.8 (C-k); 131.3 (C-2);

128.6 (C-l, C-m, C-o, C-p); 126.7 (C-n); 123.5 (C-5); 64.3 (C-1); 56.6 (C-d); 41.3 (C-j);

39.6 (C-h); 27.3 (C-e); 24.5 (C-g); 20.8 (C-f);

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

20b: 171.2 (C-c); 170.8 (C-i); 158.4 (C-6); 134.9 (C-k); 129.8 (C-4, C-9); 129.6 (C-3); 128.6

(C-l, C-m, C-o, C-p); 126.7 (C-n); 113.9 (C-5, C-8); 65.6 (C-1); 55.3 (C-7); 52.0 (C-d);

44.0 (C-h); 41.1 (C-j); 34.1 (C-2); 26.5 (C-e); 25.1 (C-g); 20.7 (C-f);

20b‘: 171.2 (C-c); 170.8 (C-i); 158.4 (C-6); 134.9 (C-k); 129.8 (C-4, C-9); 129.6 (C-3); 128.6

(C-l, C-m, C-o, C-p); 126.7 (C-n); 113.9 (C-5, C-8); 65.6 (C-1); 56.6 (C-d); 55.3 (C-7);

41.3 (C-j); 39.5 (C-h); 34.1 (C-2); 27.1 (C-e); 24.5 (C-g); 20.7 (C-f);

EXPERIMENTELLER TEIL 153

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

20c: 171.3 (C-c); 170.8 (C-i); 141.9 (C-5); 134.9 (C-k); 128.6 (C-l, C-p, C-7, C-9); 128.4 (C-m,

C-o, C-6, C-10); 126.7 (C-n); 125.9 (C-8); 65.0 (C-1); 52.0 (C-d); 44.1 (C-h); 41.1 (C-j);

35.4 (C-4); 28.2 (C-3); 27.6 (C-2); 26.6 (C-e); 25.2 (C-g); 20.9 (C-f);

20c‘: 171.3 (C-c); 170.8 (C-i); 141.9 (C-5); 134.9 (C-k); 128.6 (C-l, C-p, C-7, C-9); 128.4 (C-m,

C-o, C-6, C-10); 126.7 (C-n); 125.9 (C-8); 65.0 (C-1); 56.6 (C-d); 41.3 (C-j); 39.6 (C-h);

35.4 (C-4); 28.2 (C-3); 27.6 (C-2); 27.2 (C-e); 24.5 (C-g); 20.9 (C-f);

6.2.10.4 Synthese der 1-(2-(4-Chlorphenyl)acetyl)piperidin-2-carbonsäureester 21a-21c

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukte [mmol]

DC bzw. SC (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aussehen

21a C22H25ClN2O3 400.90

14c [2.0];

3-(Pyridin-3-yl)-

propan-1-ol [2.2]

EtOAc;

Rf = 0.29 68 gelbes Öl

21b C25H30ClNO3 427.96

14c [2.0];

5-Phenyl-

pentan-1-ol [2.2]

PE : EtOAc = 70:30;

Rf = 0.42 68 gelbes Öl

21c C29H30ClNO3 476.01 14c [2.0];

17 [2.2]

PE : EtOAc = 70:30;

Rf = 0.42 51 gelbes Öl

Tabelle 25: Analytische Daten der Verbindungen 21a-21c

154 EXPERIMENTELLER TEIL

IR [cm-1

]:

21a: 714; 768; 1015; 1196; 1422; 1492; 1640; 1733; 2859; 2941; 3031;

21b: 698; 747; 1015; 1200; 1428; 1492; 1644; 1734; 2857; 2933; 3026;

21c: 698; 750; 1015; 1195; 1426; 1493; 1643; 1735; 2857; 2932; 3029;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

21a: 8.49-8.41 (m, 2H, H-5, H-6); 7.50-7.46 (m, 1H, H-8); 7.30-7.15 (m, 5H, H-l; H-m, H-o,

H-p, H-7); 5.40 (d, 1H, 3

J = 5.5, H-d); 4.15 (t, 2H, 3J = 6.5, H-1); 3.78-3.65 (m, 3H, H-j, H-

h); 3.20 (dt, 1H, 2J = 13.0,

3J = 3.0, H-h); 2.68-2.63 (m, 2H, H-3); 2.28-2.21 (m, 1H, H-e);

2.00-1.89 (m, 2H, H-2); 1.75-1.55 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.35-1.23 (m, 2H, H-f, H-g);

21a‘: 8.49-8.41 (m, 2H, H-5, H-6); 7.50-7.46 (m, 1H, H-8); 7.30-7.15 (m, 5H, H-l; H-m, H-o,

H-p, H-7); 4.63-4.51 (m, 2H, H-d, H-h); 4.15 (t, 2H, 3J = 6.5, H-1); 3.78-3.65 (m, 2H, H-j);

2.68-2.63 (m, 3H, H-h, H-3); 2.28-2.21 (m, 1H, H-e); 2.00-1.89 (m, 2H, H-2); 1.75-1.55 (m,

3H, H-e, H-f, H-g); 1.35-1.23 (m, 2H, H-f, H-g);

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

21b: 7.34-7.26 (m, 4H, H-l, H-p, H-8, H-10); 7.24-7.15 (m, 5H, H-m, H-o, H-7, H-9, H-11); 5.41

(d, 1H, 3

J = 5.5, H-d); 4.14 (t, 2H, 3J = 6.7, H-1); 3.78-3.63 (m, 3H, H-j, H-h); 3.17 (dt, 1H,

2J = 13.0,

3J = 3.0, H-h); 2.74-2.57 (m, 2H, H-5); 2.30-2.15 (m, 1H, H-e); 1.73-1.54 (m, 9H,

H-e, H-f, H-g, H-2, H-3, H-4); 1.46-1.25 (m, 2H, H-f, H-g);

21b‘: 7.34-7.26 (m, 4H, H-l, H-p, H-8, H-10); 7.24-7.15 (m, 5H, H-m, H-o, H-7, H-9, H-11);

4.62-4.51 (m, 2H, H-d, H-h); 4.14 (t, 2H, 3J = 6.7, H-1); 3.78-3.63 (m, 2H, H-j); 2.74-2.57

(m, 3H, H-h, H-5); 2.30-2.15 (m, 1H, H-e); 1.73-1.54 (m, 9H, H-e, H-f, H-g, H-2, H-3,

H-4); 1.46-1.25 (m, 2H, H-f, H-g);

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

21c: 7.36-7.03 (m, 14H, H-aromat.); 5.80-5.71 (m, 1H, H-1); 5.48-5.42 (m, 1H, H-d); 3.75-3.51

(m, 3H, H-h, H-j); 3.16 (dt, 1H, 2J = 13.1,

3J = 3.0, H-h); 2.74-2.48 (m, 2H, H-9); 2.35-2.16

(m, 2H, H-8); 2.14-2.03 (m, 1H, H-e); 1.76-1.15 (m, 5H, H-e, H-f, H-g);

21c‘: 7.36-7.03 (m, 14H, H-aromat.); 5.80-5.71 (m, 1H, H-1); 5.13-5.08 (m, 1H, H-d); 4.62-4.47

(m, 1H, H-h); 3.75-3.51 (m, 2H, H-j); 2.74-2.48 (m, 3H, H-h, H-9); 2.35-2.16 (m, 2H, H-8);

2.14-2.03 (m, 1H, H-e); 1.76-1.15 (m, 5H, H-e, H-f, H-g);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

21a: 171.2 (C-c); 170.5 (C-i); 149.9 (C-5); 147.7 (C-6); 135.8 (C-8); 133.3 (C-4); 130.7 (C-k);

130.1 (C-l, C-p); 128.8 (C-m, C-o); 127.0 (C-n); 123.4 (C-7); 64.1 (C-1); 52.1 (C-d); 44.0

(C-h); 40.2 (C-j); 29.9 (C-2); 29.3 (C-3); 26.6 (C-e); 25.2 (C-g); 20.8 (C-f);

EXPERIMENTELLER TEIL 155

21a‘: 171.2 (C-c); 170.5 (C-i); 149.9 (C-5); 147.7 (C-6); 135.8 (C-8); 133.3 (C-4); 130.7 (C-k);

130.1 (C-l, C-p); 128.8 (C-m, C-o); 127.0 (C-n); 123.4 (C-7); 64.1 (C-1); 56.6 (C-d); 40.4

(C-j); 39.7 (C-h); 29.9 (C-2); 29.3 (C-3); 27.3 (C-e); 24.5 (C-g); 20.8 (C-f);

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

21b: 171.2 (C-c); 170.4 (C-i); 142.3 (C-6); 133.4 (C-k); 132.6 (C-n); 130.1 (C-l, C-p); 128.7

(C-m, C-o); 128.4 (C-8, C-10); 128.3 (C-7, C-11); 125.7 (C-9); 65.1 (C-1); 52.1 (C-d); 44.0

(C-h); 40.2 (C-j); 35.7 (C-5); 30.9 (C-4); 28.5 (C-3); 26.6 (C-e); 25.5 (C-2); 25.2 (C-g); 20.8

(C-f);

21b‘: 171.2 (C-c); 170.4 (C-i); 142.3 (C-6); 133.4 (C-k); 132.6 (C-n); 130.1 (C-l, C-p); 128.7

(C-m, C-o); 128.4 (C-8, C-10); 128.3 (C-7, C-11); 125.7 (C-9); 65.1 (C-1); 56.6 (C-d); 40.4

(C-j); 39.6 (C-h); 35.7 (C-5); 30.9 (C-4); 28.5 (C-3); 27.3 (C-e); 25.5 (C-2); 24.5 (C-g); 20.8

(C-f);

Die Rotationsisomere liegen im Verhältnis 80 : 20 vor.

21c: 178.7 (C-c); 170.5 (C-i); 140.7 (C-10); 137.7 (C-2); 133.4 (C-k, C-n); 130.1 (C-l, C-p);

128.8 (C-m, C-o); 128.5 (4C, C-aromat.); 128.3 (4C, C-aromat.); 126.3 (2C, C-aromat.);

76.5 (C-1); 52.1 (C-d); 44.1 (C-h); 40.3 (C-j); 38.0 (C-8); 31.7 (C-9); 26.6 (C-e); 25.2 (C-g);

20.6 (C-f);

21c‘: 178.7 (C-c); 170.5 (C-i); 140.7 (C-10); 137.7 (C-2); 133.4 (C-k, C-n); 130.1 (C-l, C-p);

128.8 (C-m, C-o); 128.5 (4C, C-aromat.); 128.3 (4C, C-aromat.); 126.3 (2C, C-aromat.);

76.5 (C-1); 56.6 (C-d); 40.3 (C-j); 39.7 (C-h); 38.0 (C-8); 31.7 (C-9); 27.5 (C-e); 24.8 (C-g);

20.6 (C-f);

156 EXPERIMENTELLER TEIL

6.2.10.5 Synthese der 1-(Benzylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäureester 22a-22e

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukte [mmol]

DC bzw. SC (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aus-

sehen

22a C25H33NO7S 491.60 15a [2.2];

16 [2.4]

Al2O3;

CHCl3 : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.82

48 gelbes

Wachs

22b141

C25H33NO7S 491.60 15b [2.2];

16 [2.4]

Cyclohexan : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.68 21

gelbes

Wachs

22c C19H22N2O4S 374.45

15a [2.2];

Pyridin-3-yl-

methanol [2.4]

PE : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.26 82 klares Öl

22d C24H31NO4S 429.57

15a [2.2];

5-Phenylpentan-

1-ol [2.4]

PE : EtOAc = 70:30;

Rf = 0.53 96 klares Öl

22e133

C23H29NO4S 415.55

15a [2.2];

4-Phenylbutan-

1-ol [2.4]

PE : EtOAc = 70:30;

Rf = 0.57

48;

(Lit. 48)133

klares Öl;

(Lit. Öl)133

Tabelle 26: Analytische Daten der Verbindungen 22a-22e

Die 1H-NMR-Daten zu 22e entsprechen der Literaturstelle

133.

EXPERIMENTELLER TEIL 157

IR [cm-1

]:

22a: 698; 739; 1010; 1124; 1238; 1336; 1455; 1589; 1733; 2857; 2938; 3063;

22b: 698; 739; 1059; 1124; 1238; 1336; 1455; 1589; 1732; 2858; 2938; 3033;

22c: 698; 739; 1059; 1127; 1148; 1335; 1455; 1579; 1738; 2859; 2944; 3061;

22d: 697; 739; 1059; 1128; 1199; 1336; 1454; 1496; 1732; 2857; 2934; 3061;

22e: 697; 738; 1059; 1128; 1199; 1336; 1454; 1603; 1732; 2859; 2939; 3061;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

22a: 7.49-7.33 (m, 5H, H-k, H-l, H-m, H-n, H-o); 6.41 (s, 2H, H-5, H-12); 4.55-4.50 (m, 1H,

H-d); 4.27 (s, 2H, H-i); 4.24-4.15 (m, 2H, H-1); 3.84 (s, 6H, H-7, H-11); 3.82 (s, 3H, H-9);

3.46-3.40 (m, 1H, H-h); 3.17 (dt, 1H, 2J = 12.4,

3J = 3.1, H-h); 2.66 (t, 2H,

3J = 7.5, H-3);

2.20-2.12 (m, 1H, H-e); 2.03-1.95 (m, 2H, H-2); 1.75-1.50 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.49-1.18

(m, 2H, H-f, H-g);

22b: 7.47-7.32 (m, 5H, H-k, H-l, H-m, H-n, H-o); 6.41 (s, 2H, H-5, H-12); 4.54-4.50 (m, 1H,

H-d); 4.27 (s, 2H, H-i); 4.25-4.15 (m, 2H, H-1); 3.84 (s, 6H, H-7, H-11); 3.82 (s, 3H, H-9);

3.48-3.40 (m, 1H, H-h); 3.17 (dt, 1H, 2J = 12.4,

3J = 3.1, H-h); 2.67 (t, 2H,

3J = 7.5, H-3);

2.19-2.12 (m, 1H, H-e); 2.03-1.95 (m, 2H, H-2); 1.75-1.50 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.49-1.15

(m, 2H, H-f, H-g);

22c: 8.63 (d, 1H, 4J = 2.0, H-3); 8.60 (dd, 1H,

3J = 5.0,

4J = 2.0, H-4); 7.74-7.70 (m, 1H, H-6);

7.45-7.41 (m, 2H, H-k; H-o); 7.39-7.30 (m, 4H, H-l, H-m, H-n, H-5); 5.26 (d, 1H, 2J = 12.6,

H-1); 5.18 (d, 1H, 2J = 12.6, H-1); 4.56 (d, 1H,

3J = 4.0, H-d); 4.25 (d, 2H,

4J = 1.3, H-i);

3.46-3.40 (m, 1H, H-h); 3.14 (dt, 1H, 2J = 12.8,

3J = 3.0, H-h); 2.16-2.10 (m, 1H, H-e); 1.70-

1.51 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.48-1.34 (m, 1H, H-g); 1.20-1.08 (m, 1H, H-f);

22d: 7.50-7.43 (m, 2H, H-k, H-o); 7.39-7.33 (m, 3H, H-l, H-m, H-n); 7.30-7.25 (m, 2H, H-8,

H-10); 7.20-7.15 (m, 3H, H-7; H-9, H-11); 4.58-4.54 (m, 1H, H-d); 4.27 (s, 2H, H-i); 4.24-

4.10 (m, 2H, H-1); 3.48-3.41 (m, 1H, H-h); 3.13 (dt, 1H, 2J = 12.8,

3J = 3.0, H-h); 2.65-2.60

(m, 2H, H-5); 2.16-2.10 (m, 1H, H-e); 1.74-1.57 (m, 7H, H-e, H-2, H-3, H-4); 1.47-1.36 (m,

3H, H-f, H-g); 1.28-1.15 (m, 1H, H-f);

22e: 7.48-7.42 (m, 2H, H-k, H-o); 7.39-7.33 (m, 3H, H-l, H-m, H-n); 7.31-7.26 (m, 2H, H-7,

H-9); 7.21-7.15 (m, 3H, H-6; H-8, H-10); 4.56 (d, 1H, 3J = 4.0, H-d); 4.27 (s, 2H, H-i); 4.25-

4.11 (m, 2H, H-1); 3.48-3.42 (m, 1H, H-h); 3.14 (dt, 1H, 2J = 12.8,

3J = 3.0, H-h); 2.69-2.62

(m, 2H, H-4); 2.18-2.11 (m, 1H, H-e); 1.76-1.57 (m, 7H, H-e, H-2, H-3, H-f, H-g); 1.50-

1.37 (m, 1H, H-g); 1.31-1.15 (m, 1H, H-f);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

22a: 171.5 (C-c); 153.2 (C-6, C-10); 137.9 (C-4); 136.7 (C-8); 131.0 (C-k, C-o); 129.3 (C-j);

128.6 (C-l, C-n); 128.5 (C-m); 105.4 (C-5, C-12); 64.6 (C-1); 60.9 (C-9); 58.9 (C-i); 56.1

158 EXPERIMENTELLER TEIL

(C-7, C-11); 56.1 (C-d); 43.5 (C-h); 32.5 (C-3); 30.3 (C-2); 27.8 (C-e); 25.0 (C-g); 20.4

(C-f);

22b: 171.5 (C-c); 153.2 (C-6, C-10); 137.9 (C-4); 136.7 (C-8); 130.9 (C-k, C-o); 129.3 (C-j);

128.6 (C-l, C-n); 128.5 (C-m); 105.4 (C-5, C-12); 64.6 (C-1); 60.9 (C-9); 58.9 (C-i); 56.1

(C-7, C-11); 56.0 (C-d); 43.5 (C-h); 32.5 (C-3); 30.3 (C-2); 27.8 (C-e); 25.0 (C-g); 20.4

(C-f);

22c: 171.3 (C-c); 149.9 (C-4); 149.6 (C-3); 136.0 (C-6); 131.1 (C-j); 130.9 (C-k, C-o); 129.2

(C-2); 128.6 (C-l, C-m, C-n); 123.6 (C-5); 64.5 (C-1); 58.9 (C-i); 56.0 (C-d); 43.5 (C-h);

27.7 (C-e); 24.9 (C-g); 20.3 (C-f);

22d: 171.5 (C-c); 142.2 (C-6); 131.0 (C-k, C-o); 129.4 (C-j); 128.5 (C-l, C-n); 128.4 (C-m);

128.3 (C-8, C-10); 128.2 (C-7, C-11); 125.8 (C-9); 65.4 (C-1); 58.8 (C-i); 56.0 (C-d); 43.4

(C-h); 35.7 (C-5); 30.9 (C-4); 28.5 (C-3); 27.9 (C-e); 25.5 (C-2); 25.1 (C-g); 20.4 (C-f);

22e: 171.5 (C-c); 141.8 (C-5); 131.0 (C-k, C-o); 129.3 (C-j); 128.5 (C-l, C-n, C-m); 128.4 (C-7,

C-9); 128.3 (C-6, C-10); 125.9 (C-8); 65.2 (C-1); 58.8 (C-i); 56.0 (C-d); 43.4 (C-h); 35.3

(C-4); 28.2 (C-3); 27.8 (C-2); 27.6 (C-e); 25.0 (C-g); 20.4 (C-f);

6.2.10.6 Synthese der 1-((4-Methylbenzyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäureester 23a und 23b

EXPERIMENTELLER TEIL 159

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukte [mmol]

DC bzw. SC (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aus-

sehen

23a C20H24N2O4S 388.48 15c [1.1];

Pyridin-3-ylmethanol [1.2]

EtOAc;

Rf = 0.49 55

braunes

Öl

23b C25H33NO4S 443.60 15c [1.1];

5-Phenylpentan-1-ol [1.2]

PE : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.68 58

klares

Öl

Tabelle 27: Analytische Daten der Verbindungen 23a-23b

IR [cm-1

]:

23a: 711; 766; 969; 1059; 1128; 1148; 1335; 1448; 1514; 1738; 2856; 2929; 3031;

23b: 699; 748; 966; 1059; 1129; 1149; 1336; 1453; 1514; 1733; 2858; 2934; 3026;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

23a: 8.63 (d, 1H, 4J = 1.7, H-3); 8.60 (dd, 1H,

3J = 4.8,

4J = 1.7, H-4); 7.74-7.69 (m, 1H, H-6);

7.34-7.28 (m, 3H, H-k, H-p, H-5); 7.16 (d, 2H, 3J = 7.8, H-l, H-o); 5.26 (d, 1H,

2J = 12.6,

H-1); 5.18 (d, 1H, 2J = 12.6, H-1); 4.56 (d, 1H,

3J = 3.7, H-d); 4.20 (d, 2H,

4J = 1.1, H-i);

3.48-3.40 (m, 1H, H-h); 3.14 (dt, 1H, 2J = 12.8,

3J = 3.0, H-h); 2.35 (s, 3H, H-n); 2.16-2.09

(m, 1H, H-e); 1.71-1.09 (m, 5H, H-e, H-f, H-g);

23b: 7.34 (d, 2H, 3J = 8.0, H-k, H-p); 7.30-7.24 (m, 2H, H-8, H-10); 7.21-7.14 (m, 5H, H-l, H-o,

H-7, H-9, H-11); 4.56 (d, 1H, 3J = 4.8, H-d); 4.24-4.09 (m, 4H, H-i, H-1); 3.48-3.42 (m, 1H,

H-h); 3.13 (dt, 1H, 2J = 12.8,

3J = 3.0, H-h); 2.63 (t, 2H,

3J = 8.0, H-5); 2.35 (s, 3H, H-n);

2.16-2.09 (m, 1H, H-e); 1.74-1.56 (m, 7H, H-e, H-f, H-g, H-2, H-4); 1.50-1.16 (m, 4H, H-f,

H-g, H-3);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

23a: 171.3 (C-c); 149.9 (C-4); 149.6 (C-3); 138.4 (C-m); 136.0 (C-6); 131.1 (C-2); 130.8 (C-k,

C-p); 129.3 (C-l, C-o); 126.1 (C-j); 123.5 (C-5); 64.5 (C-1); 58.6 (C-i); 56.0 (C-d); 43.4

(C-h); 27.7 (C-e); 24.9 (C-g); 21.2 (C-n); 20.3 (C-f);

23b: 171.6 (C-c); 142.2 (C-6); 138.3 (C-m); 130.8 (C-k, C-p); 129.2 (C-l, C-o); 128.4 (C-8,

C-10); 128.3 (C-7, C-11); 126.2 (C-j); 125.7 (C-9); 65.3 (C-1); 58.4 (C-i); 56.0 (C-d); 43.4

(C-h); 35.7 (C-5); 30.9 (C-2); 28.5 (C-3); 27.9 (C-e); 25.5 (C-4); 25.1 (C-g); 21.2 (C-n);

20.4 (C-f);

160 EXPERIMENTELLER TEIL

6.2.10.7 Synthese der 1-((4-Chlorbenzyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäureester 24a und 24b

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukte [mmol]

DC bzw. SC (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aus-

sehen

24a C19H21ClN2O4S 408.90 15d [1.4];

Pyridin-3-ylmethanol [1.5]

EtOAc;

Rf = 0.48 88

gelbes

Wachs

24b C24H30ClNO4S 464.02 15d [1.4];

5-Phenylpentan-1-ol [1.5]

PE : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.68 50

gelbes

Öl

Tabelle 28: Analytische Daten der Verbindungen 24a-24b

IR [cm-1

]:

24a: 711; 731; 968; 1059; 1128; 1148; 1336; 1492; 1578; 1738; 2854; 2932; 3034;

24b: 699; 730; 966; 1059; 1129; 1149; 1302; 1336; 1492; 1733; 2857; 2932; 3026;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

24a: 8.64 (d, 1H, 4J = 2.0, H-3); 8.61 (dd, 1H,

3J = 4.8,

4J = 2.0, H-4); 7.73-7.69 (m, 1H, H-6);

7.40-7.30 (m, 5H, H-k, H-l, H-n, H-o, H-5); 5.27 (d, 1H, 2J = 12.5, H-1); 5.18 (d, 1H,

2J = 12.5, H-1); 4.62 (d, 1H,

3J = 4.0, H-d); 4.24 (d, 1H,

2J = 13.8, H-i); 4.19 (d, 1H,

2J = 13.8, H-i); 3.48-3.38 (m, 1H, H-h); 3.11 (dt, 1H,

2J = 12.8,

3J = 3.0, H-h); 2.21-2.13 (m,

1H, H-e); 1.73-1.53 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.51-1.36 (m, 1H, H-g); 1.22-1.10 (m, 1H, H-f);

24b: 7.44-7.39 (m, 2H, H-l, H-n); 7.36-7.31 (m, 2H, H-k, H-o); 7.30-7.25 (m, 2H, H-8, H-10);

7.20-7.15 (m, 3H, H-7; H-9, H-11); 4.61 (d, 1H, 3J = 4.0, H-d); 4.25-4.09 (m, 4H, H-i, H-1);

3.48-3.42 (m, 1H, H-h); 3.09 (dt, 1H, 2J = 12.8,

3J = 3.0, H-h); 2.63 (t, 2H,

3J = 8.0, H-5);

2.19-2.13 (m, 1H, H-e); 1.77-1.61 (m, 7H, H-e, H-f, H-g, H-2, H-4); 1.50-1.12 (m, 4H, H-f,

H-g, H-3);

EXPERIMENTELLER TEIL 161

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

24a: 171.2 (C-c); 150.0 (C-4); 149.7 (C-3); 136.0 (C-6); 134.7 (C-j); 132.2 (C-k, C-o); 131.0

(C-2); 128.8 (C-l, C-n); 127.7 (C-m); 123.6 (C-5); 64.6 (C-1); 58.1 (C-i); 56.0 (C-d); 43.5

(C-h); 27.8 (C-e); 25.0 (C-g); 20.3 (C-f);

24b: 171.5 (C-c); 142.2 (C-6); 134.6 (C-j); 132.3 (C-k, C-o); 128.8 (C-l, C-n); 128.4 (C-8, C-10);

128.3 (C-7, C-11); 127.9 (C-m); 125.8 (C-9); 65.5 (C-1); 58.0 (C-i); 56.0 (C-d); 43.5 (C-h);

35.7 (C-5); 30.9 (C-2); 28.5 (C-3); 27.9 (C-e); 25.5 (C-4); 25.1 (C-g); 20.4 (C-f);

6.2.10.8 Synthese von 1-((2-Nitrobenzyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(pyridin-3-yl)-

propyl)ester 25

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukte [mmol]

DC bzw. SC (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aus-

sehen

25 C21H25N3O6S 447.50 15e [0.5];

3-(Pyridin-3-yl)propan-1-ol [0.6]

EtOAc;

Rf = 0.33 69

braunes

Öl

Tabelle 29: Analytische Daten der Verbindung 25

IR [cm-1

]: 712; 737; 966; 1059; 1147; 1197; 1336; 1351; 1528; 1733; 2861; 2945; 3031;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

8.50-8.45 (m, 2H, H-5, H-6); 8.07-8.04 (m, 1H, H-n); 7.63-7.60 (m, 2H, H-k, H-m); 7.56-7.50 (m,

2H, H-l, H-8); 7.25-7.22 (m, 1H, H-7); 4.91 (d, 1H, 2J = 13.7, H-i); 4.87 (d, 1H,

2J = 13.7, H-i); 4.61

(d, 1H, 3J = 4.5, H-d); 4.23 (t, 2H,

3J = 7.0, H-1); 3.66-3.59 (m, 1H, H-h); 3.26 (dt, 1H,

2J = 12.6,

3J = 3.0, H-h); 2.74 (t, 2H,

3J = 7.0, H-3); 2.23-2.16 (m, 1H, H-e); 2.08-1.98 (m, 2H, H-2); 1.79-1.60

(m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.57-1.43 (m, 1H, H-g); 1.30-1.18 (m, 1H, H-f);

162 EXPERIMENTELLER TEIL

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

171.4 (C-c); 153.4 (C-o); 149.8 (C-5); 147.6 (C-6); 136.2 (C-4); 136.0 (C-8); 134.1 (C-k); 133.2

(C-m); 129.6 (C-l); 125.6 (C-n); 124.3 (C-j); 123.5 (C-7); 64.5 (C-1); 56.1 (C-d); 54.3 (C-i); 43.2

(C-h); 29.9 (C-2); 29.3 (C-3); 28.0 (C-e); 24.9 (C-g); 20.3 (C-f);

6.2.10.9 Synthese der 1-(Phenylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäureester 26a-26i

EXPERIMENTELLER TEIL 163

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukte

[mmol] DC bzw. SC

(Kieselgel) Ausbeute

[%]

Aus-

sehen

26a C24H31NO7S 457.57 15f [2.5];

16 [2.8]

Al2O3;

Cyclohexan : EtOAc =

80:20; Rf = 0.33

28 gelbes

Wachs

26b C18H20N2O4S 360.43

15f [2.5];

Pyridin-3-yl-

methanol [2.8]

PE : EtOAc = 1:1

(+5 % Et3N);

Rf = 0.35

8 gelbes Öl

26c C23H29NO4S 415.55

15f [2.5];

5-Phenyl-

pentan-1-ol [2.8]

PE : EtOAc = 1:1

(+5 % Et3N);

Rf = 0.82

23 klares Öl

26d133

C22H27NO4S 401.52

15f [2.5];

4-Phenyl-

butan-1-ol [2.8]

PE : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.87 16 klares Öl

26e C21H25NO5S 403.49

Verb. 15f [2.5];

2-(4-Methoxy-

phenyl)ethanol [2.8]

PE : EtOAc = 1:1

(+5 % Et3N);

Rf = 0.74

22 klares Öl

26f C20H23NO4S 373.47 Verb. 15f [2.5];

2-Phenylethanol [2.8]

PE : EtOAc = 1:1

(+5 % Et3N);

Rf = 0.82

9 weißes

Öl

26g C21H25NO4S 387.49

Verb. 15f [2.5];

3-Phenyl-

propan-1-ol [2.8]

Cyclohexan : EtOAc =

1:1; Rf = 0.77 76 gelbes Öl

26h C20H24N2O4S 388.48

Verb. 15f [2.5];

3-(Pyridin-3-yl)-

propan-1-ol [2.8]

Cyclohexan : EtOAc =

1:1 (+5 % Et3N);

Rf = 0.42

83 gelbes Öl

26i142

C22H27NO5S 417.52

Verb. 15f [2.5];

3-(4-Methoxy-phenyl)-

propan-1-ol [2.8]

PE : EtOAc = 1:1

(+5 % Et3N);

Rf = 0.79

19 klares Öl

Tabelle 30: Analytische Daten der Verbindungen 26a-26i

IR [cm-1

]:

26a: 690; 738; 1056; 1115; 1160; 1334; 1449; 1591; 1739; 2860; 2947; 3059;

26b: 689; 738; 970; 1056; 1111; 1154; 1336; 1446; 1578; 1741; 2858; 2943; 3061;

26c: 690; 738; 963; 1093; 1157; 1338; 1446; 1603; 1735; 2857; 2933; 3061;

26d: 689; 737; 964; 1093; 1156; 1338; 1446; 1604; 1736; 2859; 2941; 3061;

26e: 689; 738; 1034; 1111; 1156; 1245; 1337; 1445; 1513; 1612; 1736; 2852; 2932; 3063;

26f: 690; 736; 1056; 1093; 1156; 1240; 1338; 1446; 1735; 2859; 2945; 3062;

26g: 689; 737; 1093; 1112; 1157; 1339; 1446; 1734; 2115; 2855; 2929; 3059;

26h: 690; 738; 1093; 1111; 1160; 1336; 1446; 1576; 1737; 2862; 2944; 3062;

26i: 689; 737; 1056; 1111; 1156; 1244; 1337; 1445; 1512; 1612; 1736; 2859; 2943; 3062;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

26a: 7.82-7.78 (m, 2H, H-j, H-n); 7.58-7.41 (m, 3H, H-k, H-l, H-m); 6.38 (s, 2H, H-5, H-12);

4.80-4.75 (m, 1H, H-d); 4.08-3.93 (m, 2H, H-1); 3.84 (s, 6H, H-7, H-11); 3.82 (s, 3H, H-9);

3.80-3.73 (m, 1H, H-h); 3.25 (dt, 1H, 2J = 12.7,

3J = 2.9, H-h); 2.62-2.56 (m, 2H, H-3); 2.19-

164 EXPERIMENTELLER TEIL

2.10 (m, 1H, H-e); 1.93-1.82 (m, 2H, H-2); 1.80-1.60 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.53-1.39 (m,

1H, H-g); 1.37-1.20 (m, 1H, H-f);

26b: 8.59 (d, 1H, 3J = 3.6, H-4); 8.52 (s, 1H, H-3); 7.78-7.73 (m, 2H, H-j; H-n); 7.63-7.58 (m, 1H,

H-6); 7.56-7.50 (m, 1H, H-l); 7.47-7.41 (m, 2H, H-k, H-m); 7.32-7.27 (m, 1H, H-5); 5.07 (d,

1H, 2

J = 12.5, H-1); 4.95 (d, 1H, 2

J = 12.5, H-1); 4.80 (d, 1H, 3

J = 5.0, H-d); 3.80-3.73 (m,

1H, H-h); 3.19 (dt, 1H, 2J = 12.7,

3J = 3.0, H-h); 2.16-2.09 (m, 1H, H-e); 1.82-1.38 (m, 3H,

H-e, H-f, H-g); 1.28-1.15 (m, 2H, H-f, H-g);

26c: 7.84-7.73 (m, 2H, H-j, H-n); 7.54-7.41 (m, 3H, H-k, H-l, H-m); 7.29-7.24 (m, 2H, H-8,

H-10); 7.20-7.12 (m, 3H, H-7, H-9, H-11); 4.72 (d, 1H, 3J = 4.7, H-d); 3.99-3.80 (m, 2H, H-

1); 3.78-3.71 (m, 1H, H-h); 3.17 (dt, 1H, 2J = 12.7,

3J = 3.0, H-h); 2.61-2.55 (m, 2H, H-5);

2.12-2.04 (m, 1H, H-e); 1.79-1.20 (m, 11H, H-2, H-3, H-4, H-e, H-f, H-g);

26d: 7.82-7.73 (m, 2H, H-j, H-n); 7.54-7.48 (m, 1H, H-l); 7.46-7.41 (m, 2H, H-k, H-m); 7.32-

7.27 (m, 2H, H-7, H-9); 7.22-7.14 (m, 3H, H-6, H-8, H-10); 4.75 (d, 1H, 3

J = 5.0, H-d);

4.04-3.85 (m, 2H, H-1); 3.81-3.75 (m, 1H, H-h); 3.21 (dt, 1H, 2J = 12.7,

3J = 3.0, H-h); 2.61

(t, 2H, 3J = 7.4, H-4); 2.15-2.08 (m, 1H, H-e); 1.80-1.42 (m, 7H, H-e, H-f, H-g, H-2, H-3);

1.33-1.23 (m, 2H, H-f, H-g);

26e: 7.84-7.72 (m, 2H, H-j, H-n); 7.59-7.43 (m, 3H, H-k, H-l, H-m); 7.06 (d, 2H, 3J = 8.7, H-4,

H-9); 6.83 (d, 2H, 3J = 8.7, H-5, H-8); 4.73 (d, 1H,

3J = 5.0, H-d); 4.19-4.02 (m, 2H, H-1);

3.80-3.71 (m, 4H, H-h, H-7); 3.11 (dt, 1H, 2J = 12.7,

3J = 3.0, H-h); 2.75 (dt, 2H,

3J = 7.0,

4J = 3.0, H-2); 2.08-2.01 (m, 1H, H-e); 1.80-1.10 (m, 5H, H-e, H-f, H-g);

26f: 7.81-7.71 (m, 2H, H-j, H-n); 7.57-7.42 (m, 3H, H-k, H-l, H-m) 7.32-7.17 (m, 3H, H-5, H-6,

H-7); 7.15-7.11 (m, 2H, H-4, H-8); 4.71 (d, 1H, 3J = 5.3, H-d); 4.24-4.04 (m, 2H, H-1);

3.75-3.67 (m, 1H, H-h); 3.07 (dt, 1H, 2J = 12.7,

3J = 3.0, H-h); 2.82-2.76 (m, 2H, H-2); 2.06-

1.97 (m, 1H, H-e); 1.79-1.20 (m, 5H, H-e, H-f, H-g);

26g: 7.84-7.70 (m, 2H, H-j, H-n); 7.53-7.48 (m, 1H, H-l); 7.47-7.40 (m, 2H, H-k, H-m); 7.31-

7.25 (m, 2H, H-6, H-8); 7.22-7.16 (m, 1H, H-7); 7.15-7.11 (m, 2H, H-5, H-9); 4.75 (d, 1H,

3J = 5.0, H-d); 4.04-3.85 (m, 2H, H-1); 3.81-3.73 (m, 1H, H-h); 3.23 (dt, 1H,

2J = 12.7,

3J = 3.0, H-h); 2.63-2.57 (m, 2H, H-3); 2.16-2.08 (m, 1H, H-e); 1.94-1.59 (m, 5H, H-2, H-e,

H-f, H-g); 1.38-1.18 (m, 2H, H-f, H-g);

26h: 8.51-8.43 (m, 2H, H-5, H-6); 7.82-7.78 (m, 2H, H-j, H-n); 7.63-7.57 (m, 1H, H-8); 7.56-7.44

(m, 3H, H-k, H-l, H-m); 7.33-7.27 (m, 1H, H-7); 4.77-4.74 (m, 1H, H-d); 4.06-3.95 (m, 2H,

H-1); 3.79-3.72 (m, 1H, H-h); 3.23 (dt, 1H, 2J = 12.7,

3J = 2.9, H-h); 2.71-2.66 (m, 2H, H-3);

2.18-2.07 (m, 1H, H-e); 1.93-1.84 (m, 2H, H-2); 1.81-1.58 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.52-1.37

(m, 1H, H-g); 1.35-1.20 (m, 1H, H-f);

26i: 7.82-7.76 (m, 2H, H-j, H-n); 7.55-7.42 (m, 3H, H-k, H-l, H-m); 7.11-7.03 (m, 2H, H-5,

H-10); 6.86-6.81 (m, 2H, H-6, H-9); 4.76 (d, 1H, 3

J = 4.8, H-d); 4.04-3.86 (m, 2H, H-1);

3.82-3.75 (m, 4H, H-h, H-8); 3.24 (dt, 1H, 2J = 12.7,

3J = 3.0, H-h); 2.59-2.53 (m, 2H, H-3);

EXPERIMENTELLER TEIL 165

2.16-2.10 (m, 1H, H-e); 1.86-1.61 (m, 5H, H-e, H-f, H-g, H-2); 1.54-1.42 (m, 1H, H-g);

1.35-1.25 (m, 1H, H-f);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

26a: 170.8 (C-c); 153.2 (C-6, C-10); 140.2 (C-i); 136.6 (C-4); 136.4 (C-8); 132.4 (C-l); 128.8

(C-k, C-m); 127.1 (C-j, C-n); 105.4 (C-5, C-12); 64.4 (C-1); 60.8 (C-9); 56.1 (C-7, C-11);

55.1 (C-d); 42.7 (C-h); 32.4 (C-3); 30.2 (C-2); 27.8 (C-e); 24.6 (C-g); 20.1 (C-f);

26b: 170.5 (C-c); 149.9 (C-4); 149.6 (C-3); 140.0 (C-i); 136.6 (C-2); 136.0 (C-6); 132.5 (C-l);

128.8 (C-k, C-m); 127.1 (C-j, C-n); 123.5 (C-5); 64.2 (C-1); 55.1 (C-d); 42.7 (C-h); 27.8

(C-e); 24.6 (C-g); 20.0 (C-f);

26c: 170.7 (C-c); 142.2 (C-6); 140.1 (C-i); 132.3 (C-l); 128.8 (C-k, C-m); 128.4 (C-8, C-10);

128.3 (C-7, C-11); 127.1 (C-j, C-n); 125.8 (C-9); 65.0 (C-1); 55.1 (C-d); 42.6 (C-h); 35.7

(C-5); 30.9 (C-4); 28.3 (C-3); 27.9 (C-e); 25.4 (C-2); 24.7 (C-g); 20.0 (C-f);

26d: 170.7 (C-c); 141.8 (C-5); 140.1 (C-i); 132.3 (C-l); 128.8 (C-k, C-m); 128.4 (C-7, C-9);

128.3 (C-6, C-10); 127.1 (C-j, C-n); 125.9 (C-8); 64.9 (C-1); 55.1 (C-d); 42.6 (C-h); 35.3

(C-4); 28.0 (C-3); 27.9 (C-2); 27.6 (C-e); 24.7 (C-g); 20.1 (C-f);

26e: 170.6 (C-c); 158.4 (C-6); 140.1 (C-i); 132.3 (C-l); 129.8 (C-4, C-9); 129.3 (C-3); 128.8

(C-k, C-m); 127.2 (C-j, C-n); 114.0 (C-5, C-8); 65.6 (C-1); 55.3 (C-d); 55.1 (C-7); 42.5

(C-h); 34.0 (C-2); 27.8 (C-e); 24.7 (C-g); 19.9 (C-f);

26f: 170.6 (C-c); 140.1 (C-i); 137.4 (C-3); 132.3 (C-l); 128.8 (C-k, C-m, C-5, C-7); 128.5 (C-4,

C-8); 127.2 (C-j, C-n); 126.7 (C-6); 65.3 (C-1); 55.0 (C-d); 42.5 (C-h); 34.8 (C-2); 27.8

(C-e); 24.6 (C-g); 19.9 (C-f);

26g: 170.4 (C-c); 140.5 (C-i); 139.8 (C-4); 132.0 (C-l); 128.5 (C-k, C-m); 128.2 (C-6, C-8);

128.0 (C-5, C-9); 126.8 (C-j, C-n); 125.8 (C-7); 64.1 (C-1); 54.7 (C-d); 42.3 (C-h); 31.7

(C-3); 29.7 (C-2); 27.6 (C-e); 24.4 (C-g); 19.7 (C-f);

26h: 170.7 (C-c); 148.7 (C-5); 146.6 (C-6); 140.2 (C-i); 137.1 (C-8); 136.8 (C-4); 132.4 (C-l);

128.9 (C-k, C-m); 127.1 (C-j, C-n); 123.8 (C-7); 63.9 (C-1); 55.1 (C-d); 42.7 (C-h); 29.7

(C-2); 29.2 (C-3); 27.7 (C-e); 24.6 (C-g); 20.1 (C-f);

26i: 170.7 (C-c); 158.0 (C-7); 140.1 (C-i); 132.9 (C-4); 132.4 (C-l); 129.3 (C-5, C-10); 128.8

(C-k, C-m); 127.1 (C-j, C-n); 113.9 (C-6, C-9); 64.4 (C-1); 55.3 (C-8); 55.1 (C-d); 42.7 (C-

h); 31.1 (C-3); 30.3 (C-2); 27.9 (C-e); 24.7 (C-g); 20.1 (C-f);

166 EXPERIMENTELLER TEIL

6.2.10.10 Synthese der 1-((3-Nitrophenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäureester 27a-27e

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukte [mmol]

DC bzw. SC (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aus-

sehen

27a C20H22N2O6S 418.46 15h [2.5];

2-Phenylethanol [2.8]

PE : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.84 97 gelbes Öl

27b C21H24N2O7S 448.49

15h [2.5];

2-(4-Methoxy-

phenyl)ethanol [2.8]

PE : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.75 97 gelbes Öl

27c C24H30N2O9S 522.57 15h [2.5];

16 [2.8]

Cyclohexan : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.48 40 gelbes Öl

27d C20H23N3O6S 433.48

15h [2.5];

3-(Pyridin-3-yl)-

propan-1-ol [2.8]

EtOAc;

Rf = 0.40 81 gelbes Öl

27e C23H28N2O6S 460.54

15h [2.5];

5-Phenyl-

pentan-1-ol [2.8]

PE : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.50 70 gelbes Öl

Tabelle 31: Analytische Daten der Verbindungen 27a-27e

IR [cm-1

]:

27a: 700; 735; 1058; 1125; 1161; 1300; 1349; 1454; 1530; 1736; 2861; 2945; 3087;

27b: 715; 735; 1034; 1125; 1161; 1245; 1350; 1464; 1530; 1736; 2859; 2936; 3088;

27c: 715; 735; 1071; 1123; 1162; 1238; 1350; 1457; 1531; 1589; 1736; 2860; 2940; 3085;

EXPERIMENTELLER TEIL 167

27d: 714; 735; 1058; 1125; 1161; 1300; 1350; 1423; 1530; 1736; 2861; 2947; 3086;

27e: 715; 734; 1058; 1125; 1161; 1300; 1349; 1453; 1531; 1736; 2857; 2932; 3085;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

27a: 8.59 (t, 1H, 4J = 2.0, H-j); 8.39 (ddd, 1H,

3J = 8.0,

4J = 2.0,

4J = 1.0, H-l); 8.04 (ddd, 1H,

3J = 8.0,

4J = 2.0,

4J = 1.0, H-n); 7.65 (t, 1H,

3J = 8.0, H-m); 7.32-7.19 (m, 3H, H-4, H-6,

H-8); 7.16-7.12 (m, 2H, H-5, H-7); 4.77 (d, 1H, 3J = 5.0, H-d); 4.26-4.14 (m, 2H, H-1);

3.80-3.73 (m, 1H, H-h); 3.05 (dt, 1H, 2J = 12.7,

3J = 2.9, H-h); 2.85 (dt, 2H,

3J = 7.0,

4J = 3.5,

H-2); 2.14-2.07 (m, 1H, H-e); 1.82-1.43 (m, 4H, H-e, H-f, H-g); 1.12-1.05 (m, 1H, H-f);

27b: 8.60 (t, 1H, 4J = 2.0, H-j); 8.39 (ddd, 1H,

3J = 8.0,

4J = 2.0,

4J = 1.0, H-l); 8.04 (ddd, 1H,

3J = 8.0,

4J = 2.0,

4J = 1.0, H-n); 7.66 (t, 1H,

3J = 8.0, H-m); 7.08-7.03 (m, 2H, H-4, H-9);

6.86-6.81 (m, 2H, H-5, H-8); 4.78 (d, 1H, 3J = 5.0, H-d); 4.21-4.10 (m, 2H, H-1); 3.81-3.74

(m, 4H, H-h, H-7); 3.07 (dt, 1H, 2J = 12.7,

3J = 2.9, H-h); 2.79 (dt, 2H,

3J = 7.0,

4J = 3.0,

H-2); 2.16-2.08 (m, 1H, H-e); 1.83-1.44 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.32-1.10 (m, 2H, H-f,

H-g);

27c: 8.62-8.60 (m, 1H, H-j); 8.41-8.37 (m, 1H, H-l); 8.12-8.08 (m, 1H, H-n); 7.68 (t, 1H, 3J = 8.0,

H-m); 6.37 (s, 2H, H-5, H-12); 4.82 (d, 1H, 3J = 4.9, H-d); 4.07-3.96 (m, 2H, H-1); 3.85 (s,

6H, H-7, H-11); 3.83 (s, 3H, H-9); 3.75-3.69 (m, 1H, H-h); 3.20 (dt, 1H, 2J = 12.7,

3J = 3.0,

H-h); 2.60-2.54 (m, 2H, H-3); 2.24-2.17 (m, 1H, H-e); 1.94-1.83 (m, 2H, H-2); 1.94-1.66

(m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.62-1.47 (m, 1H, H-g); 1.35-1.12 (m, 1H, H-f);

27d: 8.62-8.59 (m, 1H, H-j); 8.50-8.44 (m, 2H, H-5, H-6); 8.41-8.37 (m, 1H, H-l); 8.13-8.09 (m,

1H, H-n); 7.69 (t, 1H, 3J = 8.0, H-m); 7.59-7.55 (m, 1H, H-8); 7.32-7.27 (m,1H, H-7); 4.81

(d, 1H, 3J = 4.9, H-d); 4.08-3.99 (m, 2H, H-1); 3.83-3.76 (m, 1H, H-h); 3.18 (dt, 1H,

2J = 12.7,

3J = 2.9, H-h); 2.71-2.66 (m, 2H, H-3); 2.24-2.16 (m, 1H, H-e); 1.96-1.87 (m, 2H,

H-2); 1.87-1.67 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.61-1.47 (m, 1H, H-g); 1.32-1.10 (m, 1H, H-f);

27e: 8.60 (t, 1H, 4J = 2.0, H-j); 8.39 (ddd, 1H,

3J = 8.0,

4J = 2.0,

4J = 1.0, H-l); 8.09 (ddd, 1H,

3J = 8.0,

4J = 2.0,

4J = 1.0, H-n); 7.67 (t, 1H,

3J = 8.0, H-m); 7.30-7.25 (m, 2H, H-8, H-10);

7.21-7.14 (m, 3H, H-7, H-9, H-11); 4.79 (d, 1H, 3J = 5.0, H-d); 4.00-3.88 (m, 2H, H-1); 3.81

(d, 1H, 2J = 12.7, H-h); 3.14 (dt, 1H,

2J = 12.7,

3J = 2.9, H-h); 2.60 (t, 2H,

3J = 7.6, H-5);

2.21-2.14 (m, 1H, H-e); 1.85-1.49 (m, 9H, H-e, H-f, H-g, H-2, H-3, H-4); 1.35-1.15 (m, 2H,

H-f, H-g);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

27a: 170.2 (C-c); 142.1 (C-k); 137.1 (C-3); 135.3 (C-i); 132.8 (C-n); 130.0 (C-m); 128.8 (C-5,

C-7); 128.6 (C-4, C-8); 126.8 (C-l, C-6); 122.5 (C-j); 65.6 (C-1); 55.5 (C-d); 42.8 (C-h);

34.9 (C-2); 27.9 (C-e); 24.8 (C-g); 19.9 (C-f);

168 EXPERIMENTELLER TEIL

27b: 170.2 (C-c); 158.5 (C-6); 148.1 (C-k); 142.1 (C-i); 132.8 (C-n); 130.0 (C-m); 129.7 (C-4,

C-9); 129.1 (C-3); 126.8 (C-l); 122.5 (C-j); 114.0 (C-5, C-8); 65.8 (C-1); 55.5 (C-7), 55.3

(C-d); 42.8 (C-h); 34.0 (C-2); 28.0 (C-e); 24.8 (C-g); 19.9 (C-f);

27c: 170.3 (C-c); 153.3 (C-6, C-10); 148.1 (C-k); 142.1 (C-4); 136.5 (C-i, C-8); 132.7 (C-n);

130.1 (C-m); 126.8 (C-l); 122.5 (C-j); 105.3 (C-5, C-12); 64.7 (C-1); 60.8 (C-9); 56.1 (C-7,

C-11); 55.5 (C-d); 42.9 (C-h); 32.4 (C-3); 30.1 (C-2); 28.0 (C-e); 24.8 (C-g); 20.0 (C-f);

27d: 170.3 (C-c); 148.9 (C-5); 148.1 (C-k); 146.9 (C-6); 142.1 (C-4); 136.7 (C-8); 136.5 (C-i);

132.7 (C-n); 130.1 (C-m); 126.9 (C-l); 123.8 (C-7); 122.4 (C-j); 64.3 (C-1); 55.5 (C-d); 42.9

(C-h); 29.7 (C-2); 29.2 (C-3); 27.9 (C-e); 24.7 (C-g); 20.1 (C-f);

27e: 170.3 (C-c); 148.1 (C-k); 142.1 (C-6); 138.2 (C-i); 132.7 (C-n); 130.0 (C-m); 128.4 (C-8,

C-10); 128.3 (C-7, C-11); 126.8 (C-l); 125.8 (C-9); 122.5 (C-j); 65.3 (C-1); 55.5 (C-d); 42.9

(C-h); 35.7 (C-5); 30.8 (C-4); 28.3 (C-3); 28.0 (C-e); 25.3 (C-2); 24.8 (C-g); 20.0 (C-f);

6.2.10.11 Synthese von 1-(3-Methoxyphenylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(pyridin-3-

yl)propyl)ester 28

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukte [mmol]

DC bzw. SC (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aus-

sehen

28 C21H26N2O5S 418.51

15i [1.8];

3-(Pyridin-3-yl)-

propan-1-ol [2.0]

Cyclohexan : EtOAc = 1:1

(+ 5 % Et3N);

Rf = 0.50

70 gelbes

Öl

Tabelle 32: Analytische Daten der Verbindung 28

IR [cm-1

]: 685; 728; 1036; 1148; 1235; 1337; 1422; 1478; 1596; 1736; 2861; 2943; 3065;

EXPERIMENTELLER TEIL 169

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

8.51-8.47 (m, 2H, H-5, H-6); 7.66-7.60 (m, 1H, H-8); 7.40-7.29 (m, 4H, H-j, H-k, H-n; H-7); 7.09-

7.03 (m, 1H, H-l); 4.76-4.74 (m, 1H, H-d); 4.11-3.97 (m, 2H, H-1); 3.83 (s, 3H, H-o); 3.78-3.70 (m,

1H, H-h); 3.25 (dt, 1H, 2J = 12.7,

3J = 2.9, H-h); 2.71 (t, 2H,

3J = 7.6, H-3); 2.18-2.09 (m, 1H, H-e);

1.95-1.86 (m, 2H, H-2); 1.80-1.59 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.51-1.39 (m, 1H, H-g); 1.36-1.20 (m,

1H, H-f);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

170.5 (C-c); 159.5 (C-m); 148.0 (C-5); 145.8 (C-6); 141.0 (C-4); 137.2 (C-8); 136.8 (C-i); 129.6

(C-k); 123.6 (C-7); 118.9 (C-j); 118.3 (C-l); 111.8 (C-n); 63.6 (C-1); 55.3 (C-o); 54.8 (C-d); 42.5

(C-h); 29.4 (C-2); 28.9 (C-3); 27.4 (C-e); 24.3 (C-g); 19.8 (C-f);

6.2.10.12 Synthese von 1-Tosylpiperidin-2-carbonsäure-(3-(pyridin-3-yl)propyl)ester 29

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukte [mmol]

DC bzw. SC (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aus-

sehen

29 C21H26N2O4S 402.51

15j [2.2];

3-(Pyridin-3-yl)-

propan-1-ol [2.4]

EtOAc : Et3N = 95:5;

Rf = 0.51 22

braunes

Öl

Tabelle 33: Analytische Daten der Verbindung 29

IR [cm-1

]: 715; 727; 964; 1056; 1093; 1154; 1336; 1446; 1597; 1735; 2858; 2929; 3029;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

8.50-8.41 (m, 2H, H-5, H-6); 7.70-7.66 (m, 2H, H-j, H-o); 7.51-7.47 (m, 1H, H-8); 7.28-7.21 (m,

3H, H-k, H-n, H-7); 4.76 (d, 1H, 3J = 4.9, H-d); 4.08-3.96 (m, 2H, H-1); 3.77-3.68 (m, 1H, H-h);

3.23 (dt, 1H, 2J = 12.7,

3J = 2.9, H-h); 2.68-2.62 (m, 2H, H-3); 2.39 (s, 3H, H-m); 2.16-2.08 (m, 1H,

H-e); 1.93-1.84 (m, 2H, H-2); 1.80-1.38 (m, 4H, H-e, H-f, H-g); 1.34-1.20 (m, 1H, H-f);

170 EXPERIMENTELLER TEIL

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

170.8 (C-c); 149.9 (C-5); 147.7 (C-6); 143.1 (C-i); 140.5 (C-4); 136.2 (C-l); 135.8 (C-8); 129.4

(C-k, C-n); 127.2 (C-j, C-o); 123.4 (C-7); 64.0 (C-1); 55.1 (C-d); 42.6 (C-h); 29.8 (C-2); 29.3 (C-3);

27.8 (C-e); 24.6 (C-g); 21.5 (C-m); 20.1 (C-f);

6.2.11 Synthese der 1-((3-Aminophenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäureester

30a-30c

Allgemeine Vorschrift zur Synthese der Verbindungen 30a-30c:

1 Äq (Stoffmenge siehe Tabelle 34) der entsprechenden Nitroverbindung (Verbindung 12h, 27c und

27d, siehe Tabelle 34) und 5 Äq (9.0-15.0 mmol) SnCl2 x 2 H2O werden unter Argonatmosphäre in

40 ml abs. EtOH suspendiert und 2 h unter Rückfluss erhitzt. Anschließend werden 30 ml dem. H2O

und danach ges. wässrige NaHCO3-Lösung bis pH 8 zugegeben. Danach wird dreimal mit je 50 ml

EtOAc extrahiert, die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel

im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch (siehe Tabelle 34) gereinigt.

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukt [mmol]

DC bzw. SC (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aus-

sehen

30a C14H20N2O4S 312.38 12h [3.0] Cyclohexan : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.39 82 braunes Öl

30b C20H25N3O4S 403.50 27d [2.0] EtOAc : Et3N = 95:5;

Rf = 0.41 54

gelbes

Wachs

30c C24H32N2O7S 492.59 27c [1.8] EtOAc : Et3N = 95:5;

Rf = 0.72 82

gelbes

Wachs

Tabelle 34: Analytische Daten der Verbindungen 30a-30c

EXPERIMENTELLER TEIL 171

IR [cm-1

]:

30a: 686; 730; 1152; 1292; 1451; 1598; 1633; 1732; 2869; 2942; 3065; 3375; 3469;

30b: 686; 731; 1150; 1176; 1313; 1481; 1598; 1731; 2860; 2945; 3057; 3376; 3453;

30c: 686; 731; 1122; 1238; 1315; 1453; 1589; 1732; 2859; 2940; 3062; 3371; 3464;

1H-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

30a: 7.17 (t, 1H, 3J = 7.8, H-m); 6.94-6.92 (m, 1H, H-j); 6.84-6.80 (m, 1H, H-n); 6.77-6.74 (m,

1H, H-l); 5.55 (s, 2H, H-NH2); 4.51 (d, 1H, 3J = 4.0, H-d); 4.04-3.87 (m, 2H, H-b); 3.62-

3.56 (m, 1H, H-h); 3.15 (dt, 1H, 2J = 12.7,

3J = 3.0, H-h); 1.97-1.90 (m, 1H, H-e); 1.63-1.50

(m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.31-1.13 (m, 2H, H-f, H-g); 1.10 (t, 3H, 3J = 7.1, H-a);

30b: 8.43-8.39 (m, 2H, H-5, H-6); 7.64-7.60 (m, 1H, H-8); 7.34-7.29 (m, 1H, H-7); 7.16 (t, 1H,

3J = 7.9, H-m); 6.97-6.94 (m, 1H, H-j); 6.86-6.82 (m, 1H, H-n); 6.77-6.73 (m, 1H, H-l); 5.57

(s, 2H, H-NH2); 4.56 (d, 1H, 3J = 5.1, H-d); 4.05-3.85 (m, 2H, H-1); 3.63-3.55 (m, 1H, H-h);

3.21-3.11 (m, 1H, H-h); 2.64-2.58 (m, 2H, H-3); 2.00-1.92 (m, 1H, H-e); 1.86-1.77 (m, 2H,

H-2); 1.65-1.53 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.31-1.10 (m, 2H, H-f, H-g);

30c: 7.13 (t, 1H, 3J = 7.9, H-m); 6.93-6.90 (m, 1H, H-j); 6.82-6.79 (m, 1H, H-n); 6.75-6.71 (m,

1H, H-l); 6.45 (s, 2H, H-5, H-12); 5.54 (s, 2H, H-NH2); 4.55-4.50 (m, 1H, H-d); 4.03-3.84

(m, 2H, H-1); 3.72 (s, 6H, H-7, H-11); 3.60-3.52 (m, 4H, H-h, H-9); 3.19-3.09 (m, 1H, H-h);

2.53-2.45 (m, 2H, H-3); 1.96-1.91 (m, 1H, H-e); 1.82-1.74 (m, 2H, H-2); 1.61-1.50 (m, 3H,

H-e, H-f, H-g); 1.29-1.11 (m, 2H, H-f, H-g);

13C-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

30a: 169.9 (C-c); 149.2 (C-k); 139.8 (C-i); 129.2 (C-m); 117.2 (C-l); 113.0 (C-n); 110.8 (C-j);

60.4 (C-b); 54.2 (C-d); 41.9 (C-h); 26.7 (C-e); 23.5 (C-g); 19.0 (C-f); 13.5 (C-a);

30b: 169.9 (C-c); 149.1 (C-5); 149.0 (C-k); 146.8 (C-6); 139.7 (C-4); 135.9 (C-8); 135.3 (C-i);

129.1 (C-n); 123.0 (C-m); 117.0 (C-l); 112.7 (C-7); 110.5 (C-j); 63.4 (C-1); 54.1 (C-d); 41.8

(C-h); 28.7 (C-2); 27.9 (C-3); 26.5 (C-e); 23.3 (C-g); 18.9 (C-f);

30c: 170.1 (C-c); 152.4 (C-6, C-10); 149.2 (C-k); 139.9 (C-4); 136.4 (C-8); 135.3 (C-i); 129.3

(C-n); 117.2 (C-m); 113.0 (C-l); 110.7 (C-j); 105.2 (C-5, C-12); 63.7 (C-1); 59.6 (C-9); 55.5

(C-7, C-11); 54.3 (C-d); 41.9 (C-h); 31.4 (C-3); 29.3 (C-2); 26.7 (C-e); 23.5 (C-g); 19.2

(C-f);

172 EXPERIMENTELLER TEIL

6.2.12 Synthese von 1-((3-(3,3-Dimethylureido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbon-

säureethylester 31

0.17 g (1.6 mmol) Dimethylcarbaminsäurechlorid werden unter Argonatmosphäre in 20 ml abs.

CH2Cl2 gelöst und auf 0 °C abgekühlt. Danach werden 0.5 g (4.8 mmol) Et3N und nach 10 min 0.5 g

(1.6 mmol) der Verbindung 30a zugetropft und 1 h bei 0 °C sowie 14 h bei RT gerührt. Anschließend

wird der Niederschlag abfiltriert und das Lösungsmittel des Filtrats im Vakuum entfernt. Der ölige

Rückstand wird in 50 ml CHCl3 suspendiert, dreimal mit je 50 ml wässriger 2 M HCl-Lösung und

danach dreimal mit je 50 ml dem. H2O gewaschen. Die organische Phase wird über Na2SO4

getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wird

säulenchromatographisch (Kieselgel; PE : EtOAc = 1 : 1; Rf = 0.11) gereinigt und man erhält 0.14 g

(0.4 mmol) von Verbindung 31 in Form eines klaren Öls.

Summenformel: C17H25N3O5S

Mr = 383.46 g/mol

Ausbeute: 23 %

Aussehen: klares Öl

IR [cm-1

]: 687; 736; 959; 1150; 1180; 1241; 1303; 1530; 1651; 1735; 2863; 2940; 3064; 3387;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

7.79 (td, 1H, 3J = 7.5,

4J = 2.0, H-j); 7.62 (br, 1H, H-n); 7.42-7.32 (m, 2H, H-k, H-l); 6.45 (br, 1H,

H-o), 4.67 (d, 1H, 3J = 4.5, H-d); 4.05-3.86 (m, 2H, H-b); 3.78-3.70 (m, 1H, H-h); 3.23 (dt, 1H,

2J = 12.8,

3J = 3.0, H-h); 3.01 (s, 6H, H-q); 2.11-2.05 (m, 1H, H-e); 1.79-1.55 (m, 3H, H-e, H-f,

H-g); 1.49-1.37 (m, 1H, H-g); 1.31-1.18 (m, 4H, H-a, H-f);

EXPERIMENTELLER TEIL 173

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

170.7 (C-c); 155.1 (C-p); 140.5 (C-i); 140.0 (C-m); 129.5 (C-k); 123.4 (C-j); 121.1 (C-l); 117.7

(C-n); 61.1 (C-b); 55.2 (C-d); 42.7 (C-h); 36.5 (C-q); 27.8 (C-e); 24.7 (C-g); 20.0 (C-f); 14.1 (C-a);

6.2.13 Synthese von 1-((3-(3,3-Dimethylureido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbon-

säure 32

Die Synthese wurde entsprechend der Allgemeinen Vorschrift 6.2.7 durchgeführt.

Summenformel Mr

[g/mol]

Edukt [mmol]

DC-Kontrolle (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aussehen

32 C15H21N3O5S 355.41 31 [0.4]

EtOH : EtOAc = 1:1

(+ 5 % HCOOH);

Rf = 0.76

97 klares Öl

Tabelle 35: Analytische Daten der Verbindung 32

IR [cm-1

]: 688; 723; 963; 1150; 1376; 1464; 1533; 1649; 1735; 2851; 2953; 3069-3478 (b);

1H-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

12.86 (br, 1H, H-b); 8.60 (s, 1H, H-o); 8.06-7.98 (m, 1H, H-n); 7.79-7.74 (m, 1H, H-j); 7.41 (t, 1H,

3J = 8.0, H-k); 7.33-7.29 (m, 1H, H-l), 4.51 (d, 1H,

3J = 4.9, H-d); 3.65-3.58 (m, 1H, H-h); 3.26-3.18

(m, 1H, H-h); 2.94 (s, 6H, H-q); 2.01-1.94 (m, 1H, H-e); 1.60-1.41 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.25-

1.13 (m, 2H, H-f, H-g);

174 EXPERIMENTELLER TEIL

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

171.7 (C-c); 155.3 (C-p); 141.4 (C-i); 140.3 (C-m); 129.0 (C-k); 122.7 (C-j); 120.0 (C-l); 116.9

(C-n); 54.5 (C-d); 42.1 (C-h); 36.1 (C-q); 26.7 (C-e); 23.7 (C-g); 19.6 (C-f);

6.2.14 Synthese von 1-((3-(3,3-Dimethylureido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbon-

säure-(3-(pyridin-3-yl)propyl)ester 33

Die Synthese wurde entsprechend der Allgemeinen Vorschrift 6.2.10 durchgeführt.

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukte [mmol]

DC bzw. SC (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aus-

sehen

33 C23H30N4O5S 474.57

32 [0.4];

3-(Pyridin-3-yl)-

propan-1-ol [0.5]

EtOAc : EtOH = 70:30;

Rf = 0.76 97

weißes

Öl

Tabelle 36: Analytische Daten der Verbindung 33

IR [cm-1

]: 687; 736; 964; 1150; 1303; 1419; 1477; 1531; 1654; 1735; 2856; 2929; 3031; 3323;

1H-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

8.58 (s, 1H, H-o); 8.39 (br, 2H, H-5, H-6); 8.00-7.97 (m, 1H, H-n); 7.75-7.70 (m, 1H, H-j); 7.60-

7.54 (m, 1H, H-8); 7.38 (t, 1H, 3J = 8.0, H-k); 7.31-7.23 (m, 2H, H-l, H-7), 4.58 (d, 1H,

3J = 3.9,

H-d); 3.99-3.79 (m, 2H, H-1); 3.66-3.59 (m, 1H, H-h); 3.19-3.09 (m, 1H, H-h); 2.90 (s, 6H, H-q);

2.60-2.53 (m, 2H, H-3); 2.00-1.93 (m, 1H, H-e); 1.83-1.49 (m, 5H, H-e, H-f, H-g, H-2); 1.28-1.19

(m, 2H, H-f, H-g);

EXPERIMENTELLER TEIL 175

13C-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

169.9 (C-c); 155.0 (C-p); 149.2 (C-5); 146.9 (C-6); 141.3 (C-k); 139.4 (C-4); 136.1 (C-i); 135.4

(C-8); 128.7 (C-m); 123.1 (C-7); 122.6 (C-j); 118.9 (C-l); 116.6 (C-n); 63.6 (C-1); 54.3 (C-d); 42.0

(C-h); 35.8 (C-q); 28.8 (C-2); 28.1 (C-3); 26.7 (C-e); 23.5 (C-g); 19.1 (C-f);

6.2.15 Darstellung von BOC-geschützten Aminosäuren 34

6.2.15.1 Synthese von 4-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)buttersäure 34a und 3-((tert.-Butoxy-

carbonyl)amino)propionsäure 34b

Allgemeine Vorschrift zur Synthese der Verbindungen 34a und 34b:

1 Äq der entsprechenden Aminosäure (Stoffmenge siehe Tabelle 37) wird unter Argonatmosphäre in

100 ml abs. MeOH gelöst, 50 ml einer 10 % methanolischen Et3N-Lösung langsam zugetropft und

10 min unter Rückfluss erhitzt. Danach werden 2 Äq (49.2-52.8 mmol) (BOC)2O zugegeben und

solange unter Rückfluss erhitzt, bis sich alle Bestandteile gelöst haben. Nach vollständiger

Umsetzung (DC-Kontrolle, siehe Tabelle 37) wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, der

Rückstand in 10 ml eiskalter HCl (pH 2) gelöst und 10 min gerührt. Anschließend wird die wässrige

Phase viermal mit je 40 ml EtOAc extrahiert, die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4

getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukt [mmol]

DC-Kontrolle (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aussehen

34a143

C9H17NO4 203.24 4-Aminobutter-

säure [24.6]

Cyclohexan : EtOAc =

70:30; Rf = 0.38

98;

(Lit. 95)143

klares Öl;

(Lit. FS)143

34b144

C8H15NO4 189.21 3-Aminopropion-

säure [26.4]

PE : EtOAc = 70:30

(+ 5 % HCOOH);

Rf = 0.75

54;

(Lit. 89)144

klares Öl;

(Lit. FS)144

Tabelle 37: Analytische Daten der Verbindungen 34a-34b

Die 1H-NMR-, und

13C-NMR-Daten zu 34a und 34b entsprechen den Literaturstellen

145,146.

176 EXPERIMENTELLER TEIL

IR [cm-1

]:

34a: 1045; 1163; 1247; 1366; 1522; 1707; 2978; 2837-3492 (b);

34b: 1068; 1163; 1249; 1365; 1509; 1690; 2978; 3199-3580 (b);

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

34a: 4.74 (br, 1H, H-d); 3.21-3.10 (m, 2H, H-e); 2.36 (t, 2H, 3J = 7.2, H-g); 1.80 (p, 2H,

3J = 7.2,

H-f); 1.42 (s, 9H, H-a);

34b: 5.22 (br, 1H, H-d); 3.41-3.31 (m, 2H, H-e); 2.48 (t, 2H, 3J = 6.0, H-f); 1.43 (s, 9H, H-a);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

34a: 177.4 (C-h); 162.9 (C-c); 79.3 (C-b); 39.8 (C-e); 31.2 (C-g); 28.3 (C-a); 25.2 (C-f);

34b: 176.8 (C-g); 156.0 (C-c); 79.2 (C-b); 36.5 (C-e); 35.3 (C-f); 28.4 (C-a);

6.2.15.2 Synthese von 2-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)essigsäure 34c

0.75 g (10.0 mmol) Glycin sowie 0.44 g (11.0 mmol) NaOH-Plätzchen werden in 100 ml dem. H2O

gelöst und eine Lösung von 2.6 g (12.0 mmol) (BOC)2O in 30 ml THF zugetropft. Der Ansatz wird

anschließend in der Mikrowelle in 6 min auf 70 °C erwärmt und 80 min bei dieser Temperatur

gerührt. Nach vollständiger Umsetzung (DC-Kontrolle: Kieselgel; PE : EtOAc = 1: 1; Rf = 0.23

(KMnO4)) wird wässrige 6 M HCl-Lösung bis pH 2.5 zugegeben und 30 min bei RT gerührt. Die

wässrige Phase wird dreimal mit je 50 ml CHCl3 extrahiert, die vereinigten organischen Phasen über

Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das entstandene Rohprodukt wird

aus CH umkristallisiert und man erhält 1.3 g (7.4 mmol) von Verbindung 34c in Form eines weißen

Feststoffs.

Summenformel: C7H13NO4

Mr = 175.18 g/mol

Smp. = 88 °C (Lit. 89 °C)147

Ausbeute: 74 % (Lit. 77 %)147

Aussehen: weißer Feststoff (Lit. FS)147

EXPERIMENTELLER TEIL 177

Die IR-, 1H-NMR-, und

13C-NMR-Daten zu 34c entsprechen der Literaturstelle

148.

IR [cm-1

]: 1055; 1157; 1196; 1409; 1529; 1666; 1738; 2978; 2773-3446 (b);

1H-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

7.03 (br, 1H, H-d); 3.57 (d, 2H, 3J = 6.0, H-e); 1.38 (s, 9H, H-g);

13C-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

171.5 (C-f); 155.5 (C-c); 77.7 (C-b); 41.5 (C-e); 27.9 (C-a);

6.2.16 Synthese von 1-((3-(3-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)propanamido)phenyl)-

sulfonyl)piperidin-2-carbonsäureethylester 35a und 1-((3-(2-((tert.-Butoxy-

carbonyl)amino)acetamido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäureethyl-

ester 35b

Allgemeine Vorschrift zur Synthese der Verbindungen 35a und 35b:

1 Äq (2.0 mmol) der Verbindung 34b bzw. 34c (siehe Tabelle 38), 1 Äq (2.0 mmol) N-

Hydroxysuccinimid und 1 Äq (2.0 mmol) DCC werden unter Argonatmosphäre in 50 ml abs. CH2Cl2

gelöst und 2 h bei RT gerührt. Anschließend wird eine Lösung von 1 Äq (2.0 mmol) von Verbindung

30a in 20 ml abs. CH2Cl2 zugetropft und 8 h bei RT gerührt. Nach vollständiger Umsetzung (DC-

178 EXPERIMENTELLER TEIL

Kontrolle, siehe Tabelle 38) wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der ölige Rückstand in

50 ml EtOAc suspendiert. Der dadurch entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das

Lösungsmittel des Filtrats im Vakuum entfernt. Der Vorgang des Fällens und der Filtration wird

solange wiederholt, bis sich kein Niederschlag mehr bildet. Das entstandene Rohprodukt wird

säulenchromatographisch (siehe Tabelle 38) gereinigt.

Summen-

formel Mr

[g/mol] Edukt

DC bzw. SC (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aussehen

35a C22H33N3O7S 483.58 34b Cyclohexan : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.43 78 braunes Öl

35b C21H31N3O7S 469.55 34c PE : EtOAc = 60:40;

Rf = 0.31 21 braunes Öl

Tabelle 38: Analytische Daten der Verbindungen 35a-35b

IR [cm-1

]:

35a: 687; 733; 960; 1058; 1150; 1250; 1301; 1478; 1541; 1595; 1685; 2937; 3085; 3347;

35b: 686; 733; 960; 1056; 1149; 1246; 1300; 1479; 1525; 1596; 1683; 2936; 3082; 3348;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

35a: 8.39 (s, 1H, H-o); 7.94 (s, 1H, H-j); 7.88 (d, 1H, 3J = 8.0, H-n); 7.51 (d, 1H,

3J = 8.0, H-l);

7.42 (t, 1H, 3J = 8.0, H-m); 5.51 (br, 1H, H-s); 4.71 (d, 1H,

3J = 4.8, H-d); 4.08-3.89 (m, 2H,

H-b); 3.81-3.73 (m, 1H, H-h); 3.50-3.43 (m, 2H, H-r); 3.26 (dt, 1H, 2J = 12.7,

3J = 3.0, H-h);

2.66 (t, 2H, 3J = 6.1, H-q); 2.18-2.10 (m, 1H, H-e); 1.82-1.55 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.43

(s, 9H, H-v); 1.20-1.12 (m, 5H, H-a, H-f, H-g);

35b: 8.38 (s, 1H, H-o); 7.85 (s, 1H, H-j); 7.78 (d, 1H, 3J = 8.0, H-n); 7.51-7.47 (m, 1H, H-l); 7.40

(t, 1H, 3J = 8.0, H-m); 5.17 (br, 1H, H-r); 4.68 (d, 1H,

3J = 4.8, H-d); 4.05-3.87 (m, 4H, H-b,

H-q); 3.77-3.71 (m, 1H, H-h); 3.22 (dt, 1H, 2J = 12.8,

3J = 3.0, H-h); 2.14-2.06 (m, 1H,

H-e); 1.77-1.55 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.45 (s, 9H, H-u); 1.30-1.19 (m, 2H, H-f, H-g); 1.11

(t, 3H, 3J = 7.1, H-a);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

35a: 172.6 (C-c); 170.6 (C-p); 169.9 (C-t); 140.8 (C-k); 138.7 (C-i); 129.5 (C-m); 123.4 (C-n);

122.4 (C-l); 118.0 (C-j); 79.9 (C-u); 61.1 (C-b); 55.2 (C-d); 42.8 (C-h); 37.8 (C-q); 34.9 (C-

r); 28.4 (C-v); 27.8 (C-e); 24.7 (C-g); 20.0 (C-f); 14.1 (C-a);

35b: 179.3 (C-c); 170.6 (C-p); 168.0 (C-s); 141.0 (C-k); 138.1 (C-i); 133.9 (C-m); 133.4 (C-n);

129.6 (C-l); 123.5 (C-j); 80.3 (C-t); 61.2 (C-b); 55.2 (C-d); 44.6 (C-q); 42.8 (C-h); 28.3

(C-u); 27.8 (C-e); 24.7 (C-g); 20.0 (C-f); 14.1 (C-a);

EXPERIMENTELLER TEIL 179

6.2.17 Synthese von 1-((3-(3-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)propanamido)phenyl)-

sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure 36a und 1-((3-(2-((tert.-Butoxycarbonyl)-

amino)acetamido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure 36b

Die Synthese wurde entsprechend der Allgemeinen Vorschrift 6.2.7 durchgeführt.

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukt [mmol]

DC-Kontrolle (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aussehen

36a C20H29N3O7S 455.53 35a [1.6] EtOAc;

Rf = 0.16 89 weißes Wachs

36b C19H27N3O7S 441.50 35b [0.4] EtOAc : Et3N = 95:5;

Rf = 0.79 80 braunes Wachs

Tabelle 39: Analytische Daten der Verbindungen 36a-36b

IR [cm-1

]:

36a: 685; 728; 960; 1058; 1149; 1257; 1302; 1478; 1525; 1595; 1679; 2960; 3084; 2811-3562 (b);

36b: 685; 777; 960; 1056; 1150; 1249; 1299; 1478; 1537; 1596; 1680; 2935; 3090; 2857-3478 (b);

1H-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

36a: 12.84 (br, 1H, H-b); 10.21 (s, 1H, H-o); 8.09 (s, 1H, H-j); 7.77 (d, 1H, 3J = 8.0, H-n); 7.47

(t, 1H, 3J = 8.0, H-m); 7.42-7.38 (m, 1H, H-l); 6.85 (br, 1H, H-s); 4.48 (d, 1H,

3J = 4.3,

H-d); 3.62-3.55 (m, 1H, H-h); 3.24-3.15 (m, 3H, H-h, H-r); 2.51-2.44 (m, 2H, H-q); 2.03-

1.91 (m, 1H, H-e); 1.60-1.44 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.35 (s, 9H, H-v); 1.22-1.11 (m, 2H,

H-f, H-g);

36b: 12.84 (br, 1H, H-b); 10.22 (s, 1H, H-o); 8.06 (s, 1H, H-j); 7.82-7.75 (m, 1H, H-n); 7.49 (t,

1H, 3J = 7.9, H-m); 7.43-7.41 (m, 1H, H-l); 7.06 (t, 1H,

3J = 6.0, H-r); 4.49 (d, 1H,

3J = 4.3,

H-d); 3.72 (d, 2H, 3J = 6.0, H-q); 3.63-3.56 (m, 1H, H-h); 3.24-3.10 (m, 1H, H-h); 2.00-1.93

180 EXPERIMENTELLER TEIL

(m, 1H, H-e); 1.57-1.45 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.38 (s, 9H, H-u); 1.24-1.10 (m, 2H, H-f,

H-g);

13C-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

36a: 174.6 (C-c); 171.4 (C-p); 169.6 (C-t); 140.4 (C-k); 139.5 (C-i); 129.3 (C-m); 122.1 (C-n);

120.6 (C-l); 116.4 (C-j); 77.3 (C-u); 54.3 (C-d); 41.9 (C-h); 36.5 (C-q); 36.0 (C-r); 27.9

(C-v); 26.6 (C-e); 23.5 (C-g); 19.3 (C-f);

36b: 171.3 (C-c); 168.5 (C-p); 155.6 (C-s); 140.4 (C-k); 139.2 (C-i); 129.5 (C-m); 122.2 (C-n);

120.8 (C-l); 116.4 (C-j); 77.8 (C-t); 54.4 (C-d); 43.4 (C-q); 41.9 (C-h); 27.9 (C-u); 26.6

(C-e); 23.5 (C-g); 19.3 (C-f);

6.2.18 Synthese von 1-((3-(3-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)propanamido)phenyl)-

sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(pyridin-3-yl)propyl)ester 37a und 1-((3-

(2-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)acetamido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-

carbonsäure-(3-(pyridin-3-yl)propyl)ester 37b

Die Synthese wurde entsprechend der Allgemeinen Vorschrift 6.2.10 durchgeführt.

EXPERIMENTELLER TEIL 181

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukte

[mmol] DC bzw. SC

(Kieselgel) Ausbeute

[%] Aussehen

37a C28H38N4O7S 574.69

36a [1.4];

3-(Pyridin-3-yl)-

propan-1-ol [1.6]

Al2O3;

EtOAc : EtOH = 90:10

(+ 5 % Et3N); Rf = 0.74

71 weißes Öl

37b C27H36N4O7S 560.66

36b [0.3];

3-(Pyridin-3-yl)-

propan-1-ol [0.4]

EtOAc;

Rf = 0.18 40

weißes

Wachs

Tabelle 40: Analytische Daten der Verbindungen 37a-37b

IR [cm-1

]:

37a: 687; 733; 966; 1057; 1151; 1245; 1301; 1423; 1478; 1541; 1595; 1691; 2941; 3044; 3329;

37b: 686; 734; 964; 1054; 1151; 1250; 1300; 1424; 1478; 1526; 1595; 1700; 2932; 3065; 3334;

1H-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

37a: 10.25 (s, 1H, H-o); 8.40-8.37 (m, 2H, H-5, H-6); 8.12 (s, 1H, H-j); 7.74 (d, 1H, 3J = 8.0,

H-n); 7.60-7.55 (m, 1H, H-8); 7.46 (t, 1H, 3J = 8.0, H-m); 7.42-7.38 (m, 1H, H-l); 7.31-7.27

(m, 1H, H-7); 6.85 (s, 1H, H-s); 4.59 (d, 1H, 3J = 3.9, H-d); 3.97-3.82 (m, 2H, H-1); 3.61 (d,

1H, 2J = 13.3, H-h); 3.23-3.08 (m, 3H, H-h, H-r); 2.56 (t, 2H,

3J = 7.7, H-3); 2.48-2.43 (m,

2H, H-q); 2.00-1.93 (m, 1H, H-e); 1.81-1.71 (m, 2H, H-2); 1.65-1.51 (m, 3H, H-e, H-f,

H-g); 1.34 (s, 9H, H-v); 1.28-1.18 (m, 2H, H-f, H-g);

37b: (CDCl3): 8.61 (s, 1H, H-o); 8.48 (dd, 1H, 3J = 4.8,

4J = 1.5, H-6); 8.41 (d, 1H,

4J = 1.5,

H-5); 7.91 (s, 1H, H-j); 7.77 (d, 1H, 3J = 8.0, H-n); 7.56-7.47 (m, 2H, H-l, H-8); 7.42 (t, 1H,

3J = 8.0, H-m); 7.25-7.22 (m, 1H, H-7); 5.44 (s, 1H, H-r); 4.73 (d, 1H,

3J = 4.2, H-d); 4.10-

4.02 (m, 1H, H-1); 3.96-3.89 (m, 3H, H-q, H-1); 3.79 (d, 1H, 2J = 12.8, H-h); 3.24 (dt, 1H,

2J = 12.8,

3J = 3.0, H-h); 2.64 (t, 2H,

3J = 7.6, H-3); 2.18-2.10 (m, 1H, H-e); 1.90-1.60 (m,

5H, H-2, H-e, H-f, H-g); 1.49 (s, 9H, H-u); 1.35-1.28 (m, 2H, H-f, H-g);

13C-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

37a: 169.8 (C-c); 169.6 (C-p); 161.0 (C-t); 149.2 (C-5); 147.0 (C-6); 139.9 (C-k); 139.6 (C-4);

136.1 (C-i); 135.5 (C-8); 129.3 (C-m); 123.1 (C-7); 122.4 (C-n); 120.7 (C-l); 116.5 (C-j);

71.3 (C-u); 63.6 (C-1); 54.4 (C-d); 42.1 (C-h); 38.4 (C-q); 38.1 (C-r); 28.9 (C-2); 28.1

(C-3); 27.9 (C-v); 26.8 (C-e); 23.6 (C-g); 22.8 (C-f);

37b: (CDCl3): 175.2 (C-c); 170.7 (C-p); 168.1 (C-s); 149.7 (C-5); 147.7 (C-6); 141.0 (C-k); 138.4

(C-4); 136.3 (C-i); 136.1 (C-8); 129.6 (C-m); 124.4 (C-7); 123.6 (C-n); 122.7 (C-l); 118.2

(C-j); 83.1 (C-t); 64.0 (C-1); 55.2 (C-d); 44.9 (C-q); 42.8 (C-h); 29.7 (C-2); 29.2 (C-3); 28.3

(C-u); 27.8 (C-e); 24.7 (C-g); 20.1 (C-f);

182 EXPERIMENTELLER TEIL

6.2.19 Synthese von N-(3-Phenylpropyl)-1-(phenylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-

amid 38149

Die Synthese wurde entsprechend der Allgemeinen Vorschrift 6.2.16 durchgeführt.

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukte [mmol]

DC bzw. SC (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aus-

sehen

38 C21H26N2O3S 386.51 15f [2.5];

3-Phenylpropylamin [2.5]

EtOAc;

Rf = 0.90 70

braunes

Öl

Tabelle 41: Analytische Daten der Verbindung 38

IR [cm-1

]: 690; 732; 927; 1093; 1165; 1336; 1446; 1520; 1662; 2860; 2937; 3061; 3390;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

7.91-7.79 (m, 2H, H-j, H-n); 7.62-7.50 (m, 3H, H-k, H-l, H-m) 7.30-7.25 (m, 2H, H-6, H-8); 7.21-

7.14 (m, 3H, H-5, H-7, H-9); 6.65 (br, 1H, H-NH); 4.46 (d, 1H, 3J = 5.3, H-d); 3.96-3.89 (m, 1H,

H-h); 3.37-3.23 (m, 2H, H-1); 3.03-2.94 (m, 1H, H-h); 2.67-2.62 (m, 2H, H-3); 2.30-2.16 (m, 1H, H-

e); 1.88-1.80 (m, 2H, H-2); 1.53-1.20 (m, 3H, H-e, H-f, H-g); 1.13-1.00 (m, 2H, H-f, H-g);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

169.3 (C-c); 141.3 (C-4); 140.2 (C-i); 133.0 (C-l); 129.4 (C-k, C-m); 128.5 (C-6, C-8); 128.4 (C-5,

C-9); 127.1 (C-j, C-n); 126.0 (C-7); 56.3 (C-d); 43.7 (C-h); 39.3 (C-1); 33.1 (C-3); 31.3 (C-2); 23.8

(C-e); 23.4 (C-g); 19.9 (C-f);

EXPERIMENTELLER TEIL 183

6.2.20 Synthese von 2-Amino-4-methylpentansäureethylester 39150

Die Synthese wurde entsprechend der Allgemeinen Vorschrift 6.2.2 durchgeführt.

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukt [mmol]

DC-Kontrolle (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aussehen

39 C7H15NO2 145.20 L-Leucin

[38.1]

Cyclohexan : EtOAc = 1:1

(Ninhydrin); Rf = 0.71 73 braunes Öl

Tabelle 42: Analytische Daten der Verbindung 39

IR [cm-1

]: 1042; 1216; 1368; 1482; 1513; 1739; 2870; 2955; 2678-3143;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

4.14 (q, 2H, 3J = 7.1, H-g); 3.42 (t, 1H,

3J = 7.0, H-d); 1.82-1.67 (m, 1H, H-b); 1.60-1.48 (m, 3H,

H-c, H-e); 1.43-1.34 (m, 1H, H-c); 1.24 (t, 3H, 3J = 7.1, H-h); 0.90 (d, 6H,

3J = 7.0, H-a);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

176.6 (C-f); 60.7 (C-g); 52.8 (C-d); 44.0 (C-c); 24.7 (C-b); 22.9 (C-a); 21.8 (C-a); 14.2 (C-h);

6.2.21 Synthese von 4-Methyl-2-(3-methyl-2-oxopentanamido)pentansäureethylester 40

Die Synthese wurde analog der Vorschrift 6.2.5 durchgeführt.

184 EXPERIMENTELLER TEIL

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukte [mmol]

DC bzw. SC (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aus-

sehen

40 C13H23NO4 257.33 9 [10.0];

39 [10.0]

Cyclohexan : EtOAc = 70:30;

Rf = 0.78 77

braunes

Öl

Tabelle 43: Analytische Daten der Verbindung 40

IR [cm-1

]: 1031; 1150; 1197; 1463; 1527; 1650; 1740; 2873; 2961; 3315;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

7.95 (br, 1H, H-e); 4.54-4.45 (m, 1H, H-d); 4.13 (q, 2H, 3J = 7.3, H-g); 3.45-3.34 (m, 1H, H-3);

1.78-1.48 (m, 4H, H-b, H-c, H-5); 1.42-1.26 (m, 1H, H-5); 1.21 (t, 3H, 3J = 7.3, H-h); 1.08-1.02 (m,

3H, H-4); 0.90-0.80 (m, 9H, H-a, H-6);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

201.5 (C-2); 171.9 (C-f); 159.7 (C-1); 61.5 (C-g); 50.8 (C-d); 41.4 (C-3); 40.4 (C-c); 25.4 (C-5);

24.8 (C-b); 22.7 (C-a); 21.8 (C-a); 15.0 (C-4); 14.1 (C-h); 11.4 (C-6);

6.2.22 Synthese von 4-Methyl-2-(3-methyl-2-oxopentanamido)pentansäure 41151

Die Synthese wurde entsprechend der Allgemeinen Vorschrift 6.2.7 durchgeführt.

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukt [mmol]

DC-Kontrolle (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aussehen

41 C12H21NO4 243.30 40 [6.0] Cyclohexan : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.53 87 gelbes Öl

Tabelle 44: Analytische Daten der Verbindung 41

IR [cm-1

]: 1150; 1237; 1462; 1532; 1634; 1719; 2874; 2961; 2858-3323 (b);

EXPERIMENTELLER TEIL 185

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

8.04 (br, 1H, H-e); 4.64-4.54 (m, 1H, H-d); 3.50-3.40 (m, 1H, H-3); 1.78-1.48 (m, 4H, H-b, H-c,

H-5); 1.49-1.35 (m, 1H, H-5); 1.12-1.08 (m, 3H, H-4); 0.97-0.87 (m, 9H, H-a, H-6);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

201.5 (C-2); 176.0 (C-f); 159.8 (C-1); 50.6 (C-d); 41.1 (C-3); 40.5 (C-c); 25.5 (C-5); 24.9 (C-b);

22.7 (C-a); 21.7 (C-a); 15.1 (C-4); 11.4 (C-6);

6.2.23 Synthese von 4-Methyl-2-(3-methyl-2-oxopentanamido)pentansäure-(3-

(pyridin-3-yl)propyl)ester 42

Die Synthese wurde entsprechend der Allgemeinen Vorschrift 6.2.10 durchgeführt.

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukte [mmol]

DC bzw. SC (Al2O3)

Ausbeute [%]

Aus-

sehen

42 C20H30N2O4 362.46

41 [5.0];

3-(Pyridin-3-yl)-

propan-1-ol [5.5]

Cyclohexan : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.26 13

gelbes

Wachs

Tabelle 45: Analytische Daten der Verbindung 42

IR [cm-1

]: 1024; 1152; 1245; 1369; 1462; 1519; 1677; 1738; 2873; 2960; 3336;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

8.51-8.46 (m, 2H, H-k, H-l); 7.58-7.48 (m, 1H, H-n); 7.28-7.23 (m, 2H, H-e, H-m); 4.60-4.50 (m,

1H, H-d); 4.23-4.06 (m, 2H, H-g); 3.50-3.41 (m, 1H, H-3); 2.74-2.67 (m, 2H, H-i); 2.05-1.90 (m,

2H, H-h); 1.81-1.57 (m, 4H, H-b, H-c, H-5); 1.49-1.35 (m, 1H, H-5); 1.17-1.07 (m, 3H, H-4); 0.98-

0.86 (m, 9H, H-a, H-6);

186 EXPERIMENTELLER TEIL

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

201.5 (C-2); 171.9 (C-f); 159.7 (C-1); 149.4 (C-k); 147.3 (C-l); 136.4 (C-j); 136.2 (C-n); 123.6

(C-m); 64.4 (C-g); 50.9 (C-d); 41.4 (C-3); 40.5 (C-c); 29.8 (C-h); 29.3 (C-i); 25.4 (C-5); 24.9 (C-b);

22.7 (C-a); 21.8 (C-a); 15.1 (C-4); 11.5 (C-6);

6.2.24 Synthese von Pyrrolidin-2-carbonsäureethylester 43152

Die Synthese wurde entsprechend der Allgemeinen Vorschrift 6.2.2 durchgeführt.

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukt [mmol]

DC-Kontrolle (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aus-

sehen

43 C7H13NO2 143.18 Pyrrolidin-2-

carbonsäure [8.7]

CHCl3 : MeOH = 1:1

(Ninhydrin); Rf = 0.56

73;

(Lit. 71)153

klares Öl;

(Lit. Öl)153

Tabelle 46: Analytische Daten der Verbindung 43

Die 1H-NMR-Daten zu 43 entsprechen der Literaturstelle

153.

IR [cm-1

]: 1025; 1093; 1258; 1430; 1663; 1730; 2873; 2963; 3312;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

3.90 (q, 2H, 3J = 7.1, H-g); 3.49-3.41 (m, 1H, H-e); 2.83-2.75 (m, 1H, H-b); 2.66-2.58 (m, 1H, H-b);

2.52 (br, 1H, H-a); 1.89-1.79 (m, 1H, H-d); 1.64-1.41 (m, 3H, H-c, H-d); 1.00 (t, 3H, 3J = 7.1, H-h);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

174.7 (C-f); 60.2 (C-g); 59.1 (C-e); 46.4 (C-b); 29.6 (C-d); 24.9 (C-c); 13.6 (C-h);

EXPERIMENTELLER TEIL 187

6.2.25 Synthese von 1-(3-Methyl-2-oxopentanoyl)pyrrolidin-2-carbonsäureethylester 44

Die Synthese wurde analog der Vorschrift 6.2.5 durchgeführt.

Summen-

formel Mr

[g/mol]

Edukte [mmol]

DC bzw. SC (Kieselgel)

Ausbeute [%]

Aus-

sehen

44 C13H21NO4 255.31 9 [6.1];

43 [6.1]

Cyclohexan : EtOAc = 1:1;

Rf = 0.64 2

gelbes

Öl

Tabelle 47: Analytische Daten der Verbindung 44

IR [cm-1

]: 1023; 1080; 1183; 1432; 1639; 1713; 1741; 2878; 2969;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

4.88-4.79 (m, 0.5H, H-e); 4.53-4.47 (m, 0.5H, H-e); 4.24-4.11 (m, 2H, H-g); 3.77-3.55 (m, 2H, H-b);

3.44-3.16 (m, 1H, H-3); 2.35-1.69 (m, 5H, H-c; H-d, H-5); 1.47-1.21 (m, 4H, H-h, H-5); 1.15-1.05

(m, 3H, H-4); 0.96-0.85 (m, 3H, H-6);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

203.4 (C-2); 172.2 (C-f); 163.8 (C-1); 61.3 (C-g); 59.3 (C-e); 47.6 (C-b); 43.2 (C-3); 31.7 (C-d);

28.7 (C-c); 25.1 (C-5); 15.0 (C-4); 14.4 (C-h); 11.5 (C-6);

188 EXPERIMENTELLER TEIL

6.2.26 Synthese von 2-(4-Isopropylphenoxy)essigsäure 45154

1.0 g (7.3 mmol) p-Isopropylphenol werden in 30 ml 10.5 M methanolischer NaOH gelöst, auf 80 °C

erhitzt und 0.7 g (7.3 mmol) Chloressigsäure zugetropft. Anschließend wird die Reaktionslösung 2 h

bei 80 °C gerührt und 12 h bei RT stehen gelassen. Nach vollständiger Umsetzung (DC-Kontrolle:

Kieselgel; PE : EtOAc = 1 : 1 (+ 5 % HCOOH); Rf = 0.25) werden 30 ml dem. H2O und danach

konz. HCl bis pH 2 zugegeben. Die entstandene freie Säure wird viermal mit je 30 ml EtOAc

extrahiert, die vereinigten organischen Phasen viermal mit je 30 ml 10 % wässriger Na2CO3-Lösung

gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Man erhält 1.4 g

(7.2 mmol) von Verbindung 45 in Form eines braunen Öls.

Summenformel: C11H14O3

Mr = 194.23 g/mol

Ausbeute: 98 %

Aussehen: braunes Öl

IR [cm-1

]: 689; 786; 1120; 1197; 1454; 1513; 1738; 2854; 2924; 2867-3425 (b);

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

7.11-7.07 (m, 2H, H-d, H-f); 6.79-6.74 (m, 2H, H-e, H-g); 5.88 (br, 1H, H-k); 3.49 (s, 2H, H-i); 2.85

(sept., 1H, 3J= 6.9, H-b); 1.22 (d, 6H,

3J= 6.9, H-a);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

174.1 (C-j); 153.4 (C-h); 141.2 (C-c); 127.4 (C-d, C-f); 115.1 (C-e, C-g); 69.2 (C-i); 33.2 (C-b);

24.2 (C-a);

EXPERIMENTELLER TEIL 189

6.2.27 Synthese von 2-(4-Isopropylphenoxy)-1-morpholinessigsäureamid 46155

0.86 g (4.4 mmol) der Verbindung 45 werden in 30 ml DMF gelöst, nacheinander langsam 0.4 g

(4.4 mmol) Morpholin, 1.34 g (13.3 mmol) NMM und 2.8 g (8.8 mmol) PPA zugetropft und

2 Wochen bei RT gerührt. Nach vollständiger Umsetzung (DC-Kontrolle: Kieselgel; Cyclohexan :

EtOAc = 1:1; Rf = 0.40) wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, der ölige Rückstand in 50 ml

EtOAc suspendiert und dreimal mit je 30 ml wässriger 2 M HCl-Lösung, dreimal mit je 30 ml dem.

H2O und dreimal mit je 30ml ges. wässriger NaHCO3-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird

über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Man erhält 0.4 g (1.6 mmol)

von Verbindung 46 in Form eines braunen Öls.

Summenformel: C15H21NO3

Mr = 263.33 g/mol

Ausbeute: 36 %

Aussehen: braunes Öl

IR [cm-1

]: 689; 785; 1026; 1112; 1222; 1433; 1509; 1657; 2895; 2959;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

7.15-7.12 (m, 2H, H-d, H-f); 6.87-6.84 (m, 2H, H-e, H-g); 4.65 (s, 2H, H-i); 3.67-3.56 (m, 8H, H-k,

H-l, H-m, H-n); 2.85 (sept., 1H, 3J= 6.9, H-b); 1.21 (d, 6H,

3J= 6.9, H-a);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

166.8 (C-j); 155.7 (C-h); 142.2 (C-c); 127.4 (C-d, C-f); 114.3 (C-e, C-g); 67.8 (C-i); 66.7 (C-l,

C-m); 45.9 (C-k, C-n); 33.2 (C-b); 24.1 (C-a);

190 EXPERIMENTELLER TEIL

6.2.28 Synthese von 5-Methyl-2-phenyl-1H-pyrazol-3(2H)-on 47156

2.0 g (15.4 mmol) Acetessigsäureethylester werden unter Argonatmosphäre in 50 ml abs. EtOH

gelöst, 1.66 g (15.0 mmol) Phenylhydrazin zugegeben, 3 h unter Rückfluss erhitzt und anschließend

12 h bei RT stehen gelassen. Nach vollständiger Umsetzung (DC-Kontrolle: Kieselgel; Cyclohexan :

EtOAc = 1 : 1; Rf = 0.37) wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Rohprodukt aus n-

Pentan umkristallisiert. Man erhält 1.7 g (9.8 mmol) von Verbindung 47 in Form eines gelben

Pulvers.

Summenformel: C10H10N2O

Mr = 174.2 g/mol

Smp. = 130 °C (Lit. 126 °C)157

Ausbeute: 65 % (Lit. 88 %)157

Aussehen: gelbes Pulver (Lit. FS)157

Die IR-, 1H-NMR-, und

13C-NMR-Daten zu 47 entsprechen der Literaturstelle

157.

IR [cm-1

]: 692; 754; 1012; 1092; 1157; 1321; 1446; 2924; 3077; 3261;

1H-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

11.42 (s, 1H, H-e); 7.70 (d, 2H, 3J = 7.9, H-g, H-k); 7.41 (t, 2H,

3J = 7.9, H-h, H-j); 7.20 (t, 1H,

3J = 7.9, H-i); 5.36 (s, 1H, H-c); 2.11 (s, 3H, H-a);

13C-NMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

166.1 (C-d); 157.4 (C-b); 128.7 (C-h, C-j); 124.9 (C-i); 120.5 (C-g, C-k); 117.9 (C-f); 87.5 (C-c);

14.2 (C-a);

EXPERIMENTELLER TEIL 191

6.2.29 Synthese von 2-Amino-4-(methylsulfinyl)buttersäureethylester 48

0.5 g (3.0 mmol) 2-Amino-4-(methylsulfinyl)buttersäure werden unter Argonatmosphäre in 20 ml

abs. EtOH suspendiert, 1.08 g (9.09 mmol) SOCl2 langsam zugetropft, 3 h unter Rückfluss erhitzt

und anschließend 12 h bei RT gerührt. Nach vollständiger Umsetzung (DC-Kontrolle: Kieselgel;

EtOAc : Et3N = 95 : 5; Rf-Wert = 0.35) wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, der ölige

Rückstand in 30 ml ges. wässriger NaHCO3-Lösung gelöst und viermal mit je 20 ml CHCl3

extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Na2SO4 getrocknet und das

Lösungsmittel anschließend im Vakuum entfernt. Man erhält 0.2 g (1.0 mmol) von Verbindung 48 in

Form eines gelben Öls.

Summenformel: C7H15NO3S

Mr = 193.26 g/mol

Ausbeute: 35 %

Aussehen: gelbes Öl

IR [cm-1

]: 1057; 1335; 1441; 1674; 2917; 2974; 2805-3023;

1H-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

4.17 (q, 2H, 3J = 7.0, H-g); 3.60-3.52 (m, 1H, H-d); 2.61 (t, 2H,

3J = 7.3, H-b); 2.11-1.99 (m, 4H,

H-a, H-c); 1.88-1.71 (m, 1H, H-c); 1.59 (s, 2H, H-e); 1.27 (t, 3H, 3J = 7.0, H-h);

13C-NMR (CDCl3, δ [ppm], J [Hz]):

175.7 (C-f); 61.0 (C-g); 53.4 (C-d); 34.0 (C-c); 30.5 (C-b); 15.4 (C-a); 14.2 (C-h);

192 EXPERIMENTELLER TEIL

6.3 Expression von Mip

6.3.1 Verwendete Geräte

Rotationsschüttler: Innova 4330 Incubator Shaker

New Brunswick Scientific Co., Edison, USA

Zentrifuge: Sorvall RC5B Plus Zentrifuge

Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

French-Press: Hochdruckzellaufschlussapparatur Modell TS 0.75 KW

Constan Systems Ltd., Daventry, UK

Ultrazentrifuge: Ultrazentrifuge Rotor 45Ti

Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Deutschland

6.3.2 Klonierung und Transformation des Mip-Gens

Die Isolation und die Klonierung der Mip-DNA-Sequenz aus L. pneumophila-Stamm Philadelphia I,

sowie seine Transformation in E. coli-K12-Stamm HB101 wurden am Max-Planck-Institut für

Enzymologie der Proteinfaltung in Halle durchgeführt und die für die nachfolgende Expression

benötigten E. coli-Zellen zur Verfügung gestellt.

6.3.3 Anzucht von E. coli-Bakterien

Herstellung des LB-Mediums:

16.0 g Pepton, 10.0 g Hefeextrakt und 5.0 g NaCl werden unter Rühren in 1.0 L dem. H2O gelöst, mit

1 M HCl bzw. 1 M NaOH auf pH 7 eingestellt und 20 min in heißem gesättigtem Wasserdampf bei

121 °C autoklaviert. Insgesamt werden 6 x 1.0 L LB-Medium hergestellt, so dass schließlich 6

einzelne Behältnisse für die anschließende Kultivierung zur Verfügung stehen.

Herstellung der Vorkulturen:

Aus allen 6 LB-Medien werden jeweils 5.0 ml entnommen und mit 5.0 µl Ampicillin (100 µg/ml)

sowie einer E. coli-K12-HB101-Kultur versehen. Diese Vorkulturen werden 12 h im Rotations-

schüttler bei 150 rpm und 37 °C inkubiert.

EXPERIMENTELLER TEIL 193

Kultivierung der E. coli-K12-HB101-Bakterien:

Zeigen alle Proben ein Bakterienwachstum, wird jeweils eine dieser Vorkulturen (5.0 ml) sowie

1.0 ml Ampicillin (100 µg/ml) in 1.0 L LB-Medium gegeben und anschließend 24 h im

Rotationsschüttler bei 150 rpm und 37 °C inkubiert. Danach werden die gewachsenen Zellen 10 min

bei 5.000 rpm in Zentrifugengefäßen pelletiert und das Filtrat verworfen.

6.3.4 Aufschluss der E. coli-K12-HB101-Zellkulturen

Herstellung des 2 mM Trizin-Puffers pH 8.5:

1.08 g N-Tris(hydroxymethyl)methylglycin (Trizin) werden unter Rühren in 3.0 L dem. H2O gelöst

und mit 1 M HCl bzw. 1 M NaOH auf pH 8.5 eingestellt.

Mechanische Lyse:

Die Zellpellets werden auf Eiskühlung in 2 mM Trizin-Puffer pH 8.5 suspendiert und 50.0 µl

Phenylmethylsulfonylfluorid sowie 100.0 µl Proteaseinhibitor (Cocktail von Roche) zugegeben.

Diese Suspension wird in den vorgekühlten Stahlzylinder der French-press-Anlage gefüllt und ein

Druck von 1200 bar angelegt. Unter diesem Druck werden die Bakterienzellen aufgeschlossen und

die flüssige Phase anschließend 45 min bei 100.000 rpm und 4 °C ultrazentrifugiert. Der pelletierte

Rückstand wird verworfen und die flüssige Phase einer anschließenden Reinigung zugeführt.

6.3.5 Säulenchromatographische Reinigung von Mip

Herstellung des 2mM Trizin-Puffers pH 8.5:

Siehe Kapitel 6.3.4

Herstellung der 35 %igen Ammoniumsulfat-Lösung:

350.0 g (NH4)2SO4 werden unter Rühren in 1.0 L dem. Wasser gelöst.

Säulenchromatographische Reinigung:

Die gesamte Reinigung wird bei einer Temperatur von 4 °C durchgeführt.

194 EXPERIMENTELLER TEIL

1. Säule: Fractogel-DEAE (Diethylaminoethyl):

Der flüssige Rückstand der Ultrazentrifugation wird mit 1 M HCl bzw. 1 M NaOH auf pH 8.5 ein-

gestellt, auf eine mit 2 mM Trizin-Puffer pH 8.5 equilibrierte DEAE-Säule (Fractogel®) gegeben und

anschließend mit 2 mM Trizin-Puffer pH 8.5 eluiert. Das gewünschte Mip befindet sich im Eluat.

2. Säule: Fractogel-TMAE (Trimethylammoniumethyl):

Der flüssige Rückstand der ersten Säule wird auf eine mit 2 mM Trizin-Puffer pH 8.5 equilibrierte

TMAE-Säule (Fractogel®) gegeben und anschließend mit 2 mM Trizin-Puffer pH 8.5 eluiert. Das

gewünschte Mip befindet sich im Eluat.

3. Säule: Affigel-Blue:

Der flüssige Rückstand der zweiten Säule wird auf eine mit 2 mM Trizin-Puffer pH 8.5 equilibrierte

Affigel-Blue-Säule gegeben und anschließend mit 2 mM Trizin-Puffer pH 8.5 gewaschen. Das Eluat

wird gesammelt und das an die Säule gebundene Mip anschließend zweimal mit 100.0 ml eines KCl-

Gradienten (0-2 M) in Fraktionen eluiert. Die einzelnen Fraktionen dieses zweiten Durchlaufs

werden zusammen mit dem ersten Eluat der dritten Säule mittels SDS-Page-Gelelektrophorese auf

anwesendes Mip untersucht.

4. Säule: Fractogel-Propyl:

Die Protein-enthaltenen Fraktionen werden vereinigt, in 35 %iger Ammoniumsulfat-Lösung

suspendiert, auf eine mit 2 mM Trizin-Puffer pH 8.5 und mit 35 %iger Ammoniumsulfat-Lösung

equilibrierte Fractogel Propyl-Säule gegeben und anschließend mit 35 %iger Ammoniumsulfat-

Lösung gewaschen. Das Eluat wird verworfen und das gebundene Mip anschließend zweimal mit

40.0 ml eines Ammoniumsulfat-Gradienten (0-35 %) in Fraktionen von der Säule eluiert. Die

einzelnen Fraktionen des zweiten Durchlaufs werden mittels SDS-Page-Gelelektrophorese auf

anwesendes Mip untersucht.

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) (nach Lämmli 1970)158

:

Das Elektrophoresegel auf Polyacrylamidbasis (bestehend aus Trenn- und Sammelgel) wurde nach

einer allgemeinen Vorschrift am Max-Planck-Institut hergestellt und für diese Arbeit zur Verfügung

gestellt.159

Die zu untersuchenden Fraktionen, der Molekularmarker (M) und ggf. der Durchlauf (D)

werden in SDS-haltigem Probenpuffer† gelöst und mit dem Farbstoff Bromphenolblau versetzt. Das

Polyacrylamidgel wird in die Elektrophoresekammer eingesetzt und mit den gefärbten

Untersuchungslösungen beladen. Als Elektrolysepuffer wird ein SDS-haltiges Tris-Glycin-

Puffersystem‡ verwendet. Der Elektrophoreselauf erfolgt bei einer Stromstärke von 25 mA. Das

† SDS-Probenpuffer (pH 6.8): 78.0 mM Tris; 11.5 g/L SDS; 0.25 % (v/v) ß-Mercaptoethanol; 2.0 % (v/v)

Glycin; ‡ SDS-Laufpuffer (pH 8.8): 25.0 mM Tris; 192.0 mM Glycin; 3.5 mM SDS;

EXPERIMENTELLER TEIL 195

entnommene Elektrophoresegel wird mit Coomassie-Brilliant-Blau-Färbelösung§ für 12 h inkubiert.

Nach vollständiger Färbung wird das Gel anschließend durch Einlegen in eine Entfärbelösung**

entfärbt. Dieser Vorgang wird so oft wiederholt, bis der Gelhintergrund klar ist und alle

Proteinbanden eindeutig sichtbar sind. Der Vergleich der Banden der einzelnen Fraktionen mit den

Banden des Proteinmarkers identifiziert die Proben, die Mip enthalten.

6.3.6 Dialyse von gereinigtem Mip

Herstellung des 35 mM HEPES-Puffers:

25.0 g 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethansulfonsäure (HEPES) werden unter Rühren in 3.0 L

dem. H2O gelöst und mit 1 M HCl bzw. 1 M NaOH auf pH 7.8 eingestellt.

Dialyse:

Die Protein-enthaltenen Fraktionen werden vereinigt und in einen dünnwandigen Dialyseschlauch

gefüllt. Anschließend wird der Schlauch in 3.0 L 35 mM HEPES-Puffer für 12 h eingelegt und das

Protein aufkonzentriert.

6.4 Enzymatischer Assay

6.4.1 Verwendete Geräte

Temperaturschrank: Serie MKKL (+ 2 - + 45 °C)

Flohr Instruments, Utrecht, Holland

Spektrometer: Appliscan, 96-Well-Plate-Reader

Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

Mikrotiter-Platten: MicroWellTM

96-Well-Platten

Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

§ Coomassie-Färbelösung: 0.2 % (w/v) Coomassie R250; 0.05 % (w/v) Coomassie G250; 10.0 % (v/v)

Essigsäure; 30.0 % (v/v) Methanol; 17.5 % (v/v) Ethanol; **

Entfärbelösung: 45.0 % (v/v) Methanol; 10.0 % (v/v) Essigsäure;

196 EXPERIMENTELLER TEIL

6.4.2 Herstellung der Puffer- bzw. Stammlösungen

Herstellung des 10 mM HEPES-Puffers:

2.38 g HEPES und 5.84 g NaCl werden unter Rühren in 1.0 L dem. H2O gelöst und mit 1 M HCl

bzw. 1 M NaOH auf pH 7.8 eingestellt.

Herstellung der Substrat-Stammlösung:

0.01 g synthetisches Peptid werden in 0.1 ml DMSO gelöst und mit 10 mM HEPES-Puffer 1 : 600

verdünnt, so dass eine Substrat-Stammlösung mit einer Endkonzentration von 0.24 mM entsteht.

Herstellung der α-Chymotrypsin-Stammlösung:

0.01 g α-Chymotrypsin werden in 1.0 ml 10 mM HEPES-Puffer gelöst und mit demselben Puffer

1 : 50 verdünnt.

Herstellung der Mip-Stammlösung:

Die Konzentration des gereinigten Proteins wurde UV-spektrometrisch über eine Differenzmessung

der Absorptionen bei 280 nm und 310 nm bestimmt und beträgt 40.6 µM. Davon wird ein Aliquot

von 10.0 µl entnommen und mit 10 mM HEPES-Puffer so verdünnt, dass eine Mip-Stammlösung mit

einer Endkonzentration von 600 nM entsteht.

Herstellung der Inhibitor-Stammlösung:

Von jeder zu untersuchenden Substanz werden 500.0 µl einer 10 mM Stammlösung in EtOH p.a.

hergestellt. Davon werden vier Aliquoten von 10.0 µl entnommen und diese jeweils so verdünnt, dass

Lösungen mit den Endkonzentrationen 30 µM, 150 µM, 300 µM und 600 µM entstehen.

6.4.3 Protease-gekoppelter PPIase-Assay

Der PPIase-Assay wird in einem Temperaturbereich von 9-11 °C durchgeführt. Die Substanzen

werden nach folgendem Pipettierschema in die 96-Well-Platte vorgelegt:

Substrat [240 µM]

Puffer [10 mM]

Mip [0.6 µM]

Inhibitor [30, 150, 300, 600 µM]

Nullwert 100 µl 50 µl - -

Kontrolle 100 µl 30 µl 20 µl -

Probe 100 µl 20 µl 20 µl 10 µl

Tabelle 48: Pipettierschema für die Durchführung des PPIase-Assays

EXPERIMENTELLER TEIL 197

Von jedem Inhibitor, dem Nullwert sowie der Kontrolle wird eine Dreifachbestimmung

durchgeführt. Unmittelbar vor der Messung werden je 150.0 µl der α-Chymotrypsinlösung durch das

Spektrometer in jede Kavität zugegeben, so dass jeweils 300.0 µl Untersuchungslösung mit den

folgenden Endkonzentrationen der einzelnen Komponenten entsteht: Substrat: 80 µM, Mip: 40 nM,

Inhibitor: 1 µM, 5µM, 10 µM, 20 µM. Die Reaktion startet mit der α-Chymotrypsin-Zugabe und es

wird über einen Zeitraum von 200 s alle drei Sekunden die Absorption bei 390 nm bestimmt.

198 EXPERIMENTELLER TEIL

ANHANG 199

7 ANHANG

7.1 Überblick synthetisierter Verbindungen

1a N,N-Dimethylphenylsulfonsäureamid

1b 1-(Phenylsulfonyl)piperidin

1c 1-(Phenylsulfonyl)pyrrolidin

1d N-(Phenethyl)phenylsulfonsäureamid

1e (S)-N-(1-Phenylethyl)phenylsulfonsäureamid

1f N-(Prop-2-yn-1-yl)phenylsulfonsäureamid

1g N-Propylphenylsulfonsäureamid

1h N-Ethylphenylsulfonsäureamid

1i N-Isopropylphenylsulfonsäureamid

1j N-Cyclopentylphenylsulfonsäureamid

1k N-(4-Methoxybenzyl)phenylsulfonsäureamid

1l N-(4-Methylbenzyl)phenylsulfonsäureamid

1m N-Cyclopropylphenylsulfonsäureamid

1n 1-(Phenylsulfonyl)piperazin

1o N-Benzyl-N-methylphenylsulfonsäureamid

1p N-(2-(1H-Indol-3-yl)ethyl)phenylsulfonsäureamid

2 N-Benzylphenylsulfonsäureamid

3a N-Ethyl-N-methylphenylsulfonsäureamid

3b N-Methyl-N-propylphenylsulfonsäureamid

3c N-Isopropyl-N-methylphenylsulfonsäureamid

4a N,N-Dimethyl-3-(trifluormethyl)phenylsulfonsäureamid

4b N,N-Dimethylcyclohexylsulfonsäureamid

4c N,N-Dimethylbenzylsulfonsäureamid

4d 4-Acetyl-N,N-dimethylphenylsulfonsäureamid

4e N,N-Dimethyl-3-nitrophenylsulfonsäureamid

5 3-Amino-N,N-dimethylphenylsulfonsäureamid

6a 3-(Ethylamino)-N,N-dimethylphenylsulfonsäureamid

6b N,N-Dimethyl-3-(propylamino)phenylsulfonsäureamid

6c N,N-Dimethyl-3-((2,2,2-trifluorethyl)amino)phenylsulfonsäureamid

6d 3-(Dimethylamino)-N,N-dimethylphenylsulfonsäureamid

6e 3-(Dipropylamino)-N,N-dimethylphenylsulfonsäureamid

7a Piperidin-2-carbonsäureethylester

200 ANHANG

7b (S)-Piperidin-2-carbonsäureethylester

8 1-(2-Ethoxy-2-oxoacetyl)piperidin-2-carbonsäureethylester

9 3-Methyl-2-oxopentansäure

10 1-(3-Methyl-2-oxopentanoyl)piperidin-2-carbonsäureethylester

11a 1-(2-Phenoxyacetyl)piperidin-2-carbonsäureethylester

11b 1-(2-Phenylacetyl)piperidin-2-carbonsäureethylester

11c 1-(2-(4-Chlorphenyl)acetyl)piperidin-2-carbonsäureethylester

12a 1-(Benzylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäureethylester

12b (S)-1-(Benzylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäureethylester

12c 1-((4-Methylbenzyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäureethylester

12d 1-((4-Chlorbenzyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäureethylester

12e 1-((2-Nitrobenzyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäureethylester

12f 1-(Phenylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäureethylester

12g (S)-1-(Phenylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäureethylester

12h 1-((3-Nitrophenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäureethylester

12i 1-((3-Methoxyphenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäureethylester

12j 1-Tosylpiperidin-2-carbonsäureethylester

13 1-(3-Methyl-2-oxopentanoyl)piperidin-2-carbonsäure

14a 1-(2-Phenoxyacetyl)piperidin-2-carbonsäure

14b 1-(2-Phenylacetyl)piperidin-2-carbonsäure

14c 1-(2-(4-Chlorphenyl)acetyl)piperidin-2-carbonsäure

15a 1-(Benzylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure

15b (S)-1-(Benzylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure

15c 1-((4-Methylbenzyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure

15d 1-((4-Chlorbenzyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure

15e 1-((2-Nitrobenzyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure

15f 1-(Phenylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure

15g 1-((3-Nitrophenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure

15h 1-((3-Methoxyphenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure

15i 1-Tosylpiperidin-2-carbonsäure

16 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)propan-1-ol

17 1,3-Diphenylpropan-1-ol

18a 1-(3-Methyl-2-oxopentanoyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)propyl)ester

18b 1-(3-Methyl-2-oxopentanoyl)piperidin-2-carbonsäure-(1,3-diphenylpropyl)ester

19a 1-(2-Phenoxyacetyl)piperidin-2-carbonsäure-(4-methoxyphenethyl)ester

19b 1-(2-Phenoxyacetyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(pyridin-3-yl)propyl)ester

19c 1-(2-Phenoxyacetyl)piperidin-2-carbonsäure-(4-phenylbutyl)ester

ANHANG 201

20a 1-(2-Phenylacetyl)piperidin-2-carbonsäure-(pyridin-3-ylmethyl)ester

20b 1-(2-Phenylacetyl)piperidin-2-carbonsäure-(4-methoxyphenethyl)ester

20c 1-(2-Phenylacetyl)piperidin-2-carbonsäure-(4-phenylbutyl)ester

21a 1-(2-(4-Chlorphenyl)acetyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(pyridin-3-yl)propyl)ester

21b 1-(2-(4-Chlorphenyl)acetyl)piperidin-2-carbonsäure-(5-phenylpentyl)ester

21c 1-(2-(4-Chlorphenyl)acetyl)piperidin-2-carbonsäure-(1,3-diphenylpropyl)ester

22a 1-(Benzylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)propyl)ester

22b (S)-1-(Benzylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)propyl)ester

22c 1-(Benzylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(pyridin-3-ylmethyl)ester

22d 1-(Benzylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(5-phenylpentyl)ester

22e 1-(Benzylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(4-phenylbutyl)ester

23a 1-((4-Methylbenzyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(pyridin-3-ylmethyl)ester

23b 1-((4-Methylbenzyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(5-phenylpentyl)ester

24a 1-((4-Chlorbenzyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(pyridin-3-ylmethyl)ester

24b 1-((4-Chlorbenzyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(5-phenylpentyl)ester

25 1-((2-Nitrobenzyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(pyridin-3-yl)propyl)ester

26a 1-(Phenylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)propyl)ester

26b 1-(Phenylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(pyridin-3-ylmethyl)ester

26c 1-(Phenylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(5-phenylpentyl)ester

26d 1-(Phenylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(4-phenylbutyl)ester

26e 1-(Phenylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(4-methoxyphenethyl)ester

26f 1-(Phenylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(phenethyl)ester

26g 1-(Phenylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-phenylpropyl)ester

26h 1-(Phenylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(pyridin-3-yl)propyl)ester

26i 1-(Phenylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(4-methoxyphenyl)propyl)ester

27a 1-((3-Nitrophenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(phenethyl)ester

27b 1-((3-Nitrophenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(4-methoxyphenethyl)ester

27c 1-((3-Nitrophenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)propyl)ester

27d 1-((3-Nitrophenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(pyridin-3-yl))propyl)ester

27e 1-((3-Nitrophenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(5-phenylpentyl)ester

28 1-((3-Methoxyphenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(pyridin-3-yl))propyl)ester

29 1-Tosylpiperidin-2-carbonsäure-(3-(pyridin-3-yl))propyl)ester

30a 1-((3-Aminophenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäureethylester

30b 1-((3-Aminophenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(pyridin-3-yl))propyl)ester

30c 1-((3-Aminophenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)propyl)ester

31 1-((3-(3,3-Dimethylureido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäureethylester

32 1-((3-(3,3-Dimethylureido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure

202 ANHANG

33 1-((3-(3,3-Dimethylureido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-(pyridin-3-yl)propyl)-

ester

34a 4-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)buttersäure

34b 3-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)propionsäure

34c 2-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)essigsäure

35a 1-((3-(3-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)propanamido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-

ethylester

35b 1-((3-(2-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)acetamido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-

ethylester

36a 1-((3-(3-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)propanamido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure

36b 1-((3-(2-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)acetamido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure

37a 1-((3-(3-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)propanamido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-

(3-(pyridin-3-yl)propyl)ester

37b 1-((3-(2-((tert.-Butoxycarbonyl)amino)acetamido)phenyl)sulfonyl)piperidin-2-carbonsäure-(3-

(pyridin-3-yl)propyl)ester

38 N-(3-Phenylpropyl)-1-(phenylsulfonyl)piperidin-2-carbonsäureamid

39 2-Amino-4-methylpentansäureethylester

40 4-Methyl-2-(3-methyl-2-oxopentanamido)pentansäureethylester

41 4-Methyl-2-(3-methyl-2-oxopentanamido)pentansäure

42 4-Methyl-2-(3-methyl-2-oxopentanamido)pentansäure-(3-(pyridin-3-yl)propyl)ester

43 Pyrrolidin-2-carbonsäureethylester

44 1-(3-Methyl-2-oxopentanoyl)pyrrolidin-2-carbonsäureethylester

45 2-(4-Isopropylphenoxy)essigsäure

46 2-(4-Isopropylphenoxy)-1-morpholinessigsäureamid

47 5-Methyl-2-phenyl-1H-pyrazol-3(2H)-on

48 2-Amino-4-(methylsulfinyl)buttersäureethylester

7.2 logP-Werte synthetisierter Verbindungen

Die logP-Werte wurden mit Hilfe des Computerprogramms MOE berechnet und sind in Tabelle 49

dargestellt.

ANHANG 203

Verbindung logP (berechnet) Verbindung logP (berechnet)

1a 0.652 19c 4.810

1b 1.626 20a 2.909

1c 1.184 20b 4.186

1d 2.877 20c 5.114

1e 3.251 21a 4.031

1f 1.307 21b 6.148

1g 1.956 21c 7.173

1h 1.342 22a 3.410

1i 1.804 22b 3.410

1j 2.538 22c 2.205

1k 2.745 22d 4.852

1l 3.087 22e 4.410

1m 1.654 23a 2.503

1n -0.091 23b 5.150

1o 2.440 24a 2.797

1p 3.243 24b 5.444

2a 0.993 25 2.668

2b 1.607 26a 3.276

2c 1.455 26b 2.071

3 2.789 26c 4.718

4a 1.624 26d 4.276

4b 0.977 26e 3.348

4c 0.786 26f 3.392

4d 0.505 26g 3.834

4e 0.624 26h 2.601

5 0.017 26i 3.790

6a 0.677 27a 3.364

6b 1.291 27b 3.320

6c 1.099 27c 3.248

6d 0.604 27d 2.573

6e 2.514 27e 4.690

10 1.787 28 2.594

11a 2.391 29 2.899

11b 2.695 30a 1.222

11c 3.287 30b 1.966

12a 1.991 30c 2.641

12b 1.991 31 1.026

12c 2.289 33 1.770

12d 2.583 35a 1.896

12e 1.924 35b 1.808

12f 1.857 37a 2.640

12g 1.857 37b 2.552

12h 1.829 38 3.192

12i 1.850 42 3.115

12j 2.155 44 1.345

18a 5.673 46 1.895

18b 3.206 47 1.700

19a 3.882 48 -1.386

19b 3.135

Tabelle 49: Berechnete logP-Werte der hergestellten Verbindungen

204 ANHANG

LITERATURVERZEICHNIS 205

8 LITERATURVERZEICHNIS

1. Gesetz zur Verhütung und Bekämpfung von Infektionskrankheiten beim Menschen

(Infektionsschutzgesetz - IfSG). http://www.gesetze-im-internet.de/bundesrecht/ifsg/gesamt.pdf

(accessed 25.01.2012).

2. Fraser, D. W.; Tsai, T. R.; Orenstein, W.; Parkin, W. E.; Beecham, H. J.; Sharrar, R. G.; Harris, J.;

Mallison, G. F.; Martin, S. M.; McDade, J. E.; Shepard, C. C.; Brachman, P. S., Legionnaires'

disease: description of an epidemic of pneumonia. N. Engl. J. Med. 1977, 297 (22), 1189-1197.

3. McDade, J. E.; Shepard, C. C.; Fraser, D. W.; Tsai, T. R.; Redus, M. A.; Dowdle, W. R.,

Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory

disease. N. Engl. J. Med. 1977, 297 (22), 1197-1203.

4. Osterholm, M. T.; Chin, T. D.; Osborne, D. O.; Dull, H. B.; Dean, A. G.; Fraser, D. W.; Hayes, P.

S.; Hall, W. N., A 1957 outbreak of Legionnaires' disease associated with a meat packing plant. Am.

J. Epidemiol. 1983, 117 (1), 60-67.

5. Thacker, S. B.; Bennett, J. V.; Tsai, T. F.; Fraser, D. W.; McDade, J. E.; Shepard, C. C.; Williams,

K. H., Jr.; Stuart, W. H.; Dull, H. B.; Eickhoff, T. C., An outbreak in 1965 of severe respiratory

illness caused by the Legionnaires' disease bacterium. J. Infect. Dis. 1978, 138 (4), 512-519.

6. Glick, T. H.; Gregg, M. B.; Berman, B.; Mallison, G.; Rhodes, W. W., Jr.; Kassanoff, I., Pontiac

fever. An epidemic of unknown etiology in a health department: I. Clinical and epidemiologic

aspects. Am. J. Epidemiol. 1978, 107 (2), 149-160.

7. Newton, H. J.; Ang, D. K. Y.; van Driel, I. R.; Hartland, E. L., Molecular pathogenesis of

infections caused by Legionella pneumophila. Clin. Microbiol. Rev. 2010, 23 (2), 274-298.

8. Rogers, J.; Dowsett, A. B.; Dennis, P. J.; Lee, J. V.; Keevil, C. W., Influence of temperature and

plumbing material selection on biofilm formation and growth of Legionella pneumophila in a model

potable water system containing complex microbial flora. Appl. Environ. Microbiol. 1994, 60 (5),

1585-1592.

9. Kwaik, Y. A., The phagosome containing Legionella pneumophila within the Protozoan

Hartmannella vermiformis is surrounded by the rough endoplasmic reticulum. Appl. Environ.

Microbiol. 1996, 62 (6), 2022-2028.

10. Bozue, J. A.; Johnson, W., Interaction of Legionella pneumophila with Acanthamoeba

castellanii: uptake by coiling phagocytosis and inhibition of phagosome-lysosome fusion. Infect.

Immun. 1996, 64 (2), 668-673.

11. Garduno, R. A: Life cycle, growth cycles and developmental cycle of Legionella pneumophila.

http://microbiology.medicine.dal.ca/people/garduno/Garduno%20chapter.pdf (accessed 10.08.2011).

12. Steinert, M.; Hentschel, U.; Hacker, J., Legionella pneumophila: an aquatic microbe goes astray.

FEMS Microbiol. Rev. 2002, 26 (2), 149-162.

13. Machner: Modulation of Human Macrophages by the Intracellular Pathogen Legionella

pneumophila. http://2009annualreport.nichd.nih.gov/ump.html (accessed 05.08.2011).

14. Hoge, C. W.; Breiman, R. F., Advances in the epidemiology and control of Legionella infections.

Epidemiol. Rev. 1991, 13, 329-340.

15. Centers-for-Disease-and-Control-prevention Patient Facts: Learn More about Legionnaires'

disease. http://www.cdc.gov/legionella/patient_facts.htm (accessed 20.08.2011).

16. Fraser, D. W.; Wachsmuth, I.; Bopp, C.; Feeley, J. C.; Tsai, T. F., Antibiotic treatment of guinea-

pigs infected with agent of Legionnaires' disease. Lancet 1978, 1 (8057), 175-178.

206 LITERATURVERZEICHNIS

17. Robert-Koch-Institut: Ratgeber für Ärzte - Legionellose.

http://www.rki.de/cln_162/nn_468478/DE/Content/Infekt/EpidBull/Merkblaetter/Ratgeber_

Legionellose.html (accessed 10.08.2011).

18. Pedro-Botet, M. L.; Yu, V. L., Treatment strategies for Legionella infection. Expert Opin.

Pharmacother. 2009, 10 (7), 1109-1121.

19. Miyamoto, M.; Yamaguchi, Y.; Sasatsu, M., Disinfectant effects of hot water, ultraviolet light,

silver ions and chlorine on strains of Legionella and nontuberculous mycobacteria. Microbios. 2000,

101 (398), 7-13.

20. Bundesministerium-für-Gesundheit: Trinkwasserverordnung und Legionellen (Stand

19.10.2011).

http://www.bundesgesundheitsministerium.de/ministerium/presse/pressemitteilungen/2011-

02/aenderung-der-trinkwasserverordnung/trinkwasserverordnung-und-legionellen.html (accessed

10.11.2011).

21. Augsburger-Allgemeine: Legionellen: Augsburger Experte: "beunruhigende Häufung".

www.augsburger-allgemeine.de/bayern/Augsburger-Experte-beunruhigende-Haeufung-

id7153461.html (accessed 25.08.2011).

22. Augsburger-Allgemeine: Legionellen: Firma unter Verdacht. www.augsburger-

allgemeine.de/neu-ulm/Legionellen-Firma-unter-Verdacht-id15758466.html (accessed 25.08.2011).

23. Robert-Koch-Institut: SurvStat. http://www3.rki.de/SurvStat/ (accessed 10.08.2011).

24. von Baum, H.; Ewig, S.; Marre, R.; Suttorp, N.; Gonschior, S.; Welte, T.; Luck, C., Community-

acquired Legionella pneumonia: new insights from the German competence network for community

acquired pneumonia. Clin. Infect. Dis. 2008, 46 (9), 1356-1364.

25. Luck, P. C.; Steinert, M., Pathogenesis, diagnosis and therapy of Legionella infections.

Bundesgesundhbl. Gesundheitsforsch. Gesundheitsschutz 2006, 49 (5), 439-449.

26. Shevchuk, O.; Jäger, J.; Steinert, M., Virulence properties of the Legionella pneumophila cell

envelope. Front. Microbiol. 2011, 2 (74), 1-12.

27. Riboldi-Tunnicliffe, A.; Konig, B.; Jessen, S.; Weiss, M. S.; Rahfeld, J.; Hacker, J.; Fischer, G.;

Hilgenfeld, R., Crystal structure of Mip, a prolylisomerase from Legionella pneumophila. Nat. Struct.

Biol. 2001, 8 (9), 779-783.

28. Fischer, G.; Bang, H.; Ludwig, B.; Mann, K.; Hacker, J., Mip protein of Legionella pneumophila

exhibits peptidyl-prolyl-cis/trans isomerase (PPIase) activity. Mol. Microbiol. 1992, 6 (10), 1375-

1383.

29. Schmid, F. X., Prolyl isomerase: Enzymic catalysis of slow protein-folding reactions. Annu. Rev.

Biophys. Biomol. Struct. 1993, 22, 123-143.

30. Cianciotto, N. P.; Eisenstein, B. I.; Mody, C. H.; Toews, G. B.; Engleberg, N. C., A Legionella

pneumophila gene encoding a species-specific surface protein potentiates initiation of intracellular

infection. Infect. Immun. 1989, 57 (4), 1255-1262.

31. Wintermeyer, E.; Ludwig, B.; Steinert, M.; Schmidt, B.; Fischer, G.; Hacker, J., Influence of site

specifically altered Mip proteins on intracellular survival of Legionella pneumophila in eukaryotic

cells. Infect. Immun. 1995, 63 (12), 4576-4583.

32. Koehler, R.; Fanghaenel, J.; Koenig, B.; Lueneberg, E.; Frosch, M.; Rahfeld, J.-U.; Hilgenfeld,

R.; Fischer, G.; Hacker, J.; Steinert, M., Biochemical and functional analyses of the Mip protein:

Influence of the N-terminal half and of peptidylprolyl isomerase activity on the virulence of

Legionella pneumophila. Infect. Immun. 2003, 71 (8), 4389-4397.

33. Wagner, C.; Khan, A. S.; Kamphausen, T.; Schmausser, B.; Uenal, C.; Lorenz, U.; Fischer, G.;

Hacker, J.; Steinert, M., Collagen binding protein Mip enables Legionella pneumophila to

LITERATURVERZEICHNIS 207

transmigrate through a barrier of NCI-H292 lung epithelial cells and extracellular matrix. Cell.

Microbiol. 2007, 9 (2), 450-462.

34. Wikipedia: Edward Jenner. http://de.wikipedia.org/wiki/Edward_Jenner (accessed 25.08.2011).

35. Dawson, T. M.; Steiner, J. P.; Lyons, W. E.; Fotuhi, M.; Blue, M.; Snyder, S. H., The

immunophilins, FK 506 binding protein and cyclophilin, are discretely localized in the brain:

relationship to calcineurin. Neuroscience 1994, 62 (2), 569-580.

36. Szep, S.; Park, S.; Boder, E. T.; Van Duyne, G. D.; Saven, J. G., Structural coupling between

FKBP12 and buried water. Proteins Struct., Funct., Bioinf. 2009, 74 (3), 603-611.

37. Brillantes, A. M. B.; Ondrias, K.; Scott, A.; Kobrinsky, E.; Ondriasova, E.; Moschella, M. C.;

Jayaraman, T.; Landers, M.; Ehrlich, B. E.; Mars, A. R., Stabilization of calcium release channel

(Ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. Cell 1994, 77 (4), 513-523.

38. Jayaraman, T.; Brillantes, A. M.; Timerman, A. P.; Fleischer, S.; Erdjument-Bromage, H.;

Tempst, P.; Marks, A. R., FK506 binding protein associated with the calcium release channel

(ryanodine receptor). J. Biol. Chem. 1992, 267 (14), 9474-9477.

39. Breiman, A.; Camus, I., The Involvement of Mammalian and Plant FK506-Binding Proteins

(FKBPs) in Development. Transgenic Res. 2002, 11 (4), 321-335.

40. Cameron, A. M.; Nucifora, F. C., Jr.; Fung, E. T.; Livingston, D. J.; Aldape, R. A.; Ross, C. A.;

Snyder, S. H., FKBP12 binds the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor at leucine-proline (1400-1401)

and anchors calcineurin to this FK506-like domain. J. Biol. Chem. 1997, 272 (44), 27582-27588.

41. Huse, M.; Chen, Y.-G.; Massague, J.; Kuriyan, J., Crystal structure of the cytoplasmic domain of

the type I TGFβ receptor in complex with FKBP12. Cell 1999, 96 (3), 425-436.

42. Wang, T.; Donahoe, P. K.; Zervos, A. S., Specific interaction of type I receptors of the TGF-β

family with the immunophilin FKBP-12. Science 1994, 265 (5172), 674-676.

43. Ruegger, A.; Kuhn, M.; Lichti, H.; Loosli, H. R.; Huguenin, R.; Quiquerez, C.; Von Wartburg,

A., Cyclosporin A, a peptide metabolite from Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) Rifai, with

immunosuppressive activity. Helv. Chim. Acta 1976, 59 (4), 1075-1092.

44. Mutschler, E.; Geisslinger, G.; Kroemer, H. K.; Ruth, P.; Schaefer-Korting, M., Mutschler

Arzneimittelwirkungen. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart: 2008; Vol. 9.

45. Sawada, S.; Suzuki, G.; Kawase, Y.; Takaku, F., Novel immunosuppressive agent, FK506. In

vitro effects on the cloned T cell activation. J. Immunol. 1987, 139 (6), 1797-1803.

46. Tocci, M. J.; Matkovich, D. A.; Collier, K. A.; Kwok, P.; Dumont, F.; Lin, S.; Degudicibus, S.;

Siekierka, J. J.; Chin, J.; Hutchinson, N. I., The immunosuppressant FK506 selectively inhibits

expression of early T cell activation genes. J. Immunol. 1989, 143 (2), 718-726.

47. Liu, J.; Farmer, J. D., Jr.; Lane, W. S.; Friedman, J.; Weissman, I.; Schreiber, S. L., Calcineurin

is a common target of cyclophilin-cyclosporin A and FKBP-FK506 complexes. Cell 1991, 66 (4),

807-815.

48. Schreiber, S. L., Chemistry and biology of the immunophilins and their immunosuppressive

ligands. Science 1991, 251 (4991), 283-287.

49. Sabers, C. J.; Martin, M. M.; Brunn, G. J.; Williams, J. M.; Dumont, F. J.; Wiederrecht, G.;

Abraham, R. T., Isolation of a protein target of the FKBP12-rapamycin complex in mammalian cells.

J. Biol. Chem. 1995, 270 (2), 815-822.

50. Dumont, F. J.; Su, Q., Mechanism of action of the immunosuppressant rapamycin. Life Sci. 1995,

58 (5), 373-395.

208 LITERATURVERZEICHNIS

51. Bierer, B. E.; Somers, P. K.; Wandless, T. J.; Burakoff, S. J.; Schreiber, S. L., Probing

immunosuppressant action with a nonnatural immunophilin ligand. Science 1990, 250 (4980), 556-

559.

52. Bierer, B. E.; Mattila, P. S.; Standaert, R. F.; Herzenberg, L. A.; Burakoff, S. J.; Crabtree, G.;

Schreiber, S. L., Two distinct signal transmission pathways in T lymphocytes are inhibited by

complexes formed between an immunophilin and either FK506 or rapamycin. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 1990, 87 (23), 9231-9235.

53. Fischer, G.; Bang, H.; Mech, C., Determination of enzymatic catalysis for the cis-trans-

isomerization of peptide binding in proline-containing peptides. Biomed. Biochim. Acta 1984, 43

(10), 1101-1111.

54. Kofron, J. L.; Kuzmic, P.; Kishore, V.; Colon-Bonilla, E.; Rich, D. H., Determination of kinetic

constants for peptidyl prolyl cis-trans isomerases by an improved spectrophotometric assay.

Biochemistry 1991, 30 (25), 6127-6134.

55. Holt, D. A.; Luengo, J. I.; Yamashita, D. S.; Oh, H. J.; Konialian, A. L.; Yen, H. K.; Rozamus, L.

W.; Brandt, M.; Bossard, M. J.; Levy, M. A.; Eggleston, D. S.; Liang, J.; Schultz, L. W.; Stout, T. J.;

Clardyt, J., Design, synthesis, and kinetic evaluation of high-affinity FKBP ligands and the X-ray

crystal structures of their complexes with FKBP12. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115 (22), 9925-9938.

56. Steiner, J. P.; Hamilton, G. S.; Ross, D. T.; Valentine, H. L.; Guo, H.; Connolly, M. A.; Liang,

S.; Ramsey, C.; Li, J.-H. J.; Huang, W.; Howorth, P.; Soni, R.; Fuller, M.; Sauer, H.; Nowotnik, A.

C.; Suzdak, P. D., Neurotrophic immunophilin ligands stimulate structural and functional recovery in

neurodegenerative animal models. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94 (5), 2019-2024.

57. Engleberg, N. C.; Carter, C.; Weber, D. R.; Cianciotto, N. P.; Eisenstein, B. I., DNA sequence of

mip, a Legionella pneumophila gene associated with macrophage infectivity. Infect. Immun. 1989, 57

(4), 1263-1270.

58. Sippel, M. Computational Structure-based Design Approaches: Targeting HIV-1 Integrase and

the Macrophage Infectivity Potentiator of Legionella pneumophila. Dissertation, Würzburg, 2010.

59. Ceymann, A.; Horstmann, M.; Ehses, P.; Schweimer, K.; Paschke, A.-K.; Steinert, M.; Faber, C.,

Solution structure of the Legionella pneumophila Mip-rapamycin complex. BMC Struct. Biol. 2008,

8, 17.

60. Kang, C. B.; Hong, Y.; Dhe-Paganon, S.; Yoon, H. S., FKBP Family Proteins: Immunophilins

with Versatile Biological Functions. Neurosignals 2008, 16 (4), 318-325.

61. Van Duyne, G. D.; Standaert, R. F.; Schreiber, S. L.; Clardy, J., Atomic structure of the

rapamycin human immunophilin FKBP-12 complex. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113 (19), 7433-7434.

62. Michnick, S. W.; Rosen, M. K.; Wandless, T. J.; Karplus, M.; Schreiber, S. L., Solution structure

of FKBP, a rotamase enzyme and receptor for FK506 and rapamycin. Science 1991, 252 (5007), 836-

839.

63. Juli, C.; Sippel, M.; Jaeger, J.; Thiele, A.; Weiwad, M.; Schweimer, K.; Roesch, P.; Steinert, M.;

Sotriffer, C. A.; Holzgrabe, U., Pipecolic Acid Derivatives As Small-Molecule Inhibitors of the

Legionella MIP Protein. J. Med. Chem. 2011, 54 (1), 277-283.

64. Robert-Koch-Institut: RKI-Ratgeber für Infektionskrankheiten - Merkblätter für Ärzte:

Infektionen durch Chlamydien (Teil 1): Erkrankungen durch Chlamydia trachomatis.

Epidemiologisches Bulletin 2009, 37, 369-376.

65. Lundemose, A. G.; Birkelund, S.; Fey, S. J.; Mose Larsen, P.; Christiansen, G., Chlamydia

trachomatis contains a protein similar to the Legionella pneumophila mip gene products. Mol.

Microbiol. 1991, 5 (1), 109-115.

LITERATURVERZEICHNIS 209

66. Lundemose, A. G.; Kay, J. E.; Pearce, J. H., Chlamydia trachomatis Mip-like protein has

peptidyl-prolyl cis/trans isomerase activity that is inhibited by FK506 and rapamycin and is

implicated in initiation of chlamydial infection. Mol. Microbiol. 1993, 7 (5), 777-783.

67. Centers-for-Disease-and-Control-prevention: Trypanosomiasis, American.

www.dpd.cdc.gov/dpdx/html/trypanosomiasisamerican.htm (accessed 14.11.2011).

68. World-Health-Organization: Chagas disease (American trypanosomiasis).

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/ (accessed 14.11.2011).

69. Moro, A.; Ruiz-Cabello, F.; Fernandez-Cano, A.; Stock, R. P.; Gonzalez, A., Secretion by

Trypanosoma cruzi of a peptidyl-prolyl cis-trans isomerase involved in cell infection. EMBO J. 1995,

14 (11), 2483-2490.

70. Pereira, P. J. B.; Vega, M. C.; Gonzalez-Rey, E.; Fernandez-Carazo, R.; Macedo-Ribeiro, S.;

Gomis-Ruth, F. X.; Gonzalez, A.; Coll, M., Trypanosoma cruzi macrophage infectivity potentiator

has a rotamase core and a highly exposed α-helix. EMBO Rep. 2002, 3 (1), 88-94.

71. McGee, Z. A.; Stephens, D. S.; Hoffman, L. H.; Schlech, W. F., 3rd; Horn, R. G., Mechanisms of

mucosal invasion by pathogenic Neisseria. Rev. Infect. Dis. 1983, 5 (4), 708-714.

72. Leuzzi, R.; Serino, L.; Scarselli, M.; Savino, S.; Fontana, M. R.; Monaci, E.; Taddei, A.; Fischer,

G.; Rappuoli, R.; Pizza, M., Ng-MIP, a surface-exposed lipoprotein of Neisseria gonorrhoeae, has a

peptidyl-prolyl cis/trans isomerase (PPIase) activity and is involved in persistence in macrophages.

Mol. Microbiol. 2005, 58 (3), 669-681.

73. Robert-Koch-Instiut: RKI-Ratgeber für Infektionskrankheiten - Merkblätter für Ärzte:

Salmonellose (Salmonellen-Gastroenteritis). Epidemiologisches Bulletin 2009, 13, 117-126.

74. Norville, I. H.; Harmer, N. J.; Harding, S. V.; Fischer, G.; Keith, K. E.; Brown, K. A.; Sarkar-

Tyson, M.; Titball, R. W., A Burkholderia pseudomallei macrophage infectivity potentiator-like

protein has rapamycin-inhibitable peptidylprolyl isomerase activity and pleiotropic effects on

virulence. Infect. Immun. 2011, 79 (11), 4299-4307.

75. Jones, A. L.; Beveridge, T. J.; Woods, D. E., Intracellular survival of Burkholderia pseudomallei.

Infect. Immun. 1996, 64 (3), 782-790.

76. Becker, H. G. O.; Berger, W.; Domschke, G.; Fanghänel, E.; Faust, J.; Fischer, M.; Gentz, F.;

Gewald, K.; Gluch, R.; Mayer, R.; Müller, K.; Pavel, D.; Schmidt, H.; Schollberg, K.; Schwetlick,

K.; Seiler, E., Organikum: Organisch-chemisches Grundpraktikum. Barth Verlagsgesellschaft mbH:

Edition Deutscher Verlag der Wissenschaften: 1993; Vol. 19.

77. Bellamy, F. D.; Ou, K., Selective reduction of aromatic nitro compounds with stannous chloride

in nonacidic and nonaqueous medium. Tetrahedron Lett. 1984, 25 (8), 839-842.

78. Gribble, G. W.; Lord, P. D.; Skotnicki, J.; Dietz, S. E.; Eaton, J. T.; Johnson, J., Reactions of

sodium borohydride in acidic media. I. Reduction of indoles and alkylation of aromatic amines with

carboxylic acids. J. Am. Chem. Soc. 1974, 96 (25), 7812-7813.

79. Mutule, I.; Suna, E., Arylzinc species by microwave assisted Grignard formation-transmetalation

sequence: application in the Negishi coupling. Tetrahedron 2005, 61 (47), 11168-11176.

80. Neises, B.; Steglich, W., 4-Dialkylaminopyridines as acylation catalysts. 5. Simple method for

the esterification of carboxylic acids. Angew. Chem. 1978, 90 (7), 556-557.

81. Pracejus, G., Optical activation of N-phthaloyl-α-amino acid derivatives by catalysis with tertiary

bases. Liebigs Ann. Chem. 1959, 622, 10-22.

82. Ponnusamy, E.; Fotadar, U.; Spisni, A.; Fiat, D., A novel method for the rapid, non-aqueous tert-

butoxycarbonylation of some 17O-labeled amino acids and oxygen-17 NMR parameters of the

products. Synthesis 1986, (1), 48-49.

210 LITERATURVERZEICHNIS

83. Schiller, M. Neue Derivate der Etacrynsäure: Synthese und biologische Aktivität. Dissertation,

Würzburg, 2009.

84. Holzgrabe, U.; Heller, E., A new synthetic route to compounds of the AFDX-type with affinity to

muscarinic M2-receptor. Tetrahedron 2003, 59 (6), 781-787.

85. Burkhart, F.; Hoffmann, M.; Kessler, H., Stereoselective synthesis of a C-glycosidic analog of N-

glucoasparagine. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1997, 36 (11), 1191-1192.

86. Knorr, L., Synthetical experiments by means of ethyl acetoacetate. Liebigs Ann. Chem. 1886,

238, 137-219.

87. Lehmann, F.; Holm, M.; Laufer, S., Three-Component Combinatorial Synthesis of Novel

Dihydropyrano[2,3-c]pyrazoles. J. Comb. Chem. 2008, 10 (3), 364-367.

88. Hacker, J.; Ott, M.; Ludwig, B.; Rdest, U., Intracellular survival and expression of virulence

determinants of Legionella pneumophila. Infection 1991, 19 (4), 198-201.

89. Ludwig, B.; Schmid, A.; Marre, R.; Hacker, J., Cloning, genetic analysis, and nucleotide

sequence of a determinant coding for a 129-kilodalton peptidoglycan-associated protein (Ppl) of

Legionella pneumophila. Infect. Immun. 1991, 59 (8), 2515-2521.

90. Bio-Rad: Affi-Gel® Blue Affinity Chromatography Gel for Enzyme and Blood Protein

Purification. http://www3.bio-rad.com/cmc_upload/Literature/13362/Bulletin_1107.pdf (accessed

24.02.2012).

91. Fischer, G.; Wittmann-Liebold, B.; Lang, K.; Kiefhaber, T.; Schmid, F. X., Cyclophilin and

peptidyl-prolyl cis-trans isomerase are probably identical proteins. Nature 1989, 337 (6206), 476-

478.

92. Stryer, L., Biochemie. Spektrum Akademischer Verlag GmbH Heidelberg - Berlin: 1999; Vol. 4.

93. Chaplin, H. O.; Hunter, L., Associating effect of the hydrogen atom. I. Amides and sulfonamides.

J. Chem. Soc. 1937, 1114-1118.

94. Levchenko, E. S.; Bal'on, Y. G., Synthesis of arylsulfonyl derivatives of pyrrolidine, pyrroline,

and pyrrole. Zh. Org. Khim. 1967, 3 (8), 1509-1512.

95. Snyder, H. R.; Heckert, R. E., A method for the rapid cleavage of sulfonamides. J. Am. Chem.

Soc. 1952, 74, 2006-2009.

96. Malyshev, O. R.; Vinogradov, M. G., Convenient synthesis of π-acceptor chiral stationary phases

for high-performance liquid chromatography from halogen-substituted 3,5-dinitrobenzoylamides. J.

Chromatogr. A 1999, 859 (2), 143-151.

97. Block, D. G.; Bailey, R. E.; Towle, J. L. N-Alkynylarenesulfonamides and -sulfonimides.

FR1438772, 1966.

98. Goldstein, M.; Russell, M. A.; Willis, H. A., Infrared spectra of N-substituted sulfonamides.

Spectrochim. Acta, Part A 1969, 25 (7), 1275-1285.

99. Watt, G. W.; Otto, J. B., Ammonolysis of ethyl iodide by liquid ammonia. J. Am. Chem. Soc.

1947, 69, 836-838.

100. v. Braun, J.; Jostes, F.; Wagner, H., Decomposition of the six-carbon chain of adipic acid. II.

Ber. Dtsch. Chem. Ges. B 1928, 61B, 1423-1431.

101. Bollinger, F. W.; Hayes, F. N.; Siegel, S., Base-catalyzed decomposition of N-nitroso-N-

cyclopentylurethan. J. Am. Chem. Soc. 1953, 75, 1729-1730.

102. Park, K. H.; Lee, J. B., Indirect oxidative deamination of benzylamines to benzaldehydes. Synth.

Commun. 1992, 22 (7), 1061-1065.

LITERATURVERZEICHNIS 211

103. Chung, K. H.; Kim, J. N.; Ryu, E. K., Friedel-Crafts alkylation reactions of benzene with amide

bond containing compounds. Tetrahedron Lett. 1994, 35 (18), 2913-2914.

104. Jacob, R. M. 1-Alkylsulfonyl-4-alkylpiperazines. US2507408, 1950.

105. Katritzky, A. R.; Zhang, G.; Wu, J., 1-Phenylsulfonylbenzotriazole: A novel and convenient

reagent for the preparation of benzenesulfonamides and aryl benzenesulfonates. Synth. Commun.

1994, 24 (2), 205-216.

106. Ho, B.-T.; McIsaac, W. M.; Tansey, L. W.; Kralik, P. M., Hydroxyindole-O-methyltransferase.

II. Inhibitory activities of some N-acyltryptamines. J. Pharm. Sci. 1968, 57 (11), 1998-2000.

107. Chapman, C. J.; Frost, C. G.; Mahon, M. F., Structure and reactivity of new phosphine ligands

containing the hemi-labile sulfone moiety. J. Chem. Soc., Dalton Trans. 2006, (18), 2251-2262.

108. De Luca, L.; Giacomelli, G., An Easy Microwave-Assisted Synthesis of Sulfonamides Directly

from Sulfonic Acids. J. Org. Chem. 2008, 73 (10), 3967-3969.

109. Garcia Ruano, J. L.; Parra, A.; Marzo, L.; Yuste, F.; Mastranzo, V. M., One-pot synthesis of

sulfonamides from methyl sulfinates using ultrasound. Tetrahedron 2011, 67 (16), 2905-2910.

110. Burns, B.; King, N. P.; Tye, H.; Studley, J. R.; Gamble, M.; Wills, M., Chiral phosphinamides:

new catalysts for the asymmetric reduction of ketones by borane. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1

1998, (6), 1027-1038.

111. Harmata, M.; Zheng, P.; Huang, C.; Gomes, M. G.; Ying, W.; Ranyanil, K.-O.; Balan, G.;

Calkins, N. L., Expedient Synthesis of Sulfinamides from Sulfonyl Chlorides. J. Org. Chem. 2007,

72 (2), 683-685.

112. Molander, G. A.; Fleury-Bregeot, N.; Hiebel, M.-A., Synthesis and Cross-Coupling of

Sulfonamidomethyltrifluoroborates. Org. Lett. 2011, 13 (7), 1694-1697.

113. Benard, S.; Neuville, L.; Zhu, J., Copper-Mediated N-Cyclopropylation of Azoles, Amides, and

Sulfonamides by Cyclopropylboronic Acid. J. Org. Chem. 2008, 73 (16), 6441-6444.

114. Naito, H.; Hata, T.; Urabe, H., Selective Deprotection of Methanesulfonamides to Amines. Org.

Lett. 2010, 12 (6), 1228-1230.

115. Schuster, I. I.; Doss, S. H.; Roberts, J. D., Natural-abundance nitrogen-15 nuclear magnetic

resonance spectroscopy. Electronic effects in benzenesulfonamides. J. Org. Chem. 1978, 43 (25),

4693-4696.

116. Choi, J. H.; Lee, B. C.; Lee, H. W.; Lee, I., Competitive Reaction Pathways in the Nucleophilic

Substitution Reactions of Aryl Benzenesulfonates with Benzylamines in Acetonitrile. J. Org. Chem.

2002, 67 (4), 1277-1281.

117. Short, W. F.; Oxley, P. Substituted carboxamides. GB587810, 1947.

118. McKay, A. F., The reaction of primary amines with 1-nitroso-2-nitramino-2-imidazoline. J.

Org. Chem. 1951, 16, 1395-1404.

119. Agbalyan, S. G.; Esayan, G. T.; Magakyan, P. O.; Nshanyan, A. O., Esters of sulfonic acids.

XIII. Synthesis of some cyclohexanesulfonic acid derivatives. Izv. Akad. Nauk Arm. SSR, Khim.

Nauki 1964, 17 (1), 69-74.

120. Johnson, T. B.; Ambler, J. A., Amines. IV. Alkylation and hydrolysis of aliphatic sulfonamides,

New synthesis of sarcosine. J. Am. Chem. Soc. 1914, 36, 372-385.

121. Gregory, W. A. 1-(p-Sulfamoylphenyl)-2-(2,2-dichloroacetamido)-1,3-propanediols.

US2680135, 1954.

122. Waletzky, E. Anticoccidal agent. US2531755, 1950.

212 LITERATURVERZEICHNIS

123. Hill, B.; Liu, Y.; Taylor, S. D., Synthesis of α-Fluorosulfonamides by Electrophilic

Fluorination. Org. Lett. 2004, 6 (23), 4285-4288.

124. Shavyrina, V. V.; Ermakova, Z. I., Synthesis and study of some N-aminopropyl and N-

aminopropionyl derivatives of 3-substituted diphenylamines. Khim. Farm. Zh. 1969, 3 (11), 30-34.

125. Schmitz-Josten, R.; Sueling, C.; Boemer, B.; Brinkmeyer, H. Photopolymerization methods and

suitable photoactivators. DE3135115, 1983.

126. Reckhow, W. A.; Tarbell, D. S., Hexahydroindolo[2,3-a]quinolizine. J. Am. Chem. Soc. 1952,

74, 4960-4962.

127. Armistead, D. M.; Saunders, J. O. Preparation of N-(aryloxalyl)piperidine-2-carboxylates and

analogs as multidrug resistance inhibitors. WO9736869, 1997.

128. Titanyuk, I. D.; Beletskaya, I. P., Synthesis of non-natural cyclic amino acids from available

unsaturated tertiary amines. Russ. J. Org. Chem. 2010, 46 (9), 1277-1281.

129. Bender, D. R.; Brennan, J.; Rapoport, H., Periodate oxidation of α-keto γ-lactams. Enol

oxidation and β-lactam formation. Mechanism of periodate hydroxylation reactions. J. Org. Chem.

1978, 43 (17), 3354-3362.

130. Niznik, G. E.; Morrison, W. H., III; Walborsky, H. M., Metallo aldimines. Masked acyl

carbanion. J. Org. Chem. 1974, 39 (5), 600-604.

131. McFarlane, A. K.; Thomas, G.; Whiting, A., Diastereoselectivity and assignment of absolute

stereochemistry in the aza-Diels-Alder reaction of a sulfonylimino acetate with 1-methoxy-3-

trimethylsilyloxybuta-1,3-diene. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1995, (21), 2803-2808.

132. Fujii, T.; Miyoshi, M., Novel synthesis of L-pipecolic acid. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1975, 48 (4),

1341-1342.

133. Hamilton, G. S.; Li, J.-h.; Steiner, J. P. Method of using neurotrophic sulfonamide compounds.

US5721256, 1998.

134. Familoni, O. B., Synthesis of tricyclic tetrahydro 1,2-benzothiazinones via Friedel-Craft anionic

equivalents. J. Pharm. Res. Dev. 1998, 3 (1), 21-29.

135. Kosley, R. W., Jr.; Baron, B.; Jimonet, P.; Jurcak, J. G.; Shimshock, S. J.; Zhao, X.-Y.; Sher, R.;

Mueller, P. J.; Beall, J.; Barrague, M.; Guiles, J. W. 1-Arylsulfonylpiperidine derivatives and their

preparation, pharmaceutical compositions, FKBP binding compositions, and pharmaceutical use for

treatment of conditions associated with neuronal degeneration. WO2006012256, 2006.

136. Moss, W. O.; Wakefield, E.; Mahon, M. F.; Molloy, K. C.; Bradbury, R. H.; Hales, N. J.;

Gallagher, T., Ketene S,S-acetals as 1,3-dipolarophiles towards azides. A new synthetic entry into

cyclic amino acids. Tetrahedron 1992, 48 (36), 7551-7569.

137. Rapoport, H.; Campion, J. E., Synthesis of 2,3,4-trimethoxybenzocyclohepten-6-one. J. Am.

Chem. Soc. 1951, 73, 2239-2241.

138. Rosowsky, A.; Chen, H.; Fu, H.; Queener, S. F., Synthesis of new 2,4-Diaminopyrido[2,3-

d]pyrimidine and 2,4-Diaminopyrrolo[2,3-d]pyrimidine inhibitors of Pneumocystis carinii,

Toxoplasma gondii, and Mycobacterium avium dihydrofolate reductase. Bioorg. Med. Chem. 2003,

11 (1), 59-67.

139. Pfeiffer, P.; Kalckbrenner, E.; Kunze, W.; Levin, K., Hydrochalcones and hydrochalcols. J.

Prakt. Chem. 1928, 119, 109-130.

140. Martinez, R.; Ramon, D. J.; Yus, M., Easy α-alkylation of ketones with alcohols through a

hydrogen autotransfer process catalyzed by RuCl2(DMSO)4. Tetrahedron 2006, 62 (38), 8988-9001.

141. Holt, D. A.; Konialian-Beck, A. L.; Oh, H.-J.; Yen, H.-K.; Rozamus, L. W.; Krog, A. J.; Erhard,

K. F.; Ortiz, E.; Levy, M. A.; Brandt, M.; Bossard, M. J.; Luengo, J. I., Structure-activity studies of

LITERATURVERZEICHNIS 213

synthetic FKBP ligands as peptidyl-prolyl isomerase inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994, 4

(2), 315-320.

142. Choi, C.; Li, J.-H.; Vaal, M.; Thomas, C.; Limburg, D.; Wu, Y.-Q.; Chen, Y.; Soni, R.; Scott,

C.; Ross, D. T.; Guo, H.; Howorth, P.; Valentine, H.; Liang, S.; Spicer, D.; Fuller, M.; Steiner, J.;

Hamilton, G. S., Use of parallel-synthesis combinatorial libraries for rapid identification of potent

FKBP12 inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002, 12 (10), 1421-1428.

143. Schnabel, E., Improved synthesis of tert-butoxycarbonyl amino acids by a constant pH reaction.

Liebigs Ann. Chem. 1967, 702, 188-196.

144. Bentley, P. H.; Gregory, H.; Laird, A. H.; Morley, J. S., Polypeptides. I. The synthesis of

peptides related to eledoisin. J. Chem. Soc., Suppl. 1964, 6130.

145. Ejim, L.; Mirza, I. A.; Capone, C.; Nazi, I.; Jenkins, S.; Chee, G.-L.; Berghuis, A. M.; Wright,

G. D., New phenolic inhibitors of yeast homoserine dehydrogenase. Bioorg. Med. Chem. 2004, 12

(14), 3825-3830.

146. Weitman, M.; Lerman, K.; Nudelman, A.; Major, D. T.; Hizi, A.; Herschhorn, A., Structure-

activity relationship studies of 1-(4-chloro-2,5-dimethoxyphenyl)-3-(3-propoxypropyl)thiourea, a

non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor of human immunodeficiency virus type-1. Eur. J. Med.

Chem. 2011, 46 (2), 447-467.

147. Anderson, G. W.; McGregor, A. C., tert-Butoxycarbonylamino acids and their use in peptide

synthesis. J. Am. Chem. Soc. 1957, 79, 6180-6183.

148. Houen, G.; Struve, C.; Sondergaard, R.; Friis, T.; Anthoni, U.; Nielsen, P. H.; Christophersen,

C.; Petersen, B. O.; Duus, J. O., Substrate specificity of the bovine serum amine oxidase and in situ

characterization of aminoaldehydes by NMR spectroscopy. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13 (11), 3783-

3796.

149. Wei, L.; Wu Yon, Q.; Wilkinson, D. E.; Chen, Y.; Soni, R.; Scott, C.; Ross, D. T.; Guo, H.;

Howorth, P.; Valentine, H.; Liang, S.; Spicer, D.; Fuller, M.; Steiner, J.; Hamilton, G. S., Solid-phase

synthesis of FKBP12 inhibitors: N-sulfonyl and N-carbamoylprolyl/pipecolyl amides. Bioorg. Med.

Chem. Lett. 2002, 12 (10), 1429-1433.

150. Losse, G.; Jeschkeit, H., Racemate resolution of amino acid esters. IV. Preparation of optically

active esters of simple amino acids from their DL-compounds by resolution with di-O-benzoyl-D-

tartaric acid. Chem. Ber. 1957, 90, 1275-1278.

151. Gerling, K.; Heinemann, H.; Meier, A.; Langer, K. Preparation of acylated amino acid

derivatives as pharmaceuticals and dietetics. EP400499, 1990.

152. Karrer, P.; Portmann, P.; Suter, M., The reduction of α-amino carboxylic acid esters with

lithium aluminum hydride. Helv. Chim. Acta 1948, 31, 1617-1623.

153. Lochead, A. W.; Proctor, G. R.; Caton, M. P. L., Use of chloroalkenylamines for the synthesis

of 1-azabicyclo[3.3.0]octane and 1-azabicyclo[4.3.0]nonane derivatives. J. Chem. Soc., Perkin Trans.

1 1984, (11), 2477-2489.

154. Aberg, B., Plant-growth regulators. IX. p-Alkylphenoxyacetic and -propionic acids, and some

related derivatives of naturally occurring phenols. Physiol. Plant. 1954, 7, 241-252.

155. Stebbins, J. L.; Zhang, Z.; Chen, J.; Wu, B.; Emdadi, A.; Williams, M. E.; Cashman, J.;

Pellecchia, M., Nuclear Magnetic Resonance Fragment-Based Identification of Novel FKBP12

Inhibitors. J. Med. Chem. 2007, 50 (26), 6607-6617.

156. Kitamura, R., Constitution of antipyrine and related compounds. V. Experimental evidence of

the third form (the third oscillation form) of antipyrine. Yakugaku Zasshi 1940, 60, 3-9.

157. Pal, S.; Mareddy, J.; Devi, N. S., High speed synthesis of pyrazolones using microwave-assisted

neat reaction technology. J. Braz. Chem. Soc. 2008, 19 (6), 1207-1214.

214 LITERATURVERZEICHNIS

158. Laemmli, U. K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4. Nature 1970, 227 (5259), 680-685.

159. Jansohn, M.; Rothhämel, S. Gentechnische Methoden: Eine Sammlung von Arbeitsanleitungen

für das molekularbiologische Labor. http://www.springer.com/978-3-8274-2429-7 (accessed

05.03.2012).