Wachstum und Differenzierung in aus isolierten Protoplasten von Petunia hybrida entstandenem Kallus

Lehrstuhl fur Botanische Entwicklungsphysiologie der Universitat Hohenheim

Wachstum und Differenzierung in aus isolierten Protoplastenvon Petunia hybrida entstandenem Kallus

GUNTER DONN, DIETER HESS und INGO POTRYKUS

Mit 9 Abbildungen

Eingegangen am 22. ]anuar 1973

Summary

Growth and differentiation in calli originated from isolated protoplasts of Petunia hybrida

In this paper we report on the aptitude of calli originated from isolated protoplasts forexperiments on the induction of shoots and roots. Calli of this type are well suited for suchexperiments, since there is no possibility anymore for homoiogenetic induction.

A screening was made in preliminary experiments with respect to the morphogeneticpotentialities of calli obtained from internodes of Petunia hybrida. These calli are differentiating nearly quantitatively to shoots (fig. 1). Shoots and leaves having developed in this waywere transfered onto a culture medium containing 2,4-D. This auxin causes dedifferentiationand inhibits further differentiation: the surface of leaves changes completely to callus formation, and in this type of callus organogenesis is nearly completely repressed (figs. 2 and 3).

Protoplasts isolated enzymatically from mesophyll cells out of leaves of Petunia hybridawere cultured to calli of about 500,-1000 cells in a liquid culture medium containing 2,4-D(DURAND et aI., 1973). For further rapid growth these calli were transfered onto a culturemedium with agar and 2,4-D (fig. 4). In these calli morphogenesis is also blocked by 2,4-D.After two passages on culture media with different amounts of 6-BA and 2,4-D the calliwere transfered onto a differentiation inducing medium in which 2,4-D had been replaced byNAA. There, it depends upon the concentration and upon the ratio of 6-Ba and NAA,whether these calli go on growing as calli or start differentiating into roots and/or shoots(figs. 5-7). Best root formation is obtained on NAGATA-TAKEBE (1971) culture medium with0,1 mg . 1-1 NAA and without 6-BA (fig. 8). 6-BA as usually promotes differentiation intoshoots. Shoots develop, when the concentration of 6-BA is equal or higher than that of NAA.High amounts of 6-BA are inhibitory (fig. 9). These data were obtained with the cyanidintype of Petunia.

The results show that calli originated from isolated protoplasts are very well suited forexperiments with respect to organogenesis. Furthermore, these results added to the growing upof series of fertile Petunia plants from isolated protoplasts (DURAND et aI., 1973).

Zusammenfassung

An Kal1i, die aus isolierten Protoplasten von Petunia hybrida isoliert worden waren, wirddie Organogenese in Abhangigkeit insbesondere von hormonellen Faktoren untersucht. Protoplastenkalli, in denen keinerlei homoiogenetische Induktion von seiten des Gewebes der Ausgangspflanze erfolgen kann, erweisen sich als glinstige Objekte flir derartige Untersuchungen.

Z. Pjlanzenp:hysiol. Bd. 69. S. 423-437. 1973.

424 G. DONN, D. HESS und 1. POTRYKUS

Einleitung

Petunia hybrida wird zunehmend mehr Gegenstand biochemischer und entwicklungsphysiologischer Untersuchungen und auch genetischer Manipulationen (HESS, 1972).1m Rahmen von Untersuchungen zu Transformationen an isolierten Protoplastengelang es uns, aus dem Laubblattmesophyll von Petunia hybrida isolierte Protoplastenzur Teilung, Kallusbildung und schlieBlich Regeneration fortpflanzungsfahiger Pflanzen zu bringen (HESS und POTRYKUS, 1972, POTRYKUS und DURAND, 1972, DURANDet aI., 1973). Die Aufzucht von Petunien aus Protoplasten wird von uns serienmaBigdurchgeftihrt. Ein wesentlicher Schritt dabei war die Induktion von SproB- und Wurzelbildungen in den aus den isolierten Protoplasten entstandenen Kalli.

Cber dieses speziellere Interesse hinaus verdienen Versuche zur Differenzierung in«Protoplastenkalli» allgemein entwicklungsphysiologische Beachtung. Einmal ist dasAusgangsmaterial - Protoplasten aus dem Mesophyll von Laubblattern - relativ einheitlich. Vor allem aber werden die Protoplasten von ihrer Isolierung an ohne jedenKontakt mit ausdifferenziertem Gewebe unter definierten Bedingungen herangezogen.Eine homoiogenetische Induktion von seiten des Ausgangsgewebes ist infolgedessenunmoglich. Nach wenigen Passagen steht dann einheitliches Kallusmaterial zur Verftigung, das sich gut zu Untersuchungen tiber die Induktion von Differenzierungenverschiedener Art eignet. Cber einige unserer Befunde zur Induktion von Sprossenund Wurzeln in derartigen Protoplastenkalli wird im folgenden berichtet.

Material und Methoden

1. Pjlanzenmaterial:Cyanidintyp von Petunia hybrida (HESS, 1963).

2. Gewinnung und Kultur von Kallus aus Internodien:

Von ungefahr 20 his 30 em langen Triehen unter Gewachshaushedingungen (20 his 25° C)aufgezogener Petunienpflanzen wurde das ohere Drittel ahgeschnitten. Der Apex und dasanschlieBende 2 em lange SproBstiick wurde entfernt, ehenso aIle Blatter und Seitenzweige.Die Sprosse wurden dann nacheinander in 0,1 % igem Prilwasser und zweimal in sterilisiertemdeionisiertem Wasser gewaschen. AnschlieBend wurde in 70% igem Athanol (1 Min.) und nachzweimaligem Waschen in sterilisiertem deionisiertem Wasser mit 7% igem Ca(OClh (20 Nlin.)sterilisiert. N ach viermaliger Waschung mit sterilisiertem deionisiertem Wasser wurden dieSproBstiicke dann in Segmente zerlegt. Zwei SegmentgroBen wurden auf ihre Fahigkeit zurKallushildung getestet: 3 his 5 mm lange Segmente (Kultur in Plastikpetrischalen von 6 emDurchmesser) und 15 his 20 mm lange Segmente (Kultur in Reagenzglasern).

Kulturmedien

a) MURASHIGE-SKOOG (1962) + 0,1 gIl Caseinhydrolysat, enthaltend 2 mg/l 6-BA und1 mg/l NAA.

h) MURASHIGE-SKOOG (1962) in der Version nach BINDING (1971).e) Takehe-Medium (NAGATA und TAKEBE, 1971).d) Nitsch-Medium (NITSCH et OHYAMA, 1971).

Alle Medien enthielten 6 gIl Agar.

z. Pjlanzenphysiol. Bd. 69. S. 423-437. 1973.

Wachstum und Differenzierung in aus isolierten Protoplasten entstandenem Kallus 425

Segmente beider GroBen bildeten auf ihrer morphologischen Unterseite in den Mediennach MURASHIGE-SKOOG, TAKEBE und NITSCH Kallus. Ein rasches Wachstum der in Subkultur genommenen Internodienkalli erfolgte nur auf Takebe-Medium (mit 1 mg/l 6-BA und3 mg/l NAA). Auf diesem Medium im Kallus induzierte Regeneratsprosse sowie von solchenRegeneratsprossen isolierte BHittchen wurden zu Differenzierungsversuchen auf Takebe-11edium, enthaltend 0,5 mg/l 6-BA und 0,5 mg/l 2,4-D iibertragen.

3. Gewinnung und Kultur von Protoplasten:

Nach DURAND et al. (1973) aus dem Mesophyll von LaubbHittern des Cyanidintyps. 5 Wochen nach der Isolierung wiesen die in Fliissigkeitskultur gehaltenen Protoplasten einen Durchmesser von 0,2-1,0 mm auf. Solche Kalli wurden auf Agarmedien iibertragen.

4. Kulturmedium:

FUr die Kultur der Kalli und die Versuche zur Differenzierung wurde das Grundmediumnach NAGATA und TAKEBE (1971), enthaltend 0,6 % Agar (Difco Bacto-Agar) verwendet. Inihm waren die jeweils angegebenen Hormonmengen enthalten. In Vorversuchen hatte sich dasMurashige-Skoog-Medium (1962) als weniger gUnstig erwiesen.. Die Medien wurden 25 Min.bei 1,2 atm. und 120° C sterilisiert.

5. Passagen:

Vor den Versuchen zur Differenzierung wurde das Kallusmaterial fUr zwei Passagen aufdifferenzierungshemmenden Medien vorkultiviert. Erst wahrend der dritten Passage wurdeversucht, Differenzierungen zu erhalten. Wahrend aller drei Passagen wurden die Kalli in mitParafilm versiegelten Plastikpetrischalen (Fa. GREINER/NUrtingen) von 6 cm Durchmessergehalten. In jeder Petrischale befanden sich 10 ml Medium. Die Petrischalen wurden in Kottermann-Thermostaten mit Zusatzbeleuchtung eingebracht: 25 ± 2° C, 12 Stunden Licht (ca.1000 Lux durch senkrecht montierte Rohren Osram-L 15 W/25, Messung in der Mitte desThermostaten senkrecht zum Strahlengang).

1. Passage

Kulturmedien: Grundmedien nach NAGATA und TAKEBE (1971) mit0,0 0,05 0,10 0,25 0,50 1,00 mg/l 6-BAund0,0 0,05 0,10 0,25 0,50 mg/l 2,4-Din 28 von 30 moglichen Kombinationen dieser beiden Hormone (die Kombinationen 0,5/0und 1,0/0 wurden nicht getestet; die erste der beiden Zahlen in solchen Kombinationen gibtjeweils die Konzentration 6-BA in n1g/1 an, die zweite 2,4-D oder NAA ebenfalls in mg/I).20 ml Kallussuspension (vgl. 2) wurden mit hormonfreiem fliissigem Takebemedium auf80 ml aufgefUllt. In jede Petrischale mit hormonhaltigem Agarmedium wurden 0,25 ml derso verdiinnten Kallussuspension einpipettiert. Zur leichteren Verteilung der Kalli auf derAgaroberfHiche und zur weiteren Verdiinnung des hormonhaltigen Ausgangsmediums (vgl.DURAND et aI., 1973) wurden pro Petrischale noch weitere 0,5 mi hormonfreies fliissigesTakebemedium zugesetzt. AnschlieBend wurden die Petrischalen leicht in der Horizontalebewegt und das Fliissigmedium vorsichtig abpipettiert. Auf jede der 28 Hormonkombinationen entfielen 10 Petrischalen. Nach 5 Wochen erfolgte die Auswertung und die 2. Passage.

2. Passage

Bei der Auswertung der ersten Passage zeigte es sich, daB auch die hochsten getesteten HorInonkonzentrationen noch ein wenn auch schwaches Kalluswachstum zulieBen. In der 2. Pas-


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sage wurden die Hormonkonzentrationen deshalb erhoht. Sowohl 6-BA als auch 2,4-Dkamen in folgenden Konzentrationen zur Verwendung: 0,0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50, 1,0,2,0, 4,0 und 8,0 mg/I. Alle 81 moglichen Kombinationen dieser Konzentrationen wurdengetestet. Fur jede dieser 81 Kombinationen wurden 5 Petrischalen hergestellt. In jede dieserPetrischalen wurden 5 Kalli aus der ersten Passage tibertragen. Bei den neuen Kombinationen mit dem hoheren Hormongehalt wurden Kalli eingesetzt, die in der 1. Passage aufMedien mit dem jeweils gleichen Verhaltnis 6-BA/2,4-D gewachsen waren. Die Dauer der2. Passage betrug 5-6 Wochen. Bei einigen besonders wichtigen Hormonkombinationenwurde an einem Teil der Kalli nach der 4. Woche die Frischgewichtszunahme bestimmt.

3. Passage: Differenzierungsmedien

In den Medien der dritten Passage wurde das 2,4-D der zweiten Passage durch die jeweilsgleiche Gewichtsmenge NAA ersetzt. Aus arbeitstechnischen Grunden muBte die Zahl clerzu testenden Kombinationen reduziert werden (vgI. dazu Abb. 6 und 7). Die Kalli derzweiten Passage (Frischgewicht eines Kallus 20-50 mg) wurden zerteilt. Die Teilstlickewurden auf das jeweils entsprechende NAA-haltige Medium cler dritten Passage ubertragen,also auf Medien mit der gleichen Konzentration (mg/I) an den beiden Hormonen, aber mitNAA anstelle von 2,4-D. Pro Kombination wurden 10 Petrischalen mit je 5 Kallusteileneingesetzt. Nach 4, 6 und 8 Wochen wurden die Versuchsansatze ausgewertet.

6. Chemikalien, Abkiirzungen etc.

6-BA = 6-Benzyl-adenin (Fluka Nr. 13209)2,4-D = 2,4-Dichior-phenoxy-essigsaure (Serva Nr. 19410)NAA = a-NaphthyI-essigsaure (Serva Nr. 30040)Bei allen Hormonkombinationen wird zuerst 6-BA in mg/I, dann 2,4-D oder NAA, beideebenfalls in mg/l angegeben.

Ergebnisse und Diskussion

I. Di//erenzierungshemrnende Wirkung von 2,4-D

1. Dedifferenzierung von RegeneratbHittern und -sprossen und Differenzierungshemmung in Kallus aus RegeneratbHittern und -sprossen durch 2,4-D

2,4-D ist fur seine dedifferenzierende und differenzierungshemmende Wirkung bekannt. An neueren Befunden hierzu sei im gegebenen Zusammenhang erwahnt, daBisolierte Blatter von Torenia /ournieri auf 2,4-D-haltigen Medien zur Dedifferenzierung und Kallusbildung gebracht werden konnen und daB dann 2,4-D in clemeinmal gebildeten Kallus Redifferenzierungen hemmt. Nur in Abwesenheit von2,4-D kommt es zur Regeneration von SproBknospen (BA]A], 1972). Entsprechendesgilt auch fur Monocotyledonen. Junges Blattgewebe von Allium sativum bildet auf2,4-D-haltigen Medien Kallus. Auch hier erweist sich 2,4-D als Hemmstoff einerDifferenzierung, zumindest was die Organogenese anbelangt (protracheale Elelnentckonnen gebildet werden, HAVRANEK und NOVAK, 1972).

Vor den Versuchen mit Kallus aus Protoplasten testeten wir die Wirksamkeit von2,4-D an leicht zu erhaltendem Kallus aus Internodien (vgl. Material und Methoden).Internodienkallus geht auf NAA-haltigen Medien in den beiden ersten Monaten nachseiner Isolierung vom Internodium fast quantitativ zur SproBbildung uber (meistens



beniitztes Medium: Takebe-Medium (NAGATA und TABEKE, 1971), enthaltend 1,0 mg6-BA/ml und 3,0 mg NAA/ml), vgl. Abb. 1).

Fig. 1: Callus from internodes after 5 weeks of culture on Nagata-Takebe culture mediumwith 0,25 mg .1-1 6-BA and 2,0 mg .1-1 NAA. The figure shows differentiation of shoots (lowerpart) and of teratomic leaves (upper right).

Solche Regeneratsprosse und auch einzelne RegeneratbHitter, die zum Teilteratos waren, wurden auf 2,4-D-haltige Medien iiberfiihrt (meistens beniitztes Medium: Takebe-Medium (NAGATA und TAKEBE, 1971), enthaltend 0,5 n1g/1 6-BA und0,5 mg/l 2,4-D. Regeneratsprosse wie- blatter bilden Kallus, die letzteren oft aufihrer gesamten OberfHiche (Abb. 2). Bei Petunia wirkt 2,4-D also, auch was Blattorgane anbelangt, ebenso dedifferenzierend wie z. B. bei T orenia und Allium.

2,4-D unterbindet dariiber hinaus fast aIle Redifferenzierungen im Kallus. Lediglich Wurzeln konnen fallweise gebildet werden (Abb. 2 und 3). Ihr Langenwachstunlwird aber gehemmt, oft so sehr, daB die gestauchte Wurzel nur an dem sie umgebendenKranz von Wurzelhaaren erkennbar war.

Die erwahnten Wurzeln wachsen zunachst meistens negativ geotrop. Es trifft das auch furdie Wurzelbildung auf den weiter unten besprochenen Differenzierungsmedien zu. Die gleicheBeobachtung wurde schon an anderen Objekten gemacht (VASIL und HILDEBRAND, 1966). HineErklarung steht noch aus.

Dber'SproB- und Wurzelinduktion in aus Internodien von Petunia gewonnenem K.allusberichtete auch BINDING (1971). Er verwendete Medien mit der hohen Konzentration von

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9,0 mg/l IES zur Erzielung raschen Kalluswachstums und in Kombination mit anderen Faktoren auch zur SproBbildung. Unsere Kalli aus Internodien sowie aus Protoplasten kamen aufMedien mit dieser Konzentration (9,0 mg/l) an IES weder zum Wachstum noch zur Differen·zierung, sondern gingen fruher oder spater zugrunde. Moglicherweise spielen hier rassenspezifische Unterschiede eine Rolle.

Nach diesen Vorversuchen stand fest, daB 2,4-D auch an unserem Objekt einededifferenzierende und differenzierungshemmende Wirkung ausubt. Damit war dieGrundlage fur entsprechende, erweiterte Versuchsreihen an Protoplastenkalli gegeben.

2. Wachstum von Protoplastenkallus auf 2,4-D-haltigen Medien

81 verschiedene Kombinationen von 6-BA und 2,4-D wurden hinsichtlich ihrereWirkung auf Protoplastenkallus getestet (vgl. Material und Methoden). Vor allemfolgende Punkte wurden untersucht:

a) Minimalbedarf an 6-BA und 2,4-D

b) Optimalbedarf an 6-BA und 2,4-D: Erzielen elnes raschen Kalluswachstums beilockerer, parenchymatoser Wuchsform

c) Maximal vertragliche Hormonkonzentrationen

d) Differenzierungshemmung durch 2,4-D

a) Minimalbedarf an 6-BA und 2,4-D:

Fig. 2: Teratomic leaf after 4 weeks of culture on Nagata-Takebe culture medium with0,5 mg .1-1 6-BA and 0,5 mg .1-1 2,4-D. The figure shows the base of the leaf. Callus developsfrom the complete surface of the leaf. In the region between blade and petiole a root withreduced elongation growth and with root hairs has developed.



Fig. 3: Callus from internode after 4 weeks of culture on a Nagata-Takebe culture mediumwith 0,05 mg .1-1 6-BA and 0,5 mg .1-1 2,4-D. Roots with reduced elongation growth havebeen developed. The elder (basal) parts of the roots show dedifferentiation and callus formation.

Wie erwartet ist auch der ProtoplastenkaIlus aus Petunia unfahig, ohne jedenHormonzusatz zu iiberleben und zu wachsen. Das Medium mit den geringsten wirksamen Hormonkonzentrationen ist 0/0,5 (es sei daran erinnert, daB die erste Zahldie Konzentration an 6-BA, die zweite die an 2,4-D angibt, beide in mg/l). DasKaIluswachstum ist hier noch schlecht (Abb. 4). Aber schon bei der nachsthoherengetesteten Konzentration an 2,4-D wird es ausgezeichnet: auf 0/0,1 nahm das Frischgewicht der Kalli in 4 Wochen irn Mittel urn das 5,5fache zu. Fur ein gutes Wachstum der Kalli sind also nur geringe Horrnonrnengen irn Medium erforderlich. Dabei ist6-BA in Anwesenheit von 2,4-D sogar uberflussig. Es gilt das schon fur die niedrigstegetestete 2,4-D-Konzentrationen von 0,05 mg/l (Kombination 0/0,05) und dann auchfur aIle hoheren Konzentrationen. .l\.uch das Umgekehrte trifft zu: auf Medien n1it6-BA kann es auch bei Fehlen von 2,4-D zu Kalluswachstum kommen. QuantitativeWerte (Frischgewichtszunahme) sind hier aber schwer zu erhalten, wei! ein GroBteil derKalli auf auxinfreien, aber 6-BA-haltigen Medien rasch Sprosse und Wurzeln auszudifferenzieren beginnt und so nicht zu Messungen eingesetzt vrerden kann (vgl.Abb. 6 und 7).

b) Optimalbedarf an 6-BA und 2,4-D:

Die Medien mit der Hormonkombination 0/0,1 und ahnlich gut 0/0,25 sind gleichzeitig auch optimal hinsichtlich einer lockeren Wuchsform, die sich nach 4-6 Wochen



2-40 o 0.05 0.10 0.25 O.50fngJg

6-BA

o

0.05

0.10

0.25

0.50

1.0

~ILJ

Fig. 4: Calli originated from isolated protoplasts at the end of the 1. passage after 5 weeksof culture on culture media with different contents of 6-BA and 2,4-D.

Kultur auf diesen Medien einstellt. Die so erhaltenen «optimalen» Kalli wurdenmehrfach subkultiviert. Bisher wurden 4-5 Passagen auf den gleichen Medien vorgenommen, ohne daB es zu einer Abnahme der Wachstumsgeschwindigkeit odereiner Veranderung der lockeren Wuchsform gekommen ware.

Mit steigender Konzentration an 2,4-D und bei Fehlen von 6-BA nimmt danndie Desintegration der Gewebe zu. Bei einer Konzentration von 8 mg!l 2,4-D werden die Kalli schlieBlich halbfliissig. Sie bestehen dann aus locker zusammenhangendenZellgruppen und Einzelzellen, die sich auf mechanischem Wege leicht voneinandertrennen lassen. Die so gewonnenen Zellgruppen und Einzelzellen lassen sich nicht nur



auf Agarmedien, sondern auch in Flussigkeitsmedien weiterkultivieren. Allerdings

muE in den Suspensionskulturen 6-BA vorhanden seine Als hinreichend fur die

Suspensionskultur erwies sich die Hormonkombination 0,25/0,25.Mit steigender Konzentration an 6-BA wird die Eignung der Kalli als Aus

gangsmaterial fur Suspensionskulturen zunehmend schlechter. Denn der ZusammenschluB der Zellen im Gewebeverband wird fester und auBerdem werden mehr tracheidale Elemente ausdifferenziert. Die Frischgewichtzunahme ist auf Medien mit 6-BAund 2,4-D nicht haher als auf Medien nur mit 2,4-D.

c) Maximal vertragliche Hormonkonzentrationen:

Wachstumshemmung findet sich bei 2,4-D-Konzentrationen von 2 mg/l aufwarts.Bei 4 und 8 mg/l 2,4-D sterben viele Kalli abo 6-BA dagegen fuhrt auch in denhachsten getesteten Konzentrationen (8 mg/l) noch nicht zu einem Absterben der Kalli.

d) Differenzierungshemmung durch 2,4-D:

Wahrend der 1. Passage (vgl. Material und Methoden) auf 2,4-D-haltigen Medienfanden sich einige wenige SproB- und Wurzeldifferenzierungen. Sprosse traten nurauf, wenn der Gehalt an 6-BA 4-10mal haher als derjenige an 2,4-D war. Wahrendder 2. Passage ging keiner der auf den 81 Medien eingesetzten 2025 Kalli zu Dif-

Fig. 5: Calli originated from isolated protoplasts during the 3. passage (differentiation inducing culture medium) on Nagata-Takebe culture medium with 0,1 mg .1-1 6-BA and withoutauxins. Shoots develop (callus in the middle, teratomic shoots at the other calli, which normalize during further culture), the formation of roots is reduced.

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ferenzierungen tiber. DaB die betreffenden Gewebe ihre morphogenetischen Potenzennicht etwa verloren hatten, demonstrieren die Versuchsergebnisse auf Differenzie-rungsmedien (s. unten).

Die Untersuchungen zum Wachstum von Protoplastenkallus auf 2,4-D-haltigenMedien brachten also als wichtigste Ergebnisse: Kalluswachstum findet sich inner-

NAA 0

6-BAa a

0,05

0,10

0,25

0,so

1,0

2,0

0,05

a

0,10 0,25

a

O,S)

a

1,0

a

2,0 [mgJY

8,0

fngILJa a a

Fig. 6: Differentiation of roots and shoots after 4 weeks of culture on media of the 3. passage (differentiation inducing media). The total number of calli on each of the differentmedia was taken as 100 0/0. The area of each single square represents these 100 0/0;hatched areas within the squares represent calli with roots given in 0/0; likewise black areasrepresent calli with shoots (including buds and teratomic shoots, which normalize if culturedJurther); 0 represents culture media on which no callus showed organogenesis at the timeof evaluation; - represents media which have not been tested. A single column covers 1/5of the base of the squares. By this way maximum height of the column represents 20 % ofthe total area of the square and so 20 % of the total number of calli.



halb eines weiten Konzentrationsbereiches von 2,4-D. Optimal sowohl hinsichtlich derZuwachsrate als auch der lockeren Wuchsform der Kalli sind die 2,4-D-Konzentrationen von 0,1 und ahnlich von 0,25 mgjl. 6-BA ist fiir dieses optimale Kalluswachstumnicht notwendig. 2,4-D kann die Bildung von Sprossen und Wurzeln auch in Anwesenheit von 6-BA unterdrticken.

NAA a 0,05 0,10 0,25 O,SO 1,0 2,0 ~/q

6-BAo 0

0,05'

0,10

0,25

1,0

2,0

8,0

[rrg/L]

Fig. 7: Differentiation of roots and shoots on callus originated from protoplasts after 8 weeksof culture on a culture medium of the 3. passage (differentiation inducing media). For furtherexplanation see fig. 6).

II. Dijjerenzierungen auf 2,4-D-jreien Medien

1. Auxinfreie Medien

Abb. 6 und 7, jeweils die Kolumnen ganz links, orientieren tiber Differenzierungennach 4 bzw. 8 Wochen Kultur auf auxinfreien (weder 2,4-D noch NAA), aber cyto-



kininhaltigen Medien. Gehen wir nur auf Abb. 7 ein. Bei der geringsten getestetenKonzentration an 6-BA (0,05 mgjl) werden nur Wurzeln gebildet. Schon bei dernachsthoheren Konzentration von 0,1 mgjl wird die Wurzelregeneration stark reduziert. Dafiir kommt es zur SproBbildung (Abb. 5). Mit steigender Konzentration an6-BA kommt es zur volligen Blockierung der Wurzelbildung und bei 0,25 mgjl 6-BAzu einem Maximum der SproBdifferenzierung. Bei noch hoheren Konzentrationen an6-BA wird die Zahl der sproBbildenden Kalli wieder geringer.

Die Kalli waren auf differenzierungshemmenden Medien mit nur geringem 2,4-D-Gehaltvorkultiviert worden. 2,4-D und 6-BA verhielten sich in diesen Medien wie 1 : 1. Beniitztwurden folgende Hormonkonzentrationen: 0,05/0,05 und 0,1/0,1. Der Unterschied zwischenden beiden Medien kam bei der weiteren Subkultur nicht zur Auswirkung. Es ist deshalbauch wenig wahrscheinlich, daB aus diesen Vorausmedien aufgenommene Spuren an 2,4-D nachlangerer Subkultur auf 2,4-D-freien Medien noch faBbare Wirkungen ausiiben.

Eine Erklarung dafiir, daB Kallus auch auf auxinfreien Medien in Anwesenheitvo 6-BA zu wachsen vermag, bietet moglicherweise der Befund, daB verschiedeneCytokinine in Tabakkallus die Synthese von Auxinen, darunter IES, zu induzierenvermogen (SYONO und FURUYA, 1972).

Fig. 8: Callus originated from isolated protoplasts after 4 weeks of culture on a culturemedium of the 3. passage (differentiation inducing media): Nagata-Takebe culture mediumwith 0,1 mg·I-1 NAA and without 6-BA. This culture medium leads to an optimal differentiation and growth of roots.

z. PJlanzenphysiol. Ed. 69. S. 423-437. 1973.


2. NAA-haltige Medien

Seit den klassischen Untersuchungen der Arbeitsgruppe um SKOOG an Tabakkallus

(z. B. SKOOG und TSUI, 1948, SKOOG and MILLER, 1957) wurde an einer Reihe weitererArten bestatigt, daB das Auftreten und die Qualitat von Differenzierungen (Sprosseoder Wurzeln) von der Konzentration und dem Verhaltnis von Cytokininen undAuxinen im Medium abhangt (Lit. BUTENKO, 1968). Unsere Befunde an Petunialassen sich in diesen generellen Rahmen einordnen. 1m Folgenden seien deshalb nur diewichtigsten Daten mitgeteilt. Die Versuchsansatze wurden nach 4, 6 und 8 WochenKultur auf Differenzierungsmedien ausgewertet. Die Auswertungen nach 6 Wochenzeigten lediglich die erwarteten Obergange zwischen 4 und 8 Wochen Kulturdauer.Auf ihre Darstellung sei deshalb verzichtet. Ober die Differenzierungen nach 4 und8 Wochen orientieren die Abbildungen 6 und 7.

a) Wurzelbildung

Die Induktion der Wurzelbildung geht der Induktion der SproBbildung voraus.Innerhalb der ersten 4 Kulturwochen auf Differenzierungsmedien werden fast aIleWurzeln ausgebildet. Die Zahl der wurzelbildenden Kalli steigt nach der 4. Wochenur noch geringfugig an. Auch auf den NAA-haltigen Medien wachsen die meistenWurzeln negativ geotrop.

Wurzelbildung fand sich schon in Medien ohne Cytokininzusatz. Mit steigendenCytokiningaben wird die Wurzelbildung zunachst gefordert, hohe Cytokiningabenwirken wiederum hemmend. Entsprechende Befunde wurden schon von SKOOG undMILLER (1957) an Tabakkallus gemacht. Ebenso wie dort ist nicht die Absolutmengean Cytokinin fur die Qualitat der Differenzierung entscheidend, sondern das Verhaltnis Cytokinin/Auxin, im vorliegenden Fall das Verhaltnis 6-BA/NAA. Wenn dieseRelation kleiner als 0,25 ist, bilden die Petunienkalli mehr als 20 0/0 Wurzeln. Steigtder Anteil an 6-BA, so wachsen die Petunienkalli zunachst weitgehend undifferenziert, um bei weiter steigenden 6-BA-Konzentrationen zunehmend Sprosse und Blatterauszubilden.

Als das beste Medium fur Wurzelbildung und -wachstum erwies sich 0/0,1. Nurin diesem Medium wuchsen die Wurzeln wahrend der 8 Wochen andauernden Kulturzeit kontinuierlich und wurden dabei langer als 2 cm (Abb. 8). AIle anderen Medienohne 6-BA liefern zwar ebenfalls mehr Kalli mit Wurzeln als die entsprechendenMedien mit 6-BA. In diesen Fallen, vor allem bei einem NAA-Gehalt von 1,0 und 2,0mg/l, degenerieren die Wurzeln jedoch weitgehend.

b) SproBbildung

Wahrend die Induktion von Wurzeln wie eben erwahnt nach 4 Wochen Kulturauf Differenzierungsmedien weitgehend beendet ist, nimmt die Zahl der sproBbildenden Kalli zwischen der 4. und 8. Woche noch erheblich zu. Zur Induktion vonSprossen wurde also mehr Zeit benotigt als zu derjenigen von Wurzeln.



Dem Auftreten von Sprossen geht in der Regel eine gesteigerte Chlorophyllsyntheseim Kallus voraus. Die betreffenden Kalli sind fast immer dunkelgriin. Wie schonBINDING (1971) beobachtete, ist mit der dunkelgriinen Farbung ein dichterer ZusammenschluB der Zellen verbunden. Er laBt sich an der durch die dichtgepackten,abgeflachten Zellen glatterscheinenden Kallusoberflache gut erkennen.

Bei Daucus werden im Protoplastenkallus Embryoide ausdifferenziert (GRAMBOW et aI.,1972; KAMEYA and UCHIMIYA, 1972). Wir konnten Embryoide ebensowenig wie BINDING(1971) in seinen Versuchen an Internodienkallus fassen. Vielfach beobachtete dichtere Aggregationen dtirften nichts mit Embryoiden zu tun haben. Jedoch kann auch bei Petunien die Differenzierung tiber Embryoide verlaufen, wie RAO et ai. (1973) in Untersuchungen an Internodienkallus belegen konnten, unerwarteterweise sogar in Gegenwart der dedifferenzierenden2,4-D. Versuche, auch in Protoplastenkallus die Bildung von Embryoiden zu induzieren, sindeingeleitet.

Wie zu erwarten, differenziert Protoplastenkallus aus Petunia vor allem dannSprosse aus, wenn die Konzentration an Cytokinin gleich hoch oder hoher als dieKonzentration an Auxin ist (Konzentrationen in mg/l). Die optimale 6-BA-Mengehangt also von der Konzentration an NAA abo Sehr hohe 6-BA-Konzentrationen(8 mg/ml) hemmen die SproBbildung (Abb. 9).

Die genannten Befunde wurden bereits insofern praktisch ausgewertet, als sie dieAufzucht ganzer Petunien aus Protoplastenkallus ermoglichten. Dabei erwies es sichals vorteilhaft, in den Protoplastenkalli zunachst eine SproBbildung auf TakebeMedien (NAGATA and TAKEBE, 1971) zu induzieren, die 0,5 bis 2,0 mg/l NAA zusammen mit 0,2 bis 0,5 mg/l 6-BA enthielten. Die so erhaltenen Sprosse wurden zurWurzelinduktion auf Takebe-Medium, enthalten 0,1 mg/l NAA und kein 6-BA,iiberfiihrt. Derzeit sind mehr als 500 Petunien auf diese Weise aus Protoplastenaufgezogen worden. Ein Teil von ihnen hat bereits normalwachsende Nachkommengeliefert (DURAND et aI., 1973). Da die Protoplasten bzw. Protoplastenkalli vorclem Einbringen in das Differenzierungsmedium zunachst in einem 2,4-D-haltigen Me-

Fig. 9: Calli originated from isolated protoplasts after 8 weeks of culture on a culture mediumof the 3. passage (differentiation inducing media). The concentrations of the phytohormonesare the following (from the left to the right): 1 mg .1-1 6-BA and 1 mg .1-1 NAA; 2 mg .1"-1

6-BA and 2 mg·1-1 NA.A.; 8 mg·l-t 6-BA and 2 mg·l-t NAA. High concentrations of 6-BA(8 mg .1-1) inhibit differentiation of shoots.



dium (DURAND et aI., 1973) kultiviert worden waren, erwies sich ein Teil dieserPflanzen wie zu erwarten als tetraploid. Nach dem bisherigen Stand der karyologischen Uberpriifung diirfte aber ungefahr die Halfte der aus Protoplasten aufgezogenenPetunien diploid seine

Die hier geschilderten Untersuchungen zeigten, daB isolierte Protoplasten vonPetunia hybrida nicht nur zu kompletten Pflanzen aufgezogen werden konnen, sondern daB die aus ihnen entstandenen Kalli auch giinstige Voraussetzungen zum Studium morphogenetischer Prozesse bieten.

Frau B. PFROMMER danken wir fur unermudliche technische Assistenz, Herrn GartenmeisterG. BLAICH fur die Betreuung der Pflanzen. Die Untersuchungen erfolgten mit Unterstutzungdes Bundesministers fur Bildung und Wissenschaft.

Literatur

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Translations, Jerusalem 1968.DURAND, J., I. POTRYKUS et G. DONN: Z. PflanzenphysioL 69, 26 (1973).GRAMBOW, H. J., K. N. KAO, R. A. MILLER and O. L. GAMBORG: Planta (Berl.) 103, 348

(1972).HAVRANEK, P., and F. J. NOVAK: Z. PflanzenphysioL 68, 308 (1972).HESS, D.: Planta (BerL) 59, 567 (1963).- Naturwissenschaften 59, 348 (1972).HESS, D., und I. POTRYKUS: Naturwissenschaften 59, 273 (1972).KAMEYA, T., and H. UCHIMIYA: Planta (BerI.) 103, 356 (1972).MURASHIGE, T., and F. SKOOG: PhysioL Plantarum 15, 473 (1962).NAGATA, T., and I. TAKEBE: Planta (Berl.) 99, 12 (1971).NITSCH, J. P., and K. OHYAMA: C. R. Acad. Sci. Paris 273, 801 (1971).POTRYKUS, I., and J. DURAND: Nature New Biology 237, 286 (1972).

RAO, P. S., W. HANDRO and H. HARADA: Z. PflanzenphysioL 69,87 (1973).SKOOG, F., and C. TSUI: Amer. ]. Bot. 35, 782 (1948).SKOOG, F., and C. O. MILLER: Symp. Soc. expo BioI. 11,118 (1957).SYONO, K., and T. FURUYA: Plant and Cell Physiol. 13, 843 (1972).VASIL, J. K., and A. C. HILDEBRANDT: Amer. ]. Bot. 53, 869 (1966).

G. DONN, D. HESS und I. POTRYKUS, Lehrstuhl fur Botanische Entwicklungsphysiologie derUniversidit Hohenheim, D-7 Stuttgart-70 (Hohenheim), Emil-Wolff-Str. 25.


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Wachstum und Differenzierung in aus isolierten Protoplasten von Petunia hybrida entstandenem Kallus