Wirkung der Amylasen auf einige Starkeabbauprodukte VOn

Karl Myrback und Beail Grtenblad (Aus dem Biochemischen Institut, Stockholm.)

Der Starkeabbau durch die Amylasen ist im Vergleich zum Ah- bau vieler anderer zusammengesetzter Kohlehydrate sehr kompliziert. Wahrend bei anderen der Abbau bis zu h e r von der Konzentration der reagierenden Stoffe bestimmten Gleichgewichtslage, bzw. oft prak- tisch bis zur Vollstandigkeit verlauft, bleibt der Starkeabbau, meistens, wtenn nicht immer, bei Endzustanden stehen, die kehe Gleichgewichte sind und auch nicht etwa durch Inaktivierung des Enzyms bedingt sind. Untersucht man das Reaktionsgemisch, SD findet man neben dem Hauptprodukt, der Maltose, andere Kohlehydrate von hoherem Molekulargewicht bzw. niedrigerer Reduktion, die s. g. Grenzdextrine. (Uber Eigenschaften diescr Stoffe sowie Hypothesen uber die Ur- sachen zu ihrer Bildung siehe I , 2, 3, 4, 5, 6. ) Wichtig ist die Frage, ob diese Grenzdextrine wirklich von den Enzymen gar nicht angegrif- fen, oder ob sie vielleicht immer ganz langsam weiter gespalten wer- den. Nicht nur fur die Auffassung uber die Natur der Grenzdextrine, sondern auch fur das Verstehen der Wirkungsweise der Amylasen ist dies von groDer Bedeutung. Einige Versuche hieriiber sollen hier beschrieben weden, wo auch gleichzeitig einige andere Abbauprodukte der Starke untersucht wurden.

Um die Wirkungsweise eines Enzyms zu klaren, ist bekanntlich oft versucht worden, die naturlichen Substrate des Enzyms durch einfache, chemisch wohldefinierte, wenn moglich, synthetisch gewon- nene Substrate, zu ersetzen. Im Falle der Starke ist dies nur in stark beschranktem Umfange moglich. Man kennt ja eigentlich keine an- deren Substrate der Amylasen als Starke bzw. Glykogen, und zwar sind auch gewisse Spaltprodukte der Starke spaltbar, aber uber die Natur dieser Spaltprodukte sind wir ebenso wenig im klaren wie uber die Starke. Immerhin bietet die Anwendung niedrigmolekularer Sub- strate gewisse Vorteile.

I Der Redaktion am 9. Juni 1938 zugegangen.

WIRKUNG DER AWYLASEN AUF EINIGE STARKEABBAUPRODUKTE 335

Reduktion yo der Glucose

A. Spaltung einiger Grenzdextrine. Die Deutung der Versuche ist insofern schwierig, als man bei

den anzuwendenden sehr langen Versuchszeiten damit rechnen muB, da8 die wahrscheinlich als Primarprodukt entstehende Maltose auch bei der Anwendung sehr maltasearmer Amylaselosungen teilweise oder ganz in Glucose zerfallt. Deshalb wurden immer Parallelversuche rnit Maltose ausgefuhrt. Dabei weiO man jedoch nicht richtig, wie man die Maltosekonzentration wahlen soll. Hier wurde gleichviel Maltosc wie Starke genommen. Versuche wurden sowohl rnit Malz- amylase wie rnit Takadiastase (Parke k Davis) ausgefiihrt. Im Falle dcr Takadiastase kann, wie besondere Versuche zeigten, angenommen werden, daI3 die eventuell entstehende Maltose ganz in Glucose zer- fallt, so daB die Reduktionszahlen direkt in Glucose umgerechnet werden konnen.

Bsei der Darstellung der Grenzdextrine wird Starke rnit Amylase verzuckert, bis die Reduktionswirkung der Mischung nicht weiter zu- nimmt ( 2 , 3 ) . Maltose bzw. Glucose werden durch Garung beseitigt, und die Dextrine dann durch Fallung rnit Alkohol in eine -4nzahl von Fraktionen zerlegt. In samtlichen von uns untersuchten Fallen konn- ten wir immer die Grenzdextrine in viele Fraktionen von oft stark wechselndeni Molekulargewicht zerlegen. Dies ist ja auch ohne wei- teres zu erwarten, da die einzelnen Dextrine aus verschiedenen Ur- sachen gebildet werd,en, einige sicher, weil Phosphorsaure in der Starke vorkommt, andere vielleicht, weil neben den a- I -4-Glucosid- bindungen auch andere Bindungen in der Starke vorhanden sind. Es kann also sogar sehr wohl. sein, daO Dextrine rnit demselben Mole- kulargewicht nicht dieselbe Konstitution haben. DaO die einzelnen Dextrinfraktionen eine stark wechselnde Spaltbarkeit zeigen sollen, ist anzunehmen. Als Beispiel fuhren wir einige Versuche an, die rnit Grenzdextrinfraktionen ausgefuhrt wurden, die nach Einwirkung von Malzamylase auf Kartoffelstarke isoliert waren. In Tabelle I Uber- sicht uber die Dextrinfraktionen:

Mo1.-Gewicht aus der

Reduktion

I I1

I11 IV V

VI VII

VIII

Tabelle I I

0,23 or43 1,96 0.58 0,20

on53 0,08 1,99

7.14 13.4 17.4 18.7 21,o

3499 -

2520 I340 1030 960 860

5'5 -

Mo1.-Gewicht lurch Diffusion

bestimmt

336 KARL MYRBACK UND BERTIL ORTEXBLAD

25

124 89

189 224 242 256 267

-

Die Fraktionen 111, IV, VI und VIII wurden nun auf Spaltbarkcit untersucht. 0,s g Substrat in 50 ccm 0,03 Mol. Phosphat von pH = 5,3. Reduktion nach Wi l l s t a t t e r -Schude l bestimmt: Tabelle 3.

I5 59 90

I33 152 160 I77 186

I 2 2

- Zeit

I 7 I 0 2

167 189 220

266 270

135

234

Tabelle 2

RZalzamylase I Takadiastase

I 1 86

141 160 188

224 229

I12

202

r'ersuch I Versuch z Versuch 3 Versuch 4 Versuch 5 Versuch 6 Verbuch 7 Versuch 8 prakt. 111 I Frakt. 1V I Frakt.VI lFrakt.VII1~ Frakt. 111 I Frakt. 1V I Frakt. V1 (Frakt.VII1

mg Maltose I mg Glucose

2 20

47 85

I39 I54 169 161

I10

0

I 0

39 55 67 77 87 9 6

I00

23 38 59 82 91

1 0 2 I 1 1

1 I4 I I 9

s 20

25 44

52 57 52 54

(34)

Nehmen wir an, daD nur Maltose bzw. Glucose entstanden sind, so findlen wir die prozentischen Spaltungen

Versuch I 2 3 4 5 6 7 8 Oio Spaltung 3 1 4 9,s 22,6 11,6 53,s 45,3 51,s 3 7 3

Die Amylase war in den Versuchsmischungen noch nach 64 Tagen wirksam. Bei beiden Amylasen finden wir, daD die Fraktion I11 mit dem hochsten Molekulargewicht am starksten gespalten worden ist, die niedrigstmolekulare Fraktion VII I am wenigsten. Die Fraktion V I ist in beiden Fallen starker gespalten, als die &was hohermole- kulare Fraktion IV, was die oben gemachte Aussage illustnert, daD wir wahrscheinlich nicht nur mit Unterschieden im Molekulargewicht, sondern auch mit Unterschieden in der Konstitution zu rechnen haben. Durchgehend sind die Spaltungen durch Malzamylase vie1 geringer, als die durch Takaamylase, was ja auch ohne weiteres vcrstandlich ist, da die Dextrine von vornherein mit Malzamylase behandelt waren. Da das Takadiastasepraparat sonst Starke weniger weit abbaut als Malzamylase, so ist zu schlieDen, daD in der Starke Bindungsarten vorkommen, die durch Takadiastase bzw. ein darin vorhandenes spe- zielles Enzym leichter angegriffen werden, als durch Malzamylase, wahrend bei anderen Bindungsarten das Umgekehrte der Fall ist.

Zu den in der Tabelle 2 angefuhrten Zahlen ist zu bemerken, daD man natiirlichenveise nicht ohne weiteres annehmen kann, daD die entstandenen reduzierenden Reaktionsprodukte Maltose bzw. Glucose sind. Man konnte sich z. B. vorstellen, daD ein Hexasaccharid in zwei

W~IRKUNG DER AMYLASEN AUF EINIGE STARKEABBAUPRODUKTE 337

Zeit

I Minute 2 Minuten I5 ,. 25 ,,

48 9 ,

96 ,,

25 Stunden

Trisaccharide (4 ) zerfallt. Wir haben aber mit den (von Toluol be- freiten) Versuchslosungen Garversuche angestellt, durch welche ge- zeigt werden konnte, daD die Reaktionsprodukte wirklich garfahige Zucker sind. Bei der sehr langsamen nSachverzuckerungcc der Starke- dextrine entstehen also die normalen Reaktionsprodukte der Amylasen. Daneben bleiben noch neue Grenzdextrine zuriick, deren Eigenschaf- ten bestimmt werden sollen. Oh aus Dextrinen durch die Wirkung besonderer Enzyme Glucose direkt abgespalten werden kann, sei einst- weilen dahingestellt.

Weiter sei hier ein Versuch mit einem mehrmals fraktionierten Dextrir, angefuhrt. Das Praparat ist unter der Bezeichnung MT IX: I o in der Arbeit (6) beschrieben. Es war mit Takadiastase aus Maisstarke gewonnen und kann als ein fast cinheitliches Tetra- saccharid betrachtet werden. Ein gereinigtes und sehr stark aktives Malzamylasepraparat wurde angewendet. Parallelversuche mit Starke und Maltose.

Tabelle 3

Losliche Starke

I 7.8 37>0 58.0 61,4

75.8 68,8

-

yo Spaltung Maltose IGrenzdextrin (korr.)

0.0 0.0 0.0 0 8 0

0.0 -

ca. 3

Wenn wir das Grenzdextrin nicht als vollkommen unspaltbar betrach- ten wollen, so geht jedenfalls hervor, daD das angewandte Amylase- praparat die Starke etwa 40ooomal schneller spaltet als das Tetra- saccharid. Solltfe die gelaufige Auffassung vom Bau der Starke rich- tig =in, so ware anzunehrnen, daD das Tetrasaccharid eine einfache Kette von vier Glucosemolekiilen enthalten sollte, worin alle drei Glucosidbindungen dieselben sein sollten, wie die in der Maltose. Man fragt sich, warum ein so gebauter Korper nicht von der Amylase in zwei Maltosemolekule zerlegt wird ? Eine mogliche Erklarung ware die folgende (siehe auch 3) : Die Amylasen (es ist hier an die P-amy- lase zu denken) spalten nur aus langeren Ketten Maltose ab. Wenn die Ketten dadurch eine gewisse Minimilange erreicht haben, so hort die Enzymwirkung auf, weil das Enzym zu den kurzen Reststucken keine Affinitat mehr hat, vielleicht wegen der zu groDen Annaherung der reduzierenden Gruppe an die zu spaltende Bindung. Die Verhiiltnisse

Skandinav. Archiv. 80. 22

338 KARL MYRBACK UND BERTIL ORTENBLAD

konnten gewissermaBen mit dcnen bei den Polypeptidasen verglichen werden. Die Ursachen zu der Grenzdextrinbildung waren iiberhaupt darin zu suchen, daD die Amylasen Ketten unter einer gewissen Lange nicht angr'eifen. Es scheint uns aber, als konnte diese einfache ,Erkla- rung nicht richtig sein. Unter allen Umstanden kann sie nicht allein di,e Grenzdextrinbildung erklaren. Man sollte u. a. erwarten, daB die Grenzdextrine immer dieselbe MolekiilgroDe haben sollten, was aber gar nicht der Fall ist. Wir fuhlen uns gezwungen, anzunehmen, daD z. B. das oben erwahnte Tetrasaccharid nicht einfach nach dem Mal- towschema gebaut sein kann, sondern, daB darin mindestens eine Bindung anders ist als in der Maltose.

Abgesehen davon ist aber zu erklaren, warum man unter Umstan- den beinahe oder ganz unspaltbare Dextrine in betrachtlicher Menge isolieren kann, wahrend in anderen Fallen, nach Angabe mehrerer Forscher, ein vollstandiger Abbau nativer Starke zur Maltose beobach- tet werden kann. Allgemeiner ausgedriickt: Warum variiert die s. g. Verzuckerungsgrenze von Enzympraparat zu Enzympraparat ? Wir sind geneigt, folgende Erklarung anzunehmen : Die naturlichen Amy- lasepraparate enthalten als Hauptbestandteiil gewohnliche Amylasen (a - oder p-Amylasen oder Mischungen von beiden), die diejenigen Teile der Starke zu Maltose abbauen, die nach Art der Maltose gebaut sind, d. h. nach der Starkeformel von Haworth. Die Praparate ent- halten aber daneben in wechselnden, aber meist sehr kleinen Mengen, spezielle Enzyme, die auch die anders gebauten Teile der Starkemole- kiile anzugreifen vermogen. Bei Reinigung von fhylasepraparaten konnen Verschiebungen zwischcn den Mengen der einzelnen Enzyme eintreten, so daB sich bei der Reinigung des Enzyms die Verzucke- rungsgrenze Gerschieben kann. Es ist z. B. nicht unmoglich, daO die Stabilitat des oben envahnten Tetrasaccharids (Tabelle 3) darauf zuriickzufuhren ist, daD die speziellen, dextrinspaltenden Enzyme aus dem Amylasepraparat entfernt worden sind.

B. Durch Saurehydrolyse gewonnen,e Starkeabbauprodukte. Kaxtoffelstarke wurde mit dem gleichen Gewicht konzentrierter

Salzsaure 50 Stunden bei Zimmertemperatur behandelt. Die Losung wurde mit Alkohol gefallt und mehrmals umgefdlt, bis ein neutrales Produkt erhalten wurde (schlechte Ausbeute). Es zeigte im Diffu- sionsversuch ein mittleres Molekulargewicht = 800. Bei den Spal- tungsversuchen mit Amylasen trat nur eine so kleine Spaltung ein, daD die entsprechenden Werte der Parallelproben rnit Maltose groBer waren. Wir konnen dann annehmen, daI3 der entstandene reduzie- rende Zucker ganz aus Glucose besteht. Die Zunahme der Reduk-

~ Y I R K U N G DER AMYLASEN AUF EINIGE STARKEABBAUPRODUKTE 339

22 Stunden 118 ,. 190 9 .

286 ,, 17 Tage

tion in den Maltoseversuchen mu6 namlich von einer Maltasewirkung herruhren, denn die Enzymlosungen waren so lange aufbewahrt, daD darin kaum Veranderungen wahrend des Versuches haben eintreten konnen. Folgende Werte wurden bei den Spaltungsversuchen er- halten. Zu jedem Versuch 0,s g Suhstrat. Sonst wie oben.

1 . -

- - 24 64 9 21 70 I1 83 16 28 92 I8 31

22

Tabelle 4

mg Glucose Takadiastase I 8-amylase 1 Malzamylase

Spaltungszeit

In samtlichen Fallen ist die Spaltung sehr klein, wenn auch im Versuch mit Takadiastase betrachtlich g r o k r als in den anderen. Die- ses Resultat scheint uns von einiger Bedeutung. Da niimlich alle wohl darin einig sein durften, daI3 die Starke mindestens zum allergrofiten Teil aus Ketten von maltoseartig verkniipften Glucosemolekiilen be- steht, sollte man wohl annehmen, daI3 die durch Saurebehandlung gewonnenen Abbauprodukte ebenfalls zum groaten Teil aus einfachen Polymaltoseketten bestehen. Der Umstand, daD solche Produkte (nach dem obigen und mehreren anderen Versuchen mit ahnlichen Produkten) von den Amylasen nur auI3erst wenig angegriffen wer- den, muI3te dann so gedeutet werden, daD die Ketten zu kurz sind. Nach dem eingangs gesagten ware dann anzunehmen, dal3 die Grenz- dextrinbildung, wenigstens teilweise, darauf beruht, daI3 die normalen Amylasen ganz kurze Ketten nicht spalten konnen, auch wenn sie nach der Haworthschen Formel gebaut sind. Aber ganz sicher ist es sselbstverstandlich nicht, daI3 die durch Salzsaure gewonnenen Pro- dukte wirklich so gebaut sind. Erstens, wenn in der S take anders gebaute Teile vorkommen, ware es denkbar, daD sie gegen den Angriff der Saure stabiler sind, was allerdings nicht besonders wahrschein- lich erscheint. Zweitens ist es wohl nicht unmoglich, daD in der star- ken Saure irgendwelche Veranderungen eintreten, die den Angriff durch die Enzyme vqhindern. Darauf deutet.stark der Umstand, daD dw optische Drehung d q Produkte wesentlich niedriger ist, als man nach den Freudenbwgschen Regeln berechnen sollte. (Siehe z. B. F reudenberg 7.) Als Beispiel seien ehige Werte angefiihrt, die mit

Produkten derselben Art wie das oben envahnte gewonnen m d a . Diese Produkte wurden von den Enzymen ebenfalls kaum angegriffen.

22*

340 KARL MYRBACK UND BERTIL ~ R T E N B L A D , WIRKUNG DER AMYLASEN usw.

I

Molekulargewicht nach der Reduktionsbest. . Molekulargewicht nach der Diffusionsmethode 660

7 2 0

Optische Drehung (Hg-Licht) gefunden . . . 113,oO Optische Drehung berechnet . . . . . . . . >174O

Tabelle 5

635 525 640 460 114,8" 1 0 8 . 0 ~

etwa174" 164O

Lit era t 11 r

I(. MyrbBck, (I) Cwrrent Science. 1937. VI. 47. K. MyrbBck und K. Ahlborg. (2) Suensk kem. tidskr. 1937. 49. 216. K. MyrbBck, B. Ortenblad und K. Ahlborg, (3) C . R. Lab. Carlsberg. Ser.

K. MyrbBck, (4) Svensk kern. tidskr. 1938. 50. 27. K. Myrb%ck och K. Ahlborg, (5) Sv. Bryggaref. Mdnadsbl. 1938. 53. 45. K. MyrbBck, (6) ibidem 1938. 53. 93. Freudenberg, (7) Chem. Ztg. 1936. 60, 853 und 875.

Chim. 1938. 22. 357.