Wirkung von Polyen-Makrolidantibiotica auf normale und zellwandlose Zellen von Escherichia coli W1655F+

Zeitschrift fur Allg. Mikrobiologie I 15 I 8 I 1975 I 585-597

(Akademie der Wissenschaften der DDR, Forschungszentrum fiir hZolekularbiologie und Medizin, Zentralinstitnt fur &likrobiologie und experimentelle Therapie, Jena,

Direktor: Prof. Dr. med. H. KLOLL)

Wirkung von Polyen-Makrolidantibiotica auf normale und zellwandlose Zellen von Escherichia coli W 1655F+

INA HAUPT~) , EDITH SCHUHMANN, R. GEUTHER und H. THRUM

(Eingegangen am 5. 5.1975)

The polyene macrolide antibiotics are active against yeasts, fungi, and other eukaryotic cells, but are with a few exceptions inactive against bacteria. The resistance of bacteria against these compounds is usually explained by the absence of sterols in their cells, the target sites of polyene antibiotics.

However, in our experiments with mycotrienin, nystatin, tetramycin, lucensomycin, rimocidin, filipin, hgosin, flavofungin, flavomycoin, antibiotic 2814 P, antibiotic 5001 P, and candicidin it was demonstrated that bacteria may be susceptible to polyene antibiotics, too, if the wall-less stable protoplast type L-form of E. coli W1655F+ is used. The measured growth inhibition concentrations were comparable with those of typical antibacterial antibiotics.

Our experiments have shown that the normal rod form and the wall-less L-form of E. coli W1655F+ contain traces of sterols in nearly the same concent,ration range. This means that the selective sensitivity of t,he L-form cannot be explained by higher sterol content of these cells in comparison to the resistant normal rod form cells. We assume that the bacterial cell wall is res- ponsible for t,he resistance of the normal rod form by masking internal target sites.

Die antifungalen Polyenantibiotica voni Makrolidtyp reprasentieren einen Ver- bindungstyp, der durch ein GroWring-Lacton nijt einer Anzahl konjugierter Doppel- bindungen gekennzeichnet ist. Das Polyensystem kann 3-8 Doppelbindungen enthalten. Die Einteilung erfolgt deshalb priinar in die Gruppen Triene, Tetraene, Pentaene, Hexaene, Heptaene und Oktaene. Weiterhin enthalt die Mehrzahl dieser Substanzen einen Aininozucker in glykosidischer Bindung.

Fur die biologische Wirkung von Polyenantibiotica wird eine Wechselwirkung ni i t den Sterinen der cytoplasinatischen Membran sensibler Organisinen angenoiiinicn, die zu strukturellen Menibranveranderungen und damit zuin AusflieWen intrazellu- larcr Substanzen fuhrt. Polyenantibiotica heininen insbesondere Hefen, Pilze und anaere euknryotische Zellen ; sie besitzen aber bis auf wenige Ausnahmen keine anti- bakteriellen Eigenschaftcn. Die Resistenz von Bakterien gegenuber Polyenanti- biotica wird in der Literatur generell niit den1 Fehlen von Sterinen in diesen Organis- men erklart (Literaturiibersicht uber Chemie und Biologie der Polyenantibiotica bei HAMILTON-MILLER 1973, 1974).

Ini Gegensatz zu diesen Ergebnissen konnten wir erstinalig nachweisen, daW auch Bakterien von Polyenantibiotica z. T. stark gehenimt werden, wenn inan die zellwandlose L-Form von E. coli W 1655 F+ als Testorganisnius verwendet. Von 13 ge- pruften Polyenantibiotica zeigten 8 eine starke und 4 eine niaisige Wachstums- henmung. Wir konnten weiterhin nachweisen, daW sowohl die L-Form als auch die Norinalforrn Sterine in sehr niedrigen Konzentrationen enthalten. Der Steringehalt der sensiblen 1,-Forni unterscheidet sich jedoch nicht wesentlich von dern der resi-

I ) Meinem vctehrten Lehrer, Herrn Prof. Dr. K. MOTHES, zum 75. Geburtstag in Dankbarkeit gewidmet,.

586 INA HarrPT, EDITH SCHUHXANN, R. GEUTHER und H. THRUM

stenten Korlnalforin. Der Befund, dalJ die Normalform im Gegensntz zur L-Form nicht geheirllllt wird, inacht wahrscheinlich, da13 in nornlaleli E. coli-Zellcn die Zell- wand als I'enetrationsschranke fur Polyenantihiotica wirlit. Flir diese Annahnie spreelien auch unsere Untersuchungen init norinalen Zelleri von JC. coli W 1655F+, die durch Behandlung Init EEDTA gegeniiber Yolycnantihioticn sensihel gemacht werden konnten (HAUYT et cil. 1975a).

Material und i?!ethoden Substanzen: Die verwendeten Polyenantibiotica wurden von den iiachfolgend aufgefuhrten

Autoren freundlicherweisc zur Verfiignng gcst.ellt: Mycotrienin (Dr. L.CORONELLI, Lepetit, Milano, Italien), Piinari cin (Dr. HOOGLAND, Gist-Brocades,

nv research &development, Delft, Holland), Tetraniycin (DORNBEBGER et al. 1971), Lucensomycin (Dr. CASSINELLI, Farmitalia,, Milano, Italieu), Itimocidin (Doz. Dr. L. FALKOWSRI, Polytechnische Universitat, Gdansk, V B Polen). Nystatin (eigene Produkt,ion), Antibioticum 2814 P (THRUM u. DCHO 1960), Filipin (Dr. WHITFIELD, Upjolin Company, Kalamazoo. USA). Lagosin (Dr. I. P. R. HERRMANN, Glaxo Research Ltd., Greenford, England). Antibioticum 5001 P (Dr. KLEINWACHTER, ZIMET, Jena, DDR): Candicidin A 2701 (eigene Prodiiktion), Flavofungin (V. POZSCAU, Phar- nazeut,ische Werke, Debrecen, VR Ungarn). Plavomycoin (SCIILEGEL et al. 1971, SCHLEGEL 11. THRUM 1971).

Die Antibiotica wurden vor jedem Versuch frisch in Methanol gelost (2 mg/ml). Kultivierungsbedingungen und Waclistnmsniessungen der eingesetzten bakteriellen Test-

organismen : Als Testorganismen tvurden die Normalform und die zellwandlose stabile L-Form des Stamnies Escherich%n coli W 1G55 F+ eingesetzt. Zur Charakterisierung dieser Zellfornien siehe GURIPERT et nl. (1971). STRUNK u. SCJIUHMANN (1973), SCHUHMANN et al. (1974). In den Versuchen zur Messung der Waclistumshcmmung wurde Fleischbouillon (pH 7.2 ; Steringehalt 0.91 pg/ml) ohne weitere NLhrstoffzusitze vcrwendet. Parallel hierzu wiirden zusiitzlich noch Henimstoff- versuche in ciner mit Ather extrahierten Fleischbouillon mit eineni Reststeringehalt von 0,027 pg/ ml durchgefuhrt. Das Impfmaterial der Normalform und der L-Form wurde fur die Versuche 20stiindigen FliissiglieitsliiiIt.uren ent,nommen. Die L-Form-Kultur wrirde vor dem Einsatz zu den Versuchen an 3 aufeinanderfolgenden Tagen je einmal uberimpft. Alle Kulturen wurden in Steil- brustkulbchen (100 ml) mit. eineni Endvolumcn von 25 nil Flksigkeitskultur auf cinem Rnnd- schwingtisch mit 250 U!min bei 37 "C bebrutet,.

Dns Wachstum wurde durcli Estinktjonsmessungeii stundlich ent,nonimencr Proben verfolgt. Als MeDgerat diente das Spektralphotometer .,SPEXOL" vom VEB CARL ZEtSS, Jena. Geniessen wurde bei 640 nm gegen den Leerwert des Nahrmediums. Die Polyenantibiotica wurden in Me- thanol gelost,. Um eventuelle Wachstumsheniniungen durch den Methanolanteil im Medium er- fassen zu konnen nnd eine Verfalschnng der Resukate auszuschliefien, wurden entsprechende Kontrollen parallel gemessen. Die eingesetzten Antibiot,icakonzentrationen betrugen 1, 5, 10, 25 und 50 pg/ml Kulturmedium und wnrden so berechnet, da13 st,ets annahernd die gleiche Flussig- keitsnienge den Kulturen zugegeben wurde. Die Antibioticuni-Zugabe erfolgte in der frulien ex- ponentiellen Wachstamsphase der Testkiilturen.

Bestinimung des Steringehaltes: Die Normal- und L-Form von E. coli W 1655k" wnrden auf einer niit Ather extrahierten Fleischbouillon niit eincin Restskringehalt von 0,027 &nil kultiviert, in der logarithmisclien Wachstumsphase abzentrifugiert und das separierte Zellniaterial gefrierget,roclmet. Die getrockneten Zellen wurden in Anlehnung an ein Aufbereitungsschema von SCHUBERT ct.a.1. (1968) weiterverarbeitet. Jeweils 1,3g der Zelltrockenmasse worden niit 6ml Wasser aufgenommen, mit 40 nil 5yoiger KOH in Methanol versetzt. und 1 St,d. tinter Stickstoff am Ruck- flu13 verseift. Das Methanol wurde anscliliefiend durch Dest,illation ent.fernt, die verbleibende alkalische Losung 3mal mit Ather extrahiert, danach neotralisiert und noch 2mal mit Ather extrahicrt,. Die vereinigten atherischm Extrakte wirdcn mit Wasser gewsschen, uber Natrium- sulfat getrocknet und das Losringsmittel abdcstilliert. Der Ruckstand wurde uuter Anwendung der Gradientenelution an Aluniiniumoxid (MERCK, nach RROCKMANN) chromatographiert. Die Elution erfolgte mit eineni Benzol-Hexan-Gradienten (von O-lOO~o Benzol) danach mit eineni Gradienten von 0-2 74 Methanol in Benzol. Die Sterine der sauIenchromat,ographisch getrennten Fraktionen wurden gaschroniat,ographisch identifiziert und qiiantit.ativ bestimmt. Die Gas- chromatographie wurde unt.er den folgendcn Bedingungen darchgefuhrt: Gaschromatograph Varian 2740; Glassaule; spiralformig, 2,5 ni >: 3 nim (ID); 2 % XE 60 auf GaschromQ (80 bis 100 mesh) ; F'lamnienionisationsdetektor; Tragergas Argon ; Saulenvordriick 3 atii ; Saulentem- peratur 200 "C, Injrktor 235 "C. Detektor 235 "C.

Bestimmung des Phospholipidphosphat-Gehaltes: E i n aliquoter Teil des lyophilisierten Zell- materials wurde 3 ma1 mit einem Chloroform-Methanol-Gemisch (2 : 1 ) extrahiert. Die vereinigtel

W‘irlrung von Polyen-Makrolidantibiotica 587

6 3 1 12 8 3 17 14 10 4 2 0

10 5 2 14 10 8 10 7 3 12 8 4 8 4 2 7 4 1 2 0 0

13 10 7 1 12 10 8

organischen Phasen wurden im Vakuumrotationsverdampfer zur Trockne gebracht. Die Phosphat- bestimmung im mit Perchlorsaure-Schwefelsauregemisch (1 : 1) veraschten Riickstand erfolgte nach einer von GERLACH u. DEUTICKE (1963) angegebenen Methode.

Messung der Wechselwirkung voii Polyenanti biot,ica mit Cholesterin : Die Wechselwirkung von Polyenantibiotica mit Cholesterin wurde spektrophotometrisch nach NORMAN et a2. (197213) gemessen. Die Polyenantibiotica wurden 15 min vor Versuchsbeginn in Dimethylformamid (Antibiotica-Konzentration 5 x M). Cliolesterin in Methanol (4 mg/ml) gelost. Fur die Messung der Aiitibiotica-Spektren wurden 10 p1 der Antibiotica-Losung und 25 pl Methanol zu 10 ml Tris-Acehtpuffer (10 mix, p H 7) gegeben. Fur die Messung der Interaktion mit Cholesterin wurden in einem Parallelansatz an Stelle von Methanol 25 p1 der Cholesterinlosung unter Schutteln zngegeben. Die Endkonzentrationen betrugen: Cholesterin 2,G x M, Antibiotica 5 x 10-5 M. Die Losungen mit und ohne Cholesterin wurden 30 min verschlossen im Dunkeln aufbewafirt und danach mit dem registrierenden 2-Stralil-Photometer SPECOR’D UVjVIS (VEB CARL ZEISS, Jena) vermessen. Die Schichtdicke betrug 5 cm.

Tabelle 1 Biologische Wirkung von ausgewahlten Polyenantibiotica (Agardiffusionstest)

Antibioticum

iKycotrienin Pimaricin Lucensomycin Tetram ycin Rimocidin Kystatin Filipin Lagosin Antibiot,icum 2814 P Flavomycoin PIavof ungin Antibioticum 5001 P Candicidin (A 2701)

Polyen-Gruppe

Trien Tetraen Tetraen Tetraen Tetraen Tet,raen Pentmaen Pentaen Pent ae n Pentaen Pentaen Hexaen Heptaen

I Testorganismen S. cerevisiae

Antibioticum I*g/ml 10

50 25

R. subtilis Bntibioticum

50 fG/ml

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0

E. coli Antibioticum

50 Crg/ml

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Anmerkung : Angabe der Hemmwirkung als Differenz zwischen Durchmesser von Hemnizone und Stanzloch in mm.

Ergebnisse B i o 1 o g i s c he W ir k u n g d e r a u s g e w a h 1 t e n P o l y e n a n t i b i o t i c a

Tabelle 1 cnthalt eine Aufstellung uber die in unseren Untersuchungen verwendeten Polyenantibiotica und ihre biologische Wirkung auf Saccharomyces cerevisiae, Bucillzts subtilis und E. coli. Die aufgefiihrten Antibiotica gehoren alle zur Uruppe der Makrolid-Polyenantibiotica. Wie atis Tabelle 1 hervorgeht, wird X. cerevisiue von allen getesteten Polyenantibiotica gehemint. Ini Gegensatz hierzu werden U . subtilis und E. coli von Polyenantibiotica nicht beeinfluot. Eine Ausnahnie hildet nur das Hexaenantibioticum 5001 P, welches aufler S. cerevisiae noch B. subtilis, nicht aber E. coli hemmt.

W a c h s t u n i s v e r l a u f d e r N o r m a l - u n d 1,-Form von E. coli W1655 F+ u n t e r d e m E i n f l u f i v o n P o l y e n a n t i b i o t i c a

E . coli wird sowohl im Agardiffusionstest als auch in Schiittelkulturen von den untcrsuchten l’olycnadtibiotica nicht gehetuint. Ebensowenig gelingt es, die Bakterien durch Zugabe von Cholesterin zuni NBhnnediuin ZLI sensibilisieren. Die Restiinmung

588 INA HAUPT, EDITH SCHUHMANN, R. GEUTHER nnd H. THRUM

der Antibiotica-Konzentration ini finlturniedium nach deni Versiich zeigte, daS die Resistenz dieser Bakterien nicht auf cinen Ahbau der Polyenantihiotica zuriick- gefiihrt werden kann. Bakterien konnen jedoch geheinriit werden, wenn inan z. B. die zellwandlose 1,-Forni, in diesern Fall von E. coli W 1655 F+, verwendet (Abb. 1-12). I n Abbildung 1 wird atn Beispiel von Plavoiiiycoin gezeigt, dalJ die L-Form hei 5 pg/nil partiell und hei 10 pg/inl sclion total itn Wachstuin gehemmt wird, wahrend linter den gleichen Wachstunishedingnngen (Anzucht auf Fleisclibouillon niit einem Steringehalt von 0,lO pg/tiil) die entsprechende Noriiialfortii his zu einer Hetnm- stoffkonzentration von 50 pg/ml iiherhaupt niclit beeinflufit wird. Da aucli alle iibrigen Polyenantihiotica unter den genannten Bedingungen die Norinalforin niclit heniinen, wurde auf eitie wiederliolte Darstellung der Wachstuinskurven der Normal- forin in Gegenwart der anderen Antihiotica verziclitet.

Wie ails den Ahbildungen 1 - 12 ersichtlich ist, heinmen die eingesetzten Polyen- antihiotica das iIraclistutri der L-Foriii unterschiedlich stark. Die niininiale Hetnm- stoffkonzentration liegt in der Mehrznhl der Falle zwisclien 1 und 10 pg/nil und daniit in der Griiflenordnnng bekannter antihakteriell wirksanier Antihiotica.

I n ihrer Wirkung auf die zellwandlose L-Form lassen sich die gepriiften Polyen- antihiotica in 3 Gruppen nnterteilen. Zur 1. Gruppe der stark wirlisainen Yolyen- antibiotic8 gehiiren Mycotrienin, Riinocidin, T,ucensomycin, Antihioticiiiii 281 4 l', Flavofungin, Flavoniycoin, Antihiotieuni 5001 I' und Candicidin. Diese Antibiotica beeinflussen das Wachstuni der L-Forni schon in niedrigen Konzentrationen und zeigen hci 50 pg/tnl eine Heniiniing von rnindestens 80 %. Innerhalb dieser Gruppe henitiien Mycotrienin, Flavofungin, Flavoinycoin iind das Antibioticuin 5001 Y das Wachstuni der L-Form am starksten. Bei den letztgenannten Antibiotica tr i t t

71

9

.'

4 s$

8

7

fluvomycoin

4

8 Q

6

/

D

b)

flavomycoifi

1 2 3 4 5 6 7 8 fihi

Abb. 1. Wirkung von Flavomycoin aiif norinale Zellen (a) und anf zellwandlose L-Form-Zellen (b) von E . eol,i W 1G55Ft. K = Kontrolle, D = Zeitpunkt der Zugabp tles Antibiot,icums. Die Zahlen

geben die Konzentration des Antibioticunis in pg/ml a n

Wirlrung yon Polyen-Makrolidantibiotica 589

4 L " ' 1 1 ' " 1 1 7 3 4 5 6 7 8

lhl

Abb. 2. Flavofungin

x i

5

70

25

1 2 3 1 5 6 7 8 f h/

Abb. 3. Antibioticurn 5001 P

r z j c 5 6 7 8 7 2 3 4 5 6 7 B t h l th,'

Abb. 4. Mycotrienin Abb. 5. Antibioticurn 2814P

Abb. 2 - 13. Wirkung verschiedener Polyenantibiotica anf zellwandlose L-Form-Zellen von E . coli W 1655F'. K = Kontrolle, D = Zeitpunkt der Zugabe des Antibioticums. Die Zahlen geben die

Konzentration des Antibioticurns in pg/ml an

40 Zeitschrlft f. Allg. Mikrobiologie, Bd. 15, H. 8

590 INA HAUPT, EDITH SCHUHMANN, R. GEUTHER und H. THRUM

7 2 3 4 5 6 7 8 t/ni

Abb. 6. Candicidin (A 2701)

6 1 2 3 4 5 6 7 8

f fhl Abb. 8. Kimocidin

6 7 2 3 4 5 6 7 8

tihi Abb. 7. Lucensomycin

I 9 t

tt

Abb. 9. Nysht in

6 7 2 3 4 5 6 7 8

f h l Abb. 11. Tetramycin

Wirkung von Polyen-Makrolidantibiotica 591

8 -

7 - I

6 1 2 3 1 5 6 7 8 1 2 3 6 5 6 7 8

/ih/ 6

f b j Abb. 12. Filipin Abb. 13. Pimaricin

schon bei einer Heniinstoffkonzentration von 10 pg/ml sofortige Lyse der Zellen ein. Zur 2. Gruppe gehoren die Polyenantibiotica Tetrainycin, Nystatin, Filipin und Lago- sin, die erst bei 25 oder 50 pg/ml eine maoige Wachstumshemrnung bewirken. Eine 3. Gruppe wird durch Piniaricin reprasentiert, welches auch bei 50 pg/ml noch keine signifikante Heminung der L-Form hervorruft (Abb. 13).

Vergleichende Hemmstoff-Untersuchungen in einer niit Ather extrahierten Fleisch- bouillon (Reststeringehalt 0,027 pg/ml) haben gezeigt, da13 durch die Erniedrigung des an sich schon geringen Steringehaltes im Nahrmedium die Heinmung der L-Form durch Polyenantibiotica nicht abnimmt, sondern durchschnittlich um 10 yo zunimmt. Die Normalform wird auch unter diesen Versuchsbedingungen nicht gehemint.

Verg le i c h e n d e U n t e r sue h u n g e n ii be r d a s S t e r i n vo r k o ninie n i n d e r N o r m a l - n n d I;-Form von E. coli W1655 F+

Wic in dein vorangegangenen Kapitel gezeigt wurde, heminen die untersuchten Polyenantibiotica nur die T,-Form, nicht aber die Normalforni von E. coli W 1655 Ff. Da die hiologische Wirkung von Polyenantibiotica allgernein auf eine Wechsel- wirkung init den Sterinen der cytoplasniatischen Membran zuruckgefiihrt wird, sollte untersucht werden, oh die L-Form im Vergleich zur Normalforin einen hoheren Steringehalt aufweist.

Voraiissetzung fur derartige Untersuchungen ist die Anzucht beider Organisinen in dein gleichen Nahrniediuni, welches nioglichst sterinfrei sein sollte. Da die L- Form nicht i n synthetischen Nahrmedien, sondern nur in Fleischbouillon wachst, versuchten wir zunachst, die Sterine a m dieser durch Extraktion niit Ather zLi ent- fernen. Es zeigte sich jedoch, da13 die Fleischbouillon auch nach 8facher Ather- extraktion noch Spuren an Cholesterin enthielt. Da eine vollstandige Extraktion auf dieseiii Wege nicht zu erreichen war, worde die Fleischbouillon vor der Ather- extraktion alkalisch verseift. Nach dieser Behandlung enthielt das Nahrniediuni zwar keine Sterine rnehr, war aber fur die Anzucht von E. coli-Zellen unbrauchhar ge- worden. Wir verwendeten deshalb fur die Kultivierung der Normal- und L-Form cine niit Ather extrahierte Fleischbouillon init einein Rest-Cholesteringehalt von 0,027 pg/ml.

I n 1,3 g Zelltrockenmasse der Nornialforin wurden nach Verseifung, Atherextrak- tion und Saulenchroinatographie gaschromatographisch 6,2 pg Cholesterin nachgewiesen (Tab. 2). Nach dem gleichen Verfahren wurden in 1,3 g Zelltrockenmasse

40*


Kulturmedium (pg Sterin/Ansatz)

der L-Form 12,5 pg Cholesterin hestininit. I n beiden Zellfornien waren an Sterinen auRer Cholesterin nnr noch Spuren von Canipesterin nachweisbar. Fur die L-Form konnten wir zeigen, da13 90 yo des nachgcwiesenen Cholesterins in der Menibranfrak- tion lokalisiert sind. Die Ergebnisse der Sterinbestirnmung sind in Tabelle 2 zu- sanimengefaflt. Als BezugsgroWen wurden sowohl die Zelltrockenrnasse als nuch der Gehalt an Phospliolipidphosphat gewahlt. Wie Tabelle 2 zeigt, betragt der Steringehalt der Nornialforni 0,000477u der Zelltrockenmasse. Der Steringehalt der L-Forin liegt zwar mit 0,0009So/o der Zelltrockeninasse uber dern der Normalforrri, aher noch in der gleichen GroIJenordnnng. Bezieht iiian jedoch den Steringehalt auf den Yhospholipid-

Steringehalt yo des ?(, der

masse lipid- ~ h o s ~ h a t pg masse

mg g Trocken- Phospho- Bakt,erien- 'y;$ho-

phosphates

Tabelle 2 Steringehalt der Normal- und L-Form von E. coli W 1655 F i

E. coli Normalform E. coli L-Form

extrahierte Bouillon 6,2 0,00047 0,046

12,5 0,00096 0.051 extrahierte Bouillon (148)

(34,O)

gehalt, so werden die Prozentwerte von Normal- und L-Form direkt vergleichbar. Nach diesen Ergebnissen konnen die Unterschiede in der Sensibilitat zwischen der Normal- und L-Form von E . coli W 1655 F+ gegenuber Polyenantibiotica nicht auf entsprechende Unterschiede im Steringehalt beider Zellforinen zuruckgefuhrt werden.

S p e k t r op h o t o me t r i s c h e Me s s u n g d e r We c h se 1 w i r k u n g v o n P o l y e n a n t i b i o t i c a mi t C h o l e s t e r i n

Biologische Versuche machen laut Literatur wahrscheinlich, daB die Wirkung von Polyenantibiotica auf einer Wechselwirkung niit Sterinen der cytoplasniatischen Menibran beruht. I n spektrophotometrischen Untersuchungen haben LAMPEN et al. (1960) und NORMAN et al. (1972a, l972b) nachgewiesen, dafJ Cholesterin in wal3riger Losung das UV-Syektrum von Polyenantibiotica charakteristisch verandert. Unter dem Einflufl von Cholesterin erfolgt eine Zunahme des Quotienten der Extinktionen der Maxima 3/1. Die Bildung des Antihioticum-Cholesterin-Koniplexes, wie er durch die spektralen Veranderungen angezeigt wird, wird nachNoRMAN et al. (1972b) fur Sterine als spezifisch angesehen. Von den Autoren wurde auf diese Weise fur die Antibiotica Pilipin, Lncensomycin, Ainphotericin Ti, Nystatin und Pimaricin eine Wechselwirkung mit Cholesterin nachgewiesen.

Nach der Methode von NORMAN e.t al. (1972b) uberpruften wir die von uns verwendeten Polyennntibiotica auf ihre Fahigkeit, mit Cholesterin zu reagieren. Wie Tabelle 3 zeigt, konnten wir fur die Antibiotica Filipin ,Lucensomycin, Nystatin und Pimaricin die oben zitierten Befunde bestatigen. In Erweiternng dieser Unt'er- suchungen haben wir an Hand der Spektrenveranderungen nachgewiesen, daR Cholesterin auch niit allen ubrigen gepriiften Polyenantibiotica in Wechselwirkung tri t t (Tah. 3). Sehwache spektrale Verandernngen wurden unter dein EinfluR von Cholesterin hei Mycotrienin, Tet>rainycin und Candicidin, starke Effekte dagegen bei Kiniocidin, Antihioticuni 2814 P, Lagosin und Antibioticuni 5001 Y gemessen. Die Polyenantihiotica Flavofungin und Flavoinycoin konnten aus versuchstech-


Wellenlange der Maxima nm

1 2 3

282 272 262 321 305 292 32 1 307 292 319 304 292 319 306 292 321 307 293 357 340 323 360 341 324 354 336 32 1 385 363 344 402 383 364

Tabelle 3 Spekt,rophotometrische Messung der Interaktion von Polyenantibiotica mit Cholesterin

Quotient der Extinlitionen d. Maxima 3/1

- Cholesterin + Cholesterin

L O 1.20 0,66 0.84 0,69 0,81 0,70 1,10 0,70 1 , l O 0,70 0,91 0,80 1,78 0,68 1,30 0,70 1,11 0,72 1,12 1,30 1,60

PlIy cotrienin Pimaricin Tetramycin Lucensomy cin Rimoeidin Kystatin Pilipin J,iLgosin Antibioticrim 2814 P Aiitibioticum 5001 P Candicidin

nischen Griinden nicht untersucht werden, da diese Verbindungen unter den uhlichen Meljhedingungen (SCHLEGEL u. THRUM 1971) nicht das fiir Polyenantihiotica charak- teristische Ahsorptionsspektruni zeigen.

Diskussion Nach den bisher in der Literatur vorliegenden Ergebnissen wird die biologische

Wirkung von Polyenantibiotica auf eine Storung der Yermeabilitat sterinhaltiger cytoplasniatiseher Meiiibranen zuriickgefuhrt (GALE et al. 1972). Indirekte Beweise fiir die Sterin-Bezeptor-Hypothese lieferten insbesondere die Versuche mit Achole- plasma laidlaioii. Diese Organisinen e,nthalten norinalerweise keine Sterine und werden von Polyenantibiotica nur dann gehemriit, wenn sie auf sterinhaltigen Nahrmedien kultiviert werden (FEINGOLD 1965, WEBER 11. KINSKY 1905). Vergleichbare Ergebnisse wurden auch mit Sckizosacckaromyces japonicus (BULDER 1971) und Pythiuin (QCHL~~SYE;R u. GOTTLIEX 1966) erhalten.

Die Itesistenz von Bakterien gegeniiher Polyenantibiotica wird in1 allgemeinen auf das Fehlen von Sterinen in dieseri Organisnien zuruckgefiihrt. Wir konnten jedoch zeigen, dafi Polycnantibiotica dennoch eine antibakterielle Wirksarnkeit entfaltcn k6nnen, wenn inan die zellwandlose I;-Forni von E. coli W 1655 F+ als Testorganisinus verwendet. Unter den gleichen Versuchsbeclingungen wurde die Norinalforni dieses Staimnes von keinein der gepriiften Polyenantibiotica gehemnit. Die norinalen Zellen lionnteri auch nicht durch Zugabe von Cholesterin zuin Nahriiiediurri sensibilisiert werden. Ijiescr Befund steht in Ubereinstinimung riiit den erfolglosen Sensibilisie- rnngsversuchen von Bakterien anderer Autoren (RAZIN 1963, WEBER u. KINSKY 1966). Wir konnten weitcrhin ausschliefien, dafi die Kesistenz der Normalform auf einem biologischen Abban der Yolyenantibiotica beruht.

Die untersuchten Polyenantibiotica heninien das Wachstuni der L-Form unterschiedlich stark. Zu den besonders wirksamen Substanzen gehoren Mycotrienin, Flavofungin, Flavoriiycoin u n d das Antibioticuni 5001 P, wobei die letzten drei Antihiotica schon in relativ niedrigen Heniinstoffkonzentrationen eine sofortige Lyse der Zellen hervorrufen. Eine Korrelation zwischen der Wirkung der Polyenantibiotica auf Pilze und auf die bakterielle J,-Form konnte in unseren Versuchen nicht fest- gestellt werden.

Als Ursache fiir das unterschiedliche Verhalten der Normal- und L-Form gegenuber Polyenantibiotica mufiten wir zunachst zwei Moglichkeiten in Betracht ziehen, nam- lich, dali sich entweder der Steringehalt beider Zelltypen stark unterscheidet, oder


daB bei gleichem Steringehalt die Zellwand der Normalforin eine Penetrations- schranke fur Polyenantibiotica darstellt. Wir griffen deshalb ziinachst die Frage des Sterinvorkoinniens in Bakterien erneut auf.

In der Literatur wurde bisher bei der Deutung der Mesistenz von Bakterien gegeniiber Yolyenantibiotica in1 allgenieinen nicht beriicksichtigt, daB schon von ver- schiedenen Autoren aucli in Bakterien Sterine in niedrigen Konzentrationen nachgewiesen wurden (SIFFERD u. ANDERSON 1936, DAUCHY et al. 1933, FIERTEL u. KLEIN 1959). Quantitative Angaben iiber die Sterinzusaiiiinensetzung einiger Bakterien- Arten wurden erstnialig von SCHUBERT et al. (1964, 1967, 1968 und 1970) beschriehen. Dahei wurden folgende Steringehalte erinittelt : E. coli 0,0004 yo, Streptomyces oli- vaceus 0,0035 yo, Azotobacter chroococcurn 0,01 n/o und Azotobacter v i d a n d i i O,lo/' der Zelltrockenniasse. Fur eukaryotische Zellen wird ein Steringehalt von 0,l% und hoher angegeben, wobei der von Pilzen ebenfalls niindestens 0,1 yo der Zelltrockeninasse betragt. Der Steringehalt der Bakterien liegt somit in1 allgenieinen weit unter den1 von eukaryotischen Zellen mit Ausnahme des Staninies Azotobac/er vinelandii, der bezuglich des Steringehaltes einen Ubergang zu den Pilzen darstellt. Wie unsere Untersuchungen rnit diesens Stainin jedoch gezeigt haben, sind die Zellen trotz des relativ hohen Steringelialtes gegeniiber Polyenantibiotica resistent (HAUPT et at. 1975 hj. Aucli in der L-Form von Protezis mirabilis sind Sterine nachgewiesen worden (REBEL XI. MANDEL 1962, REBE:L et al. 1963). Diese sollen aber nach Meinung der Au- toren nicht durch Eigensynthese gebildet, sondern aim deni Nahrinediuin aiifge- noniirien worden sein.

I n ubereinstiinriinng mit den Ergehnissen von SCHUBERT et al. (1964) konnten wir fur die Norntalforin von E. coliW 1655 F+ einen Steringehalt von 0,00047 yo der Zelltrockeninasse erinitteln. Als Hauptsterin wurde Cholesterin und in Spuren Cam- pesterin nachgewiesen. Entgegen unseren Erwartungen zeigte sicli, dalJ auch die sensible L-Forin dieses Stainmes einen ebenso niedrigen Steringehalt - 0,00096~o der Zelltrockeninasse - aufweist. Die Sterinzusanmiensetzung ist die gleiche wie bei der Normalform. Da das Nahrmedium noch Spuren an Cholesterin enthielt, kann mit diesen Versnclien nicht entschieden werden, oh die nacligewiesenen Sterine in beiden Zelltypen biosyntlietiscli entstanden oder aus dein Nahrmediurn aufgenoininen worden sind. Fiir die Sensibilitat gegeniiber Polyenantibiotica sollte nicht der absolute Steringehalt, sondern vieliiiehr ein bestiinitites Sterin-Phospholipid-Verhaltnis ent- scheidend sein (KINSKY 1965, DEMEL et a / . 1968, NORMAN et al. 1972 b). Bezieht inan deshalb den Steringehalt auf den Phospliolipidgehalt der Zellen, so sind die yo-Werte des Steringehaltes in Nornial- und L-Form von E. coli W 1655 F+ annahernd gleich grot$. Die Lipidpliosphatnienge als direktes MaW fur den Anteil der Zellhegrenzung ist als Bezugsgrolie fur den Steringehalt nussagekraftiger als das Bezugssysteni Zelltrockenniasse, da die Mengenanteile einzelner Zellkoniponenten in Normal- nnd L-Form weit divergieren (GEUTHER u. MOLTSCIIANOV 1'372).

Unsere Ergebnisse weisen cindt.utig darauf hin, daU die Unterschiede von Normal- und L-Foriii von h'. coli W 1655 F+ hinsichtlich ihrer Scnsihilitat gegcnuher Yolyen- antibiotica nicht auf einei-n untcrschiedlichen Steringehalt in heiden Zelltypen beruhen.

Die in unseren Versnchen eingesctzten 1,-Form-Zellen unterscheiden sicli von den entsprechenden norinalen Zellen durch das Fehlen einer Zellwand (GUMPERT et al. 1971, STRI~NK u. SCHUHMANN 1973). Wir liiiissen deshalb annehnien, dalS die Zellwand die Penetration der Polyenantihiot,ica Zuni IT'irkort verhindert und soinit die beob- achtete ltesistenz der norinalen Zellen hedingt. Vergleichbare Effekte, sind inzwischen auch fiir einige ant.ihakterielle Makrolidantibiotica und fur Actinoniycin C (TAUBEX- ECK 1962, SCHUHMANN ti. TAUBENECK 1969), fur Kirroniycin (WOLF u. ZAHNER 1972) und fur Distaniycin A (SCHUHMANN et a/. 1974) beschrieben worden.


Fur die Annahnie einer Penetrationsbeschrankung sprechen auch weiterliin die Ergebnisse unserer Untersuchungen mit EDTA-behandelten nornialen Zellen von E. coli W 1655 F+ in synthetischem, cholesterinfreiem Medium. Diese Zellen, die nor- rrialerweise gegeniiber Polyenantibiotica vollig resistent sind, werden sensibel, nachdem die Pernieabilitat der Zelloberflache durch Behandlung mit EDTA erhoht worden ist (HAUPT et al. l975a). Weitcrhin ist aus diesen Versuchen noch der SchluB zu ziehen, da13 unter den gewahlten Bedingungen keine Sensibilisierung der E. coli- Zellen durch Sterine aus dem Nahrmedium crfolgt sein kann. Es bleibt danach fest- znstellen, daB E. coli-Zellen grnndsatzlich targets fur Polyenantibiotica enthalten, wobei z. Z. noch unentschieden bleibt, ob die nachgewiesenen Sterine in diesen Zentren lokalisiert sind oder nicht.

Die ffbertragharkeit der an E. coli gewonnenen Ergebnisse auf andere gramnegative oder auch auf grainpositive Bakterien mu13 noch gepriift werden. KINSKY (1962) und SHOCKMAN 11. LAMPEN (1962) fanden im Gegensatz zu iinseren Befunden an der zell- wandlosen L-Form eines gramnegativen Bakterienstammes, daB Yrotoplasten von Bacillus megateriuna - also zellwandlose Zellen eines grampositiven Bakterienstam- mes - gegeniiber Polyenantibiotica resistent sind. Aus diesen Ergebnissen wurde von KINSKY (1967) geschlossen, dalJ die Resistenz von Bakterien gegenuber Polyen- antibiotica nicht auf Penetrationsbeschrankungen der Zellwand beruhen kann. Diese generelle SchluBfolgerung, nach welcher die Zellwand als Penetrationsschranke nicht h e Ursache fur die Resistenz von Bakterien sein soll, diirfte nach unseren Ergebnissen an E. coli jedoch einer Revision zu unterziehen sein.

Es erscheint uns auBerdern erwahnenswert, daIJ fur einige Hexaenantibiotica eine Wirkung auf intakte grainpositive Bakterien beschrieben wurde (SAKAMOTO 1959, THIRUMALACHAR u. MENON 1962). Auch das von uns gepriifte Hexaenantibioticum 5001 P hemrnt B. subtilis und andere grampositive Bakterien. Moglicherweise muB fur diesc Hexaenantibiotica gegenuber granipositiven Bakterien ein anderer Wirkungs- mechanismus als gegenuber Pilzen angenommen werden. Diese Frage bedarf einer weiteren Priifung einschlieRlich der nochinaligen Untersuchung des Steringehaltes der verwendeten Bakterienstainine.

Wir danken Herrn Ing. G. ROSE fur seine Unterstiitzung bei der Aufarbeitung der Proben fiir die Sterinbestimmung, Herrn Ing. F. RITTER fur die Anfertigung der Gaschromatogramme und Herrn Dipl.-Chem. G. HESSE fur die Durchfiihrung der spektrophotometrischen Messungen.

Unser besonderer Dank gilt Frau URSULA MAY, Frau IRMGARD HEINEMANN und Frau EVA BLANKE fur die umsichtige und gewissenhafte technische Assistenz.

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Anschrift : Dr. INA HAUPT Zentralinstitut fur Mikrobiologie und experimentelle Therapie DDR 69 Jena, Betkhenbergstr. 11

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Wirkung von Polyen-Makrolidantibiotica auf normale und zellwandlose Zellen von Escherichia coli W1655F+