Aus dem Tuberkulose-Forschungs-Institut, Berlin-Buch, und dem Institut fur Lebensmittelchemie und - Technologie der Humboldt-Universitat zu Berlin

Zur antioxydativen Wirksamkeit von Isonicotinsaurehydraxid* H. IWAINSKY und CL. FRANZKE

I. Allgemeines

Unsere Lebensmittel sind auf Grund ihrer zum stofflichen Umsatz disponierten Eigenschaften leicht unerwunschten chemischen und biologischen Veranderungen ausgesetzt. Daher ist das Bestreben der Menschen, ihre Nahrungsguter vor dem Verderb zu schutzen und periodisch anfallende Lebensmittel fur einen groI3eren Zeitraum haltbar zu machen, d. h. Vorratswirtschaft zu treiben, vermutlich ebenso alt wie die Zubereitung der Nahrung selbstl.

Bei den Bemiihungen um eine sachgemaiBe Vorratshaltung nimmt die Frage nach der Haltbarmachung der relativ leicht verderblichen tierischen und pflanz- lichen Fette sowie der fetthaltigen Lebensmittel einen bedeutsamen Platz ein. Bekanntlich treten bei langdauernder oder unsachgemaDer Lagerung solcher Pro- dukte nach einer bestimmten Zeit Veranderungen ein, die sich bei Erreichen eines Grenzwertes schon rein sinnesphysiologisch bemerkbar machen. Zusatzlich ist hier- bei mit einer Wertminderung und mit dem Auftreten unphysiologischer Verbin- dungen zu r e ~ h n e n ~ , ~ .

Man unterscheidet grundsatzlich zwischen dem mikrobiellen und dem chemischen Fettverderben, wobei natiirlich einer teilweisen uberschneidung Rechnung getragen werden mu& Die Verderbsanfalligkeit gegenuber mikrobiologischen Einfliissen ist im wesentlichen auf wasserfuhrende Fette und fetthaltige Lebensmittel (Mar- garine, Butter, Mayonnaise usw.) beschrankt. Hier wird man versuchen, durch Anwendung physikalischer MaBnahmen oder durch Einsatz chemischer Konser- vierungsmittel eine Hemmung des mikrobiellen Wachstums zu erreichen. Die zweite Moglichkeit des Fettverderbens ist die Oxydation durch Einwirkung des Luftsauer- stoffes. Trotz auI3erordentlich zahlreicher Untersuchungen ist der Chemismus dieser Autoxydationsprozesse - vor alleni in den Folgereaktionen - bisher noch nicht befriedigend aufgeklart.

* Unserem verehrten Lchrer, Herrn Prof. Dr. I<. TAUFEL, zum 65. Geburtstag gewidmet. TAUFEL, K., Wiss. Ann. I, 370 (1952). LALOR, R. J., W. L. LOESCHKE U . c. A. ELVEHJEM, J. Nutrit. 45, 183 (1951).

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In den letzten Jahren sind viele chemische Verbindungen bekannt g e ~ o r d e n ~ > ~ . ~ die einen mehr oder minder starken antioxydativen EinfluB entfalten, aber nur wenige dieser Fett-Antioxydantien sind bisher in der Praxis eingesetzt worden.7

Obwohl in mehreren Staaten der Zusatz bestimmter Praparate zu Fetten und fetthaltigen Lebensmitteln bereits gesetztlich erlaubt ist, verhalt man sich in vielen anderen Landern in dieser Hinsicht noch sehr zuruckhaltend. Die Ursache hierfur mag in erster Linie in der zumeist nicht vollig iiberschaubaren physiologischen Wirkung - vor allen Dingen im Hinblick auf eine eventuelle Kanzerogenitat - derartiger Substanzen liegen.

In neuerer Zeit haben HASSEISTROM und Mitarb. iiber die antioxydative Wirk- samkeit des Isonicotinsaurehydrazids (INH) berichtet.s Sie konnten bei ihren Untersuchungen an Schweineschmalz zeigen, daB diese Verbindung in einer Kon- zentration von O,I% einen deutlich nachweisbaren Effekt entfaltet.

Weitere Untersuchungen in dieser Richtung erscheinen angezeigt, da die umfang- reichen, bei der Chemotherapie der Tuberkulose in den letzten 5 Jahren gesammelten Erfahrungen uber die Wirkung des INH auf den menschlichen Organismus eine Aussage iiber diese Verbindung zulassen. Man darf auf Grund der bisherigen Er- gebnisse wohl festhalten, daB das INH bei den in Frage kommenden Konzentrationen als Antioxydans bei gesunden Menschen wahrscheinlich keinerlei Nebenerschei- nungen auslosen wurde. Eine lranzerogene Wirkung dieses Praparates ist ebenfalls als sehr unwahrscheinlich auszuschliel3en. Man hat vielmehr versucht, - allerdings nicht mit dem gewunschten Erfolg - das INH auf Grund seiner cytostatischen Wirkungg bei der Chemotherapie des KrebseslO einzusetzen. Als problematisch wurde allerdings die praktische Anwendung von INH als Antioxydans bei Per- sonen mit aktiv verlaufender Tuberkulose erscheinen; hier bestande die Gefahr des Auftretens INH-resistenter Tuberkulosebakterien, deren Pathogenitat noch heftig umstritten ist.

I I . Eigene Untersuchungen Die bisher bekannt gewordenen Ergebnisse iiber den oxydationshemmenden

EinfluB des INH wurden mit Hilfe des von RIEMENSCHNEIDER, TURER und SPECK^' abgeanderten SWIFT-Testes erhalten. Da aber einerseits das INH, wie bekannt,

LANG, K., Klin. Wschr. 26, 257 (1948). RAEITHEL, H., 2. Lebensmittel-Unters. u. -Forsch. 99, 246 (1952). KHAN, N. A,, J. Amer. Oil Chemist's SOC. 30, 273 (1953). TAUFEL, K. u. H. ROTHE, Fette u. Seifen 53, 381 (1951).

' Vgl. BAUER, O., Dtsch. Lebensmittel-Rdsch. 50, 146, 175. 192, 218, 259 (1954). * HASSELSTROM, T., G. P. DATEO, H. S. LEVINSON, 14'. H. STAHL, E. J. HEWITT u. K. S.

KONIGSBACHER, Food Res. 19, 373 (1954). HELLRIEGEL, W. u. R. KRAUS, Tuberkulosearzt 9, 653 (1955).

RIEMENSCHNEIDER, R. TV., J. TURER u. R. M. SPECK, Oil and Soap 20 , 1139 (1943). lo SIMON, K., 2. Naturforsch. 7b, 531 (1952).

Antioxydative Wirksamkeit 55

bei der Einwirkung hoherer Temperaturen durch sekundare Umsetzungen nicht unwesentlich verandert wird12~13 und anderseits die Autoxydation bei einem nach dem SWIFT-Test gepriiften 01 u. U. recht abwegig gegenuber dem normalen oxy- dativen Fettverderb verlauft,14 wurden unsere Untersuchungen im Standversuch durchgefuhrt. Diese Arbeitsweise kommt dem naturlichen Reaktionsablauf noch am nachsten.

Aus technischen Griinden wurde als Untersuchungssubstrat Margarine gewahlt. INH laDt sich darin annahernd gleichm2Dig verteilen. AuBerdem besteht die Mog- lichkeit, zusatzlich eine etwa vorhandene antimikrobielle Wirkung des INH zu prufen. Die Versuche wurden unter den folgenden Gesichtspunkten angesetzt.

I. Vergleich der antioxydctiven Wirksamkei t von I N H und Dodecylgallat

Jeweils 250 g der ublichen Handelsmargarine werden nach Erwarmen auf 45" C mit O,I und O,OI% INH bzw. Dodecylgallat versetzt, gut durchmischt und an- schlieDend unter Riihren abgekuhlt. Die Margarine wird dann bei 25" C im diffusen Tageslicht gelagert. In bestinimten Zeitabstanden werden Proben gezogen und darin die Peroxydzahl - ausgedruckt als Verbrauch an ml n/5oo Natriumthiosulfat- losung pro I g Fett - nach SULLY^^ in der von F R A N Z K E ~ ~ abgeanderten Weise bestimmt.

POI m l "/so0 Na>S,O, j e g f i f i

- Margarine - - + q07% Dodecylgallat * +07% "

t D. 7 % /soncoiinsaurenydrarid - +@07%

_-__

50 700 150 200 250 Zeii in Tagen

Abb. I . Verlauf der Autoxydation yon Margarine bei Zusatz von INH bzw. von Dodecylgallat, ausgedriickt durch die Peroxydzahl

l2 ALBERT, A. u. C. W. REES, Biochem. J. 61, 128 (1955). l3 BONICKE, R. u. W. Reif, Naturw. 40, 606 (1953). l4 TAUFEL, K. u. R. VOGEL, Ernahrungsforsch. I , 142 (1956). l5 SULLY, B. D., Analyst 79, 86 (1954). l6 FRANZKE, Cl., Z . Lebensmittel-Unters. u. -Forsch. 103, 108 (1956).

56 IWAINSX Y/FRANZXE

Abb. I zeigt, da13 INH und Dodecylgallat den etwa gleichen oxydationshemmenden Einflul3 entfalten. Er ist bei einem Zusatz von o,o1y0 noch wenig ausgepragt, bei O,I% dagegen deutlich sichtbar.

2. Vergleich der antioxydativen Wirksamkeit aon I N H , Isonicotinsaure und N-lso- nicotinoyl-N'-acetyl-hydrazin

Um Hinweise daruber zu erhalten, welche Gruppierungen des INH fur die anti- oxydative U'irkung verantwortlich zu machen sind, wird neben INK auch Iso- nicotinsaure und das an der Hydrazingruppe substituierte N-Isonicotinoy1-N'- acetyl-hydrazin zu den Versuchen herangezogen. Die zugesetzten Mengen betragen jeweils O,I yo ; im ubrigen entspricht die Versuchsanordnung den vorher beschrie- benen Bedingungen.

- PO2 rnl Vsnn Na, S, j e g Feff

60 -

- -- Margarine -. - 8 + 0.1% lsonirotinsaurehydrazid

- 'I + 0.7% lsnnirotins&ve " + O.?%N-/SOniCofinoy/-N'-ecetyf-hyd~~jn

40 -

20 -

0 50 100 150 200 250 260 Zeif in Tagen

Abb. 2. Verlauf der Autoxydation von Margarine bei Zusatz von INH, Isonicotinsaure und N-Isonicotinoyl-N'-acetal-hydrazin, ausgedriickt durch die Peroxydzahl

Wie Abb. 2 zum Ausdruck bringt, hat auch Isonicotinsaure selbst einen deut- lichen, im Vergleich zu INH allerdings geringen Einfluf3. Dagegen ist die an der Hydrazingruppe substituierte Verbindung praktisch wirkungslos.

3. Der synergistische Einflup uon Ascorbin- und Citronensaure auf die antioxydative Wirkung von INH

Es ist eine gesicherte Tatsache, da13 das autoxydative Verderben der Fette durch Schwermetallspuren sehr stark katalytisch gefordert wird.l7?ls Schwermetalle uben

17 SKELLON, J . H., J. SOC. Cheni. Ind. 69, 116 (1950). 1s EVANS, C. D., A. W. SCHWAB, H. A. MOSER, J. E. HARLEY 11. E. H.MELVIN, J . Amer. Oil.

Chemist's Soc. 28, 68 (1951).

Antioxydative Wirksamkeit 57

auch auf INH einen recht unterschiedlichen EinfluB aus. Einerseits ist bekannt, daB z. B. Eisen(II1)- oder Mangan(I1)-Ionen eine partielle Zerstorung des INH be- wirken konnen,lg anderseits ist bei Kupfer(I1)- und Kobalt(I1)-Ionen mit einer Stabilitatserhohung infolge Komplexbildung zu rechnen.20 In diesem Zusammen- hang war zu uberprufen, wieweit der antioxydative Effekt des INH durch Syn- ergisten und durch prooxydativ wirkende bzw. mit dem INH in Wechselwirkung tretende Schwermetallspuren beeintrachtigt wird.

+ 0,7% Asrorbinsaure +0,7% ** +a,?% Zitronensiure + O l % "

20 -

____.._.. -.---

0 50 700 750 200 250 Zeit in Egen

Abb. 3. Verlauf der Autoxydation von Margarine bei Zugabe von Ascorbinsgure und INH, aus- gedriickt durch die Peroxydzahl

Wie Abb. 3 lehrt, laBt Citronensaure, die bekanntlich selbst keine fettantioxy- dative Wirksamkeit besitzt, auch bei diesen Versuchen einen EinfluB auf den Ver- lauf der Autoxydation nicht erkennen. Ascorbinsaure hingegen entfaltet einen deutlich antioxydativen Effekt.

4. Die antioxydative Wirksamkei t von I N H bei Gegemwart von Schwermetallen

Wie sich aus den unter 3. durchgefiihrten Versuchsreihen (Zusatz von Citronen- slure) ergibt, ist die Anwesenheit ins Gewicht fallender Mengen prooxydativ wirk- samer Schwermetallspuren auszuschliel3en. Durch Zugabe von definierten Mengen an Metal1 wird daher bei den folgenden Versuchsreihen ihr EinfluD auf den anti- oxydativen Effekt von INH untersucht. Die Ergebnisse sind in Abb. 4-6 wieder- gegeben.

l9 WINDER, F., Am. Rev. Tbc. 73, 779 (1956). 2o STUTTGEN, G., Arzneimittelforsch. 5 , 703 (1955).

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Konzentrationen der zugesetzten Verbindungeiz

a) 0,1377k INH (O,OI molar) b) 0,06970 ,, (0,005 ,, ) c) o , o g ~ % FeC1, - 6H,O (0,003 > >

d) 0,099% MnC& 4HzO (0,005 9 , ) e) 0,1257~ CuSO,-5H,O (0,005 ,, )

Wie sich aus Abb. 4 ergibt, wird der antioxydative Effekt von INH durch die Anwesenheit von Eisen wesentlich gemindert. r

Margarine

/ /

/.

0 30 60 Zeif in Egen

Abb. 4 . Verlauf der .4utoxydation vonMargarine bei Ge- genwart von INH und Eisen(II1)-Ionen, ausgedruckt

durch die Peroxydzahl

Abb. 5. Verlauf der Autoxydation von Margarine bei Gegenwart von INH und Kupfer(I1)-Ionen, ausge-

driickt durch die Peroxydzahl

Auch bei diesen Versuchsreihen zeigt sich nach Abb. 5 die prooxygene Wirkung des zugesetzten Schwernietalls in eindeutiger Weise.

Abb. 6 . Verlauf der Autoxydation von Margarine bei Gegenwart von INH und Mangan(I1)-Ionen, ausgedruckt durch die Peroxydzahl

Ein gleichzeitiger Zusatz von Mangan und INH zu Margarine hat nach Abb. 6 bei den gepruften Konzentrationen praktisch keinen EinfluB. Mangan allein be- wirkt dagegen einen deutlichen Anstieg der Perosydzahl.

Antioxydative Wirksamlreit- 59

j. Henzmung des mikrobiellen Wachstums durch I N H

Soweit die hier nur orientierend durchgefuhrten Untersuchungen eine Aussage zulassen, darf festgehalten werden, daB das INH gegeniiber den andern einge- setzten Verbindungen eine gewisse antimikrobielle Wirkung (Schimmelbefall) a d - weist.

I I I . Auswertung der Ergebnasse

Die antioxydative Wirkung des INH ist bei den gewahlten Bedingungen etwa ebenso gro8 wie die des Dodecylgallates. Damit konnen die Ergebnisse von HASSEL- STROM und Mitarb.* bestatigt werden. Bei diesen Autoren zeigte Propylgallat im Vergleich zu INH zwar eine starkere Wirkung. Bei unseren Untersuchungen hin- gegen fie1 ein entsprechender Vergleich gunstiger fur das INH aus, was vermutlich auf die unterschiedliche Versuchsanordnung zuruckzufuhren ist.

Wie aus den Versuchsreihen zur Klarung des wirksamen Prinzjps hervorgeht, ist vor allem die Hydrazingruppe fur die antioxydative Wirkung verantwortlich ; aber auch die Isonicotinsaure selbst besitzt einen mel3baren antioxydativen Effekt. Diese Tatsache erscheint fur die Beurteilung der Wirksamkeit bedeutungsvoll, da sich aus papierchromatographischen Untersuchungen der unter 3. beschriebenen Ver- suchsreihen ergibt, daB nach etwa z5otagiger Versuchsdauer neben INH vorwiegend Isonicotinsaure nachzuweisen ist. Bei Substitution der Hydrazingruppe des INH durch den Acetylrest wird die Verbindung praktisch wirkungslos ; hier durfte er- fahrungsgemao die Hydrolyse zur Isonicotinsaure bei quantitativer Betrachtung kaum eine Rolle spielen.

Die Deutung der Versuche unter Zusatz von Schwermetallen ist im vorliegenden Fall schwierig, weil die beiden moglichen Reaktionsablaufe, einmal die prooxydative Wirksamkeit der Schwermetalle, zum andern die Wechselwirkungen des INH experimentell schwierig voneinander abzugrenzen sind.

Auf jeden Fall wird durch den INH-Zusatz die prooxydative Wirkung der Kupfer- und Eisenionen wenigstens partiell aufgehoben. Bei Zusatz von Manganionen tritt die Kompensation des prooxydativen Effektes noch deutlicher in Erscheinung.

Zusammenfassend laBt sich feststellen, daB INH bei einer Konzentration von O,I% unter den gepruften Bedingungen einen antioxydativen Effekt entfaltet, der dem des Dodecylgallats nicht nachsteht. Bei Anwesenheit von Schwermetallen ist jedoch mit einer Wirkungsminderung zu rechnen. Bei einer evtl. Anwendung von INH als Antioxydans sollte daher nach Moglichkeit durch Zusatz eines Synergisten die prooxydative Wirkung von Schwermetallen ausgeschaltet werden. *

* Fraulein RUTH ELSNER hat uns bei der experimentellen Durchfiihrung der nrbeit bestens unterstiitzt, wofiir auch an dieser Stelle gedankt sei.

60 IWAINSK YIFRANZKE

Zusammenf assung I. Untersuchungen iiber den oxydationshemmenden EinfluB von Isonicotinsaurehydrazid,

Isonicotinsaure und N-Isonicotinoyl-N’-acetyl-hydrazin auf Margarine im Standversuch haben gezeigt, daO das INH etwa die gleiche antioxydative Wirksamkeit besitzt wie das Dodecylgallat.

2. Fur die Wirkung des INH ist die Hydrazingruppe verantwortlich. 3. Bei Gegenwart von Eisen-, Kupfer- und Mangan-Ionen tritt in unterschiedlichem AusmaD

eine deutlich wahrnehmbare Minderung des antioxydativen Effektes des INH in Erscheinung.

S u m m a r y

I. Investigations about the antioxidant influence of isonicotinicacidhydrazide, isonicotinic acid and N-isonicotinoyl-N’-acetylhydrazine on margarine have demonstrated in the stand test, that INH shows nearly the same antioxidant efficiency as dodecylgallate.

2. The hydrazine-group is responsible for the effect of INH. 3. In presence of iron-, copper- and manganese-ions there appears in various degrees a di-

stinctly perceivable decrease of the antioxidant effect of INH.

R e s u m e

I. Des recherches sur l’influence retardatrice de l’oxydation exercBe par l’acide isonicotinique hydrazyde, l’acide isonicotinique et le N. Isonicotinoil N’acetylique hydrazide sur la margarine en dilution ont 6tabli que le INH possBde approximativement la meme action antioxydante que le dodecylgallique.

2. Le groupe hydrazyde est cause de l’action du INH. 3. En presence d’ions de fer, de cuivre e t de mangankse on observe une attenuation nette,

dans une mesure diffkrente, de l’action antioxydante du INH.

Dr. HEINZ IWAINSKY, Berlin-Buch, Karowerstr. I I

nr. CL.\US FRANZKE, Berlin-WeiDensee, Goethestr. 48- j o